JPH06503473A - 融合ポリペプチド - Google Patents
融合ポリペプチドInfo
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- JPH06503473A JPH06503473A JP4501996A JP50199692A JPH06503473A JP H06503473 A JPH06503473 A JP H06503473A JP 4501996 A JP4501996 A JP 4501996A JP 50199692 A JP50199692 A JP 50199692A JP H06503473 A JPH06503473 A JP H06503473A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、伸長ベブチ1一部分が式
7式%)
[式中1
、八は任意および存在する場合はメヂオニ、・。
■]は0〜20゜
Xは全ての天然アミ、/酸残基からなる群から選択され。
Xoはプロリンおよびヒドロギンプロリンを除く全ての天然アミノ酸残基からな
る群から選択され。
)”は、nが0である場合にYがアラニン、セリンおよびトレオニンからなる群
から選択されることを除き、ブロリ〉、ヒドロキシプロリン、アラニン、セリン
およびl・リオ:ンからなる群から選択されるコて示される、そのC−末端でコ
ア蛋白部分のN−末端に共有結合している伸長ベゴ千1・部分からなる非天然融
合蛋白に関する。
また、本発明は、薬剤調製におけるかかる非天然蛋白の使用、および非天然蛋白
を固定化する物質に非天然蛋白を選択的に接触させ、該不純物を除去し、該物質
か1、該JF天然蛋白を分離し、該非天然蛋白をDPP rVと接触させ、該所
望の蛋白を単離する工程からなる、かかる非天然蛋白および不純物を含有する混
合物から所望の蛋白を精製する方法に関する。
情報の開示
スミス(Smith)らに1986年2月11日に発行された米国特許第4.5
69゜794号は、蛋白を精製する方法およびかかる方法で有用な化合物に関す
る。該発明は、C−末端の生物学的活性ポリペプチドおよび金属イオンキレート
化リンカ−であるN−末端伸長リンカ−を有する融合蛋白の単離方法を開示して
いる。
該融合ペプチドは固定化金属イオンに親和性を有する。不純物は、固定化金属イ
イオンを含有するカラムに融合蛋白を含有する混合物を通過させることによって
除去することができる。融合蛋白は金属イオンに連結され、不純物だけが溶出さ
れる。条件を変えると、固定化金属イオンから融合蛋白が遊離され、その結果、
精製された融合蛋白が得られる。
ホップ(Hopp)らに1988年11月1日に発行された米国特許第4.78
2゜137号は、高抗原性N−末端部分およびC−末端部分において所望のポリ
ペプチドを有する融合蛋白の合成を開示している。ホップらによると、融合蛋白
は、該融合蛋白の抗原性部分を認識する固定化抗体を含有するカラムに粗製上澄
みを通すことによって該粗製上澄みから精製される。固定化抗体は、カラム中に
蛋白を保持し、一方、上澄みの望ましくない成分は溶出される。次いで、カラム
条件を変えて、抗原−抗体複合物を解離させることができる。次いで、融合蛋白
を溶離し収集する。
フェリックス(Fe1ix)らに1988年3月29日に発行された米国特許第
4゜734.399号は、成長ホルモン放出因子アナログに関する。Tyr−A
laおよびHis−Alaの末端を有するいくつかのアナログが開示されている
。しかしながら、これらの分子は融合蛋白ではなく、コア蛋白にすぎない。フェ
リ・ソクスらのN−末端ジペプチドはbGRFアナログコア分子の一部分である
。
1987年5月6日に公開された欧州特許出願公開番号0 220 958は、
N−末端残基の選択的な化学的除去に関する。当該発明は、所望のポリペプチド
からN−末端残基を除去する方法および該方法で有用な化合物に関する。該所望
のポリペプチドは、式X−Proを有するリンカ−に向けてのN−末端に所望の
ポリペプチドリンクを有する融合蛋白として存在する。特定の緩衝条件に融合蛋
白を暴露させると、融合蛋白のX−Pro部分のジケトピペラジンが形成され、
切断され、これによって融合前駆体から所望のポリペプチドが生成される。本発
明では、N−末端伸長がジペプチドだけである場合、すなわち、Aが存在せず、
nが0であってXが天然アミノ酸である場合、)′はアラニン、セリンまたはト
レオニンのいずれかであるので、EPO220,958(以下、’958とも記
す)の融全蛋白は本発明には含まれない。かくして、伸長がジペプチドである場
合はいつも、それは、X−AlaSX−8erまたはX−Thrである。°95
8出願は、化学的であり、酵素的ではない、ジペプチドX−Proの切断を教示
する。ジペプチドX−AlaSX−8erおよびX−Thrは、コア蛋白からX
−Pro伸長を切断する°958出願によって教示されたタイプの化学的切断に
影響されにくい。
オーストラリア特許出願ドキュメントNo、AU−A −12709/ 88は
、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で有用な親和性ペ
プチドを含有する融合蛋白を開示している。開示されている親和性ペプチドは、
少なくとも2つの隣接するヒスチジン残基を含有するものであった。開示されて
いるIMAC精製手段は、ニトリロ三酢酸(NTA)樹脂を作製するために特定
の合成化学を必要とする。
ターロン、エム・エイ(Tallon、 M、 A、 )ら[バイオケミストリ
ー(B iochem、 )、26 : 7767−7774(1987)1は
、サツカロマイセス・セレビシェ(S accharomyces cerev
isiae)からのトリデカペプチドα−因子の伸長アナログの合成に関する。
合成されたアナログは伸長されたα−因子であり、MFα1構造遺伝子において
コードされた天然プローα−因子の配列を示す。
キール、ノー(Kiel、 G、 )ら[ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー(E ur、 J 、 B iochem、 )、111 :
49−58(1980)]は、ジベブチノルベブチダーゼ■によってメリチン
前駆体(プロメリチン)のN−末端部分の段階的切断を開示している。プロメリ
チンはミツハチの毒物の主成分である。当該前駆体のN−末端部分のアミノ酸配
列において、どの第2残基もプロリンまたはアラニンのいずれかである。プロメ
リチンがブタの腎臓から単離されたDPP IVに!l露されると、該前駆体の
N−末端領域は段階的に切断されて、成熟蛋白が生じる。プロメリチンは、本発
明の融合蛋白とは異なり、天然蛋白である。
ノコリウス、ディ(J ulius、 D、 )ら[セル(Cell)、第32
巻: 839−852(1983年3月)]は、より大きい前駆体ポリペプチド
からの酵母α−因子のプロ七ノ/ングにおいて膜結合DPP TVの役割に関す
る。酵母α−因子は、本発明の融合蛋白とは異なり、天然蛋白である。
モレイ、 ノー(Mollay、 C,)ら[ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー、160 : 3l−35(1986)]は、ツツメガニ
の皮膚分泌物がらのDPP rVの単離を記載している。DPP rVの活性が
考察されている。
メントレイン、アール(Mentlein、 R,) [F E B、第234
巻、第2号、第251頁〜第256頁(1988年7月)]は、ペプチドホルモ
ンおよび神経ペプチドの成熟および分解におIJるプロリン残基を総括している
。哺乳類では、DPP■のようなプロリン特異的プロテアーゼが調節ペプチドの
生合成に関与しないが、それらの分解で重要な役割を果し得ることが報告されて
いる。かくして、を推動物および下等を推動物において、前駆蛋白は、前駆体を
成熟形態に変換するためにDPP rVを頼りにする一方、哺乳動物における調
節蛋白のプロセッシングは、通常、分解プロテアーゼとしてDPP TVを使用
すると結論される。
フローマン、エル・エイ(Frohi+an、 L、 A、)ら[ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベステイゲーシa :/(J 、 CIin、 I n
vest、 )、78 :906−913(1983)]は、ヒト成長ホルモン
放出因子(hGRF)およびそのアナログがヒトにおいてinνivoで、およ
び血漿DPP IVによってin vitroで急速に分解されることを報告し
ている。
フローマ〉、エル・エイ(Frohman、 L、 A、 )ら[ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベステイゲーンヨン(J、Cl1n、 1nvest、
)、83 :1553−1540 (1980)]は、ヒト成長ホルモン放出因
子(hGRF)およびそのアナログがヒトにおいて
in vivoで、および血ff1DPPIVによってin vitroで急速
に分解されることを報告している。
クヒアク、ティ・エム(Kubiak、 T、 M、 )ら[トラツク・メタボ
リズム・アンド・ディスポジション(Drug Metabolism and
Dispositinn)、第17巻、第4号、第393頁〜第397頁(1
989)]は、ウソおよびブタの血漿におけるつ/成長ホルモン放出因子(bG
RF)アナログのin vitro代謝分解ならびに血漿DPP■活性との相関
性に言及している。試験されたbGRFアナログはN−末端の2位にAla残基
を有していた。血漿中のbGRFの代謝分解は血漿中のDPP■の存在よること
が報告されている。
ポン、ダブリュ(Hong、 W、 )ら[バイオケミストリー(B 1och
eIllistry)、28゜847・4−8479(1989)]は、トラン
スフェクノヨン後のチャイニーズハムスター卵巣細胞における酵素的(ニー活性
なりPP IVの発現を報告している。
フレイル、/−(Kreil、G、)[TlB5 15:23 26(1990
年1月)コは、前駆体の最終生成物への変換におけるDPPによるジペプチドの
段階的切断について総括している。フレスルによって記載されている前駆体は天
然蛋白である。本発明の融合蛋白は非天然融合蛋白である。
ボマン(Boman)ら[ジャーナル・オブ・バイオロジー・アンド・ケミスト
リー(J、Biol、Chem、)、264 : 5852−5860(198
9)]は、セクロピア・ブベ(cecropia pupae)から単離された
(DPPIVと類似の特異性を有する)ジベブチノルベプチダーゼがセクロビア
AおよびBの天然前駆体の合成コピーのN−末端から^1a−Pro−Glu−
Proの天iN−末端配列を除去することができたことを開示している。ポマン
によって開示されているプレプロセクロビンは天然蛋白である。
ダルホゲ エイチ(Dalboge、 H,)ら[バイオ/チクノロノー(Bi
o/lechnology)、5 :161−164 (1987年2月)]は
、ヒト成長ホルモン(hGH)のイー・コリ(E、coli)生産前駆体をin
vitroで真性hGHに変換することを開示している。前駆体のN−末端伸
長はノペプチジルペプチダーゼ■によって除去される。
ダルボゲ、エイチら[FEBS、第246巻(1,2): 89−93 (19
89年3月)]は、IL−β前駆体のクローニングおよび発現ならびにシペブチ
シルベプチダーゼ■を使用した前駆体のN−末端伸長の除去によるそのIL−1
βへの変換を開示している。
ダルボゲ、エイチらIF E B S、第26巻(1,2):1−3 (199
0年6月)コは、イー・コリ(E、coli)におけるN−末端メチオニンのi
n vivoプロセッノングに言及している。伸長したヒI・成長ホルモンから
のN−末端メチオニンの除去がメチオニンに隣接するアミノ酸に依存することが
報告されている。
ホップ、ティ・ビー(Hopp、 T、 P、 )ら[バイオ/テクノロン−1
6:1204−121.0(1988年10月)]は、免疫親和性精製において
使用され得る抗原性N−末端を得るために、所望の組換えリンホカインのN−末
端への8個のアミノ酸ペブチ)・の付加を開示している。この公表は、前記米国
特許第4.782゜137号と対応する。
スミス、エム・ノー(Smith、 M、 C,)ら[ツヤ−ナル・オブ・バイ
オロジー・アンド・ケミストリー、第263巻、15 : 7211−7215
(1988)]は、小ペプチドのNH2末端上の特定の金属キレート化ペプチ
ドは、金属イオン親和性クロマトグラフィーを用いてこの蛋白を精製するのに使
用できるという仮説を支持する実験的結果を開示している。この文献は、前記米
国特許第4.569.794号の実施例の1つに関する特定のデータを提供する
。特に、黄体化ホルモン放出ホルモンまたはプロインスリンに結合した金属キレ
ート化ペプチドHis−Trpの使用により、IMACを用いてのキメラペプチ
ドの精製が可能となるが、l1is−Trpを含有しない対照分子は同様な方法
で回収できない。
ホチュリ、イー(口ochul i、 E、 )ら[ジャーナル・オブ・クロマ
グラフィー(JChromat、 )、411 :177−184 (1987
)]は、金属キレート親和性クロマトグラフィーで有用なニトリロ三酢酸吸収剤
を開示している。開示された吸収剤は、N12゛て荷電すると、隣接するヒスチ
ジン残基を含有するペプチドおよび蛋白への結合に有用であることを開示してい
る。
リュンクィスト /−(Ljungquist、C,)ら[ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー、186 : 563−569(1989)
]は、固定化Zn”イオンを含有するカラムと一緒に、2.4および8の多重度
にて、金属キレート化ペプチド^1a−His−Gly−His−^rg−Pr
oを使用していることを開示している。リュンクィストによると、亜鉛カラムと
共にこの金属キレート化ペプチドを使用すると、融合蛋白の予期せぬほどに良好
な精製が捏供される。
発明の詳細な説明
本明細書で使用する「非天然融合蛋白−1、「非天然ポリペプチド」、「融合ポ
リペプチド」および「融合蛋白」なる語は、天然では通常生じず、コア蛋白部分
および伸長部分からなる蛋白およびポリペプチドを互換可能にいう。
本明細書で使用する「コア蛋白」、[゛コア蛋白部分」および[ポリペプチド蛋
1―日なる語は、分子のC−末端に位置し、伸長部分が存在しないと、所望のポ
リペプチドおよび/・′または生物学的活性蛋白である融合ポリペプチドの部分
をいい、天然生物学的活性蛋白およびポリペプチドならびにそのアナログおよび
突然変異体を^む。
本明細書〔゛使用するrN−末端伸S−1なる語は、N−末端で開始し、コア蛋
白の一部分てはない最初の約45個までのアミ2)酸をいう。
本明細書で使用する[ブt″J1;ラッグ]なる語は、生物学的に望ましい部分
が薬物と(2で有用な生物学的活性蛋白である融合蛋白をいう。
本明細書で使用゛4る「生物学的活性蛋白」および「生物学的活性ポリペプチド
」なる語は、生物学的活性を有する互換可能な蛋白およびポリペプチドをいう。
本明II]盲て使用4−る1所望の蛋白」および「望ましい蛋白」なる語は、純
粋な11態て要求される互換可能な蛋白およびポリペプチドをいう。
本明細書で使用するl−伸長部分1なる語は、N−末端伸長であって、生物学的
に望ま第1る部分の一部分てはない融合蛋白の部分をいう。
本明細書で使用するII)PPIV切断可能なN−末端伸長部分」なる語は、D
P P ■による段階的切断によ−、て除去され得るアミノ酸配列を有する融
合蛋白の伸長部分をいう。
配列リストの節においで、いくつかのアミノ酸残基は、Seq IDにおいてX
aa表iL、た。以−トの表伯が用いられる
Seq TD No、 3では、Xaa29はC−末端ア2ト化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 4では、Xaa 29はC−末端アミド化アルキニニル
残基を表す。
5eq ID No、 5では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残基
を表す。
Seq ID No、 14では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 18では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq iD No。19では、Xaa33はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 20では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 21では、Xaa4SはC−末端アミド化アルギニニル
残基を表す。
Seq ID No、 24では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 25では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq 10 No、 26では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 27では、Xaa”はC−末端アミド化アルキニニル残
基を表す。
Seq TD No、 28では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 29では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 30では、Xaa35はC−末端アミド化アルギニニル
残基を表す。
Seq ID No、 31では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq TD No、 32ては、Xaa ”はC−末端アミド化アルギニニル
残基を表す。
Seq ID No、 33では、Xaa ”はC−末端アミド化アルギニニル
残基を表す。
Seq 10 No、 34では、Xaa43はC−末端アミド化アルギニニル
残基を表す。
Seq 10 No、 35では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 36では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 37では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 38では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 39では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 40では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 41では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 42では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
Seq ID No、 43では、Xaa”はC−末端アミド化アルギニニル残
基を表す。
本発明は、改良された蛋白およびポリペプチドに関する。本発明によると、生物
学的活性ポリイーイチ1ごは、まず、コア蛋白部分を表す第1部分。およびカル
ボヤ=2.末端で該第1の部分のアミ5ノ末端に共有結合し九N−末端伸長部分
の第2部・→の2の部分を含有A−る融合蛋白として得られる。、融合ポリペプ
チドのN−末端伸1部分は、それをンペプ千、・ルベゾ千ダーセrV (DPP
TV)によ−)で切断される、17″)に−4−るアミノ酸配列を有オろ。
般発明の融合蛋白は、式
伸長部分−コア蛋白融合
1式中、[伸長部分口はDPP Th切断可能なN−末端伸長を表し、r−jは
共有ベブ千i、結合を表(−4「コア蛋白部分1はDPP 11′ブロセツソン
グに〕、っこ伸長部分から遊離されるいずかの所望のベブ千トを表11で示され
る。
本発明の融合蛋白の伸長部分は、式
%式%))
[式中、Aは任W?″あり、存在する場合はメザオニンであり。
i]は連続して結合したX’−’I’基の数を表
【ッ、当該数はかかる基の0〜
20個、好ましくは()〜10個の基を表し5
Xはすべでの天然γE 、/酸からなる群から選択され。
)−は、n = (itである場合に)゛が了−ラニン、セリンおよびトレオニ
ンからなる群から選択される以外は、プロリン、アラニン、セリン、およびトレ
オニンからな5群から選択され、
Xoはプロ1じまたはヒドロキシ・プロ1し・以外のすべての天然アミノ酸から
なる群から選択される]
て示されるアミノ酸配列を有する。
該式によると、n=1である場合、2個のY基が存在する。さらに、単一の具体
例において21個までの)゛残基および20個までのX°残基を有するのが可能
である。個々のY残基およびX゛残基、各々、それらが選択される群のいずれの
残基てあってもよい。すなわち、個々の)゛残基の全ては、所与の具体例におい
て同一である必要はない。同様に、1個を超えるX゛残基有する具体例では、存
在する個々の各X゛残基、他のX°残基がいずれの残基であるかに拘わらず、プ
ロリンおよびヒドロキシプロリンを除くいずれかのアミノ酸であり得る。個々の
各YおよびX゛残基、各々、特定の基についての約束に従わねばならず、特定位
の種々の個々の残基が前記した約束に従えば足りる。
(A)がメチオニン(Met)として存在する融合蛋白は、イー・コ’) (E
、 colt)での組換えDNA法による生物学的活性蛋白の生産に有用な配列
を表す。これらの前駆体に存在するMet配列は、通常、イー・コリの酵素系ま
たは当業者がなし得るいくつかの他の手段によって処理されるであろう。通常の
環境下、イー・コリにおける蛋白合成は、Netをコードする翻訳開始コド〉・
AUGで開始する。その結果、新しく合成されたポリペプチドはそのN−末端ア
ミノ酸としてメチオニン残基を有する。イー・コリは、Met N−末端残基が
Gly、AlaまたはSerならびにProのような比較的小さい側鎖を持つア
ミノ酸に隣接する場合1=N−末端Metを効果的に除去できる能力を有する酵
素活性を有する。N−末端Netの高特異的除去はMetの臭化ンアン媒介切断
を用いて達成できる。しかしながら、その手法が首尾よくなされるためには、当
該N−末端Metは全蛋白配列中における唯一のMetでなければならず、さも
なければ、該切断は当該配列中の各MetO後で起こる。従って、内部Met配
列を含有する融合蛋白については、Metがイー・コリ酵素系によって切断され
るべきものであれば、N−末端からの第2のアミノ酸はPro、AlaまたはS
erでなければならない。
融合ポリペプチドに加え、本発明は、該融合ポリペプチドをコードするDNA配
列よりなる組換えDNA分子;所望のポリペプチドを精製する方法を含めた該融
合ポリペプチドを使用する方法、ならびにin vivoにてのN−末端伸長の
段階的蛋白分解によって前駆体から生物学的に活性な形態に変換されるプロドラ
ッグを投与することを特徴とする薬物の送達方法に関する。
融合蛋白の生産は、共に当業者によく知られた標準的ペプチド合成技術または組
換えDNA技術を用いて達成できる。ペプチド合成は約50個またはそれ未満の
アミノ酸よりなるポリペプチドの作成方法の好ましい方法である。大きい分子に
ついては、組換えDNA技術を用いる宿主細胞にての産生が好ましい。
DPPIVによって認識され切断されるN−末端部分を含有する融合ポリペプチ
ドは、コア蛋白部分のみよりなる非修飾ポリペプチドよりも有用かつ有利である
。本発明は、2の領域の特定の利用を記載する。第1の使用は、DPP IV切
切断可能−末端伸長に共有結合的に連結した薬剤として有用である生物学的活性
ポリペプチドんらなる「プロドラッグ」なる融合ポリペプチドである。このプロ
形態は、該プロドラッグを投与されたヒトまたは他の動物の体内のDPP IV
によっての切断に際し生物学的活性形態に変換され得る。従って、本発明は、プ
ロトラングとして有用な融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの医薬品製造にお
ける使用、および生物学的活性ポリペプチドを患者に送達する方法に関する。本
発明の融合ポリペプチドの第2の使用は、N−末端伸長が精製法を効果的とする
ポI;ペプチドの成分中にあり、次いで、N−末端伸長がDPP IVを用いる
切断によって除去可能蛋白精製法である。従って、本発明は、精製手法で有用な
融合ポj1ベブチl−および所望のポリペプチドの精製法に関する。これらの使
用は本発明の詳細な説明する例であるが、断じて本発明を限定する意図のもので
はない。
両使用については、DPP TV活性によって融合蛋白のコア蛋白部分を伸長部
分から遊離させる。精製法で用いる融合蛋白の場合、コア蛋白はDPP rV切
断についての基質であるのは望ましくない。すなわち、伸長部分が除去されてし
まった漫にコア蛋白をDPP■が切断できないのが好まし7い。しばしば、コア
蛋白がI)PPrVPr下ある場合、それがプロトラングとして送達されるのが
最も好まLi)、、かかる場合、プロトラングはコア蛋白の持続的存在を生じる
。というのは、】n〜ivoて見い出される(例えば、血漿、腎臓組織および肝
臓組織中)DPPI〜′のいくつかはN−末端伸長を行う、従−)で、コア蛋白
の段階を遅延させるの1−使用されるからである。すなわち、融合蛋白の伸長部
分はD))PrVについてLl)基質および競合的阻害剤として作用でき、DP
PIVのコア蛋白に対する作用を遅ら士!、是れによ、−1てコア蛋白を一時的
に保護する。
本明細書で用いる「プロドラッグ」なる語は、薬物として有用な生物学的活性ポ
リペプチドであるコア蛋白に共有結合したDPP mV切断可能N−末端伸長を
含有する融合蛋白を意味する。本発明によるプロドラッグは、個々のプロ形態と
して、あるいは他の化合物と組み合わせて投与できる。好ましい具体例はプロド
ラッグの十分にはっきりとした個々の形態である。いずれの場合にも、該プロ形
態は体内で通常見い出される天然DPP IVによって加工される。
医薬製剤にてプロドラッグを投与する利点は、生物学的活性蛋白の活性を遅らせ
るおよび/または生物学的活性蛋白の存在延長を生じさせることにある。プロド
ラッグは非修飾分子よりも長く活性でいられる。プロドラッグは、伸長部分の実
質部分が分解され、当該分子が活性となる時の経過まで非活性状態で存在できる
。従って、プロドラッグは遅延薬物送達系として作用し得る。さらに、その長さ
およびアミノ酸配列に存在する特異的残基に応じて、異なるN−末端伸長は異な
る速度で分解する。種々のN−末端を有するプロドラッグの異なる形態の組合せ
は、長期間にわたり、患者にて持続的定常レベルを提供できる。従って、プロド
ラッグは時間遅延薬物送達系として作用し得る。
前記したごとく、ある残基がある位置を占めていれば、DPP rVはポリペプ
チドのN−末端からンペプチドを切断除去する。
本明細書で用いる「1位」なる語は、N−末端におけるアミノ酸残基位置をいう
。本明細書で用いる「2位」なる語は、1位に直ぐ隣接し、N−末端から第2番
目であるアミノ酸残基位置をいう。本明細書で用いる「3位」なる語は、2位に
直ぐ隣接し、N−末端から第3番目であるアミノ酸残基位置をいう。N−末端ノ
ペプチドを除去する切断は、アミノ酸3がプロリンまたはヒドロキシプロリンで
なくてアミノ酸2がプロリン(Pro)、ヒドロキシプロリン(Hyp)、ア%
−:> (A l a) 、セリン(Set)、またはトレオニン(lhr)の
5種のアミノ酸のうちの1ってあれば、2位および3位間で起こる。
4のアミノ酸残基が2位に存在するか否かに応じ、I)PPIVは異なる速度N
−末端残基を切断する。はとんどの場合、2位がProによって占められている
場合に最も効用的にDPP IVは切断し、2位がAhaによって占められてい
る場合に次に効果的である。1位がチロシン、フSニルアラニンまたはヒスチジ
7によって占められている場合、2位がP r OまたはAlaによって占めら
れていればDPP■は略同速度で働く。、DPP rVは、2位がSerによっ
て占めら第1ている場合に次に効果的である。Thrが2位を占める場合最も効
果がない。
二の情報を用い、種々のN−末端伸長を設計することができ、それらは異なる速
度て加J−される。かくし、て、特異的プロドラ・ノブまたはプロドラッグ形態
の組合せいずれかからなる医薬品を投与することができる。N−末端伸長の−そ
ろいを持つプロドラッグは、各々、そのアミノ酸配列に応じた速度で加工され得
る。
プロドラッグ形管のこの組合せは、時間経過により活性ポリペプチドに加工され
る一連のゴロドラ・グよりなるものに処方できる。
長さおよびアミノ酸配列残基のつくりは、DPP rVV断速度の制御因子であ
る1、全ての、あるいはほぼとんど全ての改変Y=Proを含有する伸長は最も
速東加工される一方、Y=Tbrをa゛有するものは最も遅く加工される。加え
て、XがGluまたはAspいずれかであるノペブチンル単位X−Prof!X
が中性または塩基性アミ人酸残基であるその対応単位よりもかなり遅く切断され
る。伸長は半該伸長における各切断位置において(4つのうちの)異なる残基よ
りなる二・とができるので、非常に多数の変形および改変が存在し得る。
いずれの生物学的活性ポリペプチドもポリペプチド薬物として使用できる。ここ
に引用して一体化させるPCT特許出願PCT/US90102923、ここに
引用して一体化させるPCT/US91108248、およびここに引用して一
体化させる米国特許出願07/368231は、各々、本発明のプロドラッグと
して医薬製剤で使用できるウソ成長ホルモン放出因子アナログを開示する。これ
らの出願で教示されるいずれのアナログも、本発明の融合蛋白のコアペプチド部
分として使用できる。伸長部分に連結したかかるコア蛋白よりなる融合蛋白はよ
く知られた方法を用いて当業者が生産できる。
未発明の具体例の他の例はホルモン、し・セプター、酵素、貯蔵蛋白および血液
蛋白を包含する。特別の例は、血管作用性腸管ペプチド(VIP);ヒトβ−カ
ッモルフイン:胃酸分泌抑制ペプチド(GNP);胃酸放出ペプチド(GRP)
;ヒト・ペプチドH1゜ヒト・ペプチドYY、グルカゴン様ペプチド−1の断片
7−37 ;グルカゴン様ペプチド−2,サブスタンスP、ニューロペプチドY
。
ヒト・バンクレアチンポリペプチド、インスリン様成長因子(IGF−1):ヒ
ト・成長ホルモン(hGH);ラン成長ホルモン(bGH);ブタ成長ホルモン
(pGH):プロラクチン(PRL)lヒト、ラン、ブタまたはヒツジ成長ホル
モン放出因子(GRF);インターロイキン−1β(1−1β);EGF+IG
F−2+グルカゴン、コルチコトロピン放出因子(CRF);ダイラルフィン、
ツマトス々チン−14:エンドセリン、トランスフ吋−ミング成長因子α(TG
F−α)、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β):インターロイキン
ー4:インターロイキン−6,神経成長因子(NGF);腫瘍壊死因子(TNF
):インスリン;腺維芽細胞成長因子(FGF):インターフェロン;CD4
:およびインターロイキン−2(TI、−2)またはその合成または生合成アナ
ログを包含する。これらのポリペプチドもまた本発明の融合蛋白のコア蛋白部分
を形成するのに使用できる。これらのポリペプチドは具体例の例としてのみ供さ
れるもので、本発明に範囲を限定することを意図しない。
本発明の小融合蛋白は、例えば、PCT/US90102923および07/3
68231に詳細に記載されているごと(、アプライド・バイオシステムズ(A
pplied Biosystems) 430 Aペプチド合成器(アプライ
ド・バイオシステムズ、フォスター・フイティ(Foster C1ty)、カ
リフォルニア州)を用い、固相法で合成できる。
大分子については、組換えDNAを用いる宿主細胞での産生が好ましい。組換え
DNA技術を用いて融合蛋白を生産しようとする当業者が利用できるいくつかの
異なる方法がある。典型的には、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を発現
ベクターに挿入し、次いて、これを用いて適当な宿主細胞を形質転換するか、あ
るいはトランスフェクトする。次いで、挿入された遺伝子を宿主で発現させ、所
望のポリペプチドを得る。同様に本発明の融合ポリペプチドを得るには、付加的
D N A配列を遺伝子イン−Q−)に含ませる。特別には、N−末端伸長残基
をコードするDNAを、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の5′端部に作
動可能に連結させる。この付加的遺伝物質は、プロモーターの制御下となるよう
に、発現ベクターのプロモーターの下流に入れなければならない。加えて、発現
された蛋白産物が所望のポリペプチドに共有結合したN−末端伸長を誘導するよ
う、当該遺伝子に対して適当な解読枠にて入れなければならない。
f〆一、て、組換えi) N A技術を用いて本発明の融合蛋白を生産するには
、所望のN−末端伸長のアミ5ノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを設計
しなけれがならず、これらのオリゴヌクレオチドはコア蛋白部分をコードする当
該遺伝子の;5゛端部のL流に挿入しなければならず、ニオ1でキメラ遺伝子が
生成する。
プロドラッグとしての融合蛋白の利用に加えて、本発明は、生物学的活性組換え
ポリペプチドの精製および加工に関する。最も好ましくは、所望の生物学的活性
組換えポリペプチドは可溶性形管で産生されるか、あるいは宿主から分泌される
。本発明によると、融合蛋白の伸長部分は精製手段によって認識され得る。融合
蛋白は、含有される分泌媒質または抽出溶液に存在する物質から精製され、次い
で、コア蛋白部分から伸長部分を除去し、かくして、精製された所望の蛋白が得
られる。従って、本発明の融合蛋白に最も適した所望の蛋白は、それ自体DPP
■切断についての基質でないそれらの生物学的活性ポリペプチドである。
本発明によると、所望の蛋白につきコードする遺伝子配列を単離し、合成するか
、あるいは他の方法で得、伸長部分をコードするDNA配列に作動可能に連結さ
せる。伸長部分をコードするDNA配列に作動可能に連結した所望の蛋白につい
ての遺伝子を含有するハイブリッド遺伝子をキメラ遺伝子という。
キIう遺伝子および組換えベクターを調製し、それを用いて宿主細胞を形質転換
もしくは1−ランスフェクトし、宿主細胞でベクターを複製させ、生物学的活性
外来ポリペプチドを発現させるための方法および材料は、ブリンブルズ・オブ・
’、/ −>”?−1−、:Lビュレー7a > (Principles o
f Gene Manipulation)、オールド0アンド・プリムローズ
(Old and Primrose)、第2版、1981およびザムブルック
(Sai+brook)ら、モレキュラー・クローニング(lloleeula
r Cloning)、第2版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラホラトリ
ー・プレス(Cold Spring HarborLaboratory P
ress)、ニューヨーク(1989)に記載されており、ここに引用して一体
化させる。
本発明は、融合蛋白をコードする組換えキメラ遺伝子、それを含有する発現ベク
ター、これらの発甲ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主、およ
びこれらの遺伝子、発現ベクター、および該ベクターで形質転換またはトランス
フェクトした宿主を得る方法に関する。
形質転換またはトランスフエフ+−した宿主細胞で組換えDNA技術の産物とし
て発現できるいずれの原核生物または真核生物蛋白を精製するのにも本発明を用
いることができる。これらの組換え蛋白産物はホルモン、レセプター、酵素、貯
蔵蛋白、血液蛋白、プロティンエンジニアリング技術による突然変異蛋白、また
は合成蛋白を包含する。産生される所望のポリペプチドはHIV RNAアーゼ
H,t−PA、、I 1.、−1、IL−ルセブター、CD4、ヒト神経成長因
子、5CD4−PE40、ヒト呼吸ンンノチウムウイルス(R3V)FGキメラ
糖蛋白(ここに、引用して一体化させる米国特許出願07/743780参照)
、EGF、ICF−1、IGF−2、グルカゴン、コルチコトロピン放出因子(
CRF) 、ダイノルフィン、エンドセリン、トランスフォーミング成長因子α
(TGF−α)、シュードモナス属エンドトキンン40 (PE40)、トラン
スフォーミング成長因子−β(TGF−β)、インスリンおよびそれらのアナロ
グを包含し得る。
精製法の例はIMACおよび免疫アフィニティーを包含する。DPP TVを使
用して除去できる伸長ペプチドの使用を用いることができる他の手段は本発明の
範囲内にあると考えられる。
本発明の1の具体例において、生物学的活性ポリペプチド部分および金属キレー
ト化ペプチドである伸長部分を含有する融合蛋白は固定化金属アフィニティーク
ロマ1−グラフィー系で有用である。
蛋白分画用の固定化金属イオシ了ソイニティークロマトグラフィー(IMAC)
はまずポラス、ノエイ(Porath、 J、 )ら[ネイヂ+ −(Natu
re)、258:598−599(1975)によって開示された3、ポラス(
Porath)は、イミドニ酢酸(I DA)で樹脂を誘導体化させること、お
よび金属イオンをIDA−誘導体化樹脂にキレ−1・結合させることを開示して
いる。ポラス(Porath)は、固定化金属イオンを含有するカラムノX:蛋
白が固定化され得ることを開示している。それは、通常に使用されているイミド
−酢酸(IOA)をマi・リンクスに付着させ、続いて、金属イオ〉を含IDA
樹脂にキレ−1・化させることを含む。該蛋白は、電子を供給できるアミ/酸残
基の官能基を通じて金属イオンに結合する。可能な電子供与アミノ酸残基は/ス
ティン、ヒス千/ン、およびトリプトファンである。蛋白は、電子供与性側鎖を
も一つ】またはそれを超えるこれらのアミノ酸を通じて金属イオンと相互作用す
る。
二こj−引用して一体化させる米国特許4569794号にて、スミス(Smi
th)らは、ある種のアミノ酸残基が固定化金属イオンに蛋白を結合させる要因
であると開示している。しかしながら、ヒスチジン側鎖が結合に関与していると
、pHを低トさせることによりて、あるいはイミダゾールのごとき競合的対リガ
ンドを用いることによって結合蛋白を溶出させることができる。蛋白におけるヒ
スチン2をへ有する。7−または[・リペブ千トが、IMCAが選択的精製技術
であることを示すために使用されている。従って、スミスらは、所望のポリペプ
チドに共有結合した金属キレ−1・化ペプチドよりなる融合蛋白を生産するため
の組換えDNA技術の使用を開示している。金属キレート化ペプチドは所望のポ
リペプチドを取り扱うのに効果的な伸長部分である。この取扱は蛋白の精製で使
用することができる。
改変Hi s残基を有する金属キし・−ト化ペプチドでのIMCA技術の使用は
、ここに引用して一体化させる米国特許出願071506605に開示されてい
る。
米国特許用in 071506605は、金属キレート化ペプチドが3〜6の改
変Hi s残基よりなる場合、融合蛋白ののIMCA精製で予期せぬ優れた結果
を生む特異的金属キレート化ペプチドを開示している。米国特許出願07150
6605および米国特許第4569794号の教示により、DPP TV認識配
列の構成である少なくとも3つの改変ヒスチジンをもつ金属主1ノート化ペプチ
ド部分を有する融合蛋白の精製に通常使用されるIDA樹脂を用いることが可能
である。
融合蛋白の構築およびIMAC系でのその使用は米国特許第4569794号に
より教示される。改変Hi s残基よりなる金属キレート化ペプチド部分の構築
および使用は米国特許出願071506605号に教示される。改変Hi s残
基間の残基を認識できるDPP rVを融合蛋白に供することによって、本発明
は、IMCA技術を仕様して精製でき、続いてDPP IVで加工して所望のポ
リペプチドを得ることができる融合蛋白を提供する。
本発明のこの具体例により、伸長部分が式。
A−X−Y (X’−Y)、
によって表すことができる金属キレート化ペプチドであり、ここに、Aは任意で
あって存在すればメチオニンであり。
nは連続的に連結するX’ −Y基の数を表し、その数はかかる基の0〜20、
好ましくは0〜10基を表す。
Xはすべての天然アミノ酸よりなる群から選択され;Yはプロリン、アラニン、
セリン、およびトレオニンよりなる群から選択され、ただし、n=0である場合
、Yはアラセン、セリン、およびトレオニンよりなる群から選択される。
X゛ はプロリンおよびヒドロキシプロリンを除(すべての天然アミノ酸よりな
る群から選択され。
ここに、少なくとも2〜3個のX”表示残基および、所望により、Xはヒスチジ
ンである。好ましくは、YはProであってnは少な(とも3である。DPP■
で処理した場合、N−末端伸長は段階的に切断され、生物学的活性ポリペプチド
を生じる。ただし、生物学的活性ポリペプチドはDPP IV基質自体ではな融
合蛋白の1の例は、式
Hi s−Y (Hi sY> 。
[式中、n=3、YはPro、Hyp、A、la、SerまたはTbrであって
、Proが最も好ましい]
を有する伸長部分を包含する。融合蛋白のもう1つの例は、式:%式%)
E式中、nは3〜8、Xはいずれかの天然アミノ酸;YはPro、Hyp、Al
a。
SerまたはThrであって、Proが最も好ましい]を有する伸長部分を包含
する。
N−末端Metはイー・コリにおける蛋白合成の結果であって、隣接アミノ酸が
Pro、Gly、AlaまたはSerである場合にイー・コリ酵素系によって加
工されることは公知であるので、以下の伸長はIMAC精製および組換えDNA
技術によってイー・コリにて細胞内で発現される生物学的活性ペプチドまたは蛋
白の切断て有用な配列を表す。
Me t −X−Y (Hi s −Y) 。
ここに、n=3−8、XはPro、GlySSer、またはAla;およびYは
Pro、Hyp、、Ala、Set、またはThrであって、Proが最も好ま
しい。
もう1つの例において、所望のペプチドまたは蛋白が形質転換およびl・ランス
フェクノヨンの後に所与の宿主から分泌されるべき場合、X−Y −(Hi s
−’i”)。
[式中、N−3〜8、Xは所与の宿主からの分泌系に適合するいずれの天然アミ
ノ酸であってもよく、)”はP r 01Hyp、A] a、Ser、またはT
hrを意味する]
のごとき、輸送を芥易とする伸長部分を用いて蛋白またはポリペプチドを分泌す
るようにヘクターを設計することができる。
融合蛋白を用い、DPP TV加工技術に適するもう1つの蛋白精製系は免疫ア
フィニティー精製である。ここに引用して一体化させるホップ(Hopp)らに
1988年11月1日に発行された米国特許第4782137号は、高抗原性N
−末端部分およびC−末端部分の所望のポリペプチドを有する融合蛋白の合成を
開示している。ホップ(llopp)らによると、融合蛋白の抗原性部分を認識
する固定化抗体を含有するカラムに粗製上澄みを通すことによって、融合蛋白を
該粗製上澄みから精製する。次いで、カラム条件を変化させて抗原−抗体複合体
の解離を起こすことができる。
本発明によると、融合蛋白の高抗原性N−末端部分は、DPP IV認識可能残
基を含有する伸長部分である。ホップ([1opp)らの記載のごとき収集の後
、本発明の融合蛋白はDPP IVに暴露することができ、それにより、伸長部
分を除去する。当業者ならば本発明のN−末端伸長でホップの免疫アフィニティ
ー精製を行うことができる。
本明細書中に記載する具体例および実施例は本発明の性質を記載するもので、本
発明の範囲を限定するものではない。考えられる等価なものは、伸長の除去が手
段の組合せによるような少なくとも1の他の手段によって加工できるN−末端残
基を有する融合蛋白を包含する。また、考えられる等価なものは、化学的修飾ア
ミノ酸残基よりなる融合蛋白を包含する。
実施例
実施例IDPPrV基質であるコア蛋白を有する融合プロドラッグである合成プ
ロドラッグ
プロドラッグとして合成および投与され得る融合ポリペプチドは、生物学的活性
ポリペプチドのN−末端に共有結合したDPP TV分解されうるN−末端伸長
を有する。これらのプロドラッグの式は式伸長部分−コア蛋白薬物部分
[式中、「伸長部分」はDPP TV切断されうるN−末端伸長を表し、「−」
は共有ペプチド結合を表し、「コア蛋白部分」はDPP IVプロセシングによ
って伸長部分から遊離されるいずれかの所望のペプチドを表すコで示すことがで
きる。この実施例では、融合蛋白のコア蛋白は伸長部分の除去にたずされるDP
P IVに関する有効な基質である。
合成ブロトラノゲは当該技術分野でよく知られているペプチド合成技術を使用し
て製造され得る、。
1つの具体例では、コア蛋白部分は表皮成長因子(EGF)であり、伸長蛋白は
Gly−Pro−Phe−AlaであるGly ’ −Pro−3−Phe−2
−Ala−’−4EGFコ。
別の具体例では、コア蛋白部分はグルカゴンてあり、伸長蛋白はAla−Pro
−Phe−Alaである
、へIa ’−Pro−3−Phe 2−Ala−’−[GI−UCAGONI
。
別の具体例では、コア蛋白部分は[A1a16Leu27] −bGRF(12
9)NO3(Seq I D 3)であり、伸長部分はTyr−AlaであるT
yr2−Ala−’−([A1a15Leu”]−bGRF(1−29)NH2
+。
実施例2DPPIV基質でないコア蛋白を有する融合蛋白である合成プロドラッ
グ
プロトヨ・りとして合成および投与され得る融合ポリペプチドは、生物活性ポリ
ペプチドの凡−末端に共有結合し5たDPP rV分解されうるN−末端伸長を
有する。これらのプロドラ戸グに関する式は式伸長部分−コア蛋白薬物部分
[式中、「伸長部分」はDPP rV分解されうるN−末端伸長を表し、「−」
は共有ペプチド結合を表し、「コア蛋白部分」はDPP IVプロセシングによ
って伸長部分から遊離されるいずれかの所望のペプチドを表す]て示すことがで
きる。
合成プロドラッグは当該技術分野でよく知られているペプチド合成技術を使用し
て製造され得る。
1つの具体例では、コア蛋白部分はbGRFア+ログである[Va12.5er
8・28゜Leu”]−bGRF(1−33)OH(Seq ID 1)であり
、伸長部分はG 1y−Pro−Tyr−、Alaである。
G 1y−4−Pro−” −Tyr−2−Ala−’ −([Va12S e
r8・28Ala” Leu”]−bG RF(1−33)OHI。
別の具体例では、コア蛋白部分は副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)であ
り、伸長部分はGly−Pro−Phe−AlaであるGay−’−Pro 3
−Phe−2−Ala−’−[CRFコ。
別の具体例では、コア蛋白部分はダイノルフィンであり、伸長部分はPhe−P
ro−Phe−Alaである
Phe−’ −Pro−’ −Phe−2−Ala−’−[D YNORF I
N]。
別の具体例では、コア蛋白部分はソマトスタチン−28であり、伸長部分はGl
y −Pro −Phe −ProであるGlr’−Pro ’−Phe−2−
Pro−’−[SOMATO8TATIN−28]。
別の具体例では、コア蛋白部分はエントチリン(endothelin)であり
、伸長部分はAla−Pro−Phe−Alaである:Ala”−Pro−3−
Phe−2−Ala−’−[ENDOTHELIN]。
別の具体例では、コア蛋白部分はbGRFアナログである[ I 1.e2S
er8・2sAlaI5Leu”]−bGRF(1−40)OH(Seq ID
2)であり、伸長部分はPhe−Alaである・
Phe−2−Ala−’ −i[11e2ser””AlaI5Leu”コーb
cRF(1−40)OHI。
別の具体例では、コア蛋白部分は[11e2A1a”Leu27]−bGRF(
1−29)NO3(Seq I D 4)であり、伸長部分はTyr−8erで
ある:Tyr2− Ser’ −1[11e2A1a15Leu”3−b G
RF (1−29)NO21゜実施例3 bGRFアナログであるLeu”−b
GRF(1−29)NO3の持続的存在
bGRFアナログであるLeu”−bGRF(129)NO3(その配列は5e
qlD5として示される)は、5eqlD5で示されるコア蛋白からなる薬物お
よび種々のN−末端伸長プロドラッグとして投与され得る。
プロドラッグの数種類の変形は、コア蛋白部分と(−で5eqlD5を使用して
よく知られている方法によって調製され得る。これらの5eqlD5をベースと
するブ0ドラッグに関する伸長部分はI 1e−Ala、 Gly −Pro−
+ 1e−Pro、5eqlD6.5eqlD7、Tyr−AlalGly−P
ro−Tyr−Ala、 5eqN)8.5eqlD9.5eqlD10.5e
qlD11.5eqlD12.5eqlD13、Tyr −A 1a−Tyr
−A laおよびVal−、Alaである。
実施例4 bGRFアナログである[Thr2Ala”Leu27コーbGRF
(1−29)N)−(2の持続的存在
b G RFアナログである[Thr”Ala”I−eu”コーbGRF(12
9)NH2(その配列は5eqlD14として示される)は、5eqll)14
で示されるコア蛋白部分からなる薬物および種々のN−末端伸長プロトラ・ノブ
として投与され得る。
名々、Tyr−Thr、 Tyr−3erおよびTyr−Thr −Tyr −
Thrの伸長部分を有するプロドラッグの3種類の変形を調製し5た。
実施例5 HIV RNasc HおよびN−末端伸長を含有する融合蛋白組換
えイー・コリ(E、coli)からキメラ蛋白を精製するための戦略は固定化金
属イオンに対し、て親和性を有する、交互にヒスチ/ンを含有する金属キレート
化ペプチドドメインに基づいて記載される。ベクターはコア蛋白としてHIVR
Nase Hを使用する融合蛋白の合成を指示するように構築される。以下に示
すとおり、これらの融合蛋白は、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(
IM、八C)による精製に関する交互になっているしスチ7ン、金属キレート化
ペブチF’(m c p )を除去するためのDPP rV切断に関する交互に
なっているプロリンまたは交互になっているアラニンを有するように設訂される
。
本発明の好まし、いDPPTV切断されうるN−末端伸長を以下に概略記載する
:融合蛋白HIVRH/mcpg1は旧V RNase Hに結合した5eql
D15のN−末端伸長からなる
\1et−” −Pro” −Ala−’ −Hls−8−Pro−’ −Hl
s6−Pro−5−His−’ −Pro−3−His−2−Ala−’−[H
I V RNase Hl。
融合蛋白HIVRH/mc+)#2はHI V RNase Hに結合した5e
qlD16のN−末端伸長からなる
Met−■=A la” ’ −Pro−’ −His−’ −A la−’
−His−’ −Ala−’ −His−’ −Ala−3−His−2−Al
a−’−[HI V RNase Hl。
融合蛋白HIVRH/mcp#3はHI V RNase Hに結合した5eq
lD17のN−末端伸長からなる:
Met−” −Gly−” −Pro−’ −His−’ −Pro−7−Hi
s−’ −Pro−5−His−’ −Pro−3−Hjs−2−Ala−’−
[HI V RNA5e Hコ。
これらの融合蛋白は、イー・コ1バE、coli)中でクローン化および発現さ
れ、DEAEクロマトグラフィーおよびRP−HPLCを使用して精製される。
N−末端配列決定を使用して、融合蛋白を特徴付ける。交互になっているヒスチ
ジンを含有する融合蛋白の、IMACによる組換え蛋白の精製、次いで、DPP
rVによるN−末端伸長の除去への適用は、本発明の利用性を確証する。
HI V RNase H遺伝子を含有するキメラ遺伝子の構築全ての組換えD
NAを標準的な方法によって作製する。金属キレート化ペプチド/切断配列に相
当するオリゴヌクレオチドを構築、精製、アニール化し、HIVRNAseHを
コードしている遺伝子に連結してキメラ遺伝子を形成する。
交互になっているヒスチジン/DPPrV認識された切断残基/HI V−RN
aseHをコードする発現ベクターを作製するために、キメラ遺伝子を最終発現
ベクターに挿入する。キメラ遺伝子構築物を含有する発現ベクターを使用して標
準的な方法によってイー・コリを形質転換する。イー・コリにおける遺伝子の発
現の結果、キメラ遺伝子によってコードされた融合蛋白が生産される。これらの
融合蛋白は、HI V RNase Hアミノ酸ならびに交互になっているヒス
チジン(金属キレート化ペプチド)および交互になっているプロリンまたはアミ
ジンを含有するN−末端伸長を含有する。
粗製イー・コリ抽出物の調製および配列決定のための融合蛋白の単離イー・コリ
細胞ペースト約39を、1真M/チオトレイトール(DDT)、EDTA。
フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、およびベンズアミジンH
CI。
1019/(アプロチニン、ロイペプチンおよびヘスタチンを含有する0、25
Mリン酸カリウム(pH7,2)30wfに懸濁させる。この懸濁液を、フレン
チプレスを介して3回通過させて細胞を破壊する。細胞溶解物を12.000r
pmで1時間遠心する。上清を除去し、固形硫酸アンモニウムを飽和度70%ま
で添加する。1時間撹拌した後、腎濁液を12. OOOrp+aで1時間遠心
する。上演を廃棄し、ベレットを、1mM DTT、PMSFおよびベンズアミ
ノンを含有する5emMhリス(Trjs)(pH7,5)2.25mlに再溶
解する。次いて、4℃で一晩、該溶液を2Q@Mhリス、50gM CaC1,
1++M DTT、10%グリセロールおよび01νM EDTA(pH7,5
)(緩衝液A)中で透析する。透析物を収集し、緩衝液Aの1容量で希釈し2、
緩衝液A中で平衡化して洗浄したDEAEセルロースのHbfカラム1丁適用す
る。ランスルー(run through)を回分式で収集し7、カラトを緩衝
液A 5011てさらに洗浄(−7た。これらの溶液を収集し、プールし、70
%硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮し、緩衝液A2m1に再懸濁し、前記と同
様に透析する。N−末端配列分析による特徴付けのために濃縮したRlIを使用
する。
IMACを使用する融合蛋白の精製
粗製抽出物からの組換え蛋白の精製のための金属キレート化ペプチドを使用する
b]能性は、モデル蛋白としてHI V RNase Hと一緒に組換えイー・
コリにおいて発現される以下のキメラ体(chimerics)を使用すること
によって示すことができる。融合蛋白HIV RNase H/mcp#1、H
I V RNase H/mcp#2およびHI V RNase H,/m
c p # 3が各々精製される。
I N、j A Cカラムを以下のとおり調製する。ガラス濾過器上、ミリ(M
illi) −Q水てフフルマノア(Pharmacia)からのキレート化セ
ファロース高速流<Chelating 5epharose Fast F]
ow)を完全に洗浄し、た。次いで、ゲルを水に再懸濁してスラ1;−を形成す
る。該スラリーを容量6m(までのカラムカラム(ファルマンア)(IX7cm
)中に注意して注いだ。ゲルを固定した後、該カラムを50mM EDTA (
エチレンジアミン四酢酸)(pH8,0)5容量で洗浄する。次いで、該カラム
を0,2N NaOH5容量およびミリーQ水5容量で洗浄する。次いで、該カ
ラムに5eiM Ni504(またはZnCl2またはCll5O4)5容量を
充填する。最後に、カラムを平衡緩衝液5ベツド容量で洗浄する。平衡緩衝液は
、5001M NaCr、1mM PMSF、1mMベンズアミジン、1(bg
/lロイペプチンおよび10ss+/rアプロチニンを含有する201M トリ
ス(pH8,0)から調製される。
該カラムを少なくとも5容量の平衡緩衝液で平衡化した。粗製組換えイー・コリ
抽出物5〜1Qifを重力によってカラムに適用する。全ての粗製物質をカラム
に入れた後、該カラムを、500aM NaC/(pH8,0)の代わりに1.
0MNaCfを含有する平衡緩衝液10カラム容量で洗浄する。
次いで、カラムを、pH8,0で平衡緩衝液中増加濃度のイミダゾールで溶離す
る。初期実験について、各実験について多くの溶離を行ってキメラ体が溶離され
る濃度を測定する。その後、この溶離を簡素化し、通常、ちょうど3種類のイミ
ダゾール濃度を使用する 平衡緩衝液(pH8,0)中35mM、1100tお
よび30(bMイミダゾール。各イミダゾール緩衝液10ベツド容量を使用する
。溶離の間に、該カラムを平衡緩衝液10容量で洗浄する。最後に、該カラムを
50wM EDTA(pH8,0)5ベツド容量で剥離をして、いずれかの蛋白
がまだカラムに結合されているかを決定する。カラムに対する流速はL(bl1
分である。
各5Ifの両分を収集する。該カラムは室温で操作される。
商業的に入手可能なピアス(Pierce)蛋白アッセイキットを使用して試料
の蛋白含量を測定する。
ベセラ、ニス・ビー(Becerra、 S、 P、 )ら、FEBS 270
(1,2): 76−80(1990年9月)に開示されている方法によって、
HI V RNase H活性を測定する。これは本明細書中に引用記載する。
\−末端伸長した融合蛋白から成熟蛋白への変換蛋白1mg当たり520(bl
JO比活性を有する、ヒト胎盤から精製した商業的に入手可能なりPPIV(エ
ンザイム・システムズ・プロダクツ(Enzy+oe SystemsProd
ucts)、カリフォルニア州ダブリン)を使用する。IUは、pH7,8で1
分のうちに、合成基質であるAla−Pro−7−アミノ−4−2−)リフルオ
ロメチルクマリン1 uIIioleを加水分解することと等価である。酵素的
変換は、基質に対する酵素の比1・1100(/w)で、25℃で30分間、D
PP rVと一緒に1〜10ma/wNの濃度の融合蛋白(約1〜10(bg)
のインキュベーションによって行われる。IMACによって未切断融合蛋白から
所望のポリペプチドを回収する。
N−末端配列分析によって確実性を確認する。
実施例5 in vitroでのウソ血漿中でのbGRFアナログプロドラッグ
のプロセシング
第1表は、in vitroでのウソ血漿とのインキュベーション後に、3種類
のN−末端伸長アナログ Tyr’−Ala−’−Tyr−”−Ala−’−(
[Leu”]−bGRF(129)NH4I (Seq I D 19)、1i
e−2−Ala−’−([Leu27]−bGRF(1−29)NH4I (S
eq I D 18)およびTyr−”−Ala−’−([Leu”]−bGR
F(1−29)NH4I (Seq l D 25)から、コアペプチドである
[Leu”] −b G RF(129)NO3(Seq l D 5)の発生
を示す代表的実験を概略記載する。インキ、べ−7gン#:合物において検出さ
れる唯一の代謝物質はDPP−■関連切断の生成物であったものであった。
Tyr’−Ala−’−Tyr−2−Ala−’ −([Leu’)]−bGR
F(129)NH4I(Seq TD 19)は時間を越えて連続して、Tyr
−2−Ala−’−([1−eu”]−bGRF(1,29)NH□l (Se
q ID 25)、[Leu”]−bGRF(129)NO3(コアペプチド、
5eqlD5)、最後に[Leu”] bGRF(329)NO3(Seq I
D 24’)に変換された。
Tyr 2−Ala−1−1[Leu27コーーbGRF(129)NH4I
(Seq I D 25)は、[Leu”]川用GRF(1−29)NO3(、
コアペプチド、5eqlD5)に、次いで、[Leu”3−bGRF(329)
NO3(Seq ID 24)に変換された。コアペプチド自体である[Leu
”]−bGRF(1−29)NO3(Seq ID 5)は、血漿DPP−rV
によって[J−eu”] −bGRF(3−29)NO3(Seq ID 24
)に変換された。
実験で使用したH P L C条件下で他の代謝が観察されなかった場合でさえ
、ペプチド[Leu2)] bGRF(329)NO3(Seq ID 24)
が時間を越えて消失し、これは、他の非DPP−■関連蛋白分解も、有意に遅い
速度であるが、生じたに違いないということを示す。ここで示されたDPP−r
V切断されうるbGRFプロドラッグから生じたコアbGRFペプチドだけでな
く融合蛋白から生じたコア蛋白の半減期がウソ血漿と一緒に直接インキュベート
されたコアペプチド(Seq ID 5)の半減期と比較してin vivoで
有意に延長された(第1表)。さらにまた、該プロドラッグから放出されたコア
ペプチドが存在する時点は、プロドラッグ伸長長さとよく関連すると思われる。
伸長部分に4個のアミノ酸残基を有するプロドラッグ(Seq ID 19)か
ら生じた5eqlD5の半減期は5eqID 18または25におけると同様に
伸長においてアミノ酸を2個だけ有するproGRFsから誘導されたものより
も長かった。
実施例7 bGRFアナログプロドッグのin vivoおよびin vitr
o生物活性第2表に示すとおり、ホルスタイン種去勢ウシにアナログ5eqlD
18をiv注射すると、血漿成長ホルモン(GH)レベルは上昇した。体重1h
e当たり02nI!olの投与量で血漿中で誘発された成長ホルモンレベルを、
同一投与量のコアペプチド(Seq ID 5)を】■注射した後に生じる成長
ホルモンレベルと比較した。伸長ペプチド5eqlD18およびコアペプチド5
eqlD5の両者をGH放出についてin vit、ro下垂体細胞アッセイで
試験すると、伸長ペプチド5eqTD18はコアペプチド5eqlD5の固有力
価を約5%だけ有したことを強調するのは重要である。したがって、これら2つ
のペプチドの匹敵するinνivo活性は、コアペプチドがinνivoで伸長
ペプチドから放出され得たことを示すと思わわる。
第3表に示すとおり、伸長において4個のアミノ酸残基を有するb G RFプ
ロドラッグ(Seq ID L9)による処置についてin vivoで同一パ
ターンのG)l放出が観察された。第1表に示すとおり、in vitroでこ
れら2つのbGRFプロドラッグから生じたコアペプチドのin vitro半
減期における有意な差異にもかかわらず、伸長において4個または2個のアミノ
酸を有するプロドラッグ(各4、ペプチド5eqlD19およびSeq ID
18)による処置後のin vivo誘発GH放出において有意な相違はなかっ
た。10シ1シ0成長ホルモン放出は迅速であり、コアペプチド5eqlD5な
らびに5eqlD19および18について同一であり、b G RFγJ−ログ
による攻撃誘発の後のGHビークの時間の差異1才なかった。
これらの結果の我々の解釈は、10〜・ivoでのプロトラッグからの迅速なG
H放出が、きっと、血漿DPP−IV濃度よりも約100倍高い、全体的に高い
組織および器官DPP−IVレベルに依存するということである。これは、第1
表に概略記載されるin vitrn実験において観察された切断と比較し7て
in vivoでのプロドラソグプロセシングの速度の差異を説明するであろう
。改変された(延長された)成長ホルモン放出をあまり示さないが、そのプロド
ラッグ前駆体から得られるコアペプチドの半減期がin vivoで延長される
ことも可能性がある。in vivoでのGH放出がbGRFの刺激物質効果お
よびソマトスタチン(成長ホルモン放出抑制因子、5RIP)の抑制作用によっ
て調節されるのは知られている。モスリイ(Moseley)ら(ツヤ−ナル・
オブ・エンドクリノoン(J、Endocr、)、17.253−259.19
88)の給餌された去勢ウシ(meal−fed 5teer)モデルにおいて
、下垂体が給餌後と対比して給餌前にGRF攻撃誘発に対してより応答するとい
う理由で、給餌の2時間前に動物にGRFをiv注射した。腸/膵臓5RIFの
放出のような給餌に関連する因子は、下垂体のGHを放出する能力を妨げる。
すなわち、GHは5RIFオーバートーン(overtone)の間じゅうGR
Fの存在下でさえ下垂体から放出されないであろう。通常、攻撃誘発されない給
餌された去勢ウソモデルにおいて、血清GHaKは、給餌の5〜8時間後に別の
外因性偶発性GHパルスを伴うと給餌後3〜6時間(いわゆる、トラフ期(tr
ough period))の基本レベルに対して衰退する。給餌の2時間前の
GRF注射に応答して、GH応答は、5〜・20分以内に迅速に生じ、GHレベ
ルは基本ラインに戻る前に120〜240分間上昇したままである。ニオ1まで
に試験したGRFプロドラソゲの場合、第1の外因性GHビークだけが上昇し7
、第2のピークはいずれの処置効果も示さなかった。本発明者らの実験において
プロドラッグから得られたコアGRFの半減期は、コアペプチドを、外因性GH
のうち第2の外因性ノ\−ストを起こすのに充分な濃度で循環中に存在させるの
に充分に長く(通常、第1のバースト後4〜6時間)は延長されなかったかもし
れない。
−緒に、本発明者らの結果は、(i)DPP−IV−切断されうるN−末端伸長
を有するb G RFプロドラッグがDPP−TV媒介切断を介してin vi
vtoでウシ血漿中でコアペプチドを成功裏に生じるべくプロセシングされ;(
ji)プロドラッグから生したコアペプチドのin vitro半減期が充分に
長く、プロドラッグにおけるN−末端伸長長さの関数であり、(th)非常に低
い固有力価を有するbGRFプロドラッグがjn vivoでGHの放出におい
てコアペプチドと同等に有効であったという事実が、コアペプチドが予想された
ようにin vivoで得られたに違いないことを示すので、ここに記載した一
般的なプロドラッグ概念を支持する。
実施例8 Gly−’−Pro−3−11e−2−Pro−’I[Leu”]b
GRF(1−29)NH2]、トリフルオロ酢酸塩の調製
式GIy−Pro−11e−Pro−Tyr−Ala−Asp−Aha−11e
−Phe−Thr−へsn −S er−Tyr −Arg −Lys −Va
l −Leu −G ly −G in −Leu −Ser −Ala −1
へrg−Lys−Leu−Leu−Gln−Asp−11e−Leu−Asn−
Arg−NO3(CF 5COOH塩として)を有するGRFアナログペプチド
5eqlD26の合成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願
PCT/US90102923に開示されている方法Aに従って段階的方法で行
われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):Asp 4.16 (4):Th
r 1.07 (1):Set 1.81 (2);Glu 2.07 (2)
、Pro 1.98 (2);Gly 1.99 (2);Ala 2.99(
3):Val 1.13 (1)、lie 2.84 (3)、Leu 5.0
8 (5);Tyr 193 (2); Phe O,96(1): Lys
2.04 (2):Arg 2.97 (3)。
実施例9 Tyr−’−Ala−5−Gly−’−Pro−3−1ie−2−P
ro−’([Leu”]bGRF(129)NHzl、 トリフルオロ酢酸塩の
調製伸長部分として5eqlD6からなり、式: # 3 H−Tyr−Ala
−Gly −Pr。
−I le −Pro −Tyr −Ala −Asp −Ala −I le
−Phe −Thr −Asn −Ser −Tyr−Arg −L ys
−Val −Leu −G ly −Gin −Leu −Ser −Ala
−Arg −Lys −Leu−Leu−Gln−Asp−1ie−Leu−A
sn−Arg−Nl2 (CF3COOH塩として)を有するGRFアナログペ
プチド5eqlD27の合成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特
許出願PCT/US90102923に開示されている方法Aに従って段階的方
法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):ASTl 4.04 (4
):Thr 1.03 (1,);Ser 1.74 (2):Glu 2.0
5(2)、Pro 1.99 (2):Gly 2.00 (2):Ala 4
.01 (4);Val 128 (1)、Ile 2.84 (3)、Leu
5.09 (5)+Tyr 2.94 (3); PheO,97(1):L
ys 2.07 (2);Arg 3.00 (3)。
実施例1.OLys−’−Pro−’−Tyr−’−Ala−5−Gly−’−
Pro−”−Tie−” −Pro−’ t[Leu27コbGRF(129)
NH4I、 トリフルオロ酢酸塩の調製
伸長部分として5eqlD7からなり、式: Lys −Pro−Tyr−Al
a−Giy−P ro−11e −、P ro −Tyr −Ala−Asp−
A 1a−11e −Phe −Thr −Asn −Ser −T yr−A
rg−Lys −Val−Leu −G 1y−G in −Leu −5er
−A la −Arg−Lys −Leu−Leu −Gin −Asp −1
1e−Leu−Asn −Arg−Nl2 (CF 3COOH塩と1て)をr
iするGRFアナログベブ千ド5eqlD28の合成は、本明細書中に引用記載
する公開されたI) CT特許出願PCT/US90102923に開示されて
いる方法へに従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値)
: Asp 4.04 (4);Thr 0.95 (1): Ser 1.7
8 (2):Glu 2.04 (2)、Pro 2.9]、 (3):Gly
1.98 (2);Ala 3.91 (4):〜’al(1,96(1)、
lee 2.86 (3)、Leu 5.08 (5);Tyr 3.06 (
3):Phe (1,97
(1):Lys 3.06 (3);Arg 3.08 (3)。
実施例14 Gly−’−Pro−3−Tyr−2−Ala−’([Leu27
]bGRF(1−29)NH4I、 トリフルオロ酢酸塩の調製式#6 Gly
−Pro−Tyr−Ala−Tyr−A1.a−Asp−Ala−11e−Ph
e−Thr −Asn −S er −Tyr −Arg −Lys −Val
−Leu −G ly −G in −Leu −Ser −A la −A
rg −Lys −Leu −Leu −Gin −Asp−11e −Leu
−A、sn −Arg −NH!(CF3COOH塩として)を有するGRF
アナログペプチド5eqlD29の合成は、本明細書中に引用記載する公開され
たPCT特許出願PCT/US90102923に開示されている方法Aに従っ
て段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):Asp 4.0
1 (4);Thr O,96(1);Ser 1.80 (2):Glu 2
.02 (2); Pro 0.97 (1);Gly 1.98(2)+A1
a3.91 (4);Val O,99(1)、lie 1.89 (2)、L
eu 5.08 (5);Tyr 3.05 (3):Phe O,98(1)
; Lys 2.03 (2);Arg 3.06(3)。
実施例12 Tyr−’−Ala−5−Gly−’−Pro−”−1−yr−2
−Ala−’([Leu”]bGRF(129)NH4I、 トリフルオロ酢酸
塩の調製伸長部分として5eqlD8からなり、式: # 7 Tyr−Ala
−Gly−Pro −Tyr −A la −Tyr −Ala−Asp −A
la −11e −Phe −Thr −Asn −Ser −Tyr −A
rg −Lys−Val−Leu −G ly −G In −Leu −5e
r−Ala −Arg −Lys −Leu −Leu−Gin−Asp −1
1e −Leu−Asn−Arg−Nl2(CF 、、 C0OH塩として)を
有するGRFアナログペプチド5eqlD30の合成は、本明細書中に引用S己
載する公開されたPCT特許出8PCT/US90/′02923に開示されて
いる方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値)
Asp 4.07 (4):Thr O,96(1): Set 1.79 (
2):Glu 2.02(2): Pro 0.99 (1):Gly 1.9
5 (2)+A]a 4.80 (5):Val O96(1)、Ile 1.
87 (2)、Leu 5.09 (5);Tyr 4.11 (4);Phe
O,97(1); Lys 2.06 (2)、Arg 3.08 (3)。
実施例13 Lys−’−Pro7−Tyr−6−Ala−5−Gly−’−P
ro−’−Tyr2−Ala−’ i[I、eu27コbGRF(1−29)N
H4I、 トリフルオロ酢酸塩の調製
伸長部分とし、て5eqlD9からなり、弐 #8Lys−Pro−Tyr−A
la −G 1y−P ro−Tyr−A la−Tyr−= 、へ1a−As
p−、へ1a−11e−−円】e−−Thr−Asn−5er−Tyr−、へr
g −Lys−’v’al −−Leu−Gly−G]、n−Leu−Ser−
Ala−Arg −Lys−Leu−1−co−Gln−、八sp−lie−L
eu−Asn−Arg−Nl2(CF3COOH塩として)を有するGRFアナ
ログペプチド5eqlD31の合成は、本明細書中に引用記載する公開されたP
CT特許出願PCT/US90/CI 2923に開示されている方法Aに従っ
て段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):Asp 4.0
6 (4):Thr O,95(1); Ser 1.78 (2):Glu
2.01 (2): Pro 1.95 (2);Gly 1.96 (2)+
Ala181 (5);〜’al 0.95 (1)、Ile 1.87 (2
)、Leu 5.09 (5);Tyr 4.12 (4): Phe O,9
6(1);Lys 3.08 (3)+Arg 3.10(3)。
実施例14 Phe−”−Ala9−]−]ys8−Pro−7−Tyr−6A
la−’−Gly’−Pro−”Tyr 2−へla ’i[Leu27]bG
RF(129)NH4I、トリフルオロ酢酸塩の調製
伸長部分として5eqlD10からなり、式 #9 Phe−Ala−Lys−
Pro −Tyr−、へla−Gly−P ro−Tyr −Ala−Tyr−
Ala−Asp−Ala−11e−Phe−Thr−、Asn−5er−Tyr
−Arg−Lys−Val −Leu−Gly−Gln−Leu−5er−Al
a −、Arg −Lys −Leu −Leu −G in −Asp −1
1e −Leu −Asn −Arg −N H2(CF 、COOH塩として
)を有するGRFアナログペプチド5eqlD32の合成は、本明細書中に引用
記載する公開されたPCT特許出願PCT/US90102923に開示されて
いる方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値)
、へsp 4.16 (4):Thr 1.01 (1): Set 1.89
(2):Glu 2.08 (2)+ Pro 1.91 (2):Gly
1.93 (2)+Ala5.72(6):〜’al O,97(1)、Ile
1.90 (2)、 Leu 5.09 (5):Tyr 4.09 (4)
; Phe 1.99 (2); Lys 3.08 (3);Arg、3.0
4(3)。
実施例15 Gly”−Pro−”−Phelo−Ala9−I、ys−’ −
Pro−’−Tyr−’−Ala−’ −Gly−’ −Pro−’−Tyr−
2−Ala−’ ([Leu”l b G RF (129)NH4I、 トリ
フルオロ酢酸塩の調製伸長部分として5eqlD11からなり、弐 # 10
Gly −Pro −Phe −A 1a−Lys −Pro −Tyr −A
la−G 1y−Pro −Tyr −A ia −Tyr −Ala −As
p−2〜la −11e −Phe −Thr−へsn −Ser−Tyr−A
rg−9Lys−Val−Leu−Gly −G in−Leu−S er−、
’ll la−Arg−Lys−Leu−1−eu−G in−Asp−I l
e−Leu−1へsn−Arg−Nl2 (CF3COOH塩として)を有する
GRFアナログペプチド5eqTD33の合成は、本明細書中に引用記載する公
開されたPCT特許出願PCT/US90102923に開示されている方法へ
に従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっコ内は理論値):Asp
4.08 (4)+Thr O,96(1): Set 1.79 (2):G
lu 2.07 (2): Pro 2.88 (3):Gly 2゜94 (
3); 、Ala 5.74 (6); Val 0.96 (1)、lie
1.88 (2)、Leu5.13 (5):Tyr 4.11 (4);Ph
e 1.99 (2);Lys 3.10 (3);、Arg 3.09 (3
)。
実施例16〜’al−”−Pro−13−Gly−12−Pro−”−Phe−
’°−Ala−’−Lys−8− Pro−7−Tyr−’−Ala−5−Gl
y−’ −Pro−’−Tyr−2−Ala−’i[Leu”]bGRF(1−
29)NH4I、 トリフルオロ酢酸塩の調製
伸長部分トLテseq l D 12からなり、式 # 11 Val−Pro
−cly−P ro −Phe −A la −Lys −Pro −Tyr
−Ala −Gly −P ro −Tyr −A la −Tyr |
A la−Asp−Ala−11e−Phe−Thr−Asn−5er−Tyr
−Arg−Lys−Val−Leu −G ly −G In −Leu −S
er −A la −Arg −Lys −Leu7 Leu −G in −
Asp |
11e−Leu−Asn−Arg−Nl2 (CF3COOH塩として)を有す
るGRFアナロゲベブチド5eqlD34の合成は、本明細書中に引用記載する
公開されたPCT特許出願PCT/US90102923に開示されている方法
へに従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):Asp
4.04 (4):Thr O,96(1): Ser 1.81 (2);
Glu 2.04 (2); Pro 3.80(4);Gly 2.99 (
3)+Ala 5.92 (6):Val 1.98 (2)、lie 1゜8
9 (2)、Leu 5.10 (5):Tyr 4.09 (4):Phe
1.99 (2);Lys3.06 (3);Arg 3.08 (3)。
実施例17 Arg−”−Pro−11′−Val−”−Pro−13−Gly
−”−Pro−” −Phe−IO−Ala−’ −Lys−s−Pro−’
−Tyr−’ −Ala−’ −Gly−’ −Pro−3−Tyr−”−Al
a−’[[Leu27]bGRF(1−29)NH21,トリフルオロ酢酸塩の
調製
伸長部分としく5eqlD13からなり、弐 # 12 Arg−Pro−Va
l −Pro −Gly −Pro −Phe −Ala −Lys −Pro
−Tyr −Ala −G ly −Pro −Tyr −Ala −Tyr
−Ala −Asp −A la −11e −Phe −Thr −Asn
−Ser −Tyr −Arg −Lys−Val −Leu−G ly −
G In−Leu −Ser −A la −Arg −Lys −Leu −
Leu −Gln−Asp−1ie−Leu−Asn−Arg−NH2(CF3
COOH塩として)を有するGRFアナログペプチド5eqlD35の合成は、
本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願PCT/’LlS90/’
02923に開示されている方法AI:従って段階的方法で行われる。アミノ酸
分析(かっこ内は理論値):Asp4゜10 (4):Thr O,98(1)
; Ser 1.84 (2);Glu 2.03 (2): Pr。
4、82 (5):Gly 2.97 (3): Ala 5.91 (6):
val 1.99 (2)。
11e 1.88 (2)、Leu 5.09 (5);Tyr 4.10 (
4): Phe 1.98(2); Lys 3.03 (3)+Arg 4.
09 (4)。
実施例I F3 Val−2−Ala−’i[Leu27’1bGRF(1−2
9)NH2)、 トリフルオロ酢酸塩の調製
式#14〜’al−Ala−Tyr−Ala−Asp−Ala−11e−Phe
−Thr−Asn−Ser −Tyr−Arg −Lys−Val −Leu
−Gly −Gin −Leu −5er−Ala −Arg−Lys−Leu
−Leu−Gin−Asp−1ie−Leu −−−Asn−Arg−NH2(
CF 3 COOH塩として)を有するGRFアナログペプチド5eqlD36
の合成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願PCT/US9
0102923に開示されている方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ
酸分析(かっこ内は理論値):Asp 3.98 (4)+Thr O,89(
1):Ser 1.76 (2):Glu 2.02 (2);Gly 1.0
5 (1)+Ala 3.87 (4);Vall、85 (2)、Ile 1
.77 (2)、Leu 5.17 (5):Tyr 2.04 (2);Ph
e O,97(1); Lys 2.07 (2);Arg 3.06 (3)
。
実施例19 Tyr−2−Thr−’([Ala”Leu”コbGRF(1−2
9)NH21,トリフルオロ酢酸塩の調製
式 #】5 丁yr−Thr−Tyr−Ala−Asp−Ala −1ie−P
he−Thr−Asn−Ser −Tyr −Arg −L ys −Val
−Leu −A la −G in −Leu −Ser −Ala −Arg
−Lys−Leu−Leu−Gin−Asp−11e−Leu−Asn−Arg
−NH。
(CF3COOH塩として)を有するGRFアナログペプチド5eqlD37の
合成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願PCT/US90
102923に開示されている方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ酸
分析(かっこ内は理論値)・Asp 4.06 (4):Thr 1.86 (
2):Ser 1.77 (2);Glu 2.07 (2);Ala 3.9
8 (4):Val 1.08 (1)、1ie1.89 (2)、 Leu
5.14 (5);Tyr 2.94 (3);Phe O,96(1);Ly
s 1.99 (2);Arg 3.04 (3)。
実施例20 Tyr2−Thr−’i[11e2Ala”Leu27]bGRF
(1−29)NH21゜トリフルオロ酢酸塩の調製
式: # 16 Tyr−Thr−Tyr−11e −Asp−Ala −11
e−Phe−Thr−Asn−Ser −Tyr −Arg −Lys −Va
l −Leu −A la −G In −Leu −Ser −Ala −A
rg−Lys−Leu−Leu−Gin−Asp −lie−Leu−Asn−
Arg−NH2(CF3C001(塩として)を有するGRFアナログペプチド
5eqlI)38の合成は、本明細書中に引用記載する公開された1)CT特許
出願PCT/US90102923に開示されている方法Aに従って段階的方法
で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論@):Asp 4.07 (4):
Thr 1.87 (2>; Ser 1.75 (2):Glu 2.07
(2):Ala 2.94 (3);Val 1.09 (1)、Ice2.8
7 (3)、 Leu 5.12 (5):Tyr 2.92 (3):Phe
O,96(1):Lys 2.00 (2)+Arg 3.05 (3)。
実施例2]、Tyr”−Thr”’([Thr2Ala15Leu”コbGRF
(129)NH4I。
トリフルオロ酢酸塩の調製
式# 17 Tyr−Thr−Tyr−Thr−Asp−Ala−11e−Ph
e−Thr−Asn−5er−Tyr −Arg −Lys−Val −Leu
−Ala −Gln −Leu −Ser −A la −Arg−Lys−L
eu−Leu−Gln−Asp −lie−Leu−Asn−Arg−NH2(
CF3COOH塩として)を有するGRFアナログペプチド5eqlD39の合
成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願PCT/US901
02923に開示されている方法A(:従って段階的方法で行われる。アミノ酸
分析(かっこ内は理論値):Asp 4.05 (4):Thr 2゜68 (
3); Set 1.77 (2):Glu 2.07 (2);Ala 2.
90 (3);Val 1.08 (1)、1ie1.89 (2)、Leu
5.20 (5):Tyr 2.87 (3’); Phe O,93(1)+
1、ys 2.01 (2) ; Arg 3.07 (3)。
実施例22 Tyr−’−3er−’i[Thr2Ala”Leu”]bGRF
(1−29)NH21゜トリフルオロ酢酸塩の調製
式R18Tyr−3er−Tyr−Thr−Asp−Ala−11e−Phe−
Thr−Asn−5er−Tyr−Arg−Lys−Val −Leu−A l
a−G in−Leu−5er−A la−Arg−Lys −Leu−Leu
−Gin−Asp −lie−Leu−Asn−Arg−NH。
(CF3COOH塩とし、て)を有するGRFアナログペプチド5eqlD40
の合成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願PCT/US9
0102923に開示されている方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ
酸分析(かっこ内は理論値):Asp 4.11 (4):Thr 1.82
(2): Ser 2.64 (3);Glu 2.05 (2):Ala 2
.90 (3):〜’at 1.04 (1)、1ie1.87 (2)、Le
u 5.16 (5);Tyr 2.92 (3); Phe O,94(1)
;Lys 2.01 (2) ; Arg 3.04 (3)。
実施例23 Tyr’−Thr3−Tyr2−Thr−’i[Thr2A1a1
5Leu”]bGRF(129)NH21,)リフルオロ酢酸塩の調製式: #
19 Tyr−Thr−Tyr−Thr−Tyr−Thr−Asp−Ala−
11e−Phe−Thr −Asn −S er −Tyr −Arg −Ly
s −Val −Leu −Ala −Gin −Leu −5er−、A l
a −Arg −Lys −Leu −Leu −Gln −Asp−11e
−Leu −Asn −Arg −NH2(CF3COOH塩として)を有する
GRFアナログペプチド5eqlD41の合成は、本明細書中に引用記載する公
開されたPCT特許出願P CT/U Se 0102923に開示されている
方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):A
sp 4.06 (4):Thr 3.66 (4)+5et1.85 (2)
;Glu 2.05 (2);Ala 2.93 (3);Val 1.09
(1)。
Ice 1.91 (2)、Leu 5.15 (5):Tyr 3.91 (
4):Phe O,95(1); Lys 2.00 (2)+Arg 3.0
4 (3)。
実施例24 Tyr2−Ala−’([Leu”]bGRF(1−29)NH4
I、 トリフルオロ酢酸塩の調製
式Tyr−Ala−Tyr−Ala−Asp−Ala−11e−Phe−Thr
−Asn−5er−Tyr −Arg −Lys −Val −Leu −G
ly −Gln −Leu −Ser −A la −Arg −Lyp −L
eu −Leu −Gin −Asp −11e −Leu−Asn−Arg
−NH2(CF 3COOH塩として)を有するGRFアナログペプチド5eq
lD42の合成は、本明細書中に引用記載する公開されたPCT特許出願PCT
/US90102923に開示されている方法Aに従って段階的方法で行われる
。アミノ酸分析(かっこ内は理論1id)+Asp 4.01 (4):Thr
O,97(1)+ Ser 1.88 (2);Glu 2.00 (2):
Gly 1.02 (1);Ala 3.88 (4);Val O,97(1
)、1ie1.86 (2)、Leu 5.03 (5);Tyr 3.03
(3);Phe O,96(1);Lys 2.18 (2) : Arg 3
.03 (3)。
実施例25 Tyr−”−Ala−3−Tyr−2−Ala−’l[Leu27
]bGRF(1−29)NHzl、)リフルオロ酢酸塩の調製
式# l 3 Tyr−Ala−Tyr−Ala−Tyr−Ala−Asp−A
la−11e−Phe−Thr −Asn −S er −Tyr −Arg
−Lys −Val −Leu −G 1y−Gin −Leu −5er−A
Ia −Arg −Lys −Leu −Leu −Gin −Asp −1
1e −Leu −Asn −Arg −NO3(CF、C0OH塩として)を
有するGRFアナログペプチド5eqlD43の合成は、本明細書中に引用記載
する公開されたPCT特許出願PCT/US90102923に開示されている
方法Aに従って段階的方法で行われる。アミノ酸分析(かっこ内は理論値):A
sp 3.97 (4);Thr O,90(1); Ser 1゜74 (2
);Glu 1.98 (2);Gly 1.04 (1):Ala 4.85
(5);ValO,91(1)、lie 1.77 (2)、Leu 5.1
3 (5);Tyr 4.14(4): Phe O,99(1); Lys
2.07 (2);Arg 3.05 (3)。
! フリートマン(F riedman)ら(インターナショナル・ジャーナル
・オブ・ペプチド・アンド・プロティン・リサーチ(Int、 J 、 Pep
tide and ProteinRes、)、37 :14−20 [199
1コ)による開示に従って、in vitroウシ下垂体前葉細胞培養物中でペ
プチドを試験した。
n クビアク(Kubiak)ら(ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポ
ジション(Drug Met、 Djsp、)、17:393−397 [19
89])の開示に従って、37℃で、in vitroでウシ血漿中30μMで
ペプチドをインキュベートした。ここで示された値は、血漿中で直接インキュベ
ートされた[Leu”]−bGRF(129)NO3(Seq、ID 5)また
は各々、伸長ペプチドSeq。
IDNo1.8.25もしくは19から得られた[Leu”)]−bGRF(1
−29)NO3(Seq、ID 5)の半減期に関係する。2種類の血漿プール
を用いる2つの実験を行づた。かっこ内に示した実施例1および2゜# ペプチ
ドSeq、ID19は、異なるウシ血漿プールを使用して、[Leu”]−bG
RF(129)NO3(Seq、ID 5)に対して試験した。この血漿標本中
のSeq、ID5の半減期は502分てあった。
第2表 給餌されたポルスフィン種去勢つ1.xにおける種々の用量の[Leu
”]−bGRF(129)NO3(Seq l D 5)およびI 1e−2−
Pro−’ICL、eu27F−bGRF(129)NH4I (Seq ID
18)のIV注射に対する血清GH応答
8 給餌の2時間前に所定の用量のペプチドを動物に1v注射した。手段はモス
l イ(Moseley)ら、/+−1−ルーtブ・エンFり’J10ノー (
JEndocrjnology)、117:253−259 (1988)によ
る開示に従った。
° 分析Aは全ての去勢ウシを含み、分析BはGRF注射に応答する去勢ウシお
よび対間去勢ウソだけを含む。
゛パ・“パ カラム中の種々の上付き文字を有する値は有意に異なる(P<0.
05)。
第3表 給餌されたホルスタイン種去勢ウシガニおける種々の用量の[Leu2
7]−bGRF(129)NO3(Seq ID 5)およびTyr−’−Al
a−” −Tyr2−Ala−’ t[Leu”コーbGRF(129)NO2
1(Seq I D 19)のTV注射に対する血清GH応答
I 給餌の2時間前に所定の用量のペプチドを去勢ウシに1■注射した。手段は
モスリイ(Moseley)ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー(J。
E ndocrinology)、117:253−259 (1988)によ
る開示に従った。
゛ 分析Aは全ての去勢ウシを含み、分析BはGRF注射に応答する去勢ウシお
よび対照去勢ウシだけを含む。
1°゛・6 カラム中の種々の上付き文字を有する値は有意に異なる(P<0.
05)。
配列リスト
(1゛一般的情報
″(+) 出願人 クビアク、テしす・エム/ヤーマ、サティノユ・ケイ
(ij ) 発明の名称 融合ポリペプチド(ffl) 配列の数 42
(iv)通信宛先
(A) 宛名 アソブノコン・カンパニー−−コーホレート・パテンツ・アンド
・ト1ノ一ドマークス
(B) ス]・リ−1・ へンリエンタ・ス1−リート301番(E) 国・
アメリカ合衆国
(F) ZIP: 49001
(v)コンビ、−々−解読可能形態
(A) 媒体型 ギイスケン!・(3M 3.5、DS両面i、OMB)(B)
コンピューター IBMPCコンパティプル(C)オペレーティングシステム
PC−DO8/MS−DO8(D) ソフトウェア WordPerfect
5.1(vi) 現出願データ
(A) 出願番号
(B) 出願臼
(C) 分類
(vi)優先権基礎出願データ
(A) 出願番号 tJs07/626.727(B) 出願臼−13z12/
90
(軸)優先権基礎出願データ
(A) 出願番号・ tJs07/614.170CB) 出願臼 14/1.
1/90
(楯)優先権基礎出願データ・
(A) 出願番号: PCT/US90102923(B) 出願臼 3010
5/90
(vi) 優先権基礎出願データ
(A) 出願番号・ US07/368.231(B) 出願臼 16106/
89
(vi) 優先権基礎出願データ・
(A) 出願番号 US071506.605(B) 出願臼 09104/9
0
(vi) 代理人情報・
(A) 氏名 デルカ、マーク
(B) 登録番号 33229
(C) 参照/書類番号・ 4595
(IX)通信番号情報
(A) 電話 616 385 5210(B) ナレソクス 616 385
6897(2)配列番号1についての情報
(1)配列特徴・
(A) 長さ 33
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポo/’−・ 直鎖状
(Xl)配列記載 配列番号 1
Tyr Val Asp Ala Ile Phc Thr Ser Ser
Tyr Arg Lys Val Leu Ala G1nLeu Ser A
la Arg Lys I、eu Leu Gin ASpIle Leu S
er Arg Gin Gin Gly1u
(3)配列番号2についての情報
(1)配列特徴
(A) 長さ 、40
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(Xl)配列記載 配列番号 2
Tyr Ile Asp Ala Ile Phe Thr Ser Scr
Tyr Arg I−ys Val Leu Ala Gi■
Glu Arg Asn Gin GILI Gln Gly ^la(・1)
配列番号3についての情報
(1)配列特徴
(A) 長さ 29
(B) タイプ・ アミノ酸
(D) トポロジー・ 直鎖状
(Lx) 特徴
(A) 名称/キイ・ C−末端アミド化アルキニニル残基(B’) 位置 X
aa29
(Xl)配列記載 配列番号 3
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr Arg Lys Val Leu^la G]、nl 5 10 15
Leu Ser^la Arg Lys Leu Leu Gin Asp I
le Leu Asn Xaa(5)配列番号4についての情報
(i) 配列特徴。
(A) 長さ・ 29
(B) タイプ・ アミノ酸
(D) トポロン−直鎖状
(jx) 特徴・
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xaa
29
(Xl)配列記載・ 配列番号・4
Tyr Ile Asp^la Ile Phe Thr Asn Ser T
yr Arg Lys Val Leu Ala G1nLeu Ser Al
a Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu As
n Xaa(6)配列番号5についての情報・
(])配列特徴
(A) 長さ 29
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴:
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置: Xa
a29
(尤)配列記載 配列番号 5:
Leu Ser^la Arg Lys Leu Leu Gin Asp I
le Leu Asn Xaa0Z5
(7)配列番号6についての情報・
(i) 配列特徴
(A) 長さ・ 6
(B) タイプ アミノ酸
(D)1〜ポロジー 直鎖状
(Xl)配列記載 配列番号 6
■yr Ala Gly Pro lie Pr。
(8)配列番号7についての情報
(i) 配列特徴
(In l−ポロノー、 直鎖状
(xj) 配列記載、 配列番号 7
Lys Pro Tyr Ala Gly r’ro Ile Pr。
(9)配7jl]番号8についての情報(1)配列特徴
(A) 長さ 6
(B) タイプ・ アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xi) 配列記載: 配列番号 8
Tyr Ala Gly Pro Tyr^1a(10)配列番号9についての
情報:
(f) 配列特徴:
(A) 長さ= 8
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(xl)配列記載: 配列番号=9゜
Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala(11)配
列番号10についての情報。
(i) 配列特徴・
(A) 長さ 10
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー・ 直鎖状
(Xl)配列記載 配列番号、10゜
Phe Ala Lys Pro Tyr^la Gly Pro Tyr A
la(12)配列番号11についての情報・(i) 配列特徴
(A) 長さ 12
(B) タイプ アミノ酸
(D) I−ポロジー 直鎖状
(Xl)配列記載・ 配列番号 11
Gly Pro Phe^la Lys Pro Tyr^la Gly Pr
o Tyr Ala(13)配列番号12に一ついての情報(1)配列特徴
(A、)長さ 14
(B) タイプ アミノ酸
(D) l−ポロノー n鎖状
(x3)配列記載 配列番号 12:
Val F’ro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr
Ala Gly Pro Tyr ^1a(14)配列番号13についての情
報
(1)配列特徴
(A) 長さ 29
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(Xl)配列記載 配列番号 13
^rg Pro Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys
Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala] 5 10 15
(15)配列番号14についての情報
(1)配列特徴
(A) 長さ・ 29
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルキニニル残基(B) 位lW: X
aa29
(Xl)配列記載: 配列番号 14
Tyr Thr Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr Arg Lys Val Leu^la G1nLeu Ser Al
a Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu As
n Xaa(16)配列番号15についての情報
(i) 配列特徴・
(A) 長さ 11
(B) タイプ アミノ酸
(D) +=ポロジー 直鎖状
(Xl)配列記載・ 配列番号、15:Met Pro^la His Pro
His Pro His Pro His^1a(17)配列番号16につい
ての情報
(i) 配列特徴
(A) 長さ、11
(B) タイプ、 アミノ酸
(D) トポロジー・ 直鎖状
(Xl)配列記載: 配列番号・16二11et Ala Pro His A
la His Ala Ris Ala His Ala(18)配列番号17
についての情報・(i) 配列特徴:
(A) 長さ 11
(B) タイプ・ アミノ酸
(D) トポロンー: 直鎖状
(刀)配列記載 配列番号 17゜
klet Gly Pro l1is Pro HiCNPro [lis P
ro l1is Alf1(+9) E列番号18についての情報(i) 配9
り特徴
(A) 長さ 31
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称2/′キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 X
aa3]
(Xl)配列紀V 配列番号 18
11ePro Tyr Ala Asp Ala lie Phe T11r^
sn Ser ’ryr Arg Lys Val Leul 、5 10 1
5
Gly Gin Leu Ser Ala ArgLys 1.eu I−eu
Gin Asp Ile 1.eu Asn Xaa20 25 3Q
(20)配列番号19についη“の情報(+)ル】列特徴
(、へ)長さ 33
(B) タイプ ア2ノ゛酸
(D) トポロジー 直鎖状
(IX)特徴
(。知 名称、′キイ (ニー末端アミド化アルギニニル残基(B)位置Xa
a 33
(Xl)へ2列記載 配ηり番号 19Tyr Aha Tyr Ala Ty
r Ala Asp Aha ice Phe Thr Ser Ser Ty
r Arg Lysl 5 10 15
Val Leu Ala Gln I−eu Ser Ala Arg Lys
Leu Leu Gin Asp Ile LeII 5■■
aa
(21)配列番号20についての情報
(i) 配列特徴
(A) 長さ、39
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー: 直鎖状
(IX)特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置+ Xa
a39
(xl)配列記載 配列番号 20
Phe Ala I、ys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr
Ala Tyr Ala Asp Ala Ile Pl奄■
l 5 10 15
Thr Asn Ser 丁yr Arg Lvs Val Leu Ala
Gln Leu Ser Aha Arg Lys Leu20 25 、 3
0
i+eu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa(22)配列番号
21についての情報
(1)配列特徴。
(A) 長さ 45
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(1x)特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミF化アルギニニル残基(B) 位置 Xaa
45
(Xl)配列記載 配列番号 21
Arg Pro Val Pro (山・Pro Phe^la Lys Pr
o Tyr Ala Gly Pro Tyr Alal 5 10 15
fyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser
Tyr ArgLys Val Leu Gly G1nLeu Scr Al
a ArgLys Leu Leu Gin Asp ile Leu Asn
Xaa(:13)ν列番号22について−の情報(i) 配列特徴
(・λ)長さ 10
(B) ダイ’j アミノ酸
(D) トポロア・−直鎖状
(xj’) 配列記載 配列番号 22円]e Ala Lys Prn Ty
r Ala Guy Pro Tyr Ala(24)配列番号23についての
情報
(+) 配列特徴
(A) 長さ 16
(B) タイプ アミ2ノ酸
(D) トポロン−直鎖状
(η)配列記載 配列番号 23
Arg Pro Val Pro Gl)°Pro Phe^la Lys P
ro Tyr Ala Gly Pro Tyr^1a(25)配列番号24に
ついての情報
(1)配列特徴
(A) 長さ 27
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポ口2・−直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称/キイ・ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置: X
aa27
(xi) ’e列記載・ 配列番号 24・Asp Ala lie Phe
Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val I−eu Gl、
y Gin Leu 5■■
^1a Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu
Asn Xaa(26)配列番号25についての情報。
(i) 配列特徴
(A) 長さ 31
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロン−直鎖状
(]IX特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位@: Xa
a31
(xi) 配列記載 配列番号 25
Tyr^la Tyr^la Asp Ala rlePhe Thr Ser
Ser Tyr Arg Lys Val Leul 5 10 15
Gly Gin Leu Ser^la Arg Lys Leu Leu G
in Asp Ile Leu Asn Xaa(27)配列番号26について
の情報
(i) 配列特徴
(A) 長さ・ 33
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(1x)特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置: Xa
a33
(xl)配列記載、 配列番号:26;(28)配列番号27についての情報。
(i) 配列特徴
(A) 長さ 35
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー、 直鎖状
(1x)特徴。
(A) 名称/キイ、 C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xa
a35
(Xl)配列記載 配列番号 27
Leu Asn Xaa
(29)配列番号28についての情報
(i’) 配列特徴
(A)長さ 37
(B) タイプ、 アミノ酸
(D) トポロジー・ 直鎖状
(iX) 特徴
(A) 名称/キイ・ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置: X
aa37
(XI)配列記載: 配列番号:28゜Asp Ile Leu Asn Xa
a(30)配列番号29についての情報・(i) 配列特徴。
(D) トポロジー・ 直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称/キイ: C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xa
a33
(対)配列記載・ 配列番号:29゜
Xaa
(31)配列番号30についての情報
(])配列特徴
(I〕)トポロン−・ 直鎖状
(u) 特徴
(A) 名称/キイ、 C−末端アミド化アルギニニル残基(B)位置: Xa
a35
(Xl)配列記載 配列番号 30゜
Leu Asn Xaa
(32)配列番号31についての情報
(])配列特徴
(7へ)長さ 37
(B) タイプ アミノ酸
(D)l−ポロ/−直鎖状
(IX)特徴
(A) 名称/′キイ C−末端アミド化アルキニニル残基(B) 位1iF:
Xaa37
(Xl)配列記載・ 配列番号 31
Lys Pro Tyr^la Gly Pro Tyr Ala Tyr A
la Asp Ala lie Phe Thr Asn] 5 10 15
Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu
Ser Ala Arg Lys Leu Leu G1nAsp Ile L
eu Asn Xaa(33)配列番号32についての情報。
(j) 配列特徴
(Δ)長さ・ 39
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(1x)特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xaa
39
(Xl)配列記載 配列番号 32−
Phe Ala Lys Pro Tyr^la Gly Pro Tyr^l
a Tyr Ala Asp Ala Ile Phel 5 ]0 15
Thr Asn Ser Tyr^rg Lys Val Leu Gly G
ln Leu Ser Ala Arg Lys LeuLeu Gin As
p Ile Leu Asn Xaa(34)配列番号33についての情報。
(i) 配列特徴:
(A) 長さ 41
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xaa
41
(Xl)配列記載 配列番号 33
Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr^la Gly P
ro Tyr^la Tyr^la Asp Ala+ 5 10 15
He Phe Thr Asn Scr Tyr Arg Lys Vai L
eu Gly Gin Leu Ser Ala ArgLys Leu Le
u Gin Asp Ile Leu Asn Xaa(35)配列番号311
についての情報(i) 配列特徴・
(A) 長さ 43
(B) ぐイブ アミノ酸
(D) トづ支ロノー 直鎖状
(ixJ 特徴
(A)名称、/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(’B) 位@: X
aa43
(Xl)配列記載 配列番号 34
Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr
Ala Gly Pro Tyr Ala Tyr Ala] 5 10 15
Asp Ala Ile l”he Thr Asn Ser Tyr Arg
1.ys Val Leu Gly Gin Lcu 5モ■
八Ia Arg [、ys Leu Leu Gin Asp Ile Leu
Asn Xaa(36)配列番号35についての情報
(i) 配列特徴
(A)長さ 45
(B) タイプ アミノ酸
([))トボロ2− 直鎖状
(IX)特徴。
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位fil:
Xaa45
(xi) 配列記載、 配列番号 35゜Tyr^la Asp^la Ile
Phe Th+−Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu
Gly G1nLeu Ser Ala Arg Lys LeuLeu G
in Asp Ile Leu Asn Xaa(37)配列番号36について
の情報
(i) 配列特徴
(A) 長さ 31
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー・ 直鎖状
(ix) 特徴:
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xaa
31
(Xl)配列記載、 配列番号 36゜(38)配列番号37についての情報
(1)配列特徴・
(A) 長さ 31
(B) タイプ、 アミノ酸
(D) l−ポロン−・ 直鎖状
(ix) 特徴
(、A’) 名称/′キイ C−末端アミド化アルギニニル残基(B)位1:
Xaa31
(Xl)配列1ii2載 配列番号 37:Tyr Thr Tyr :へla
Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg
Lys Val Le■
l 5 10 15
Ala Gin Lcu Ser Ala Arg Lys Leu 1.eu
Gin Asn Ile Leu Asn Xaa(39)配列番号38につ
いての情報
(1)配列特徴・
(A) 長さ 31
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称/キイ C−末端アミド化アルキニニル残基(B) 位置 Xaa
31
(Xl)配列記載 配列番号 38
Tyr Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Phe Thr^
sn Ser Tyr Arg Lys Val Leul 5 10 15
^1a Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu
Gin Asp Ile Leu Asn Xaa(40)配列番号39につい
ての情報
(1)配列特徴
(A、) 長さ 31
(B) タイプ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎮状
(tx) 特徴。
(A) 名称/キイ・ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位@: X
aa3]
(i) 配列記載 配列番号 39
Tyr Thr Tyr Thr Asp^la Ile Phe Thr A
sn Ser Tyr Arg Lys Val Leul 5 10 15
Ala Gin Leu Ser^la Arg Lys Leu Leu G
in Asp Ile Leu Asn Xaa(41)配列番号40について
の情報。
(i) 配列特徴・
(A) 長さ・ 31
(B) タイプ・ アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴
(A) 名称/キイ: C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位ra:
Xaa31
(xi) 配列記載: 配列番号・40Tyr Ser Tyr Thr As
p^la Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys
Val Leul 5 10 15
^1a Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu
Gin Asp Ile Leu Asn Xaa(42)配列番号41につい
ての情報:(1)配列特徴・
(A) 長さ:33
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(鎗)特徴。
(A) 名称/キイ・ C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置: X
aa33
(XI)配列記載、 配列番号 41
Tyr Thr Tyr Thr Tyr Thr Asp^la Ile P
he Thr Asn Ser Tyr Arg Lysl 5 10 15
Val Leu Ala Gln Leu Ser Ala Arg Lys
Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asnaa
(43)配列番号42についての情報。
(1)配列特徴
(A) 長さ 31
(B) タイプ: アミノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(ix) 特徴・
(A) 名称/キイ、 C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置: X
aa31
(Xl)配列記載、 配列番号、42
Tyr^la Tyr^la Asp^la Ile Phe Thr Ser
Ser Tyr Arg Lys Val Leul 5 10 15
Gly Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu
Gin Asp Ile Leu Asn Xaa(44)配列番号43につい
ての情報:(i) 配列特徴。
(A) 長さ 33
(B) タイプ アミノ酸
(D)1−ポロン−直鎖状
(iり 特徴。
(A) 名称/キイ、 C−末端アミド化アルギニニル残基(B) 位置 Xa
a33
(Xl)配列記載 配列番号 43
Tyr^la Tyr^1.a Tyr Ala Asp Ala Ile P
he Thr Ser Ser Tyr Arg Lysl 5 10 15
Val Leu Ala Gin Leu Ser^la Arg Lys L
eu Leu Gin Asp Ile Leu 5eraa
四訂慣審報牛
11.11..11.1□11,2.1.1.If−ρCT/US911091
52[1際調査報告
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号// A 61 K 3
7102 8314−4C37/24 8314−4C
37/28 8314−4C
37/36 8314−4C
37/43 8314−4C
C12N 15/12
1.5/16
(81)指定回 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、SE)、0A(BF
、BJ、CF、CG、CI、CM、GA、GN、ML、MR,SN、TD、TG
)、AU、 BB、 BG、 BR,CA、 C3,FI、 HU、JP。
KP、KR,LK、MG、MN、MW、No、PL、RO,SD、SU、 US
I
Claims (16)
- 1.伸長ペプチド部分が式: A−X−Y(X′−Y)n [式中、 Aは任意、存在する場合はメチオニン;nは0〜20; Xはすべての天然アミノ酸残基からなる群から選択され;X′はプロリンおよび ヒドロキシプロリン以外のすべての天然アミノ酸残基からなる群から選択され; Yは、nがOであってAが存在しない場合にYがアラニン、セリンおよびトレオ ニンからなる群から選択される以外は、プロリン、ヒドロキシプロリン、アラニ ン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される]で示される、コア蛋白 部分のN−末端にC−末端にて共有結合されている伸長ペプチド部分からなる非 天然融合蛋白。
- 2.Aが存在し、XがPro、Gly、AlaおよびSerからなる群から選択 される請求項1記載の非天然融合蛋白。
- 3.nが0〜10である請求項1記載の非天然融合蛋白。
- 4.生物学的活性ポリペプチドがbGRFアナログ、EGF;IGF−2、グル カゴン;コルチコトロピン放出因子;ダイノルフィン、ソマトスタチン−14; エンドセリン;トランスフォーミング成長因子α;血管作用性小腸ペプチド;ヒ トβ−方ソモルフィン;胃酸分泌抑制ペプチド;胃酸放出ペプチド;ヒトペプチ ドHI;ヒトペプチドYY;グルカゴン様ペプチド−1断片7−37:グルカゴ ン様ペプチド−2;サブスタンスP;神経ペプチドY;ヒト膵臓ポリペプチド; インスリン様成長因子−1;ヒト成長ホルモン;ウシ成長ホルモン;ブタ成長ホ ルモン:プロラクチン:ヒト成長ホルモン放出因子;ウシ成長ホルモン放出因子 :ブタ成長ホルモン放出因子;ヒツジ成長ホルモン放出因子;インターロイキン −1β;およびインターロイキン−2からなる群から選択される請求項1記載の 非天然融合蛋白。
- 5.伸長ペプチド部分が【配列があります】、Seq ID 6、Seq ID 7、【配列があります】、【配列があります】、Seq ID 8、Seq I D 9、SeqID 10、Seq ID 11、Seq ID 12、Seq ID 13、【配列があります】、【配列があります】、Seq ID 15 、Seq ID 16、Seq ID 17、Seq ID 22およびSeq ID 23からなる群から選択される請求項1記載の非天然融合蛋白。
- 6.nが3〜5である請求項2記載の非天然融合蛋白。
- 7.全てのX′残基がヒスチジンである請求項6記載の非天然融合蛋白。
- 8.Xがヒスチジンである請求項7記載の非天然融合蛋白。
- 9.3個のY残基がプロリンである請求項7記載の非天然融合蛋白。
- 10.薬剤を調製するための請求項1記載の非天然融合蛋白の使用。
- 11.薬剤が同一の生物学的活性部分および異なる伸長部分を有するさらなる融 合蛋白からなる請求項10記載の使用。
- 12.非天然融合蛋白の生物学的活性部分がbGRFアナログである請求項10 記載の使用。
- 13.融合蛋白を、融合蛋白を固定化する物質に選択的に接触させ;不純物を除 去し; 該物質から融合蛋白を分離し; 該融合蛋白とDPPWとを混合し; 所望の蛋白を単離すること からなる、請求項1記載の非天然融合蛋白および不純物を含有する混合物から所 望の蛋白を精製する方法。
- 14.該物質がカラム中に固定されている請求項13記載の方法。
- 15.該物質が伸長部分に結合する抗体である請求項13記載の方法。
- 16.該物質が固定化金属イオンであって、伸長部分が、ヒスチジンである、少 なくとも3つの連続したX′残基からなる請求項13記載の方法。
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