HUT69963A - Non-naturally-occuring fusion proteins and process for preparing them - Google Patents

Non-naturally-occuring fusion proteins and process for preparing them Download PDF

Info

Publication number
HUT69963A
HUT69963A HU9301705A HU170593A HUT69963A HU T69963 A HUT69963 A HU T69963A HU 9301705 A HU9301705 A HU 9301705A HU 170593 A HU170593 A HU 170593A HU T69963 A HUT69963 A HU T69963A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
tyr
ala
seq
pro
Prior art date
Application number
HU9301705A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9301705D0 (en
Inventor
Teresa M Kubiak
Satish K Sharma
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of HU9301705D0 publication Critical patent/HU9301705D0/hu
Publication of HUT69963A publication Critical patent/HUT69963A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57509—Corticotropin releasing factor [CRF] (Urotensin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57536—Endothelin, vasoactive intestinal contractor [VIC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/655—Somatostatins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

u A jelen találmány olyan fúziós polipeptidekre vonatkozik, amelyek a természetben nem fordulnak elő, és az N-terminálison egy olyan részt tartalmaznak, amely dipeptidilpeptidáz IV enzimmel (DPP IV) hasítható.
A molekuláris biológia, speciálisan a rekombináns DNS technológia lehetővé teszi a kívánatos biológiai hatású peptidek aránylag nagy mennyiségben való előállítását. Ezenfelül, a polipeptideket kódoló genetikus információk módosíthatók, így a módosított peptidek aránylag nagy menynyiségeinek előállítására nyílik lehetőség. A polipeptideket gyakran azért módosítják, hogy a hatásukat javítsák vagy a termelésüket és/vagy előállításukat kedvezőbbé tegyék. Ennek megfelelően igen sok erőfeszítést tettek annak meghatározására, hogy a polipeptidek biológiai hatásának növelése, fokozása vagy más jellegű változtatása érdekében milyen módosítások kívánatosak. Emellett igen sok munkát fordítottak a kívánt polipeptidek módosítására abból a célból, hogy termelésüket és tisztításukat megkönnyítsék.
A természetes polipeptidek a bioszintézis során gyakran nagyobb méretű prekurzorok formájában képződnek, amelyek aztán egy sor proteolitikus hasítás eredményeként alakulnak át a végtermékekké. Ennek megfelelően több olyan proteáz létezik, amely speciális aminosavakat és/vagy aminosavszekvenciát ismer fel és hasít. Ezek a proteázok vesznek részt egy prekurzor fehérjének a végső polipeptid termékké való átalakításában.
Egy ilyen proteáz a dipeptidilpeptidáz IV (DPP IV) (EC 3.4.14.5). A DPP IV-et először Hopsu-Havu, V. K. és G. G.
-3»·> Glenner [Histo. Chemie 3:197-201 ( 1966) írta le először, és kimutatták, hogy ez az enzim sok emlős szövetében jelen van. A DPP IV jelenleg a kereskedelemben az Enzyme Systems Producfts (Dublin, California) cégtől beszerezhető. A DPP IV egy speciális aminosav-szekvenciát ismer fel a fehérjék Nterminálisán. Közelebbről, a DPP IV akkor hasít le egy dipeptidet az N-terminálisról, ha az N-terminálistól számított második aminosav prolin (Pro), hidroxi-prolin (Hyp), alanin (Alá), szerin (Ser) vagy treonin (Thr), és bármilyen aminosav lehet az N-terminális helyzetében, feltéve, hogy az N-terminálistól számított harmadik aminosavmaradék nem prolin vagy hidroxi-prolin. A DPP IV aktivitása nagyobb, amikor a prolin vagy alanin az N-terminálistól számított második aminosav, és az enzim általában akkor a leghatékonyabb, ha ezt a helyzetet prolin foglalja el. A DPP IV enzimnek a természetben előforduló peptidek prekurzoraiban levő PRO rész lépésenként! hasításában való közreműködéséről széles körben beszámoltak.
A modern technológia lehetővé tette a biológiailag aktív fehérjék magas szintű termelését. Fontos polipeptidek állíthatók elő peptidszintetizátor segítségével vagy gazdasejtekben rekombináns DNS technológia alkalmazásával. A biológiailag hatásos fehérjéket gyakran gyógyszerként adagolják. Számos olyan példa említhető, amikor az aktív fehérjéket kezelésre, megelőzésre vagy tulajdonságok fokozására vagy visszaszorítására használják. Mivel a DPP IV és más proteázok lebontják a fehérjéket, ezek a gyógyszerek hajlamosak a lebomlásra. így, a biológiailag aktív polipep
-4tidek gyógyszerként való alkalmazásával kapcsolatban az a gond, hogy tartós jelenlétük lehetősége csökken, és ezért gyakrabban kell ezeket a polipeptideket adagolni.
A rekombináns DNS módszerekben bekövekezett gyors fejlődés, amely révén lehetővé vált a polipeptidek, fehérjék és analógjaik nagy mennyiségben és nagyon rövid idő alatt történő előállítása, szükségessé tette ezen fehérjék bonyolult, a gazdasejtek által termelt és a táptalajban levő összes fehérjét tartalmazó keverékekből való igen hatékony és előre megjósolható módon történő elkülönítését. A gazdasejtek által termelt heterológ polipeptidek tisztítása nagyon költséges is lehet, és a tisztítás magának a fehérje terméknek a denaturálódását is okozhatja. A fehérje tisztításának módszereiről adnak áttekintést Hopp és munkatársai a 4,782,137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak (1988. november 1.) a technika állását ismertető részében.
A szakterület korlátainak elkerülésére és hogy jobb módszerekhez jussunk, rekombináns DNS technikával a kívánt polipeptidet a természetben elő nem forduló formában állíthatjuk elő, amely a tisztításnál 1igandumként vagy más targetként használható linker-peptidet tartalmaz. Például a 4,782,137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás antigén linker peptidet tartalmazó, a természetben elő nem forduló peptid szintézisére vonatkozik. A természetben elő nem forduló fehérjét át lehet engedni egy immobilizált antitesteket tartalmazó oszlopon, az antitestek az antigén linkerhez kötődnek, így a nem-természetes fehérje elkülöníthető. A 4,569,794 számú amerikai egyesült államok
-5bel szabadalmi leírás olyan, a természetben elő nem forduló fehérjék tisztítási eljárását ismerteti, amelyek az N-terminálison immobilizált fémekkel szemben affinitást mutató csoportot tartalmaznak. A nem-természetes fehérjék egy oszlopban levő immobilizált fémionokhoz kötődnek. Ezekkel a módszerekkel az az egyetlen probléma, hogy a linker peptid gyakran nemkívánatos, és a linkért esetleg nehéz eltávolítani .
A jelen találmány olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjékre vonatkozik, amelyek egy magfehérjerészt és az N-terminálison egy DPP IV enzimmel hasítható hosszabító részt tartalmaznak. A jelen találmány szerint egy, a természetben elő nem forduló fehérje akkor jön létre, amikor a magfehérjéhez nem olyan N-terminális hosszabbító rész kapcsolódik, amely a természetben előfordul; ezért az ilyen fehérjéket a természetben elő nem forduló fúziós fehérjéknek nevezzük. A jelen találmány olyan előgyógyszerekre vonatkozik, amelyek a természetben elő nem forduló, DPP IV enzimmel hasítható fehérjék, és bennük a magfehérje-rész biológiailag aktív fehérje. A jelen találmány tárgyát olyan, a természetben elő nem forduló, DPP IV enzimmel hasítható fehérjék képezik, amelyek tisztítási eljárásokban használhatók, oly módon, hogy az N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész olyan sajátságot vagy tulajdonságot kölcsönöz a természetben elő nem forduló fehérjéknek, amely tisztításukat könynyebbé teszi.
A jelen találmány olyan, a természetben elő nem forduló fehérjéket bocsát rendelkezésre, amelyeknek az N-terminálisához DPP IV enzimmel hasítható rész kapcsolódik, és
-6amikor a természetben elő nem forduló fehérje DPP IV hatásának van kitéve, a természetben elő nem forduló fehérje egy kívánt fehérjévé alakul. Amikor a természetben elő nem forduló fehérjét előgyógyszerként használjuk, a természetben elő nem forduló fehérje biológiailag aktív fehérjévé való átalakulása in vivő, a cél fajban található DPP IV hatására megy végbe. Amennyiben tisztítási eljárásban alkalmazzuk, a természetben elő nem forduló fehérjének a speciálisan tervezett N-terminálisát használjuk 1igandumként, és aztán DPP IV enzimmel az N-terminálison levő hosszabbító rész lehasításával a kívánt fehérjét felszabadítjuk.
A jelen találmány lehetővé teszi a kívánt fehérjének a természetben elő nem forduló fehérje formájában való előállítását, amely utóbbi aztán DPP IV hatására a kívánt fehérjévé alakítható. Az elögyógyszerek a beteg endogén DPP IV enzimjének hatására az idők során gyógyszerré alakulnak át, így a betegben a hatóanyag hosszabb ideig van jelen, és így csökkenti az adagolás gyakoriságát. A kívánt fehérjéket tiszta állapotban a jelen találmány szerint oly módon különíthetjük el, hogy a természetben elő nem forduló fehérjéket állítunk elő, majd tisztítás után a természetben elő nem forduló fehérjéket in vitro DPP IV enz imme1 a kívánt fehérjévé hasítjuk. A jelen találmány tehát olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjékre vonatkozik, amelyekben egy hoszzabbító fehérjerész C-terminálisával egy magfehérjerész N-terminálisához kapcsolódik; a fenti hoszszabbító fehérjerész az
A-X-Y(X’-Y)n általános képlettel jellemezhető, ebben a képletben
-7A adott esetben van jelen, és amikor jelen van, jelentése metionin;
n értéke 0-20;
X bármely, a természetben előforduló aminosavmaradék;
X’ bármely, a természetben előforduló aminosavmaradék, a prolin és hidroxi-prolin kivételével;
Y prolin, hidroxi-prolin, alanin, szerin és treonin, kivéve, ha n = 0, ekkor Y alanin, szerin vagy treonin.
A jelen találmány tárgyát képezi a természetben elő nem forduló ilyen fehérjék gyógyászati készítményekben való alkalmazása, és a kívánt peptideknek ilyen természetben elő nem forduló fehérjéket és szennyezéseket tartalmazó keverékből tiszta állapotban való előállítási eljárása is, amely abban áll, hogy a fenti, természetben elő nem forduló fehérjéket olyan anyaggal hozzuk érintkezésbe, amely a fenti, természetben elő nem forduló fehérjét immobilizálja a fenti keverékből, eltávolítjuk a szennyezéseket, elválasztjuk a természetben eló nem forduló fehérjét a fenti anyagtól, a fenti, természetben elő nem forduló fehérjét DPP IV enzimmel reagáltatjuk, és a fenti, kívánt fehérjét elkülönítjük .
A 4,569,794 számú (1986. február 11.) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Smith és munkatársai fehérjék tisztítására alkalmas eljárásokat, és ilyen eljárásokban használható vegyületeket ismertetnek. A találmány egy olyan eljárást is magába foglal, amely a Cterminálison biológiailag aktív polipeptidet és az Nterminálison egy hosszabbító, fémionokkal kelátot képező
-8linkert tartalmazó fúziós fehérjék elkülönítésére alkalmas. A fúziós peptid immobilizált fémionokkal szembeni affinitással rendelkezik. A szennyezéseket úgy lehet eltávolítani, hogy a fúziós fehérjét magábafoglaló keveréket immobilizált fémionokat tartalmazó oszlopon engedik át. A fúziós fehérje a fémionokhoz kötődik, és csak a szennyezések eluálódnak. A körülmények megváltoztatásával a fúziós fehérjéket az immobilizált fémionoktól megszabadítják, és így tisztított fúziós fehérjét kapnak.
A 4,782,137 számú (1988. november 1.) amerikai egyesült államokbel szabadalmi leírásban Hopp és munkatársai olyan fúziós peptidek szintézisét ismertetik, amelyek N-terminálisként egy erősen antigénes részt és C-terminálisként egy kívánt polipeptidet tartalmaznak. Hopp és munkatársai szerint a fúziós fehérjét úgy tisztítják, hogy a nyers felülúszót immobilizált antitesteket tartalmazó oszlopon engedik át, amely antitestek felismerik a fúziós fehérje antigénrészét. Az immobilizált antitestek a fehérjét az oszlopban tartják, míg a felülúszó nemkívánatos komponensei eluálódnak. Az oszlop körülményeit aztán úgy változtatják, hogy az antigén-antitest komplexum disszociáljón. Ezt követően a fúziós fehérjét eluálják és összegyűjtik.
A 4,734,399 számú (1988. március 29., Félix és munkatársai) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás növekedési hormont felszabadító faktor analógokra vonatkozik. Néhány olyan analógot írnak le benne, amelyek Tyr-Ala és His-Ala terminálisokat tartalmaznak. Azonban ezek a molekulák nem fúziós fehérjék, hanem inkább csak magfehérjék. A Félix és munkatársai szerinti N-terminális dipeptidek
-9részei a bGRF analóg magmolekulának.
Az 1987. május 6-án, 0 220 958 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben N-terminális maradékok szelektív kémiai eltávolítását írják le. A találmány olyan eljárásra és az eljárásban alkalmazható vegyületekre vonatkozik, amelyek N-terminális maradékoknak a kívánt polipeptidről való eltávolítására használhatók. A kívánt polipeptid fúziós fehérjeként létezik, benne a kívánt polipeptid az N-terminálisán egy X-Pro általános képletű linkerhez kapcsolódik. A fúziós fehérjét speciálisan puffereit körülmények közzé helyezve a fúziós fehérje X-Pro részében egy diketopiperazin képződik, majd lehasad, így a fúziós fehérjéből a kívánt polipeptid keletkezik. Az EPO 220,958 (’958 ) fúziós fehérjéi nem tartoznak a jelen találmány körébe, mivel a jelen találmány szerint, ha az N-terminálison levő hosszabbító rész csak egy dipeptid, azaz, ha A nincs jelen, n értéke 0 és Y egy, a természetben előforduló aminosav, Y vagy alanin, szerin vagy treonin. így, ha a hosszabító rész dipeptid, képlete X-Ala, X-Ser vagy X-Thr. A ’958-as bejelentés szerint az X-Pro dipeptidet kémiai, és nem enzimatikus úton hasítják le. A ’958-as bejelentés szerint az X-Ala, X-Ser és X-Thr dipeptid nem hasítható azzal a típusú kémiai reakcióval, amely az X-Pro részt vágja le a magfehérjéről.
Az AU-A-12709/88 számon nyilvánosságra hozott ausztráliai szabadalmi bejelentésben olyan fúziós fehérjéket ismertetnek, amelyek immobilizált fémaffinitásos kromatográfiában (IMAC) használható affinitásos peptideket tartalmaznak. A leírt affinitásos peptidek legalább két
-10szomszédos hisztidinmaradékot tartalmaznak. Az ismertetett IMAC tisztítási módszer alkalmazásához egy speciális kémiai eljárás szükséges a nitrilo-triecetsav-gyanták (NTA) előállítására.
Tallon, M. A. és munkatársainak cikke [Biochem. 26, 7767-7774 (1987)] Saccharomyces cerevisiae-ből származó tridekapeptid alfa-faktor meghosszabbított analógok szintézisére vonatkozik. Az előállított analógok meghosszabbított alfa-faktorok, amelyek természetben előforduló pro-alfafaktor szekvenciákat képviselnek az MFalfal szerkezeti génben.
Kriel, G. és munkatársai az Eur. J. Biochem. 111:49-58 (1980) irodalmi helyen a melittin prekurzor (Promelittin) N-terminális részének dipeptidilpeptidázzal való lépésenkénti hasítását írják le. A promelittin a mézelő méh mérgének a fő komponense. A prekurzor N-terminálisának aminosavszekvenciájában minden második maradék prolin vagy alanin. Amikor a promellitint sertés veséből izolált DPP IV hatásának teszik ki, a prekurzor N-terminális része lépésenként lehasad, és így az érett fehérje keletkezik. A promelittin, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjéktől eltérően, természetben előforduló fehérje.
Julius, D. és munkatársai a Cell, 32:839-852 (1983. március) irodalmi helyen található publikációban az élesztő alfa-faktornak egy nagyobb prekurzor polipeptidből való előállítási eljárásáról és a membránhoz kötött DPP IV ezen eljárásban játszott szerepéről írnak. Az élesztő alfafaktor, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjéktől eltérően, természetben előforduló fehérje.
-11Mollay, C. és munkatársai (Eur. J. Biochem. 160:31-35 (1986) a DPP IV enzimnek a Xenopus laevis bőrváladékából való elkülönítését és a DPP IV aktivitását ismertetik.
Mentlein, R. [FEB,234(2):251-256 (1988. julius)] prolin maradékokról számol be peptid hormonok és neuropeptidek érése és lebomlása során. Azt írja, hogy emlősökben prolin specifikus proteázok, mint a DPP IV, nem vesznek részt a szabályzó peptidek bioszintézisében, de fontos szerepet játszhatnak azok lebontásában. Ebből arra következtet, hogy míg a gerincesekben és kisebb gerincesekben a prekurzor fehérjék érett formává való átalakítása a DPP IV enzimtől függ, addig a szabályzó fehérjék az emlősökben a DPP IV-et általában lebontási proteázként használják.
Frohman, L. A. és munkatársai a J. Clin. Invest. 78:906-913 (1986) irodalmi helyen megjelent közleményéből megtudjuk, hogy a humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) és analógjai in vivő emberekben és in vitro plazma DPP IV hatására gyorsan degenerálódnak.
Frohman, L. A. és munkatársai [J. Clin. Invest. 83:1533-1540 (1989)] arról számolnak be, hogy a humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) és analógjai in vivő emberekben és in vitro plazma DPP IV hatására gyorsan degenerálódnak.
Kubiak, T. M. és munkatársai a Drug Metabolism and Disposition, 17(4):393-397 (1989) irodalmi helyen a szarvasmarha növekedési hormont felszabadító faktor (bGRF) analógok szarvasmarhában és sertés plazmában in vitro végbemenő metabolikus lebomlását és annak a plazma DPP IV aktivitásé/ val való kapcsolatát ismertetik. A vizsgált bGRF analógok az
-12N-terminális 2-helyzetében Alá maradékot tartalmaztak. Arról számolnak be, hogy a bGRF plazmában való metabolikus lebomlása a DPP IV plazmában való jelenlétének köszönhető.
Hong, W. és munkatársai [Biochemistry, 28:8474-8479 (1989)] enzimatikusan aktív DPP IV kínai hörcsög petesejtjében, transzfekció után való kifejezéséről számolnak be.
Kreil, G. [TIBS 15:23-26 (1990 január)] prekurzorok végtermékké alakítása során dipeptidek DPP-kkel való lépésenként! hasítását ismerteti. A prekurzorok, amelyekről Kreil ír, a természetben előforduló fehérjék. A jelen találmány szerinti fehérjék a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék.
Boman és munkatársai a J. Bioi. Chem. 264:5852-5860 (1989) irodalmi helyen mutatják be, hogy a cecropia pupaeből izolált dipeptidilpeptidáz (a DPP IV-hez hasonló specifitású enzim) képes volt a cecropia A és B természetes prekurzorairól készült szintetikus másolatok N-terminálisáról az Ala-Pro-Glu-Pro természetes N-terminális szekvenciát eltávolítani. A Boman által ismertetett preprocecropin természetben előforduló fehérje.
Dalboge, H. és munkatársai [Bio/technology, 5:161-164 (1987.február) E. coli által termelt humán növekedési hormon prekurzorának autentikus hGH-vá való in vitro átalakítását írják le. A prekurzornak az N-terminálison kapcsolódúó részét dipeptidilpeptidáz I enzimmel távolították el.
Dalboge, H. és munkatársai [FEBS, 246(1,2):89-93 (1989 március)] az IL-lbéta prekurzor klónozását és kifejezését, valamint IL-lbétává való alakítását írják le, amely eljárás
-13során a prekurzor N-terminálishoz kapcsolódó részét dipeptidilpeptidáz I-gyel távolítják el.
Dalboge, H. és munkatársai [FEBS, 266(1,2):1-3 (1990. június)] E. coli-ban N-terminális metionin in vivő eltávolításáról számolnak be. Azt találták, hogy az N-terminális metioninnak a meghosszabbított humán növekedési hormonból való eltávolítása a metioninnal szomszédos aminosavtól függ.
Hopp, T. P. és munkatársai a Bio/Technol. 6:1204-1210 (1988. október) irodalmi helyen arról írnak, hogy egy kívánt rekombináns limfokin N-terminálisához egy nyolc aminosavból álló peptidet adtak, hogy antigénes N-terminálist hozzanak létre, amely aztán immunoaffinitásos tisztítási eljárásban használható. Ez a közlemény megfelel a fentebb említett, 4,782,137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak.
Smith, M. C. és munkatársai [J. Bioi. Chem. 263, 15:7211-7215 (1988) olyan kísérleti eredményeket ismertetnek, amelyek alátámasztják azt a feltételezést, hogy egy kis peptid amino-terminálisán specifikus fémekkel kelátot képező peptidek használhatók a fehérje fémion affinitási kromatográfiás eljárással való tisztítására. Ez a közlemény a fentebb említett, 4,569,794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egyik példájának adatait is közli. Közelebbről, a His-Trp fémmel kelátot képező peptid alkalmazása luteinizáló hormont felszabadító hormonhoz vagy proinzulinhoz kapcsolva lehetővé teszi a kimérás peptid IMAC módszerrel való tisztítását, ugyanakkor a kontroll molekulák, amelyek nem tartalmazzák a His-Trp linkért, ilyen módon nem nyerhetők ki.
-14Hochuli, E. és munkatársai [J. Chromat. 411:177-184 (1987)] a fémkelát affinitásos kromatográfiás eljárásban adszorbensként használható nitrilo-triecetsavat ismertetik. Arról számolnak be, hogy a fenti abszorbens, Νΐώ -vei töltve szomszédos hisztidinmaradékokat tartalmazó peptidek és fehérjék megkötésére használható.
Ljungquist, C. és munkatársai az Eur. J. Biochem.
186:563-569 (1989) irodalmi helyen az Ala-His-Gly-His-ArgPro fémmel kelátot képző peptid kétszeresének, négyszeresénekó és nyolcszorosának alkalmazását írják le immobilizált Zn^+ ionokat tartalmazó oszlopon. Ljungquist szerint ilyen fémmel kelátot képző peptid cinkoszlopokkal együtt való alkalmazáskor várakozáson felüli jó eredménnyel tisztíthatok a fúziós fehérjék.
A jelen leírásban a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, a természetben elő nem forduló fúziós polipeptidek, fúziós polipeptidek és fúziós fehérjék kifejezések felcserélhető módon olyan fehérjékre és polipeptidekre utalnak, amelyek normális esetben a természetben nem fordulnak elő, és amelyek egy magfehérje részből és egy hosszabbító részből állnak.
A magfehérje, magfehérje rész és a polipeptid rész a fúziós polipeptidnek a molekula C-terminálisán levő részét jelenti, és a hosszabbító rész hiányában ez a kívánt polipeptid és/vagy biológiailag aktív fehérje, amely többek között valamely természetben előforduló biológiailag aktív fehérje és polipeptid, valamint ezek valamely analógja és mutánsa lehet.
Az N-terminálison levő hosszabbító rész az első és
-15| C billeg feljebb kb. 45 aminosavra utal az N-terminálistól kezdve, amely(ek) a magfehérjének nem része(i).
Az elögyógyszer (prodrug) meghatározás olyan fúziós fehérjéket jelent, amelyekben a biológiailag kívánt rész egy biológiailag aktív fehérje, amely gyógyszerként használható .
A biológiailag aktív fehérje és biológiailag aktív polipeptidek megnevezés felcserélhetöen olyan fehérjékre és polipeptidekre utal, amelyek biológiai aktivitással rendelkeznek.
A kívánt fehérje és a kívánatos fehérje felcserélhető módon olyan fehérjéket és polipeptideket jelent, amelyeket tiszta formában kívánunk előállítani.
A hosszabbító rész a fúziós fehérje azon részére utal, amelyik egy N-terminálishoz kapcsolódó hosszabító rész, és amely nem része a biológiailag kívánatos fehérjének .
A DPP IV-gyel hasítható N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész a fúziós fehérje azon hosszabbító részét jelenti, amelynek az aminosav-szekvenciája lehetővé teszi a DPP IV enzimmel való lépésenkénti hasítást.
A szekvenciákat felsoroló részben néhány aminosavmaradékot Xaa-val jelöltünk a szekvencia leírásában. Erre a következő értelmezések érvényesek:
A 3-as azonosítási számú szekvenciában Xaa^ a C-terminálison amidéit argininilmaradékot jelent.
A 4-es azonosítási számú szekvenciában Xaa^$ a C-terminálison amidéit argininilmaradékot jelent.
Az 5-ös azonosítási számú szekvenciában Xaa^ a C-16 terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 14-es azonosítási számú szekvenciában Xaa^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 18-as azonosítási számú szekvenciában Xaa^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
ο Q
A 19-es azonosítási számú szekvenciában Xaa°° terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 20-as azonosítási számú szekvenciábaqn Xaa^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 21-es azonosítási számú szekvenciában Xaa4^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 24-es azonosítási számú szekvenciában Xaa^7 terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 25-ös azonosítási számú szekvenciában Xaa^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 26-os azonosítási számú szekvenciában Xaa^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
Q C
A 27-es azonosítási számú szekvenciában Xaa°3 terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
x Q 7
A 28-as azonosítási számú szekvenciában Xaa terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 29-es azonosítási számú szekvenciában Xaa terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 30-as azonosítási számú szekvenciában Xaa^ terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 31-es azonosítási számú szekvenciában Xaa° terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 32-es azonosítási számú szekvenciában Xaa a Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca Ca Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
-17A 33-as. azonosítási számú szekvenciában Xaa4® a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 34-es azonosítási számú szekvenciában Xaa4^ a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 35-ös azonosítási számú szekvenciában Xaa4^ a cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 36-os azonosítási számú szekvenciában Xaa^l a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 37-es azonosítási számú szekvenciában Xaa^l a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 38-as azonosítási számú szekvenciában Xaa^ a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 39-es azonosítási számú szekvenciában X3^ a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 40-es azonosítási számú szekvenciában Xaa^ a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 41-es azonosítási számú szekvenciában Xa33 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 42-es azonosítási számú szekvenciában Xaa^ a Cterminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 43-as azonosítási számú szekvenciában X33 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A jelen találmány javított fehérjékre és polipeptidekre vonatkozik. A jelen találmány szerinti biológiailag aktív polipeptideket először két részből álló fúziós fehérjeként állítjuk elő, az első rész a magfehérje rész; és a második egy N-treminálison kapcsoldó hosszabbító rész, amely a lánc végén levő karboxicsoportjával kovalensen kötődik az első rész láncvégi aminocsoportjához. A fúziós polipeptid N (60?
-18terminálishoz kapcsolódó hosszabbító részének olyan az aminosavszekvenciája, amely a dipeptidilpeptidáz IV (DPP IV) által hasíthatóvá teszi.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérje a következő képlettel jellemezhető:
hosszabbító rész - magfehérje rész, ebben a hosszabbító rész a DPP IV-gyel hasítható, Nterminálishoz kapcsolódó hosszabbító részt jelenti, egy kovalens peptidkötés; és a magfehérje rész bármely olyan kívánt peptidet jelöl, amely a hosszabbító rész DPP IV-gyel való lehasításakor felszabadul.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérje hosszabbító része az
A-X-Y(X’-Y)n általános képletnek felel meg, amelyben
A adott esetben van jelen, és amikor jelen van metionint jelent, n a szekvenciálisán kapcsolódó X’-Y csoportok számát jelenti, amely 0 és 20 közötti, előnyösen 0 és 10 közötti lehet;
X bármely, a természetben előforduló aminosav;
Y prolin, alanin, szerin vagy treonin, kivéve, ha n értéke 0, mert akkor Y alanin, szerin vagy treonin;
X’ bármely, a természetben előforduló aminosav, kivéve a prolint vagy hidroxi-prolint.
A képlet szerint, amikor n = 1, két Y maradék van. Továbbá, legfeljebb 21 Y maradék és 20 X’ maradék lehet egyetlen molekulában. Az egyes Y maradékok és X’ maradékok a megadottak köréből bármely csoportot jelenthetik. Azaz,
-19egyetlen molekulában nem kell az összes Y maradéknak azonosnak lennie. Hasonlóképpen, az egynél több X’-t tartalmazó molekulában minden egyes jelenlevő X’ maradék a prolin és hidroxi-prolin kivételével bármely aminosavmaradék lehet, függetlenül attól, hogy a többi X’ milyen maradékot jelent. Minden egyes Y és X’ maradéknak meg kell felelnie az adott csoportra vonatkozó szabályoknak, és mindössze az szükséges, hogy a speciális helyzetekben levő különböző maradékok kövessék a fentebb ismertett szabályokat.
Az olyan fúziós fehérjék, amelyekben (A) metioninként (Met) jelen van, olyan szekvenciát képviselnek, amely alkalmas biológiailag aktív fehérjék rekombináns DNS módszerrel E.coli-ban való előállítására. A Met szekvencia jelenléte ezekben a prekurzorokban általában az E. coli enzimatikus rendszere segítségével vagy más, a szakember számára ismert módszerekkel eltávolítható. Az E. coli-ban történő fehérjeszintézis, normális körülmények között a Met-t kódoló AUG transzlációs iniciációs kodon iniciálásával kezdődik. Ennek eredményeként az újonnan szintetizált polipeptidek N-terminális aminósavként metioninmaradékot tartalmaznak. Az E. coli olyan enzimatikus aktivitással rendelkezik, amely hatásosan eltávolítja az N-terminális metionint, ha a Met N-terminális maradék egy aránylag kis oldalláncú, például Gly, Alá vagy Ser, valamint Pro aminosavval szomszédos. Az N-terminális metionint nagy szelektivitással távolíthatjuk el bróm-cián által közvetített hasítással. Azonban, hogy ez az eljárás sikeres legyen, az N-terminális metioninnak az egyetlen metioninnak kell lennie az egész fehérjeszekvenciában; egyébként a hasítás a széklé-W
-20venciában levő minden metionin után végbemegy. A fentieknek megfelelően, belső Met szekvenciát tartalmazó fúziós fehérjék esetében az N-terminálistól számított második aminosavnak prolinnak, glicinnek, alaninnak vagy szerinnek kell lennie, ha a Met aminosavmaradékot E. coli enzimatikus rendszerrel kívánjuk eltávolítani.
A fúziós polipeptidek mellett a jelen találmány rekombináns DNS molekulákra, amelyek a fúziós polipeptidet kódoló DNS szekvenciákból állnak; az ilyen rekombináns DNS molekulákat alkalmazó eljárásokra; a fúziós polipeptidek alkalmazási eljárására vonatkozik, beleértve a kívánt polipeptidek tisztítási eljárásait és a gyógyszer adagolási módszereket, amelyek abból állnak, hogy olyan előgyógyszereket adagolunk, amelyek a prekurzorból az N-terminálison kapcsolódó hoszszabbító rész in vivő, lépésenként történő proteolitikus eltávolítása útján alakulnak biológiailag aktív formává.
A fúziós polipeptideket standard peptidszintézissel vagy rekombináns DNS technikával állíthatjuk elő, a szakember ezeket a módszereket jól ismeri. A peptidszintézis az előnyös eljárás a kb. 50 vagy ennél kevesebb aminosavat tartalmazó polipeptidek előállítására. Nagyobb molekulák esetében gazdasejtekben, rekombináns DNS technológiával való előállítás az előnyösebb.
Azok a fúziós peptidek, amelyek N-terminálishoz kapcsolódó, a DPP IV által felismerhető és hasítható részt tartalmaznak, a csak a magfehérjéból álló, módosítatlan polipeptideknél hasznosabbak és előnyösebbek. A jelen találmány két különösen hasznos alkalmazási területet ismertet.
-21Az első alkalmazás olyan, előgyógyszer-nek nevezett fúziós polipeptidek rendelkezésre bocsátása, amelyek gyógyszerként használható biológiailag aktív polipeptidekből és ahhoz kovalensen kötött, a DPP IV által hasítható N-terminálishosszabbító részből állnak. Ezek az előfonnák biológiailag aktív formákká alakíthatók annak az embernek vagy más állatnak a testében levő DPP IV enzim általi hasítással, amelynek az előgyógyszert beadják. Ennek megfelelően a jelen találmány előgyógyszerként használható fúziós polipeptidekre, fúziós polipeptidek gyógyászati készítményben való alkalmazására és biológiailag aktív polipeptidek betegeknek való adagolási eljárására vonatkozik. A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidek második alkalmazási területeként a fehérjék tisztítási eljárását említhetjük, amelyben a polipeptid N-terminálisához kapcsolódó hoszszabbító rész teszi lehetővé a vegyület hatékony tisztítását, és ez a hosszabbító rész aztán DPP IV enzimmel való hasítással eltávolítható. Ennek megfelelően a jelen találmány olyan fúziós polipeptidekre, amelyek tisztítási eljárásokban felhasználhatók, valamint kívánt polipeptidek tisztítási eljárására vonatkozik. Ezek az alkalmazási lehetőségek csak példaként szolgálnak a jelen találmány hasznosságának szemléltetésekor, és a találmányt semmilyen vonatkozásban nem korlátozzák.
Mindkét alkalmazás esetében a fúziós fehérje magfehérje részét a hosszabbító résztől DPP IV enzim segítségével szabadítjuk meg. A tisztítási eljárásokban használt fúziós fehérjéknél nemkívánatos, hogy a magfehérjék a DPP IV hasítás szubsztrátumai legyenek. Azaz, előnyös, ha a DPP IV
-22nem képes a magfehérjét hasítani, miután a hosszabbító részt el távolítóttűk. Gyakran az a legkívánatosabb, ha a magfehérje DPP IV szubsztrát, hogy elögyógyszerként adagoljuk. Ilyen esetekben az előgyógyszer a magfehérje elnyújtott jelenlétét eredményezheti, mivel az in vivő (például plazmában, veseszövetben és májszövetben) jelenlevő DPP IV kerül felhasználásra az N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész eltávolítására, és így a magfehérje lebomlásának késleltetésére. Azaz, a fúziós fehérje hosszabbító része a DPP IV szubsztrátjaként és kompetitív inhibitorként szerepelhet, késleltetve a DPP IV magfehérjére gyakorolt hatását, ezáltal időlegesen védve a magfehérjét.
Az előgyógyszer itt olyan fúziós fehérjét jelent, amely az N-terminálishoz kapcsolódóan DPP IV által hasítható hosszabbító részt tartalmaz, amely kovalensen kötődik egy magfehérje részhez, amely biológiailag aktív polipeptid, és gyógyszerként használható. A jelen találmány szerint az előgyógyszert egyedüli előformaként vagy más vegyületekkel együtt adagolhatjuk. Az előnyös kiviteli alak az elögyógyszer egy jól meghatározott egyedi alakja. Mindegyik esetben az előalakokat a természetben előforduló, normálisan a testben található DPP IV enzim alakítja át.
Az előgyógyszer gyógyászati készítmny formájában való adagolásának előnye, hogy késlelteti a hatást és/vagy a biológiailag aktív fehérje jelenlétét meghosszabbítja. Az előgyógyszer nem-hatásos állapotban létezhet addig, amíg a hosszabbító rész megfelelő része lebomlik, és a molekula hatásossá válik. Az előgyógyszerek, ezért időben késleltető gyógyszeradagoló rendszerként működhetnek. Továbbá, az N
-23terminálishoz kapcsolódó különböző hosszabbító részek különböző sebességgel bomlanak, a hosszuktól és az aminosavszekvenciájukban jelenlevő speciális maradékoktól függően. Az N-terminálison eltérő hosszabbító részt tartalmazó különféle előgyógyszerformák kombinációját hozhatjuk létre, amely a betegben egy bizonyos ideig a hatóanyag időben nyújtott, állandó szinten történő leadását biztosítja. Az előgyógyszerek ily módon késleltetett hatóanyagleadó rendszerként működhetnek.
Mint már az előzőekben említettük, a DPP IV a polipeptid N-terminálisáról egy dipeptidet hasít le, feltéve, hogy bizonyos helyzeteket bizonyos maradékok foglalnak el. A leírásban az 1-es helyzet az N-terminális aminosavmaradékra utal. A 2-es helyzet annak az aminosavmaradéknak a helyzetét jelenti, amely az 1-es helyzettel közvetlenül szomszédos, és amely az N-terminálistól számítva a második. A 3-as helyzet megjelölés arra az aminosavmaradék helyzetre vonatkozik, amely a 2-es helyzettel közvetlenül szomszédos, és az N-terminálistó1 számítva a harmadik. Az Nterminális dipeptid hasítása a 2-es és 3-as helyzet között megy végbe, feltéve, hogy a 3-as helyzetű aminosav nem prolin vagy hidroxi-prolin, és a 2-es helyzetű aminosav a következő öt aminosav, prolin (Pro), hidroxi-prolin (Hyp), alanin (Alá), szerin (Ser) vagy tréonin (Thr) egyike.
A DPP IV az N-terminális maradékokat különböző sebességgel hasítja, attól függően, hogy a négy aminosav közül melyik van a 2-es helyzetben. A legtöbb esetben a DPP IV a hasítást illetően akkor a leghatékonyabb, ha a 2-es helyzetet prolin foglalja el, és ezt követően az aktivitása akkor
-24a legnagyobb, ha a 2-es helyzetben alanin található. Amikor az 1-es helyzetet tirozin, fenil-alanin vagy hisztidin foglalja el, a DPP IV körülbelül olyan hatékonysággal működik, mint amikor a 2-es helyzetben prolin- vagy alaninmaradék van. A DPP IV ezt követő hatékonysággal akkor működik, ha a 2-es helyzetben szerin található. Az enzim a legkisebb aktivitást akkor mutatja, ha treonin a 2-es helyzetű aminosav.
Ezen ismereteket felhasználva számos N-terminális hosszabbítást tervezhetünk, amelyek különböző sebességgel hasíthatok. így egy adagolandó gyógyszer állhat egy speciális előgyógyszerből vagy előgyógyszer-formák kombinációjából. Az egyes előgyógyszerek, amelyekben az N-terminálishoz különféle hosszabbító részek kapcsolódnak, az aminosavszekvenciájuktól függő sebességgel fognak átalakulni. Az előgyógyszer-formák kombinációja olyan készítménnyé formálható, amely egy sor előgyógyszert tartalmaz, és azok biológiailag aktív polipeptiddé való átalakulása időben elhúzódóan megy végbe.
A maszkírozó maradék hossza és aminosavszekvenciája egyaránt befolyásolja a DPP IV enzim általi hasítás sebességét. A csak prolinból álló vagy majdnem minden Y változó helyén prolint tartalmazó hosszabbító rész hasad a leggyorsabban, míg az Y helyén treonint tartalmazó a leglassabban. Emellett ismert, hogy az X-Pro dipeptidegységek, amelyekben X vagy glutamin vagy aszparagin, sokkal lasabban hasadnak, mint azok a megfelelőik, amelyekben X semleges vagy bázikus aminosavmaradék. Mivel a hosszabbító részek különféle (négy) maradékokat tartalmazhatnak a hosszabbítás
-25minden hasítható helyzetében, a variációk és permutációk igen nagy száma fordulhat elő.
Bármely biológiailag hatásos polipeptid használható polipeptid gyógyszerként. A PCT/US90/02923 és PCT/US91/08248 számú nemzetközi, valamint a 07/368,231 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések, amelyekre ezúton utalunk,szarvasmarha növekedési hormont felszabadító faktor analógokat ismertetnek, amelyek gyógyászati készítmények előállítására, a jelen találmánynak megfelelően, előgyógyszerként használhatók. Ezekben a bejelentésekben szereplő bármely analóg alkalmazható a jelen találmány szerinti fúziós fehérje magpeptidjeként. Az ilyen magfehérjerészekből és a hozzájuk kapcsolódó hosszabbító részekből álló fúziós fehérjéket a szakember számára jól ismert eljárásokkal állíthatjuk elő.
A jelen találmány megvalósításának más kiviteli példáiként a hormonokat, receptorokat, enzimeket, raktározó fehérjéket és vérfehérjéket említjük. Speciális példák a következők: vazoaktív intesztinális peptid (VIP); humán béta-kazomorfin; gyomor gátló peptid (GIP); gyomor felszabadító peptid (GRP); Hl humán peptid; YY humán peptid; a glukagonszerű peptid-1 7-37 fragmentuma; glükagonszerű peptid-2; P anyag; Y neuropeptid; humán hasnyálmirigy polipeptid; inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1); humán növekedési hormon (hGH); szarvasmarha növekedési hormon (bGH); sertés növekedési hormon (pGH) ; prolaktin (PRL); humán, szarvasmarha, sertés vagy juh növekedési hormont felszabadító faktor (GRF) ; interleukin-lbéta (IL-lbéta); EGF; IGF-2; glukagon; kortikotropint felszabadító faktor
-26(CRF); dinorfin; szomatosztatin-14: endotelin; transzformáló növekedési faktor alfa (TGF-alfa); transzformáló növekedési faktor béta (TGF-béta); interleukin-4; interleukin-6; ideg növekedési faktor (NGF); tumor nekrózis faktor (TNF); inzulin; fibroblaszt növekedési faktor (FGF); interferon; CD4; és interleukin-2 (IL-2) vagy ezek szintetikus vagy bioszintetikus analógjai. Ezek a polipeptidek a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék magfehérje részeként is alkalmazhatók. A fentebb felsorolt polipeptidek csak a kiviteli alakok példáiként szolgáltak, és a jelen találmány körét semmiképpen nem korlátozzák.
A jelen találmány szerinti kisebb fúziós peptideket például szilárdfázisú módszerrel, az Applied Biosystems 430A típusú peptidszintetizátorral (Applied Biosystems, Foster City, California) állíthatjuk eló, amely módszert a PCT/US90/02923 számú nemzetközi és a 07/368,231 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések részletesen ismertetik.
A nagyobb molekulák esetében az előállítás előnyösen rekombináns DNS módszerrel, gazdasejtekben történik. Azon szakemberek számára, akik fúziós fehérjéket rekombináns DNS technológiával kívánnak előállítani, különféle módszerek állnak rendelkezésre. Általában a kívánt polipeptidet kódoló géneket expressziós vektorokba iktatják, amelyeket aztán megfelelő gazdasejtek inszerciós transzformálására vagy transzfektálására használnak. A beiktatott gén aztán a gazdasejtben kifejeződik, és a kívánt polipeptid termelődik. A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidek hasonló módon való előállításához a géninszert egy további DNS szekvenciát
-27is tartalmaz. Közelebbről, az N-terminálishoz kapcsolandó hosszabító részt kódoló DNS operábilisan hozzá van kapcsolva a kívánt polipeptidet kódoló gén 5’-végéhez. Ezt a további genetikus anyagot az expressziós vektor promoterjétól downstream kell elhelyezni, hogy a promoter kontrollja alatt legyen. Ezen felül, ezt a részt a génnel tökéletes leolvasási keretbe kell helyezni, úgy hogy a kifejezett fehérjetermékben a hosszabbító rész kovalensen kötődjön a kívánt polipeptidhez.
Ezért, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék rekombináns DNS technológiával való előállításához olyan oligonukleotidokat kell tervezni, amelyek a kívánt, Nterminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész aminosavszekvenciáját kódolják, és ezeket az oligonukleotidokat a magfehérjerészt kódoló gén 5’-végéhez képest upstream kell operábilisan inszertálni, kimérés gént hozva létre. Az oligonukleotidok előállításának módjai és a kimérás gén termelésére használt technikák a szakember számára jól ismertek.
A fúziós fehérjék előgyógyszerként való alkalmazása mellett a jelen találmány biológiailag aktív rekombináns polipeptidek tisztítására és átalakítására is kitérjed.A kívánt biológiailag akív rekombináns polipeptideket legelőnyösebben oldható vagy a gazdából kiválasztott formában állítjuk elő. A jelen találmány szerint a fúziós fehérje hosszabbító részét tisztítási segédeszközként hasznosíthatjuk. A fúziós fehérjét megtisztítjuk a kiválasztási közegben vagy extrakciós oldatban mellette jelenlevő anyagoktól, és aztán a magfehérjéről eltávolítjuk a hosszabbító részt, így
-28a kívánt fehérjét tisztított állapotban kapjuk. Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék előállítására legalkalmasabb, kívánt fehérjék azok a biológiailag aktív polipeptidek, amelyek maguk nem szubsztrátok a DPP IV hasításhoz.
A jelen találmánynak megfelelően egy kívánt fehérjét kódoló génszekvenciát elkülönítünk, szintetizálunk vagy másképpen kapunk, és operábilisen egy, a hosszabbító részt kódoló DNS szekvenciához kapcsoljuk. A hibrid gént, amely a kívánt fehérjét egy, a hosszabbító részt kódoló DNS szekvenciához operábilisan kapcsolva tartalmazza, kimérás génnek nevezzük.
A kimérás gének és rekombináns vektorok előállításának, ezek felhasználásával a gazdasejtek transzformálásának vagy transzfektálásának, a vektorok gazdasejtekben való replikációjának és biológiailag aktív idegen polipeptidek és fehérjék kifejezésének módszereit és anyagait a Principles of Gene Manipulation (A génmanipulálás elvei) (Old and Primrose, 2nd edition, 1981) című munkában és Sambrook és munkatársai Molecular Cloning (Molekuláris klónozás) (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, 1989) című könyvében ismertetik, amelyekre ezúton utalunk.
A jelen találmány rekombináns kimérás génekre, amelyek fúziós fehérjéket kódolnak, ezeket tartalmazó kifejező vektorokra, ezekkel a kifejező vektorokkal transzformált vagy transzfektált gazdákra, és ezen gének, kifejező vektorok előállítási eljárására és ezen vektorokkal transzformált vagy transzfektált gazdákra is vonatkozik.
A jelen találmány bármely prokarióta vagy eukarióta
-29fehérje tisztítására használható, amely rekombináns DNS technológia termékeként egy transzformált vagy transzfektált gazdasejtben kifejezhető. Ezek a rekombináns fehérje termékek lehetnek hormonok, receptorok, enzimek, tároló fehérjék, vérfehérjék, mutáns fehérjék, amelyeket biotechnológiai úton állítunk elő, vagy szintetikus fehérjék. Az előállított kívánt fehérjék között lehet például HÍV RNáz H, tPA, IL-1, IL-1 receptor, CD4, humán ideg növekedési faktor, SCD4-PE40, humán légzési syncytial vírus (RSV) FG kimérás glikoprotein (ld. a 7/543,780 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést), EGF, IGF-1, IGF-2, glukagon, kortikotropin felszabadító faktor (CRF), dinorfin, endotelin, transzformáló növekedési faktor-alfa (TGF-alfa), Pseudomonus endotoxin 40 (PE40), transzformáló- növekedési faktor-béta (TGF-béta), inzulin és ezek analógjai.
A tisztítási módszerek közül az IMAC és immunaffinitás említhető példaként. A jelen találmány körébe tartoznak más olyan tisztítási eljárások is, amelyek DPP IV enzimmel eltávolítható hosszabbító részt tartalmazó peptideket alkalmaznak.
A jelen találmány egyik foganatosítási módja szerint azok a fúziós fehérjék, amelyek egy biológiailag aktív polipeptid részből és egy fémmel kelátot képező peptid hoszszabbító részből állnak, immobilizált fémaffinitási kromatográfiás rendszerben használhatók.
Az immobilizált fémion affinitási kromatográfia (IMAC) fehérjék frakcionálására való alkalmazását először Porath, J. és munkatársai írták le [Natúré, 258:598-99 (1975)].
Porath egy gyantára imino-diecetsavval (IDA) vitt fel fűnk
-30ciós csoportokat, és ezeket fémionokkal keláttá alakította. Porath szerint immobilizált fémionokat tartalmazó oszlopban a fehérjék immobilizálhatók. Ez a folyamat abból áll, hogy az egyébként gyakran használt imino-diecetsavat egy mátrixhoz kapcsolják, majd az imino-diecetsavat tartalmazó gyantához fémiont adva kelátot képeznek. A fehérjék a fémionokhoz kötődnek az aminosavmaradékok elektront leadni képes funkciós csoportjaival. A potenciális elektronleadó aminosavmaradékok a cisztein, hisztidin és triptofán. A fehérjék a fémionokkal ezen aminosavak közül egynek vagy többnek az elektronleadó oldalláncán át képeznek kötést.
Smith és munkatársai a 4,569,794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyre ezúton utalunk, azt állapítják meg, hogy bizonyos aminosavmaradékok a felelősek a fehérjének az immobilizált fémionokhoz való kötődéséért. Azonban, a megkötött fehérje a pH csökkentésével vagy kompetitiv ellenligandum, például, ha a kötés kialakításában hisztidin oldalláncok is résztvesznek, imidazol alkalmazásával eluálhatók. Hisztidint tartalmazó di- és tripeptideket tartalmazó fehérjéket használtak annak megmutatására, hogy az IMAC szelektív tisztítási módszer. Ennek megfelelően, Smith és munkatársai rekombináns DNS technikával állítottak elő olyan fúziós fehérjéket, amelyekben egy fémmel kelátot képező peptid kovalensen kapcsolódik a kívánt polipeptidhez.
Az IMAC technológia váltakozó hisztidinmaradékokat tartalmazó, fémmel kelátot képező peptidek esetében való alkalmazását ismertetik a 07/506,605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amelyre
-31ezúton utalunk. A 07/506,605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben speciális fémkelátképző peptideket írnak le, amelyekkel váratlanul kiváló eredmények érhetők el valamely fúziós fehérje IMAC tisztításában, ha a fémmel kelátot képező peptid 3-tól 6-ig változó hisztidin maradékot tartalmaz. A 07/506,605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a 4,569,794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás kitanításait követve lehetséges az általánosan használt IDA gyantát az IMAC technikában olyan fúziós fehérjék tisztítására alkalmazni, amelyek legalább három váltakozó hisztidinmaradékot magábafoglaló, fémmel kelátot képező peptidrészt tartalmaznak, és ez a peptidrész a DPP IV által felismert szekvencia alkotórésze. Fúziós fehérjék előállításáról és ezek IMAC rendszerben való alkalmazásáról a 4,569,794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban találunk bővebb ismertetést. A váltakozó hisztidinmaradékokból álló, fémmel kelátot képező peptidrészek előállítására és alkalmazására vonatkozóan a 07/506,605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ad kitanítást. A jelen bejelentés váltakozó hisztidinmaradékok között DPP IV által felismerhető maradékokat tartalmazó fúziós fehérjét bocsát rendelkezésre, amely IMAC technológiával tisztítható, és aztán DPP IV enzimmel hasítva a kívánt polipeptiddé alakítható.
A jelen találmány ezen foganatosítási módja szerint a hosszabbító rész egy fémmel kelátot képező peptid, amely az A-X-Y(X’-Y)n általános képlettel jellemezhető, ebben
-32A adott esetben van jelen, és akkor metionint jelent;
n a szekvenciálisán kapcsolódó X’-Y csoportok számát jelenti, amely szám 0 és 20, előnyösen 0 és 10 közötti;
X bármely, a természetben előforduló aminosav;
Y prolin, alanin, szerin vagy treonin, kivéve, ha n = 0, akkor Y alanin, szerin vagy treonin;
X’ bármely, a természetben előforduló aminosav, kivéve a prolint és hidroxi-prolint;
és amelyben legalább 2-3 X’-vel jelölt csoport van, és adott esetben az X-ek hisztidint jelentenek. Előnyösen az Y prolin és n értéke legalább 3. A vegyület DPP IV enzimmel való kezeléskor a hosszabbító rész lépésenként hasad le, ily módon a biológiailag aktív polipeptid képződik, feltéve, hogy a biológiailag aktív polipeptid maga nem DPP IV szubsztrát.
A fúziós fehérjék egyik csoportja például His-Y(His-Y)n általános képletű hosszabbító részt tartalmaz, amelyben n = 3-8, és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint, legelőnyösebben prolint jelentenek.
A fúziós fehérjék másik példájaként az
X-Y(His-Y)n általános képlettel jellemezhető hosszabbító részt tartalmazókat említjük, ahol a képletben n értéke 3-8, X bármely, a természetben előforduló aminosav; és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint, legelőnyösebben prolint jelentenek.
Mivel az N-terminális metionin az E. coli-ban történő fehérjeszintézis következnménye, és ismert, hogy az E. coli
-33enzimrendszer lehasítja, amennyiben a szomszédos aminosav prolin, glicin, alanin vagy szerin, a
Met-X-Y(His-Y)n általános képletű hosszabbító rész olyan szekvenciát képvisel, amely alkalmas a rekombináns DNS technikával az E. coli-ban intracellulárisan kifejezett biológiailag aktív peptidek vagy fehérjék IMAC módszerrel történő tisztítására és hasítására; a képletben n értéke 3-8, X prolin, glicin, szerin vagy alanin; és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint, legelőnyösebben prolint jelentenek.
Egy másik példában, ha a kívánt peptidet egy adott gazdából transzformáció vagy transz iválasztáss akarjuk előállítani, a vektorokat tervezhetjük oly módon, hogy a fehérje vagy polipeptid egy hosszabbító részt tartalmazó formában választódjék ki, amely rész elősegíti a szállítást, és az
X-Y-(His-Y)n általános képlettel jellemezhető, ebben n = 3-8, X bármely, a természetben előforduló és az adott gazda kiválasztási rendszerével kompatibilis aminosav lehet, és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint jelentenek.
Egy másik, fúziós fehérjéket alkalmazó fehérje tisztítási rendszer az immunoaffinitáson alapúló tisztítás, amely igen megfelel a DPP IV hasításos technológia esetében. Az 1988. november 1-én Hopp és munkatársai részére engedélyezett 4,782,137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyre ezúton utalunk, nagy antigéntu34 lajdonságú N-terminális részből és egy kívánt polipeptid Cterminális részből álló fúziós fehérje szintézisét ismertetik. Hopp és munkatársai szerint a fúziós fehérjét a nyers felülúszóból úgy különítik el, hogy a nyers felülúszót egy immobilizált antitesteket tartalmazó oszlopon engedik át, amikoris az antitestek a fúziós fehérje antigénrészeit felismerik. Az immobilizált antitestek a fehérjét az oszlopban tartják, miközben a felülúszó nemkívánt komponensei eluálhatók. Az oszlopban levő körülményeket aztán úgy változtatják, hogy az antigén-antitest komplex disszociáljon.
A jelen találmány szerint a fúziós fehérje erős antigéntulajdonságú N-terminálisa egy olyan hosszabbító rész, amely DPP IV által felismerhető maradékokat tartalmaz. A Hopp által leírt módon történő elkülönítés után a fúziós fehérjét a jelen találmány szerint DPP IV hatásának tesszük ki, amely a hosszabbító részt eltávolítja. A szakember a Hopp szerinti immunaffinitásos tisztítási eljárást meg tudja valósítani a jelen találmány szerinti N-terminális hoszszabbító részt tartalmazó polipeptidekkel vagy fehérjékkel.
A leírt foganatosítási módok és példák csupán a jelen találmány bemutatására szolgálnak, és semmiképpen nem korlátozzák a találmány körét. Az ekvivalensek magukba foglalják az olyan fúziós fehérjéket, amelyek esetében az N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész eltávolításához legalább egy másik módszer szükséges, úgyhogy a hosszabbító rész eltávolítása módszerek kombinációjának eredménye. Az ekvivalensek körébe tartoznak az olyan fúziós polipeptidek is, amelyek kémiailag módosított aminosavmaradékokat tártál-35máznák.
1példa
Szintetikus előgyógyszerek, amelyek fúziós fehérjék, és magfehérjéjük DPP IV szubsztrát
A szintézissel előállítható és elögyógyszerként adagolható fúziós polipeptidekben egy DPP IV enzimmel bontható Nterminális hosszabbító rész kovalensen kapcsolódik a biológiailag aktív polipeptidhez. Ezen előgyógyszerek a hosszabbító rész - magfehérje gyógyszer rész általános képlettel írhatók le, ahol a hosszabbító rész egy, a DPP IV enzimmel lehasítható N-terminál ishoz kapcsolódó hosszabbító részt, a - jel kovalens peptidkötést, és a magfehérje rész bármely kívánt peptidet jelent, amely a hosszabbító rész DPP IV-gyel való lehasításával szabaddá tehető. Ebben a példában a fúziós fehérje magfehérje része a hosszabbító rész eltávolítása után a DPP IV enzim potenciális szubsztrátja.
A szintetikus előgyógyszereket a szakterületen jól ismert peptidszintézis módszereivel állíthatjuk elő.
Az egyik megvalósítási mód szerint a magfehérje rész az epidermális növekedési faktor (EGF), és a hosszabbító rész Gly-Pro-Phe-Ala, így a fúziós fehérje képlete:
Gly-4-Pro_3-Phe-2-Ala-1-[EGF].
Egy másik esetben a magfehérje rész glukagon és a hosszabbító rész Ala-Pro-Phe-Ala, így a fehérje képlete:
Ala-4-Pro-3-Phe_2-Ala_1-[GLUKAGON].
Egy további fúziós fehérjében a magfehérje rész [Ala^^Leu27]-bGRF(1-29)NH2 (3-as azonosítási számú szekvencia) és a hosszabbító rész Tyr-Ala, a képlet
36Tyr~2-Ala-1-{[Ala15Leu27]-bGRF(1-29)NH2}·
2.példa
Szintetikus elogyógyszerek, amelyek magfehérje része nem DPP IV szubsztrát
A szintézissel előállítható és előgyógyszerként adagolható fúziós polipeptidekben egy DPP IV enzimmel lebontható N-terminális hosszabbító rész kovalensen kapcsolódik a biológiailag aktív polipeptidhez. Ezen előgyógyszerek a hosszabbító rész - magfehérje gyógyszer rész általános képlettel írhatók le, ahol a hosszabbító rész egy, a DPP IV enzimmel lehasítható, N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító részt, a - jel kovalens peptidkötést, és a magfehérje rész bármely kívánt peptidet jelent, amely a hosszabbító rész DPP IV-gyel való lehasításával szabaddá tehető.
A szintetikus előgyógyszereket a szakterületen jól ismert peptidszintézis módszereivel állíthatjuk elő.
Az egyik foganatosítási mód szerint a magfehérje rész egy bGRF analóg, [Val2,Ser8’28,Leu27]-bGRF(1-33 )0H (1-es azonosítási számú szekvencia), és a hosszabbító rész GlyPro-Tyr-Ala, így a fúziós fehérje képlete:
Gly~4-Pro-8-Tyr-2-Ala-l-{[Val2-Ser8’28Ala^3Leu27]bGRF(1-33)0H}.
Egy másik esetben a magfehérje rész kortikotropint felszabadító faktor (CRF) , és a hosszabbító rész Gly-Pro-Phe-Ala, így a fehérje képlete:
Gly-4-Prop~3-Phe-2-Ala-1-[CRF].
Egy harmadik esetben a magfehérje rész dinorfin, és a hosszabbító rész Phe-Pro-Phe-Ala, a képlete pedig
-37Phe-4-Pro-3-Phe~2-Ala_1-[DINORFIN].
Egy további fúziós fehérjében a magfehérje rész szomatosztatin-28, és a hosszabbító rész Gly-Pro-Phe-Pro, így a fehérje képlete:
Gly_4Pro“3-Phe“2-Ala-1-[SZOMATOSZTATIN-28].
Egy még további fúziós fehérjében a magfehérje rész endotelin, és a hosszabbító rész Ala-Pro-Phe-Ala, így a képlet:
Ala-4-Pro-3-Phe-2-Ala-1-[ENDOTELIN] .
Egy következő foganatosítási módnak megfelelően a magfehérje rész bGRF analóg, [I1e2Ser®’28Ala^®Leu27]bGRF(l-40)OH (2-es azonosításiszámú szekvencia), és a hoszszabbító rész Phe-Ala, így a fúziós fehérje képlete:
Phe_2-Ala-1-[[Ile2Ser8’28Ala15Leu27]-bGRF(1-40)OH}.
Egy másik foganatosítási mód szerint a magfehérje rész [Ile2Ala48Leu27]-bGRF(1-29)NH2 (4-es azonosítási számú szekvencia), és a hosszabbító rész Tyr-Ser, a fehérje képlete pedig
Tyr~2-Ser_1-{[Ile2Ala15Leu27]-bGRF(1-29)NH2·
3.példa
A Leu27-bGRF(1-29)NHq bGRF analóg nyújtott jelenléte
Egy bGRF analógot, az 5-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű Leu27-bGRF(1-29)NH2 peptidet, gyógyszerként adagolhatjuk, amely gyógyszer magfehérjeként az 5-ös számú szekvenciából és az N-terminálison változatos hosszabbító részt tartalmazó előgyógyszerekből áll.
Az előgyógyszerek néhány változata az 5-ös azonosítási számú szekvencia magfehérjeként való felhasználásával, jól ismert módszerekkel előállítható. A hosszabbító részek az
-385-ös azonosítási számú szekvencián alapuló elögyógyszerek esetében Ile-Ala, Gly-Pro-Ile-Pro, a 6-os és 7-es azonosítási számú szekvenciák alkalmazásakor Tyr-Ala, Gly-Pro-TyrAla, a 8-as, 9-es, 10-es, 11-es, 12-es és 13-as azonosítási számú szekvenciák esetében pedig Tyr-Ala-Tyr-Ala és Val-Ala.
4. példa
A ÍThr^Ala^^Leu^^l-bGRF(1-29)NHo bGRF analóg nyújtott jelenléte
A [Thr^Ala^^Leu^^j-bGRFÍ1-29)NH2 bGRF analógot, amelynek szekvenciája a 14-es azonosítási számúnak felel meg, gyógyszerként adagolhatjuk, amely magfehérjeként a 14-es azonosítási számú szekvenciából és az N-terminálison különböző hosszabbító részeket tartalmazó előgyógyszerekből áll. Az elögyógyszerek közül hármat készítettünk el, amelyek a Tyr-Thr, Tyr-Ser és Tyr-Thr-Tyr-Thr hosszabbító részeket tartalmazzák.
5. példa
HÍV RNáz H-t és N-terminális hosszabbítást tartalmazó fúziós fehérjék
A rekombináns E. coli-ból származó kimérés fehérjék tisztításának stratégiáját fémmel kelátot képező peptidrészt alapul véve írták le, amely immobilizált fémionokkal szemben affinitást mutató, váltakozó hisztidinmaradékokat tartalmaz. Vektorokat szerkesztünk olyan fúziós fehérjék szintézisének irányítására, amelyek magfehérjeként HÍV RNáz H-t tartalmaznak. Mint az az alábbiakban látható, ezeket a fúziós fehérjéket úgy terveztük, hogy az IMAC módszerrel történő tisztítás céljára váltakozó hisztidineket és a fémmel kelátot képező peptid (mcp) DPP IV enzimmel történő
-39lehasításához váltakozó prolinokat vagy alaninokat tartalmazzanak .
A jelen találmány szerinti előnyös, DPP IV enzimmel hasítható, N-terminális hosszabító részek a következők:
1-es számú HIVRH/mcp fúziós fehérjében a 15-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő N-terminális hoszszabbító rész HÍV RNáz H-hoz kapcsolódik:
Met~ü-Pro-10-Ala-9-His-8-Pro-7-His-6-Pro-5-His-4Pro~3-His_2-Ala_1-[HÍV RNáz H].
A 2-es számú HIVRH/mcp fúziós fehérjében a 16-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű N-terminális hosszabbító rész kapcsolódik a HÍV RNáz H-hoz:
Met-11-Ala_10-Pro_9-His“8-Ala“7-His“6-Ala“5-His-4Ala-3- His“2- Ala-1-[HIV RNáz H].
A 3-as számú HIVRH/mcp fúziós fehérjében a 17-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő N-terminális hoszszabbító rész kapcsolódik a HÍV RNáz H-hoz:
Met-1l-Gly~l9-Pro_9-His-8-Pro-7-His_6-Pro-5-His-4Pro-3-His_2-Ala_1-[HIV RNáz H].
Ezeket a fúziós fehérjéket E. coli-ban klónozzuk és fejezzük ki, majd DEAE adszorbensen kromatografálva és RPHPLC technika alkalmazásával tisztítjuk. A fúziós fehérjék jellemzésére az N-terminális szekvenálást használjuk. Az, hogy rekombináns fehérjék IMAC eljárással való tisztítására váltakozó hisztidint tartalmazó fúziós fehérjéket alkalmazunk, majd az N-terminális hosszabbító részt DPP IV segítségével eltávolítjuk, a jelen találmány hasznosságát bizonyítja.
HÍV RNáz H gént tartalmazó kimérés gének előállítása
-40le^n
Minden rekombináns DNS-t standard technikával állítunk elő. A fémmel kelátot képező peptid/hasítás szekvenciának megfelelő oligonukletidokat hozunk létre, ezeket megtisztítjuk, renaturáljuk, és egy HÍV RNázt kódoló génhez kapcsolva kimérás gént állítunk elő.
Váltakozó hisztidineket/DPP IV által felismert hasítási maradékokat/HIV-RNáz H-t kódoló kifejező vektorok előállítására egy kimérás gént a végsó kifejező vektorba építünk be. A kimérás gén szerkezeteket tartalmazó expreszsziós vektorokat használjuk az E. coli standard technikával történő transzformálására. Az E. coli-ban a gének expreszsziója eredményeként a kimérás gének által kódolt fúziós fehérjék termelődnek. Ezek a fúziós fehérjék HÍV RNáz H aminosavakból és váltakozó hisztidineket tartalmazó (fémmel kelátot képező peptid) és váltakozó prolinokat vagy alaninokat tartalmazó N-terminális hosszabbító részből állnak.
Nyers E. coli extraktumok előállítása és fúziós fehérjék elkülönítése szekvenciameghatározás céljára
Megközelítőleg 3 g E coli sejtpasztát 30 ml 0,25 mólos, 7,2-es pH-jú kálium-szulfátban szuszpendálunk, amely 1 mmol ditiotreitet (DTT), EDTA-t, fenil-metil-szulfonilfluoridot (PMSF) és benzamidin-hidrokloridot, 10 mg/liter aprót inint, leupeptint és besztatint tartalmaz. Ezt a szuszpenziót egy francia présen háromszor átnyomjuk, hogy a sejteket összetörjük. A sejtlizátumot 12 000 rpm mellett 1 órán át centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, és szilárd ammónium-szulfátot adunk hozzá 70%-os telítettségig. 1 órás keverés után a szuszpenziót 12 000 rpm mellett 1 órán
-41át centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, és a pasztillát 2,25 ml 50 mmólos, 7,5-es pH-jú trisz-pufferben újra oldjuk, amely 1 mM DTT-t, PMSF-t és benzamidint tartalmaz. Az oldatot ezután egy éjszakán át 20 mM trisz-puf ferból, 50 mM nátrium-kloridból, 1 mM DTT-böl, 10% glicerinből és 0,1 mM EDTA-ból álló (A) pufferben 4’C-on dializáljuk. Az összegyűjtött dializátumot egy térfogat A pufferrel hígítjuk, és 10 ml mosott DEAE cellulózból készült, A pufferrel egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. A lefolyó folyadékot részletekben gyűjtjük, és az oszlopot még 50 ml A pufferrel tovább mossuk. Ezeket az oldatokat összegyűjtés után bepároljuk, és a 70%-os ammónium-szulfáttal kicsapott anyagot 2 ml A pufferben ismét szuszpendáljuk, majd a fenti módon dializáljuk. Tömény RH-t használunk az N-terminális szekvencia analízissel történő jellemzéshez.
Fúziós fehérjék tisztítása IMAC eljárással
A fémmel kelátot képező peptidnek rekombináns fehérjék nyers extraktumból történő elkülönítésére való használhatóságát a következő, rekombináns E. coli-ban kifejezett kimérák és HÍV RNáz H mint modellfehérje alkalmazásával szemléltethetjük. Az 1-es számú HÍV RNáz H/mcp, a 2-es számú HÍV RNáz/mcp és a 3-as számú HÍV RNáz H/mcp fúziós fehérjék mindegyikét tisztítjuk.
Az IMAC oszlopokat a következőképpen készítjük. A Pharmacia cégtől származó, kelátot képező Sepharose Fást Flow adszorbenst egy zsugorított üvegszűrőn Milli-Q vízzel alaposan mossuk. A gélt ezután ismét vízben szuszpendáljuk, így zagyot kapunk. Ebből 6 ml-t (1x7 cm) óvatosan egy üvegoszlopba (Pharmacia) töltünk. A gél leülepedése után az
-42oszlcpot 5 térfogat 50 mmólos, 8-as pH-jú etilén-diaminotetraecetsav-oldattal, aztán 5 térfogat 0,2 N nátriumhidroxid-oldattal és Milli-Q vízzel mossuk. Az oszlopra ezután 5 térfogat 50 mmólos nikkel-szulfát (vagy cink-klorid vagy réz-szulfát) oldatot viszünk. Az oszlopot végül 5 ágytérfogatnyi egyensúlybahozó pufferrel mossuk. Az egyensúlybahozó puffer 20 mM-os, 8,0-as pH-jú trisz-puffér, amely 500 mm nátrium-kloridot, 1 mM PMSF-et, 1 mM benzamidint, 10 mg/liter leupeptint és 10 mg/liter aprotinint tartalmaz.
Az oszlopot legalább 5 térfogat egyensúlybahozó pufferrel hozzuk egyensúlyba. 5-10 ml nyers rekombináns E. coli extraktumot viszünk az oszlopra gravitáció segítségével. Miután az összes nyers anyag az oszlopba ért, az oszlopot 10 oszloptérfogat egyensúlybahozó pufferrel mossuk, amely 8,0as pH-jú, és az 500 mM nátrium-k1orid helyett 1,0 M nátrium-kloridot tartalmaz.
Az oszlopot aztán imidazolt egyre növekvő koncentrációban tartalmazó, 8,0-as pH-jú egyensúlybahozó pufferrel eluáljuk. A korábbi kísérletek során minden alkalommal számos eluciót végeztünk annak a koncentrációnak a meghatározására, amelynél a kimérás peptid eluálódik. Később ezt az elúciót egyszerűsítettük, és általában csak három imidazolkoncentrációt, azaz 35 mM, 100 mM és 300 mM koncentrációjú, 8,0-as pH-jú egyensúlybahozó pufferrel készült imidazololdatot alkalmazunk. Végül 5 ágytérfogatnyi 50 mmólos, 8,0-as pH-jú EDTA-oldatot engedünk át az oszlopon annak meghatározására, hogy van-e még kötött fehérje az adszorbensen. Az oszlopon az átfolyási sebesség 1,0 ml/perc. 5 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopokkal szobahőmérsékleten dolgozunk.
A minták fehérjetartalmának meghatározására a kereskedelemben kapható Pierce fehérjemeghatározó készletet használjuk .
A HÍV RNáz H aktivitást Becerra, S. P és munkatársai által a FEBS 270(1,2):76-80 (1990. szeptember) irodalmi helyen leírt eljárásával határozzuk meg, amelyre ezúton is utalunk.
Az N-terminálison hosszabbított fúziós fehérjék érett fehérjékké való alakítása
A kereskedelemben kapható, humán placentából származó, 5200 mU/mg fehérje fajlagos aktivitású tisztított DPP IV enzimet (Enzyme Systems Products, Dublin, Ca.) használunk. 1 egység (U) 1 mikromol szintetikus szubsztrát, Ala-Pro-7amino-4-2-trifluor-metil-kumarin 7,8-es pH-értéken 1 perc alatt történő hidrolíziséhez szükséges enzimmennyiség. Az enzimatikus átalakítást úgy végezzük, hogy kb. 1-100 mg fúziós fehérjét 1-10 mg/ml koncentráció mellett 25’C-on, 30 percig DPP IV-gyel, 1:100 enzim:szubsztrát arányt alkalmazva inkubálunk. A kívánt polipeptidet a hasítatlan fúziós fehérje mellől IMAC eljárással különítjük el. Az azonosságot Nterminális szekvenciaanalízissel bizonyítjuk.
6.példa bGRF analóg előgyógyszerek emésztése szarvasmarha plazmában in vitro
Az 1.táblázat foglalja össze azokat a kísérleteket, amelyek a [ Leu27]-bGRF(1-29)NH2 (5-ös azonosítási számú szekvencia) magpeptid három N-terminálisan hosszabított analógjából, azaz a Tyr-4-Ala-3-Tyr-2-Ala-1-{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2) (19-es azonosítási számú szekvencia), Ile ώ-44Alá ^-{[Leu27]-bGRF(1-29)ΝΗ2} (18-as azonosítási számú szekvencia), Tyr-2-Ala-l-{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2) (25-ös azonosítási számú szekvencia) fúziós fehérjékből szarvasmarha plazmában való inkubálással, in vitro történő szabaddá tételét mutatják be. Az inkubációs elegyekben csupán azok a metabolitok voltak kimutathatók, amelyek a DPP IV enzimmel való hasítás során keletkeztek.
A Tyr-4-Ala-3-Tyr-2-Ala-1-{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2} (19es azonosítási számú szekvencia) az idők folyamán szekvenciálisán Tyr-2- Ala-l-{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2 } (25-ös azonosítási számú szekvenciájú) peptiddé, [Leu27]-bGRF(129)NH2 (5-ös azonosítási számú szekvenciájú) magpeptiddé és végül [Leu27]-bGRF(3-29)NH2 (24-es azonosítási számú szekvenciájú) peptiddé alakult.
A Tyr-2-Ala_1-{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2} (25-ös azonosítási számú szekvencia) [Leu27]-bGRF(1-29)NH2 képletú, az 5-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő magpeptiddé, majd a 24-es azonosítási számú szekvenciával azonos szerkezetű [Leu27]-bGRF(3-29)NH2 peptiddé alakul. Magát az 5-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű [Leu27]bGRF(1-29)NH2 magpeptidet a plazma DPP-IV enzimje a 24-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű [Leu27]-bGRF(3-29)NH2 peptiddé alakítja.
Noha a kísérletben alkalmazott HPLC körülmények között más metabolitot nem figyeltünk meg, a [Leu27]-bGRF( 3-29 )NH2 (24-es azonosítási számú szekvenciájú) peptid az idők folyamán eltűnt, ami arra utal, hogy más, nem DPP-IV enzimmel kapcsolatos proteolízisnek is végbe kell mennie, de szignifikánsan kisebb sebességgel. Nemcsak a DPP-IV-gyel hasít
-45ható előgyógyszerekből származtatott mag bGRF peptid volt kimutatható, hanem a fúziós fehérjéből származó magfehérje félideje is meghosszabbodott az in vitro. közvetlenül marha plazmával inkubált magpeptid (5-ös azonosítási számú szekvencia) felezési idejéhez képest (1.táblázat). Emellett, az az időtartam, ameddig az előgyógyszerből felszabaduló magpeptid jelen van, összefüggésben látszik lenni az előgyógyszer hosszabbító részének hosszával: a hosszabbító részben négy aminosavat tartalmazó előgyógyszerből (19-es azonosítási számú szekvenciából) származtatott 5-ös azonosítási számú szekvencia félideje hosszabb volt, mint azé, amely a hosszabbító részben csupán két aminosavat tartalmazó proGRF-ből, például a 18-as vagy 25-ös azonosítási számú szekvenciából származott.
7.példa bGRF analóg előgyógyszerek in vivő és in vitro biológiai aktivitása
Amint az a 2.táblázatban látható, a plazma növekedési hormon (GH) szintje megemelkedett, amikor Holstein növendékmarháknak intravénás injekció formájában a 18-as azonosítási számúnak megfelelő szekvenciájú analógot adtunk be. 0,2 nmol/kg testtömeg dózisnál a plazmában a hormonszint növekedése összemérhető volt azzal az értékkel, amely a magpeptid (5-ös azonosítási számú szekvencia) iv injektálása hatására alakult ki. Fontos hangsúlyozni, hogy a 18-as azonosítási számú szekvenciával rendelkező hosszabbított peptid az 5-ös azonosítási számúnak megfelelő szekvenciájú magpeptid potenciáljának csak mintegy 5%-ával rendelkezett, amikor a két fehérje GH felszabadító hatását in vitro,
hipofízis sejtben vizsgáltuk. Ezért, ezen két peptid in vivő körülmények között mutatott hasonló aktivitása arra enged következtetni, hogy a magpeptid in vivő felszabadult a hosszabbított peptidböl.
Ugyanilyen GH felszabadulás-változást figyeltünk meg in vivő akkor is, amikor négy aminosavmaradékból álló hosszabbítást tartalmazó bGRF elógyógyszerekkel végeztük a kezelést, az eredményeket a 3.táblázat mutatja. Nem volt jelentős különbség az in vivő indukált GH felszabadulásban a hosszabbító részben 4 vagy 2 aminosavat tartalmazó (19-es és 18-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezet) elógyógyszerekkel történő kezeléskor, annak ellenére, hogy ebből a két bGRF előgyógyszerből származtatott magpeptid felezési ideje in vitro mérve jelentős eltérést mutatott, amint az az 1.táblázatban látható. Az in vivő növekedési hormon felszabadulás gyors volt, és azonos mértékű a magpeptid (5-ös azonosítási számú szekvencia) és a 19-es és 18-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű peptidek esetében, és a bGRF analógok beadását követően a GH maximum eléréséhez szükséges időben sem mutatkozott különbség .
Ezeket az eredményeket úgy értelmezzük, hogy a GH gyors felszabadulása az előgyógyszerből annak köszönhető, hogy a szövet és szerv DPP IV szintje nagyon magas, kb. százszor nagyobb a plazma DPP-IV koncentrációjánál. Ez magyarázza az előgyógyszer in vivő emésztésének sebessége és az 1. táblázatban összefoglalt in vitro kísérletekben megfigyelt hasítási sebesség közötti különbséget. Az is valószínű, hogy az előgyógyszer prekurzorból származtatott magpeptid felezé-47si ideje in vivő meghosszabbodott, de nem annyira, hogy megváltozott (hosszabbodott) növekedési hormon felszabadulást eredményezzen. Ismert, hogy a GH felszabadulást in vivő a bGRF stimuláló hatása és a szomatosztatin (szomtatotropin felszabadulását gátló faktor, SRIF) gátló hatása befolyásolja. Moseley és munkatársai takarmánnyal táplált növendékmarha modelljében [ (J. Endocr. 17, 253-259 (1988 )] az állatoknak intravénás injektálással GRF-et adtak be az etetés előtt két órával, mivel a hipofízis jobban reagál a GRF kihívásra etetés előtt, mint etetés után. Az etetéssel párosuló tényezők, így például a bél/hasnyálmirigy SRIF felszabadulása hatással lehet a hipofízis növekedési hormont felszabadító képességére. Más szóval, nem szabadul fel GH a hipofízisből még GRF jelenlétében sem, ameddig az SRIF túlsúlyban van. Normális esetben a kezeletlen, takarmánnyal táplált növendékmarha modellben a szérum GH koncentráció az etetés után 3-6 óra (úgynevezett vályú periódus) alatt alapszintre csökken, majd egy másik exogén epizódszerú GH pulzus jelentkezik az etetést követő 5. és 8. óra közötti periódusban. Az etetés előtt 2 órával kapott GRF injekció hatására a GH válasz gyorsan, 5-20 perc alatt megjelenik, és a GH szint 120-240 percig emelt marad az alapvonalra való visszatérés előtt. Az eddig vizsgált GRF előgyógyszerek esetében csak az első exogén GH csúcs növekedett meg, a második semmilyen változást nem mutatott a kezelések hatására. Lehetséges, hogy a mi kísérleteinkben az előgyógyszerekből származó mag-GR.F felezési ideje nem volt elég hosszú ahhoz, hogy a magpeptid a keringésben olyan koncentrációban legyen jelen, amely az exogén GH második exogén kitörésére
-48hatással van, általában az elsőt követő 4-6 óra elteltével.
összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az eredményeink alátámasztják az előzőekben ismertetett előgyógyszer elképzelést, mert (i) a DPP-IV-gyel hasítható N-terminális hoszszabbító részt tartalmazó bGRF előgyógyszerek szarvasmarha plazmában in vitro, DPP-IV által közvetített hasítással sikeresen alakíthatók magpeptid(ek)ké ; (ii) az előgyógyszerekből származó magpeptidek in vitro felezési ideje szignifikánsan megnövekedett, és az előgyógyszerben levő N-terminális hosszabbító rész hosszúságától függött; (iii) az a tény, hogy a bGRF előgyógyszerek nagyon alacsony saját potenciállal in vivő a magpeptiddel azonos hatékonyságot mutattak a GH felszabadításában, arra utal, hogy a magpeptid nagy valószínűséggel in vivő képződik, ahogy azt korábban is már gondoltuk.
8.példa
Gly~4-Pro~3-Ile~2-Pro~1-{[Leu27lbGRF(1-29)NH2)-trifluoracetát-só előállítása
A 26-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete Gly-ProIle-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-ValLeu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-AsnArg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,16 (4); Thr 1,07 (1); Ser 1,81 (2); Glu 2,07 (2); Pro 1,98 (2); Gly 1,99 (2); Alá 2,99 (3); Val 1,13 (1); He 2,84 (3); Leu 5,08 (5);
-49Tyr 1,93 (2); Phe 0,96 (1); Lys 2,04 (2); Arg 2,97 (3).
9.példa
Tyr~6-Ala~5-Gly~4-Pro~3-Ile~2-Pro~1-{ΓLeu271bGRF(1-29)NH2)~ trifluor-acetát-só előállítása
A 27-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 6-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
3.sz. H-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-ThrAsn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szere-
pelnek: Asp 4 ,04 ( :4); Thr 1,03 (1); Ser 1,74 (2); Glu 2,05
(2); Pro 1,99 (2); Gly 2,00 (2); Alá 4,01 (4); Val 1,28 (1);
Ile 2,84 (3); Leu 5,09 (5); Tyr 2,94 (3); Phe 0,97 (1); Lys
2,07 (2); Arg 3,00 (3).
10.példa Lys~8-Pro~7-Tyr~e~Ala~5-Gly~4-Pro~3-Ile~2-Pro~l-{[Leu271 bGRF(1-29 )NHο}-trifluor-acetát-só előállítása
A 28-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 7-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete: Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-ThrAsn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só fór
-50májában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben
szerepelnek: Asp 4 ,04 (4); Thr 0 ,95 (1); Ser 1,78 (2); Glu
2,04 (2); Pro 2,91 (3) ; Gly 1,98 (2); Alá 3,91 (4); Val 0,96
(1); Ile 2,86 (3); Leu 5,08 (5); Tyr 3,06 (3); Phe 0,97 (1);
Lys 3,06 (3); Arg 3,08 (3).
11.példa
Gly~4-Pro~3-Tyr~2-Ala~l{[Leu^1bGRF(1-29)NH£l-trifluoracetát-só előállítása
A 29-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
6.sz. Gly-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-IlePhe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NHg (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek
zárójelben szerepelnek: Asp 4,01 (4); Thr 0,96 (1); Ser 1,80
(2); Glu 2,02 (2); Pro 0,97 (1); Gly 1,98 (2); Alá 3,91 (4);
Val 0,99 (1); Ile 1,89 (2); Leu 5,08 (5); Tyr 3,05 (3); Phe
0,98 (1); Lys 2,03 (2); Arg 3,06 (3).
12.példa
Tyr~6-Ala~5-Gly~4-Pro~3-Tyr~2-Ala~1írLeu271bGRF(l-29)NHoj-trifluor-acetát-só előállítása
A 30-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 8-as azonosítási
-51számú szekvenciának megfelélő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
7.sz. Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-ThrAsn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben
szerepelnek: Asp 4 ,07 (4); Thr 0 , 96 (1); Ser 1,79 (2); Glu
2,02 (2); Pro 0,99 (1) ; Gly 1,95 (2); Alá 4,80 (5); Val 0,96
(1); Ile 1,87 (2); Leu 5,09 (5); Tyr 4,11 (4); Phe 0,97 (1);
Lys 2,06 (2); Arg 3,08 (3).
13.példa
Lys~8-Pro~7-Tyr~6-Ala~5-Gly~4-Pro~3-Tyr~2-Ala~l{[Leu^71bGRF(1-29)-NHo}-trifluor-acetát-só előállítása
A 31-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 9-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
8.sz. Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-IlePhe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,06 (4); Thr 0,95 (1); Ser 1,78 (2); Glu 2,01 (2); Pro 1,95 (2); Gly 1,96 (2); Alá 4,81 (5);
Val 0,95 (1); He 1,87 (2); Leu 5,09 (5); Tyr 4,12 (4); Phe 0,96 (1); Lys 3,08 (3); Arg 3,10 (3).
14.példa Phe~ie-Ala~9-Lys~8-Pro~7-Tyr~e-Ala~5-Gly~4-Pro~3-Tyr~2Ala~l{ΓLeu2?1 bGRF(1-29l-NHol-trifluor-acetát-só előállítása
A 32-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 10-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
9.sz. Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-AspAla-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (tri'f luorecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti
értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,16 (4); Thr 1 ,01 (I);
Ser 1,89 (2); Glu 2,08 (2); Pro 1,91 (2); Gly 1,93 (2) ; Alá
5,72 (6); Val 0,97 (1); Ile 1,90 (2); Leu 5,09 (5); Tyr 4,09
(4); Phe 1,99 (2); Lys 3,08 (3); Arg 3,04 (3).
15.példa Gly~l2-Pro~H-Phe~ie-Ala~9-Lys~8-Pro~?-Tyr~6-Ala~5-Gly~4Pro~3~Tyr~2- Ala~^{ΓLeu2?1bGRF(1-29)-NH2trifluor-acetát-só előállítása
A 33-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 11-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
10.sz . Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-53-
76<m
Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GlnLeu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti »
értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,08 (4); Thr 0,96 (1);
Ser 1,79 (2); Glu 2,07 (2); Pro 2,88 (3); Gly 2,94 (3); Alá
5,74 (6); Val 0,96 (1); He 1,88 (2); Leu 5,13 (5); Tyr 4,11
(4); Phe 1,99 (2); Lys 3,10 (3); Arg 3,09 (3).
16.példa Val~l4-Pro~13-Gly~12-Pro~-ll-Phe-ie-Ala~9-Lys-8-Pro-7Tyr~6-Ala~5-Gly~4-Pro~3-Tyr~2-Ala~1íÍLeu27lbGRF(l-29)-NHo}trifluor-acetát-só előállítása
A 34-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 12-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
11.sz. Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-TyrAla-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuGly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-ArgNH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,04 (4); Thr
0,96 (1); Ser 1,81 (2); Glu 2,04 (2); Pro 3,80 (4); Gly2,99 (3); Alá 5,92 (6); Val 1,98 (1); He 1,89 (2); Leu 5,10(5);
Tyr 4,09 (4); Phe 1,99 (2); Lys 3,06 (3); Arg 3,08(3).
17.példa
Arg~1®-Pro~15-Val~14-Pro-~13-G1y~4 2-Pro~1-Phe~lθ-Ala~9Lys~®-Pro~7-Tyr~θ-Ala~5-Gly~4-Pro~3-Tyr~2-Ala~^'^fΓLeu27]bGRF( 1-29 l-NHg}-trifluor-acetát-só előállítása
A 35-ös számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 13-es számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
12.sz. Arg-Pro-Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-GlyPro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
4,10 (4); Thr 0,98 (1); Ser 1,84 (2); Glu 2,03 (2); Pro 4,82
(5); Gly 2,97 (3); Alá 5,91 (6); Val 1,99 (1); Ile 1,88 (2);
Leu 5,09 (5); Tyr 4,10 (4); Phe 1,98 (2); Lys 3,03 (3); Arg
4,09 (4).
18.példa
Val~2-Ala~l{[Leu271bGRF(l-29)NH2}-trifluor-acetát-só előállítása
A 36-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
14.sz . Val-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
3,98 (4); Thr 0,89 (1) ; Ser 1,76 (2) ; Glu 2,02 (2); Gly 1,05
(1); Alá 3,87 (4); Val 1,85 (2); Ile 1,77 (2); Leu 5,17 (5);
Tyr 2,04 (2); Phe 0,97 (1); Lys 2,07 (2); Arg 3,06 (3).
19.példa
Tyr~2Thr~^ { Γ Ala^Leu271 bGRFÍ 1-29 )NH2 }-trif luor-acetát-só előállítása
A 37-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
15.sz. Tyr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NHg (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a
következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
4,06 (4); Thr 1,86 (2); Ser 1,77 (2); Glu 2,07 (2); Alá 3,98
(4); Val 1,08 (1); He 1,89 (2); Leu 5,14 (5); Tyr 2,94 (3);
Phe 0,96 (1); Lys 1,99 (2); Arg 3,04 (3) .
20.példa
Tyr~2-Thr~1{ΓIle2Ala15Leu271bGRF(1-29)NH2)-trifluor-acetátsó előállítása
A 38-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
16.sz. Tyr-Thr-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a
következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
4,07 (4); Thr 1,87 (2); Ser 1,75 (2); Glu 2,07 (2); Alá 2,94
(3); Val 1,09 (1); He 2,87 (3); Leu 5,12 (5) ; Tyr 2,92 (3);
Phe 0,96 (1); Lys 2,00 (2 ); Arg 3,05 (3).
.példa
Tyr~^-Thr~^f [ Thr^Ala-^ 5l6U27 ]bQRF( 1-29 )NH2 )-trif luor-acetátső előállítása
A 39-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
17.sz. Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a
következő , az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
4,05 (4); Thr 2,68 (3); Ser 1,77 (2); Glu 2,07 (2) ; Alá 2,90
(3); Val 1,08 (1); He 1,89 (2); Leu 5,20 (5); Tyr 2,87 (3);
Phe 0,93 (1); Lys 2,01 (2); Arg 3,07 (3) .
22.példa
Tyr~2-Ser~lί ΓThr^Ala^^Leu^]bGRF(1-29)NHo)~trifluor-acetátsó előállítása
A 40-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
18.sz. Tyr-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a
következő , az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
4,11 (4); Thr 1,82 (2); Ser 2,64 (3); Glu 2,05 (2); Alá 2,90
(3); Val 1,04 (1); He 1,87 (2); Leu 5,16 (5); Tyr 2,92 (3);
Phe 0,94 (1); Lys 2,01 (2); Arg 3,04 (3).
23.példa
Tyr~4-Thr~3-Tyr~2-Thr~1í ΓThr2Ala15Leu271bGRF(1-29)NHo}trifluor-acetát-só előállítása
A 41-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
19.sz. Tyr-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-SerTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Asn-Arg-NHg (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelne-
k: Asp 4, 06 (4); Thr 3 , 66 (4); Ser 1,85 (2) ; Glu 2,05 (2);
Alá 2,93 (3); Val 1,09 (1); Ile 1,91 (2) ; Leu 5,15 (5); Tyr
3,91 (4); Phe 0,95 (1); Lys 2,0 (2); Arg 3,04 (3).
24.példa
Tyr~2-Ala~1(Γ Leu27 TbGRFÍl-29)NH2}-trifluor-acetát-ső előállítása
A 42-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete Tyr-AlaTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2
-58(trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,01 (4); Thr 0,97 (1); Ser 1,88 (2); Glu 2,00 (2); Gly 1,02 (1); Alá 3,88 (4); Val 0,97 (1); He 1,86 (2); Leu 5,03 (5); Tyr 3,03 (3); Phe 0,96 (1); Lys 2,18 (2); Arg 3,03 (3).
25.példa
Tyr~4-Ala~3-Tyr~2-Ala~l-{Γ Leu2 71bGRF(1-29)Nl^l-trifiuoracetát-só előállítása
A 43-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete
13.sz. Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a
következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
3,97 (4); Thr 0,90 (1); Ser 1,74 (2); Glu 1,98 (2); Gly 1,04
(1); Alá 4,85 (5); Val 0,91 (1); He 1,77 (2); Leu 5,13 (5) ;
Tyr 4,14 (3); Phe 0,99 (1)5 Lys 2,07 (2); Arg 3 ,05 (3).
I 6 $3
1.Táblázat
A kiválasztott GRF analógok in vitro potenciája és in vitro plazmastabilitása
Peptidszekvencia A szekvencia azonosító száma In vitro hatás* In vitro plazma . *♦ tl/2 (perc)
A peptid+ 5 1,00 24,8 (1.kísérlet)
B peptid+ 18 0,045 43,2 (1.kísérlet)
C peptid+ 25 0,13 38,5 (1.kísérlet)
D peptid+ 19 0,052 297,1#(2.kísérlet)
A peptideket in vitro marha adenohipofízis sejttenyészetben vizsgáltuk Friedman és munkatársai által leírt módon [Int. J. Peptide and Protein Rés. 37:14-20 (1991)].
A peptideket 30 mikromólos koncentrációban marhaplazmában in vitro inkubáltuk 37’C-on, Kubiak és munkatársai közleményében [Drug Met. Disp. 17:393-397 (1989)] ismertettek szerint. Az értékeket a közvetlenül plazmában inkubált vagy a 18-as, 25-ös és 19-es azonosító számú szekvenciának megfelelő szerkezetű hosszabbított polipep-60tidből származtatott 5-ös azonosító számú szekvenciára, a [Leu27]-bGRF(1-29)NH2 peptidre vonatkoztatott felezési idők formájában adjuk meg.
# A 19-es szekvenciaazonosítási számú peptidet a [Leu27]bGRF(1-29)NH2 (5-ös azonosító számú szekvencia) pepiiddel együtt egy eltérő marhaplazma fürdőben vizsgáltuk. Az 5-ös azonosító számú szekvencia felezési ideje ebben a plazmamintában 50,2 perc volt.
+ A peptid: [Leu27]-bGRF(1-20)NH2
B peptid: Ile-2-Pro“4{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2}
C peptid: Tyr-2-Ala_l{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2}
D peptid: Tyr“4-Ala_3-Tyr-2-Ala-1{[Leu27]-bGRF(1-29)NH2}
2.Táblázat p rf
A [Leu^1' ]~bGRF( 1-29 )NÜ2 (5-ös azonosító számú szekvencia) és Ile-2-Pro-l{[Leu27]bGRF(1-29)NH2} (18-as azonosító számú szekvencia) különböző, intravénás injekció formájában beadott dózisaira adott szérum GH válaszok takarmánnyal táplált Holstein növendékmarhákban
Választ adó Csúcs- magasság A csúcs eléréséhez A 0-8 óra alatti
Kezelés Dózis állatok (ng/ml) szükséges terület (U)
idő (perc)
nmol/kg száma Aa Ba Aa Ba Aa Ba
Sóoldat 0 1 1 1 1 1 1 1 O 1 1 1 1 1 1 1 32,4b 32,4b 89b 89b 4,3b 4,3b
B peptid+ 0,02 8/10c 71,2b’ c 76,9b,c 23c 18c 4,6b,c 5,0b’c
A peptid+ 0,20 9/10c 119,8C 130,9C 23c 14c 1 1 1 1 1 1 1 73 1 1 00 1 1 - 1 1 CD 1 7,0d
B peptid+ 0,20 10/10c 101,4C> d 101,4C 26c 26c 6,3c’d 6,3c,d
B peptid+ 20,0 10/10c 137,8d 137,8C 23c 23c 10,le 10,le
SEM 0,04 9,1 9,4 8 8 0,3 0,3
p-érték 0,0001 0,007 0,007 0 ,04 0,03 0,0001 0,0001
-62Μη
Az állatoknak a peptidek feltüntetett dózisát 2 órával az etetés előtt adtuk be intravénás injekció formájában, és a Moseley és munkatársai által a J. Endocrinology 117:253-259 (1988) irodalmi helyen leírt módszer szerint jártunk el.
+ B peptid: 18-as azonosító számú szekvencia
A peptid: 5-ös azonosító számú szekvencia a Az A analízis minden növendékmarhát magába foglal, a
B analízis viszont csak a GRF injekcióra választ adó és kontroll állatok figyelembevételével készült.
b,c,d,e Az egy oszlopban különböző felső indexszel ellátott értékek szignifikánsan különbözőek (P < 0,05).
3.Táblázat
A [Leu27]-bGRF(1-29)NH2 (5-ös azonosító számú szekvencia) és a Tyr-4-Ala-3-Tyr_2-Ala1{[Leu27]bGRF(1-29)NH2} (19-es azonosító számú szekvencia) különböző, intravénás injekció formájában beadott dózisaira adott szérum GH válaszok takarmannyal táplált Holstein növendékmarhakban
Választ Csúcs- A csúcs A 0-10 óra
adó magasság eléréséhez alatti
Kezelés Dózis állatok (ng/ml) szükséges terület (U)
nmol/kg száma Aa Ba Aa Ba Aa Ba
Sóoldat 0 — 30,9b 30,9b 45b 45b 3,9b 3,9b
A peptid+ 0,02 9/12c,d 91,9C 101,3C 41b 20c 4,7b,c 4,7b»c
D peptid+ 0,02 10/12c’d 88,5C 92,4C ' 1 1 -O 1 1 O 1 co i 1 1 1 1 22c 4,8C 4,4b,c
A peptid+ 0,20 ll/12d 79,3C 79,lb , c 21C 18c 5,4C 5,3C
D peptid+ 0,20 7/12c 97,4C 120,lc 63b 83c 5,4C 5,4c’d
D peptid+ 2,0 9/12c,d 74,5C 70,8b’ c 24b 18c 6,9a 6,8d
SEM 0,10 15,9 17,3 14 8 0,4 0,4
p-érték 0,0001 0,06 0,06 0,28 0,11 0,0008 ί 0,007
EMS 0,1117 3042 3623 2260 763 2281 2483
-64Az állatoknak a peptidek feltüntetett dózisát 2 órával az etetés előtt adtuk be intravénás injekció formájában, és a Moseley és munkatársai által a J. Endocrinology 117:253-259 (1988) irodalmi helyen leírt módszer szerint jártunk el.
D peptid: 19-es azonosító számú szekvencia
A peptid: 5-ös azonosító számú szekvencia
Az A analízis minden növendékmarhát magába foglal, a B analízis viszont csak a GRF injekcióra választ adó és kontroll állatok figyelembevételével készült.
Az egy oszlopban különböző felső indexszel ellátott értékek szignifikánsan különbözőek (P < 0,05).
A szekvenciák felsorolása
1-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Val Asp Alá He Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá
1 5 10 15
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp He Leu Ser Arg Gin
20 25 30
Gin Gly Glu
2-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 40 (B) Típusa: aminosav
(D) Topológiája: lineáris (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Ile Asp Alá Ile Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá
1 5 10 15
Gin Leu •Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Ser Arg Gin
20 25 30
Gin Gly Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Alá
35 40
3-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 29 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn
Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu
Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
4-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 29
(B) Típusa: aminosav
(D) Topológiája: lineáris
(ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Ile Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá
10 15
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
25
5- ös azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 29 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly
10 15
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
25
6- os azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 6 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Tyr Alá Gly Pro Ile Pro
5
7- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 8
-67(B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Ile Pro
1.5
8- as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 6 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá
5
9- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 8 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá
5
10- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 10 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá m
11- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 12 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá
10
12- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 14 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Val Pro Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá
1.5 10
13- as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 16 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro
10
Tyr Alá
14- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 29
-69(B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Thr Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá
10 15
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
25
15- ös azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 11 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Met Pro Alá His Pro His Pro His Pro His Alá
10
16- os azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 11 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Met Alá Pro His Alá His Alá His Alá His Alá
5 10
17- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 11
-70(B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Met Gly Pro His Pro His Pro His Pro His Alá
10
18- as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Ile Pro Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val
10 15
Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn
25 30
Xaa
19- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr 1 Alá Tyr Alá Tyr 5 Alá Asp Alá Ile Phe 10 Thr Ser Ser Tyr Arg 15
Lys Val Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile
20 25 30
Leu Ser Xaa
20-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 39 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa39 (xi) A szekvencia leírása:
Phe 1 Alá Lys Pro Tyr 5 Alá Gly Pro Tyr Alá 10 Tyr Alá Asp Alá Ile 15
Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg
20 25 30
Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
35
21-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 45 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix ) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa45 (xi) A szekvencia leírása:
Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr
1 5 10 15
Alá Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu
20 25 30
Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
40 45
22- es azonosítási számú szekvencia;
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 10 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá
5 10
23- as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 16 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
A szekvencia leírása:
Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro
5 10
Tyr Alá
24- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 27 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
-73(ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa27 (xi) A szekvencia leírása:
Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu
10 15
Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
25
25-ös azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn
20 25 30
Xaa
26-os azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (Β) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
Gly Pro 1 Ile Pro Tyr 5 Alá Asp Alá Ile Phe 10 Thr Asn Ser Tyr Arg 15
Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile
20 25 30
Leu Asn Xaa
27-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 35 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa35 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá 1 Gly Pro Ile 5 Pro Tyr Alá Asp Alá 10 Ile Phe Thr Asn Ser 15
Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin
20 25 30
Asp Ile Leu Asn Xaa
35
28-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 37 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék
-75(B) Elhelyezkedése: Xaa37 (xi) A szekvencia leírása:
Lys Pro Tyr Alá Gly Pro He Pro Tyr Alá Asp Alá He Phe Thr
1 5 10 15
Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu ,Ser Alá Arg Lys Leu
20 25 30
Leu Gin Asp He Leu Asn Xaa
35
29-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
Gly 1 Pro Tyr Alá Tyr Alá 5 Asp Alá He Phe 10 Thr Asn Ser Tyr Arg 15
Lys Val. Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile
20 25 30
Leu Asn Xaa
30-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 35
(B) Típusa: aminosav
(D) Topológiája: lineáris
(ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék
-76(B) Elhelyezkedése: Xaa35 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr 1 Alá Gly Pro Tyr Alá 5 Tyr Alá Asp Alá 10 He Phe Thr Asn Ser 15
Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin
20 25 30
Asp He Leu Asn Xaa
35
31-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 37 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa37 (xi) A szekvencia leírása:
Lys 1 Pro Tyr Alá Gly 5 Pro Tyr Alá Tyr Alá 10 Asp Alá He Phe Thr 15
Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu
20 25 30
Leu Gin Asp He Leu Asn Xaa
35
32-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 39 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa39 (xi) A szekvencia leírása:
Phe 1 Alá Lys Pro Tyr Alá 5 Gly Pro Tyr Alá Tyr 10 Alá Asp Alá Ile 15
Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg
20 25 30
Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
35
33-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 41 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa41 (xi) A szekvencia leírása:
Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá Tyr Alá Asp
1 5 10 15
Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser
20 25 30
Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
35 40
34-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 43 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
-78(ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa43 (xi) A szekvencia leírása:
Val 1 Pro Gly Pro Phe 5 Alá Lys Pro Tyr Alá 10 Gly Pro Tyr Alá Tyr 15
Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin
20 25 30
Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
40
35-ös azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 45 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa45 (xi) A szekvencia leírása:
Arg 1 Pro Val Pro Gly 5 Pro Phe Alá Lys Pro 10 Tyr Alá Gly Pro Tyr 15
Alá Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu
20 25 30
Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa
35 40 45
36-os azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Val Alá Tyr Alá Asp Alá He Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp He Leu Asn
20 25 30
Xaa
3 7—< es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Thr Tyr Alá Asp Alá He Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp He Leu Asn
20 25 30
Xaa
38- as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (6
-80(ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
.Tyr Thr. Tyr Ile Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn
20 25 30
Xaa
39-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Thr Tyr Thr Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val
1 5 • 10 15
Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn
20 25 30
Xaa
40- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Ser Tyr Thr Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val
1 5 10 15
Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn
20 25 30
Xaa
41-< es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix ) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Thr Tyr Thr Tyr Thr Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg
1 5 10 15
Lys Val Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile
20 25 30
Leu Asn Xaa
42-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék
-82(B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys Val
10 15
Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn
25 30
Xaa
43-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidéit argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Tyr Alá Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr Ser Ser Tyr Arg
1 5 10 15
Lys Val Leu Alá Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile
20 25 30
Leu Ser Xaa

Claims (16)

  1. Szabadalmi igénypontok:
    1. A természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben egy magfehérje rész N-terminálisához egy hosszabbító peptidrész C-terminálisával kovalensen kapcsolódik, a hoszszabbító rész
    A-X-C-Y(X’-Y)n általános képlettel jellemezhető, amelyben
    A adott esetben van jelen, és ha jelen van, akkor metionin;
    n értéke 0-20;
    X bármely, a természetben előforduló aminosav maradéka ;
    X’ bármely, a természetben előforduló aminosav maradéka a prolin és hidroxi-prolin kivételével;
    Y prolin, hidroxi-prolin, alanin, szerin vagy treonin, kivéve, ha n = 0, és A nincs jelen, ekkor Y alanint, szerint vagy treonint jelent.
  2. 2. Az 1.igénypont szerinti, természetben elő nem forduló olyan fúziós fehérjék, amelyekben A jelen van, és X prolin, glicin, alanin vagy szerin.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti olyan, a természetben elő nemn forduló fúziós fehérjék amelyekben n értéke 0-10.
  4. 4. Az 1.igénypont szerinti olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben a biológiailag aktív polipeptid az alábbiak egyike: bGRF analógok, EGF; IGF-2, glukagon; kortikotropint felszabadító faktor; dinorfin, szomtatosztatin-14 ; endotelin; transzformáló növekedési faktor alfa; vazoaktív intesztinális peptid (VIP); humán béta-kazomorfin; gyomor gátló peptid; gyomor felszabadító peptid; Hl humán peptid; YY humán peptid; glukagonszerű peptid-1 7-37 fragmentum; glukagonszerű peptid-2; P anyag; Y neuropeptid; humán hasnyálmirigy polipeptid; inzulinszerű növekedési faktor-1; humán növekedési hormon; szarvasmarha növekedési faktor; sertés növekedési faktor; prolaktin; humán növekedési hormont felszabadító faktor; szarvasmarha növekedési hormont felszabadító faktor; sertés növekedési hormont felszabadító faktor; juh növekedési hormont felszabadító faktor; interleukin-lbéta; és interleukin-2.
  5. 5. Az 1.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben a hosszabbító peptid rész az alábbiak egyike: Gly-Pro-Ile-Pro, 6-os azonosítási számú szekvencia, 7-es azonosítási számú szekvencia, Tyr-Ala, Gly-Pro-Tyr-Ala, 8-as 9-es, 10-es, 11-es, 12-es, 13-as azonosítási számú szekvencia, Tyr-Ala-Tyr-Ala, Val-Ala, 15ös, 16-os, 17-es, 22-es és 23-as azonosítási számú szekvencia .
  6. 6. A 2.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló olyan fúziós fehérjék, amelyekben n értéke 3-5.
  7. 7. A 6.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben minden X’ maradék hisztidin.
  8. 8. A 7.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló olyan fúziós fehérjék, amelyekben X hisztidin.
  9. 9. A 7.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló olyan fúziós fehérjék, amelyekben három Y maradék prolin.
  10. 10. Az 1.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, amikor a gyógyásza ti készítmény további fúziós fehérjéket is tartalmaz, amelyek azonos biológiailag aktív részből és különböző hosszabbító részből állnak.
  12. 12. A 10.igénypont szerinti alkalmazás, amikor a természetben elő nem forduló fúziós fehérje biológiailag aktív része egy bGRF analóg.
  13. 13. Eljárás az 1.igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjéket és szennyezéseket tartalmazó elegyből a kívánt fehérje tisztítására, amely a következő lépésekből áll:
    - a fúziós fehérjék szelektív érintkeztetése olyan anyaggal, amely immobilizálja a fúziós fehérjét;
    - a szennyezések eltávolítása;
    - a fúziós fehérjéknek a fenti anyagtól való elválasztása;
    - a fúziós fehérje DPP IV-gyel való kombinálása; és
    - a kívánt fehérje elkülönítése.
  14. 14. A 13.igénypont szerinti eljárás, amelyben az anyag egy oszlopban van rögzítve.
  15. 15. A 13.igénypont szerinti eljárás, amelyben az anyag olyan antitest, amely a hosszabbító részhez kötődik.
  16. 16. A 13.igénypont szerinti eljárás, amelyben az anyag immobilizált fémionokból áll, és a hosszabbító rész legalább
    3 egymást követő X’ maradékot tartalmaz, amelyek hisztidinek .
HU9301705A 1990-12-13 1991-12-12 Non-naturally-occuring fusion proteins and process for preparing them HUT69963A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62672790A 1990-12-13 1990-12-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9301705D0 HU9301705D0 (en) 1993-10-28
HUT69963A true HUT69963A (en) 1995-09-28

Family

ID=24511577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9301705A HUT69963A (en) 1990-12-13 1991-12-12 Non-naturally-occuring fusion proteins and process for preparing them

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0561971A1 (hu)
JP (1) JPH06503473A (hu)
AU (1) AU662508B2 (hu)
CA (1) CA2094512A1 (hu)
CZ (1) CZ109393A3 (hu)
FI (1) FI932680A0 (hu)
HU (1) HUT69963A (hu)
IE (1) IE914347A1 (hu)
NO (1) NO932148L (hu)
RU (1) RU2114119C1 (hu)
SK (1) SK60893A3 (hu)
TW (1) TW213923B (hu)
WO (1) WO1992010576A1 (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050272652A1 (en) 1999-03-29 2005-12-08 Gault Victor A Peptide analogues of GIP for treatment of diabetes, insulin resistance and obesity
US6759393B1 (en) 1999-04-12 2004-07-06 Pfizer Inc. Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions
EP1052286A3 (en) * 1999-04-12 2001-07-25 Pfizer Products Inc. Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions
CA2391906A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Transkaryotic Therapies, Inc. Nucleic acid construct for optimized production of products
EP1205551A1 (en) * 2000-11-09 2002-05-15 Pfizer Products Inc. Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions
JP4865565B2 (ja) 2003-12-09 2012-02-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１アゴニストを用いた食物選択の制御
JP2008501765A (ja) 2004-06-11 2008-01-24 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ−１アゴニストを用いた薬剤誘発性肥満の中和
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
CA2597649A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Gip analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP1996937A4 (en) † 2006-03-06 2009-04-08 Amunix Inc GENETIC PACKS AND USES THEREOF
US8497240B2 (en) 2006-08-17 2013-07-30 Amylin Pharmaceuticals, Llc DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
EP2573102B1 (en) * 2010-01-29 2018-10-03 Archer-Daniels-Midland Company Peptide domains that bind small molecules of industrial significance
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
LT2814840T (lt) 2012-02-15 2020-02-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii kompozicijos ir jų gavimo ir naudojimo būdai
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
AU2016301303B2 (en) 2015-08-03 2021-10-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
CA3067674A1 (en) * 2017-06-29 2019-01-03 Ureka Sarl Pro-drug peptide with improved pharmaceutical properties
AU2019270184A1 (en) 2018-05-18 2020-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia A

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703004A (en) * 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
AU625787B2 (en) * 1989-06-16 1992-07-16 Pharmacia & Upjohn Company Stabilized, potent grf analogs
DK0527778T3 (da) * 1990-04-09 1996-10-21 Upjohn Co Forbedret fremgangsmåde til rensning af rekombinante proteiner og forbindelser, som er anvendelige ved en sådan fremgangsmåde

Also Published As

Publication number Publication date
WO1992010576A1 (en) 1992-06-25
SK60893A3 (en) 1993-10-06
HU9301705D0 (en) 1993-10-28
CZ109393A3 (en) 1994-01-19
IE914347A1 (en) 1992-06-17
EP0561971A1 (en) 1993-09-29
RU2114119C1 (ru) 1998-06-27
NO932148D0 (no) 1993-06-11
AU662508B2 (en) 1995-09-07
CA2094512A1 (en) 1992-06-14
TW213923B (hu) 1993-10-01
FI932680A (fi) 1993-06-11
AU9116591A (en) 1992-07-08
FI932680A0 (fi) 1993-06-11
NO932148L (no) 1993-08-09
JPH06503473A (ja) 1994-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT69963A (en) Non-naturally-occuring fusion proteins and process for preparing them
CA2367856C (en) Analogs of gastric inhibitory peptide and their use for treatment of diabetes
JP2507106B2 (ja) インスリン様成長因子１（ｉｇｆ―１）または因子２（ｉｇｆ―２）の類縁ペプチド
JP4291900B2 (ja) 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法
AU2008365555B2 (en) Glucagon analogues
US20100210815A1 (en) Insulin production methods and pro-insulin constructs
TW200817432A (en) Amidated insulin glargine
CA2747155A1 (en) Glucagon analogues
JPS60155196A (ja) 成長ホルモン放出因子類似物
JP2002506792A (ja) Ｎ末端修飾ｇｌｐ−１誘導体
CA2747197A1 (en) Glucagon analogues
JPS6094998A (ja) インシュリン誘導体の製法
JP2008502301A (ja) ペプチドの抱合
TW200817511A (en) Method for preparing insulin analogs with dibasic B chain end
KR101036524B1 (ko) 수식 펩티드의 제조 방법
JPH083196A (ja) カルシトニン誘導体及びその用途
WO1988010299A1 (en) A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
JPH0786120B2 (ja) ポリペプチド
JPS61112099A (ja) 新規ポリペプチド及びその製造法
HU211572A9 (hu) Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik
JP4276462B2 (ja) 修飾ペプチドの製造方法
JPH0533993B2 (hu)
JPH04271794A (ja) デス（６４，６５）−プロインシュリンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee