SK60893A3 - Fusion polypeptides - Google Patents

Description

Doterajší stav techniky

Metódy technológie žiadaných genetická informácia modifikovaná, modifikovaných molekulárnej biológie, najmä rekombinantné DNA umožňujú produkciu relatívne veľkých množstiev biologicky aktívnych po 1 ypepti d ov . Okrem toho zakódovaná v po 1 ypeptidoch môže byť sa vyprodukovalo veľké množstvo abv sa poivpeptidov. Modifikácia polypeptidov využíva často na zlepšenie: ich aktivity alebo na uľahčenie ich výroby a/alebo prípravy. Preto sa venovalo mnoho úsilia, aby sa zistilo, ktoré modifikácie žiadaným zvýrazňujú alebo inak menia biologickú polypeptidov. Okrem toho sa mnoho požadovaných polypeptidov, aby sa čistenie.

Polypeptidy vyrábané prírodnými postupmi sa často najskôr b i o s y n t e t i z u j ú ako veľké p r e k u r z o r y , k t o r- é sú potom u p r a v e n é sériou proteo 1 y t. i c ký c h štiepení na konečné produkty. Preto existujú viaceré proteázy, ktoré rozoznajú a štiepia špecifické aminokyseliny alebo reťazce aminokyselín. Tieto proteázy sa podieľajú na konverzii prekurzorového proteínu na konečný po 1ypeptidový produkt.

Jednou z týchto proteáz je d i pe pt i dv 1 pe pt idú z. a IV (DPP IV) ( EC 3.4.10.5). DPP IV opísaná v iiops u-Ha vu , V.K. and G.G. G 1 e n n e r , 11 isto. C h e m i e 3 : 1.9 7 - 2 0 ! ( 1 9 O 6 ) a j e j pr í t o m n o s t bo 1 a dokázaná v mnohých cicavčích tkanivách. V súčasnosti j c: L) ľ P IV komerčne dostupná od firmy knzyme Systems Products (Dublin. Califorňia). DPP IV rozpoznáva špecifické reťazec aminokyselín na N-koncoch protcínov. Špeciálne DPP IV odštiepi dipeptid od spôsobom zvyšujú, a k t i v j. t u ž i a d a n ý c h pracuje na modifikáciách uľahčila ich výroba a a na N-k o n c i aminokyse1 in.v

N-konca, ak druhá aminokyselina od N-konca je prolín (Pro), hydroxypro1ín (Hyp), alanín (Ala), sériu (Ser) a treonín (Thr) je ľubovoľná aminokyselina, pričom tretí zvyšok od N-konca nesmie byt prolín alebo hydroxypro1 í n. DPP IV je účinnejšia, ak druhá aminokyselina od N-konca je prolín alebo alanín a obvykle je najúčinnejšia keď je na tom mieste prolín. Aktivita DPP

Aktivita štiepení PRO častí prekurzorov prirodzene

IV pri postupnom sa vyskytujúcich peptidov je rozsiahle dokumentovaná.

Moderné technológie umožňujú produkciu biologicky aktívnych proteínov na vysokej úrovni. Dôležité polypeptidy je možné syntetizovať pomocou syntetizátorov peptidov alebo v hostiteľských bunkách pomocou technológie rekombinantnej DNA. Biologicky aktívne proteíny sa často používajú ako lieky. Sú mnohé príklady, v ktorých sa aktívne proteíny používajú ako liečivá, profylaktické prostriedky alebo na zvýraznenie alebo potlačenie určitých vlastností. Pretože DPP IV a iné proteázy degradujú proteíny, sú tieto lieky náchylné degradovať. Problémom používanie biologicky aktívnych polypeptidov ako liečiv je teda znižovanie ich obsahu v tkanivách, takže sa preto musia podávať častejšie. Rýchly rozvoj metodológie rekombinantnej DNA, ktorý umožnil produkciu polypeptidov, proteínov a ich analógov vo veľkých množstvách v priebehu veľmi krátkej doby vytvoril potrebu vys oko ú č innej a spoľahlivej izolácie týchto proteínov zo v ktorých sú všetky proteíny bunkách spolu s proteínmi zložitých zmesí, v hostiteľských média. C i s t e n i. e produkovali é r a s t o v é h o rozdielnych polypeptidov produkovaných hostiteľskými, bunkami môže byť veľmi drahé a inôže spôsobiť denaturáciu i samotného Prehľad metodík čistenia pínie í nov je stavu t e c h n i k v pro t. e í n o v é h o produktu, obsiahnutý v prehľade

137, udeleného 1.11.1988 11 o p po v i a iným t ý m t o o d k a z o m .

Aby sa obišli obmedzenia techniky technológia rekombinantnej DNA môže žiadaných po 1vpeptidov vo lormc umelých proteínov obsahujúcich s p o i o v a c í p e p t i d , k to r v s a m ô ž e p o u ž i. i a k o 1 i g a n d a 1 e bo i n ý v U S p a t e n t e č. d 7 8 2 , ktorý j e t. u z a h r n u t ý n a šli 1 e pš i e me t ódy. p o u ž i ť k z í s kani u .3 cieľ pre čistiace prostriedky. Napríklad US patent č. 6 782 137, popisuje syntézu umelého peptidu obsahujúceho antigénový spojovací peptid. Umelý proteín obsahujúcu iniobi 1 i zované protilátky, peptid, a tak ich môže opisuje čistenie umelých môže prejsť cez kolónu ktoré viaže na spojovací US patent č. 6 569 796 izolovať

1) r o t e í n o v obsahuj ú c i t: h p r e d 1 ž e n i e na N-konci, ktoré majú afinitu k imobi1 i žuvaným kovom. Umelé proteínv sa viažu na iniobi 1 i zované kovy na kolóne. Problémom týchto metód je to, že spojovací peptid je často nažiadaný a jeho odstránenie môže byť obtiažne.

Tento vynález sa týka umelých spojených proteínov, ktoré obsahujú proteínové jadro a predĺženie N-konea štiepi teľné DPP IV. Podľa tohoto vynálezu sa získa umelý proteín, ktorého predĺženie pripojené k základnému proteínu sa nevyskytuje prirodzene ako predĺženie N -k o n c a základného proteínu, preto je to umelý spojený proteín. Tento vynález sa týka proteínových liekov, ktoré sú umelé proteínv štiepiteľné DPP IV, ktorých proteínové jadro je biologicky aktívny proteín. Tento vynález sa týka umelých proteínov, št i epi te ľ nýc 1i DPP IV, ktoré sú užitočné pre metódy čistenia, pretože predĺženie N-konca je charakteristikou alebo vlastnosťou uľahčujúcou čistenie proteínov.

Tento vynález dáva umelé

N-konca štiepiteľné DPP IV.

s DPP IV vedie ku konverzii proteín. Ak sa použije umelý p r o t e í n y , ktoré majú pred í ž e n í e takže expozícia umelého proteínu umelého proteínu na žiadaný p r o t e í n a k o proteínový liek, zmení sa na biologicky aktívny proteín in vivo účinkom DPP IV

Ak sa použijú v čistiacom pro te í n y pomocou š pec i. f i, c k y prítomnej v cieľovom o r g a n i z m e procese, je možné čistiť umelé označených N-koncov ako l.i.gandov a potom ich spracovať DPP IV. ktorá odstráni predĺženie N-konca a uvoľní žiadaný proteín.

výrobu žiadaných proteínov a k n neskoršie premenia na žiadané

Proteínové lieky sa

T e n to v y! i á i e z umelých proteínov, um o z n u (í ktoré sa proteínv vv s ta v e n í m DPP IV.

lieky v priebehu doby pomocou vlastnej pacientovej zaistí trvalú prítomnosť aktívnej látky v tele zn í ž i mu o ž s tv o pod á v a n í 1 i e k o v.

z m c n i a n a

DPP IV, čo pacienta a

Čisté žiadané proteíny je možné vynálezu výrobou a čistením umelých spracovaním umelých proteínov in vitro vznikol žiadaný proteín.

izolovať podľa tohto p r o t e í n o v a potom pomocou DPP IV, aby

Podstata vynález u

Tento vynález sa obsahujúceho predĺženú svojho C-konca k k-koncu t ý k a umelého spojeného proteínu, proteínovú časť kovalentne viazanú od základnej proteínovej časti, ktorého predĺžená proteínová časť má vzorec:

A-X-Y(X’-Y)_n kde A je voliteľné a keď je prítomné je to metionín, n je 0-20,

X je vybrané zo	skupiny obsahujúcej	všetky	prirodzene	sa
vyskytujúce zvyšky	ain i noky s e 1 í n ,
X’je vybrané zo	skupiny o b s a b uj ú c e j	všetky	prirodzene	sa
vyskytujúce z v y	škv aninokyse1 í n	okrem	p r o 1. í n u	a
hydroxypro1 ínu,
Y je vybrané zo	skupiny obsahujúcej	p r o 1 í n ,	hydroxypro1	in,

ume 1ých čistenia a 1 a n í n , s e r í n a t r e o n í n .

Tento vynález sa týka tiež použitia týchto proteínov v liekových prípravkoch a spôsobov žiadaných proteínov zo zmesi obsahujúcej takéto umelé proteíny a nečistoty, obsahujúci kroky selektívneho styku uvedených umelých proteínov s materiálom, ktorý i ino bi 1 i zu j e uvedené umelé proteíny, odstránenia uvedených nečistôt, oddelenia uvedených umelých proteínov od uvedeného materiálu, kontaktovania uvedeného umelého proteínu s DPP IV a izolácie uvedeného žiadaného proteínu.

US patent č. A 569 79A, udelený 1I.2.19B6 Smithovi a k o 1 . , sa týka č i s t en i a pro t e í. n o v a 1 á t o k u ž i t o č n ý c h p r j. t ý c h t o pos tupo t: h . p r o t e í n o v ,

U-konci a c h i? i a t u j ú c i

Vynález popisuje spôsob izolácie spojených ktoré majú biologicky aktívne polvpepi.idy na spojovací člen na N-kone i, ktorým je člen k ovo\ c ióny. Spojený p e p t. j. d má a t ini tu k imobi1 izovaným kovovým iónom. Nečistoty prechodom zmesi obsahujúcej spojený imobilizované kovové ióny. kovovými iónmi a vymyjú p o d m i e n k a e h s a s p o j e n ý kovových iónov a tak je možné o d stráni ť. proteín. kolónou S p o j t; n ý proteín sa sa len nečistoty. Pri p e p t i d uvoľní z sa získa vyčistený obsahu j ú c o u asociuje s uvedených i m o b i 1 i z o v a n ý c h spojený proteín. US patent č ó 7 8 2 137, udelený 1.11.1988 H o p p o v i a kol., popisuje syntézu spojeného proteínu, ktorý má vysoko antigénnu N-koncovú časť. a žiadaný polypeptid na C-konci. Podľa lloppa a kol., spojené proteínv sa čistia z neopracovaného supernatantu prepustením neopracovaného supernatantu cez kolónu obsahujúcu imobilizované protilátky, ktoré spojeného proteínu. Imobilizované na kolóne, zatiaľ čo nežiadúce rozlišujú antigénnu časť protilátky udržujú proteín zložky supernatantu sú

č. publikácie 0 220 950, na selektívne chemické eluované. Spojený proteín sa potom eluu.je a zachytí.

US patent č. ó 7 34 399, udelený 29.3.1988 Felixovi a kol., sa týka analógov faktorov uvoľňujúcich rastový hormón) Popísaný je celý rad analógov, ktoré majú koncové skupiny Tyr-Ala a liis-Ala. Tieto molekuly nie sú však spojené proteínmi, ale skôr len jadrami proteínov. Koncové d ipeptidy podľa Felixa a kol., sú časťou jadra molekuly bGRF analóga. Európska patentová prihláška, publikovaná 6.5.1987, sa vzťahuje odstránenie zvyškov na N-kone i. Vynález sa týka spôsobu a zlúčenín užitočných, na odstránenie zvyškov na N-konci z požadovaných polypeptidov. Požadovaný polypeptid existuje vo forme spojeného proteínu, ktorý má žiadaný po 1vpeptídový člen na N-konci spojovacieho člena so vzorcom X-Pro. Po vystavení spojeného proteínu špecifickým podmienkam tlmivého roztoku, diketopiperazín X-Pro časti spojeného proteínu sa vytvorí a uvoľní. Tak vznikne zo spojeného proteínu žiadaný polypeptid. Spojené proteínv pudla EPO 220 958 nie su d o tohto vyrillczu zahrnuté, pretože podľa tohto vynálezu v prípade, že predĺženie N-kouca je Jen dipepfid. t. j. keď A chýba, n je 0 a

X je p r i r o d z e 11 e s a s e r í n alebo t r e o n í n.

vyskytujúca aminokyselina, Y je alanin, Teda vždy keď je rozšírený (predĺžený)

- () dipept.id, je to X-Ala, X-Ser alebo X-Thr. Prihláška 220 958 popisuje chemickú, nie Dipeptidy X-Ala, X-Ser štiepenia, popísaného enzyma ti ckú hydrolýzu dipeptidu X-Pro.

a X-Thr nie sú náchylné na tento typ v prihlášk.e 22 0 950, ktoré skráti (oddelí) X-Pro predĺženie od jadra proteínu.

Austrálska patentová prihláška, číslo dokumentu AU-Al2709/88, popisuje spojené peptidy, použiteľné pre afinitnú kovovú chromatograf iu (IMAC). Popísané afinitrié peptidy obsahovali aspoň dva susedné liistidínové zvyšky. Čistenie IMAC popísanými prostriedkami vyžaduje zvláštnu syntetickú chémiu na prípravu živíc kyseliny n itri 1 u tr i oc tove j (NTA).

Tallon M.A., a iní Biochem. 26: 7767-777A (1987) sa týka syntézy rozšírených analógov tridekapeptidu alfa faktoru Saccharomyces cerevisiae. Syntetizované analógy sú rozšírené alfa faktormi, ktoré predstavujú reťazce prirodzeného pro-alťa faktora kódovaného v M F - a 1 í a -1 štruktúrnom géne.

G.Kreil a iní.,: Eur. J.Biochem., 111, 99-58 (1980) popisujú, postupné štiepenie na N-koncovej časti prekurzora melitínu ( Proine 1 ití n ) d i pept i d y 1 p e p t i dá zou IV. Promelitín je h 1avná zložka včelieho jedu. V reťazci aminokyselín na N-konci prekurzora je každý druhý zvyšok buď prolín alebo alanín.Keď sa na promelitín pôsobí DPI’ IV, izolovanou z bravčových ľadvín, oblasť N-k on c a prekurzora sa štiepi, postupne za vzniku zrelého (mature) proteínu. Promelitín na rozdiel od spojených proteínov podľa tohto vynálezu je prirodzene sa vyskytujúci p r o t e í n .

M o 1 1 a y C. a i n í. ,Eu r. J.B i o c h e m. ,16 0, 31-35 ( 1986) popisujú izoláciu 1)1’P IV z kožných sekrétov Xenopus laevis.

R o z o b e r' á s a a k t i v i t a D P P IV.

M e n 11 e i n R . , F F B , V <.» 1.234: číslo 2 , 2 5 1-256 ( j ú 1 1988 ) zhŕňa úlohu prol {nových zvyškov' pri starnutí a degradác i i peptidových hormónov a neuropeptidov. Je známe, že proteázy u cicavcov š p e c i f i c k é n a p r o J í n . ako j e D P P 1 V , n i. e s u z a po j e n e do syntézy regulátorov peplidov, ale môžu mať dôležitú úlohu p r i i c h d e g r a d á c i i . K o n š t a n tu j e s a t e d a , ž e z a t i a 1 č o u obral lovcov a nižších n hra i lovcov prokúrzorové prot e í ny sa i

spoliehajú na DPP IV, aby premenila prekuzory na zrelé formy, spracovanie regulátorov proteínov u cicavcov používa DPP IV obyčajne ako degradačnú proteázu.

Frohman L.A. a iní, J.Clin. Invest. 78, 906-913 (1986) uvádzajú, že faktor uvoľňujúci ľudsky rastový hormón (hGRF) a jeho analógv rýchle degenerujú in vjvo u človeka a in vltro účinkom plazmovej DPP IV.

Kubiak T.M. a iní: Drug Metaholism and Disposition, 17,č . ú , 393-397 ( 1989) r e f e r u j ú o metabolickej degradácii in vitro analógu uvoľňujúcej hovädzí rastový hormón (bGRF) v hovädzej a bravčovej plazme a jej koreláciu s aktivitou plazmovej DPP IV. Skúšané analógv bGRF mali Ala zvyšok v polohe 2- od N-konca. Uvádza sa, že metabolická degradácia (bGRF) v plazme je vyvolaná prítomnosťou plazmovej DPP IV.

Hong W. a iní, Biochemistry, 28: 8A7Ú-8A79 (1989) uvádzajú vyjadrenie pre enzymaticky aktívnu DPP IV v bunkách . vaječníkov čínskych škrečkov po transfekcii.

G. TIBS 15: 23-26 d i p e p t i d o v pomocou na konečné produkty. Prekurzory popísané Kre i lom sú prirodzene sa vyskytujúce proteíny. Spojené proteíny podľa tohoto vynálezu sú umelé proteíny.

Boman a iní, J Biol. Chem. 26é : 58 5 2-5860 ( 1989) ukázali, že dipeptidylpeptidóza izolovaná z ceoropia pupae (s podobnou špecificitou ako má DPR IV) bola schopná odstrániť prirodzené reťazce na N-konci Ala-Pro-GIu-Pro z N-konca syntetických kópií prirodzených prekurzorov cecropia A a B. Preprocecropin popísaný Bohmanom je prirodzene sa vyskytujúci proteín.

Dalboge Ií. a iní Bi o/t.echno 1 ogv, 5: 161—164 (február

1987) popisujú premenu in vi. tro prckurzura ľudského rastového hormónu (hGH), vyrobeného E. coli na autentický h GII . Koncové predĺženie prekurzora sa odstráni d i pe p t i d ylpepti d á z o u I.

Dalboge 11. a iní FF13S , 266 (1,2): (marec 1989) popisujú klónovanie a expresiu prekurzora IL-.1 beta a jeho konverziu na IL-1 beta odstránením predĺženia prekurzora na N-konci.

(január 1990) zhŕňa postupné DPP pri konverzii prekurzorov

Krei 1 štiepenie d i pep ti dy 1pept i dá z o u I.

Dalboge II. a iní, FFB3 . (1,2): 1-3 (jún 1990) popisujú spracovanie in vi vo N-koncového int: t. ionínu v E. coi i.Uvádza sa, že odstránenie N-koncového metionínu z rozšíreného ľudského rastového hormónu bolo závislé na aminokyseline susediacej s m e t i o n £ n o m .

Hopp T. P. íi iní, Bio/technoľ. 6: 1206-1210 (okt.1988) popisujú pripojenie peptidu s ôsmimi aminokyselinami na N-koniec rekombinantného lymfokinu, aby sa vytvoril antigénny N-koniec, ktorý by bolo možné /použiť na imunoaíinitné čistenie. Táto publikácia odpovedá US patentu č. 6 702 137 popísanému vyššie.

Smith M.C. a iní, J.Biol. Chem. Voi.263, 15: 7211-7215 (1988) popisujú experimentálne výsledky podporujúce hypotézu, že selektívne peptidy, chelátujúce kovy na NH2-konci malého peptidu, je možné využiť na čistenie tohto proteínu pomocou i ó nové j afinít, nej c hromatograf i e. Tento odkaz uvádza špecifické údaje týkajúce sa jedného z príkladov vyššie 569 796. Menovité použitie peptidu spojeného k luteinizačnému hormónu hormón, alebo k proinzulínu umožňuje, aby c h i m é r n y p e p t i d sa čistil p o m o c o u 1M A C, zatiaľ čo kontrolované molekuly neobsahujúce člen His-Trp nie je možné získať podobným spôsobom.

Hochuli E. a iní, J.Chromat. 611: 177-186 (1987) popísali absorbent s kyselinou n itri 1 otrioctovou užitočný pre kovovú iónovú afinitnú chromá tograf in. Uvádza sa, popísaného US patentu č. 6 ehe 1 átujúceho kovy His-Trp uvoľňujúcemu absorbent, keď nasýti Ni ^{2 +} p r o t e í n o v o b s a h u j ú c i c b peptidov i z v y š k y .

1, j u n g q u i s t C . a iní popis uj ú pou ž i t i e

A1 a - H i s - G 1 v - II i s - A r g - P r o ze popísaný pre v i fi z a n i e hi s t i d í nové užitočný s u s e d i a c e

Eur. J . B i o c 11 e m. 186: 563-569 ( 1989) peptidu e b e 1 á fu j úe eb o kovy v dvoj, š fvo r a osemnásobnej m u 11 i c i p J i t e s po i u s k o 1 ó n o u o b s a hu j u c o n im o bi 1 i z o van e Z i/ ⁺ ióny. Podľa Ljungquista použitie tohto peptidu ehelátujúceho kovy so zinkovou kolónou poskytuje neočakávane dobré čistenie spojeného proteínu.

Tak ako sú tu používane výrazy 'umelý spojený proteín, u in e 1 ý s po j e n ý p o 1 y p e p t i d , spoj e ne p r o t. e i n y a s po j e n e polypeptidy vzťahujú sa zameniteľné na proteíny a polypeptidy, ktoré sa nevyskytujú normálne v prírode a ktoré obsahujú jadrovú proteínovú časť a predĺženú časť.

Tak ako sú tu používané výrazy jadro proteínujadrová časť proteínu a časť polypeptidu týkajú sa časti spojeného polypeptidu, ktorá je umiestnená na C-konci molekuly a ktorá by bez predĺženej časti bola žiadaným polypeptidom a/alebo biologicky aktívnym proteínom včítane prirodzene sa vyskytujúcich biologicky aktívnych proteínov, po lype.pt i do v a ich a n a 1 ó g o v a m u t a n t o v.

je tu používaný výraz predĺženie N-konca prvú až z asi 45 aminokyselín začínajúcich na

N-konci, ktoré nie sú časťou jadrového proteínu.

Tak ako je tu používaný výraz proteínový liek, vzťahuje sa na spojené proteíny, ktorých biologicky aktívny proteín je užitočný ako liek.

Tak ako sú tu používané výrazy biologicky aktívny proteín a biologicky aktívne polypeptidy, vzťahujú sa vymeniteľné na proteíny a polypeptidy, ktoré majú biologickú aktivitu.

Tak ako sú tu používané výrazy žiadaný proteín a žiadaný polypeptid, vzťahujú sa vymeniteľné na proteíny a polypeptidy, ktoré sa majú získať v čistej forme.

Tak ako vzťahuje sa na

Tak ako je tu používaný výraz predĺžená časť, týka sa časti spojeného proteínu, ktorá je predĺžením N-konca a ktorá nie je časťou biologicky žiadanej časti.

Tak ako je tu používaný výraz predĺžená časť N-konca IV, týka sa predĺženej časti spojeného a m i u o k y s e 1 í n , k t o r- é j e m o ž n é štiepite ľná DTP proteínu, k 1 o r á odstrániť postupným štiepením pomocou b P P IV.

ma

V p opis e r e t a z c: o v i ek toré z v v š k v a m j. n o k v s e 1 í n (j z n a e e u é v S e k v . 11) a k o X a a

S e k v . 1 l) e . 3 X a a

Pre u e platí nasledujúci popis: predstavuje amidovaný arginylový zvvšok na C-konci

Sek v. 111 č. ή Xaa²⁹ predstavuje amidovaný arginylový zvvšok na C-k o n c i .

v	S e k v . í D t	. o Xaa29	pred í; ta v u j e	a m i d o v a n ý	a rginy1 ový
zvyšok	na C-k o n c i .
V	Sekv. 1D č.	14	Xaa29	predstavuje	amidovaný	arginylový
zvyšok	na C-kone i,.
V	Sekv. ID č.	18	Xaa 3 1	pred s tavu j t:	a m i d o v a n ý	a r- g i n y 1 o v ý
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	19.	X a a 3 3	p r e d s t a v u j e	amidovaný	arginylový
zvyšok	na C-konci.			/
V	Sekv. I D č.	20	Xaa39	p r e d stavuje	a m i d o v a n ý	arginylový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	21	Xaa45	p r e d s t a v u j e	amidovaný	arginylový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	2 4	X a a 2 7	predstav u j e	amidovaný	arginy1ový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	2 5	Xaa 3 1	predstavuje	amidovaný	a rgi ny1ový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	26	X a a 3 3	predstavuje	a m i d o v a n ý	arginy1ový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	27	Xaa 3 5	p r e d s t a v u j e	amidovaný	a rg i ny1ový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. ID č.	28	Xaa37	predstavuje	amidovaný	arginylový
zvyšok	na C-kon c i.
V	Sekv. ID č.	29	Xaa33	preds tavuj e	amidovaný	a rg i ny1ový
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. 1D č.	30	Xaa 3 5	predstav u j e	a m i d o v a n ý	a rgi ny1ový
zvyšok	na C-k o n c i.
V	Sekv. II) č .	31	X a a 3 7	pred s t a v u j e	a m i d o v a n ý	arginylový
zvyšok	na C-ko n e i.
V	Sekv. I D č.	3 2	X a a 3 9	p r e d s t a v u j f;	a m i d o v a n ý	arg i ny1ový
zvýš ok	na C-k o n e i .
V	Sekv. ID č .		Xaa4 3	pred stavu j e	a m i d o v a n ý	argi ny 1ový
zvyšok	na C-k onci.
V	Sekv. I D č.	3 4	Xaa 4 3	pred s tavu j e	a rii i d o v a n ý	a r g i. n y 1 o v ý
zvyšok	na C-konci.
V	Sekv. 1 D č.	3 5	Xaa 4 3	p r' e d s ta v u j e	a m i d o v.»n ý	a r g i n y 1. o v ý
zvýš o k	na C-konci.
V	S e k v . I D č .	36	X a a 3 '	p r u < i s i a v 11 j e	a m i d < > v ŕi j i ý	argi. n y i o v ý

1

zvyšok	na C-konci .
V	S e k v . I D č .	37	Xaa3 1	predstavuje	a m i d o v či n ý	a r g i n y 1 o v ý
zvyšok	na C-konc i .
V	Sekv . II) č .	30	Xaa3 1	p r e d s t. a v u j e	ainidovaný	arginvlový
zvyšok	na C - k o n c i. .
V	Sekv. I D č .	39	Xaa3 1	p r e d s t a v u j e	amidovaný	a rg i ny 1 o vý
zvyšok	na C-kone i.
V	Sekv. 11) č .	4 0	Xaa 3 1	predstavuje	amidovaný	a rg i ny1 ový
zvyšok	na C-konc i .			/
V	Sekv. ID č .	41	Xaa3 3	p r e d s t či v u j e	či m i d o v a n ý	a r g i n y 1 o v ý
zvyšok	na C-k o n c i .
V	Sekv . II) č .	42	Xaa3 1	pred s t. a v u j e	a m i d o v a n ý	arg i ny J ový
zvyšok	na C-konc i .
V	Sekv. II) č .	43	Xaa 3 3	predstavuj e	amidovaný	arginy1ový
zvyšok	na C-k o n c i .

Vynález sa týka upotrebiteľných proteínov a po 1 ypepti dov. Podľa tohto vynálezu biologicky aktívne polypeptidy sa najskôr pripravia ako spojené proteíny obsahujúce dve časti: prvú čast druhú časť, predĺženie n či svojom karboxylovom predstavujúcu jadrovú časť proteínu a N-konca, ktoré je kovalentne spojené konci k amínovému koncu prvej časti. Predĺžená časť N-konca spojeného polypeptidu má reťazec aminokyselín, ktoré ju robia citlivú na štiepenie pomocou dipeptidylpeptidázy IV (DPP IV). Spojený proteín podľa tohto vynálezu má vzorec:

Predĺžená časť-jadrová časť proteínu znamená predĺženie N-konca šti ep i te ľného predstavuje kovolentnú peptidickú väzbu kde predĺžená časť' pomocou DPP IV, a a jadrová časť proteínu znamená žiadaný peptid, ktorý sa uvoľní od predĺženej časti spracovaním pomocou DPP IV.

Predĺžená časť spojeného proteínu podľa tohoto vynálezu má reťazec aminokyselín na s 1 edu j úc eh o vzorca:

A-X-Y(X’-Y) n kde Λ buď chýba, alebo znamená metionín, n pred s to v i.i j e počet' 1 i.neárne spojených (X'-Y) skupín. Toto číslo je od 0 ďo 20 takýchto skupín, s výhodou O až 10 s ku pín ,

X je vybrané zo skupiny tvorenej všetkými v prírode sa vyskytujúcimi aminokyselinami ,

Y ju v y b r či n é zo .s k u p i n y hyd r oxypro 1 í noín , alanínom. serínom a prípadov, keď n = 0, potom je Y vybrané alanínom, serínom a treonínorn,

X’ je vybrané zo skupiny tvorenej

t. vo r e n e j pro 1 inom ,

L re o n í n o m, s výnimkou zo skupiny' tvorenej všetkými v p r í r· o d e sa výnimkou prolínu a vyskytujúcimi aminokyselinami s hydroxypro1 í nu .

Podľa tohto vzorca, keď n=l, sú tu dva Y zvyšky. Ďalej je možné mať až dvadsaťjedna Y zvyškov a dvadsať zvyškov X’ v jednom prevedení. Jednotlivými Y a X’ zvyškami môže byť akýkoľvek zvyšok zo skupiny, z ktorej sa vyberajú. To znamená, že jednotlivé zvyšky Y nemusia podobne pri prevedení s viac byť v danom prevedení, totožné, ako jedným zvyškom X’, každý prítomný jednotlivý X’ zvyšok môže byť akákoľvek aminokyselina s výnimkou prolínu a hydroxypro1 ínu, bez ohľadu na to, aký zvyšok je každý iný X’ zvyšok. Každý individuálny Y a X’ zvyšok musí súhlasiť s pravidlami pre danú zvláštnu skupinu a všetko, čo je nevyhnutné je, aby rôzne individuálne zvyšky v špecifických polohách vyhovovali pravidlám vyššie uvedeným.

Spojené proteíny, v ktorých (A) je prítomný ako metionín (Met) predstavujú reťazce uži t o č n é na produkciu biologicky aktívnych proteínov pomocou metodík rekomhi nantne j DNA v E.

p r e k u r z o r o c h j e o h y č a j n e coli alebo niektorými coli. Reťazec Met prítomný v týchto spracovaný e n z y m a ti c kým s y s t é m o m E inými prostriedkami, ktoré môžu použiť osohy s priemernými odbornými znalosťami. Syntéza proteínov v E. coli je za normálnych okolností iniciovaná translačným iniciačným kodónom AUG, kódujúcim pre Met. V dôsledku toho novo syntetizované polypeptidy majú metionínový zvyšok ako svoju N-koncovú aminokyselinu. E. coli má enzýmu t.ickú aktivitu schopnú účinne odstraňovať Met na N “kone i, keď Met. zvyšok na N-konci susedí s aminokyselinou s relatívne malým bočným reťazcom, ako je Glv, A la alebo Ser rovnako ako ľro. Vysoko špeeitické ods t rá nen i e Met z N-konca je možné pomocou bréxnkyánu, štiepiaceho Met. Avšak, aby táto procedúra hoia úspešná, Met na N-konci musí by ť jed i n ý m M e t v e e 1 o m p c o i e i n o v o m r e ť a z c i , in a k n a s I. či n e š t i e p e nie k a ž d é h o M e t v r e ť a z c i . Prelo pre s p o j e n é· pro i e í n y

3 obsahujúce vnútorný Met reťazca musí byť druhou aminokyselinou od N-konca Pro, Ala alebo Ser, pokiaľ sa má Met odstrániť e n z y m a t i c k ý m systémom E. c o 1 i.

Okrem spojených peptidov sa tento vynález vzťahuje na molekuly, ktoré majú reťazce rekombinantnej DNA kódujúce spojené polypeptidy, na metódy použitia rekombi nantne. j DNA, na metódy použitia spojených p o 1 y p e p t. i d o v v č í t a n e m e t ó d čistenia žiadaných polypeptidov a na metódy podávania liekov zahrňujúce použitie proteínových liekov, ktoré sú prevedené z prekurzorov na biologicky aktívne formy postupným proteolytickým štiepením predĺženia N-konca in vivo.

Výroba spojených polypeptidov môže byť realizovaná pomocou štandardnej syntézy peptidov alebo obidva s p ô s o by s ú použitím m e t o d í. k dobre z n á m e priemer n ý m rekombinantnej DNA, odborníkom. Syntéz ti prípravu polypeptidov, aminokyselín. Pre väčšie peptidov je preferovanou metódou na ktoré o b s a h u j ú m e nej ako 50 molekuly sa dáva pred n osť p o už i t i a metód rekombinantnej DNA v hostiteľských bunkách.

Spojené polypeptidy, ktoré rozpoznávané a štiepené DPI’ IV sú ako nemodifikované polypeptidy, jadro. Tento vynález popisuje užitočnosti. Prvá proteínové lieky' s po j en e majú predĺženie N-k o n c a užitočnejšie a výhodnejšie ktoré majú len proteínové d v e ohla st i p o 1 y p e p t i d y z v 1 á š ť. n e j na zvvané k t o r é za h rň u jú b i o 1 o g i c k y aktív n e polypeptidy užitočné ako Lieky kovalentne spojené s predĺžením N-konca štiepi teľ ným DPI’ IV. Tieto protormy sa rnôžu previesť na biologicky aktívne formy štiepením DľP IV v ľudskom alebo zvieracom tele, do ktorébo boli podané ako prote í no vý liek. Teda tento vynález sa vzťahuje na spojené polypeptidy užitočne použitie spojených polypeptidov v a na metódu podávania biologicky aktívnych poly p e p t i d o v p a c i e n t o vi. D r u b y m použi 1.1 in s p o j e u ý c b polypeptidov podľa t obi: o vynálezu je čistenie p rote í nov, ριΊ, ako proteínové lieky, liečivých prípravkoch ktorom predĺženie N-konca umožňuje .jeho čistenie, a pomocou Dľľ IV. leda tento je zlož kou po i y p e p t i. d u . ktoré zložkou odstrániteľnou štiepením vynález sa vzťahuje na spojené polypeptidy užitoční’; pre procesy čistenia a na spôsob čistenia žiadaných po lypeptidov. Slúži to užitočnosť t o ii t o vynálezu a nemá to obmedz i ť.

Pri obidvoch použitiach sa. jadrová proteínová časť spojeného proteínu uvoľňuje od predĺženej časti činnosťou DPP 1 V .

V prípade spojených proteínov používaných v čistiacich metódach je nežiaduce, aby jadrové proteíny boli substrátmi na ako p r í k 1 a d y v y s v e t ľ u j ú c e žiadnym spôsobom vynález štiepenie pomocou DPP IV tomu, aby DPP IV nebola sa dáva prednosť jadrový proteín po jadrového; p r o t e í n u , v i v o (t. j . v p 1 a z m e

Z n a m t; n á to, že schopná štiepiť odštiepení predĺženej časti. Často je veľmi žiadúce, abv v prípade, keď jadrový proteín je substrátom pre DPP IV, bol podávaný vo forme proteínového lieku. V takýchto prípadoch proteínový liek môže predĺžiť životnosť pretože časť DPP IV nachádzajúca sa in a tkáni ľadvín a pečene) bude použitá na spracovanie predĺženia N-konca a tek sa teda oneskorí degradácia proteínu. Znamená to, predĺženie N-konca môže účinkovať ako substrát pre DPP IV a konkurenčný inhibítor, oneskorujúci dočasne účinok DPP IV na jadrový proteín, a tým ho dočasne chrániť.

Tak ako sa tu používa, proteínový liek znamená spojený predĺženú časť N-konca štíepiteľnú DPP viazanú na jadrový proteín, ktorý je proteín obsahujúci IV a kovalentne biologicky aktívnym poJypeptidom užitočným ako liek. podávať ako s inými d e f i n o v a n á

Proteínové lieky.podľa individuálne prípravky zlúčeninami. Výhodným tohto vynálezu sa môžu alebo v kombinácii pr e v e d e n í m je dobre individuálna forma proteínového lieku. Vo všetkých prípadoch proteínové lieky sa spracovávajú prirodzene sa vyskytujúcou DPP IV, normálne sa na c há d za j ú c ou v organizme.

Výhodou podávania proteínového lieku v liekových prípravkoch je to, že s po ma i u j e aktivitu a/alebo zaisťuje predĺženú prítomnosť biologicky aktívneho proteínu. Proteínové lieky môžu leda z os láva ť aktívne ďalej ako n emod i. f i k o v a n é molekuly. Proteínové lieky môžu existoval’. v neaktívnom .stave dokiaľ neuplynie taký čas, že sa n eďeg ra d u j e dostatočná čast predĺženej č a s t. i a molekula sa nestane a k t í v n a . P r o t e i no v e

5 lieky môžu t eda ú č i n k o v a ť ak υ s ú s t a v y uvoľňujúce lieky s rôzne predĺženia N-konea sa v závislosti od ich dĺžky a v ich reťazci aminokyselín.

oneskoreným účinkom. Okrem toho degradujú rôznymi rýchlosťami, špecifických zvyškov prítomných

Možné je vytvoriť rôznu kombináciu rôznych foriem proL e í nových liekov, majúcich rozličné predĺženie N-konca, ktoré môžu zaistiť trvalú a stabilnú úroveň aktívneho lieku v pacientovi počas dlhej doby. Proteínové lieky teda môžu účinkovať ako sústavy uvoľňujúce lieky s oneskoreným účinkom.

Ako je vyššie uvedené, DPI’ IV štiepi od N-konca polypeptidu, pokiaľ určité zvyšky obsadzujú určité polohy. Tak ako sa tu používa, poloha jedna vzťahuje sa 11a polohu zvyšku aminokyseliny na N-konci. Tak ako vzťahuje sa bezprostredne N-konca. Tak polohu polohou sa tu používa poloha dva, na polohu zvyšku aminokyseliny, ktorá susedí s polohou jedna a ktorá je druhá od ako sa tu používa poloha tri, vzťahuje sa na zvyšku aminokyseliny, ktorá bezprostredne susedí s dve a ktorá je tretia od N-konca. Štiepenie, ktoré odstraňuje dipeptid z N-konca prebieha medzi polohou dva a polohou tri, pokiaľ a monuky s 1 i na tri. nie je prolín (Pro), hydroxypro1 ín (Hvp), alanín (Ala), serín (Ser) a treonín (Thr).

DPP IV štiepi zvyšky na N-konci rôznou rýchlosťou, podľa am i. n o k y s e i í n je v pol o h e d v a . Vo prípadov DPP IV štiepi najúčinnejšie, pokiaľ poloha obsadená Pro a ďalej je najúčinnejšia, pokiaľ poloha Keď je poloha jedna obsadená ty ro z ínom, h i s tidínom, DPP- ľ V pracuje približne rovnakou rýchlosťou, keď poloha dva je obsadená Pro alebo Ala. DPP IV je potom ďalej najúčinnejšia, keď poloha dva je obsadená Ser. Najmenej je účinná, keď poloha dva je obsadená toho, ktorá zo štyroch väčšine dva je dva je o b sadená Ala ť e n y 1 a 1 a n í n o m a 1 e b o

T hr.

S využitím í e. j i o pre d lžen.ia N- k o n c o v, i 111 or m á e i e k i o r é s a rýchlosťami. Je možne teda podáva t huď špecifický proteínový liek je možné navrhnúť rôzne budú š i i e p i ť. rôznymi prípravky, ktoré obsahujú alebo kom b i n á c .i u foriem p r' o t e í n o v ý c h 1 i e k o v . P r o L e í n o v e i i. e k v , m a j u c e. v ý b e r p r e <1 1 ž e n i. a

6

N-konca budú spracovávané rýchlosťou, ktorá bude závislá na ich reťazci aminokyselín. Možné je formulovať takú kombináciu proteínových liekov, aby obsahovala sériu proteínových liekov, ktoré budú spracovávané na aktívne peptidv v priebehu časového úsek u

Dĺžka a úprava reťazca aminokyselín sú kontrolujúce faktory rýchlostí štiepenia DPP všetky alebo väčšinu alternujúcich najrýchlejšie, zatiaľ čo predĺženia konverzované najpomalšie. Ďalej je

IV ί

Predĺženia obsahujúce s p r a r: o v a n e Y = Thr budú z n á m e, že d i p e p t i d i c k é jednotky X-Pro, kde X je buď Glu alebo Asp, sa štiepia omnoho pomalšie ako ich analógy, kde X je neutrálny alebo zásaditý zvyšok aminokyseliny. Pretože predĺženia môžu obsahovať rôzne zvyšky (zo štyroch) na každej polohe predĺženia, môže existovať extrémne veľký počet, variácií a permutácií.

Akýkoľvek biologicky aktívny polypeptid môže sa použiť ako po 1ypeptidový liek. PCT patentová

PCT/US90/02923, zaradená tu týmto odkazom, prihláška č. PCT patentová prihláška č. PCT/US91/O82A8, zaradená sem týmto odkazom a US patentová prihláška č. 07/368 231, zaradená sem týmto odkazom a každý popis analógov hovädzieho faktora uvoľňujúceho rastový v liečivých prípravkoch ako vynálezu. Ľubovoľný analóg hormón, ktoré je možné použiť proteínový liek podľa tohto popísaný v týchto prihláškach sa môže p o už i ť ako jadrová peptidická časť. spojeného proteínu podľa tohto vynálezu. Spojené proteínv obsahujúce takéto jadrové proteínové časti spojené s predlžujúcimi časťami môže pripraviť ktokoľvek, k t.o vie priemerne používať dobre známe metódy.

Iné hormóny, proteínv p r í k 1 a d y r e c e p t o ry

S p e c i f i c k é u s k u t. o č n e n i a t o h t o e n z ý m y , z. á s o b n é p r í k 1 a d y z. a b r ň u j ú :

peptid ( V 1 P ) , ľudský 'ne ta-ka zomor f in , v y 11 á 1 e z u o b s a b u j ú proteínv a krvné v a. z o Ά k í. í v n y č r t: v n ý žalúdočný inhibi čný peptid (G1 ľ), žalúdočný uvoľňujúci peptid (GkP), ľudský peptid Hl, ľudský peptid YY, ľ ragmen í 7-37 g i oka gónu podobného pepťidu i, giukagúnu podobný pe pi i d - 2 , látku ľ, neuropeptid Y? ľudský pankreatický po 1 ypep i i d, inzulínu podobný rastový lak t.o r - i (í G ľ - I ) . ľ o ti s k ý r n si o v ý hormón ( b GII ) , bo v a d z í r a s t o v ý

7 hormón (bGH), bravčový rastový hormón (pGíl), prolaktín (PRL), ľudský, hovädzí alebo bravčový rastový faktor uvoľňujúci rastový hormón (GRF), i riter 1 eukí n-1 beta (IT-Ιβ); EGF, iGF-2, glukagón, faktor uvoľňujúci kor t. ikotropí n (CRF), dynorfín, somat o s tat í n-J 4, endot.elín, transŕ ormačný rastový faktor alfa (TGF alfa), rastový transformačný faktor β (TGF β), inter1eukín-4 , i n ter 1 euk í in-6 , nervový rastový faktor (NGF), faktor nádorovej nekrózy (TNF), inzulín, f ibrob1 a s tový rastový faktor (FGF), i n ter f e. r ó n , C 1)4 ich syntetické či bi o syn I. e f i cké a i n t e r 1 e u k í n-2 (I L—2) ale b o analógy. Tieto polypeptidy sa tiež môžu použiť na vytvorenie jadrovej časti spojených proteínov podľa tohto vynálezu. Tieto polypeptidy majú slúžiť len ako príklady uskutočnenia a nemajú obmedzovať rozsah tohto vyná1ezu.

Menšie spojené proteíny syntetizovať napr. použitím podľa tohto vynálezu je možné metodiky pevnej f.ázv s použitím syntetizátorov peptidov (Applied Biosystems, Foster City, California), ako je podrobne popísané v RĽT/US90/02923 a 07/368 231.

U väčších molekúl sa dáva prednosť použitiu rekombinantnej ONA v hostiteľských bunkách, Tu je odborníkom, ktorí si prajú použiť metódu rekombinatnej DNA .na prípravu spojených proteínov, k dispozícii niekoľko spôsobov. Obyčajne sa gény kódujúce polypeptidy vložia do expresných vektorov, ktoré sa potom použijú na transformáciu alebo transfekciu vhodných hostiteľských buniek. Vložený gén je potom exprimovaný v hostiteľskej bunke a žiadaný polypeptid sa syntetizuje. Aby sa vyrobili spojené proteíny podľa vynálezu rovnakým spôsobom, do génu sa zaradí dodatočný reťazec DNA. DNA kódujúca zvyšky predĺženia N-k o n c a je špecificky viazaná na 5’ koniec génu kódujúceho požadovaný polypeptid. Tento dodatočný genetický materiál sa musí umiestniť downs tream oci

m u s x	by
ku g i	? n u .
p r e d i ži	Hli < 1
i. d .

aktivátora expresného vektora akt i vát ora. taviac reťazci v z b ľ a ílom o b s ah o v a f z v y š k y požadovaný po i vpept i.d .

tak, aby boj pod kontrolou umiestnený vo vhodnom čítacom tak aby exprimovaný proteín N-kouca kovaientne viazané na

8

Aby sa získali spojené proteíny podľa vynálezu pomocou metodík rekombinantne j DNA, je preto nutné navrhnúť o 1 i gonuk 1 e o t. i d y , ktoré kódujú reťazce aminokyselín žiadaného predĺženia N-konea a vloženia upstream proteínovú časť, za tieto o 1 i gonuk 1 e ot.i dy musia byť schopné od 5’ konca génu v z n i k u c h i m é r n e h o o 1 igonuk1 e o t i d ov a metódy používané na kódujúceho jadrovú génu. Metódy výroby produkciu chimárnych

Požadované biologicky s výhodou pripravia h o s t i t e ľ a.P o d ľ a tohoto nie kódu j ú c a .génov sú dobre známe priemerným odborníkom.

Okrem užitočnosti spojených proteínov ako proteínových liekov týka sa tento vynález čistenia a spracovania biologicky aktívnych rekombinantných po 1ypeptidov aktívne rekombinantné polypeptidy sa v rozpustnej forme alebo vylúčením z vynálezu predĺžená časť spojeného proteínu môže byť rozpoznaná .čistiacimi pros triedkami.Spojený proteín sa čistí od materiálu prítomného vo vylučovacom médiu alebo extrakčnum roztoku a potom sa spracuje, aby sa oddelila predlžujúca časť od jadrovej časti proteínu a tak sa pripravil požadovaný proteín. Preto požadované proteíny najvhodnejšie podľa tohto vynálezu sú biologicky aktívne polypeptidy, ktoré samotné substráty pre štiepenie DPP IV.

V súlade stýmto vynálezom génová sekvencia požadovaný proteín sa izoluje, syntetizuje alebo získa inak a operatívne spojí s DNA sekvenciou kódujúcou predlžujúcu časť. Hybridný gén obsahujúci gén pre požadovaný proteín .operatívne spojený s DNA sekvenciou kódujúcou predlžujúcu časť sa nazýva c h i m é i' n y gén.

Metódy a materiály na prípravu chimérnych génov a rekombinantných vektorov, transformáciou alebo transfekciou hostiteľských buniek, replikáciou vektorov v hostiteľských bunkách a expresia biologicky aktívnych cudzích polypeptidov a proteínov sú popísané v ľ rinč i ples o f (jene Mani p u 1 a t i on , 01 d and Primrose, 2nd odition, 19131 a v Sambrook a i n í . , : M o J e c u 1 e r Cloning, 2nd editiori, Cold Spring linrbor laboratory Press, NY (1989). Obidve sú zahrnul é do popisu týmto odkazom.

Tento vynález sa I ýka rekombinantných chimérnych génov, ktoré kódujú spojené proteíny. expresných vektorov s rovnakou funkciou, hostiteľov transformovaných alebo trans f ek tovaných týmito expresnými vektormi, a spôsobov získania týchto génov, expresných vektorov a hostiteľov transformovaných alebo transfektovaných uvedenými vektormi.

Tento vynález je možné použiť. na čistenie každého prokaryotického či euka ry o t. i ckéh o proteínu, ktorý .je možné vyjadriť ako produkt technológie rekombinantnej DNA v transformovaných alebo transfektovaných hostiteľských bunkách. Tieto rekombinantné proteínové produkty obsahujú hormóny, receptory, enzýmy, zásobné proteíny, krvné proteíny a mutantné proteíny vyrobené metódami proteínového inžinierstva,alebo syntetické proteíny. Vyrobené požadované proteíny môžu obsahovať HIV RNázu H, t.PA, II. —1 , receptor II,-1, CD4 , ľudský nervový rastový faktor·, sCD4-PĽ40, chimérny glykoproteín ľudského respiračného syneýtneho víru RSV (pozri US patentovú prihlášku č. 07/543 780, začlenenú do popisu týmto odkazom), EGF, IGF-1, IGF-'2, glukagón, faktor uvoľňujúci k o r t i k o t r o p í n (CRF), dynorfín, endotelín, rastový transformačný faktor alfa (TGF alfa), Pseudomonus endotoxín 40 (PE40), rastový transf ormačný faktor β (TGF fJ) , inzulín a ich analógy

Príklady imunoafinitu.

čistiacich prostriedkov z a h r ň u j ú

Iné čistiace prostriedky, ktoré rozšírené peptidy odstrániteľné pomocou DPP IV predpokladanom rozsahu tohto vynálezu.

V jednom uskutočnení tohto vynálezu spojené proteíny, obsahujúce biologicky aktívny polypeptid a predĺženú časť, ktorá je pepť. i dom c b e 1 á tu j ú c i m kovy, sú užitočné v imobi 1 i zovaných systémoch kovovej afinitne j chromá tograíi e.

Imobi1 i zoναná kovová afinitná chromatografia (IMAG) na frakcionáciu proteínvv bola prvýkrát popísaná : Poratb a iní.,:Nature 258: 598-599 ( 1975). Poratb popísal d e r i va í .i zá c i u živice kyselinou i mi. n od i o e f o von (IDA) a ehe lá tovanie kovových iónov na živicu derival i žuvanou 1DA.

proteíny je možné imobi lizovaľ na i ó ny. To vyžadu j e i m i n o o c I o v e j ( 1 DA ')

IMAG a využijú s ú t. i e ž v

Po ra i b po p í s a i , ž e kolónu obsahujúcu n a v i a z a n i e bežne na matricu s i m o t» i l i z o v a n é k o v o v é používanej kyseliny nasledujúcim c he 1 á t nvan í m kiiviivýcli iónov na živicu obsahujúcu ión/y cez funkčné skupiny poskytovať elektróny, zvyškov aminokyselín sú reagujú s kovovými aminokyselín s

IDA. Proteíny sa viažu na kovový/é zvyškov aminokyselín schopných

Po tenc i oná 1 ne e 1 ekt.rodonory zo cysteín, histidíny a tryptoťán. Proteíny iónmi cez jednu alebo viac t ý c h t o e 1ektrodonornými bočnými reťazcami.

Smith a' iní popisujú v 11S zahrnutý do popisu týmto o d p o v e d a j ú z a patente č. A 569 79A, ktorý je odkazom, že určité zvyšky aminokyselín i m o b i 1 i z o v a n é n aviazanie proteínu na je však možné kovové ióny. Naviazaný proteín eluovať znížením pH alebo použitím konkurenčných proti 1igandov ako je imidazol, keď sú zapojené do väzby histidínové bočné reťazce. Di- alebo tripeptidy obsahujúce histidín sa použili metóda súlade

61) 5 p o p i s u j e špecifické dávajú nečakane výborné

US patentu živicu v

IMAC na dôkaz, že IMAC je selektívna čistiaca s tým Smith a iní popisujú použitie metód rekombinantnej DNA na výrobu spojeného proteínu obsahujúceho peptid chelátujúci kovy kovalentne spojený s požadovaným po 1ypeptidom chelátujúci kovy je predĺženou časťou, ktorá je ovládacou pákou pre žiadaný polypeptid. Táto ovládacia páka sa môže použiť na čistenie proteínu.

Použitie technológie IMAC s peptidmi che 1 á tuj úc im i kovy, ktoré majú striedavé zvyšky II i s , je popísané v US patentovej prihláške č. 07/506 605, začlenenej do popisu týmto odkazom. US patentová prihláška č. 07/506 peptidy chelátujúce kovy, ktoré výsledky pri IMAC čistení spojeného proteínu, keď peptid chelátujúci kovy obsahuje tri až šesť alternujúcich zvyškov His. Podľa poznatkov US patentovej prihlášky č. 07/506 605 a č. A 569 79A je možné využívať bežne používanú IDA na čistenie spojených proteínov. majúcich cnelátujúcu kovy s aspoň tromi alternujúcimi h i s t í d í novými zvyškami, ktoré i vor i a reťazce rozoznateľné DPP IV. Štruktúra spojených prnfcintiv a použitie v IMAC sústave je predmetom US patentu č. A 569 79A. Štruktúra a použitie peptidickej časti ehe i át.u j úc e j kovy s alternujúcimi His zvyškami sú vvsvei leué v US patentovej prihláške č. 07/p06 6 D 5 . V y t v o r e n im spojeného p e p i i d u so z v y š i< a m i r o z ozná t e. 1 n y m i '21

DPP IV medzi a i ternu júcimi His zvyškami tento vynález dáva spojený proteín, ktorý sa dá čistiť pomocou ľMAC technológie a následne spracovať pomocou DPP IV na žiadaný polypeptid.

Podľa tohoto uskutočnenia predloženého vynáleze, predĺžená časť je peptid chelátujúci kovy, ktorý môže byť zobrazený vzorcom:

A-X-Z(X’-Y)_n kde A buď nie je, alebo znamená meti oní n, n predstavuje počet postupne spojených X ’-Y skupín, toto číslo znamená od 0 do 20 takýchto skupín, s výhodou 0 až 10 skupín,

X je vybrané zo skupiny tvorenej všetkými prirodzene sa vyskytujúcimi am i n o k y s e 1 i. na m i

Y je vybrané zo skupiny tvorenej prolínom, alanínom, serínom a treonínom, s výnimkou prípadov, keď n=0, potom je Y vybrané zo skupiny tvorenej alanínom, serínom a treonínom,

X’ je vybrané zo skupiny tvorenej všetkými prirodzene sa vyskytujúcimi zvyškami aminokyselín s výnimkou prolínu a hydroxyprolinu, pričom aspoň dva až tri zvyšky označené X’ a prípadne X sú histidíny (His). Y je s výhodou Pro a n je aspoň 3. Účinkom za vzniku a Y sú Pro, iivp, Ala, Ser alebo Thr. s príklad spojeného proteínu obsahujúceho

DPP IV sa predĺženie N-konca postupne štiepi biologicky aktívneho po 1 ypep t i d u , keď ovšeín biologicky aktívny polypeptid nie je sám substrátom DPI¹ IV.

Jeden príklad spojeného proteínu má predĺženú časť vzorca

His-Y(His-Y) n kde n = 3 až 11 výhodou Pro. Iný predĺženú časť. majúca vzorec:

X-Y(HÍS-Y)_n kde n = 3 a ž 0 , X j e k i o r á ko ľ v e k p r i r o d z e n e sa vyskytujúca aminokyselina a Y sú Pro, Hyp, Ala, Ser alebo ľhr, s v ý h o d o u P r o .

Pretože Met na N-kone i je dôsledok syntézy proteínu v

E.-coli a · je známe, že je spracovaný e iizyiua t i ck ý m systémom E . t: o 1 i , po k i a ľ j t; s u s e d n á a m i n o k y s e i i n a

P r o , U 1 y , A l a a I. e bo

Ser, nasledujúce predĺženie predstavuje re.ťazce užitočné pre

IMAC čistenie a štiepenie biologicky aktívnych peptidov či proteínov exprimovaných vnútromo1ekulovo v E. coli metódami r e k o m b i n a n t n t: j DNA

M e t - X - Y (II i. s - Y) n kde n = 3 až 8, Y sú Pro , Cly, Ser alebo Ala a Y sú Pro, Hyp, Ala, Ser alebo Thr, s výhodou Pro.

a k p r í k 1 a d e , daného

V inom vylučuje z sa požadovaný peptid či proteín hostiteľa po transformácii alebo transfekcii, vektory inôž.u byť navrhnuté tak, aby vylučovali proteín alebo polypeptid pomocou predĺženej časti, ktorá uľahčuje transport, ako je

X-Y(HÍs-Y)_n kde n = 3 až 8, X môže byť ktorákoľvek prírodné sa vyskytujúca aminokyselina kompatibilná s vylučovacím systémom daného hostiteľa a Y sú Pro, Hyp, Ala, Ser alebo Thr.

Iný purifikačný systém na čistenie proteínov, ktorý používa spojených proteínov a ktorý je dobre pri spôsobiteľný technológii spracovania pomocou DI’P čistenie. US patent č. 4 7(i2 iných, zahrnutý do popisu

IV je imunoafinitné 137 vydaný 1.11.1988 pre Hoppa a týmto odkazom, popisuje syntézu spojeného proteínu, ktorý má vysoko antigénnu N-koncovú časť a požadovaný polypeptid v časti. C-konca. Podľa Hoppa a iných spojené proteíny sa čistia zo surového supernatantu prechodom protilátky, kolónou obsahujúcou imobilizované rozpoznávajú antigénnu časť. spojeného proteínu. Imobilizované protilátky zadržia proteín v kolóne, zatiaľ čo nežiadúce zložky supernatanta sa eluujú. Potom je možné zmeniť podmienky v kolóne tak, aby komplex a n t i. g é n - p r o t i 1 á tkv disocioval.

Podľa tohto vynálezu vysoko antigénna N-koncová časť spojeného proteínu je predĺženou časťou, ktorá obsahuje zvyšky rozpoznateľné DPP IV. Po zhromaždení spojeného proteínu, popísaného v Hoppovom patente, sa proteín · vystaví DPP IV, č í m sa odstráni predĺžená časť. Priemerní odborníci m ô ž u vy k o n á va ť i m u n o a f in i t. n ý č i s t i. a c i s y s t é m po d ľ a Hoppa s predĺženou časťou pudla fotil o vynálezu na N-kone i.

Tu popísané uskutočnenie a príklady stužia na vysvetlenie p o d s t n f v tónin v y n a i e z u a nie s u u r e e n e na u I mi e d z e n i e r o z s a h u z a h r ň u j ú s p o j e n č schopné spracovania tak, že odstránenie vynálezu. Uvažované ekvivalenty tiež proteíny, ktoré majú predĺženie N-konca aspoň jedným z ostatných prostriedkov predĺženej časti sa dosiahne kombináciou prostriedkov. Uvažované ekvivalenty obsahujú tiež spojené proteíny, ktoré majú chemicky modifikované zvyšky aminokyselín.

Príklady uskutočnenia vyná 1 e z u

Príklad 1

Syntetické proteínové lieky, ktoré: proteínovými liekmi majúce jadrové proteíny, DPP IV.

su spojenými ako sú su b s t r á t v

Spojené polypeptidy, podávané ako proteínové môžu byť syntetizované ktoré i i eky, štiepi teľné DPP IV kovalentne spojené na N-koniec biologicky aktívneho polypeptidu. Štruktúra týchto proteínových liekov môže byť vyjadrená vzorcom:

predĺžená Časť - jadrová časť proteínu kde predĺžená časť” znamená predĺženie N-konca štiepitelné pomocou DPP IV, predstavuje kovalentnú peptidovú väzbu a jadrová časť proteínu znamená žiadaný uvoľní od predĺženej časti spracovaním majú predĺženie N-konca p e p t i d , k t. o r ý sa tomto príklade jadrový p o t e n c i o n á 1 n y m s u b s t r á t o m p r e d í ž e n e j č a s t i. .

Syntetické proteínové porno cou DPP IV. V prot e í. n spojeného proteínu je DPP IV nasledujúcim odstránením lieky je možné pripraviť metódami peptidovej syntézy, ktoré sú v obore dobre známe.

V jednom uskutočnení vynálezu jadrová proteínová časť je epidermálnv rastový faktor (EGF) a predĺženou časťou je G i ý - P r o - P h e - Λ i a :

G 1 y ^Λ - ľ r o ·^λ - P h e ² - A 1 a ¹ - ( E G E )

V inom prevedení jadrová pro í.e í no vá časť je glukagón a predĺženou časťou je A i a -Pro -Phe-Ala:

A 1 a '* - Pro ⁵ - P h e ² - A 1 a ‘ - ( g i u k a g é' n )

V inom prevedení jadrová proteínová časí je

- 2 6 (Ala¹⁵Leu²⁷)-bGRI: (1-29)NH2 (sek ID 3) a je Tyr-Ala:

Tyr ²-A i a ¹ - {[A1 a ¹⁵ Leu ^{2 7} J -bG R F(1-29)N H 2}.

predĺženou Časťou

Príklad 2

Syntetické proteínové lieky, ktoré sú spojené proteínové lieky majúce jadrové proteíny, ktoré nie sú substrátmi DPP IV.

Spojené polypeptidy, ktoré môžu 4>yť syntetizované a podávané ako proteínové lieky, majú predĺženie N-konca degradovateľné DPP IV spojené na Ν'-koniec biologicky aktívneho polypeptidu. Štruktúra týchto proteínových liekov môže byť vyjadrená vzorcom:

predĺžená časť-jadrová časť proteínu kde predĺžená časť znamená predĺženie N-konca štiepiteľné pomocou DPP IV, predstavujú kovalentnú peptidickú väzbu a jadrová časť proteínu znamená žiadaný peptid, ktorý sa uvoľní od predĺženej časti spracovaním pomocou DPP IV. V tomto príklade jadrový proteín spojeného proteínu je potenci oná 1nym substrátom DPP IV vzniknutým odstránením predĺženej časti.

Syntetické proteínové lieky sa dajú pripraviť metódami peptidovej syntézy, ktoré sú v obore dobre známe.

V jednom p r e v e d e n í jadrová proteínová časť je a n a 1 ó g bGRF, (Val², Ser⁸·²⁸,Leu ²⁷)bGRF(1-33)0H (sek. ID 1) a predĺženou č a sť o u je G 1 y- ľ r o-P h e-A 1 a:

G 1 y ^ή - P r o ³ -Phe ² - A 1 a ¹ - { | V a 1 ² S e r ⁸ - ^{2 8} Leu ^{2 7} ] -bGRF (1. -33 ) OH }

V inom prevedení jadrová proteínová časť je faktor uvoľňujúci kor t iko trop í 11 (CRF) a predĺženou časťou je G ly-Pro-Phe-Ai a:

G 1 y^ή-Pro1-Phe²-A 1 a ¹ -(CRF)

V inom uskutočnení jadrová proteínová časť. je dynorfín a predĺženou časťou je P h tí - ľ r o - ľ h t; - A i a :

Phe ⁴-Pr o ^J-Phe ² - A 1 a ^! - ( íly n or 1; í n )

V inom prevedení jadrová proteínová časť je s oma to s ta 1 i n - 2 íl a predĺženou časťou je G i y-P r o - Phe - P r o :

G 1 y '* - P r o ¹ - P h e ^z - P r o ' - ( s o m a t o s t a L í. 11 - 2 8 )

V inom prevedení -jadrová časť. proteínu je predĺženou časťou je A 1 a - P r o - P h t: - A 1 a :

A 1 a ⁴ - Pr o ³ - Ph e ² - A1. a ¹ - ( e n d o t e i í n )

V inom prevedení jadrová proteínová časť je analóg bGRF [ 11 e ²Ser ⁸ · ^{2 8} A 1 a ^{1 5} Leu ^{2 7} j-bGRF ( J. -40 ) OH (sek. ID 2) a predĺženou časťou je Phe-Ala:

Phe²-Ala >-{[I1 e ² Ser ⁸·^{2 8}A 1 a ¹³ Leu ²⁷]-bGRF(1-40)OH}

V inom prevedení jadrová proteínová časť je [11 e ²A 1 a ¹⁵ Leu²⁷]-bGRF(1-29)NH2 (sekv. ID 4) a predĺžená časť je Tyr-Ser:

Tyr ²-Ser’{[11 e²Λ1 a ¹⁵ Leu ^{2 7}]-bGRF(1-29)NH 2}.

endotelín a

Príklad 3

Predĺžená prítomnosť analógii bGRF Leu ^{2 7} - bGRF ( 1 - 29 ) NH 2

Analóg bGRF, Leu ²⁷-bGRF(1-29)NH2, ktorého reťazec je ukázaný ako Sekv. ID 5, je možno podávať ako liek obsahujúci jadrový proteín ukázaný ako Sekv.

rozšírené proteínové lieky.

Dá sa pripraviť celý r ad dobre známych metód s použitím proteínovej časti. Rozširujúce založených n a Sekv. ID 5 sú Phe-Ala, G 1 y-P r o-11 e-P r o, Sekv 6, Sekv. ID 7, Tyr-Ala, G1 y-Pro-Tyr-AI a , Sekv. ID 8, Sekv

í.D 5 a rozmanité na N-konci proteínových liekov pomocou Sekv. ID 5 aku jadrovej časti proteínových liekov ID

II)

9, Sekv. ID 10, Sekv. ID T y r - A1 a - T y r - A 1 a a V a 1 - A i a .

I.

Sekv

II) 12, Sekv. ID 13,

Príklad 4

P r e d 1 ž e n á p r í t o m n o s ť t Thr ²A1 a ^{1 r}> Leu ^{2 7} ] -bGRľ( I -29 ) NH 2 bGRF

Analóg bGRF, í Tli r ² Λ 1 a ' i.e u ^{2 7} ] - bGRF ( 1 - 29 ) NH 2 , ktorého reťazec je ukázaný ako s e kve n c i a ID 14 , je možné podávať a k o liečivo oosahujúce jadrový proteín ukázaný ako Sekv ID 1.4 a N-konci. rozšírených proteínových iiekov. Pripravené proi e í novýeh ijeknv s r o z š i r u j ú c i m i časťami r a d n a holi tri verz.it

Tvr-Tiir. Tvr-Seľ a Tvr-Thr-Tv r-Th r '2 6

P r í k 1 a (i 5

Spojené proteíny obsahujúce J1IV RNázu H a predĺženia N-konca

P o p i s u j e r e k o m b i n a n t n e j c h e 1 á t u j ú c i c h afinitou k c h i iné r ny c h pro t eí nov z na doménach peptidov h i s t i d í n y s Vektory sú a a 1 t.e r n u j ú c e p r o 1 í n y či pomocou DPP IV, aby sa sa stratégia čistenia Ľ . c o i i , založených kovy obsahujúcich alternujúce imobi1izovaným kovovým iónom, konštruované na riadenie syntézy spojených proteínov pomocou HlV RNázy H ako jadrového proteínu. Ako je ukázané nižšie, tieto spojené proteíny sú navrhnuté tak, aby mali alternujúce histidíny na čistenie pomocou aíinitnej chromatografi e (imobi1 izované kovové ióny) IMAC alternujúce alaníny na štiepenie odstránil peptid chelátujúci kovy (incp).

Predĺženia N-konca štiepiteľné DPP IV, ktorým sa dáva prednosť podľa tohto vynálezu, sú načrtnuté nasledovne:

Spojený protein HIVRH/incp číslo 1 obsahuje ako predĺženie N-konca Sekv. ID 15 spojenú k Hl V RNáze H:

Met^{1 1}-Pro ^{1 0}-A 1 a ⁹-H i. s ⁸ - Pro ⁷ - P r o ⁶-H i s ⁵-H i s ⁴-Pro ³-H i s ²-A 1 a 1-(111 V RNáza H).

Spojený protein HIVRH/mcp č.2 obsahuje ako predĺženie N-konca Sekv. ID 16 spojenú s IIIV KNázou H:

Me11 ¹ - A 1 a 1 °-Pro ⁹-H i s ⁸-A 1 a ⁷-H i s ⁶-A 1 a ⁵-H i s ⁴-A J a ³-H i s' ²-A 1 a l -( HI V RNáza H).

Spojený protein HIVRH/mcp č. 3 obsahuje ako predĺženie N-konca Sekv. 11) 17 spojenú k H í V RNáze íl:

M e t^{1 1} -G 1 y ’ ⁰ - P r o ⁹ - H i s ⁸ - P r o ⁷ - P r o ^& - H i s ⁵ - H i s ⁴ - P r o ³ - H i s ² - A1 a ’ - ( HIV RNáza H).

Tieto spojené proteíny sú k lénovanú a exprimovanú E. c o J i a čistia sa pomocou DEAE c hroma togra 1 i.e a RP HPLC . Na charakterizáciu spojených proteínov sa používa

N-konca. Aplikácia spojených proteínov alternujúce histidíny na čistenie rekombi iiantných proteínov pomocou IMAC u následné odstránenie predĺženia N-konca DPP IV po tvrdzuje užitočnosť· t.oh i o vynáiczu.

Konštrukcia chimérnych génov obsahujúcich gén 11IV RNázy H

V š e t k y metú d a m i .

rekombi na n tn é DNA 0 1 i g o n u k i e o t i d y , sa pripravia odpovedá júc e štandardnými c h e 1 á t u j ú c i m kovom/š t i e pi t e ľ nýin reťazcom, sa pripravia, vyčistia, ochladia ku génu kódujúcemu 11IV RNázu, aby vznikol chimérny a spoja gén .

Aby RNázy H, š t i e p i t e ľ n é expresného chimérnych sa pripravili expresné vektory kódujúce zvyšky Hl V o b s a li u j ú c t; j a 1 t tí r n u j ú c e h i s t j. d í n y a r o z poznáte ľ n é a DPR IV, chimérny gén sa vloží do :konečného vektoru. Expresné vektory obsahujúce konštrukcie g é n o v sa p o u žijú na transformáciu E. coli štandardnými metódami. V y 11 a č e n i e génov v Ľ. coli vedie k tvorbe spojených proteínov kódovaných chimérnymi génmi. Tieto spojené proteíny obsahujú aminokyseliny I1IV RNázy II a predĺženie N-konca, obsahujúce alternujúce histidíny (peptid chelátujúci kovy) a alternujúce prolíny a alaníny.

Príprava surových extraktov E. coli proteínov na sekvenovanie a izolácia spojených

Asi 3 g pasty buniek E. coli sa suspenduje v 30 ml 0,25 mol fosforečňanu draselného, pH 7,2, obsahujúceho 1 mmol d i ti otre i to 1 u (DTT), EDTA, a b e n z a m i d í n h y d r o c h 1 o r i d u , f e n y 1 m e t y 1 s u 1 f o n y 1 f 1 u o r i d u ( P M S F ) 10 mg/1 aprotinínu, leupeptínu a bestatínu. Táto suspenzia prešla trikrát francúzskym lisom, aby sa rozrušili bunky, bunkový lyzát sa odstred'oval pri 12 000 o t./m i n po dobu 1. hodiny. S u p e r na ta n t. sa od d fólii a pridal, sa pevný síran amónny na 70 % nasýtenie. Po .1 ho miešania sa suspenzia odstredila pri 12 000 ot ./min počas 1 hodiny. Supernatani. .sa odstránil a koláč sa znova rozpustil v 2,2? ml 50 mmol Tris, pH 7,5, .1 mmol DTT, PNS f a benzami d ínu.

Kolóna í MAC sa pripraví, nasledujúco: c ii e 1 á t u j ú c a s f? í a r ó za Ea.st Elfiw od firmy Pharmác i a sa dôkladne premyje Mi 1 ly —Q vodou na s i. n t. r o v a n o m s k i e n o m 1. i I t r 1 . Del sa z n o v a s u s p e n d u j e v o vode, aby vznikla suspenzia. Suspenzia sa naleje opatrne do sklenenej kolóny (Pharmacia) na objem (> ml (1 x 7 cm). .Po tí usadení gélu sa kolóna premyje 5 objemami 30 mmol EDTA (kyselina e ty 1 énd i a m i. n o t e t r a o c Lo vá ) , pH 8,0. Potom sa kolóna premyje 5 objemami 0,2 N NaOH a 5 objemami Milly-Q vody. Kolóna sa potom nasýti 5 objemami b 0 mmol N i SO 4 (alebo ZriCl 2 alebo C11SO4). Nakoniec sa kolóna premyje 5 voľnými objemami tlmi. v é h o r o z t o k u rovnovážneho

P o vn o vážil v tlmivv roztok sa pripraví z 20 mmol Tri s, pH 8,0, obsahujúceho 500 mmol NaCl, 1 mmol l’MSF, 1 mmol benzamidínu, 10 mg/1 leupeptínu a 10 mg/1 a p r o n i t í n u .

Kolóna sa vyvažovala aspoň s 5 objemami rovnovážneho m i v é h o roztoku. 5 až E. c o 1 i sa vlastnou in 1 surových extraktov r e k o m b i na n t n e j váhou nanesie na kolónu. Po vniknutí kolóny sa kolóna premyje 10 voľnými objemami tlmivého roztoku, obsahujúceho 1,0 mol NaCl namiesto

500 mmol NaCl, pH 8,0.

eluuje zvyšujúcimi celého materiálu do

Kolóna imidazolu v sa p o tom pH 0,0 sa koncentráciami Pri z a č i a t o č n vc h pufrovac om roztoku pri pokusoch sa uskutočňuje väčší počet, premývaní v každom pokuse, aby sa stanovila koncentrácia, pri ktorej sa chiméra eluuje. Neskoršie sa toto vymývanie zjednoduší a tri koncentrácie imidazolu: 35 mmól.

imidazolu v 11 m i v o m rovnovážnom roztoku, o b y č a j n e s a p o u ž i j ú 100 m m ó 1 a 300 m m ó .1 pH 8,0. Použije sa desať voľných objemov každého roztoku. Med z i v y m ý v a n í m s a rovnovážneho 11 m i v é h o roztoku.

kolóna premyje 10 tlmivého o b j e m íi in i

Nakoniec sa kolóna premyje 5 objemami 50 mmól EDTA, pH 8,0, aby sa zistilo či je v kolóne viazaný ešte nejaký proteín. Prietokové rýchlosti kolónou sú 1,0 ml/min. Odoberajú sa 5 ml frakcie. Kolóny sa prevádzkujú izbovej teplote. Na stanovenie obsahu proteínu vo vzorkách komerčne dostupne skúšobné súpravy Pieree pri sa pou ž í v a j ú proteín.

Aktivita Becerra S.P. a

HIV R N -j z y j. n í . : ľ EHS

H sa stanoví metódou popísanou v 27 D ( 1,2 ) 76-80 (s epf.1990),za hrn u t ú do popisu tými. o odkazom.

Konverzia spojených proteínov rozšírených (matui'c) proteíny n a N - konci tiíi z r c 1 é '2 9

Používa sa komerčne dostupná DPP IV, čistená z ľudskej placenty (Enzýme Systems Products, Dublin, CA), so špecifickou aktivitou 5200 rnli na mg proteínu. Jeden U je ekvivalentný hydrolýze 1 mikromólu syntetického substrátu, A 1 a-Pro-7-am i no-9 -2-1ri 1 1uórmety 1 kumarínu za jednu minútu pri pH 7,8. Enzymatická konverzia prebieha pri inkubácii spojeného proteínu (asi '1 až J 00 mg) s koncentráciou 1 až 10 τη g/ml s DPP

IV pri 25 »C substrátu 1 po dobu 30 minút a hmôt

100. Ž i a d a n ý p o 1 y p e p t. i d s a o d d e i í neštiepeného spojeného proteínu pomocou IMAC. Spoľahlivosť potvrdí analýzou reťazca na N-konci.

od sa

Príklad 6 liekov s ana logmi bGPF

Spracovanie proteínových hovädzej plazme in vitro

Tabuľka sumarizuje typické pokusy, ktoré ukazujú vytvorenie jadrového peptidu (Leu ²⁷)-bGPF(1-29)NH2 (Sekv.ID 5) z jeho troch arialógov rozšírených na N-konci:

Tyr⁴-A1 a ³-Tyr²-A 1 a ¹ -(Leu ²⁷)bGRF(1-29)NH 2 (Sekv. ID 19) e ²-A 1 a ¹ -(Leu ²⁷)bGPF(1-29)NH2 (Sekv. ID 18)

Tyr²-A1 a ¹ -(Leu²⁷)bGPF(1-29)NH2 (Sekv. ID 25) pri inkubácii v hovädzej plazme in vitro. Jediné met.abolity zistené v inkubačných zmesiach boli produkty štiepenia spojené s DPP IV.

Ty r ⁴-A 1 a ³-Tvr ²-A 1 a ¹ - ( Leu ^{2 7} ) bG PF ( 1 - 29 ) NH 2 (Sekv. ID .19) s e postupne menil na Ty r ²-A 1 a ¹ - ( L e u ^{2 7} ) bGPF ( J. - 29 ) NH 2 (Sekv. ID 25), ( Le u ^{2 7} )-bGR F ( 1 - 2 9 ) NH 2 (jadrový peptid Sekv. II) 5) a na koniec na (Leu²⁷)- i)GPF( 3-29) NH 2 (Sekv. ID 2 ú).

Ty r ² - A 1 a ¹ - ( Le u ^{2 7} ) bGPF (1 - 29 ) Nli 2 ( Leu ^{2 7} )-bGPF ( 1 - 29 ) Nli 2 (jadrový pepv (Leu²⁷)- bGPF(3-29)NH2 (Sekv. il) (Leu²⁷)- bGPF(I-29)NH2 (Sekv. ID plazmovej DPP IV na bGRF(3-29)NH2 (Sekv. ID 29).

Aj ked za podmienok HPLC n e b o 1 i p o z o r o v a n é i n é m a t a b o 1 i t y

(Sekv.	II) 2	5) s e menil 11a
i. d S (í k	v. ID	5) a potom na
29) .	S á m	jadrový peptid
5)	k 0 n v e r	toval účinkom
ekv. I D 29).
pou ž í vanýeh	pri pokusoch,
ΗΪ P t i. d	bGKF(3	-29) Nli 2 (Sekv.
t .) m » ž e	m u s í.	dochádzať aj k

iným p r o t e o 1 ý z a m . ktoré nie sú spósoiiené DPP IV, samozrejme pri významne pomalších rýchlostiach. Jadrový bGRF peptid sa nielen uvoľňoval z tu popísaných liekov š t i e p i t e ľných DPP IV, ale i polčas vzniku jadrového proteínu zo spojeného proteínu sa významne predľžil in vitro v porovnaní s polčasom jadrového proteínu (Sekv. ID 5) inkuhovaného priamo v hovädzej plazme (Tabuľka 1). Okrem toho dobu, keď bol proteín, uvoľňovaný p r í t o m n ý j a d r o v ý z proteínového lieku, je možné dobre / koreiovat s dĺžkou predĺženia proteínového lieku: polčas Sekv.

ID generovaného z proteínového liek u š tvrm i aminokyselinovými zvyškami bol dlhší ako toho, ktorý bol odvodený od proGRF, ktorý má len dve aminokyseliny v predĺžení ako Sekv. ID 18 alebo 25.

liekov s analógmi bGRF in vivo a

Ako je hormónu sa injektovaný

Príklad 7

Bioaktivita proteínových i n v i t r o .

ukázané v tabuľke 2, hladiny plazmového rastového zvýšili, keď Bo 1 steinským býkom - kastrátom bol intravenózne analóg Sekv. ID 10. Pri dávke 0,2 nmól/kg telesnej hmotnosti, indukované hladiny plazmového rastového hormónu boli porovnateľné s tými, ktoré vyvolala intravenózna injekcia jadrového peptidu (Sekv. ID 5). Potrebné je zdôrazniť, že predĺžený peptid Sekv. ID % vlastného účinku jadrového peptidu (Sekv obidva boli testované in vitro na uvoľňovanie mal len asi ID 5), keď

G H z buniek porovnateľná in vivo aktivita že jadrový peptid sa uvoľňoval hypofýzy. Preto sa týchto dvoch peptidov ukazuje, z predĺženého peptidu in vivo.

Rovnaký obraz uvoľňovania G H in v j vo sa po z o í^-o val tiež proteínových liekov a analógmi bGRF, ktoré mali. aminokyselín v predĺžení (Sekv. ID 19), ako je ukázané v tabuľke 3. Tu nebol žiadny významný rozdiel medzi uvoľňovaním GII indukovaným in vivo podávaním proteínových pri podávaní štyri zvyšky

1. i ekov , k t or é ma 1 i.

alebo 2 aminokyseliny v predĺžení ( p e p 1 i d y S c k v v i. t. r o p o 1 č a s u p r o t. e í n o v ý r h

ID 19 a Sekv. ÍD 18), cez významný rozdiel in jadrovéno pľideínu generovaného z týchto dvoch liekov s bGRF, ako je ukázané v Tabuľke l.

.ako je ukázané

1

Uvoľňovanie rastového hormónu in vivo bolo rýchle pre jadrový peptid (Sekv. I.b ä) ako i pre Sekv. II) 19 a 18, bez akéhokoľvek časového rozdielu maxima GH po podráždení bGRF analogmi.

Naša interpretácia týchto uvoľňovanie GH výsledkov je takáto: Rýchle proteínovými liekmi in vivo je spôsobená celkove vysokými hladinami tkáňovej a orgánovej DPP IV, ktoré sú asi 100 krát väčšie ako je koncentrácia plazmovej DPP IV. To vysvetľuje rozdiel v rýchlostiach spracovania proteínových liekov in vivo v porovnaní so štiepením in vivo zhrnutým v Tabuľke 1. Rovnako je možnú, že polčas jadrového peptidu vznikajúceho z prekurzorových proteínových liekov sa predĺžil in vivo, nie však dostatočne, aby sa prejavilo zmenené (predĺžené) uvoľňovanie rastového hormónu. Je známe, že uvoľňovanie Gll in vivo je. ovplyvňované stimulačným účinkom s o m a t. o s t a t í n u ( i n h i b i č n ý f a k t o r SRIF)· V príklade kastrátov Moseley a iní : J. Endocr. 17,

253^259 (1988) sa zvieratám vpichol intravenózne G1?F dve hodiny pred kŕmením z. tých dôvodov, že podvesok je citlivejší, na dráždenie GRF pred kŕmením ako po kŕmení. Faktory spojené s kŕmením ako vylučovanie ž 1 č ovej/pankreatickej SRIF môžu rušiť schopnosť podvesku uvoľňovať GH. Inými slovami, z podvesku sa nebude uvoľňovať žiadny Gll za prítomnosti GRF bGRF a inhibičným účinkom .uvoľňovania somato tropínu, (býčkov) kŕmených otrubami v priebehu prevahy SRIF. V kŕmených otrubami koncentrácie na z á k 1 a d n ú ú r o v e ň 3 nerušenom príklade kastrátov plazmového GH normálne klesá j ú hodín po kŕmení (tzv. ž ľa hov é obdobie) s ďalším zvláštnym nevypočítateľným pulzom GH medzi 5 až 8 hodinami po kŕmení. Ako odpoveď na injekciu GRF 2 hodiny pred kŕmením, dochádza k rýchle j odozve GH v priebehu 5-20 minút a hladina GH zostáva zvýšená po dobu 120 až 2A0 minút než sa vráti k základu. V prípade 'doleraz skúšaných GRF proteínových liekov, bol zvýšený len prvý exogénny GH pík, druhý neukázal žiadny účinok liečby. Je možné, že sa polčas jadrového GRF uvoľňovaného z. proteínového lieku v našich pokus o c h ne pred 1 ž i 1 d <> s 1 a t o č n e , «ί i>y umožni i j a d r o v é mu p e p i. i d u bvť prítomný v kolobehu v koncentráciách dostatočných na

2 ovplyvnenie ďalšieho zvláštneho pulzu exogénnej GH, obyčajne A až 6 hodín po prvom.

Celkove naše výsledky podporujú obecnú koncepciu proteínových liekov tu popísanú, pretože: i) GRF proteínové lieky s predĺženiami na N-konci š ti epi t.e ľnými DPP IV sa úspešne pripravili, aby produkovali jadrový peptid v hovädzej plazme in vitro cez DPP IV sprostredkované štiepenia, i i j i t

polčas jadrového proteínu vznikajúceho in vitro zo spojeného proteínu sa významne predĺžil a hol funkciou dĺžky predĺženia N-kone a proteínového lieku, iii) skutočnosť, že bGRF proteínové lieky s veľmi nízkou vlastnou potenciou boli rovnako účinné ako jadrový peptid pri uvoľňovaní G1I in vivo, ukazuje že jadrový peptid sa tvoril in vivo, ako sa predpokladalo .

Príklad 8

Príprava Gly^z‘-Prol-Ile²-Pro^I-{(i,eu²⁷)bGRF(l-29)NH2} trifluóroctovej soli..

Syntéza analógu GRF peptidu Sekv. 11) 26, ktorý má vzorec: Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg--Lys-l,eu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (ako trif1uóroctová soľ) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, zahrnutej do popisu týmto odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty v

zátvorkách: Asp	A ,	16 (6)	, Thr	1,07 (J),	S e r	1,81	(2) ,	G 1 u	2,07
(2), Pro 1,98	(2)	, G l y	1 , 99	(2), Ala 2	,99	(3) ,	Val 1	L , 1 3	( 1 ) ,
íle 2,86 (3 ) ,	1, e u	5,0 8	( 5 ) ,	Tyr 1,93	(2) ,	Ph e	0,96	O) ,	Lys

2,06 (2), Arg 2,97 (3).

Príklad 9

Pri p r a v a Ty r- A 1 a - G 1 y ⁴ -Pro ^J- I 1 e ²-Pro¹ -{(Leu ^{2 7} ) b G R F (.1 - 29 ) NII 2 } t r i f 1 n ó r o c f o v e j s o 1 i. .

Syntéza analógu GRí pept i d n Sekv. ID 27, obsahujúceho Sekv. íl) 6 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

3H - Ty r - A 1 a - G 1 y - ľ r e - 1 1 e - i’ r o - Ty r - A J. a - A s p - Λ i a - 1 i e - P h e - T h r - A s n S e r-Ty r - A r g - l.y.s -Val- L e u-G i y-G ] n - l.e u-Se r - A i a - Arg - l.y s - l.e u - L e u 3 3

G 1 η - A s p -1 1 e - L e u - A s n - A r g - N Η 2 (ako t r i í 1 u ó r· o c t o v á s o ľ ) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A. ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej zahrnutej do popisu týmto aminokyselín, teoretické hodnoty v zátvorkách: Thr 1,03 (1), Ser 1,74 (2), Glu 2,05 (2), Pro Ala 4,01 (4), Val 1,-28 (1), íle pribi á š k e P C T/U S 9 0/0 2 92 3, odkazom. Výsledky analýzy A s p 4,04 (4 ) ,

1,99 (2). Gly

2,00 (2)

2,84 (3), Leu 5,09 (5), Tyr 2,94 (3), Pbe 0,97 (1), Lys 2,07 (2), Arg 3,00 (3).

Príklad 10

Príprava Lys ⁸-Pro ⁷-Tyr ⁶-A 1 a ⁵-G 1 y ⁶-Pro ³-I1 e ²-Pro ' -{( Le u ^{2 7})bG RF (1- 2 9 ) N112 } trifluóroctovej soli

Syntéza analógu GRF peptidu sckv. II) 28, obsahujúceho Sekv.ID 7 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec: Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-11e-Pro-ľyr-A1 a-Asp-A 1 a -11 e-Phe-ThrAsn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-I.eu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-íle-Leu-Asn-Arg-NH2 (ako tr 111uóroctová soľ) sa uskutočňuje postupne podľa postupu a, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923,

zahrnutej	do	popi s u	t. ý m t0	odkazom.	Výsledky	a n a i ý z y
aminokyselín,	t e 0 r e t i c	ké hodnoty	s ú v z á t v 0 r k á c h :	A s p 4,04
(4), Thr	0,95	( 1 ) , Ser	1 ,78	(2) ,	Glu 2,04	( 2 ) , Pro	2,91 (3),
Gly 1,98	(2) ,	Ala 3,91	(ó) .	Va 1	0,96 (1),	íle 2,86	(3), Leu
5,08 (5),	Tyr	3 , (.) 6 ( 3 )	, Pbe	0,97	(í), Ly.s	3,06 (3) ,	Arg 3,08

(3).

Príklad 11

Príprava G 1 y ^Λ-Pro ³-Tvr ²-A i a ¹ -{(Leu ^{2 7})bGRF(1 - 29)NH 2 } trií 1 u ó roctovej soli

Syntéza analógu GRF pept.idu Sekv. II) 29, ktorý má vzorec:

6-G 1 y-P r o-Ty r- A 1 a - Ty r - Λ 1 a - A s p - Λ 1 a - I 1 e - Pii e — T li r - A s n - S e r-Ty r - A rgLys-Va i-Leu-G i y - G ! n - L e u - S e r-A J a - Arg - Ly.s - Leu- í, c u-G 1 n - A s p - í í e Leu-Asn-Arg-NH2 (ako t r i í I u óracetát) sa uskutoční postupne podľa postupu A. ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US9OO2923, začlenenej do popisu týmto od ka z o m. Vý s 1 e d ky a na t ý z y a mi no ky seI in, teoretické ho d n o t y s u u v e d e ne v z á t v o r i< ó ch: A s p 4,0.) ( 4 ) , f n r 0.9 6 ( 1 ) , S c r .1 , 8 0

6

(2) ,	Glu 2,02 (2),	ľr o	0,97	(1) ,	G 1 y	1,98	(2) ,	A la 3,91
Val	0,99 (1), Íle	1,89	(2) ,	L e u	5,0 8	(5) ,	Ty r	3,05 (3)
D , 98	(1), Lys 2,03	(2) ,	Arg	3,0 6	( 3 ) .

Príklad 12

Príprava Tyr ⁶-A 1 a ⁵-G 1 y⁴-ľro ³-Tyr ²-A 1 a ¹ -{(Leu ^{2 7})bGRF(1-29)NH2) trifluóracetátu.

/

Syntéza analógii GRF pept.idu Sek v. II) 30, obsahujúceho Sekv. ID 8 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

7-Tyr-Ala-Gly-ľro-Tyr-A 1.a-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-SerTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-11 e-Leu-Asn-Arg-NH 2 (ako tr i 1^:1 uóra c e tá t) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, začlenenej do popisu týmto odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické

hodnoty	sú v	zátvorkách	: Asp	6,07	(A) ,	T h r	0,96	(D ,	S e r	1,79
(2 ) , Glu	2,02	(2),	ľro	0,99	(D ,	G 1 y 1	,95	(2) ,	A l a 6	, 80	(5) ,
Val 0,96	(D	, íle	1,87	(2) ,	L e u	5,09	(5) ,	Ty r	6,11	(A),	Phe
0,97 (1)	, Lys	2,06	(2) ,	Arg	3,0 8	(3) .
Príklad	13
Príprava	Lys 8	- P r o 7 -	Ty r 6	-A la 5	-Gly*	-Pro 3 -	Ty r 2	-A la 1	-{(Leu	27)bGRF-

(1-2 9)N H 2} trifluóracetátu.

Syntéza analógu GRF pept.idu Sekv. ID 31, obsahujúceho Sekv. ID 9 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

8-Lys-Pro-Tyr-A J a-G 1y-ľro-Tyr-Ala-Tyr-A1a-Asp-A1a-11e-Phe-Thr-

A s n - S e r - Ty r - A r	g-Lys-Va 1-Le	u -	G 1 γ-	G i n - L e u - S e r - A 1 a - A r g -	Lys-Leu-
Leu-G 1 n-Asp-11.	e - L e u - A s n - A r	a — o	ΝΙΙ 2	( a k o t r i ť 1 u o r a c	e t á t)	sa
uskutočňuje postupne podľ	<1	po s	i u}>u A, ktor ý	j <	popísan ý v
publi ková ne j	PTC pribi á.š	k e	P	CT/US90/02923 ,	z a členenej	d o
popisu týmto	odkazom.		V ý s 1	e d k y a n a 1 ý z y	a m i n o k y s e	i í n ,
teoretické hodnoty sú v	z á	t v o r	k á ch: A s p 6.06	(6 )	, Thr	0,95
(1), S e r 1,7 8	(2), Glu 2 ,	0 i	(2)	. ľro 1,95 (2)	, G 1 y	1 , 96	('2) ,
A 1 a 6,81 (5) ,	Va i 0,9 5 (1	) ,	1 i	e 1,87 (2 ) , i. e u	5,0 9 ( 5 ) ,	Ty r
6,12 (6), ľli e	0,96 ( i 1 , 1. y	S	3,08	(3) , Arg 3 , i 0	( 3 ) .

Príklad 14

Príprava Phe¹⁰-A 1 a ⁹-Lys ⁸-Pr o ⁷-Tyr ⁶-A 1 a ⁵-G 1 y ⁴ -Pro 3-Tyr ²-A 1 a ¹ {(Leu²⁷ )bG R F( 1 - '2 9 ) N H 2 } trií 1 uórace tá tu .

Syntéza analógu GRF peptidu Sek v. 11) 32 obsahujúceho Sekv.ID 10 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

9-Ph e-A 1 a-Ly s-Pr o-Tyr-A 1 a-G 1v-Pro-Ty r-A1 a-Tyr-A 1 a-A s p-A 1 a-11 e Phe-Thr-Asn-Se r'- Ty r - A r g - Ly s - V a 1 - L e u - G 1 y - G 1 n-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Nil2 (ako trif luór ace tá t) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v

* publikovanej začlenenej do	PCT paten!ovej p 0 f) i s u t ý m 10	prihláške PCT/US90/02923,
odkazom.	v ý s 1 e d k y	a n a 1 ý z y
• *	aminokyselín,	teoretické hodnoty	s ú v z á	tvorkách:	A s p A , 16
	(A), Thr 1,01	(1), Ser 1,09 (2),	G 1 u 2,0 0	(2), Pro	1,91 (2),
	Gly 1,93 (2),	A la 5,7 2 (6), Val	0,97 (1),	íle ],90	(2), Leu
	5,09 (5), Tyr	A,09 (A), Phe 1,99	(2), Lys	3,00 (3),	Arg 3,0 A

(3) .

Príklad 15

Príprava G 1 y ^{1 2} - Pr o ^{1 l}-Pheⁱ⁰-Ala⁹-Lys⁸-Pro⁷-Tyr^G-Alo-^>-GLy⁴-Pro³Tyr²-Ala¹-{(Leu²⁷) bGKF (1-29 ) N J12 } t r i. f 1 uóra c e tá tu .

Syntéza analógu GRF peptidu Sekv. ID 33 obsahujúceho Sekv. ID 11 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

10-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-AlaAsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-LeuS e r-A1 a-Arg-Ly s - Le u-Leu-G 1 n-A s p-11 e -Le u-Λ s n -A rg-NH 2 (ako

tri f 1 uórac et.át.)	sa uskutočňuj	e p 0 s t u p n e p 0 d ľ a p 0 s t u p u	A ,	k t or ý
je popísaný	v p u b 1. i k 0 v n nej	PCT patentovej	p r i h 1 á š k e
PCT/US9O/O2923,	zahrnutej do	popi .su týmto odkazom.	Výs	l edky
analýzy aminoky	s e 1 í 11 , t e 0 r e t i.	c k é	hodnoty sú v zátvorkách	: A s p
A,00 (A), Thr	0,96 (T), Ser	1. , 7 9	(2 ) , G 1 u 2,07 (2) ,	Pro	2,0 0
(3), Gly 2,9A	(3), A 1 a 5,7 ó	( (>) ,	Val 0,9 6 (J. ) . Íle	1 , íl 0	(2) ,
Leu 5,13 (5),	Tvr A,j 1 (A) ,	l’h e	1,99 (2), Lvs 3,10	( 3)	, Arg
3,09 (3).
P r í k 1 a d 16
P r- í p r a v n V u 1 ’ Z| -	Pr 0! ! - G 1 y * 2 - Pt	„11-	Phe10 -A 1 a 9 - L ys 8 - pr 0 7	-Tyr	G _

A 1 a ⁵ - G 1 y ^h - Pr o - Ty r ² -· A 1 a ¹ - { ( L e u ^{2 7} ) bG R ľ (1-2 9 ) N11 2 } t r i í 1 u ó r a c e lá 36 tu .

Syntéza analógu GRF peptidu Sekv. ID 36, obsahujúceho Sek v. ID 12 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

11-Va 1 -Pro-G 1 y-ľr o-l’li e-A 1 a - Ly s - Pr o-Ty r-Λ 1 α-G 1 y-ľro-Ty r-A1 a Tyr-Ala-Asp-Ala-Iíe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-GlyG1 n - L e u - S e r - A 1 a - A r g - Lv s - L o u - L c u -G 1 n - A s p-11 e - L e u - A s n - A r g - N H 2 (ako t r i f 1 u ó r a c e t á ť ) sa uskutočňuje y o s t up n e po d ľ a post upu A, ktorý je popísaný v p u b 1 i k o v a n e j PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, zahrnutej do popisu týmto odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty sú v zátvorkách:

A s p 6,06	(ó) ,	Thr	0,96	(D ,	Ser	1,01	(2) ,	Glu	2,06	(2) ,	Pro
3,80 (6),	Gly	2,99	( 3) .	A 1 a	5,92	(6),	Val	1,98	(2),	íle	1 , 89
(2), Leu	5,10	(5) ,	Ty r	6,09	(á) ,	Phe 1,99	(2) ,	I.y s	3,06	(3) ,
Arg 3,08	(3) .

Príklad 17

Príprava Arg^{1 6} - Pro ^{1 5} - Val ^{1 4}- Pro^{1 3} - G 1 y ^{1 2} - Pro ¹ t-Phe^-Ala^-Lys⁸Pro⁷-Tyr⁶-A1 a ⁵-G 1 y ⁴-Pro ³-Tyr ² -A 1 a ¹ -{(Leu ²⁷)bGRF(1-29)NH2} trifluóracetátu.

Syntéza analógii GRF peptidu Sekv. ID 35, obsahujúceho Sekv. ID 13 ako predĺženú časť, ktorý má vzorec:

12-Arg-Pro-Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-ProTyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-The-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-ValLeu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-bys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-AsnArg-NIl2 (ako tri f 1uóracetát) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, zahrnutej do popisu týmto odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty sú v

zátvorkách	: A s p 6,10	(6), Thr	0,98 (1).	S e r	1,86	(2) ,	Glu	2,03
(2), Pro 6	,82 (5 ) , (	11 y 2,97	( 3 ) , A 1 a 5	,9 i.	(6) ,	Val ]	1. , 99	(2) ,
íle 1,88	( 2 ) , b e u 5 i	-09 (5),	Ty r 6, 10	(O .·	Pb e	1,98	(2) ,	, by s

3,03 (3), Arg 6,09 (6).

ľr í k l ad 1 B

P r { [> r a va Va 1 ² - A i a ¹ - { ( i.e u ^{2 7} ) b(?R F (1-2 9 ) NT f z ) t r i ŕ l u ó r a c e tá t o v e j s o 1 i .

Syntéza a n n i ó g u (, R ľ peptidu Sekv. i D 3(> má vzorec:

14-Va1-Ala-Tyr-A 1 a-Asp-A1 a-11e-ľhe-Thr-As n-Ser-Tyr-Arg-Lys Va1-Leu-G1y-G1n-Leu-Ser-A1 a-Arg-Lys-Leu-Leu-G 1»-Asp-1J e-LeuAsn-Arg-NHž ( ako tri f 1uórac etá t) sa uskutoční postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej l’CT patentovej prihláške PCT /US9O/O2923, zahrnutej do popisu týmto odkazom: Výsledky analýzy aminokyselín, t e o r e t i e k é h o d n o t y s ú v z á t v o r k á c h:A s p 3,9 B (4), Thr 0,89 (1), Ser 1,76 ( 2 ) , G 1 u 2,02 (2), Gly 1,05 (1), Ala 3,87 (4), Val 1,85 (2), Íle 1.77 (2), Leu 5,17 (5), Tyr 2,04 (2), Phe 0,97 (1), Lys 2,07 (2), Arg

3,06 (3).

Príklad 19

Príprava Tyr²-Thŕ¹-{(A 1 a ¹⁵ Leu ^{2 7})bGKF( 1 - '29 ) N11 2 } t r i í 1 u ó r a e e tá tu .

Syntéza analógu GRF peptidu Sekv. II) 37, ktorý má vzorec:

15-Tyr-Thr-Tyr-A 1 a-As p-A i a-1 i e-Phe-Thr-As n-Ser-Tyr-Arg-Lys Va 1 - Leu-A1 a-G 111-Leu-Ser-A 1 a - Arg-Ly s-Leu -Leu-G 1 n-A s p - .1 1 e-LeuAsn-Arg-NH2 (ako trif luóracetát.) sa robí postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, zahrnutej do popisu týmto odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty sú v zátvorkách: A s p 4,06 ( 4 ) , 'ľhr 1 , íl 6 ( 2 ) , Ser 1,77 ( 2 ) , G 1 u '2,07 (2), Ala 3,90 (4), Val 1,08 (1), íle 1,89 (2), Leu 5,1.4 (5), Tyr 2,94 (3), Phe 0,96 (1), Lys 1,99 (2), Arg 3,04 (3).

Príklad 20

Príprava Tyr ²-Thr ¹ - {( I1 e ² Λ 1 a ^1r’ Le u^{2 7})bGRľ(1-29 ) NH 2}tri í lu ó ra c e t á t u .

Syntéza analógu GRF peptidu Sekv. íl) 38, ktorý má vzorec:

16-Tyr-Thr-Tvr - 1 1 e-A s p-Λ I a - 1 1 e- ľhe - Thr-A s n-S e r-Ty r-Arg-Ly s Va 1 - Leu-A 1 a-G I n - I.e u - S e r-A 1 a - A rg - Ly s - Le u - 1. e u-G 1 n-A s p - 1 i e - L, e u Asn-Arg-NHz (ako t r i f 1uóracetá t) sa uskutočňuje postupne podľa ktorý je popísaný v publikovanej

PCT/OS90/02923. zahrnutej do odkazom.Výs1edky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty sú v z á t: v o r k á c b : A s p ó , 0 7 ( 4 ) , T i 1 r í , 8 7 ( 2 ) , S e r 1,75 ( 2 ) , G 1 u '2,0 7 (2), Ala 2,94 (.3) , Val 1,0 d (i), .1 1 e 2,87 (3), l.ei.i. 5,12 (5),

PCT p a t e n t o v c; j p o p i s u t ý m t. o postupu A, p e i b 1 á š k e

í)

Tyr 2,92 (3), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2)., Arg 3,05 (3).

Príklad 21

Príprava Tyr ² - Thr¹ - {(Thr ²-A 1 a ^{1 5} - Leu·^{2 7} ) bGRF (1 - 29 ) N H 2 } trifluóra c e t á t u .

Syntéza a n a 1 ύ g u O P F p e p t i d u S e k v . 11) 3 9 , ktorý má v z o r e c :

17-Tyr-Tlir-Tyr-Thr-Asp-A 1 a -11 e-Plie - Thr-Asn - S er-Tyr-Arg-Ly s Va 1 - Leu- A 1 a-G 1 n - L. e u-S e r- A 1 a - Arg - l,y s -Leu-Leu-G 1 n- A s p - I 1 e - LeuAsn-Arg-NH2 (ako tr j. f 1 uóracetá t.) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej prihláške PCT/US9O/O2923, zahrnutej do popisu Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické zátvorkách: Asp 4,05 (4), Thr 2,68 (3), Ser 1,77 (2), GIu 2,07 (2),.Ala 2,90 (3), Val 1,08 (1), íle 1,89 (1), Leu 5,20 (5),

Tyr 2,87 (3), Phe 0,93 (1), Arg 3,07 (3).

PCT patentové j týmto odkazom, h o d n o t y sú v

Príklad 22

Príprava Tyr ²-Se r ¹ -{(Thr ²-A 1 a ¹⁵-Leu ^{2 7})bGRF(1-29 ) NH 2} tr i f 1 uóracetá t u.

Syntéza analógii GRF peptidu Sekv. ID 40, ktorý má vzorec:

18-Ty r-S er-Tyr-Tlir-Asp-A I a -11 e-Pli e-Thr-A s n-S e r-Ty r-Arg-Ly s Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-I.eu-I.eu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 (ako tri f 1uóracetát) sa uskutočňuje postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, zahrnutej do popisu týmto odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty sú uvedené v zátvorkách: Asp 4,11 (4), Thr 1,82 (2), Ser 2,64 (3), Glu 2,05 (2), Ala 2,90 (3), Val 1,04 (1), íle 1,87 (2), Leu 5,16 (5),

Tyr 2,92 (3), Phe 0,94 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,04 (3).

P r í k 1 a d_2 3

P r í p r či v a Ty r ⁴ -T h r ^J-T y r ² -ľ h r ¹ -{(T h r ² -A 1 a ¹ ’- L e u ^{2 7}) h G R P ( 1-29) N H 2 } t r i f 1. u óra c e tá tu .

Syntéza a na logu GRF peptidu Sekv. í D 41, ktorý má vzorec:

19-Ty r-Tli r-Ty r-ΐ ii r - Ty r - T li r-A s p - A i a - i i e - P h e - T h r- A s 11 - S e r-Ty r Arg-Lys-Va 1 - L e u - Λ i ,1 - (í I n - i, e u - S e r-A i a - A r g- L y s -Leu- l.e u - G 1 n - A.s pI 1 e - L e u - A s n - A r g - Ml 2 (a k o i. r i 1 i u ó r a c e I á t. ) s a postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v PCT patentovej prihláške PCT/IJ 890/02923 , zahrnutej do popisu t. ý int: o odkazom. Výsledky analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty sú v zátvorkách: Asp 4,06 (4), Thr 3,66 (4), Ser 1,85 (2)', Clu 2,05 (2), Ala 2,93 (3), Val 1,09 (1), íle 1,91 (2), l.eu 5,15 (5), Tyr 3,91 (4), The 0,95 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,04 (3).

Príklad 24

Príprava Tyr ²-A J a ¹ - {( Leu ^{2 7} ) bGRF (1 -29 ) Nli2 } tri ŕ 1uóra c e tá tu.

Syntéza analógu GRF peptidu Sekv.ID 42, ktorý má vzorec:

Tyr-A 1 a-Tyr-A1 a-As p-A1 a -11 e-Phe-Thr-A sn-S er-Tyr-Arg-Lys-Va1Leu-G 1 y-G 1 n-Leu-Se r- A j a - Arg - Ly s-Leu -l.eu-G 1 n- A s p- I 1 e - L e u - A s n Arg-NIÍ2 (ako tr i í 1uóra c e tá tu) sa riadi postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške

PCT/1JS90/02923, zahrnutej do popisu týmto analýzy aminokyselín, teoretické hodnoty 4,01 (4), Thr 0,97 (1), Ser 1,88 (2), Glu (1), Ala 3,88 (4), Val 0,97 (1), Íle 1,86 odkazom. Výsledky v zátvorkách: Asp

2,00 (2), Gly 1,02 ( 2 ) , be u 5,03 (5 ) ,

Tyr 3,03 (3), Phe 0,96 (1), Lys 2,08 (2), Arg 3,03 (3).

Príklad 25

Príprava Ty r ⁴ - A 1 a ³ - Ty r ² - A1 a ¹ - { (l.eu ^{2 7} ) bGRF ( 1 - 29 ) Nli 2 } trifluóracetátu.

syntéza a n a 1 ó g u GRF p e p t i d u S e k v 11) 43, k t o r ý m á vzorec:

13-Tyr-A 1 a-Tyr-Λ 1 a-Tyr-A 1 a-As p-A1 a-11 e-Phe-Thr-Asn-S e r-TyrArg-Ly s-Va 1 - Leu-G 1 y-G 1 n-l.eu-Se r-A la- Arg - by s - L.eu - L e u-G 1 n- A s p11e-Leu-Asn-Arg-NH2 (ako tr i f 1 u ó ra c e tát) sa riadi postupne podľa postupu A, ktorý je popísaný v publikovanej PCT patentovej prihláške PCT/US90/02923, zahrnutej do popisu týmto

odkazom. Výsledky analýzy	aminokv	s e 1 í n	, t c	: 0 ľ e t i c	ké hodno t	y s ú
v zátvorkách: Asp 3,97 (4)	, Thr	0,90	(D i	. S e 1 ’	1,74 (2 ) ,	G .1 u
1,98 (2), Gly 1,04 ( 1) , A i	a 4 , 8 5	( 5) ,	V a i	0,9 1	( 1 ) ,	I 1 e	1,77
( 2 ) , 1, u u 5 , i 3 ( 5 ) , T y r 4 , 1	6 ( 6 ) ,	ľne 0	, 9 9	(. 1 j ,	by s	2.0 7	(2) ,

Arg 3,05 (3).

Tabuľka j

Oe'innost in vitro a s t a b i i i i a v plazme in viiro vyhrntýcli GRF a n a 1 ó g o v

Peptidový reťazec	SekvID NO	U č i. n n o s ť A	Plazmový * * ti/2(min)
(Leu27)bGRF(1-29)NH2	5	1.00	2A . 0(1 )
Ile2-Pro’-(Leu27 )bGRF( 1 - 2 9 ) N íl 2	10	0.04 5	43.2(1)
Tyr2-A 1 a J-(Leu 2 7)bGRF(1-29)NH2	2 5	0.13	38.5(1)
Tyr4 -A 1 a 3-Tyr2 -
A 1 a]-(Leu 27)bGRF(L-29)NH2 ***	19 }	0.052	297.1(2)

Poznámky:

* peptidy sa testovali v kultúre buniek prednej hovädzej hypofýzy, ako popisujú Friedman a iní: ľnt.J.Peptide and Proteín Res. 37, 14-20 (1991).

** peptidy sa inkubovali v 30 mikromóloch hovädzej plazmy in vitro pri 37 °C, ako popisujú Kubiak a iní: Drug.Met.Disp. 17, 393-397 (1989). Tu uvedené hodnoty sa vzťahujú na polčas (Leu ²⁷)bGRF(1-29)NH2 (Sekv. II) 5) inkubovanom priamo v plazme alebo na (Leu ²⁷)bGRF(1-29)NH z (Sekv. ID 5) generovanom z rozšírených peptidov Sekv. II) 18, 2 5 alebo 19. Uskutočnili sa dva pokusy s dvoma rôznymi vzorkami plazmy. Číslo pokusu je uvedené v zátvorke.

*** peptid Sekv. ID 19 sa skúšal proti ( Leu ^{2 7} ) bGRF( 1 -29 ) NH'2 rôznych vzoriek hovädzej plazmy.

(Sekv. ID Polčas Sekv

5) s použitím II) 5 v tejto plazme bol 5D, 2 minút.

.1

Tabuľka 2

Odozva s é r o v ého GH na

IV rôznych dávok (Leu²⁷)bGRF(l-29)NH2 (Sekv. ID 5) a e ²-Pro ¹ - { (I.eu ^{2 7} ) bGRF (1-29 ) NH 2 (Sekv ID 18) u Ho 1 s t e i n s kých kastrátov kŕmených otrubami*

Liečenie	Dávka nmo 1 / kg	P ο č e t cl	V ý š k a p í k u ng/kg	1 n t. e r v a 1	Plocha ***
			Aa	B a	Aa	Ba	Aa	Ba
Roztok**	C)	0b	32.4 b	3 2.4 b	8 9 b	89b	4.3 >’	4 . 3 b
SekvID18	0.02	8 /1 0 c·	7 .1. . 2b · c	7 6.9 b · «	23«	18«	4 . 6 b - «	5.0 b - c
SekvID 5	0.20	9 /1 0 r-	119.8«	130.9«	23«	14«	6.8d	7.0d
SekvID18	0.20	10/10c	10 1.4 c . d	101.4«	26«	26«	6.3 « - d	6.3 « · d
SekvID18	20.0	10/10«	1 3 7.8 d	138.8«	2 3 «	23«	10.1«	10 . le
SEM		0.04	9.1	9.4	8	8	0.3	0.3
phodnota		0.0001	0.007	0.007	0.04	0.0 3	0.00 01	0.0001

Poznámky:

Zvieratám sa peptidy vpi choval i intravenózne v uvedených dávkach dve hodiny pred kŕmením postupom popísaným v Moseley a iní: J.Endocr. 17, 253-259 (1988).

Analýza A zahŕňa všetkých kastrátov a analýza B len kastrátov odpovedajúcich na injekciu GRF a kontrolné kastráty.

a Zvieratá s odozvou * * fyziologický roztok soli * * * oblasť 0-8 hodín (jednotky) b, c, d,e hodnoty s rôznymi indexami v stĺpci sú významne rozdielne (P menšie ako 0,05).

Tabuľka 3
Odozva s é r o v éh o	G H	na IV injekcie	r ô z n y c h	d á v o k
(Leu27)bGRF(l-29)NH2		(Sekv. 10	5)	a
T y r 4 - A 1 a 3 -1 1 e 2 ~ P r o 1 -	{(Le	u27 )-l)GKF( 1 -29)NH2)	(Sekv. II)	19) u
Ho 1 steinských kastrá	to v	kŕmený c b otrú ba m i *

Liečení e	Dávka nmo 1 /kg	P o č e t a	-7Výška piku ng/m 1	Interval	Plocha ***
A	D	A	B	A	B
Roztok**	0	0b	30.91’	30.9b	A5b	A 5 b	3.9b	3.9b
SekvID 5	0.02	9/12°·d	91 . 9C	101.3'-	Ai b	20c	A . 7 b · c	A . 7 b ’ c
SekvlD19	0.02	10 /12 c · d	80.5C	92 . Ac	30b	22c	A . 8 c	A . A b · c
SekvID 5	0.20	ll/12d	7 9.3 c	79.1b - c	21b	10c	5 . A c	5.3C
SekvID19	0.20	7/12c	9 7 . A c	J. 2 0.1 c	63b	8C	5 . Ac	5 . A c . <1
SekvIDl 8	20.0	9/12c · d	7 A . 5 c	70.8b-c	2Ab	18 c	6.9d	6.8d
SEM		0.1	15.9	17.3	1 A	0 . A	0.3	0 . A
phodno ta		0.0001	0.06	0.06	0.28	0.11	0.0000	0.007
EMS		0.1117	30 A 2	362 3	2260	7 63	2 2 81	2A83

Poznámky:

Zvierat á m s a p e p t i d y vpi c h o v a 1 i i n t r a v e n ó z n c: v u v e d e n ý c h dávkach dve hodiny pred kŕmením postupom popísaným v Mosele.v a iní: J.Endocr. 17, 253-259 (1900).

Analýza A zahŕňa všetkých kastrátov a analýza B len kastrátov odpovedajúcich na injekciu GRF a kontrolné kastráty.

a Zvi e r a tá s odozvou ** fyziologický roztok soli *** oblasť 0—0 hodín (jednotky) b,c,d,e hodnoty s rôznymi, indexami. v stĺpci sú významne rozdielne (P menšie ako 0,05).

Zoznam reťazcov informácie o reťazci Sek v. II) č. J

C i i a r a k f e r i s i. i k a r e ť a z c a :

) A)	D 1 ž k a	: 3 3
B)	T y i):	či m i n o k y s e i in
D)	To po )	ú g i a : i i n e čí r

xi) Popis reťazca : Sekv. ID e. 1

5 10

Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-The-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu 15 2 0 2 5

A1 a-G 1n-Leu-Ser-A1 a-Arg-Lys- Leu-Le u-G J n-As p-11e-Leu-Ser-Arg 30

Gln-Gln-Gly-Glu

Informácie o reťazci Sekv. I ľ) č. 2 Charakteristika reťazca: i ) A) DÍžka: 90

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna xi) Popis reťazca : Sekv. ID č. 2 1 5 10

Tyr-I1e-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu 15 20 25

Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-l.eu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg 30 35 90

G1 n-G1n-G1y-G1 u-Arg-A s n-G1n-G1u-G1n-G1 y-A1 a

Informácie o reťazci Sekv. Charakteristika reťazca: i) A) Dí žka:29

B) Typ: aminokyselina

D) Topo1ógia:1 ineárna i x) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový

B) Poloha: Xaa29 xi) Popis reťazca : Sekv. II) č

5

Tvr-A 1a-Asp-A1 a -1 i e-Phe-Thr-Asn 1 5 21)

A 1 a - 0 1 n - Le: u-S e: r-A 1 a - A r g -- L y s - I. e u

Informácie o reťazci Sekv. Cha ra kle r i s t i k a re ťa z c a :

zvyšok ninidovaný na C konci

S e r -Ty r - A r g - Ly s - V a I - I. c u 2 5

Le: u-G i n - A s i» - I 1 e - L t: u - A s n -Xa a

II) č . a

i) A) I)ížka: '29

D) TyP^: aminokyselina

D) T o p o 1 ó g i a : lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa29 xi) Pop i s r e ťa z c a : Sek v . I L) č . 6

5 1D ϋ ’ Tyr-11 e-Asp-A1 a-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu

20 25 * A 1 a-G 1 n - Leu-S e r-A 1 a - Arg-Lys-l.eu- Leu-G 1 n-Asp- I 1 e-Le u- Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č.5

Charakteristika reťazca: i) A) D í ž k a:2 9

B) Typ: aminokyselina D) Topo1ógia:1 ineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa29 xi) Popis reťazca : Sekv. ID č. 5

10 * Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu

20 25

Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-l.eu-I.eu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Xaa

I n f o r m á c i e o r e ť a z c i S e k v . ID č . 6

C h a r a k t e r :i. s tiká r e: ť a z c a : i ) A) D í žka : 6

B) Typ: aminokyselina D) Topológia: lineárna xi) Popis reťazca : Sekv. 1D č . 6

5

Ty r-A 1 a -G 1 y-Pr o - I 1 e-P ro

Informácie o reťazci Sekv. II) č.7 Charakteristika r e ť a z c a : i) A) Dížka: 8

B) Typ: aminokyselina

D) Topo 1 óg ia : 1 i ne á rna xi) Popis reťazca : Sekv. 11) č. 7

5

Ly s - P r o - Ty r - A 1 a - G 1 y - P r o -11 e - P r o

Informácie o reťazci Sekv. ID č. 8 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 6

B) Typ: am inokys e 1 ina

D) Topológia: lineárna, xi) Popis reťazca : Sekv. II) č. 8

5

Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala

Informácie o reťazci Sekv. ID č.9 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 0

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia:1ineárna xi) Popis reťazca : Sekv. ID ó. 9

5

Ly s-Pro-Ty r-A 1 a-G 1 y-Pro-'i’yr-A 1 a

I n ť o r m á c i e o r e ť. a z c i S <' k v . ID č . 1D Charakteristika reťazca:

i)	A)	Dĺžka: 10
	B)	Typ: am i	no k y.s e 1 i na
	D)	T o p o 1 ó g i. a	: i i n e á r 11 a
xi)	P opi s retaz. c	a : S (í k. v . ] D č	. 1 0

5 10

Phe- A 1 a - Ly s - Pr o-Tyr-A 1 a - G i y - i’ro-Tyr-Λ i a

Informácie o reťazci Sek v. II) č. 11 Charakteristika reťazca: i) A) Dĺžka: 12

B) Typ: aminokyselina

D) T o p o 1 ó g i a : 1 i n e á r n a x i ) Popis r e ť. a z c a : S e k v . I D č . 11

10

Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala

Informácie o reťazci Sekv. ID č.12 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 14

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna x i) Popis reťazca : Sekv. 11) č . 12

5 10

Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-ľro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala

Informácie o reťazci Sekv. Charakteristika reťazca:

i)	A)	Dĺžka:16
	B)	T y i): a m i n o	k y s e 1 i n a
	D)	T o p o 1 ó g i a :	1 ineárna
xi )	Popis r e ť a z c. e»	: Sekv. I D č	. 13

5 10

A r g - P r o - V a 1 - P r o - G 1 y - P r o - P h e - Λ 1 a - L y s - P r o - Ty r - A1 a - G 1 y - P r o 15

Tyr-A 1 a

Informácie o reťazci Sekv. ID č. 14 Charakteristika reťazca:

i) A) Dĺžka: 29

D) Typ: aminokyselina D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci D) Poloha: Xaa29 x i ) Popis r e ť a z t: či : S e: k v . 11) č . 14

5 10

Tyr-Thr-As p-A1 a -11e-Ph e-Thr-A sn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu 15 20 25

A1a-G1n-Leu-S e r-A1 a-Arg-Lys-Leu-Leu-G1n-Asp-11 e-Leu-As n-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č.15 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 11

D) Typ: aminokyselina

D) Topo 1 ógiči : 1 i rieárnu x i ) Popis reťazca : S e k v . ID č . 1.5

5 10

Met-Pro-A 1 a - H i s-Pro~H i s - Pr o-ILi s - Pro-Hi s-A 1 a

Informácie o reťazci Sekv. II) č.16 Charakteristika reťazca: i ) A) DÍžka: 11

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna xi) Popis r e ťa z c či : Sekv. II) č. i 6

]. 5 10

M e i - A 1 a - P r o - H i s - Λ 1 a - H i .s - A 1 a -11 i s - A i a - íl i s - A 1 a

Informácie o reťazci. Sekv. 11) č. 17 Charak't. e r i s t i k a r e ťa z c a : i ) A ) D í ž k fi : 11

B) Tv p: a m i no k y s e i i na

	D) Topo1ógia:1ineárna
xi )	Popis reťazca : Sekv. ID č. 17
1	•ô . 10
Met-	- G 1 y - P r o - II i s - P r o - H i s - P r o - H i s - P r o - H i s - A 1 a Informácie o reťazci Sekv. 11) č. 10

/

Charakteristika reťazca:

i)	A) Dĺžka: 31
ii	B) Typ: aminokyselina D) T o p o I ň g i a: lineárna
ix)	Črty: A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C kone B ) Poloha: X a a 3.1
xi)	Popis reťazca : Sekv. II) č . 10
1	5 10
ΙΙθ-	-Pro-Tyr-A1a-Asp-A 1 a -11 e -Phe-Thr-Λ s n-S e r-Tyr-Arg-Lys -
Ι 5	20 2 5
Val-	- Leu-G 1 y-G1n-Leu-S c r-A 1 a -A rg-Lys-Le u-Le u-G1 n-A s p-11 e-Le u
' 30
Asn-	-Xaa Informácie o reťazci S t: k v . 11) č . 1 9

Charakteristika reťazca

i)	A) Dĺžka: 33 B) Typ: a m i n o k y s e 1 i na
ix)	D) Topológia:1ineárna Črty: A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci
xi )	B ) P o 1 o h a ; X a a 3 3 P o j) i s reťazca : Sekv. II) č. 19
1	5 10
Ty r-	-A la - Ty r - A 1 a - Ty r - A 1 a - A s p-A i a - I 1 e -- ľ h e - Thr - A s n - S e r-S e r-
1 5	2 0 2 5
Arg-	-l.ys-Vii 1 - i,e u - A 1 a - G J n ·· i. e u - S e r - A i a - A r g - L y s - l,e u -- L e u-G 1 u - A s p

1le-Leu-Ser-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. II) č . 20 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 39

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa39 xi) Popis reťazca : Sekv. II) č. 20

10

Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Glv-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala15 20 25

Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-'ľyr-Arg-Lys-Vai-L eu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala 30 35

Arg-Lys-Leu-Leu-G1n-Asp-I1e-Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci. Sekv. III č. 21 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 45

B) Typ: aminokyselina

D ) T o p o 1 ó g i a : 1 i n e á r n a i x) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa45 xi) Popis reťazca : Sekv. ID č.21

5 10

A r g - P r^- o - V a 1 - P r o - G 1 y - P r o - P h e - .A 1 a -1, y s - P r o - ľ y r - A 1 a - G 1 y - P r o 15 20 25

Ty r - A1 a - T y r - A L a - A s p - A 1 a - í i e - P h t? - T h r' - A s n - S e r - T y r - A r g - L y s - V a I

35 40

Leu-G 1 y-G 1 n - Leu - S e r-A i a - A r g - f y s - Leu - Le u - G 1 n-As p - I 1 e - I.e u4 5

Informácie o reťazci Sekv. II) č.'22 C h a r a k t e r isti k a r e ť a z c a : i) A) Dĺžka: 10

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna x i ) Popis r e ť či z c a : Sekv. I D č . 22 /

5 í 0

Phe-A 1 a-Lys -Pro-Ty r-A 1 a-G 1 y-Pro-Tyr-A 1 a

Informácie υ reťazci Sekv. U) č . 23 Charakteristika reťazca: i) A) I) í ž k a : 16

B) Typ: a m i n o k y s e 1 i. n a

D) Topo1ógia:1ineárna xi) Popis reťazca : Sekv. ID č. 23

5 10

Arg-Pro-Va 1-Pro-G 1 y-Pro-Phe-A 1 a-Lys-Pr o-Tyr-A 1 a-G 1y-Pro15

Tyr-A la

Informácie o reťazci Sekv. ID č . 29 C h a r a k ť e r j. s ť i k a r e ťa z e a : i) A) Dĺžka: 27

D) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna i x) Črty:

A) Má zo v/kľúč : Argi riy 1 ovv zvyšok amidovaný na C konci

II) Po J oh a : X a a 2 7 xi) Popis reťaz c íi : Sekv. ID č, 29

5 1 0

As p-A 1 a - I 1 e - Phe -Th r-A s n-Se r-Ty r-A rg- 1.-y s -Val- Leu-G 1 v-G i n15 '2 0 2 5

Le u - S e í' - Λ i a - A r g - i. y s - L e u - L e u - G 1 n - A s ρ- I I e -1, e u - A s n - X a a

Informácie o reťazci Sekv. II.) č.25 Charakteristika reťazca: i) A) Dĺžka:31

D) Typ: a m i n o k y s e 1 i n a

D) Topo 1ógia:1ineárna i x) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa3l xi) Popis reťazca : Sekv. II) č. 25

5 K)

Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Il e -Plie-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg - Ly s 15 20 25

Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle30

Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č.26 Charakteristika reťazca : i) A) Dĺžka: 33

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

D) Poloha: X a a 3 3 xi) Popis reťazci» : Sekv. II.) č. 26

I 5 10

G 1 y - P r o -1 1 e - - P r o - T y r - A 1 a - A s p - A 1 a - 1 1 e - P h e - T h r - A s n - S e r - T y r 15 20 25

Arg-i,y s - Va 1 - I, e u-G 1 y - G 1 n - Le u - S e r - A 1 a - A r g -1, y s - L e u -1, e u -G 1 n - A.s p 30

II e-Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. II) č.27 Charakteristika reťazca: i ) A ) D i ž k a : 3 5

B ) T y p : a m i n o k y s e i i n a

D ) T o p o 1 ó g i a : 1 i n e í\ r n a ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa 35 x i ) Popis r e t a z c a : Sekv. II) č . 27 /

5 10

Ty r - A 1 a - G1 y - P r o - I 1 e - P r c> - T y r - A 1 a - A s p - A 1 a - I 1 e - P h e - T h r - A s n 15 20 25

Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Len-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu30 35

Leu-G 1 n-A s p-I 1 e-Leu-A.s n-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č.28 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 37

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa37 xi) Popis reťazca : Sekv. II) č. 28

5 10

Lys-Pro--Tyr-Ala-Gly-Pro-Iie-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phc15 20 25

Thr-Asn-Se r-Ty r-Arg-I.y s - Va 1 - Leu-G 1 y-G 1 n-Leu-Se r-A 1 a - Arg - Ly s 30 3 5

Leu-Leu-G1n-As p- I 1 e-Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č.29 C h a r a k t e r t s t i k a r e. ť a z c: a :

i) A) DÍžka: 3 3

B) Tvp: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný ria C konci B ) Poloha: X a a 3 3 x i ) Popis reťazca : Sekv. II) č . 29

5 10

Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr15 · 20 25

Arg-Lys-Va1-Leu-G1y-G1n-Leu-S e r-A 1 a-Arg-Lys-Leu-Leu-G i n30

A s p -11 e - L e u - A s n - X a a

Informácie o reťazci Sekv. ID č.30 C h a r a k t e r i s t i k a reťazca: i) A) DÍžka: 35

B) Typ: aminokyselina

D) T o p o 1 ó g i a : 1 i n e á r n či ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na t konci

B ) Poloha: Xa a 35 xi) Popis reťazca : Sekv. II) č. 30

5 10

Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn15 20 25

Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-G1y-G1 n-Leu-S e r-A1 a-Arg-Lys-Leu30

Leu-G1 n-Asp-I1e-Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č. 31 Ch a r a k t e r i s tiká r e ť a z c a:

i) A) DÍžka: 37

B) Typ: aminokyselina

D) Topo légia: lineárna i x) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B ) P o 1 o h a : xi) Popis reťazca

Sekv. II) e . 3.1

- 54 10

Ly s - Pro-Tyr-A 1. a - G 1 y-Pr υ-Tyr-A 1 n - Tv r-Λ 1 a - A s p-A 1 a - 11 e-Phe15 20 25

Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg~Lvs-Va1-Leu-G J y .-G 1 n-Leu -Ser- A 1 a-Arg30 35

Lys-Leu-Leu-G 1. n-Asp-I 1 e-Leu-Asn-Xaa /

Informácie o reťazci Sekv. ID č.32 Charakteristika reťazca: i) A) Dĺžka: 39

B) Typ: aminokyselina

D) T o p o 1 ó g i a : 1 i. n e á r n a ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa39 xi) Popis reťazca : Sekv. II) č.32

I 5 10

Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala15 20 2 5

II e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-I,ys- Va 1 -I.eu-G 1 y-G 1 n-Leu-Ser30 35

A1 a-Arg-Lys-Leu-Leu-G1n-Asp-11e-Leu-Asn-Xaa

I n f o r m á c i e o reťazci. Sekv. ID č . 3 3 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 41

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaaúl xi) Popis reťazca : Sekv. 11) č. 33

5 10

G 1 y - Pro-Phe-A 1 a - Lys-Pro-Tyr-A 1 a - G i y-Pro-Tvr-A i a - Ty r-A 1 a 15 2 0 2 5

A s p-A 1 a - I 11: - Pli e - Tli r - A s n - S e r - Ty r - Arg - l.y s - Va I - l.e u - G i y-G .1 n -30 35 40

Le u-Ser-A1 a-Arg-Lys-Leu-Le u~G1 η-A sp-11e-Leu-Asn-Xa a

Informácie o reťazci Sekv. ID č.34 Charakteristika reťazca : i) A) DÍžka: 43

B) Typ: aminokyselina

D ) T o p o 1 ó g i a : 1 i n e á r n a ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) l’oloha: Xaa 4 3 x i) Popis reťazca : Sekv. II) č . 3 4

10

Val-Pro-Gly-ľro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala15 20 25

Tyr-Al a-Asp-A1 a-11 e-Phe-Thr-A s n-Ser-Tyr-Arg-I,ys-Va 1 - Leu30 3 5 4 0

G 1 y-G 1n-Leu-Ser-A1 a-Arg-Lys-Leu-Leu-GI n-A sp-11 e-Leu-As n-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. II) č.35 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 45

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: 1 i n e á r n o ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xa a 4 5 x i ) Popis r e ť a z c a : Sekv. 11) č . 35

5 10

Arg-Pro-Va i - ľro-G 1y-Pro-Phe-A 1 a -Lys -Pro-Tyr-A 1a-G1 y-Pro15 20 25

Ty r-A 1 a - Ty r-A 1 a - A s ρ-A 1 a - I I e - P h e - Thr- A s n-S c r-'ľv r-Arg - l.y s 3 0 35 4 0

V a 1 - Leu-G i y-G 1 n-Leu-Sc r~A 1 a - Arg-l.y s - l,eu~ Leu-G 1 n-Asp- I i e4 5

Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. II) č . 36 Charakteristika r' e ť a z c a : i) A) DÍžka: 31

B) Typ: aminokyselina

D) Topo1ógia:1ineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok’ amidovaný na C konci

B) Poloha: X a a 31 x i ) Popis reťazca : Sekv. II) č . 36

5 10

Val-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys15 20 25

Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile30

Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. II) č.37 Charakteristika reťazca: i) A) DÍžka: 31

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa 31 xi) Popis reťazca : Sekv. II) č. 37

5 10

Tyr-Thr-Tyr-A1 a-As p-A1 a-í 1 e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys 15 20 30

Va 1 - Leu-A 1 a-G 1 n-Leu-Ser-A1 a -Arg-Lys-Leu-Leu-G 1n-Asp-11 e31.

L e u - A s n - X a a

Inf ormácie o reťazci Sekv. 11) č . 3íl C ha r a k t e r 1 s V. i k a r e ť a z c a : i ) A ) D í 7. k a : 3 I

B) Typ: aminokyselina

D) Τορυ1ógia:1ineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok arnidovaný na C kone;

B) Poloha: Xaa 31 xi) Popis reťazca : Sekv. 11) č. 30

5 10

Ty r-Thr-Tyr -11 e-A sp-A 1 a -1 I e - Phe - Thr-A sn-Ser-Ty r-Arg-l.y s 15 20 25

V a 1 - Leu-A1 a-G 1 n-l.evi-S e r-A 1 a-Arg-l.y s -Leu-Leu-G 1 n- A s p-11 e30

Leu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č . 39 Charakteristika reťazca : i) A) Dĺžka: 31

B) Typ: aminokyselina

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok arnidovaný na C kone

B) Po 1oha: Xaa 31 xi) Popis reťazca : Sekv. ID č. 39

5 10

Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-A 1 a-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys15 20 25

Va1-Leu-A1a-G1n-Leu-S e r-A 1 a-Arg-Lys -Leu-Leu-G1n-As p-1 1 e30

1. e u - A s n - X a a

Informácie o re ťa z c i Sekv. ID č.AO C h a r a k t e r i. s f i k a r e ť a z c a :

i )	A)	D 1 ž ka	: 3 i
	B)	Typ:	am i no k ys e i i na
	D)	T o p o 1	ó g i a :	i i n e á r n a

i. x ) C r t y :

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa31 xi) Popis reťazca : Sekv. ID č. 60

5 1.0

Tyr-Ser-Tyr-Thr-As p-A 1 a-11 e -Phe-Thr-As n-Ser-Tyr-Arg-Lys 15 ' 2(1 '25

V a 1 - L e u - A1 a - G 1 n - L e u - S e r - A 1 n - A r g -1, y s -1, e u - L e u - G 1 n - A s p -11 e 30

l.eu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv. ID č.61 Charakťeristikareťazca: i) A) Dĺžka: 33

B) Typ:aminokys e 1 i na

D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa33 xi) Popis reťazca : S e k v. II) č. 61

10

Tyr-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-A1 a-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr15 20 25

Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-l.eu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln30

Asp-11 f:-l.eu-Asn-Xaa

Informácie o reťazci Sekv, II) č. 6 2 C h a r a k ť e: r i s t. i k a r e ť a z c a : i) A) Dĺžka:31

B) Typ: aminokyselina

1.)) To p o 1 ó g i a : 1 .i n o á r n a i x ) Č r t y :

A) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok amidovaný na C konci

B) Poloha: Xaa3i xi) Popis reťazca : Sekv. ID č. 62

Iní ormá c i e Charakteristika * i 1 A ) D í ž k a :

5 10

Ty r-A 1 a - T y r-A 1 a -A sp- A 1 <i - I 1 e - P h e -Thr-Ser-S er-Tyr-Arg-Ly s 15 20 25

V a 1 - Leu - G ly-G 1 n-Leu-S e r-A 1 a - Arg - L y s-Leu-), e u-G 1. n- A sp -11 e 30

Leu-Asn-Xaa o reťazci Sekv. ID č.4 3 r e ť a z c a :

3

B) Typ: aminokyselina D) Topológia: lineárna ix) Črty:

A ) Názov/kľúč: Arginylový zvyšok a m i tl o v a n ý na C k o n c i B) Poloha: Xa a 3 3 x i ) Popis reťazca : S e k v . I D č . 4 3

5 1.0

Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr15 20 25

Arg-Lys-Va 1 - Leu-A 1 a-G 1 n-Le u-Ser-A1 a-Arg-Lys-Leu-Leu-G 1n30

Asp-Ile-Leu-Ser-Xaa

P Λ 'ľ . Ľ N. ’ľ 0 V Ľ

Claims (1)

1. NÁROKY

   1. Umelý spojený proteín obsahujúc i predĺženú peptidovú časť kovalentne viazanú od jeho C-konca ku N-koricu jadrovej proteínovej časti, vyznačený tým, že jeho predĺžená proteínová časť má vzorec:

   A-X-Y(X'-Y)n kde A buď nie je, alebo znamená metionín, n je 0 až 20,

   X je vybrané zo skupiny tvorenej všetkými v vyskytujúcimi zvyškami aminokyselín

   X’ je vybrané zo skupiny tvorenej vyskytujúcimi zvyškami aminokyselín s hydroxypro1inu,

   Y je vybrané zo skupiny serinom a prírode sa všetkými v prírode sa v ý u i m k o u p r o 1 í. n u a hydroxypro1 inom, alanínom, prípadov, keď N - 0, potom alanínom, s e r í n o in a t r e o n í n o m t v o r e n e j t r e o n í n o in pro1 inom, s v ý n j. m k o u je Y vyhrané zo skupiny tvorenej

   2. Umelý spojený proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že A je prítomné a X je vybrané zo skupiny tvorenej Pro, Gly, Ala alebo Ser.

   3. Umelý spojený proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že n je U až 10.

   4.Umeľ ý spojený proteín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený biologický aktívny polvpeptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej analógy bGRI·', EOF, IGF-2, glukagón, faktor· kor tiko tropín dyno r í; in , endotelín, rastový t.ra ns f o rmu j úc i fakt.or a i la, vazoaktívny črevný peptid, ľudský B-ka zomorl. in , žalúdočný inhih j.čuý peptid, žalúdočný uvoľňovací peptid, ľudský peptid Hl, ľudský peptid YY, fragment 7-37 glukagónu podobného pepti.du-1, g 1 u k a g ó n u pod n hu ý p e p t 1 d - 2 , i á I k o P , n e u r o p e p t i d Y , l u d s k y pankreatický polypept.id, inzulínu podobný rasiľový laktor-l, ľudský rastový hormón, faktor rastový hormón, hovädzí rastový hormón, bravčový hormón, prolaktín, ľudský faktor uvoľňujúci rastový hovädzí faktor uvoľňujúci rastový hormón, bravčový uvoľňujúci rastový hormón, ovčí faktor uvoľňujúci rastový hormón, i nter1eukí n-1β, inter 1eukín-2.

   5 . Umelý spojený proteín pod ľa n á r o k u 1 , vyznačujúci sa tým, že uvedená predĺžená peptidická časť je vybratá z 0 skupiny obsahujúcej 01 y-P r o-11 e - P r o , , Sekv. ID 6, Sekv. ID 7, Tyr-A 1 a , G 1 y - Pro-Tyr-Ala, Sekv . ID 8 , Sekv. ID 9, Sekv. ID 10, Sekv . ID 11, Sekv. 1D 12, Sekv , ID 13 t T y r - Λ 1 a - T y r - A 1. a , Va1-A 1 a , Sekv. ID 15, Sekv. ID ' 16, í I e k v . I D 17, Sekv. ID 22, Sekv. ID i 23. 6 . U m e 1 ý spojený p r o t e í n podľa nároku 2 , vyznačujúci sa tým, že n j e 3 až 5 . 7 . Umelý spojený protein pod ľa n á roku 6 , v y z n a č u j vi c i s a tým, že všetky X’zvyšky sú histidíny. 8 . Ume J ý s po j e n ý protein pod ľa ná roku 7 , v y z n a č vi j ú c i s a tým, ž e X je h i s t i d í n. 9 . Umelý spojený protein p o d ľ a ná roku 7 , v y z n a č vi j ú c i s a tým, ž e tri Y zvyšky sú prolín.

   10. Použitie umelého spojeného prípravu liečiva.

   P r o 11: í n u p o d ľ a n á r- o k u 1 n a

   11. Použitie umelého spojeného proteínu podľa nároku 10, vyznačujúce sa tým, že uvedené liečivo obsahuje ďalšie spojené proteíny majúce identické biologicky aktívne časti a rôzne r o z .š i r u j ú c e č a s t i .

   12. Použitie umelého spojeného proteínu podľa nároku 10, vyznačujúce sa t ým , že uvedená bioingicky aktívna časť uvedeného spojeného proieimi je analog bOKl.

   3 . S p ô s o b č iste n i a ž i a d a n ý e b p r o t. e í n o v z o z m e s í , obsahu jú c i c li umelý spojený proteín podľa nároku 1 a nečistoty, vyznačujúci sa tým, ž e uvedený spojený proteín sa selektívne kontaktuje s materiálom, ktorý imobi 1 i z.uj e uvedený spojený proteín, u v e d t; n é n t: čistoty s a o d s t r á n i a ,

   uvedený spojený' p r o t e í. n s a o d d e 1 í. o d / kombinuj e u vede n ý spojený p r o t e í n s a u v e d e n ý žiadaný p r o t e í n sa izoluje.

   uvedeného materiálu, s DPP IV a

   16. Sp ô s o b čistení a po d ľ a nároku 13, že uvedený materiál je fixovaný v kolóne.

   15. Spôsob čistenia podľa nároku 13, že uvedený materiál sú protilátky, ktoré predĺženej časti.

   vyznačujúci sa tým, vyznačujúci sa tým, sa viažu k uvedenej

   16. Spôsob čistenia že uvedený materiál sú predĺžená časť obsahuje sú histidíny.

   podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, i m o b i 1 i z. o v a n é k o v o v é ióny a uvedená aspoň 3 nasledujúce X’ zvyšky, ktoré