HU211572A9 - Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik - Google Patents
Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik Download PDFInfo
- Publication number
- HU211572A9 HU211572A9 HU9500654P HU9500654P HU211572A9 HU 211572 A9 HU211572 A9 HU 211572A9 HU 9500654 P HU9500654 P HU 9500654P HU 9500654 P HU9500654 P HU 9500654P HU 211572 A9 HU211572 A9 HU 211572A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- pro
- ala
- tyr
- leu
- gly
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 191
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 103
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 83
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 103
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 101
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 87
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 86
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 86
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 83
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 claims description 71
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 claims description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 47
- 101000825768 Bos taurus Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 44
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 40
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 38
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 29
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 29
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 claims description 29
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 25
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 20
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 18
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 17
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 17
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 16
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 15
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 15
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 14
- 102000034288 naturally occurring fusion proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108091006048 naturally occurring fusion proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 11
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 9
- 108010022152 Corticotropin-Releasing Hormone Proteins 0.000 claims description 8
- 102000012289 Corticotropin-Releasing Hormone Human genes 0.000 claims description 8
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 6
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 claims description 5
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 108010065372 Dynorphins Proteins 0.000 claims description 4
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 claims description 4
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 claims description 4
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 4
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024622 Proenkephalin-B Human genes 0.000 claims description 4
- NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N Tyr-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NLKUJNGEGZDXGO-XVKPBYJWSA-N 0.000 claims description 4
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 claims description 4
- 102400000015 Vasoactive intestinal peptide Human genes 0.000 claims description 4
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 claims description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 4
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 4
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 claims description 3
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 claims description 3
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 claims description 2
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 claims description 2
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 2
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000983116 Homo sapiens Pancreatic prohormone Proteins 0.000 claims description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 claims description 2
- 101000825739 Ovis aries Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 claims description 2
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 claims description 2
- HSRXSKHRSXRCFC-WDSKDSINSA-N Val-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSRXSKHRSXRCFC-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 claims description 2
- 102000046327 human PPY Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 2
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 claims 1
- OABLKWMLPUGEQK-JYJNAYRXSA-N Pro-Tyr-Met Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OABLKWMLPUGEQK-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims 1
- 102400000820 Somatostatin-14 Human genes 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 85
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 57
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 57
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 55
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 26
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 26
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 23
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 21
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 21
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 20
- -1 tPA Proteins 0.000 description 19
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- HOBNTSHITVVNBN-ZPFDUUQYSA-N Asp-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N HOBNTSHITVVNBN-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 18
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 17
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- JNGHLWWFPGIJER-STQMWFEESA-N Gly-Pro-Tyr Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JNGHLWWFPGIJER-STQMWFEESA-N 0.000 description 14
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 14
- MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 13
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 12
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 12
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 12
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 9
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 6
- JHSRGEODDALISP-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JHSRGEODDALISP-XVSYOHENSA-N 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 6
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 6
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 6
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- SSFWXSNOKDZNHY-QXEWZRGKSA-N Gly-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN SSFWXSNOKDZNHY-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 5
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N ethyl (2s,5s)-5-methylpyrrolidine-2-carboxylate;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.CCOC(=O)[C@@H]1CC[C@H](C)N1 VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N 0.000 description 5
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N VUGWHBXPMAHEGZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N Tyr-Thr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N Phe-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GNRMAQSIROFNMI-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 3
- OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N Pro-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 108010009291 promelittin Proteins 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003902 Cathepsin C Human genes 0.000 description 2
- 108090000267 Cathepsin C Proteins 0.000 description 2
- 244000097582 Cecropia peltata Species 0.000 description 2
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- IXHQLZIWBCQBLQ-STQMWFEESA-N Gly-Pro-Phe Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IXHQLZIWBCQBLQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N His-Pro-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTWNSIDWAFSEEI-RWMBFGLXSA-N Pro-His-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N3CCC[C@@H]3C(=O)O YTWNSIDWAFSEEI-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- 101000633010 Rattus norvegicus Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 2
- GFZQWWDXJVGEMW-ULQDDVLXSA-N Tyr-Arg-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O GFZQWWDXJVGEMW-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- KIJLSRYAUGGZIN-CFMVVWHZSA-N Tyr-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KIJLSRYAUGGZIN-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 2
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical group OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- SJRUJQFQVLMZFW-WPRPVWTQSA-N Val-Pro-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SJRUJQFQVLMZFW-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-UHFFFAOYSA-N srif Chemical compound N1C(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(C)N)CSSCC(C(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000003287 1H-imidazol-4-ylmethyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[*])=C1[H] 0.000 description 1
- PZEUTLIKVUEDLB-UHFFFAOYSA-N 2-[[[2-[[6-amino-2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[2-[[1-[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]propanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]acetyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoylamino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(carbamoylamino)propanoyl]-(3-amino-3-oxopropyl)carbamoyl]amino]pentanediamide Chemical compound CCC(C)C(NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CNC(N)=O)C(=O)N(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(N)=O PZEUTLIKVUEDLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N BTJVOUQWFXABOI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XBQSLMACWDXWLJ-GHCJXIJMSA-N Asp-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O XBQSLMACWDXWLJ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FRJIAZKQGSCKPQ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XOZOSAUOGRPCES-STECZYCISA-N Ile-Pro-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XOZOSAUOGRPCES-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- MVBZBRKNZVJEKK-DTWKUNHWSA-N Met-Gly-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MVBZBRKNZVJEKK-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N Met-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 244000028344 Primula vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016311 Primula vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N Pro-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102400000821 Somatostatin-28 Human genes 0.000 description 1
- 101800004701 Somatostatin-28 Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N Thr-Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N Tyr-Ala-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N 0.000 description 1
- ADBDQGBDNUTRDB-ULQDDVLXSA-N Tyr-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ADBDQGBDNUTRDB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N Tyr-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000001667 episodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000321 herbal drug Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 229940066369 honey bee venom Drugs 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N piperazine-2,5-dione Chemical compound O=C1CNC(=O)CN1 BXRNXXXXHLBUKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- GGYTXJNZMFRSLX-DFTNLTQTSA-N somatostatin-28 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]1C(N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(O)=O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO GGYTXJNZMFRSLX-DFTNLTQTSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A jelen találmány olyan fúziós polipeptidekre vonatkozik, amelyek a természetben nem fordulnak elő, és az N-terminálison egy olyan részt tartalmaznak, amely dipeptidilpeptidáz IV enzimmel (DPPIV) hasítható.
A találmány háttere
A molekuláris biológia, speciálisan a rekombináns DNS technológia lehetővé teszi a kívánatos biológiai hatású peptidek aránylag nagy mennyiségben való előállítását. Ezenfelül, a polipeptideket kódoló genetikus információk módosíthatók, így a módosított peptidek aránylag nagy mennyiségeinek előállítására nyílik lehetőség. A polipeptideket gyakran azért módosítják, hogy hatásukat javítsák vagy a termelésüket és/vagy előállításukat kedvezőbbé tegyék. Ennek megfelelően igen sok erőfeszítést tettek annak meghatározására, hogy a polipeptidek biológiai hatásának növelése, fokozása vagy más jellegű változtatása érdekében milyen módosítások kívánatosak. Emellett igen sok munkát fordítottak a kívánt polipeptidek módosítására abból a célból, hogy termelésüket és tisztításukat megkönnyítsék.
A természetes polipeptidek a bioszintézis során gyakran nagyobb méretű prekurzorok formájában képződnek, amelyek aztán egy sor proteolitikus hasítás eredményeként alakulnak át a végtermékekké. Ennek megfelelően több olyan proteáz létezik, amely speciális aminosavakat és/vagy aminosav szekvenciát ismer fel és hasít. Ezek a proteázok vesznek részt egy prekurzor fehérjének a végső polipeptid termékké való átalakításában.
Egy ilyen proteáz a dipeptidilpeptidáz IV (DPP IV) (EC 3.4.14.5). A DPP IV-et először Hopsu-havu, V. K. és G. G. Glenner [Histo. Chemie 3: 197-201 (1966) írta le először, és kimutatták, hogy ez az enzim sok emlős szövetében jelen van. A DPP IV jelenleg a kereskedelemben az Enzyme Systems Products (Dublin, California) cégtől beszerezhető. A DPP IV egy speciális aminosav-szekvenciát ismer fel a fehérjék N-terminálisán. Közelebbről, a DPP IV akkor hasít le egy dipeptidet az N-terminálisról, ha az N-terminálistól számított második aminosav prolin (Pro), hidroxi-prolin (Hyp). alanin (Alá), szerin (Ser) vagy treonin (Thr), és bármilyen aminosav lehet az N-terminális helyzetében, feltéve, hogy az N-terminálistól számított harmadik aminosavmaradék nem prolin vagy hidroxi-prolin. A DPP IV aktivitása nagyobb, amikor a prolin vagy alanin az N-terminálistól számított második aminosav, és az enzim általában akkor a leghatékonyabb, ha ezt a helyzetet prolin foglalja el. A DPP IV enzimnek a természetben előforduló peptidek prekurzoraiban levő „PRO rész lépésenkénti hasításában való közreműködéséről széles körben beszámoltak.
A modern technológia lehetővé tette a biológiailag aktív fehérjék magas szintű termelését. Fontos polipeptidek állíthatók elő peptidszintetizátor segítségével vagy gazdasejtekben rekombináns DNS technológia alkalmazásával. A biológiailag hatásos fehérjéket gyakran gyógyszerként adagolják. Számos olyan példa említhető, amikor az aktív fehérjéket kezelésre, megelőzésre vagy tulajdonságok fokozására vagy visszaszorítására használják. Mivel a DPP IV és más proteázok lebontják a fehérjéket, ezek a gyógyszerek hajlamosak a lebomlásra. Úgy, a biológiailag aktív polipeptidek gyógyszerként való alkalmazásával kapcsolatban az a gond, hogy tartós jelenlétük lehetősége csökken, és ezért gyakrabban kell ezeket a polipeptideket adagolni.
A rekombináns DNS módszerekben bekövekezett gyors fejlődés, amely révén lehetővé vált a polipeptidek, fehérjék és analógjaik nagy mennyiségben és nagyon rövid idő alatt történő előállítása, szükségessé tette ezen fehérjék bonyolult, a gazdasejtek által termelt és a táptalajban levő összes fehérjét tartalmazó keverékekből való igen hatékony és előre megjósolható módon történő elkülönítését. A gazdasejtek által termelt heterológ polipeptidek tisztítása nagyon költséges is lehet, és a tisztítás magának a fehérje terméknek a denaturálódását is okozhatja. A fehérje tisztításának módszereiről adnak áttekintést Hopp és munkatársai a 4 782 137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak (1988. november 1.) a technika állását ismertető részében.
A szakterület korlátainak elkerülésére és hogy jobb módszerekhez, jussunk, rekombináns DNS technikával a kívánt polipeptidet a természetben elő nem forduló formában állíthatjuk elő, amely a tisztításnál ligandumként vagy más targetként használható linker-peptidet tartalmaz. Például a 4 782 137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás antigén linker pepiidet tartalmazó, a természetben elő nem forduló peptid szintézisére vonatkozik. A természetben elő nem forduló fehérjét át lehet engedni egy immobilizált antitesteket tartalmazó oszlopon, az antitestek az antigén linkerhez kötődnek. így a nem-természetes fehérje elkülöníthető. A 4 569 794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan, a természetben elő nem forduló fehérjék tisztítási eljárását ismerteti, amelyek az N-terminálison immobilizált fémekkel szemben affinitást mutató csoportot tartalmaznak. A nem-természetes fehérjék egy oszlopban levő immobilizált fémionokhoz kötődnek. Ezekkel a módszerekkel az az egyetlen probléma, hogy a linker peptid gyakran nemkívánatos, és a linkért esetleg nehéz eltávolítani.
A jelen találmány olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjékre vonatkozik, amelyek egy magfehérjerészt és az N-terminálison egy DPP IV enzimmel hasítható hosszabbító részt tartalmaznak. A jelen találmány szerint egy. a természetben elő nem forduló fehérje akkor jön létre, amikor a magfehérjéhez nem olyan N-terminális hosszabbító rész kapcsolódik, amely a természetben előfordul; ezért az ilyen fehérjéket a természetben elő nem forduló fúziós fehérjéknek nevezzük. A jelen találmány olyan előgyógyszerekre vonatkozik, amelyek a természetben elő nem forduló. DPP IV enzimmel hasítható fehérjék, és bennük a magfehérje-rész biológiailag aktív fehérje. A jelen találmány tárgyát olyan, természetben elő nem forduló, DPP IV enzimmel hasítható fehérjék képezik, amelyek tisztítási eljárásokban használhatók, oly módon, hogy
HU 211 572 A9 az N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész olyan sajátságot vagy tulajdonságot kölcsönöz a természetben elő nem forduló fehérjéknek, amely tisztításukat könnyebbé teszi.
A jelen találmány olyan, a természetben elő nem forduló fehérjéket bocsát rendelkezésre, amelyeknek az N-terminálisához DPP IV enzimmel hasítható rész kapcsolódik, és amikor a természetben elő nem forduló fehérje DPP IV hatásának van kitéve, a természetben elő nem forduló fehéije egy kívánt fehérjévé alakul. Amikor a természetben elő nem forduló fehérjét előgyógyszerként használjuk, a természetben elő nem forduló fehérje biológiailag aktív fehérjévé való átalakulása in vivő, a cél fajban található DPP IV hatására megy végbe. Amennyiben tisztítási eljárásban alkalmazzuk, a természetben elő nem forduló fehérjének a speciálisan tervezett N-terminálisát használjuk ligandumként, és aztán DPP IV enzimmel az N-terminálison levő hosszabbító rész lehasításával a kívánt fehérjét felszabadítjuk.
A jelen találmány lehetővé teszi a kívánt fehérjének a természetben elő nem forduló fehérje formájában való előállítását, amely utóbbi aztán DPP IV hatására a kívánt fehérjévé alakítható. Az előgyógyszerek a beteg endogén DPP IV enzimjének hatására az idők során gyógyszerré alakulnak át, így a betegben a hatóanyag hosszabb ideig van jelen, és így csökkenti az adagolás gyakoriságát. A kívánt fehérjéket tiszta állapotban a jelen találmány szerint oly módon különíthetjük el, hogy a természetben elő nem forduló fehérjéket állítunk elő, majd tisztítás után a természetben elő nem forduló fehérjéket in vitro DPP IV enzimmel a kívánt fehérjévé hasítjuk.
A találmány összefoglalása
A jelen találmány tehát olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjékre vonatkozik, amelyekben egy hosszabbító fehérjerész C-terminálisával egy magfehérjerész N-terminálisához kapcsolódik; a fenti hosszabbító fehérjerész az
A-X-Y(X’-Y)n általános képlettel jellemezhető, ebben a képletben
A adott esetben van jelen, és amikor jelen van, jelentése metionin;
n értéke 0-20;
X bármely, a természetben előforduló aminosavmaradék;
X’ bármely, a természetben előforduló aminosavmaradék, a prolin és hidroxi-prolin kivételével;
Y prolin, hidroxi-prolin, alanin, szerin és treonin, kivéve, ha n = 0, ekkor Y alanin, szerin vagy treonin. A jelen találmány tárgyát képezi a természetben elő nem forduló ilyen fehérjék gyógyászati készítményekben való alkalmazása, és a kívánt peptideknek ilyen természetben elő nem forduló fehérjéket és szennyezéseket tartalmazó keverékből tiszta állapotban való előállítási eljárása is. amely abban áll, hogy a fenti, természetben elő nem forduló fehérjéket olyan anyaggal hozzuk érintkezésbe, amely a fenti, természetben elő nem forduló fehérjét immobilizálja a fenti keverékből.
eltávolítjuk a szennyezéseket, elválasztjuk a természetben elő nem forduló fehérjét a fenti anyagtól, a fenti, természetben elő nem forduló fehérjét DPP IV enzimmel reagáltatjuk, és a fenti, kívánt fehéijét elkülönítjük.
A 4 569 794 számú (1986. február 11.) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Smith és munkatársai fehérjék tisztítására alkalmas eljárásokat, és ilyen eljárásokban használható vegyületeket ismertetnek. A találmány egy olyan eljárást is magába foglal, amely a C-terminálison biológiailag aktív polipeptidet és az N terminálison egy hosszabbító, fémionokkal kelátot képező linkért tartalmazó fúziós fehérjék elkülönítésére alkalmas. A fúziós peptid immobilizált fémionokkal szembeni affinitással rendelkezik. A szennyezéseket úgy lehet eltávolítani, hogy a fúziós fehérjét magábafoglaló keveréket immobilizált fémionokat tartalmazó oszlopon engedik át. A fúziós fehérje a fémionokhoz kötődik, és csak a szennyezések eluálódnak. A körülmények megváltoztatásával a fúziós fehéijéket az immobilizált fémionoktól megszabadítják, és így tisztított fúziós fehérjét kapnak.
A 4 782 137 számú (1988. november 1.) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Hopp és munkatársai olyan fúziós peptidek szintézisét ismertetik, amelyek N-terminálisként egy erősen antigénes részt és C-terminálisként egy kívánt polipeptidet tartalmaznak, Hopp és munkatársai szerint a fúziós fehéijét úgy tisztítják, hogy a nyers felülúszót immobilizált antitesteket tartalmazó oszlopon engedik át, amely antitestek felismerik a fúziós fehérje antigénrészét. Az immobilizált antitestek a fehérjét az oszlopban tartják, míg a felülúszó nemkívánatos komponensei eluálódnak. Az oszlop körülményeit aztán úgy változtatják, hogy az antigén-antitest komplexum disszociáljon. Ezt követően a fúziós fehérjét eluálják és összegyűjtik.
A 4 734 399 számú (1988. március 29., Félix és munkatársai) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás növekedési hormont felszabadító faktor analógokra vonatkozik. Néhány olyan analógot írnak le benne, amelyek Tyr-ala és His-Ala terminálisokat tartalmaznak. Azonban ezek a molekulák nem fúziós fehérjék, hanem inkább csak magfehérjék. A Félix és munkatársai szerinti N-terminális dipeptidek részei a bGRF analóg magmolekulának.
Az 1987. május 6-án, 0 220 958 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben N-terminális maradékok szelektív kémiai eltávolítását írják le. A találmány olyan eljárásra és az eljárásban alkalmazható vegyületekre vonatkozik, amelyek N-terminális maradékoknak a kívánt polipeptidről való eltávolítására használhatók. A kívánt polipeptid fúziós fehérjeként létezik, benne a kívánt polipeptid az N-terminálisán egy X-Pro általános képletű linkerhez kapcsolódik. A fúziós fehérjét speciálisan puffereit körülmények közzé helyezve a fúziós fehérje X-Pro részében egy diketopiperazin képződik, majd lehasad. így a fúziós fehérjéből a kívánt polipeptid keletkezik. Az EPO 220 958 ('958) fúziós fehérjéi nem tartoznak a jelen találmány körébe, mivel a jelen találmány szerint, ha
HU 211 572 A9 az N-terminálison levő hosszabbító rész csak egy dipeptid, azaz, ha A nincs jelen, n értéke 0 és Y egy, a természetben előforduló aminosav, Y vagy alanin, szerin vagy treonin. Így, ha a hosszabító rész dipeptid, képlete X-Ala, X-Ser vagy X-Thr. A ’958-as bejelentés szerint az X-Pro dipeptidet kémiai, és nem enzimatikus úton hasítják le. A ’958-as bejelentés szerint az X-Ala, X-Ser és X-Thr dipeptid nem hasítható azzal a típusú kémiai reakcióval, amely az X-Pro részt vágja le a magfehérjéről.
Az AU-A-12 709/88 számon nyilvánosságra hozott ausztráliai szabadalmi bejelentésben olyan fúziós fehérjéket ismertetnek, amelyek immobilizált fémaffinitásos kromatográfiában (IMAC) használható affinitásos peptideket tartalmaznak. A leírt affinitásos peptidek legalább két szomszédos hisztidinmaradékot tartalmaznak. Az ismertetett IMAC tisztítási módszer alkalmazásához egy speciális kémiai eljárás szükséges a nitrilo-triecetsav-gyanták (NTA) előállítására.
Tallon, M. A. és munkatársainak cikke [Biochem. 26, 7767-7774 (1987)] Saccharomyces cerevisiae-ből származó tridekapeptid alfa-faktor meghosszabbított analógok szintézisére vonatkozik. Az előállított analógok meghosszabbított alfa-faktorok, amelyek természetben előforduló pro-alfa-faktor szekvenciákat képviselnek az MFalfal szerkezeti génben.
Kriel. G. és munkatársai az Eur. J. Biochem. 111:49-58(1980) irodalmi helyen a melittin prekurzor (Promelittin) N-terminális részének dipeptidilpeptidázzal való lépésenkénti hasítását írják le. A promelittin a mézelő méh mérgének a fő komponense. A prekurzor N-terminálisának aminosavszekvenciájában minden második maradék prolin vagy alanin. Amikor a promellitint sertés veséből izolált DPP IV hatásának teszik ki, a prekurzor N-terminális része lépésenként lehasad, és így az érett fehérje keletkezik. A promelittin, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjéktől eltérően, természetben előforduló fehérje.
Julius. D. és munkatársai a Cell, 32:839-852 (1983. március) irodalmi helyen található publikációban az élesztő alfa-faktomak egy nagyobb prekurzor Polipeptidből való előállítási eljárásáról és a membránhoz kötött DPP IV ezen eljárásban játszott szerepéről írnak. Az élesztő alfa-faktor, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjéktől eltérően, természetben előforduló fehérje.
Mollay. C. és munkatársai (Eur. J. Biochem. 160:31-35(1986) a DPPIV enzimnek aXenopus laevis bőrváladékából való elkülönítését és a DPP IV aktivitását ismertetik.
Mentlein. R. [FEB, 234(2):251-256 (1988. július)] prolin maradékokról számol be peptid hormonok és neuropeptidek érése és lebomlása során. Azt írja, hogy emlősökben prolin specifikus proteázok. mint a DPP IV, nem vesznek részt a szabályzó peptidek bioszintézisében, de fontos szerepet játszhatnak azok lebontásában. Ebből arra következtet, hogy míg a gerincesekben és kisebb gerincesekben a prekurzor fehérjék érett formává való átalakítása a DPP IV enzimtől függ, addig a szabályzó fehérjék az emlősökben a DPP IV-et általában lebontási proteázként használják.
Frohman, L. A. és munkatársai a J. Clin. Invest. 78:906-913 (1986) irodalmi helyen megjelent közleményéből megtudjuk, hogy a humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) és analógjai in vivő emberekben és in vitro plazma DPP IV hatására gyorsan degenerálódnak.
Frohman, L. A. és munkatársai [J. Clin. Invest. 83:1533-1540 (1989)] arról számolnak be, hogy a humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) és analógjai in vivő emberekben és in vitro plazma DPP IV hatására gyorsan degenerálódnak.
Kubiak, T. M. és munkatársai a Drug Metabolism and Disposition, 17(4):393-397 (1989) irodalmi helyen a szarvasmarha növekedési hormont felszabadító faktor (bGRF) analógok szarvasmarhában és sertés plazmában in vitro végbemenő metabolikus lebomlását és annak a plazma DPP IV aktivitásával való kapcsolatát ismertetik. A vizsgált bGRF analógok az N-terminális 2-helyzetében Alá maradékot tartalmaztak. Arról számolnak be, hogy a bGRF plazmában való metabolikus lebomlása a DPP IV plazmában való jelenlétének köszönhető.
Hong, W. és munkatársai [Biochemistry, 28:84748479 (1989)] enzimatikusan aktív DPP IV kínai hörcsög petesejtjében, transzfekció után való kifejezéséről számolnak be.
Kreil, G. [TIBS 15:23-26(1990. január)] prekurzorok végtermékké alakítása során dipeptidek DPP-kkel való lépésenkénti hasítását ismerteti. A prekurzorok, amelyekről Kreil ír, a természetben előforduló fehérjék. A jelen találmány szerinti fehérjék a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék.
Boman és munkatársai a J. Bioi. Chem. 264:58525860(1989) irodalmi helyen mutatják be, hogy a cecropia pupae-ből izolált dipeptidilpeptidáz (a DPP IV-hez hasonló specifitású enzim) képes volt a cecropia Aés B természetes prekurzorairól készült szintetikus másolatok N-termináiisáról az Ala-Pro-Glu-Pro természetes N-terminális szekvenciát eltávolítani. A Boman által ismertetett preprocecropin természetben előforduló fehérje.
Dalboge, H. és munkatársai [Bio/technology, 5:161-164 (1987. február) E. coli által termelt humán növekedési hormon prekurzorának autentikus hGH-vá való in vitro átalakítását írják le. A prekurzornak az N-terminálison kapcsolódó részét dipeptidilpeptidáz I enzimmel távolították el.
Dalboge, H. és munkatársai [FEBS, 246(1,2):89-93 (1989 március )] az IL-lbéta prekurzor klónozását és kifejezését, valamint IL-lbétává való alakítását írják le, amely eljárás során a prekurzor N-terminálishoz kapcsolódó részét dipeptidilpeptidáz I-gyel távolítják el.
Dalboge, H. és munkatársai [FEBS, 266(1,2):1-3 (1990. június)] E. coli-ban N-terminális metionin in vivő eltávolításáról számolnak be. Azt találták, hogy az N-terminális metioninnak a meghosszabbított humán növekedési hormonból való eltávolítása a metioninnal szomszédos aminosavtól függ.
Hopp, T. P. és munkatársai a Bio/Technol. 6:12041210 (1988. október) irodalmi helyen arról írnak, hogy
HU 211 572 A9 egy kívánt rekombináns limfokin N-terminálisához egy nyolc aminosavból álló peptidet adtak, hogy antigénes N-terminálist hozzanak létre, amely aztán immunoaffinitásos tisztítási eljárásban használható. Ez a közlemény megfelel a fentebb említett, 4,782,137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak.
Smith, M. C. és munkatársai [J. Bioi. Chem. 263,15:7211-7215 (1988) olyan kísérleti eredményeket ismertetnek, amelyek alátámasztják azt a feltételezést, hogy egy kis peptid amino-terminálisán specifikus fémekkel kelátot képező peptidek használhatók a fehérje fémion affinitási kromatográfiás eljárással való tisztítására. Ez a közlemény a fentebb említett, 4 569 794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egyik példájának adatait is közli. Közelebbről, a His-Trp fémmel kelátot képező peptid alkalmazása luteinizáló hormont felszabadító hormonhoz vagyproinzulinhoz kapcsolva lehetővé teszi a kimérés peptid IMAC módszerrel való tisztítását, ugyanakkor a kontroll molekulák, amelyek nem tartalmazzák a HisTrp linken, ilyen módon nem nyerhetők ki.
Hochuli, E, és munkatársai [J. Chromat. 411:177184 (1987)] a fémkelát affinitásos kromatográfiás eljárásban adszorbensként használható nitrilo-triecetsavat ismertetik. Arról számolnak be, hogy a fenti abszorbens. Ni2+-vel töltve-szomszédos hisztidinmaradékokat tartalmazó peptidek és fehérjék megkötésére használható.
Ljungquist, C. és munkatársai az Eur. J. Biochem. 186:563-569 (1989) irodalmi helyen az ALa-His-GlyHis-Arg- Pro fémmel kelátot képző peptid kétszeresének, négyszeresének és nyolcszorosának alkalmazását írják le immobilizált Zn2+ ionokat tartalmazó oszlopon. Ljungquist szerint ilyen fémmel kelátot képző peptid cinkoszlopokkal együtt való alkalmazáskor várakozáson felüli jó eredménnyel tisztíthatók a fúziós fehérjék.
A találmány részletes leírása
A jelen leírásban a „természetben elő nem forduló fúziós fehérjék”, a „természetben elő nem forduló fúziós polipeptidek”, „fúziós polipeptidek” és „fúziós fehérjék” kifejezések felcserélhető módon olyan fehérjékre és polipeptidekre utalnak, amelyek normális esetben a természetben nem fordulnak elő, és amelyek egy magfehérje részből és egy hosszabbító részből állnak.
A „magfehérje”, „magfehérje rész” és a „polipeptid rész” a fúziós polipeptidnek a molekula C-terminálisán levő részét jelenti, és a hosszabbító rész hiányában ez a kívánt polipeptid és/vagy biológiailag aktív fehérje, amely többek között valamely természetben előforduló biológiailag aktív fehérje és polipeptid, valamint ezek valamely analógja és mutánsa lehet.
Az „N-terminálison levő hosszabbító rész” az első és legfeljebb kb. 45 aminosavra utal az N-terminálistól kezdve, amely(ek) a magfehérjének nem része(i).
Az „előgyógyszer” (prodrug) meghatározás olyan fúziós fehérjéket jelent, amelyekben a biológiailag kívánt rész egy biológiailag aktív fehérje, amely gyógyszerként használható.
A „biológiailag aktív fehérje” és „biológiailag aktív polipeptidek” megnevezés felcserélhetően olyan fehérjékre és polipeptidekre utal, amelyek biológiai aktivitással rendelkeznek.
A „kívánt fehérje” és a „kívánatos fehérje” felcserélhető módon olyan fehérjéket és polipeptideket jelent, amelyeket tiszta formában kívánunk előállítani.
A „hosszabbító rész” a fúziós fehérje azon részére utal, amelyik egy N-terminálishoz kapcsolódó hosszabító rész, és amely nem része a biológiailag kívánatos fehérjének.
A „DPP IV-gyel hasítható N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész” a fúziós fehéije azon hosszabbító részét jelenti, amelynek az aminosav-szekvenciája lehetővé teszi a DPP IV enzimmel való lépésenkénti hasítást.
A szekvenciákat felsoroló részben néhány Y aminosavmaradékot Xaa-val jelöltünk a szekvencia leírásában. Erre a következő értelmezések érvényesek:
A 3-as azonosítási számú szekvenciában Xaa29 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 4-as azonosítási számú szekvenciában Xaa29 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 5-ös azonosítási számú szekvenciában Xaa29 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 14-es azonosítási számú szekvenciában Xaa29 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 18-as azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 19-es azonosítási számú szekvenciában Xaa33 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 20-as azonosítási számú szekvenciában Xaa39 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 21-es azonosítási számú szekvenciában Xaa45 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 24-es azonosítási számú szekvenciában Xaa27 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 25-ös azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 26-os azonosítási számú szekvenciában Xaa33 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 27-es azonosítási számú szekvenciában Xaa35 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 28-as azonosítási számú szekvenciában Xaa37 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 29-es azonosítási számú szekvenciában Xaa33 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 30-as azonosítási számú szekvenciában Xaa35 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 31-es azonosítási számú szekvenciában Xaa37 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 32-es azonosítási számú szekvenciában Xaa39 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 33-as azonosítási számú szekvenciában Xaa45 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 34-es azonosítási számú szekvenciában Xaa43 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 35-ös azonosítási számú szekvenciában Xaa45 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 36-os azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
HU
211 572 A9
A 37-es azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 38-as azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 39-es azonosítási számú szekvenciában X31 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 40-es azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 41-es azonosítási számú szekvenciában X33 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 42-es azonosítási számú szekvenciában Xaa31 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A 43-as azonosítási számú szekvenciában X33 a
C-terminálison amidált argininilmaradékot jelent.
A jelen találmány javított fehérjékre és polipeptidekre vonatkozik. A jelen találmány szerinti biológiailag aktív polipeptideket először két részből álló fúziós fehérjeként állítjuk elő, az első rész a magfehérje rész; és a második egy N-terminálison kapcsolódó hosszabbító rész, amely a láncvégén levő karboxicsoportjával kovalensen kötődik az első rész láncvégi aminocsoportjához. A fúziós polipeptid N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító részének olyan az aminosavszekvenciája, amely a dipeptidilpeptidáz IV (DPP IV) által hasíthatóvá teszi.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérje a következő képlettel jellemezhető:
hosszabbító rész - magfehérje rész, ebben a „hosszabbító rész” a DPP IV-gyel hasítható. N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító részt jelenti, egy kovalens peptidkötés; és a „magfehérje rész” bármely olyan kívánt peptidet jelöl, amely a hosszabbító rész DPP IV-gyel való lehasításakor felszabadul.
A jelen találmány szerinti fúziós fehérje hosszabbító része az
A-X-Y(X’-Y)n általános képletnek felel meg, amelyben
A adott esetben van jelen, és amikor jelen van metionint jelent, n a szekvenciálisán kapcsolódó X’-Y csoportok számát jelenti, amely 0 és 20 közötti, előnyösen 0 és 10 közötti lehet;
X bármely, a természetben előforduló aminosav;
Y prolin, alanin, szerin vagy treonin, kivéve, ha n értéke 0, mert akkor Y alanin, szerin vagy treonin;
X’ bármely, a természetben előforduló aminosav, kivéve a prolint vagy hidroxi-prolint.
A képlet szerint, amikor n = 1, két Y maradék van.
Továbbá, legfeljebb 21 Y maradék és 20 X’ maradék lehet egyetlen molekulában. Az egyes Y maradékok és X’ maradékok a megadottak köréből bármely csoportot jelenthetik. Azaz, egyetlen molekulában nem kell az összes Y maradéknak azonosnak lennie. Hasonlóképpen. az egynél több X’-t tartalmazó molekulában minden egyes jelenlevő X’ maradék a prolin és hidroxiprolin kivételével bármely aminosavmaradék lehet, függetlenül attól, hogy a többi X’ milyen maradékot jelent. Minden egyes Y és X’ maradéknak meg kell felelnie az adott csoportra vonatkozó szabályoknak, és mindössze az szükséges, hogy a speciális helyzetekben levő különböző maradékok kövessék a fentebb ismertetett szabályokat.
Az olyan fúziós fehérjék, amelyekben (A) metioninként (Met) jelen van, olyan szekvenciát képviselnek, amely alkalmas biológiailag aktív fehérjék rekombináns DNS módszerrel E. coíi-ban való előállítására. A Met szekvencia jelenléte ezekben a prekurzorokban általában az E. coli enzimatikus rendszere segítségével vagy más, a szakember számára ismert módszerekkel eltávolítható. Az E. coli-ban történő fehérjeszintézis, normális körülmények között a Met-t kódoló AUG transzlációs iniciációs kodon iniciálásával kezdődik. Ennek eredményeként az újonnan szintetizált polipeptidek N-terminális aminosavként metioninmaradékot tartalmaznak. Az E. coli olyan enzimatikus aktivitással rendelkezik, amely hatásosan eltávolítja az N-termináIis metionint, ha a Met N-terminális maradék egy aránylag kis oldalláncú, például Gly, Alá vagy Ser, valamint Pro aminosavval szomszédos. Az N-terminális metionint nagy szelektivitással távolíthatjuk el bróm-cián által közvetített hasítással. Azonban, hogy ez az eljárás sikeres legyen, az N-terminális metioninnak az egyetlen metioninnak kell lennie az egész fehérjeszekvenciában; egyébként a hasítás a szekvenciában levő minden metionin után végbemegy, A fentieknek megfelelően, belső Met szekvenciát tartalmazó fúziós fehérjék esetében az N-terminálistól számított második aminosavnak prolinnak, glicinnek, alaninnak vagy szerinnek kell lennie, ha a Met aminosavmaradékot E. coli enzimatikus rendszerrel kívánjuk eltávolítani.
A fúziós polipeptidek mellett a jelen találmány rekombináns DNS molekulákra, amelyek a fiízós polipeptidet kódoló DNS szekvenciákból állnak; az ilyen rekombináns DNS molekulákat alkalmazó eljárásokra; a fúziós polipeptidek alkalmazási eljárására vonatkozik, beleértve a kívánt polipeptidek tisztítási eljárásait és a gyógyszer adagolási módszereket, amelyek abból állnak, hogy olyan előgyógyszereket adagolunk, amelyek a prekurzorból az N-terminálison kapcsolódó hosszabbító rész in vivő, lépésenként történő proteolitikus eltávolítása útján alakulnak biológiailag aktív formává.
A fúziós polipeptideket standard peptidszintézissel vagy rekombináns DNS technikával állíthatjuk elő, a szakember ezeket a módszereket jól ismeri. A peptidszintézis az előnyös eljárás a kb. 50 vagy ennél kevesebb aminosavat tartalmazó polipeptidek előállítására. Nagyobb molekulák esetében gazdasejtekben, rekombináns DNS technológiával való előállítás az előnyösebb.
Azok a fúziós peptidek, amelyek N-terminálishoz kapcsolódó, a DPP IV által felismerhető és hasítható részt tartalmaznak, a csak a magfehérjéből álló, módosítatlan polipeptideknél hasznosabbak és előnyösebbek. A jelen találmány két különösen hasznos alkalmazási területet ismertet.Az első alkalmazás olyan, „előgyógyszer”-nek nevezett fúziós polipeptidek rendelkezésre bocsátása, amelyek gyógyszerként használható biológiailag aktív polipeptidekből és ahhoz kovalensen kötött, a DPP IV által hasítható N-terminális hosszab6
HU 211 572 A9 bitó részből állnak. Ezek az előfonnák biológiailag aktív formákká alakíthatók annak az embernek vagy más állatnak a testében levő DPPIV enzim általi hasítással, amelynek az előgyógyszen beadják. Ennek megfelelően a jelen találmány előgyógyszerként használható fúziós polipeptidekre, fúziós polipeptidek gyógyászati készítményben való alkalmazására és biológiailag aktív polipeptidek betegeknek való adagolási eljárására vonatkozik. A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidek második alkalmazási területeként a fehérjék tisztítási eljárását említhetjük, amelyben a polipeptid N-terminálisához kapcsolódó hosszabbító rész teszi lehetővé a vegyület hatékony tisztítását, és ez a hoszszabbító rész aztán DPP IV enzimmel való hasítással eltávolítható. Ennek megfelelően a jelen találmány olyan fúziós polipeptidekre, amelyek tisztítási eljárásokban felhasználhatók, valamint kívánt polipeptidek tisztítási eljárására vonatkozik. Ezek az alkalmazási lehetőségek csak példaként szolgálnak a jelen találmány hasznosságának szemléltetésekor, és a találmányt semmilyen vonatkozásban nem korlátozzák.
Mindkét alkalmazás esetében a fúziós fehérje magfehérje részét a hosszabbító résztől DPP IV enzim segítségével szabadítjuk meg. A tisztítási eljárásokban használt fúziós fehérjéknél nemkívánatos, hogy a magfehérjék a DPP IV hasítás szubsztrátumai legyenek. Azaz, előnyös, ha a DPP IV nem képes a magfehérjét hasítani, miután a hosszabbító részt eltávolítottuk. Gyakran az a legkívánatosabb, ha a magfehérje DPP IV szubsztrát, hogy előgyógyszerként adagoljuk. Ilyen esetekben az előgyógyszer a magfehérje elnyújtott jelenlétét eredményezheti, mivel az in vivő (például plazmában. veseszövetben és májszövetben) jelenlevő DPP IV kerül felhasználásra az N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész eltávolítására, és így a magfehérje lebomlásának késleltetésére. Azaz, a fúziós fehérje hosszabbító része a DPP IV szubsztrátjaként és kompetitív inhibitorként szerepelhet, késleltetve a DPP IV magfehérjére gyakorolt hatását, ezáltal időlegesen védve a magfehérjét.
Az „előgyógyszer” itt olyan fúziós fehérjét jelent, amely az N-terminálishoz kapcsolódóan DPP IV által hasítható hosszabbító részt tartalmaz, amely kovalensen kötődik egy magfehérje részhez, amely biológiailag aktív polipeptid, és gyógyszerként használható. A jelen találmány szerint az előgyógyszert egyedüli előformaként vagy más vegyületekkel együtt adagolhatjuk. Az előnyös kiviteli alak az előgyógyszer egy jól meghatározott egyedi alakja. Mindegyik esetben az előalakokat a természetben előforduló, normálisan a testben található DPP IV enzim alakítja át.
Az előgyógyszer gyógyászati készítmény formájában való adagolásának előnye, hogy késlelteti a hatást és/vagy a biológiailag aktív fehéije jelenlétét meghosszabbítja. Az előgyógyszer nem-hatásos állapotban létezhet addig, amíg a hosszabbító rész megfelelő része lebomlik. és a molekula hatásossá válik. Az előgyógyszerek. ezért időben késleltető gyógyszeradagoló rendszerként működhetnek. Továbbá, az N-terminálishoz kapcsolódó különböző hosszabbító részek különböző sebességgel bomlanak, a hosszuktól és az aminosavszek vénei áj ukban jelenlevő speciális maradékoktól függően. Az N-terminálison eltérő hosszabbító részt tartalmazó különféle előgyógyszerformák kombinációját hozhatjuk létre, amely a betegben egy bizonyos ideig a hatóanyag időben nyújtott, állandó szinten történő leadását biztosítja. Az előgyógyszerek ily módon késleltetett hatóanyagleadó rendszerként működhetnek.
Mint már az előzőekben említettük, a DPP IV a polipeptid N-terminálisáról egy dipeptidet hasít le, feltéve, hogy bizonyos helyzeteket bizonyos maradékok foglalnak el. A leírásban az „1-es helyzet” az N-teiminális aminosav maradékra utal. A „2-es helyzet” annak az aminosavmaradéknak a helyzetét jelenti, amely az
1-es helyzettel közvetlenül szomszédos, és amely az N-terminálistól számítva a második. A „3-as helyzet” megjelölés arra az aminosavmaradék helyzetre vonatkozik, amely a 2-es helyzettel közvetlenül szomszédos, és az N-terminálistól számítva a harmadik. Az N-terminális dipeptid hasítása a 2-es és 3-as helyzet között megy végbe, feltéve, hogy a 3-as helyzetű aminosav nem prolin vagy hidroxi-prolin, és a 2-es helyzetű aminosav a következő öt aminosav, prolin (Pro), hidroxi-prolin (Hyp), alanin (Alá), szerin (Ser) vagy treonin (Thr) egyike.
A DPP IV az N-terminális maradékokat különböző sebességgel hasítja, attól fügően. hogy a négy aminosav közül melyik van a 2-es helyzetben. A legtöbb esetben a DPP IV a hasítást illetően akkor a leghatékonyabb, ha a 2-es helyzetet prolin foglalja el, és ezt követően az aktivitása akkor a legnagyobb, ha a 2-es helyzetben alanin található. Amikor az 1-es helyzetet tirozin, fenil-alanin vagy hisztidin foglalja el, a DPP IV körülbelül olyan hatékonysággal működik, mint amikor a 2-es helyzetben prolin- vagy alaninmaradék van. A DPP IV ezt követő hatékonysággal akkor működik, ha a 2-es helyzetben szerin található. Az enzim a legkisebb aktivitást akkor mutatja, ha treonin a 2-es helyzetű aminosav.
Ezen ismereteket felhasználva számos N-terminális hosszabbítást tervezhetünk, amelyek különböző sebességgel hasíthatók. így egy adagolandó gyógyszer állhat egy speciális előgyógyszerből vagy előgyógyszer-formák kombinációjából. Az egyes előgyógyszerek, amelyekben az N-terminálishoz különféle hosszabbító részek kapcsolódnak, az ami nosavszek véne iájuktól függő sebességgel fognak átalakulni. Az előgyógyszerformák kombinációja olyan készítménnyé formálható, amely egy sor előgyógyszert tartalmaz, és azok biológiailag aktív polipeptiddé való átalakulása időben elhúzódóan megy végbe.
A maszkírozó maradék hossza és aminosavszekvenciája egyaránt befolyásolja a DPP IV enzim általi hasítás sebességét. A csak prolinból álló vagy majdnem minden Y változó helyén prolint tartalmazó hosszabbító rész hasad a leggyorsabban, míg az Y helyén treonint tartalmazó a leglassabban. Emellett ismert, hogy az X-Pro dipeptidegységek, amelyekben X vagy glutamin vagy aszparagin, sokkal lassabban hasadnak, mint
HU 211 572 A9 azok a megfelelőik, amelyekben X semleges vagy bázikus aminosavmaradék. Mivel a hosszabbító részek különféle (négy) maradékokat tartalmazhatnak a hosszabbítás minden hasítható helyzetében, a variációk és permutációk igen nagy száma fordulhat elő,
Bármely biológiailag hatásos polipeptid használható polipeptid gyógyszerként. A PCT/US90/02923 és PCT/US91/08248 számú nemzetközi, valamint a 07/368,231 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések, amelyekre ezúton utalunk, szarvasmarha növekedési hormont felszabadító faktor analógokat ismertetnek, amelyek gyógyászati készítmények előállítására, a jelen találmánynak megfelelően, előgyógyszerként használhatók. Ezekben a bejelentésekben szereplő bármely analóg alkalmazható a jelen találmány szerinti fúziós fehérje magpeptidjeként. Az ilyen magfehérje részekből és a hozzájuk kapcsolódó hosszabbító részekből álló fúziós fehérjéket a szakember számára jól ismert eljárásokkal állíthatjuk elő.
A jelen találmány megvalósításának más kiviteli példáiként a hormonokat, receptorokat, enzimeket, raktározó fehérjéket és vérfehérjéket említjük. Speciális példák a következők: vazoaktív intesztinális peptid (VIP), humán béta-kazomorfin; gyomor gátló peptid (GIP); gyomor felszabadító peptid (GRP); Hl humán peptid; YY humán peptid; a glukagonszerű peptid-1
7-37 fragmentuma; glükagonszerű peptid-2; P anyag; Y neuropeptid; humán hasnyálmirigy polipeptid; inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1); humán növekedési hormon (hGH); szarvasmarha növekedési hormon (bGH); sertés növekedési hormon (pGH); prolaktin (PRL); humán, szarvasmarha, sertés vagy juh növekedési hormont felszabadító faktor (GRF); interleukin1 béta (IL-lbéta); EGF; IGF-2; glukagon; kortikotropint felszabadító faktor (CRF; dinorfin; szomatosztatin-14 endotelin; transzformáló növekedési faktor alfa (TGF-alfa); transzformáló növekedési faktor béta (TGF-béta); interleukin-4; interleukin-6; ideg növekedési faktor (NGF); tumor nekrózis faktor (TNF); inzulin; fibroblaszt növekedési faktor (FGF); interferon; CD4; és interleukin-2 (IL-2) vagy ezek szintetikus vagy bioszintetikus analógjai. Ezek a polipeptidek a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék magfehérje részeként is alkalmazhatók. A fentebb felsorolt polipeptidek csak a kiviteli alakok példáiként szolgáltak, és a jelen találmány körét semmiképpen nem korlátozzák.
A jelen találmány szerinti kisebb fúziós peptideket például szilárdfázisú módszerrel, az Applied Biosystems 430A típusú peptidszintetizátorral (Applied Biosystems, Foster City, California) állíthatjuk elő, amely módszert a PCT/US90/02923 számú nemzetközi és a 07/368,231 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések részletesen ismertetik.
A nagyobb molekulák esetében az előállítás előnyösen rekombináns DNS módszerrel, gazdasejtekben történik. Azon szakemberek számára, akik fúziós fehérjéket rekombináns DNS technológiával kívánnak előállítani, különféle módszerek állnak rendelkezésre. Általában a kívánt polipeptidet kódoló géneket expressziós vektorokba iktatják, amelyeket aztán megfelelő gazdasejtek inszerciós transzformálására vagy transzfektálására használnak. A beiktatott gén aztán a gazdasejtben kifejeződik, és a kívánt polipeptid termelődik. A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidek hasonló módon való előállításához a géninszert egy további DNS szekvenciát is tartalmaz, közelebbről, az N-terminálishoz kapcsolandó hosszabító részt kódoló DNS operábilisan hozzá van kapcsolva a kívánt polipeptidet kódoló gén 5’-végéhez. Ezt a további genetikus anyagot az expressziós vektor promoterjétől downstream kell elhelyezni, hogy a promoter kontrollja alatt legyen. Ezen felül, ezt a részt a génnel tökéletes leolvasási keretbe kell helyezni úgy, hogy a kifejezett fehérjetermékben a hosszabbító rész kovalensen kötődjön a kívánt polipeptidhez.
Ezért, a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék rekombináns DNS technológiával való előállításához olyan oligonukleotidokat kell tervezni, amelyek a kívánt, N terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész aminosavszekvenciáját kódolják, és ezeket az oligonukleotidokat a magfehérjerészt kódoló gén 5’-végéhez képest upstream kell operábilisan inszertálni, kimérás gént hozva létre. Az oligonukleotidok előállításának módjai és a kimérás géntermelésére használt technikák a szakember számára jól ismertek.
A fúziós fehérjék előgyógyszerként való alkalmazása mellett a jelen találmány biológiailag aktív rekombináns polipeptidek tisztítására és átalakítására is kiterjed. A kívánt biológiailag akív rekombináns polipeptideket legelőnyösebben oldható vagy a gazdából kiválasztott formában állítjuk elő. A jelen találmány szerint a fúziós fehérje hosszabbító részét tisztítási segédeszközként hasznosíthatjuk, A fúziós fehérjét megtisztítjuk a kiválasztási közegben vagy extrakciós oldatban mellette jelenlevő anyagoktól, és aztán a magfehérjéről eltávolítjuk a hosszabbító részt, így a kívánt fehérjét tisztított állapotban kapjuk. Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti fúziós fehérjék előállítására legalkalmasabb, kívánt fehérjék azok a biológiailag aktív polipeptidek, amelyek maguk nem szubsztrátok a DPPIV hasításhoz.
A jelen találmánynak megfelelően egy kívánt fehérjét kódoló génszekvenciát elkülönítünk, szintetizálunk vagy másképpen kapunk, és operábilisen egy, a hosszabbító részt kódoló DNS szekvenciához kapcsoljuk. A hibrid gént, amely a kívánt fehérjét egy, a hoszszabbító részt kódoló DNS szekvenciához operábilisan kapcsolva tartalmazza, kimérás génnek nevezzük.
A kimérás gének és rekombináns vektorok előállításának, ezek felhasználásával a gazdasejtek transzformálásának vagy transzfektálásának, a vektorok gazdasejtekben való replikációjának és biológiailag aktív idegen polipeptidek és fehérjék kifejezésének módszerei! és anyagait a „Principles of Gene Manipulation” (A génmanipulálás elvei) (Old and Primrose, 2nd edition, 1981) című munkában és Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning” (Molekuláris klónozás) (2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, 1989) című könyvében ismertetik, amelyekre ezúton utalunk.
HU 211 572 A9
A jelen találmány rekombináns kimérás génekre, amelyek fúziós fehérjéket kódolnak, ezeket tartalmazó kifejező vektorokra, ezekkel a kifejező vektorokkal transzformált vagy transzfektált gazdákra, és ezen gének, kifejező vektorok előállítási eljárására és ezen vektorokkal transzformált vagy transzfektált gazdákra is vonatkozik.
A jelen találmány bármely prokarióta vagy eukarióta fehérje tisztítására használható, amely rekombináns DNS technológia termékeként egy transzformált vagy transzfektált gazdasejtben kifejezhető. Ezek a rekombináns fehérje termékek lehetnek hormonok, receptorok, enzimek, tároló fehérjék, vérfehérjék, mutáns fehérjék, amelyeket biotechnológiai úton állítunk elő, vagy szintetikus fehérjék. Az előállított kívánt fehérjék között lehet például HÍV RNáz H, tPA, IL-l.IL-l receptor, CD4. humán ideg növekedési faktor, sCD4-PE40, humán légzési syncytial vírus (RSV) FG kimérás glikoprotein (ld. a 7/543 780 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést), EGF, IGF-1, 1GF-2, glukagon, kortikotropin felszabadító faktor (CRF), dinorfin, endotelin, transzformáló növekedési faktor-alfa (TGF-alfa), Pseudomonus endotoxin 40 (PE40), transzformáló növekedési faktor-béta (TGFbéta), inzulin és ezek analógjai.
A tisztítási módszerek közül az IMAC és immunaffinitás említhető példaként. A jelen találmány körébe tartoznak más olyan tisztítási eljárások is, amelyek DPP IV enzimmel eltávolítható hosszabbító részt tartalmazó peptide két alkalmaznak.
A jelen találmány egyik foganatosítási módja szerint azok a fúziós fehérjék, amelyek egy biológiailag aktív polipeptid részből és egy fémmel kelátot képező peptid hosszabbító részből állnak, immobilizált fémaffinitási kromatográfiás rendszerben használhatók.
Az immobilizált fémion affinitási kromatográfia (IMAC) fehérjék frakcionálására való alkalmazását először Porath, J. és munkatársai írták le [Natúré, 258:598-99 (1975)]. Porath egy gyantáira imino-diecetsavval (IDA) vitt fel funkciós csoportokat, és ezeket fémionokkal keláttá alakította. Porath szerint immobilizált fémionokat tartalmazó oszlopban a fehérjék immobilizálhatók. Ez a folyamat abból áll, hogy az egyébként gyakran használt imino-diecetsavat egy mátrixhoz kapcsolják, majd az imino-diecetsavat tartalmazó gyantához fémiont adva kelátot képeznek. A fehérjék a fémionokhoz kötődnek az aminosavmaradékok elektront leadni képes funkciós csoportjaival. A potenciális elektronleadó aminosavmaradékok a cisztein, hisztidin és triptofán. A fehérjék a fémionokkal ezen aminosavak közül egynek vagy többnek az elektronleadó oldalláncán át képeznek kötést.
Smith és munkatársai a 4,569,794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyre ezúton utalunk, azt állapítják meg, hogy bizonyos aminosavmaradékok a felelősek a fehérjének az immobilizált fémionokhoz való kötődéséért. Azonban, a megkötött fehérje a pH csökkentésével vagy kompetitiv ellenligandum, például, ha a kötés kialakításában hisztidin oldalláncok is résztvesznek, imidazol alkalmazásával eluálhatók, Hisztidint tartalmazó di- és tripeptideket tartalmazó fehérjéket használtak annak megmutatására, hogy az IMAC szelektív tisztítási módszer. Ennek megfelelően, Smith és munkatársai rekombináns DNS technikával állítottak elő olyan fúziós fehérjéket, amelyekben egy fémmel kelátot képező peptid kovalensen kapcsolódik a kívánt polipeptidhez.
Az IMAC technológia váltakozó hisztidinmaradékokat tartalmazó, fémmel kelátot képező peptidek esetében való alkalmazását ismertetik a 07/506 605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalni bejelentésben, amelyre ezúton utalunk. A 07/506 605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben speciális fémkelátképző peptideket írnak le, amelyekkel váratlanul kiváló eredmények érhetők el valamely fúziós fehérje IMAC tisztításában, ha a fémmel kelátot képező peptid 3-tól 6-ig változó hisztidin maradékot tartalmaz. A 07/506 605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a 4 569 794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás kitanításait követve lehetséges az általánosan használt IDA gyantát az IMAC technikában olyan fúziós fehérjék tisztítására alkalmazni, amelyek legalább három váltakozó hisztidinmaradékot magábafoglaló, fémmel kelátot képező peptidrészt tartalmaznak, és ez a peptidrész a DPP IV által felismert szekvencia alkotórésze. Fúziós fehérjék előállításáról és ezek IMAC rendszerben való alkalmazásáról a 4 569 794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban találunk bővebb ismertetést. A váltakozó hisztidinmaradékokból álló, fémmel kelátot képező peptidrészek előállítására és alkalmazására vonatkozóan a 07/506 605 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ad kitanítást. A jelen bejelentés váltakozó hisztidinmaradékok között DPP IV által felismerhető maradékokat tartalmazó fúziós fehérjét bocsát rendelkezésre, amely IMAC technológiával tisztítható, és aztán DPP IV enzimmel hasítva a kívánt polipeptiddé alakítható.
A jelen találmány ezen foganatosítási módja szerint a hosszabbító rész egy fémmel kelátot képező peptid, amely az A-X-Y(X’-Y)„ általános képlettel jellemezhető, ebben A adott esetben van jelen, és akkor metionint jelent; n a szekvenciálisán kapcsolódó X’-Y csoportok számát jelenti, amely szám 0 és 20, előnyösen 0 és 10 közötti;
X bármely, a természetben előforduló aminosav;
Y prolin, alanin, szerin vagy treonin, kivéve, ha n = 0, akkor Y alanin, szerin vagy treonin;
X bármely, a természetben előforduló aminosav, kivéve a prolint és hidroxi-prolint;
és amelyben legalább 2-3 X’-vel jelölt csoport van, és adott esetben az X-ek hisztidint jelentenek. Előnyösen az Y prolin és n értéke legalább 3. A vegyület DPP IV enzimmel való kezeléskor a hosszabbító rész lépésenként hasad le, ily módon a biológiailag aktív polipeptid képződik, feltéve, hogy a biológiailag aktív polipeptid maga nem DPP IV szubsztrát.
HU 211 572 A9
A fúziós fehérjék egyik csoportja például
His-Y(His-Y)n általános képletű hosszabbító részt tartalmaz, amelyben n = 3-8, és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint, legelőnyösebben prolint jelentenek. A fúziós fehérjék másik példájaként az
X-Y(His-Y)n általános képlettel jellemezhető hosszabbító részt tartalmazókat említjük, ahol a képletben n értéke 3-8, X bármely, a természetben előforduló aminosav; és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint, legelőnyösebben prolint jelentenek.
Mivel az N-terminális metionin az E. coli-ban történő fehérjeszintézis következménye, és ismert, hogy az E. coli enzimrendszer lehasítja, amennyiben a szomszédos aminosav prolin, glicin, alanin vagy szerin, a
Met-X-Y(His-Y)n általános képletű hosszabbító rész olyan szekvenciát képvisel, amely alkalmas a rekombináns DNS technikával az E. coli-ban intracellulárisan kifejezett biológiailag aktív peptidek vagy fehérjék IMAC módszerrel történő tisztítására és hasítására; a képletben n értéke 3-8. X prolin, glicin, szerin vagy alanin; és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint, legelőnyösebben prolint jelentenek.
Egy másik példában, ha a kívánt peptidet egy adott gazdából transzformáció vagy transzfekció után kiválasztással akarjuk előállítani, a vektorokat tervezhetjük oly módon, hogy a fehérje vagy polipeptid egy hoszszabbító részt tartalmazó formában választódjék ki, amely rész elősegíti a szállítást, és az
X-Y-(His-Y)n általános képlettel jellemezhető, ebben n = 3-8. X bármely, a természetben előforduló és az adott gazda kiválasztási rendszerével kompatibilis aminosav lehet, és az Y-ok prolint, hidroxi-prolint, alanint, szerint vagy treonint jelentenek.
Egy másik, fúziós fehérjéket alkalmazó fehérje tisztítási rendszer az immunoaffinitáson alapuló tisztítás. amely igen megfelel a DPP IV hasításos technológia esetében, Az 1988. november 1 -én Hopp és munkatársai részére engedélyezett 4 782 137 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyre ezúton utalunk, nagy antigéntulajdonságú N-terminális részből és egy kívánt polipeptid C terminális részből álló fúziós fehérje szintézisét ismertetik. Hopp és munkatársai szerint a fúziós fehérjét a nyers felülúszóból úgy különítik el, hogy a nyers felülúszót egy immobilizált antitesteket tartalmazó oszlopon engedik át, amikoris az antitestek a fúziós fehérje antigénrészeit felismerik. Az immobilizált antitestek a fehérjét az oszlopban tartják, miközben a felülúszó nemkívánt komponensei eluálhatók. Az oszlopban levő körülményeket aztán úgy változtatják, hogy az antigén-antitest komplex disszociáljon.
A jelen találmány szerint a fúziós fehérje erős antigéntulajdonságú N-terminálisa egy olyan hosszabbító rész. amely DPP IV által felismerhető maradékokat tartalmaz, A Hopp által leírt módon történő elkülönítés után a fúziós fehérjét a jelen találmány szerint DPP IV hatásának tesszük ki, amely a hosszabbító részt eltávolítja. A szakember a Hopp szerinti immunaffmitásos tisztítási eljárást meg tudja valósítani a jelen találmány szerinti N-terminális hosszabbító részt tartalmazó polipeptidekkel vagy fehérjékkel.
A leírt foganatosítási módok és példák csupán a jelen találmány bemutatására szolgálnak, és semmiképpen nem korlátozzák a találmány körét. Az ekvivalensek magukba foglalják az olyan fúziós fehérjéket, amelyek esetében az N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító rész eltávolításához legalább egy másik módszer szükséges, úgyhogy a hosszabbító rész eltávolítása módszerek kombinációjának eredménye. Az ekvivalensek körébe tartoznak az olyan fúziós polipeptidek is, amelyek kémiailag módosított aminosavmaradékokat tartalmaznak.
1. példa
Szintetikus előgyógyszerek amelyek fúziós fehérjék és magfehérjéjiik DPP ÍV szubsztrát A szintézissel előállítható és előgyógyszerként adagolható fúziós polipeptidekben egy DPP IV enzimmel bontható N terminális hosszabbító rész kovalensen kapcsolódik a biológiailag aktív polipeptidhez. Ezen előgyógyszerek a hosszabbító rész - magfehérje gyógyszer rész általános képlettel írhatók le, ahol a „hosszabbító rész” egy, a DPP IV enzimmel lehasítható N-terminálishoz kapcsolódó hosszabbító részt, a jel kovalens peptidkötést, és a „magfehérje rész” bármely kívánt peptidet jelent, amely a hosszabbító rész DPP IV-gyel való lehasításával szabaddá tehető. Ebben a példában a fúziós fehérje magfehérje része a hosszabbító rész eltávolítása után a DPP IV enzim potenciális szubsztrátja.
A szintetikus előgyógyszereket a szakterületen jól ismert peptidszintézis módszereivel állíthatjuk elő.
Az egyik megvalósítási mód szerint a magfehérje rész az epidermális növekedési faktor (EGF), és a hosszabbító rész Gly-Pro-Phe-Ala, így a fúziós fehérje képlete:
Gly4-Pro-'-Phe2-Alal-[EGF].
Egy másik esetben a magfehérje rész glukagon és a hosszabbító rész Ala-Pro-Phe-Ala, így a fehérje képlete:
A]a-4-Pro-=Phe-2-Ala-'-[GLUKANON].
Egy további fúziós fehérjében a magfehérje rész [Ala15 Leu27]-bGRF(l-29)NH2 (3-as azonosítási számú szekvencia) és a hosszabbító rész Tyr-Ala, a képlet
Tyr2-Ala1 - {[Ala'5 Leu27]-bGRF( 1 -29)NH2}
2. példa
Szintetikus előgyógyszerek amelyek magfehérje része nem DPP IV szubsztrát
A szintézissel előállítható és előgyógyszerként adagolható fúziós polipeptidekben egy DPP IV enzimmel lebontható N-terminális hosszabbító rész kovalensen kapcsolódik a biológiailag aktív polipeptidhez. Ezen előgyógyszerek a hosszabbító rész - magfehérje gyógyszer rész általános képlettel írhatók le, ahol a „hosszabbító rész” egy. a DPP IV enzimmel lehasítható, N-terminálishoz
HU 211 572 A9 kapcsolódó hosszabbító részt, a jel kovalens peptidkötést, és a „magfehérje rész” bármely kívánt peptidet jelent, amely a hosszabbító rész DPP IV-gyel való lehasításával szabaddá tehető.
A szintetikus előgyógyszereket a szakterületen jól ismert peptidszintézis módszereivel állíthatjuk elő.
Az egyik foganatosítási mód szerint a magfehérje rész egy bGRF analóg, [Val2, Ser8·28, Leu27]-bGRF(l33)OH (1-es azonosítási számú szekvencia), és a hosszabbító rész Gly- Pro-Tyr-Ala, így a fúziós fehérje képlete:
Gly“4-Pro“3-Tyr2-ALa“l-{ [Val2-Ser8·28 Ala15Leu27) bGRF(l-33)OH).
Egy másik esetben a magfehérje rész kortikotropint felszabadító faktor (CRF), és a hosszabbító rész GlyPro-Phe-Ala, így a fehérje képlete:
Gly^-Prop-3-Phe2-Alá-' -[CRF].
Egy harmadik esetben a magfehérje rész dinorfin, és a hosszabbító rész Phe-Pro-Phe-Ala, a képlete pedig
Phc4-Pro3-Phe2- Al a-1 - [DINORFIN].
Egy további fúziós fehérjében a magfehérje rész szomatosztatin-28, és a hosszabbító rész Gly-Pro-PhePro, így a fehérje képlete:
Gly^-Pro3-Phe2- Alá1 -[SZOM ATOSZTATIN-28].
Egy még további fúziós fehérjében a magfehérje rész endotelin, és a hosszabbító rész Ala-Pro-Phe-Ala, így a képlet:
Ala’-Pro3-Phe2-Alá1 - [ENDOTELIN].
Egy következő foganatosítási módnak megfelelően a magfehérje rész bGRF analóg, [lle2 Ser8·28 Alá15 Leu27] bGRF(l-40)OH (2-es azonosítási számú szekvencia), és a hosszabbító rész Phe-Ala, így a fúziós fehérje képlete:
Phe2-Alá-1 - {[De2Seiá28Alal 5Leu27]-bGRF( 1 -40)OH)
Egy másik foganatosítási mód szerint a magfehérje rész [lle2 Alá15 Leu27]-bGRF(l-29)NH2 (4-es azonosítási számú szekvencia), és a hosszabbító rész Tyr-Ser, a fehérje képlete pedig
Tyr2-Ser'-{[lle2 Alá'5 Leu27]-bGRF(l-29)NH2
3. példa
A Leu21 -bGRF( I-29)NH2 bGRF analóg nyújtott jelenléte
Egy bGRF analógot, az 5-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű Leu27-bGRF( 129)NH2 peptidet, gyógyszerként adagolhatjuk, amely gyógyszer magfehérjeként az 5-ös számú szekvenciából és az N-terminálison változatos hosszabbító részt tartalmazó előgyógyszerekból áll.
Az elógyógyszerek néhány változata az 5-ös azonosítási számú szekvencia magfehérjeként való felhasználásával. jól ismert módszerekkel előállítható. A hosszabbító részek az 5-ös azonosítási számú szekvencián alapuló elógyógyszerek esetében Ile-Ala, GlyPro-Ile-Pro, a 6-os és 7-es azonosítási számú szekvenciák alkalmazásakor Tyr-Ala, Gly-Pro-Tyr-Ala, a 8-as,
9-es. 10-es, 11-es, 12-es és 13-as azonosítási számú szekvenciák esetében pedig Tyr-Ala-Tyr-Ala és ValAla.
4. példa
A [Thr2 Alá'5 Leu2·1 ]-bGRF(l-29)NH2 bGRF analóg nyújtott jelenléte
A [Thr2 Alá15 Leu27]-bGRF(l-29)NH2 bGRF analógot, amelynek szekvenciája a 14-es azonosítási számúnak felel meg, gyógyszerként adagolhatjuk, amely magfehérjeként a 14-es azonosítási számú szekvenciából és az N-terminálison különböző hosszabbító részeket tartalmazó előgyógyszerekből áll. Az előgyógyszerek közül hármat készítettünk el, amelyek a Tyr-Thr, Tyr-Ser és Tyr-Thr-Tyr-Thr hosszabbító részeket tartalmazzák.
5. példa
HÍV RNáz H-t és N-terminális hosszabbítást tartalmazó fúziós fehérjék.
A rekombináns E. co/i-ból származó kimérás fehérjék tisztításának stratégiáját fémmel kelátot képező peptidrészt alapul véve írták le, amely immobilizált fémionokkal szemben affinitást mutató, váltakozó hisztidinmaradékokat tartalmaz. Vektorokat szerkesztünk olyan fúziós fehérjék szintézisének irányítására, amelyek magfehérjeként HÍV RNáz H-t tartalmaznak. Mint az az alábbiakban látható, ezeket a fúziós fehérjéket úgy terveztük, hogy az IMAC módszerrel történő tisztítás céljára váltakozó hisztidineket és a fémmel kelátot képező peptid (mcp) DPP IV enzimmel történő lehasításához váltakozó prolinokat vagy alaninokat tartalmazzanak.
A jelen találmány szerinti előnyös, DPP IV enzimmel hasítható, N-terminális hosszabító részek a következők:
1-es számú HIVRH/mcp fúziós fehérjében a 15-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő N-terminális hosszabbító rész HÍV RNáz H-hoz kapcsolódik:
Met11 -Prol0-Ala9-His8-Pro7-His6-Pro5-His^*Pro3-His2-Ala'-[HIV RNáz H],
A 2-es számú HIVRH/mcp fúziós fehérjében a 16os azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű N-terminális hosszabbító rész kapcsolódik a HÍV RNáz H-hoz:
Merl,-AlaI0-Pro9-His8-Ala7-His6-Ala5-His4Ala~3-His2-Alal-[HIV RNáz H].
A 3-as számú HIVRH/mcp fúziós fehérjében a 17-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő N-terminális hosszabbító rész kapcsolódik a HÍV RNáz H-hoz:
Merll-Glyl0-Pro9-His8-Pro7-His6-Pro5-His“4Pro-3-His-2-Ala-'-[HIV RNáz H],
Ezeket a fúziós fehérjéket E. co/i-ban klónozzuk és fejezzük ki, majd DEAE adszorbensen kromatografálva és RPHPLC technika alkalmazásával tisztítjuk. A fúziós fehérjék jellemzésére az N-terminális szekvenálást használjuk. Az, hogy rekombináns fehérjék IMAC eljárással való tisztítására váltakozó hisztidint tartalmazó fúziós fehérjéket alkalmazunk, majd az n-terminális hosszabbító részt DPP IV segítségével eltávolítjuk, a jelen találmány hasznosságát bizonyítja.
HÍV RNáz H gént tartalmazó kimérás gének előállítása
Minden rekombináns DNS-t standard technikával ll
HU 211 572 A9 állítunk elő. A fémmel kelátot képező peptid/hasítás szekvenciának megfelelő oligonukletidokat hozunk létre, ezeket megtisztítjuk, renaturáljuk, és egy HÍV RNázt kódoló génhez kapcsolva kimérás gént állítunk elő.
Váltakozó hisztidineket/DPP IV által felismert hasítási maradékokat/HIV-RNáz H-t kódoló kifejező vektorok előállítására egy kimérás gént a végső kifejező vektorba építünk be. A kimérás gén szerkezeteket tartalmazó expressziós vektorokat használjuk az E. coli standard technikával történő transzformálására. Az E. co/í-ban a gének expressziója eredményeként a kimérás gének által kódolt fúziós fehérjék termelődnek. Ezek a fúziós fehérjék HÍV RNáz H aminosavakból és váltakozó hisztidineket tartalmazó (fémmel kelátot képező peptid) és váltakozó prolinokat vagy alaninokat tartalmazó N-terminális hosszabbító részből állnak.
Nyers E coli extraktumok előállítása és fúziós fehérjék elkülönítése szekvenciameghatározás céljára
Megközelítőleg 3 g E. coli sejtpasztát 30 ml 0,25 mólos. 7,2-es pH-jú kálium-szulfátban szuszpendálunk. amely 1 mmol ditiotreitet (DTT), EDTA-t, fenilmetil-szulfonil fluoridot (PMSF) és benzamidin-hidrokloridot, 10 mg/liler aprotinint, leupeptint és besztatint tartalmaz. Ezt a szuszpenziót egy francia présen háromszor átnyomjuk, hogy a sejteket összetörjük. A sejtlizátumot 12 000 rpm mellett 1 órán át centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, és szilárd ammóniumszulfátot adunk hozzá 70%-os telítettségig. 1 órás keverés után a szuszpenziót 12 000 rpm mellett 1 órán át centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, és a pasztillát
2.25 ml 50 mmólos, 7,5-es pH-jú trisz-pufferben újra oldjuk, amely 1 m M DTT-t, PMSF-t és benzamidint tartalmaz. Az oldatot ezután egy éjszakán át 20 mM trisz-pufferből, 50 mM nátrium-kloridból, 1 mM DTTból. 10% glicerinből és 0,1 mM EDTA-ból álló (A) pufferben 4°C-on dializáljuk. Az összegyűjtött dializátumot egy térfogat A pufferrel hígítjuk, és 10 ml mosott DEAE cellulózból készült, A pufferrel egyensúlyba hozott oszlopra visszük fel. A lefolyó folyadékot részletekben gyűjtjük, és az oszlopot még 50 ml A pufferrel tovább mossuk. Ezeket az oldatokat összegyűjtés után bepároljuk, és a 70%-os ammónium-szulfáttal kicsapott anyagot 2 ml A pufferben ismét szuszpendáljuk, majd a fenti módon dializáljuk. Tömény RH-t használunk az N-terminális szekvencia analízissel történő jellemzéshez.
Fúziós fehérjék tisztítása IMAC eljárással
A fémmel kelátot képező peptidnek rekombináns fehérjék nyers extraktumból történő elkülönítésére való használhatóságát a következő, rekombináns E. co/í-ban kifejezett kimérák és HÍV RNáz H mint modellfehérje alkalmazásával szemléltethetjük. Az 1 -es számú HÍV RNáz H/mcp. a 2-es számú HÍV RNáz/mcp es a 3-as számú HÍV RNáz H/mcp fúziós fehérjék mindegyikét tisztítjuk.
Az IMAC oszlopokat a következőképpen készítjük. A Pharmacia cégtől származó, kelátot képező Sepharose Fást Flow adszorbenst egy zsugorított üvegszűrőn Milli-Q vízzel alaposan mossuk. A gélt ezután ismét vízben szuszpendáljuk, így zagyot kapunk. Ebből 6 ml-t (1x7 cm) óvatosan egy üvegoszlopba (Pharmacia) töltünk. A gél leülepedése után az oszlopot 5 térfogat 50 mmólos. 8-as pH-jú etilén-diamino tetraecetsav-oldattal, aztán 5 térfogat 0,2 N nátrium hidroxid-oldattal és Milli-Q vízzel mossuk. Az oszlopra ezután 5 térfogat 50 mmólos nikkel-szulfát /vagy cink-klorid vagy réz-szulfát) oldatot viszünk. Az oszlopot végül 5 ágytérfogatnyi egyensúlybahozó pufferrel mossuk. Az egyensúlybahozó puffer 20 mM-os, 8,0-as pH-jú triszpuffer, amely 500 mm nátrium-kloridot, 1 mM PMSFet, 1 mM benzamidint, 10 mg/liter leupeptint és 10 mg/liter aprotinint tartalmaz.
Az oszlopot legalább 5 térfogat egyensúlybahozó pufferrel hozzuk egyensúlyba. 5-10 ml nyers rekombináns E. coli extraktumot viszünk az oszlopra gravitáció segítségével. Miután az összes nyers anyag az oszlopba ért, az oszlopot 10 oszloptérfogat egyensúlybahozó pufferrel mossuk, amely 8,0-as pH-jú, és az 500 mM nátrium-klorid helyett 1,0 M nátrium-kloridot tartalmaz .
Az oszlopot aztán imidazolt egyre növekvő koncentrációban tartalmazó, 8,0-as pH-jú egyensúlybahozó pufferrel eluáljuk. A korábbi kísérletek során minden alkalommal számos elúciót végeztünk annak a koncentrációnak a meghatározására, amelynél a kimérás peptid eluálódik, később ezt az elúciót egyszerűsítettük, és általában csak három imidazol koncentrációt, azaz 35 mM. 100 mM és 300 mM koncentrációjú, 8,0-as pH-jú egyensúlybahozó pufferrel készült imidazol oldatot alkalmazunk. Végül 5 ágytérfogatnyi 50 mmólos. 8,0-as pH-jú EDTA-oldatot engedünk át az oszlopon annak meghatározására, hogy van-e még kötött fehérje az adszorbensen. Az oszlopon az átfolyási sebesség 1,0 ml/perc. 5 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopokkal szobahőmérsékleten dolgozunk.
A minták fehérjetartartalmának meghatározására a kereskedelemben kapható Pierce fehérjemeghatározó készletet használjuk.
A HÍV RNáz H aktivitást Becerra, S. P. és munkatársai által a FEBS 270(1,2):76-80 (1990. szeptember) irodalmi helyen leírt eljárásával határozzuk meg, anelyre ezúton is utalunk.
Az N-terminálison hosszabbított fúziós fehérjék érett fehérjékké való alakítása A kereskedelemben kapható, humán placentából származó, 5200 mU/mg fehérje fajlagos aktivitású tisztított DPPIV enzimet (Enzyme Systems Products, Dublin, Ca.) használunk. 1 egység (U) 1 mikromol szintetikus szubsztrát, Ala-Pro-7-amino-4-2-trifluor-metil-kumarin
7,8-es pH-értéken 1 perc alatt történő hidrolíziséhez szükséges enzimmennyiség. Az enzimatikus átalakítást úgy végezzük, hogy kb. 1-100 mg fúziós fehérjét 1-10 mg/ml koncentráció mellett 25°C-on, 30 percig DPP IVgyel, 1:100 enzim:szubsztrát arányt alkalmazva inkubálunk. A kívánt polipeptidet a hasítatlan fúziós fehérje mellől IMAC eljárással különítjük el. Az azonosságot N terminális szekvenciaanalízissel bizonyítjuk.
HU 211 572 A9
6. példa bGRF analóg előgyógyszerek emésztése szarvasmarha plazmában vitro
Az 1. táblázat foglalja össze azokat a kísérleteket, amelyek a [Leu27]-bGRF(l-29)NH2 (5-ös azonosítási számú szekvencia) magpeptid három N-terminálisan hosszabított analógjából, azaz a Tyr'4-Ala_3-Tyr'2Ala-1-{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2] (19-es azonosítási számú szekvencia), Ile_2-Ala_1-{[Leu27]-bGRF(l29)NH2} (18-as azonosítási számú szekvencia), Tyr-2Ala~1-{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2] (25-ös azonosítási számú szekvencia) fúziós fehérjékből szarvasmarha plazmában való inkubálással, in vitro történő szabaddátételét mutatják be. Az inkubációs elegyekben csupán azok a metabolitok voltak kimutathatók, amelyek a DPPIV enzimmel való hasítás során keletkeztek.
A TyrJ*-Ala~3-Tyr_2-Ala_l-{[Leu27]-bGRF (129)NH2} (19-es azonosítási számú szekvencia) az idők folyamán szekvenciálisán Tyr2-Ala'-{ [Leu27]-bGRF (1—29)NH2} (25-ös azo nosítási számú szekvenciájú) peptiddé, [Leu27]-bGRF(l-29)NH2 (5-ös azonosítási számú szekvenciájú) magpeptiddé és végül [Leu27]bGRF(3-29)NH2 (24-es azonosítási számú szekvenciájú) peptiddé alakult.
A Tyr2-Ala-'-{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2] (25-ös azonosítási számú szekvencia) [Leu27)-bGRF(l-29)NH2 képletű. az 5-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő magpeptiddé, majd a 24-es azonosítási számú szekvenciával azonos szerkezetű [Leu27)-bGRF(3-29)NH2 peptiddé alakul. Magát az 5-ös azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű [Leu27] bGRF(l29)NH2 magpeptidet a plazma DPP-IV enzimje a 24-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű [Leu27]-bGRF(3-29)NH2 peptiddé alakítja.
Noha a kísérletben alkalmazott HPLC körülmények között más metabolitot nem figyeltünk meg, a [Leu27]bGRF(3-29)NH2 (24-es azonosítási számú szekvenciájú) peptid az idők folyamán eltűnt, ami arra utal, hogy más, nem DPP-IV enzimmel kapcsolatos proteolízisnek is végbe kell mennie, de szignifikánsan kisebb sebességei. Nemcsak a DPP-IV-gyel hasítható előgyógyszerekből származtatott mag bGRF peptid volt kimutatható, hanem a fúziós fehérjéből származó magfehérje félideje is meghosszabbodott az in vitro, közvetlenül marhaplazmával inkubált magpeptid (5-ös azonosítási számú szekvencia) felezési idejéhez képest (1. táblázat). Emellett, az az időtartam, ameddig az előgyógyszerből felszabaduló magpeptid jelen van, összefüggésben látszik lenni az előgyógyszer hosszabbító részének hosszával: a hosszabbító részben négy aminosavat tartalmazó előgyógyszerből (19-es azonosítási számú szekvenciából) származtatott 5ös azonosítási számú szekvencia félideje hosszabb volt, mint azé, mely a hosszabbító részben csupán két aminosavat tartalmazó proGRF-ből, például a 18-as vagy 25-ös azonosítási számú szekvenciából származott.
7. példa bGRF analóg előgyógyszerek in vivő és in vitro biológiai aktivitása.
Amint az a 2. táblázatban látható, a plazma növekedési hormon (GH) szintje megemelkedett, amikor Holstein növendék marháknak intravénás injekció formájában a 18-as azonosítási számúnak megfelelő szekvenciájú analógot adtunk be. 0,2 nmol/kg testtömeg dózisnál a plazmában a hormonszint növekedése összemérhető volt azzal az értékkel, amely a magpeptid (5-ös azonosítási számú szekvencia) iv injektálása hatására alakult ki. Fontos hangsúlyozni, hogy a 18-as azonosítási számú szekvenciával rendelkező hosszabbított peptid az 5-ös azonosítási számúnak megfelelő szekvenciájú magpeptid potenciáljának csak mintegy 5%-ával rendelkezett, amikor a két fehérje GH felszabadító hatását in vitro, hipofízis sejtben vizsgáltuk. Ezért, ezen két peptid in vivő körülmények között mutatott hasonló aktivitása arra enged következtetni, hogy a magpeptid in vivő felszabadult a hosszabbított pepiidből.
Ugyanilyen GH felszabadulás-változást figyeltünk meg in vivő akkor is, amikor négy aminosavmaradékból álló hosszabbítást tartalmazó bGRF előgyógyszerekkel végeztük a kezelést, az eredményeket a 3. táblázat mutatja. Nem volt jelentős különbség az in vivő indukált GH felszabadulásban a hosszabbító részben 4 vagy 2 aminosavat tartalmazó (19-es és 18-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezet) előgyógyszerekkel történő kezeléskor, annak ellenére, hogy ebből a két bGRF előgyógyszerből származtatott magpeptid felezési ideje in vitro mérve jelentős eltérést mutatott, amint az az 1. táblázatban látható. Az in vivő növekedési hormon felszabadulás gyors volt, és azonos mértékű a magpeptid (5-ös azonosítási számú szekvencia) és a 15-es és 18-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű peptidek esetében, és a bGRF analógok beadását követően a GH maximum eléréséhez szükséges időben sem mutatkozott különbség.
Ezeket az eredményeket úgy értelmezzük, hogy a GH gyors felszabadulása az előgyógyszerből annak köszönhető, hogy a szövet és szerv DPP IV szintje nagyon magas, kb. százszor nagyobb a plazma DPP-IV koncentrációjánál. Ez magyarázza az előgyógyszer in vivő emésztésének sebessége és az 1. táblázatban öszszefoglalt in vitro kísérletekben megfigyelt hasítási sebesség közötti különbséget. Az is valószínű, hogy az előgyógyszer prekurzorból származtatott magpeptid felezési ideje in vivő meghosszabbodott, de nem annyira, hogy megváltozott (hosszabbodott) növekedési hormon felszabadulást eredményezzen. Ismert, hogy a GH felszabadulást in vivő a bGRF stimuláló hatása és a szomatosztatin (szomtatotropin felszabadulását gátló faktor, SRIF) gátló hatása befolyásolja. Moseley és munkatársai takarmánnyal táplált növendékmarha modelljében [(J. Endocr. 17, 253-259 (1988)] az állatoknak intravénás injektálással GRF-et adtak be az etetés előtt két órával, mivel a hipofízis jobban reagál a GRF kihívásra etetés előtt, mint etetés után. Az etetéssel párosuló tényezők, így például a bél/hasnyálmirigy SRIF felszabadulása hatással lehet a hipofízis növekedési hormont felszabadító képességére. Más szóval, nem szabadul fel GH a hipofízisből még GRF jelenlétében sem. ameddig az SRIF túlsúlyban van. Normális esetben a kezeletlen, takarmánnyal táplált növendék13
HU 211 572 A9 marha modellben a szérum GH koncentráció az etetés után 3-6 óra (úgynevezett vályú periódus) alatt alapszintre csökken, majd egy másik exogén epizódszerű GH pulzus jelentkezik az etetést követő 5. és 8. óra közötti periódusban. Az etetés előtt 2 órával kapott GRF injekció hatására a GH válasz gyorsan, 5-20 perc alatt megjelenik, és a GH szint 120-240 percig emelt marad az alapvonalra való visszatérés előtt. Az eddig vizsgált GRF előgyógyszerek esetében csak az első exogén GH csúcs növekedett meg, a második semmilyen változást nem mutatott a kezelések hatására. Lehetséges, hogy a mi kísérleteinkben az előgyógyszerekből származó mag-GRF felezési ideje nem volt elég hosszú ahhoz, hogy a magpeptid a keringésben olyan koncentrációban legyen jelen, amely az exogén GH második exogén kitörésére hatással van, általában az elsőt követő 4-6 óra elteltével.
Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az eredményeink alátámasztják az előzőekben ismertetett előgyógyszer elképzelést, mert (i) a DPP-IV-gyel hasítható N-terminális hoszszabbító részt tartalmazó bGRF előgyógyszerek szarvasmarha plazmában in vitro. DPP-IV által közvetített hasítással sikeresen alakíthatók magpeptid(ek)ké; (ii) az előgyógyszerekből származó magpeptidek in vitro felezési ideje szignifikánsan megnövekedett, és az előgyógyszerben levő N-terminális hosszabbító rész hosszúságától függött; (iii) az a tény. hogy a bGRF előgyógyszerek nagyon alacsony saját potenciállal in vivő a magpeptiddel azonos hatékonyságot mutattak a GH felszabadításában, arra utal, hogy a magpeptid nagy valószínűséggel in vivő képződik, ahogy azt korábban is már gondoltuk.
8. példa
Gly-'-Pro^-Ile^-Pro-' -{[Leu21] bGRF(l29)NHj-trifluor acetát-só előállítása
A 26-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluorecetsavas só formájában), az A) eljárás szerint, a PCT/US9O/O2923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,16 (4); Thr 1,07 (1); Ser 1,81 (2); Glu 2,07 (2);
Pro 1,98 (2); Gly 1,99 (2); Alá 2,99 (3); Val 1,13 (1);
Ile 2.84 (3); Leu 5,08 (5); Tyr 1,93 (2); Phe 0,96 (1);
Lys 2,04 (2); Arg 2,97 (3);
9. példa
Tyr^-Ala-^-Gli^-Pro^-lle^-Pro-'/lLeu21} bGRF l J-29)NH2] trifluor-acetát-só előállítása A 27-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 6-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
3. sz. H-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-Asp-AlaIle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,04 (4); Thr 1,03 (1); Ser 1,74 (2) ; Glu 2,05 (2); Pro 1,99 (2); Gly 2,00 (2); Alá 4,01 (4); Val 1,28 (1); Ile 2,84 (3); Leu 5,09 (5); Tyr 2,94 (3) ; Phe 0,97 (1); Lys 2,07 (2); Arg 3,00 (3).
J0. példa
Lys~s-Pro~7-Tyr6-Alar5-Gly~4-Pm~3Ile~2Pm~}{[Leu27] bGRF (l-29)NHfl-trifluor-acetát-só előállítása
A 28-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 7-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-Ala-AspAla-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NHi (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US9O/O2923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,04 (4); Thr 0,95 (1); Ser 1,78 (2) ; Glu 2,04 (2); Pro 2,91 (3); Gly 1,98 (2); Alá 3,91 (4) ; Val 0,96 (1): Ile 2,86 (3); Leu 5,08 (5); Tyr 3,06 (3) ; Phe 0,97 (1); Lys 3,06 (3); Arg 3,08 (3).
11. példa
Gly^-Pro--'-Tvr-2-Ala-,-f[Leu27l bGRF (129)NH2l-trifluor-acetát-só előállítása A 29-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
6. sz. Gly-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr-AlaAsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Aig-Lys-Val-Leu-GlyGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-LeuAsn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,01 (4); Thr 0,96 (1); Ser 1,80 (2); Glu 2,02 (2); Pro 0,97 (1); Gly 1,98 (2); Alá 3,91 (4); Val 0,99 (1); Ile 1,89 (2); Leu 5.08 (5); Tyr 3,05 (3) Phe 0,98 (1); Lys 2.03 (2); Arg 3,06 (3).
12. példa
Tyr-6-Ala-5-Gly^-Pro-2-Tyr-2-Ala-'-/[Leu27] bGRF (1-29)NHA-trifluor-acetát-só előállítása A 30-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 8-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
7. sz. Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-AlaIle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GlnLeu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn14
HU 211 572 A9
Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,07 (4); Thr 0,96 (1); Ser 1,79 (2); Glu 2,02 (2); Pro 0,99 (1); Gly 1,95 (2); Alá 4,80 (5); Val 0,96 (1); lle 1,87 (2); Leu 5,09 (5); Tyr 4,11 (4); Phe 0,97 (1); Lys 2,06 (2); Arg 3,08 (3);
13. példa
Lys^-Pro^-Tyr^-Ala^-Gly^-Pro^-Tyr^-Alar'{[Leu27] bGRF (l-29)NH2]-trifluor-acetát-só előállítása
A 31-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 9-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
8. sz. Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-AlaAsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuGly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IleLeu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,06 (4); Thr 0,95 (1); Ser
1,78 (2) Glu 2.01 (2); Pro 1,95 (2); Gly 1,96 (2); Alá
4,81 (5); Val 0.95 (1); lle 1,87 (2); Leu 5,09 (5); Tyr
4,12 (4); Phe 0,96 (1); Lys 3,08 (3); Arg 3,10 (3).
14. példa
Phe-i0-Ala-9-Lxs-s-Pro-''-TyC(,-Ala-3-Gly^-Pro-3Tyr2-Ala-}-HLeu27] bGRF (1-29)NH j-trifluoracetát-só előállítása
A 32-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 10-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
9. sz. Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-AlaTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,16 (4); Thr 1,01 (1); Ser 1,89 (2); Glu 2,08 (2); Pro 1,91 (2); Gly 1,93 (2); Alá 5,72 (6); Val 0,97 (1); lle 1,90 (2); Leu 5,09 (5); Tyr 4,09 (4); Phe
1,99 (2); Lys 3,08 (3); Arg 3,04 (3).
75. példa
Gly12-Pro' -Phe~' °-A la^-Lys^-Pro^-Tyr^-A la~5GÍy^-Pro-3-Tyr2-Ala-' -{[Leu27] bGRF (129)NH2j-trifluor-acetát-só előállítása
A 33-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 11-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
10. sz. Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-TVr-Ala-Gly-ProTyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,08 (4); Thr 0,96 (1); Ser 1,79 (2); Glu 2,07 (2); Pro 2,88 (3); Gly 2,94 (3); Alá 5,74 (6); Val 0,96 (1); lle 1,88 (2); Leu 5,13 (5); Tyr 4,11 (4); Phe 1,99 (2); Lys 3,10 (3); Arg 3,09 (3).
76. példa
Vat~'4-Pro~} 3-Gly-' 2-Pro~'1 -Phe~'°-Ala-9-Lys-(’Pro-7-Tyr6-Ala-5-Gly^-Pro-3-Tyr2-Ala-'-[[Leu27] bGRF (l-29)NHi]-trifluor-acetát-só előállítása A 34-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 12-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
11. sz. Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-AlaGly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjlik elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,04 (4); Thr 0.96 (1); Ser 1,81 (2); Glu 2,04 (2);
Pro 3,80 (4); Gly 2,99 (3); Alá 5.92 (6): Val 1,98 (1);
lle 1,89 (2); Leu 5,10 (5); Tyr 4,09 (4); Phe 1,99 (2);
Lys 3,06 (3); Arg 3,08 (3).
7. példa
Arg-'6-Pro-]5-Vat-'4-Pro-'3-Gly-'2-Pro--Phe-'°AlaT^-Lys-^-Pro-7-Tyrb-Ala---Gly-4-Pro-3-Tyr~2Ala-'-[[Leu27] bGRF (1 -29)NH2)-trifluor-acetátsó előállítása
A 35-ös számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amely a 13-es számú szekvenciának megfelelő hosszabbító részt tartalmaz, és amelynek képlete:
12. sz. Arg-Pro-Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-ProTyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-PheThr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCTZUS90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4.10 (4); Thr 0.98 (1); Ser 1,84 (2); Glu 2.03 (2); Pro 4,82 (5); Gly 2,97 (3); Alá 5,91 (6); Val 1,99 (1) ; lle 1.88 (2); Leu 5,09 (5); Tyr 4,10 (4); Phe 1,98 (2) ; Lys 3,03 (3); Arg 4,09 (4).
HU 211 572 A9 / 8. példa
Val-2-Ala-'-{[Leu21} bGRF(l-29)NH2}-trifluoracetát-só előállítása
A 36-os azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
14. sz. Val-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-üe-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluorecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp
3,98 (4); Thr 0,89 (1); Ser 1,76 (2); Glu 2,02 (2); Gly 1,05 (1) ; Alá 3,87 (4); Val 1,85 (2); lle 1,77 (2); Leu 5,17 (5); Tyr 2,04 (2); Phe 0,97 (1); Lys 2,07 (2); Arg 3,06 (3).
19. példa
Tyr2-Thr'-í[Ala'5 Leu21] bGRF(l-29)NH2}-trifluor-acetát-só előállítása
A 37-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
15. sz. Tyr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,06 (4); Thr 1,86 (2); Ser 1,77 (2); Glu 2,07 (2); Alá 3,98 (4); Val 1,08 (1); lle 1,89 (2); Leu 5,14 (5); Tyr 2,94 (3); Phe 0,96 (1); Lys 1,99 (2); Arg 3,04 (3).
20. példa
Tyr-2-Thr-'-/Hle2 Alá'5 Leu21] bGRFtl-29)NH2}trifluor-acetát-só előállítása A 38-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
16. sz. Tyr-Thr-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US590/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,07 (4); Thr 1,87 (2); Ser 1,75 (2); Glu 2,07 (2) ; Alá 2,94 (3); Val 1,09 (1); lle 2,87 (3); Leu 5,12 (5); Tyr 2,92 (3); Phe 0,96 (1); Lys 2,00 (2); Arg 3,05 (3) .
21. példa
Tyr'-Thr'-HThr2 Alá'5 Leu21] bGRF(l-29)NH2jtrifluor-acetát-só előállítása A 39-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
17. sz. Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyz-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(trifluor
-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,05 (4); Thr 2,68 (3); Ser 1,77 (2); Glu 2,07 (2); Alá 2,90 (3); Val 1,08 (1); lle 1,89 (2); Leu 5,20 (5); Tyr 2,87 (3); Phe 0,93 (1); Lys 2,01 (2); Arg 3,07 (3).
22. példa
Ty^-Ser-'-ÍIThr2 Alá'5 Leu21] bGRF(l-29)NH2jtrifluor-acetát-só előállítása A 40-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
18. sz. Tyr-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,11 (4); Thr 1,82 (2); Ser 2,64 (3); Glu 2,05 (2); Alá 2,90 (3): Val 1,04 (1); lle 1,87 (2); Leu 5,16 (5); Tyr 2,92 (3); Phe 0.94 (1); Lys 2,01 (2); Arg 3,04 (3).
23. példa
Tyi^-Thr^-Tyr^-Thr-'-ílThr2 Alá'5 Leu21] bGRF(l-29)NH2)-trifluor-acetát-só előállítása A 41-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete:
19. sz. Tyr-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-PheThr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon, lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,06 (4); Thr 3,66 (4); Ser 1,85 (2); Glu 2,05 (2); Alá 2,93 (3); Val 1,09(1); lle 1,91 (2); Leu 5,15 (5); Tyr 3,91 (4); Phe 0,95 (1); Lys 2.0 (2); Arg 3,04 (3).
24. példa
Tyr2-Ala-'-jlLeu21] bGRF(l-29)NH2j-trifluoracetát-só előállítása
A 42-es azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluor-ecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US90/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 4,01 (4); Thr 0,97 (1); Ser 1,88 (2); Glu 2,00 (2); Gly 1,02 (1); Alá 3,88 (4); Val 0,97 (1); lle 1,86 (2); Leu 5.03 (5); Tyr 3.03 (3); Phe 0,96 (1); Lys 2,18 (2); Arg 3.03 (3).
HU 211 572 A9
25. példa
Tyr^-Ala-'-Tyri-Ala-'-([Leu21 ] bGRF(I29)NH2J-trifluor-acetát-só előállítása A 43-as azonosítási számú szekvenciának megfelelő szerkezetű GRF analóg peptidet, amelynek képlete 5 13. sz. Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (trifluorecetsavas só formájában), az (A) eljárás szerint, a PCT/US9Q/02923 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon lépésenként állítjuk elő. Az aminosavanalízis eredménye a következő, az elméleti értékek zárójelben szerepelnek: Asp 3,97 (4); Thr 0,90 (1); Ser 1,74 (2); Glu 1,98 (2); Gly 1,04 (1); Alá 4,85 (5); Val 0,91 (1); Ile 1,77 (2); Leu 5,13 (5); Tyr 4,14 (3); Phe 0,99 (1); Lys 2,07 (2); Arg 3,05 (3)
1. táblázat
A kiválasztott GRF analógok in vitro potenciája és in vitro plazmastabilitása
| Peptidszekvencia | A szekvencia azonosító száma | In vitro hatás* | In vitro plazma t]/2** (perc) |
| A peptid+ | 5 | 1,00 | 24,8 (1. kísérlet) |
| B peptid+ | 18 | 0,045 | 43,2 (1. kísérlet) |
| C peptid* | 25 | 0,13 | 38,5 (1. kísérlet) |
| D peptid* | 19 | 0,052 | 297,1# (2. kísérlet) |
A peptideket in vitro marha adenohipofízis sejttenyészetben vizsgáltuk Fríedman és munkatársai által leírt módon [Int. J. Peptide and Protein Rés. 37:14-20(1991)].
A peptideket 30 mikromólos koncentrációban marhaplazmában in vitro inkubáltuk 37 'C-on. Kubiak és munkatársai közleményében [Drug
Met. Disp. 17:393-397 (1989)] ismertettek szerint. Az értékeket a közvetlenül plazmában inkubált vagy a 18-as. 25-ös és 19-es azonosító 27 számú szekvenciának megfelelő szerkezetű hosszabbított polipeptidből származtatott 5-ös azonosító számú szekvenciára, a [Leu ]bGRF( l-29)NH2 pepiidre vonatkoztatott felezési idők formájában adjuk meg.
# A 19-es szekvenciaazonosítási számú peptidet a [Leu27] bGRF(l-29)NH2 (5-ös azonosító számú szekvencia) peptiddel együtt egy eltérő marhaplazma fürdőben vizsgáltuk. Az 5-ös azonosító számú szekvencia felezési ideje ebben a plazmamintában 50,2 perc volt.
+ A peptid: [Leu27)-bGRF(l-20)NH2
B peptid: Ile_2-Pro '-[[Leu27]-bGRF( 1-2O)NH2)
C peptid: Tyr’2-Ala-|-([Leu27]-bGRF(l-2O)NH2)
D peptid: Tyr~‘-Ala'3-Tyr2-Ala1-( [Leu27]-bGRF( 1-2O)NH2)
2. Táblázat
A (Leic7]-bGRF(1-29)NH2 (5-ös azonosító számú szekvencia) és lle~2-Pro~!-( [Leu27 ] bGRF( 1-29)NH2) (18-as azonosító szekvencia) különböző, intravénás injekció formájában adott dózisaira adott szérum GH válaszok takarmánnyal táplált Holstein növendékmarhákban*
| Kezelés | Dózis nmol/kg | Választ adó állatok száma | Csúcs magasság (ng/ml) | A csúcs eléréséhez szükséges idő (perc) | A 0-8 óra alatti terület (U) | |||
| Aa | Ba | Aa | Ba | Aa | Ba | |||
| Sóoldat | 0 | 0b | 32,4b | 32,4b | 89b | 89b | 4,3b | 4,3b |
| B peptid* | 0,02 | 8/10c | 71,2bc | 76,9b-c | 23c | 18c | 4,6bc | 5,0bc |
| A peptid* | 0,20 | 9/10c | 119,8C | 130,9C | 23c | 14c | 6,8d | 7,0d |
| B peptid* | 0,20 | 10/10c | 101,4cd | 101,4C | 26c | 26c | 6,3cd | 6,3cd |
| B peptid* | 20,0 | 10/10c | 137,8d | 137,8C | 23c | 23c | 10,le | 10,le |
| SEM | 0,04 | 9,1 | 9,4 | 8 | 8 | 0,3 | 0,3 | |
| p-érték | 0,0001 | 0,007 | 0,007 | 0,04 | 0,03 | 0,0001 | 0,0001 |
Az állatoknak a peptidek feltüntetett dózisát 2 órával az etetés előtt adtuk be intravénás injekció formájában, és a Moseley és munkatársai által a Endocrinology 117:253-259 (1988) irodalmi helyen leírt módszer szerint jártunk el.
+ B peptid: 18-as azonosító számú szekvencia A peptid: 5-ös azonosító számú szekvencia a Az A analízis minden növendékmarhát magába foglal, a B analízis viszont csak a GRF injekcióra választ adó és kontroll állatok figyelembevételével készült.
b. c. d. e Az egy oszlopban különböző felső indexszel ellátott értékek szignifikánsan különbözőek (P <0,05).
HU 211 572 A9
3. Táblázat
A [Leu27]-bGRF( J-29)NH2 (5-ös azonosító számú szekveacia) a Tyr^-Ala~7-T\r2-Ala~1 /[Leu27] bGRF( 1-29)NH2) (19 azonosító számú szekvencia) különböző, intravénás injekció formájában beadott dózisaira adott szérum GH válaszok takarmánnyal táplált Holstein növendékmarhákban*
| Kezelés | Dózis nmol/kg | Választ adó állatok száma | Csúcsmagasság (ng/ml) | A csúcs eléréséhez szükséges | A 0-8 óra alatti terület (U) | |||
| Aa | Ba | Aa | Ba | Aa | Ba | |||
| Sóoldat | 0 | 30,9b | 30,9b | 45b | 45b | 3,9b | 3,9b | |
| A peptid+ | 0,02 | 9/12cd | 91,9C | 101,3C | 41b | 20c | 4,7b,c | 4,7b,c |
| D peptid+ | 0,02 | 10/12cd | 88,5C | 92,4C | 30b | 22c | 4,8C | 4,4b,c |
| A peptid+ | 0,20 | 1 l/12d | 79,3C | 79,lbc | 21c | 18c | 5,4C | 5,3C |
| D pepii d+ | 0,20 | 7/12C | 97,4C | 120,1 | 63b | 83c | 5,4C | 5,4c,d |
| D peptid+ | 0,20 | 9/12c-d | 74,5C | 70,8bc | 24b | 18c | 6,9a | 6,8d |
| SEM | 0,10 | 15,9 | 17,3 | 14 | 8 | 0,4 | 0,4 | |
| p-érték | 0,0001 | 0,06 | 0,06 | 0,28 | 0,11 | 0,0008 | 0,007 | |
| EMS | 0.1117 | 3042 | 3623 | 2260 | 763 | 2281 | 2483 |
Az állatoknak a peptidek feltüntetett dózisát 2 órával az etetés előtt adtuk be intravénás injekció formájában, és a Moseley és munkatársai által a J Endocrinology 117:253-259 (1988) irodalmi helyen leírt módszer szerint jártunk el + D peptid: 19-es azonosító számú szekvencia, A peptid: 5-ös azonosító számú szekvencia a Az A analízis minden növendékmarhát magába foglal B analízis viszont csak a GRF injekcióra választ és kontroll állatok figyelembevételével készült.
b. c. d Az egy oszlopban különböző felső indexszel ellátott értékek szignifikánsan különbözőek (P 0,05)
A szekvenciák felsorolása (A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav
1-es azonosítási számú szekvencia: (D) Topológiája: lineáris (i) A szekvencia jellemzői: (xi) A szekvencia leírása:
| Tyr | Val | Asp | Ala | Ile | Phe | Thr | Ser | Ser | Tyr | Arg | Lys | Val | Leu | Ala |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Gin | Leu | Ser | Ala | Arg | Lys | Leu | Leu | Gin | Asp | Ile | Leu | Ser | Arg | Gin |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Gin | Gly | Glu |
2-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 40 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (xi) A szekvencia leírása:
| Tyr | Ile | Asp | Ala | Ile | Phe |
| 1 | 5 | ||||
| Gin | Leu | Ser | Ala | Arg 20 | Lys |
| Gin | Gly | Glu | Arg | Asn 35 | Gin |
| Thr | Ser | Ser | Tyr 10 | Arg | Lys | Val | Leu | Ala 15 |
| Leu | Leu | Gin | Asp | Ile | Leu | Ser | Arg | Gin |
| 25 | 30 | |||||||
| Glu | Gin | Gly | Ala |
3-as azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 29 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (BJ Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Ala Asp Ala Ile 1 5
Gin Leu Ser Ala Arg
Phe
Lys
Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala 10 15
Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa 25
HU 211 572 A9
4- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői;
(A) Hossza: 29 (B) Típusa; aminosav (D) Topológiája: lineáris
Tyr Ile Asp Alá Ile Phe Thr 1 5
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu 20
5- ös azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői;
(A) Hossza: 29 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
Tyr Alá Asp Alá Ile Phe Thr 1 5
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu 20
6- os azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 6 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Tyr Alá Gly Pro Ile Pro 1 5
7- es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 8 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Ile Pro 1 5
8- as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 6 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá 1 5
Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr 1 5
12-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 14
Val Pro Gly Pro Phe Alá Lys 1 5 (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Alá 10 15
Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa 25 (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa29 (xi) A szekvencia leírása:
Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly 10 15
Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa 25
9-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 8 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá 1 5
10-es azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 10 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá 15 10
U-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 12 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Alá Gly Pro Tyr Alá 10 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Pro Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá 10
HU 211 572 A9
13-as azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői;
(A) Hossza: 16 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris A szekvencia leírása:
Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Alá Lys Pro Tyr Alá Gly Pro 15 10
Tyr Alá 15
14-es azonosítási számú szekvencia: (ix) Jellegzetessége:
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált argininil- |
| (A) Hossza: 29 | maradék | |
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa29 | |
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | |
| Tyr Thr Asp Alá | Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu | Ala |
| 1 | 5 10 | 15 |
Gin Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp Ile Leu Asn Xaa 20 25
15-ös azonosítási számú szekvencia (B) Típusa: aminosav
| (i) A szekvencia jellemői: | (D) Topológiája: lineáris |
| (A) Hossza: 11 | A szekvencia leírása: |
| Met Pro Alá His Pro His | Pro His Pro His Alá |
| 1 5 | 10 |
| 16-os azonosítási számú szekvencia | (B) Típusa: aminosav |
| (i) A szekvencia jellemzői: | (D) Topológiája: lineáris |
(A) Hossza: 11 A szekvencia leírása:
Met Alá Pro His Alá His Alá His Alá His Alá
| 15 10 |
| 17-es azonosítási számú szekvencia: (B) Típusa: aminosav |
| (i) A szekvencia jellemzői: (D) Topológiája: lineáris |
| (A) Hossza: 11 A szekvencia leírása: |
| Met Gly Pro His Pro His Pro His Pro His Alá |
| 15 10 |
18-as azonosítási számú szekvencia:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
Ile Pro Tyr Alá Asp Alá Ile 1 5
Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg 20
Xaa (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31
| (xi) A szekvencia leírása: | |||
| Phe | Thr Asn Ser Tyr Arg | Lys | Val |
| 10 | 15 | ||
| Lys | Leu Leu Gin Asp Ile | Leu | Asn |
| 25 | 30 |
19-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
HU 211 572 A9
| Tyr Alá Tyr 1 Lys Val Leu Leu Ser Xaa | Alá Tyr 5 Alá Gin 20 | Alá Asp Alá Ile Phe Thr Ser Ser Tyr Arg | |||||
| 10 Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin Asp 25 | 15 Ile 30 | ||||||
| 20-as azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált argininil- | |||||
| (A) Hossza: 39 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa39 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Phe Alá Lys | Pro Tyr | Alá | Gly | Pro | Tyr Alá Tyr Alá Asp Alá | Ile | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Phe Thr Asn | Ser Tyr | Arg | Lys | Val | Leu Alá Gin Leu Ser Alá | Arg | |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Lys Leu Leu | Gin Asp | Ile | Leu | Asn | Xaa | ||
| 35 | |||||||
| 21-es azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált argininil- | |||||
| (A) Hossza: 45 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa45 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Arg Pro Val | Pro Gly | Pro | Phe | Alá | Lys Pro Tyr Alá Gly Pro | Tyr | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Alá Tyr Alá | Asp Alá | Ile | Phe | Thr | Asn Ser Tyr Arg Lys Val | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Gly Gin Leu | Ser Alá | Arg | Lys | Leu | Leu Gin Asp Ile Leu Asn | Xaa | |
| 35 | 40 | 45 | |||||
| 22-es azonosítási számú szekvencia: | (B) Típusa: aminosav | ||||||
| (i) | A szekvencia jellemzői: | (D) Topológiája: lineáris | |||||
| (A) Hossza: 10 | A szekvencia leírása: | ||||||
| Phe Alá Lys | Pro Tyr | Alá | Gly | Pro | Tyr Alá | ||
| 1 | 5 | 10 | |||||
| 23-as azonosítási számú szekvencia: | (B) Típusa: aminosav | ||||||
| (i) | A szekvencia jellemzői: | (D) Topológiája: lineáris | |||||
| (A) Hossza: 16 | A szekvencia leírása: | ||||||
| Arg Pro Val | Pro Gly | Pro | Phe | Alá | Lys Pro Tyr Alá Gly Pro | Tyr Alá | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| 24-es azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) | A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált argininil- | ||||
| (A) Hossza: 27 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa27 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Asp Alá Ile | Phe Thr | Asn | Ser | Tyr | Arg Lys Val Leu Gly Gin | Leu | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Ser Alá Arg | Lys Leu | Leu | Gin | Asp | Ile Leu Asn Xaa | ||
| 20 | 25 | ||||||
| 25-ös azonosítási számú szekvencia: | (B) Típusa: aminosav | ||||||
| (i) | A szekvencia jellemzői: | (D) Topológiája: lineáris | |||||
| (A) Hossza: 31 | (ix) Jellegzetessége: |
HU 211 572 A9 (A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Tyr Alá Asp Alá
| Ile 1 | Phe | Thr | Ser | Ser 5 | Tyr | Arg |
| Leu Xaa | Gly | Gin | Leu | Ser 20 | Alá | Arg |
26-os azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
| Gly | Pro | Ile | Pro | Tyr | Alá | Asp |
| 1 Lys | Val | Leu | Gly | 5 Gin | Leu | Ser |
| Leu | Asn | Xaa | 20 |
Lys Val
| 10 Lys Leu Leu Gin Asp Ile | 15 | ||
| Leu | Asn 30 ' | ||
| 25 | |||
| (ix) Jellegzetessége: (A) Név/kulcs: C-terminálisan maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása: | amidált argininil- | ||
| Alá | Ile Phe Thr Asn Ser 10 | Tyr | Arg 15 |
| Alá | Arg Lys Leu Leu Gin 25 | Asp | Ile 30 |
27-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 35 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa35 (xi) A szekvencia leírása:
| Tyr | Alá | Gly | Pro | Ile | Pro | Tyr | Alá | Asp | Alá | Ile | Phe | Thr | Asn | Ser |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Tyr | Arg | Lys | Val | Leu | Gly | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg | Lys | Leu | Leu | Gin |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Asp | Ile | Leu | Asn | Xaa |
28-as azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 37 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa37 (xi) A szekvencia leírása:
| Lys | Pro | Tyr | Alá | Gly | Pro | Ile | Pro | Tyr | Alá | Asp | Alá | Ile | Phe | Thr |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Asn | Ser | Tyr | Arg | Lys | Val | Leu | Gly | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg | Lys | Leu |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Leu | Gin | Asp | Ile | Leu | Asn | Xaa | ||||||||
| 35 |
29-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
| Gly | Pro | Tyr | Alá | Tyr | Alá Asp | |
| 1 Lys | Val | Leu | Gly | 5 Gin | Leu | Ser |
| Leu | Asn | Xaa | 20 |
| Alá | Ile | Phe 10 | Thr | Asn | Ser | Tyr | Arg 15 |
| Alá | Arg | Lys | Leu | Leu | Gin | Asp | Ile |
| 25 | 30 |
HU 211 572 A9
30-as azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 35 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininil-maradék (B) Elhelyezkedése: Xaa35 (xi) A szekvencia leírása:
| Tyr | Alá | Gly | Pro | Tyr | Alá | Tyr |
| 1 | 5 | |||||
| Tyr | Arg | Lys | Val | Leu | Gly | Gin |
| 20 | ||||||
| Asp | Ile | Leu | Asn | Xaa | ||
| 35 |
Alá Asp Alá Ile Phe Thr Asn Ser 10 15
Leu Ser Alá Arg Lys Leu Leu Gin 25 30
31-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 37 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris
| Lys | Pro | Tyr | Alá | Gly | Pro | Tyr |
| 1 | 5 | |||||
| Asn | Ser | Tyr | Arg | Lys 20 | Val | Leu |
| Leu | Gin | Asp | Ile | Leu 35 | Asn | Xaa |
32-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 39 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa37
| (xi) A szekvencia leírása: | |||
| Alá | Tyr Alá Asp Alá Ile | Phe | Thr |
| 10 | 15 | ||
| Gly | Gin Leu Ser Alá Arg | Lys | Leu |
| 25 | 30 |
(ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa39 (xi) A szekvencia leírása:
| Phe | Alá | Lys | Pro | Tyr | Alá | Gly |
| 1 | 5 | |||||
| Phe | Thr | Asn | Ser | Tyr 20 | Arg | Lys |
| Lys | Leu | Leu | Gin | Asp 35 | Ile | Leu |
| Pro | Tyr | Alá 10 | Tyr | Alá | Asp | Alá | Ile 15 |
| Val | Leu | Gly | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg |
| 25 | 30 |
Asn Xaa
33-as azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 41 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa41 (xi) A szekvencia leírása:
| Gly | Pro | Phe | Alá | Lys |
| 1 | 5 | |||
| Alá | Ile | Phe | Thr | Asn 20 |
| Alá | Arg | Lys | Leu | Leu 35 |
| Pro | Tyr | Alá | Gly | Pro 10 |
| Ser | Tyr | Arg | Lys | Val 25 |
| Gin | Asp | Ile | Leu | Asn 40 |
| Tyr Alá | Tyr Alá Asp 15 | |||
| Leu | Gly | Gin | Leu | Ser |
| 30 | ||||
| Xaa |
34-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 43 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa43 (xi) A szekvencia leírása:
HU 211 572 A9
| Val Pro Gly | Pro Phe | Alá | Lys | Pro | Tyr Alá Gly Pro Tyr Alá | Tyr | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Alá Asp Alá | Ile Phe | Thr | Asn | Ser | Tyr Arg Lys Val Leu Gly | Gin | |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Leu Ser Alá | Arg Lys | Leu | Leu | Gin | Asp Ile Leu Asn Xaa | ||
| 35 | 40 | ||||||
| 35-ös azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált | argininil- | ||||
| (A) Hossza: 45 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa45 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Arg Pro Val | Pro Gly | Pro | Phe | Alá | Lys Pro Tyr Alá Gly Pro | Tyr | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Alá Tyr Alá | Asp Alá | Ile | Phe | Thr | Asn Ser Tyr Arg Lys Val | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Gly Gin Leu | Ser Alá | Arg | Lys | Leu | Leu Gin Asp Ile Leu Asn | Xaa | |
| 35 | 40 | 45 | |||||
| 36-os azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált | argininil- | ||||
| (A) Hossza: 31 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa31 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Val Alá Tyr | Alá Asp | Alá | Ile | Phe | Thr Asn Ser Tyr Arg Lys | Val | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Leu Gly Gin | Leu Ser | Alá | Arg | Lys | Leu Leu Gin Asp Ile Leu | Asn | |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Xaa | |||||||
| 37-es azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált | argininil- | ||||
| (A) Hossza: 31 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa31 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Tyr Thr Tyr | Alá Asp | Alá | Ile | Phe | Thr Asn Ser Tyr Arg Lys | Val | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Leu Alá Gin | Leu Ser | Alá | Arg | Lys | Leu Leu Gin Asp Ile Leu | Asn | |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Xaa | |||||||
| 38-as azonosítási számú szekvencia: | (ix) Jellegzetessége: | ||||||
| (i) A szekvencia jellemzői: | (A) Név/kulcs: C-terminálisan | amidált | argininil- | ||||
| (A) Hossza: 31 | maradék | ||||||
| (B) Típusa: aminosav | (B) Elhelyezkedése: Xaa31 | ||||||
| (D) Topológiája: lineáris | (xi) A szekvencia leírása: | ||||||
| Tyr Thr Tyr | Ile Asp | Alá | Ile | Phe | Thr Asn Ser Tyr Arg Lys | Val | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||
| Leu Alá Gin | Leu Ser | Alá | Arg | Lys | Leu Leu Gin Asp Ile Leu | Asn Xaa | |
| 20 | 25 | 30 |
39-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
HU 211 572 A9
Tyr Thr Tyr 1
Leu Alá Gin
Thr Asp Alá 5
Leu Ser Alá 20 lle Phe Thr Asn Ser Tyr Arg 10
Arg Lys Leu Leu Gin Asp He 25
Lys Val 15
Leu Asn Xaa 30
40-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Ser Tyr 1
Leu Alá Gin
Thr Asp Alá He 5
Leu Ser Alá Arg 20
Phe Thr Asn Ser Tyr Arg 10
Lys Leu Leu Gin Asp lle 25
Lys Val 15
Leu Asn Xaa 30
41-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
| Tyr | Thr | Tyr | Thr | Tyr | Thr | Asp | Alá | He | Phe | Thr | Asn | Ser | Tyr | Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Lys | Val | Leu | Alá | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg | Lys | Leu | Leu | Gin | Asp | lle |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Leu | Asn | Xaa |
42-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 31 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa31 (xi) A szekvencia leírása:
Tyr Alá Tyr Alá Asp Alá lle 1 5
Leu Gly Gin Leu Ser Alá Arg 20
Phe Thr Ser Ser Tyr Arg 10
Lys Leu Leu Gin Asp He 25
Lys Val 15
Leu Asn Xaa 30
43-es azonosítási számú szekvencia: (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 33 (B) Típusa: aminosav (D) Topológiája: lineáris (ix) Jellegzetessége:
(A) Név/kulcs: C-terminálisan amidált argininilmaradék (B) Elhelyezkedése: Xaa33 (xi) A szekvencia leírása:
| Tyr | Alá | Tyr | Alá | Tyr | Alá | Asp |
| 1 | 5 | |||||
| Lys | Val | Leu | Alá | Gin | Leu | Ser |
| 20 | ||||||
| Leu | Ser | Xaa |
| Alá | He | Phe 10 | Tyr | Ser | Ser | Tyr | Arg 15 |
| Alá | Arg | Lys | Leu | Leu | Gin | Asp | He |
| 25 | 30 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (12)
1. A természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben egy magfehérje részN-terminálisához egy hosszabbító peptidrész C-terminálisával kovalensen kapcsolódik, a hosszabbító rész
A-X-C-Y(X‘-Y)n általános képlettel jellemezhető, amelyben
A adott esetben van jelen, és ha jelen van, akkor metionin;
55 n értéke 0-20;
X bármely, a természetben előforduló aminosav maradéka;
X’ bármely, a természetben előforduló aminosav maradéka a prolin és hidroxi-prolin kivételével:
60 Y prolin, hidroxi-prolin, alanin, szerin vagy treonin,
HU 211 572 A9 kivéve, ha n = 0, és A nincs jelen, ekkor Y alanint, szerint vagy treonint jelent.
2. Az 1. igénypont szerinti, természetben elő nem forduló olyan fúziós fehérjék, amelyekben A jeien van, és X prolin, glicin, alanin vagy szerin.
3. Az 1. igénypont szerinti olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék amelyekben n értéke 0-10.
4. Az 1. igénypont szerinti olyan, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben a biológiailag aktív polipeptid az alábbiak egyike: bGRF analógok, EGF; IGF-2, glukagon; kortikotropint felszabadító faktor; dinorfin, szomtatosztatin-14; endotelin; transzformáló növekedési faktor alfa; vazoaktív intesztinális peptid (VIP); humán béta-kazomorfin; gyomor gátló peptid; gyomor felszabadító peptid; Hl humán peptid; YY humán peptid; glukagonszerű peptid-1 7-37 fragmentum; glukagonszerű peptid-2; P anyag; Y neuropeptid; humán hasnyálmirigy polipeptid; inzulinszerű növekedési faktor-1; humán növekedési hormon; szarvasmarha növekedési faktor; sertés növekedési faktor; prolaktin; humán növekedési hormont felszabadító faktor; szarvasmarha növekedési hormont felszabadító faktor; sertés növekedési hormont felszabadító faktor; juh növekedési hormont felszabadító faktor; interleukin-lbéta; és interleukin-2
5. Az 1. igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, nmelyekben a hosszabbító peptid rész az alábbiak egyike; Gly-Pro-Ile-Pro, TyrAla-Gly-Pro-Ile-Pro, Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-IlePro. Tyr-Ala, Gly-Pro-Tyr-Ala, Tyr-Ala-Gly-Pro-TyrAla, Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Phe-Ala-LysPro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Gly-Pro-Phe-Ala-LysPro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Val-Pro-Gly-Pro-PheAla-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Arg-Pro-ValPro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-TyrAla, Tyr-Ala-Tyr-Ala, Val-Ala, Arg-Pro-Val-Pro-GlyPro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala and Met-Pro-Ala-His-Pro-His-Pro-His-Ala, Met-Ala-ProHis-Ala-His-Ala-His-Ala-His-Ala, Met-Gly-Pro-HisPro-His-Pro-His-Pro-His-Ala, Phe-Ala-Lys-Pro-TyrAla-Gly-Pro-Tyr-Ala.
6. A 2. igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló olyan fúziós fehérjék, amelyekben n értéke 3-5.
7. A 6. igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjék, amelyekben minden X’ maradék hisztidin.
8. A 7. igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló olyan fúziós fehétjék, amelyekben három Y maradék prolin.
9. Eljárás az 1. igénypont szerinti, a természetben elő nem forduló fúziós fehérjéket és szennyezéseket tartalmazó elegyből a kívánt fehérje tisztítására, amely a következő lépésekből áll:
- a fúziós fehérjék szelektív érintkeztetése olyan anyaggal, amely immobilizálja a fúziós fehérjét;
- a szennyezések eltávolítása;
- a fúziós fehérjéknek a fenti anyagtól való elválasztása;
- A fúziós fehérje DPP IV-gyel való kombinálása; és
- a kívánt fehérje elkülönítése.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, amelyben az anyag egy oszlopban van rögzítve.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, amelyben az anyag olyan antitest, amely a hosszabbító részhez kötődik.
12. A 9. igénypont szerinti eljárás, amelyben az anyag immobilizált fémionokból áll, és a hosszabbító rész legalább 3 egymást követő X’ maradékot tartalmaz, amelyek hisztidinek.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500654P HU211572A9 (hu) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9500654P HU211572A9 (hu) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211572A9 true HU211572A9 (hu) | 1995-12-28 |
Family
ID=10986564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500654P HU211572A9 (hu) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU211572A9 (hu) |
-
1995
- 1995-06-30 HU HU9500654P patent/HU211572A9/hu unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2367856C (en) | Analogs of gastric inhibitory peptide and their use for treatment of diabetes | |
| RU2114119C1 (ru) | Слитой белок и способ выделения слитого белка | |
| JP2507106B2 (ja) | インスリン様成長因子１（ｉｇｆ―１）または因子２（ｉｇｆ―２）の類縁ペプチド | |
| JP4291900B2 (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
| US20100210815A1 (en) | Insulin production methods and pro-insulin constructs | |
| TW200817432A (en) | Amidated insulin glargine | |
| JP2002506792A (ja) | Ｎ末端修飾ｇｌｐ−１誘導体 | |
| MXPA06006746A (es) | Analogos de glp-1 novedosos ligados a agentes similares a albumina. | |
| CA2747155A1 (en) | Glucagon analogues | |
| JPH0691834B2 (ja) | インシュリン誘導体の製法 | |
| JPH0586094A (ja) | ペプチドおよびその製造方法 | |
| JP2010265287A (ja) | ペプチドアミド化方法 | |
| WO2022227707A1 (zh) | 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用 | |
| TW200817511A (en) | Method for preparing insulin analogs with dibasic B chain end | |
| KR20050012717A (ko) | 수식 펩티드의 제조 방법 | |
| US5612454A (en) | Process for purification of polypeptide using a buchner funnel | |
| HU211572A9 (hu) | Fúziós polipeptidek. Az átmeneti oltalom az 1-38. igénypontra vonatkozik | |
| JP4276462B2 (ja) | 修飾ペプチドの製造方法 | |
| JPH0533993B2 (hu) | ||
| EP0431926A1 (en) | Process for producing des(64,65)-proinsulin | |
| EP0570244B1 (en) | Process for preparing peptides having a C-terminal proline amide | |
| HUT63857A (en) | Process for producing grf-analogs |