TW213923B

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Publication number: TW213923B
Application number: TW080109839A
Authority: TW
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 1993-10-01
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Description

__86 - 五、發明説明（1 ) 發明範圍本發明是有關非自然生成之融合多肽類，含有可為二狀基肽酶IV (DPP IV)解離之N -末端部份。 · 發明背景分子，生物技術，尤其是重组體DNA技術，可用於產製相當大量的欲求的生物活性多呔。再者，編碼多呔之填傳資料可修飾Μ產生相當大量的經修飾多肽。於多肽上進行之修飾作用常用來改進其活性或有助於其產製及。因此，已投注極大努力Μ決定何種修飾是欲求的’ w增加、加強或者改變欲求多肽之生物活性。此外’已進行許多研究修飾欲求之多肽為W幫_助_其產製及纯化。自然生成之多呔最初之生合成常是較大前軀體，其再經一糸列蛋白酶解離之修整而產生#終產物。因此，存在有許多蛋白酶，其可確認及解離特異的胺基酸及/或胺基酚序列。這些蛋白梅參與前軀體蛋白質至最終多肽產物之轉化作用。此種蛋白酶之一是二呔基肽酶IV (DPP IV)(EC 3, 4, 14, 5 )°DPP IV 最先由 Hopsu-Havu, V. Κ·及 G. G. Glenner ，報告於 Histo. Chemie 3 : 197-201 (1966)，且已示出存在於許多哺乳動物組織中。DPP IV目前可購自 Enzyme Systems Products (Dub 1妾:n, California) ° DPP IV可確認蛋白質N -末端之持異胺基酸序列。特言之，當 N -末端第二胺基酸是脯胺酸（pro)、羥基脯胺酸（Hyp)、 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •訂· .線. 甲 4(210X297'/：沒） 2139-3 A6 B6 五、發明説明（2 ) 丙胺酸（A 1 a )、弱胺酸（S e r )、及蘇胺酸（T h「）及N -末端殘基位置為任何胺基酸，且若脯胺酸或羥基脯胺酸非位於距N -末端第三胺基酸殘基時，則Dpp IV可自末端解離二肽。當脯胺酸或丙胺酸為距N-末端第二胺基酸時DPP IV活性較有效率，而當該位置是脯胺酸時最有效率。DPP IV於自然生成呔類之前軀體“PRO，，部份逐步解離中之活性已被廣泛報告。現代技術已可大量產製生物活性蛋白質。利用肽合成儀或於宿主细胞中利用重姐DNA技術，可合成重要的多肽。通常，生物活性蛋白質Μ藥物被投予。已有許多實例存在，其中活性蛋白質充作治療劑、預防劑使用，或以加強或遏止特徵。由於DPP IV及其他蛋^白酶可降解蛋白質，這些藥物易被降解。因此，使用生物活性多肽充作藥物之難處是其持續存在會減少，且因此必#貞頻繁地投予。可令多肽類、蛋白質及其類似物於極短時間内大量產製之重姐DNA技術，其快速的發展已引起以高效率及可預測方式分離這些蛋白質之需求，係自包括由宿主细胞所產生的及於生長培養基中之蛋白質结！量的複合混合物中分離。由宿主细胞產生之異質多肽，其純化+分昂貴且可造成蛋白質產物本身之變性。關於蛋白質纯化技術之總覽，可見美國專利案第4, 782, 137之背景技藝一段，公告於1988年 11月1日.Hopp et a丨，已列為迷案參考。為克服技藝中之限制且提供較佳方法，重組DNA技術可用來提供圼非自然生成蛋白質之欲求的多肽，其中含有一 {請先《讀背面之注意事項再填其本页) -¾. .打· 甲 4(210X 297乂沒） 2139^3 A6 B6 五、發明說明（3) 個連接子呔’可充作配體或其他用於純化方法之標的。如 •美國專利案第4,7 82,137係有關合成含抗原性連接子肽之非自然生成之肽。非自然生成之蛋白質，可通過含經固化抗Si (其可结合至抗原性連接子）之層析柱，因此分離出非自然生成之蛋白筲。美國專利案4,569,794號係有關純化非自然生成蛋白質之方法，其中含對經固化金羼具親和力之N -末端延伸部份。非自然生成蛋白質可與層析柱中經固化之金屬離子结合。在這些方法中所具有之難處是連接子肽常常是不要的，且其移去十分困難。本發明是有闞非自然生成之融合蛋白質，其含有核心蛋白質部份及可為DPP IV解離之N -末端延伸部份。依據本發明，提出一種非自然生成之蛋白^質，其中Μ核心蛋白質黏附之延伸部份，並非現實上可與核心肽黏附之Η -末端延伸部份；因此，是非自然生成之融=合蛋白質。本發明是有闞前藥，其係DPP IV可解離之非自然生成之蛋白質，其中核心蛋白質部份是生物具活性之蛋白質。本發明是有關可用於純化方法中之DPP IV可解離之非自然生成之蛋白質，因是Ν -末端延伸部份提供有助於非自然生成蛋白質纯化之特激或特性。 .本發明提出非自然生成之蛋白質，其具有可為DPP IV解離之Ν -末端延伸部份，因此將非自然生成之蛋白質暍於 DPP IV下可造成非自然生成蛋白演轉化成為欲求之蛋白質。當充作前藥使用時，非自然生成的蛋白質利用標的棰颺中所存在之DPP IV，可於活體内處理成具生物活性之蛋白 {請先《讀背面之注意事項再填寫本页) 甲 4(210X297 父角） 0 五、發明说明（4 ) 質。當用於純化方法中，非自然生成的蛋白質可利用其特異設計之末端為配體而純化，再KDPP IV處理以、除去 N -末端延伸部份並釋出欲求的蛋白質。 - 本發明可用K產製圼非自然生成蛋白質之欲求的蛋白質，之後其當與DPP IV暴荛可轉化成欲求的蛋白質。前藥利用病人之内源性DPP IV，經過一段時間後轉化成藥物’因此達到活性藥物於病人之持續存在且減少投藥頻率。利用本發明經由非自然生成蛋白質之產製及纯化可分離純的欲求蛋白質，之後於活體内M DPP IV處理非自然生成之蛋白質Μ產生欲求的蛋白質。發明要點 _ — 本發明是有關非自然生成之融合蛋白質’含有一個延伸的肽部份，在其C -末端共價鏈结=至核心蛋白質部份之Ν -末端上，該延伸肽部份具下式： Α-Χ-Υ (X ' -Υ)η 其中 Α是視所箱的，且當存在時是甲硫胺酸； η 是 0 - 20 ; X選自下列包括所有自然生成逆J胺基酸殘基； X 選自下列包括除了脯胺酸及羥基腩胺酸以外的所有自然生成的胺基酸殘基； {請先《讀背面之注意事項再填寫本页} 6 甲 4(210X297 2 沒） A6 B6 五、發明説明（5) Y選自下列包括脯胺酸、羥基脯胺酸、丙胺酸、弱胺酸及蘇胺酸|除了當η是0時則Y選自下列包括丙胺酸、弱胺酸及蘇胺酸。 - 本發明也是有關此種非自然生成蛋白質於醫學製劑中之用法，及自含有此種非自然生成蛋白質及雜質之混合物中純化欲求蛋白質之方法，方法包括以下步驟：將該非自然生成之蛋白質與可固化該非自然生成蛋白質之材料選擇<性接觸，移去雜質*自該材料中分出非自然生成之蛋白質，將該非自然生成之蛋白質與ΟΡΡ IV接觸，並分離欲求之蛋白質。資料揭示 _ — Smith et al ，於1986年2月11日公告之美國專利No. 4,569,794是f關純化蛋白質之> 法及用於此製法中之化合物。發明中描述分離融合蛋白質之方法，其在C -末端具有具生物活性之多呔，及一個金屬離子嵌合連接子之末端延伸連接子。融合呔對經固化之金臑離子有親和力。將含有融合蛋白質之混合物通過含經固化金屬離子之層析柱可除去雜質。融合蛋白質將與金屬離子相連结，而只溶離出雜質。一旦改變條件，融合肽可自經固化的金屬離子中釋出，因此生成純化的融合蛋白質。 Η 〇 p p e t a 1 ·,於1 9 8 8年1 1月1函公告的美國專利案第 4,782,137 ，揭示融合蛋白質之合成，其具有高度抗原性，I I * 之N -末端部份及位於C -末端之欲求的多肽。依據Hopp et {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 甲4(210X 297公发） A6 B6 2139?3 五、發明説明（6 ) al.,融合蛋白質可純化自粗製上清液，係將粗製上清液通過含有經固化抗體之層析柱*其係可確認融合蛋白質之抗原部份。烴固化抗體可將蛋白質保持於管柱中，而溶離出上清液中非欲求之姐份。之後改變層析g條件，K離解抗原-抗體複合物。融合蛋白質再溶離及收集。

Felix et al·,於1988年3月29日公告的美國專利案第 4,734,399號，是有闞生長激素釋放因子類似物。也揭示具有Tyr-Ala及His-Ala末端之許多類似物。然而，這些分子非融合蛋白質，而僅是核心蛋白質。Felix等人之H -末端二肽為bGRF類似物核心分子之部份。 1987年3月6日發表之歐洲專利案0 220 958 ，是有關 N -末端殘基之選擇性化學移去_ L本發明是有關可用於自欲求多肽中移去N -末端殘基之方法及方法中有用之化合物。欲求的多肽呈融合蛋白質存在，# N -末端有欲求的多肽與具式X-Pro之連接子連接。一旦融合蛋白質與特異的緩衝條件曝露後，可形成及解離融合蛋白質之X-P「〇部份之二嗣基哌嗪，由是自融合前軀體中產生欲求之多肽。ΕΡ0 220,958(’958)之融合蛋白質並不包括在本發明中，因為依據本發明，當N -末端延伸部份僅是二肽，即當A不存在，η是0且X是自然生成三胺基酸•則Y是丙胺酸、弱胺酸或蘇胺酸。因此，每逢延伸部份是二肽*其是X-Ala 、 X-Ser或X-Thr 。，958案教示：φ;Χ-Ρ「〇之化學（非酵素性）解離。二肽X-Ala 、X-Ser及X-Thr並不易感受 '95δ案所教示之化學解離型式，其解離型式係自核心蛋白甲 4 (210X297 乂沒） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .裴· .訂· •綠. A6 B6 2139^3 五、發明説明（7 ) 質中切出X-Pro延伸部份。澳洲專利案No. AU-A- 12709/88揭示融合蛋白質，其含有可用於經固化金屬親和力層析（IMAC)中之親和力肽類。所揭示之親和力肽類含有至少二個毗鄰的組胺酸殘基。所揭示之IMAC純化方法中，需有特殊的合成化學K製成氮川三醋酸（N T A )樹脂。

Tallon, M. A., et al., Biochem. 26：7767-7774 (1 987)係有闞自釀酒酵母中合成十三肽a-因子之延伸之類似物。經合成的類似物為經延伸之a-因子，其代表指導合成MFal结構基因中自然生成之前a -因子之序列。

Kriel, G. et al., Eur. J. Biochem. 111=49-58 (1 9 8 0 )描述M二基呔酶I V對布L魯士菌素前軀體（布魯士菌素原）N -末端部份之逐步解離。布魯士菌素原是蜜蜂毒液之主要姐份。於前軀體N -末端#份之胺基酸序列中，每一第二殘基是脯胺酸或丙胺酸。當布魯士菌素原與分離自豬腎之DPP IV暴露，前軀體之N -末端區即以逐步方式解離產生成熟的蛋白質。但是布魯士菌素原和本發明的融合蛋白質不同，其係一棰自然生成之蛋白質。

Julius, D., et al., Cell, Vol 32 ： 839 - 852 ( 1 983 , 3月）是有關结合於膜上之DPP IV於酵母α -因子自較大的前軀體多肽中處理之角色。酵母a-因子和本發明的融合蛋白質不同，其也是一種自然生藏之蛋白質。

Mollay, C. et al, Eur. J. Biochem. 160 :31-35 (1986)描述DPP IV自爪蟾皮膚分泌中之分離。其中論及甲4(210X 297公沒） {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •装. •打· ♦ A6 B6 2139^3 五、發明说明（8) D P P I V之活性。

Mentlein, R., FEB, Vol. 234, No. 2, ρρ· 251-256 (1988年，7月）缌覽肽激素及神經肽成熟及降解中之脯胺酸殘基。據報告，於哺乳動物中，如DPP IV之脯胺酸特異蛋白酶並末涉及於調控性呔類之生合成，但在其降解作用中則扮演重要角色。因此，可结論道雖然於脊椎動物及低等脊椎動物中前軀體蛋白質有賴DPP IVM將前軀體轉化成成熟型式，但哺乳動物中調控蛋白質之處理通常使用DPP IV為降解蛋白酶。

Frohman, L. A. et al. J. Clin. Invest. 78：906-913 (1986)報告人類生長激素釋放因子（hGRF)及其類似物，可於人類活體內及試管内為獎DP P I V快速地降解。

Frohman, L. A. et al. J. Clin. Invest. 83:1533-15 40 (1989)報f人類生長激素釋#因子（hGRF)及其類似物，可於人類活體內及試管内為血漿DPP IV快速地降解。

Kubiak, T. M., et al, Drug Metabolism and Disposition, Vol. 17，No. 4，pp. 393-397(1989)是有關牛生長激素釋放因子（bGRF)類似物於牛及豬血漿中之試管内代謝性降解作用，及與血漿DPP IV活性之相互關係。受試的bGRF類似物在N -末端第2位置上有一個/Ua殘基。據報告，血漿中bGRF之代謝性降解作用是由於血漿中存在有DPP I V。芸

Hong, W., et al, Biochemistry, 28:8474-8479 (1989)報告經轉感後，酵素活性DPP IV於中國倉鼠卵细胞 ___-10 - 甲 4(210X297 W 沒） (請先閏讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打. .綠， A6 B6 2139*^^ 五、發明說明（9 ) {請先閭讀背面之注意事項再填寫本页) 中之表現。

Kreil. G·, TIBS 15:23-26(1990, 1 )缌覽於前軀體至最终產物之轉化作用中，二肽為DPP之逐步解離。為 ICreil所述之前軀體係自然生成之蛋白質。本發明的融合蛋白質為非自然生成之融合蛋白質。 B 〇 m a n, e t a 1. , J. Biol. C h e m . 264:5852-5860 (1989)明示分離自蠶蛹之二肽基肽酶（和DPP IV有相似^之特異性），可自蠶A及B自然前軀體合成套數之N -末端，移去Ala-Pro-Glr-Pro之天然N -末端序列。由Boman揭示之前蠶素原（preprocecropin)是自然生成之蛋白質。

Dalboge, H., e t a 1 , Bio/technology, 5:16卜164(1987, 2)揭示於試_ 内將由大腸桿菌所產生之人類生長激素（hGH)前軀體轉化成真正的hGH 。前軀體之 N -末部延伸部#以二肽基肽酶I =移去。

Dalboge, Η . , e t a 1 , FEBS, V o 1 . 246(1,2):89-93(1989, 3 )揭示IL-l/S前軀體之複殖及表現，M及利用二肽基肽酶I移去前軀體之N -末端延伸部份而轉化成I L - 1 /9 。

Dalboge, H., et al, FEBS, Vol. 266(l,2)：l-3 (1990，6月）是有關N -末端甲硫胺酸於大腸桿菌中之活體内處理作用。據報告，自延伸之人類生長激素中移去N -末端甲硫胺酸，依郧接甲硫胺酸之激基酸而定。

Hopp, T. P. et al., Bio/Technol. 6:1204-1210(1988, 10月），揭示將一個8個胺基酸之肽加 _-11 - 甲 4(210X 297W 沒） 213923 A6B6 五、發明説明（10 ) 至欲求之重组體淋巴激素N -末端•权提供可用於免疫親和力纯化法中之抗原性N -末端。此案相當於上述的美國專利案第 4,782, 137 。 Smith, M. C., et al., J. Biol, Chem. Vol. 263, 15:721卜7215 (198δ)揭示實驗性结果，M支持位於小狀 NHZ末端之特異金靨嵌合性狀’可被利用於金靥離子親和力層析中Μ純化該蛋白質。此參考文獻提出關於上述美國專利案Ho· 4，569，794中實例之一'之特異數據。特言之，使用鏈结至促黃體（生成）激素釋放因子或胰島素原之金屬嵌合性狀His-Trp *使得嵌合性狀可利用IMAC純化，而不含His-Trp連接子之對照用分子則無法以類似方式回收。 Η 〇 c h u 1 i , E . et a 1 . , J . C h r o in a t. 411:177-184 (1987)揭示一種可用於金'靥嵌合$和力層析之氮川三醋酸吸附劑。其中指出，所揭示之吸附劑當充滿Hi*2，可用於结合含有毗鄰的姐胺酸殘基之肽及蛋白質。 Ljungquist, C . e t a 1. , E u r. J. B i o c h e m . 186: 563 - 569 ( 1 989 )揭示2- 4及8倍多之金羼嵌合肽Ala-His-Gly-His-Arg-Pro與含有經固化之Zn + 2離子之層析柱 —起使用。依據Ljungquist此金鼷嵌合呔與鋅層析柱之用法，可提供融合蛋白質意外地良好純化方法。發明夕詳Μ說明如此中所用的“非自然生成之融合蛋白質”、“非自然 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· *打· .綠· _ - 12 - 甲 4(210X297 W 沒） A6 B6 2139，^ 五、發明说明（11) 生成的融合多肽”、“融合多肽”及“融合蛋白質”係可交換地據現寘上通常不發生之蛋白質及多肽，旦其含有核心蛋白質部份及一個延伸部份。 . 如此中所用的“核心蛋白質”、“核心蛋白質部份”係指位於分子C -末端之融合多肽部份，且其並無延伸部份，將會是欲求的多肽及/或具生物活性之蛋白質，包括自然生成之具生物活性蛋白質及多肽、及其類似物及變種。如此中所用的“ N-末端延伸”係指始於N-末端第一個至多達約45個胺基酸，且其並非核心蛋白質一部份。如此中所用的“前藥”係指可充作藥物，其生物欲求部份是生物活性蛋白質之融合蛋白質。如此中所用的“生物活性蛋_白~質”及“生物活性多肽” 係指具有生物活性之可交換之蛋白質及多肽。如此中所用0¾ “欲求蛋白質，，為“可欲求的蛋白質，，係可交換地指被尋求之圼纯型式之蛋白質及多肽。如此中所用的“延伸部份”係指融合蛋白質的一部份’ 其是N -末端延伸部份且非生物上欲求部份中的一部份。如此中所用的“ D P P I V可解離之N -末端延伸部份”係指融合蛋白質之延伸部份，其具有可為DPP IV逐步解離而移去之胺基酸序列。在序列表中，某些胺基酸殘基在Se<! ID中已被命名為 X a a 。應用Μ下的說明： & 於Seq ID No. 3, Xaa2e代表C -末端酿胺化之精胺醢基殘基。 -13 - 甲 4(210X 297W 发） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .装· •打- •線· 2139^3 A6 B6 五、發明说明（12) 於Seq ID No. 4, Xaa2e代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 5, Xaa2S代表C -末端醸胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID Ho. 14, Xaa2e代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 18, Xa a31代表C-末端醯胺化之精胺臨基殘基。於Seq ID No. 19, Xaa33代表C-末端_胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 20,父3330代表〇末端醯胺化之精胺醯基殘基。 _ — 於Seq ID No. 21, Xaa4S代表C -末端醯胺~化之精胺醯基殘基。 ^ 於Seq ID No. 24, Xaa27代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 25, Xaa31代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 26, Xaa33代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 27, Xaa35代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。芸於Seq ID No. 28, Xaa37代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。 (請先《讀背面之注意事項再填寫本页) 甲 4(210X 297 公发） 213923 A6 B6 五、發明说明（13 ) 於Seq ID No. 29, Xaa33代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 30, Xaa35代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 31, Xaa37代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 32, Xaa3S代表C-末端醯胺化之精胺醯;基殘基。於Seq ID No. 33, Xaa4S代表c-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 34, Xaa43代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。一一於Seq ID No. 35, Xaa45代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。 … _ r- 於Seq ID No. 36, Xa a31代表C-末端醢胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 37, Xa a31代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 38, Xaa31代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 39, Xaa31代表C -末端醯胺化之精胺醯基殘基。云於Seq ID Ho. 40, Xaa31代表C -末端瞌胺化之精胺醯基殘基。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打. •綠. __-15 - 甲4(210X 297公沒） 2139^3 A6 五、發明說明（14 ) 於Seq ID No. 41, Xaa33代表C-末端醯胺化之精肢醯基殘基。於Seq ID No. 42, Xaa31代表C-末端醯胺化之精胺醯基殘基。於Seq ID No. 43, Xaa33代表C-末端醯胺化之精胺醢基殘基。本發明是有關改進之蛋白質及多肽。依據本發明，生物活性多肽先圼融合蛋白質被產製，其含有二部份：第一部份代表核心蛋白質部份；及N -末端延伸部份之第二部份，其以羥基末端共價鏈结至第一部份的胺基末端。融合多肽之N -末端延伸部份所具有之胺基酸序列，使其可接受二肽基肽酶IV (DPP IV)之解離。—— 依據本發明的融合蛋白質具有下式：延伸部份-f心蛋白質部份其中“延伸部份”代表D P P I V可解離之N -末端延伸部份； “ 一 ”代表一個共價的肽鐽；及“核心蛋白質部份”代表自延伸部份由D P P I V處理所釋出之任何欲求之肽。依據本發明融合蛋白質之延伸部份，具有依據下式之胺基酸序列： A-X-Y (X ' -Υ)n 5Γ 其中A是視所需的，且當存在時是甲硫胺酸； η代表依序鏈结之X’-Y基團之數目，數目代表有〇至 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •装· .訂· ♦ _- 16- 甲 4(210Χ297Υ 潑） A6 B6 213923 五、發明說明（15 ) (請先閱讀背面之注意事項再填窝本页) 22個此基團，較好是0至10個基圈。 X選自下列包括任何自然生成之胺基酸； Y選自下列包括脯胺酸、丙胺酸，弱胺酸及蘇胺酸，除了當η = 0 ，則Υ選自下列包括丙胺酸、弱胺酸、及蘇胺酸； X’選自下列包括除了脯胺酸及羥基脯胺酸Μ外之任何自然生成之胺基酸； -訂. 依據此式，當η = 1 ，此中有二個Υ殘基。再著，可能有多達21個Υ殘基及20個X’殘基於一個單一具體實例中。個別的Υ殘基及X'殘基，分別可為自其所選出基圈中的任一殘基。即•於一個具體實例中，所有個別的Υ殘基並不一定要相同、類似地，在具有_1 一個Μ上X’殘基之具體實例中，存在的各個個別的X'殘基可為除了脯胺酸及羥基脯胺酸Μ外的任何胺基酸殘基，而不@其他任何X’殘基為何。各個個別的γ及r殘基必須分別適順用於特殊基團之準則，且所需要的是在特殊位置上之各種個別殘基依循上文詳述之準則。 •綠. 其中（A)為甲硫胺酸（Met)之融合蛋白質代表於大腸桿菌中可利用重组DHA方法產製生物活性蛋白質之序列。存在於這些前軀體中之Met序列，通常為大腸桿菌之酵素糸统或其他某些方法所處理，此可由一般精藝者進行。在正常情況下，於大腸桿菌中蛋白質泛合成，始於指導合成 Met之轉譯起始密碼子AUG 。因此，新合成之多呔具有甲硫胺酸殘基為其N -末端胺基酸。當Met N -末端殘基所郧接甲 4(210X297·^：沒） _-17 - A6 B6 五、發明説明（16 ) 之胺基酸具有相當小的測鐽如：Gly 、Ala或Ser以及 Pro ，則大腸桿菌具有可有效移去N-末端Met之酵素活性。利用溴化氰調介之Met解離可完成N-末端Met高度特異的解離。然而為了使該步驟可成功，N-末端Met必須是整個蛋白質序列中唯一的Met ;否則解離可於序列中每個 Met後面發生。因此，對於含有内部Met序列之融合蛋白質，距H -末端第2位之胺基酸必需是Pro 、Gly 、/Ua或 Ser ，此係指若Met欲為大腸桿菌酵素糸統所移去時而言 Ο 除了融合多肽•本發明是有關重組體DNA分子，其含有編碼融合多肽之DHA序列；使用重組體DNA分子之方法；融合多肽之用法，包括純化欲_求^多呔之方法及進送藥物之方法，其包括投予前藥，而其可於活體内由N -末端延伸部份之逐步蛋白_解除去而由前軀#轉化成具生物活性型式。融合多肽之產製可利用標準的呔合成或重姐DHA技術予以完成*二者對一般精藝者均是熟知的。肽合成是製成含有50個胺基酸K下之多肽之較佳方法。對較大分子而言 •則Μ在宿主细胞中利用重姐DNA技術為較佳。

融合多肽中，其含有可為DPP IV確認及解離之Ν -末端部份者較僅含核心蛋白質部份之未經修飾多肽為有用且有益。本發明描述二個有特殊利用性之方面。第一種用法是提出所謂“前藥”之融合多肽，其含有可充作前藥之生物活性多肽，且共價鐽结至DPP IV可解離之Ν -末端延伸部份。這些原型於已投有前藥之人體或其他動物體内•可為DPP 18 甲 4 (210X297 父角） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打_ A6 B6 213923 五、發明说明（17 ) IV解離成具生物活性型式。·因此本發明是有翮可充作前藥之融合多呔，融合多肽於轚學製劑中之用法，及遞送生物活性多肽至病人之方法。依據本發明，融合多肽的第二種用法是在蛋白質纯化過程中，其中N -末端延伸部份是多肽之組份*使其可有效地進行純化方法，之後此N -末端延伸部份利用DPP IV解離。因此，本發明是有關可用於純化步驟中之融合多肽，K及純化欲求多肽之方法。這些用法;可充作賁例來說明本發明之利.用性，但不欲以任何方式限制本發明。於二種用法中，融合蛋白質之核心蛋白質部份經由DPP IV活性自延伸部份中釋出。於融合蛋白質用於純化方法之例子中，並不希望核心蛋白質_ID PP IV解離之受質。即，於延伸部份已除去後，較好DPP IV無法解離核心蛋白質。最常希望的是_核心蛋白質是DPJ>- IV受質時，其可呈前藥酸逓送。於此種例子中，前藥可造成核心蛋白質持續的存在，因為活體内（如血漿、腎姐織及肝組織）所見的某些 DPP IV可用來處理N -末端延伸部份*且因此延緩核心蛋白質之降解。即，融合蛋白質之延伸部份可充作DPP IV之受質及競爭性抑制者，延緩核心蛋白質上DPP IV之作用，由是暫時保護核心蛋白質。如此中所用的“前藥”表示一種融合蛋白質，其含有一個DPP IV可解離的N -末端延伸部激’共價结合至可充作藥物之生物活性多肽之核心蛋白質部份。依據本發明前藥之投予可呈個別的原型，或與其他化合物绲合。較佳之具體 19 甲 4 (210X297 公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .装· .打. A6 B6 五、發明説明（18) 實例係已明確定義之前藥個別型式。於任一例子中，原型為自然見於體内之自然生成的DPP IV所處理。前藥於》學製劑中投藥之優點，是其可延緩活性及/或預備以擴大生物活性蛋白質之存在。前藥可較未經修飾之分子保持更久之活性。前藥可以非活性狀態存在，直到經過一段時間後足夠的延伸部份被降解且分子變得更具活性為止。因此前藥可如延時藥物遞送糸统般作用。再者’不同的N -末端延伸部份以不同的速率降解’依據其長度及胺基酸序列中特異殘基存在而定。可提出具有各種N —末端延伸部份之不同型式前藥之混合，其可在病人體内歷一段時間後呈現活性藥物持續且穩定之水平。因此前藥可如延時藥物遞糸統般作用。 _ — 如上所述，只要某些殘基上據某些位置，DPP IV可自多肽之N -末端解離出二肽。如此中$用的“第1位置”係指於N -末端之胺基酸殘基位置。此中所用的“第2位置”係指緊鄰第1位置且距N -末端第2位置之胺基酸殘基位置。如此中所用的“第3位置”係指緊鄰第2位置，且距N -末端第3位之胺基酸殘基位置。可移去N-末端2肽之解離發生於第2及第3位置間，但第3位置需是非脯胺酸或羥基腩胺酸，且第2個胺基酸是下列5個胺基酸之一：脯胺酸 (P r 〇 )、羥基脯胺酸（H y p )、丙胺酸（A 1 a )、弱胺酸 (Ser )、或蘇胺酸（Thr )。 έ DPP IV Μ不同速率解離Ν -末端殘基1係依據4個胺基酸中何者存在於第2位置。在多數例子中，當第2位置為 20 甲 4(210X 2971'沒） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. 打. A6 B6 五、發明说明（19 ) Pro時，DPP IV解離最有效率，其次是Ala 。當第1位置為酩胺酸、羊角胺酸或姐胺酸左據時，DPP IV作用速率和第2位置為Pro或Ala左據時相同。當第2位置為Ser•左據時DPP IV次有效率。而KThr左據第2位置時其最無效率。利用此資料，可設計各種N -末端延伸部份，其可以不同的速率處理。因此可投予之藥物可含有特異前藥或前藥型式之混合。攜有各色N -末端延伸部份之前藥，各自可以依其胺基酸序列而定之速率處理。可調和此種前藥型式之混合，Μ含有可在一段時間後處理成具活性多肽之一糸列前藥。長度及胺基酸序列殘基之組_纖，是DPP IV解離速率中之控制性因素。含有所有的或幾乎所有的交錯之Y = Pro的延伸部份最先亭理，而含Y = Tly-者則最後轉化。此外，已知二狀基單位X-Pro (其中Y是Glu或Asp )較其對映部份（其中X是中性或鹼性胺基酸殘基）解離慢許多。由於延伸部份在其各解離位置上可含不同的殘基，故可存在有極大數目之變異及過空變作用。任何具生物活性之多肽均可充作多肽藥物使用，PCT專利案PCT/US 90/02923 (在此列為本案參考）、pCT/US /08248 (例為本案參考）及美國利案系列第07/368, 231 (列為本案參考）各自揭示午生長激漢釋於因子類似物，依據本發明其可呈藥用於K學製劑中。於這些申請茱中所教示的任何類似物，依據本發明可充作融合蛋白筲之核心肽部 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •装· .緣. 甲4(210X 297W沒) 2你0_^_ 五、發明說明？0) 份。由一般精藝者利用热知之方法，可產製含有此種核心蛋白質部份並鏈结至延伸部份之融合蛋白質。本發明其他具體實例包括激素、受體、酵素、貯存蛋白質及血液蛋白質。特殊實例包括：血管活性腸肽（VIP)；人類酪嗎啡（/3-Casomorphin);H抑制性狀（GIP); 胃釋出肽（GRP);人類肽HI ;人類肽YY ;類胰高血耱激素肽-1之7-37片段；類胰高血糖激素肽-2; P物質；神經肽 Y ;人類胰多肽；類胰島素生長激素-l(IGF-l);人類生長激素（hGH):牛生長激素（bGH);豬生長激素（PGH); 催乳激素（PRL); 人類、牛、豬或羊生長激素釋放因子 (GRF);間白素-1/3(IL-/Q);EGF ;IGF-2;胰高血糖激素；促緊上腺皮質激素釋放因j_(CRF);載諾菲 (dynortin);生長激素釋放抑制因子-14;内皮素；轉形生長因子a (TGF - α ) ·，轉形生長專子/9 (TGF-/9 );間白素 -4;間白素-6;神經生長因子（NGF);腫瘤壞死因子 (THF);胰島素；纖維母细胞生長因子（pGF);干擾素； CD4 ;及間白素-2UL-2)或其合成或生合成類似物。這些多肽也可用來形成根據本發明之融合蛋白質之核心蛋白質部份。這些多肽僅充作具體賁例且不因此限制本發明範圍 Ο 依據本發明可合成較小的融合蛋白質，如Μ固相法利用 A ρ ρ 1 i e d B i 〇 s y s t e m s 4 3 0 Α 狀合誠儀（A ρ ρ 1 ί e d Biosystems, Foster City, California)如 PCT/RS 90/02923 及 07/368,23 1 中詳述一般。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .^· _打· 甲 4(210X2971'沒） A6 B6 五、發明說明（21 ) 對於較大的分子，則Μ利用重姐D N A於宿主細胞中產製為較佳。對欲利用重姐DNA方法產生融合蛋白質之一般精藝者而言，有許多不同的方法可應用。典型而言，編碼欲求多肽之基因嵌入表現載體中*之後再用來轉形或轉成適合的宿主细胞。所嵌入之基因再於宿主细胞中表現，且產生欲求之多肽。為以類似方法產生本發明之融合多肽，則在基因嵌入子中包括有額外的DHA序列。特言之，編碼^ N -末端延伸部份殘基之DNA鍵结至編碼欲求多肽基因之 5'端。此額外的置傳材料必須置於表現載體啟動子之下游，如此可在啟動子之控制下。此外，必須與基因位正確讀譯架構，如此所表現之蛋白質產物包括H -末端延伸部份殘基共價鍵结至欲求多呔上。__ 因此，為利用重姐DNA技術產製根據本發明之融合蛋白質時，必須設計寡核苷酸，其編=碼欲求之N -末端延伸部份之胺基酸序列，且這些寡核苷酸必須操作性嵌入編碼核心蛋白質部份之基因之5’端上游，Μ產生嵌合型基因。製備寡核苦酸之技術及用於產製嵌合基因之技術，係一般精藝者熟知的。除了充作前藥之融合蛋白質利用性外，本發明是有關具生物活性之重姐體多肽之純化及處理。欲求之生物活性重姐體多肽|最好製成可溶型式·或自宿主中分泌出來。依據本發明，融合蛋白質之延伸部激可Κ純化方法確認。融合蛋白質自所存在之分泌培養基中純化，或萃取含彼之溶液，之後處理Κ自核心蛋白質部份除去延伸部份，如此產 23 {請先閱讀背面之注意事項再填萁本页) •打· 甲 4(210X 297公沒） A6 B6 213923 五、發明説明（22) 生純化之欲求蛋白霣。因此，欲求蛋白質最適合處理，因依據本發明之融合蛋白質是本身並非DPP IV解離受質之生物活性多肽。 - 依據本發明，分離、合成或者取得可指導合成欲求蛋白質之基因序•並操作性鐽结至編碼延伸部份之DNA序列上。雜種基因，其含有指導合成欲求蛋白質之基因*並操作性鐽结至編碼延伸部份之DNA序列，則其稱之為嵌合基因 0 用於製備嵌合基因及重組載體之方法及材料*利用同者轉形或轉慼宿主细胞，於宿主细胞中複製載體及表現具生物活性之外來多狀蛋白質，逑於Principles of Gene Manipulation, by Old and P_r i_m r o s e，2nd edition, 1 9 8 1 及 S a m b r ο o k e t a 1 ·，Μ ο 1 e c u 1 a r C 1 ο n i n g，2 n d Edition, Cold Spring Harbor JL-aboratory Press, NY (1 989)，均列為本案參考。本發明是有闞編碼融合蛋白質之重組嵌合基因，含彼之表現ISSI ’ Μ這些表現載體轉形或轉感的宿主I及取得這些基因、表現載體、及為該載體轉形或轉感宿主之方法。明可用來純化任何的原核或真核细胞蛋白質，其可於經轉形或轉感之宿主细胞中，呈重姐體DNA技術之產物般表現°這些重姐蛋白質產物包括激素、受體、酵素、貯存蛋白質、血液蛋白質、由蛋白潔逍傅技術產生之突變蛋白質’或合成的蛋白質。所產生之欲求的多肽可包括： HIV RNase H，tPA, IL-；!, 受體，CD4,人類神經生 ___- 24 - 甲 4(210X 2972 沒） (請先閱讀背*之注意事項再填窩本页) .装. •訂· •緣. 2139-3_ _ 五、發明説明（23) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 長因子，SCD4-PE40 ，人類呼吸道合胞病毒（RSV) FG嵌合的糖蛋白（見美國專利案No. 07/543,780，列為本案參考 )* EGF, IGF-1, IGF-2, 胰高血糖激素、促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF)，載諾菲（dynorfin)，内皮素，轉形生長因子a (TGF-α)，假單胞菌内毒素40(ΡΕ40)，轉形生長因子-/3 (TGF-/3)，胰島素及其類似物。純化方法之實例包括IMAC及免疫親和力。其他應用可為 DPP IV移去之延伸部份之肽之纯化方法也包括在本發明範圍之内。於本發明的一個具體實例中，融合蛋白質包括具生物活性之多肽部份及一個延伸部份，後者為一金羼嵌合肽，可用於經固化之金鼷親和力層析_糸^統中。欲分级分離蛋白質之經固化之金羼離子親和力層析 .打. (IMAC)首先揭示於 P〇rath, J. e，t- a 1 . , N a t u r· e 258:589-599(1975) 。 Porath 揭示从亞胺二醋酸（idA)衍生樹脂，並嵌合金羼離子至經IDA-衍生化之樹脂上。 P〇「ath所揭示之蛋白質可固化於層析柱中，其中含有經固化之金靨離子。此中涉及將一般用的亞胺二醋酸（IDA)黏附至基質上，之後金颺離子嵌合至含IDA之樹脂上。蛋白質經由可供予電子之胺基酸殘基之官能基而與金屬雔子结合。可能的供電子胺基酸殘基有半胱胺酸、姐胺酸、及色胺酸。蛋白質經由這些具供予電穿測鐽之胺基酸一個以上而與金屬離子交互作用。

Smith et a 1 .於美國專利No. 4,569,794中（例為本 -2 5 - 肀 4(210X297L'沒） A6 B6 2139^-' 五、發明說明（24) 案參考）揭示某些胺基酸殘基負貴蛋白質與經固化金屬離子之结合。然而，經结合之蛋白質由PH之降低或若结合中涉及有组胺酸測鐽時則採用競爭性的抗配體< 如咪哩）來溶離出來。已使用.蛋白質中含有姐胺酸之二或三肽，以顯示 IMAC是一種選擇性純化技術。因此，Smith等人揭示使用重組體DN A技術來產生融合蛋白質，其含有金靥嵌合肽並 .共價鐽结至一個欲求多狀。金屬嵌合肽是一個延伸部份，其對欲求之多肽而言是有效的可乘之機。此可乘之機可用於蛋白質純化。利用具有交替的His殘基之金靥嵌合肽之I MAC技術，其用法揭示於美國專利案第0 7 / 5 0 6 , 6 0 5，其已列為本案參考。美國專利荼第07/506, 605，示特異的金鼷嵌合肽，當金鏖嵌合肽含有2至6個交替的His殘基，其在融合蛋白質之IHAC純化宁可提供意外絕佳卢结果。依據美國專利案 No. 07/506,605及美國專利荼No. 4,569,794所教示的，可於IMAC中應用常用的IDA樹脂，以強化融合蛋白質，而其中所含的金鼷嵌合呔部份具至少三個交替的姐胺酸殘基，其為DPP IV-可確認序列中之姐份。構架融合蛋白質，及其於IMAC糸統中之用法，教示於美國專利No. 4, 56 9, 794中。含有交替的H is殘基之金靨嵌合肽部份，其構架及用法教示於美專利案第〇 7 / 5 0 6 , 6 0 5號中。經由提供一個在交替的H is殘基間有DP泛IV可確認殘基之融合蛋白質，本發明提供一個可利用IMAC技術純化之融合蛋白質，其接下來M DPP IV處理Μ生成欲求之多肽。 26 - 千 4(210X2971'沒） ί請先閑讀背面之注意事項再填寫本育) .装· .訂. _綠· A6 B6 五、發明說明（25 ) 依據本發明此具體賁例，延伸部份是一個金屬嵌合肽，其可由下式代表： A-X-Y (X'-Υ) η 且進一步地，其中Α是視所需的，且若存在時是甲硫胺酸；； η代表依序鍵结的X'-Y基團之數目，數目代表此基團有由〇至20個，較好是0至10。 X選自下列包括任何自然生成之胺基酸； Υ選自下列包括腩胺酸、丙胺酸、弱胺酸、及蘇胺酸，除了當η = 0 。則Υ選自下列_包^括丙胺酸、弱胺酸、及蘇胺酸； X ’選自下列φ括除了腩胺酸或菩基脯胺酸以外的任何自然生成之胺基酸；其中至少2至3個命名為X’及視所裔地X為组胺酸 (His)。較好，Υ是Pro且η是至少3 。當以DPP IV處理，Ν -末端延伸部份Μ逐步方式解離，產生生物活性之多肽，但生物活性多肽本身並非DPP IV之受質。融合蛋白質的一個實例，包括具下式之延伸部份 H is-Y (Η is-Y) η ί- 其中η = 3 至8 ，且 Ys是 Pro、 Hyp、 Ala、 Ser或 Thr， (請先閑讀背面之注意事項再填寫本页) •装· .打. .線. _-27 - 甲 4(210X297 公发） 2139^3 A6 B6 五、發明说明（26 ) Pro為最佳。融合蛋質的另一實例為具有下式延伸部份 X-Y (H i s-Y)η - 其中η是3至8 ，X是任何自然生成之胺基酸；且Ys 是 Pro、 Hyp、 Ala、 Ser或 Thr， Pro為最佳 ° 由於N -末端Met是蛋白質於大腸桿菌中合成之结果，且已知當鄰接胺基酸是Pro、Gly、Ala或Ser時可為大腸桿菌之酵素系統所處理，以下延伸部份代表可用於在大腸桿菌细胞內為重姐體DNA技術所表現之生物活性肽或蛋白質之 IMAC純化及解離。 Met-X-Y (H i s-Y)η 其中η = 3 至8 ， X 是Pro、 Gly、 Ser或Ala;且 Ys是 Pro、 Hyp' Ala' Ser或 Thr，以 Pro為最佳 ° 於另一實例中，若欲求之肽或蛋白質可於轉形或轉感後自其宿主中分泌出來，則可設計載體，以利用有助於運送之延伸部份分泌出蛋白質或多呔，如： X-Y- (H is-Y) „ ST 其中η = 3至8 ，X可為任何自然生成胺基酸，係可與其宿主之分泌糸统相容者，且Ys是Pro、Hyp、Ala、Ser或 {請先閱讀背面之注意事項再填駕本页) *装. •訂· •線. _-28 - 甲4(210X 297乂发） 2139^3 A6 B6 五、發明説明（27)

Th r ° 另一蛋白質純合DPP I V處理技 No. 4,782,137 列為本案考，揭性之N-末端部份 Hopp et a 1.,融有可確認融合蛋。經固化之抗體不要的组份則溶抗體複合物。依據本發明，個含有DPP I V可利中所述之收_ IV中，由是移去 N -末端延伸部份此中所述之具不欲限制本發明份之融合蛋白質伸部份之移去是包括含有化學上化系統*其中術者為免疫親其使用融和力純化 a 1公告於，由 Η 〇 p p e t 示合成一種融合蛋白質及在C-末端部份為一個合蛋白質之纯化，係將白質抗原部份之經固化可將蛋白質保持在層析離。之後改變層析柱條合蛋白。美國 1988 年 •其具欲求的粗製上抗體之柱中，件，Μ 質且其極適專利案第 11月1日，有高度抗原多肽。依據清液經過含層析柱而得而上清液中解離抗原- {請先《讀背面之注意事項再填寫本页) •发· 融合蛋確認殘後，依延伸部來實行體實例範圍。，其可由於方經修飾白質的度抗原基之延伸部份。據本發明#融合份。一般精藝者 Hopp的免疫親和及實例用Μ說明意欲相當的包括 Κ至少一個其他法乏混合應用所胺基酸殘基之融性Ν -末端部份是— 經過如上文Η0ΡΡ專蛋白質可曝於DPp 可以依據本發明之力纯化系统。本發明之本質，且具有N -末端延伸部方法處理，如此延致。意欲相當的尚合多肽。 •打· •if. 29 甲 4(210X 297W 沒） 3 CP 91¾ 2

A B 五、發明說明（2 8) 實例實例1 合成的前藥，其為具有DPP IV受質之核心蛋白質之融合前藥 - 可合成且如前藥般投藥之融合多肽，具有一個DPP IV可降解之N -末端延伸部份，其並共價鏈結至生物活性多肽之 N -末端。這些前藥之公式可表示如下：延伸部份一核心蛋白質藥物部份其中“延伸部份”代表D P P I V可解離之N -末端延伸部份；〃代表共價的肽鐽；及“核心蛋白質部份”代表任何欲求的肽，其經DPP IV處理可自延伸部份釋出。於此實例中，融合蛋白質的核心蛋白質於延伸部份移去後，是DPP I V潛在之受質。一一利用技藝中熟知之肽合成技術可產生合成的前藥。於一個具體亨例中，核心白質，份是上皮生長因子 (EGF)，且延伸部份是 Gly-Pro-Phe-Ala: G ly_4-Pro_3-Phe_z-Ala_1-[EGF] 於另一個具體實例中，核心蛋白質部份是胰高血糖激素，且延伸部份是Ala-Pro-Phe-Ala。 Ala—4-Pr〇-3-Phe_2-Ala3-[胰高血糖激素] 於另一具體實例中，核心蛋白質部份是 (請先W讀背面之注意事項再填其本页) •5t. •打· •sf· -30 - 甲 4 (210X297 乂发） A6 ^139： 3__ 五、發明說明(29) [Ala15Leu27]-bGRFU_29)NH2(Seq ID 3)且延伸部份是 T y r - A 1 a ：

Tyr-2-Ala-1-{[AlalsLeu27]-bGRF(l-29)NH2} 實例2 合成的前藥，其係具有非DPP IV受質之核心蛋白質之融合蛋白質；合成且呈前藥般投藥之融合多呔，具有一個DPP IV可降解之N -末端延伸部份，並共價鏈结至生物活性多肽之N -末端。這些前藥之公式可表現如下延伸部份-核心蛋白質藥物部份 < 其中"延伸部份”代表D P P I H解離之N -末端延伸部份； “ - ”代表共價的肽鐽；且“核心蛋白質部份”代表任何欲求之肱，其ψ經DPP IV處理而声延伸部份釋出。合成的前藥可利用技藝中熟知之肽合成技術產製。於一個具體實例中，核心蛋白質部份是b G R F類似物* [Val2, Ser8.2S,Leu27]-bGRFU-33)0H(Seq ID 1)，且延伸部份是 Gly-Pro-Tyr-Ala:

Gly-4-Pr〇-3-Tyr-2-Ala-1-{[Val2Sers-28Ala15Leu27]-b GRF (1-33)0H) 〇於另一具體實例中，核心蛋白質部份是促皮質釋放因子 (CRF)，且延伸部份是 Gly-Pro-Phe-Ala: 甲4(210X 297乂沒） (請先聞讀背面之注竞事項再填寫本页) .装· •打· •綠. _-31 - A6 B6 五、發明说明（3〇 ) G 1 y - A - P r ο " 3 - P h e - z - A 1 a - 1 - [ C R F ] ° 於另一具體實例中，核心蛋白質部份是載諾菲，且延伸部份是 Phe-Pro-Phe-Ala: Ρ}ιθ_4-Ργ·〇_3-Ρ1ίθ_2-Α13_1-[載諾菲]。於另一具體實例中，核心蛋白質部份是生長激素釋放抑制因子-28，且延伸部份是Gly-Pr〇-Phe-Ala: Gly — 4- Pr〇-3-Phe-2-A U二1 -[生長激素釋放抑制因子-2 8 ]。於另一具體實例中，核心蛋白質部份是内皮素，且延伸部份是 Ala-Pro-Phe-Ala: /\la_4-Pro_3-phe-2-Ala_1"·[内皮素]。於另一具體賁例中，核心蛋白質是b G R F類似物 [IleaSer^.wAlaULeuUl-bGRFU-dinOMSeq ID 2)且延伸部份是P h e - A丨a : ^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· .打· .^ 甲 4(210X 297 公发） 32 A6 B6 叭抓。_ 五、發明说明（31 ) Phe-z-Ala-1-{Clle2Ser8-28Ala15Leu2'7]-bGRF(l-40)0H} Ο 於另一具體實例中，核心蛋白質部份是 [IU2Ala15Leu27]-bGRFU-29)NH2(Seq ID 4)，且延伸部份是 Tyr-Ser: Tyr~2-Ser-1-{[Ile2Ala15Leu27]-bGRF (1-29)ΗΗζ) ° 實例3 bGRF類似物Leu27-bGRF(l-29)NH2之持鑛存在 bGRF類似物Leu27-bGRF(卜2_9XHH2 ，其序列示於Seq ID 5，可呈藥物般投予，其中含有示於Seq ID 5之核心蛋白質及各種H -亨端延伸之前藥。利用Seq I D 5為核心蛋白部份，可以熟知的方法製成各種型式的前藥。用於這些以Seq ID 5為基礎之前藥中之延伸部份為：Ile-Ala, Gly-Pro-Ile-Pro, Seq ID 6, Seq ID 7, Tyr-Ala, Gly-Pr〇-Tyr-Ala, Seq ID 8, Seq ID 9, Seq ID 10, Seq ID 11, Seq ID 12, Seq ID 13, Tyr-Ala-Tyr-Ala及 Val-Ala 。實例 4 bGRF 類似物[Thr^/UaiieuMl-bGRFddWNHa 之持續存在 bGRF類似物[Th「2AlalsLeu27]-bGRF(l-29)NH2，其序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 33 肀 4(210X297 乂沒）扒挪3_^_ 五、發明说明（3 2) 示於Seq ID 14 ，可圼藥物般投予，其含有示於Seq ID 14之核心蛋白質部份及各種N -末端延伸之前藥。已製成三種型式之前藥，分別有Tyr-Thr, Tyr-Ser，及 Tyr-Thr-Tyr-Thr 之延伸部份。實例5 含有Η I V R N a s e Η及N -末端延伸部份之融合蛋白質本實例描述自重姐體大腸桿菌中純化嵌合蛋白質之策略，係依據含有交替的姐胺酸，及對經固化之金屬離子具親和力之金屬嵌合肽區域。構築載體Κ指令融合蛋白質之合成，其中使用HIV RNase Η為核心蛋白質。如下文所示的，設計這些融合蛋白質，使其_有_交替的姐胺酸以、利用經固化之金屬離子親和力層析法（I M A C )純化，及交替的腩胺酸或交替的丙胺酸以使DPP IV解離，-移去金屬嵌合肽（mcp) Ο · 依據本發明較佳的DPP IV可解離N -末端延伸部份示於下融合蛋白質HIV RH/mcp ttl，含有Seq ID 5之N-末端延伸部份並鏈结至Η I V R N a s e Η : Met-11-Pr〇-lo-Ala-0-His-8-Pr〇-7-His-e-Pr〇-5-His-4-Pro~3-His-z-Ala-1-[HIV RNas^H] 融合蛋白質HIV RH/racp (12，含有Seq ID 16之N-末端延 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .装· •打. 綠· _-34 - 甲 4(210X 297公沒） 2139^° A6B6 五、發明説明（33) 伸部份並鍵结至HIV RHase H : Met-11-Ma-1。-Pro-β-His-β-Ala-7-His-β-Ala-5-His-4-A1a - 3-His-2 - A 1 a - 1 - [ Η I V RHase Η] 融合蛋白質HIV RH/racp #3，含有Seq ID 17之N-末端延伸部份並鏈结至HIVRNaseH: ; Met-11-Gly-lo-Pr〇-0-His-8-Pr〇-y-His-e-Pr〇-5-His-4-Pro~3-His-2-Ala-1-[HIV RHase H] 這些融合蛋白質選殖及表現_於^大腸桿菌，並利用DEAE層析及RP-HPLC纯化。N -末端之定序用來鑑定融合蛋白質。含有交替姐胺_之融合蛋白質應界至KIMAC純化重姐蛋白質之中，再MDPP IV除去N -末端延伸作用，可證實本發明之利用性。構築含有HIV RNase Η基因之嵌合基因所有的重姐體DNA以標準技術製備。相當於金靨嵌合肽 /解離序列之寡核苷酸構築、純化，回冷並連接至編碼 HIV RNase Η之基因中以形成一個嵌合基因。為製備編碼交替的姐胺酸/ D P Pg I V可確認之解離殘基 /HIV RNase Η之表現載體，將嵌合體基因嵌入最终之表現載體中。含有嵌合基因構體之表現載體，Κ標準技術轉形 (請先聞讀背面之注意事項具填寫本頁) •訂· •緣· 甲4(210X 297W沒) 2l39<^ A6 B6 五、發明说明（3 4) 大腸桿菌。基因於大腸桿菌中之表現，可造成嵌合基因所編碼之融合蛋白質之產製。這些融合蛋白質含有HIV R,N a s e Η胺基酸及N -末端延伸部份，後者含有交替的組胺酸（金屬嵌合肽）及交替的脯胺酸或丙胺酸° 製備粗製的大腸稈菌萃取物並分離融合蛋白質以供定序約3克大腸桿菌细胞糊懸浮於30毫升0.25 Μ磷酸鉀、pH 7.2中，其中含有11^二硫異赤藻酵（〇1'1')、£01'/\、苯基甲基磺醯基氟（PMSF)、及苄胖HCL 、1〇毫克/升抑肽酶、亮肽素及見恩汀（bestatin)。此懋浮液通過French Press三次Μ打破细胞。溶胞產物以12,000 γρπι離心1小時。上清液移去並加硫酸銨固_體^至70%飽和度。經攢拌1 小時後，懋浮液Μ 1 2 , 0 0 0 r ρ m離心1小時。上清液丟棄，且團塊再溶於2.25毫升5〇11^1>^名，出7.5中，其中含有 1 mM DTT，PMSF 及苄胖。溶液再於 20 mM Tris, 50 mM NaCl，1 DTT，10% 甘油及 0.1 mM EDTA pH 7.5( A 緩衝溶液）中，以4 °C透析一夜。收集透析液，以1倍體積之A緩衝溶液稀釋，並填料至10奄升經洗滌之DEAE纖維素管柱中（其平衡於A緩衡溶液中）。分批收集流過液，旦管柱進一步以50奄升A緩衝溶液洗·縣。這些溶液收集、匯集，並M70%硫酸銨沉澱而濃縮，再懋浮於2毫升a緩衝液中’並如上述地透析。經濃縮的深Η用於末端序列分析之鑑定中。甲4(210Χ 297公沒） (請先閲讀背面之注意事項再填弈本页) •装· •打· 36 213923 A6 B6 五、發明説明（35) 利用IMAC純化融合蛋白質利用金屬嵌合肽*以自粗製萃取物中纯化重姐體蛋白質之可行性，可利用以下表現於重姐體大腸桿菌中之嵌合體明示，其中MHIV RNase Η為典型蛋白質。各自純化融合蛋白質HIV RNase H/mcp ffl， HIV RNase H/mcp 林2及HIV RNase H/mcp 林30 IMAC管柱製備如下：Chelating Sepharose Fast Flow 購自Pharmacia ，於多孔玻璃滅膜上以Milli-Q水充份洗源。游獎小心地倒入玻璃層析柱（Pharmacia)使體積為6 毫升（1x7公分）。一旦凝膠沉降，層析柱K 5倍體積之 50 mM EDTA(乙底酸）cH 8.0洗滌。此之後，層析柱M5倍體積的0.2 N NaOH及5倍體樓的Milli-Q水洗滌。層析柱再充填W5倍體積的50 mM NiS〇4(或ZnCl2或CuS〇4)。最後，層析柱M5倍流床體積的平異緩衝溶液洗滌。平衡媛衝溶液姐成為20 mM Tris pH 8.0 ·含有500 mM NaCl， 1 mM PMSF, 1 mM苄胖，10毫克/升亮肽素，及10毫克/ 升抑肽酶。層析柱以至少5倍體積之平衡緩衝溶液平衡。Μ重力將 5-10毫升粗製的大腸桿萃取物填至層析柱上。一旦粗製原料已進入層析柱内，柱以1 0倍體積平衡溶液洗滌（其中含 1.0 M NaCl,以取代500 mM NaCl, pH 8.0 )。層析柱再以於平衡緩衝溶液PH&8.0中之咪唑漸增濟度溶離。在早先實驗中*於每一寅驗中可完成大量的溶離，以決定嵌合物被溶離之湄度。而後此溶離簡化，且卜通常只 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本百) •裝. •打· ____-37 - 甲 4 (210X297 2 沒） A6 B6 五、發明说明（36) 用3種咪唑濃度=35 ιηΜ, ΙΟΟ mM,及300 mM咪唑於平衡緩衝溶液中，出8.0。各眯唑緩衝液使用10倍床體積。於溶離間，層析柱M10倍體積之平衡媛衝溶液洗滌。最好，層析柱倍體積之50 mM EDTA，出 8.0洗脫以決定是否仍有任何蛋白質结合至管柱上。層析柱之流速為1.0毫升 /分。收集5毫升流份。層析柱於室溫下進行實驗。 Μ商品化之Pierce蛋白質分析套姐，來決定樣品中蛋白質含量。 M Becerra, S. P. et al., FEBS 270(1,2)： 76-80 (1990, 9 )所述之方法來決定HIV RNase H活性，列為本案參考。 N -末端延伸之融合蛋白質至成熟蛋白質之轉化作用使用純化自人類胎盤，此活性為5200 raU /奄克蛋白質之商品化 DPP IV(Enzyme Systems Products, Dublin, Ca.)。；！單位相當於在pH 7.8下1分鐘内，水解1微莫耳的合成受質，Ala-Pro-7 -胺基- 4- 2，三氟甲基香豆素，酵素轉化之進行，係在25 =下，將卜1〇奄克/毫升的融合蛋白質（約1 -100毫克）與DPP IV共置，此中酵素對受質比率為1 : 100U/W)。欲求之多肽利用IMAC自未解離之融合蛋白質中回收。由N -末端序列分析證實確賁性。賁例6 於試管内於牛血漿中處理bGRF類似物前藥表1綜合代表性實驗，K說明核心蛋白質， _-38 - 甲4(210X 297公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .装· .訂· A6 B6 2139^^ 五、發明説明（37) (請先聞讀贄*之注意事項再填寫本页) [Leu27]_bGRFn-29)NH2(Seq ID 5)自其三個 N-末端延伸之類似物： ·

Tyr-4-Ala_3-Tyr-2-Ala-1-{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2}(Se q .ID 19), I le^-Ala-'-i [Leu27]-bGRF (1-29) NH2} (Seq ID 18)及 Tyr-L/Uad-iCLeu^y-bGRFUjWNHzHSeq ID 25)，經於試管内牛血漿中培育而產生。於培育混合物中可測及之唯一代謝物為DPP-IV-相闞之解離產物。；經一段時間後，

Tyr-4-Ala-3-Tyr-z-Ala-1-{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2}(Se q ID 19),繼而轉化成

Tyr^-Ala'1-{ [Leu27]-bGRF (1-29) NH2} (Seq ID 25)» [Leu27]-bGRF(1-29)ΝΗ2(核心_狀_，Seq ID 5)，且最後至 [Leu27] - bGRF ( 3 - 29)ΝΗ2(Seq ID 24)。

Tyr-2-Ala-'-{[Leu27]-bGRF(s 卜 -29)NH2)(Seq ID 25)轉化成[Leu27]-bGRF(l-29)NH2(核心狀，Seq ID 5)，之後至[Leu27]-bGRF(3-29)NH2(Seq ID 24)。核心肽本身， [L e u 2 7 ] - b G R F (1 - 2 9 ) Ν Η 2 } (S e q I D 5 )轉化成 [Leu27]-bGRF(3-29)NH2(Seq ID 24)利用血漿 DDP IV。即使在實驗條件下之Η P L C中覼察不到其他的代謝物，肽 [LeU27]-bGRF(3-29)NH2(Seq ID 20)經一般時間後會消失 *其顯示其他非與DPP IV相關的蛋白水解物一定也會發生但Μ更顧著低之速率進行。不僅泚處所示出之由DPP-IV-可解離之bGRF前藥所產生之核心bGRF肽*旦自融合蛋白質所產生之核心蛋白質之半衰期、和直接與牛血漿培菏之核 __- 39 - 肀4(210X 297乂潘） A6 B6 2139^3 五、發明說明（38 ) {請先聞讀背面之注意事項再填襄本页) 心肽（Seq ID 5)之半衰期比較，前者於試管内有顯著的延長（表1)。再者，自前藥中釋出核心呔之時間似無與前藥延伸部份之長度極有闞係：自延伸部份有4涸胺基酸之前藥（Seq ID 19)產生Seq ID 5之半衰期，較僅有2個胺基酸（於延伸部份）GRFs原（如Seq ID 18或25)所衍生者為長 Ο 實例7 bGRF類似物前藥之活體内及試管内生物活性如表2所示，當Holstein小牛iv注入類似物Seq ID 18 時，血漿生長激素（GH)水平會提高。於每公斤體重0.2毫微莫耳之劑量下，血漿中誘生的生長激素水平，可與Μ相同劑量之核心肽（Seq ID 5)i v_L射所產生的比得上。強調延伸呔Seq ID 18只有約5 %核心肽Seq ID 5固有強度的 5 %是十分重要的，此係當二者s均針對GH之釋出進行試管内垂體细胞分析時。之後，此二肽之可比較的活體内活性似乎顯示，核心呔已於活體内自延伸肽中釋出。相同的活體内GH釋出型式，也可見於延伸部份有4個胺基酸殘基之bGRF前槩處理中（Seq ID 19)，如表3所示。延伸部份具4或2個胺基酸之前藥（肽Seq ID 19及Seq ID 18)，其處理後之活體内誘導的GH釋出並無顯著差異· 差異顯著處在於試管内自此二fc>GRF前藥產生核心肽之活體内半衰期，如表1所示。活體内连長激素之釋出是快速的，且和核心肽Seq ID 5以及Seq ID 19及18相同，於施K bGRF類似物後之GH峰時間上並無差異。 -40" 甲 4(210X297乂沒） 2139^^ A6 56 五、發明說明（39) 對這些结果我們的說明是，活體内GH自前藥之快速釋出大半是由於整體而言高的組继及器官DPP-IV水平·其約為血漿DPP-IV濃度之100倍高。此點可解釋前藥活體内處理之速率，和表1綜合之於試管内實驗所見的解離比較下有差異。也有可能，核心肽自其前藥前軀體產生之半衰期於活體内有所延長，但並不足以顯示有改變之（延伸之）生長激素之釋出。已知G Η活體内之釋出，由b G R F之剌激作用及生長激素釋放抑制因子，SRIF之抑制作用所調控。於 Moseley等人的公牛餵食棋式中（J. Endocr. 17, 253-2 5 9 ，動物於餵食前2小時•靜脈注入G R F ，因為餵食前垂體對GRF較餵食後更有反應。和餵食有關之因素，如腸胰SRIF之釋出，可能會于抗垂_體-釋出GH之能力。換言之* 於SRIF高控下，即使有GRF ，也無GH可自垂體中釋出。正常時，在未施壓之公牛餵食横式=中，血清中GH濃度於餵食後3 - 6小時可下降至基準水平（所謂的低落期），在餵食後 5- 8小時有另一個外因性GH偶發脈衝。為反應餵食前2小時之GRF注射，可在5-20分鐘内快速地發生GH反應。且於再回復至基線前，GH水平可保持1 20- 240分鐘之提高。到目前為止所測試之G R F前藥中，只有第一個外因性G Η峰是提高的，第二個並未顯示任何的處理效應。可能在我們實驗中，自前藥產生核心GRF之半衰期並不夠長*使得循環中無法存在有足夠的核心呔濃度f Μ逹成外因性G Η的第二次突發，通常是第一次後4 - 6小時可發生。缌之，我們的结果支持此中所揭示之前藥一般槪念，因 {請先《讀背面之注意事項再埃寫本頁) ___ - 41 - 甲 4(210X 2971'沒） A6B6 五、發明説明(4〇 ) 為： (i ) (ii ) (iii ) 具有DPP IV可解離之N -末端延伸作用之bGRF前藥，可小心地處理，K於試管内牛血獎中經DPP-IV調介之解離而成水地產生核心肽；核心呔自前藥產生之試管内半衮期，顯著較長且為前藥中N -末端延伸部份長度之函數關係；具有極低固有效力之bGRF前藥和核心狀在活體内 G Η釋出上同等有效之事實顯示，極有可能核心呔如所預期地於活體内產生。 {請先《讀背面之注意事項再填寫本页) .装· 實例製備

Gly_4-Pro_3-Ile_2-Pro_1-([一Le..u27]bGRF(l-29)KH2}，三氟乙酸鹽 •打. .φ· 结構為 Gly-Pro-Ile-Pr〇-Tyr-声J a-Asp-Ala-I le-Phe-Thr-Asn_Ser-Tyr-Arg_Lys_Val_Leu_Gly-Gln_Leu_Ser_ Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Glr-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg- HH2 ( MCF3C00H鹽存在）之GRF類似物肽Seq ID26之合成，依公告之PCT專利申請案PCT/US90/02923中所敘述之步驟A 逐步進行；該案列於此為參考。胺基酸分析结果如下，括號中為理論值：Asp 4.16(4); Thr 1.07(1); Ser 1.81(2)； Glu 2.07(2)； Pro(2) 1.98； Gly 1.99(2)；

Ala 2.99(3)； Val 1.13(1)； 11¾ 2.84(3)； Leu 5.08 (5)； Tyr 1.93(2); Phe 0.96(1); Lys 2.04(2)； Arg 2.97(3)。甲 4 (210X297 公沒） 42 A6 B6 213923 五、發明说明（41) 實例9 製備

Tyr-e-Ala-e-Gly'4-Pr〇-3-Ile-2Pr〇-1{[Leu2-7]bGRF(l-2 9) NH2),三氟乙酸鹽 - 含Seq ID6作為其延伸部分之GRF類似物肽Seq ID27之合成法，其结構為：MH-Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro-Tyr Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Leu_Asn_Arg_HH2(MCF3C00H 鹽型式）’依公告 PCT 專利申請案PCT/US90/02923號中所敘述之步驟A逐步進行。該荼列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中： Asp 4.04(4)； Thr 1.03(1)； Ser 1.74(2)； Glu 2.05 (2); Pro 1.99(2)； Gly 2.00_(2)； Ala 4.01(4)； Val 1.28(1); lie 2.84(3); Leu 5.09(5); Tyr 2.94(3);

Phe 0.97(1); Lys 2.07(2); Arp 3.00(3) ° 實例1 0 製備

Lys-8-Pr〇-7-Tyr-〇-Ala-5Gly-4Pr〇-3-Ile-2-Pro_1{[Leu 27]bGRF(l-29)NH2),三氟乙酸鹽

合成结構如下含Seq ID7作為其延伸部分之GRF類似物肽 Sed ID28: Lys-Pr〇-Tyr-/Ua-Gly-P「〇-Ile-Pr〇-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(以 CF3CO〇S 鹽存在），依公告 PCT 專利申請案PCT/US90/02923號中所敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值示於括號内： 43 甲4(210X297 公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •打. •綠· A6 B6 213923 五、發明说明（4刁

Asp 4.04(4)； Thr 0.95(1)； Ser 1.78(2)； Glu 2.04 (2)； Pro2.91(3)； Gly 1.98(2)； Ala 3.91(4)； Val 0.96 (1); lie 2.86(3); Leu 5.08(5); Typ 3.06(3); Phe 0.97(1); Lys 3.06(3); Arg 3.08(3)。實例 11 製備 (1-29) HH2}，三氟乙酸鹽合成结構如下之GRF類似物肽See? ID29: #6 Gly-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile~Fhe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(WCF3COOH 鹽存在），依公告PCT專利申請案PCT/US90/02923號中所敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為_參_考。胺基酸分析，理論值示於括號內：Asp 4.01(4); Thr 0.96(1); Ser 1.80(2)； Glu 2.02(2)； Pro 0.^7(1): Gly 1.98(2)；

Ala 3.91(4)； Val 0.99(1)； lie 1.89(2)； Leu 5.08(5)； Thy 3.05 (3)； Phe 0.98(1)； Lys 2.03(2)； Arg 3.06(3)° 實例1 2 製備

Tyr-°-Ala-5-Gly-4-Pr〇-3-Tyr-2-Ala-1-{[Leu27]bGRF (1-29) NH2)，三氟乙酸鹽合成结構如下含S e q I D 8作為延伸部分之G R F類似物肽 Seq ID30: tf7 Tyr-Ala-Gly-ProiTyr-Ala-Tyr-Ala-Ala-Asp-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn- _~ 4 4 - 甲 4(210X 297S沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •訂· ♦ 2139£3 A6 B6 五、發明說明（43) Arg-NH2(MCF3COOH鹽存在），依公告PCT專利申請案 PCT/US90/02923號中所敘之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值示於括號内：Asp 4.07(4) ；Thr 0.96(1)； Ser 1.79(2)； Glu 2.02(2)； Pro 0.99 (1) ； Gly 1.95(2)； Ala 4.80(5)； Val 0.96(1)； lie 1.87(2)； Leu 5.09(5)； tyr 4.11(4)； Phe 0.97(1)； Lys 2.06(2)； Arg 3.08(3)° 賁例1 3 製備 Lys_8-Pro_7-Tyr_e-Ala_5-Gly_4-Pro-3-Tyr"'2-Ala_1-{[ Leu27]bGRF(l-29)NH2}，三氟乙酸鹽合成结構如下含Seq ID9作為延伸部分之GRF類似物肽 Seq ID30: it8Lys-Pr〇-Tyr-Al_a 二G ly-Pr〇-Tyr-Ala-Tyr -Ala-Asp-Ala-Ile-Phe~Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg ~X-y s-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(MCF3C00H 盥存在），依公告 PCT 專利申請荼PCT/US90/02923號中所敘之步驟A逐步進行。胺基酸分析，理論值不於括號内：/\5口4.06(4);1'11「 0.95(1); Ser 1.78(2)； Glu 2.01(2)； Pro 1.95 (2)； Gly 1.96(2)； Ala 4.81(5)； Val 0.95(1)； lie 1.87 (2) ； Leu 5.09(5)； Tyr 4.12(4)； Phe 0.96(1); Lys 3.08(3)； Arg 3.10(3)° 莨例14 製備云 Phe-lo-Ala-0-Lys-8-Pr〇-7-Tyr-e-Ala-5-Gly-4-Pr〇-3-T y r — 2 - A 1 a - 1 - ( [ L e u 2 7 ] b G R F U - 2 9 ) N Η 2 )，三氟乙酸鹽 {請先聞讀背面之注意事項再填窩本页) *装· ，線. _-45 - 甲 4(210X 297公沒） 2139^3 A6 B6__ 五、發明説明（44 ) (請先《讀背面之注意事項再填其本頁) 合成结構如下含Seq ID10作為延伸部分之GRF類似物肽 Seq ID32： if 9 P h e - A 1 a - L y s - P r 〇 - T y r - A 1 a - G 1 y - P r 〇 - T y r -Alu-Tyr-Ala-Asp-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Ars-NH2(WCF3COOH 鹽存在），依公告 PCT專利申請案PCT/US90/02923號中所敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值示於括號内：Asp 4.16(4) ; Thr 1.01(1); Ser 1.89(2); Glu 2.08(2)； Pro 1.91 (2)； Gly 1.93(2)； Ala 5.72(6)；

Val 0.97(1)； lie 1.90 (2)； Leu 5.09(5)； Tyr 4.09 (4)； Phe 1.99(2)； Lys 3.08(3)； Arg 3.04(3)° 實例1 5製備 _ —

Gly'12-Pro_11-Phe"10-Ala'®-Lys_8-Pro~7-Tyr~e-Ala'5 -Gly-4-Pr〇-3-Tyr-2-Ala-1-{[Le-uZ7]bGRF (1 - 2 9 ) hi H 2 } · 三氟乙酸鹽合成结構如下含Seq ID11作為延伸部分之GRF類似物狀 Seq ID33： ttlOGly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-

Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-

Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-

Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Ar'g_NH2(M CF3COOH 鹽式存在），依公告P C T專利申請案P C T / U 0 / 0 2 9 2 3號中所敘之步驟 A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值示於括號内：Asp 4.08(4) ; Thr 0.96(1); Ser 1.79(2); 46 甲 4(21〇Χ 297公沒） A6 B6 2139^3 五、發明说明（45 )

Glu 2.07(2)； Pro 2.88 (3)； Gly 2.94 (3)； Ala 5.74(6)； Val 0.96(1)； lie 1.88 (2)； Leu 5.13(5)； Tyr 4.11 (4)； Phe 1.99(2)； Lys 3.10(3)-； Arg 3.09(3)。實例16

Val'14-Pro_13-Gly_lz-Pro"11-Phe~:lo-Ala_e-Lys_8-Pro _7-Tyr_e-Ala-5-Gly_4-Pro_3-Tyr_2-Ala'1-{[Leu2'7]bGR F (1-29)NH2)，三氟乙酸鹽合成结構如下之含Seq ID12作為延伸部分之GRF類似物狀 Seq ID34: <fllVal-Pr〇-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro -Tyr-Ala-Gly-Pr〇-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser~Tyr-Arg-Lys-Val .^L eu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg- N H 2( M C F 3 C 0 ◦ H鹽序在），依公告P C=T-專利申請案 PCT/US90/02923號中敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值示於括號内：Asp 4.04(4) ；Thr 0.96(1)； Ser 1.81(2)； Glu 2.04(2)； Pro 3.80 (4)； Gly 2.99 (3)； Ala 5.92(6)； Val 1.98(2)； lie 1.89 (2)； Leu 5.10(5)； Tyr 4.09 (4)； Phe 1.99(2)；

Lys 3.06(3)； Arg 3.08(3)° 實例1 7 製備

Arg"ie-Pr〇-ls-Val_14-Pr〇-13-iGly-12-Pr〇-11-Phe-10-Ala-°-Lys-8-Pr〇-7-Tyr-e-Ala-5-Gly-4-Pr〇-3-Tyr-2-Ala-iHLeuMUGRF (1-29)NH2)，三氟乙酸鹽甲 4(210X 297公沒） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 装· .打· 綠. A6 B6 213923 ^、發明说明（4 6 ) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成结構如下含Seq ID13作為延伸部分之GRF類似物狀 Seq ID35： }tl2Arg-Pr〇-Val-Pr〇-Gly-Pr〇-Phe-Ala-Lys-Pr〇-Tyr-Ala-Gly-Pr〇-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala--Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-G ly-G ln-Leu-Ser-Ala-Arg_Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(MCF3C00H鹽存在），依公告PCT專利申請案 PCT/US90/02923號中敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值示於括號内：Asp 4.10(4) ；Thr 0.98(1)； Ser 1.84(2)； Glu 2.03(2)； Pro 4.82 (5); Gly 2.97 (3); Ala 5,91(6); Val 1,99(2); lie 1.88 (2)； Leu 5.09(5)； Tyr 4.10 (4)； Phe 1.98(2); Lys 3.03(3); Arg 4.09(4) °_— · 實例 18 製備 Val-z-Ala-inLeu^UGRF (1-29)NH2}，三氟乙酸鹽 . (- •訂· 合成结構如下之GRF類似物呔Seq ID36: #14 •汰·

Val-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln_Asp_Ile-Leu_Asn_Arg_NH2(M CF3COOH 鹽存在），依公告PCT專利申請案PCT/US90/02923號中敘述之步驟 A逐步進行，該荼列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中：Asp 3.93(4) ; Thr 0.89(1); Ser 1.76 (2)； Glu 2.02(2)； Gly 1.05 (5)； Ala 3.87(4)； Val 1.85(2)； lie 1.77 (2)； Leu 5.17(5)； Tyr 2.04 (2)； Phe 0.97(2); Lys 2.07(2); Arg 3.06(3)。 48 -4 8 - 甲 4(210X2971'沒） A6 B6 2139¾3 五、發明説明（47 ) 實例 19 製備 Tyr-a-Thr-i-HAla15 Leu27]bGRF (1 - 2 9 ) Ν Η 2 }，三氟乙酸鹽合成结構如下之GRF類似物肽Seq ID37: tfl5 Tyr-Thr -Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NHdMCFsCOOH 鹽存在），依公告 PCT專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中： Asp 4.06(4)； Thr 1.86(2)； Ser 1.77(2)； Glu 2.07 (2)； Ala 3.98(4)； Val 1.08(1)； lie 1.89(2)； Leu 5.14(5)； Tyr 2.94(3)； Phe 0.96(1)； Lys 1.99 (2)； Arg 3.04(3)° _ — 實例 20 製備 Tyr_2-Th「_1-([Ile2 Ala15 Leu27]bGRF (1-29)NH2)，与氟乙酸鹽合成結構如下之GRF類似物肽Seq ID38: H16 Tyr-Thr -Tyr~I le-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-HH2(MCF3COOH 鹽存在），依公告 PCT專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中： Asp 4.07(4)； Thr 1.87(2)； Ser 1.75(2)； Glu 2.07 (1); Ala 2.94(4); Val 1.09( l5; lie 2.87(3); Leu 5.12(5)； Tyr 2.92(3)； Phe 0.96(1)； Lys 2.00 (2)； Arg 3.05(3) ° _- 49 - 甲 4(210X297 公沒） ....................................一 .........::¾..............................^.........一 .................终 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 2i 挪 3 A6 B6 五、發明说明（4 8 ) {請先閱讀背面之注意事項再填穽本页) 實例 21 製備 Tyr-LThf-i-nThr2 Ala15 Leu27]bGRF (1-29) NH2}，三氟乙酸鹽合成结構如下之GRF類似物肽Seq ID39: <ί17 Tyr-Thr -Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NHziWCFsCOOH 鹽存在），依公告 PCT專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟A逐步進行 *該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中： Asp 4.05(4)； Thr 2.68(3)； Ser 1.77(2)； Glu 2.07 (2)； Ala 2.90(3)； Val 1.08(1)； lie 1.89(3)； Leu 5.20(5)； Tyr 2.87(3)； Phe 0.93(1); Lys 2.01 (2)； Arg3.07(3)。 —一寅例 22 製備 Tyr^-Ser — i- HThrz Ala15 Leu27]bGRF (1-29)NH2}，三氟乙酸鹽 •打. •線. 合成结構如下之GRF類似物肽Seq ID40: #18 Tyr-Ser Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(MCF3COOH 鹽存在），依公告 PCT專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中： Asp 4.11(4)； Thr 1.82(2)； Ser 2.64(3)； Glu 2.05 (2); Ala 2.90(3); Val 1.04( 15; lie 1.87(2); Leu 5.16(5)； Tyr 2.92(3)； Phe 0.94(1)； Lys 2.01 (2)； Arg 3.04 (3)。 _~ 5 0 - 甲4(210X 297公潑）五、發明說明（49) 實例 23 製備 Tyrq-Thr-s-Tyr-z-Thr-iUThrz Ala15 Leu27]bGRF (1-29)NH2}，三氟乙酸鹽合成结構如下之G R F類似物肽S e q I D 4 1 : <Π 9 T y r - T h r Tyr-Thr-Tyr_Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr_ Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln_Leu-Ser-Ala_Arg-Lys-Leu_ Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-HH2 (M CF3COOH 鹽存在），依公告PCT專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中：Asp 4.06(4); Thr 3.66(3); Ser 1.85(2); Glu 2.05 (2)； Ala 2.93(3)； Val 1.09(1)； lie 1.91 (2)； Leu 5.15(5)； Tyr 3.91(4)； Phe 0.95(1)； Lys 2,00 (2); Arg 3.04(3)。 __ 實例 24 製備 Tyr-^la-i-HLeu^jbGRF (1-29)NH2)，三氟乙酸鹽 (- 合成结構如下之GRF類似物肽Seq ID42:Tyr-Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala_Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Len-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2(MCF3C00H 鹽存在），依公告 PCT 專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟A逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中：Asp 4.01(4)； Thr 0.97(3)； Ser 1.88(2)； Glu 2.00 (2)； Gly 1.02(1)； Ala 3.88(4)； V a^i 0.97(1)； lie 1.86 (2)； Leu 5.03(5); Tyr 3.03(4)； Phe 0.96 (1); Lys 2 . 18 (2) ; Arg 3.03 (3)。 A6B6 ....................................ί ..............篆..............................tr.........................终{請先《讀背面之注意事項再填宵本页) 甲 4(210X297 公沒） 2139^3 A6 B6 五、發明說明（50 ) 實例 25 製備 Tyr-A-Ala — sTyrWMa-iiaei^WbGRF (1-29)NH2)，三氟乙酸鹽合成结構如下之GRF類似物肽Seq ID43: itl3 Tyr-Ala Tyr-Ala-Tyr-Ara-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 (W CF3COOH 鹽存在），依公告PCT專利申請案PCT/US90/02923中敘述之步驟A 逐步進行，該案列於此為參考。胺基酸分析，理論值列於括號中：Asp 3.97(4); Thr 0.90(1); Ser 1.74(2); Glu 1.98 (2)； Gly 1.04(1)； Ala 4.85(4)； Val 0.91(1)； lie 1.77 (2)； Leu 5.13(5)； Tyr 4.14(4)； Phe 0.99 (1); Lys 2.07 (2)—;—Arg 3.05(3)。 ....................................................^..............................^...............................终 (請先閱讀背面之注意事項再填穽本頁) _-52 - 甲 4(210X297公沒）

I 3 s9 32

6 fl A R 五、發明说明（51 ) 表1.選定之GRF類似物之試管内效力和試管内血獎安定：度肽列序 Seq. ID No. 試管内效力-t 1管内；血漿 t ** h/2 (分鐘） [Leu27]-bGRF(l-29)NH2 5 1:00 24.8 (S 驗 l). Ile_2-Pro-1{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2} 18 0.045 43.2 (茛驗1) _ Tyr-2-Ala_1{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2} 25 0.13 38.5 (茛驗1) Tyr_4-Ala'3-Tyr'2-Aia'1{[Leu27]-bGRF(l-29)NH2} 19 0.052 297.1# (茛驗2). 1 * 如 Friedman 等人所敘述（Ι_ηί—· J. Peptide and (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •装·

Protein Res. 37:14-20[1991])，Μ 牛腦下垂體則葉细胞培養号試管内試驗肽。< - .打. 如 Kub Uk等人所敘述（Drug Met. D ί sp · 1 7 : 393 - 397 C 1 989 ])，將30wM肽於牛血漿中37°0下試管內培養。此處所列之數值乃[Leu27]-bGRF(l-29)NH2(Seq. ID 5)直接於血漿中培養或分別從延伸肽Seq. ID 18 ，25或 19所產生之[Leu27]-bGRF(l-29)NH2(Seq. ID 5)之半衰期。以二種不同之匯集血漿進行二種實驗，括號内指示茛驗1和實驗2 。 . S K不同之匯集牛血清試驗肽这eq id. 19相對於 [Leu27]-bGRFU-29)NH2(Seq. ID 5)，）Seq. ID 5 於此血漿檢品中之半衰期為50.2分鐘。 -53 - 甲 4(210X297 公发） % A6B6 五、發明説明（52 ) 表2.在Holstein公牛餵食模式中各種劑量的 [Leu27]-bGRF(l-29)NH2(Seq. ID 5)和 Ile-2-Pr〇-1{ [Leu27]- bGRF (1-29) NH-2}(Seq 18)靜脈注射後，血清GH反應。w

ID 處理劏垦毫微莫耳 /公斤反應之動物數目高峰 (奄微克/ 毫升）到達高峰之時間 (分）頭横0-8 小時 (單位） A* ^ Β· A* B* A1 B1 食鹽水 0 0^ 32.4b 32.4b 89b 896 4.3b 4.3& Seq ID 18 0.02 8/10" 71.26·£ 76.9^ 23c 18c 4.6°'f 5.06-c Seq ID 5 Θ.20 9/101 119.8C 130.9C 23c 14c 6.8d 7.0° Seq ID 38 0,20 10/1^ 101.4C.0 101.4C 26c 26c 6.ya 6.3C·0 Seq ID 18 20.0 ΙΟ/ΗΤ 137.8° 137.8C 23c 23L 10.1* iO.V SEM .04 9,1 8 8 J .3 p值' .0001 .007 .007 .04 M .0001 .0001 {請先閱讀背面之注意事項再填窵本頁) •装. *訂· 實驗動物於餵食前2小時靜注所示之狀劑量’方法如

Moseley 等人於 J. Endocrinology 117:253-259 (1 9 8 8 )中所敘述。線. a 分析值A包括所有公牛，分析值8僅包括對GRF注射有反應之公牛和對照姐公牛。 b,c,d,e檷内不同的註腳數值為备意義的差異（Ρ〈·05) 54 甲 4 (210X297 Υ 发） 3 r.M 93 t 2

6 6 A B 五、發明説明（53) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 表3.在Holstein公牛餵食棋式中各種劑量的 [Leu27]-bGRF(l-29)NH2(Seq. ID 5)和

Tyr-4-Ala_3-Try-2-Ale_1{[Leu2'7]-bGRF(l-29)NH 2)(Seq. ID 19)靜脈注射之後之血清應。" 處理劑量毫微莫耳 /公斤反應之動物數目高峰 (毫微克/ . 奄升）到達高峰之時間 (分）面_構0_10 小時 (單位）< A* Ba ' λ B A B 僉鹽水· 0 --- 30.96 30.9b 45b 45b 3.9b 3.9b Seq ID 5 0.02 9/12c>e 91义 101.3C 4Γ 2(f -4.7b,c 4.7 * Seq ID 19 0.02 10/12^° 88.5C 92.4C 306 22c 4.8C AA^,C Seq ID 5 0.20 11/12β 793c- 79.16，c 21° 18C 5.4f 53c Seq ID 19 0.20 7/12c 97.4C 120.Γ 63b 8C 5.4C 5.4c'd Seq ID 19 2.0 9/12^ 74.5C 70.86.c 246 18l 6.9。 6.8e SEM .10 15.9 17.3 14 8 4 .4 p值 .0001 .06 .06 ,2S .11 .0008 .007 EMS ' .1117 3042 3623 2260 763 2281 2483 ::: 實驗公牛於餵食前2小時靜注所示之肽劑量，方法如

Moseley 等人於 J· Endocrinology 117:253-259 (1 9 8 8 )中所敘述。 a 分析值A包括所有公牛’分析值B僅包括對G R F注射有反懕之公牛和對照姐公牛 b,c,d,e檷内不同的註腳数值為有意義的差異（P<.〇5)。 -55 - f 4(210X297 公 *) A6 B6 五、發明説明(54 ) 序列表 ⑴一般資料： (i) 申請者：Kubiak, Te「esaM. - • Sharma, Satist K. (ii) 發明標題：融合多肽 (iii )序列數目：4 2 (iv )通信地址： (A)地址：Upjohn Company (普強公司）-Corp. Patents & Trademarks (專利和商標） (B 街：301 Henrietta Street Ο市：Kalamazoo Ο 州：M i c h i g a「（密西根）_ _ (D國：U S A (美國） (F)郵遞區號：4 9 0 0 1 ·-- (V )電腦可讀示型式·· 機型：d i s k e 11 e ( 3 Μ 3 . 5 , D S d 〇 u b 1 e s i d e 1 · 0 Μ B ) Θ電腦：IBM PC combatible 〇操作系統：PC-D0S/MS-D0S O軟體：Word Perfect 5.1 (vi )目前申請資料： (A)申請號碼： ©列案日期：〇分類： (vii )先前申請資料： _- 5 6 - 甲 4(210X 297C沒） (請先閱讀背面之注意事項再填宵本页) .装. •訂· . A6 56 五、發明议明（55) ㊇申請號碼：US 07/626,7 27 ©列案日期：1 3 / 1 2 / 9 0 (vffi )先前申請資料： ⑼申請號碼：US07/614,170 (B列案日期：14/11/90 (vii )先前申請資料：㈧申請號碼：PCT/US90/02923 ©列案日基：30/05/90 (vii )先前申請資料：㈧申請號碼：US07/368.231 (B列案日期：16/06/89 (vii )先前申請資料： _ ㈧申請號碼：US07/50(3,605 (B列案日期： 09/04/90 _ (viii )律師/事務所資料： (A)姓名：DeLuca, Mark (B註冊號碼：33229 〇參考/案號：4595 (ix )電訊連絡資料： (A)電話：616 385 5210 (B 電傅：616 385 6897 ⑵S E Q I D 1號之資料： ^ (i )序列特微： (A)長度：33 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •訂· .綠· _- 57 - 甲 4(210X297公沒） A6B6 五、發明说明（56) Θ型式：胺基酸〇形勢：線型 (X i )序列說明：S E Q I D 1號： Tyr Val Asp Ala lie Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys 1 5 10 Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin 15 20 Asp lie Leu Ser Arg Gin Gin Gly Glu 25 30 (3) SEQ ID 2號資料： (i )序列特徵：㈧長度：40 _ (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (X ί )序列說明：S E Q I D 2號 Tyr lie Asp Ala lie Phe Thr Ser Ser Tyr Arg Lys 1 5 10 Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin 15 20 Asp lie Leu Ser Arg Gin Gin Gly Glu Arg Asn Gin 25 30 35 Glu Gin Gly Ala 40 (4) SEQ ID3 號資料： (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •訂· _- 58 - 甲4(210X 297t'沒） A6 B6 213¾^3 五、發明說明（57) (i )序列特徵：㈧長度：29 (B型式：胺基酸 - 〇形勢：線型 (i X)特性： (A)名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 ©位置：Xaa29 (X i )序列說明：S E Q I D 3號：

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys 1 5 10

Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin 15 _20

Asp lie Leu Asn X a a 25 -- ⑸S E Q I D 4號資料： (i )序列特徵： <A)長度：29 ©型式：胺基酸 (D形勢：線型 (i X)特性：仰名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 ©位置：Xaa29 (X i )序列說明：S E Q I D 4號

Tyr lie Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys _- 59 - 甲 4(210X 297乂沒） (請先閱讀背面之注意事項再填穽本頁) •装· .訂· •線· A6B6 五、發明説明（58 ) . 1 5 10 V a 1 Leu A1 a Gin Leu Ser A 1 a A r g Lys Leu Leu Gin 15 20 Asp lie Leu A s η X a a 25 (S) S E Q I D 5 號資料： (i )序列特徵：長度：29 (B型式：胺基酸 O形勢：線型 (ix)特性：钩名稱/關鐽：C -端胺化之精胺醯基殘基 Θ 位置：X a a 2 9 U i )序列說明：SEQ ID 5號__ Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys 1 5 10 Val Leu Gly Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin 15 20 Asp lie Leu Asn X a a 25 ⑺S E Q I D 6號資料： (i )序列特徵： ^ (A)長度：6 (B型式：胺基酸 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本π) __-60 -甲 4(210X 297公发） 213923 A6 B6 五、發明说明（59: Ο形勢：線型 (X i )序列說明：S E Q I D 6號 Tyr Ala Gly Por lie Pro ⑻S E Q I D 7號資料： (i )序列特徵： iA)長度：8 ©型式：胺基酸〇形勢：線型 (xi)序列說明：SEQ ID 7號 Lys Pro Tyr Ala Gly Pro lie Pro 1 5 ⑼S E Q I D 8號資料： _ 一 (i )序列特徵： (A)長度 (B型式 Ο形勢 (x i )序列說明 Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala 1 5 (1 0 ) S E Q I D 9 號資料： (i )序列特徵： (A)長度：6 ®型式：胺基酸 <D形勢：線型胺基酸線型 SEQ ID 8號 -61 - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .装· •打. 甲 4(210X 297^:^) 2139^3 A6 B6 五、發明説明（60) (>(1)序列說明：5£0 10 9號： Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala 1 5 (11) S E Q I D 1 0 號資料： (i )序列特徵妁長度 Θ型式 Ο形勢 (x i )序列說明 10 胺基酸線型 SEQ ID 10號： Phe Ala Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala 1 5 10 (12)SEQ ID 11號資料： __ (i )序列特徵 l〇 — 胺基酸線型 SEQ ID 11 號： iAJ長度 (B)型式 O形勢 (χ i )序列說明

Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala 1 5 (13)SEQ ID 12號資料： (i )序列特激： (AJ長度：1 4 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 10 (請先《讀背面之注意事項再填寫本页) δ2 Τ4(210Χ297 7^) A6 B6 ^139^3 五、發明說明（61 ) (X i )序列說明：SEQ ID 12號：

Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Ala Gly Pro 1 5 10- T y r Ala (1 4 ) S E Q I D 1 3 號資料： (i )序列特徵：㈧長度：16 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (xi)序列說明：SEQ ID 13號：

Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Ala 1 5 一― 10

Gly Pro Tyr Ala 15 -- (15)SEQ ID 14號資料： (i )序列特徵：㈧長度：29 (B型式：胺基酸 <D形勢：線型 (i X)特性： ⑼名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯莛殘基 (B 位置：Xaa29 ^ (：< i )序列說明：S E Q I D 1 4號：

Tyr Thr Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys 甲 4(210X 297乂沒） (請先聞讀背面之注意事項再填窠本页) •装· .打· 63 A6 B6 五、發明說明（62) 1 5 10 Va 1 Leu Ala Gin Leu S e r ' A 1 a Arg L y s Leu Leu Gin 15 20 - Asp lie Leu A s n Xaa 25 (16) SEQ ID 15號資料 ( 1 )序列特徵：钩長度： 11 ©型式：胺基酸〇形勢：線型 (i X )序列說明： SEQ ID 15號 Met Pro A 1 a His Pro Hi s Pro- 一H i s Pro His A 1 a 1 5 10 (17) SEQ ID 16號之資料： ( )序列特徵：内長度： 11 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (X ί )序列說明： SEQ ID 16號 Met Ala Pro His Ala His Ala His Ala His Ala 1 5 ' 10 (18) S E Q I D 1 7號之資料： 5Γ (i )序列特徴： (Αί長度： 11 64 - 甲 4(210X 297公沒） 2139Γ.3 五、發明説明（63) A6 B6 ©型式 :胺基酸〇形勢 :線型 (X i)序列說明：SEQ ID 17號： - Met Gly Pro Hi s Pro His Pro His Pro His A 1 a 1 5 10 (19)SEQ ID 18號之資料： (i )序列特徵 (A)長度：31 (B型式 :胺基酸〇形勢 :線型 (i χ )特性： (A)名稱 /關鍵：C -端_藏胺化之精胺醯基殘基 (B位置 :X a a 3 1 (x i )序列說明： SEQ ID 18號：- lie Pro Tyr A1 a Asp A 1 a lie P h e Thr A s n S e r T y 1 5 10 A r g Lys Val'Le u Gly Gin Leu S e r Ala A r g Lys L e 15 20 Leu Gin Asp 11 e Leu A s n Xaa 25 30 (20)SEQ ID 19號之資枓： (i )序列特徵： 5Γ (A)長度：33 Θ型式 :胺基酸 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .装· .打. .綠· _-65 - 甲4(210X 297公沒） 2139?；3 A6B6 五、發明说明（64) Ο形勢：線型 (ί X)特性：㈧名稱/闞鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 ©位置：X a a 3 3 (x i )序列說明：S E Q I D 1 9號 Tyr Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Ser 1 5 10 Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg 15 20 Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Ser X a a 25 30 (21)SEQ ID 20 號之資料： _ — (i )序列特徵：㈧長度：3 9 - Θ型式：胺基酸〇形勢：線型 Ux)特性： (Αί名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺臨基殘基 (Β 位置：Xaa39 (X i )序列說明：S E Q I D 2 0號 Phe Ala Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala Tyr Ala 1 5 — 10 Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu 15 20 {請先閱讀背面之注意事項再填窩本页) •装· •打· _- 6 6 - 甲 4 (210X297 公发） 2139^3 A6 B6 五、發明说明（6 5) A 1 a Gin Leu S e r Ala A r g L y s Leu Leu Gin Asp lie 25 30 35 Leu A s n X a a - (2 2 ) S E Q I D 2 1號之資料： ( i )序列特徵： (A)長度： 45 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (i x)特性： (Α)名稱/ 關鐽：C -端臨胺化之精胺醯基殘基 Θ位置：X a a 4 5 (X ί )序列說明： SEQ ID 21犟— Ar g Pro V a 1 Pro G 1 y Pro Phe Ala L y s Pro T y r A 1 a 1 5 10 G 1 y Pro T y r Ala T y r Ala Asp Ala lie Phe Thr A s n 15 20 S e r T y r A r g L y s V a 1 Leu G 1 y Gin Leu S e r Ala A r g 25 30 35 L y s Leu Leu Gin Asp lie Leu A s n X a a 40 45 (23)SEQ I D 2 2號之資料： (i )序列特徵： r- (A)長度：1 0 (B型式：胺基酸 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .¾. .打· _~ 6 7 - 甲 4(210X 297公沒） 2139 A6 B6 五、發明說明（66 ) 〇形勢：線型 (xi)序列說明：SEQ ID 22號 Phe Ala Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala 1 5 10 (24) SEQ ID 23號之資料： (i )序列特徵：㈧長度：16 <B型式：胺基酸〇形勢：線型 (X i )序列說明：S E Q I D 2 3號 Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Ala 1 5 — — 10 Gly Pro Tyr Ala 15 - (25) SEQ ID 24號之資料： (i )序列特徵：㈧長度：27 ©型式：胺基酸〇形勢：線型 (ix)特性： W名稱/關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B 位置：Xaa27 ^ (xi)序列說明：SEQ ID 24號 Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) •打· .線. _-68 - 甲 4 (210X297 公沒） 2139S3 A6 B6 五、發明說明（67 ) 1 5 10 G 1 y Gin Leu S e r Ala A r g L y s Leu Leu Gin Asp lie 15 20 - Leu Asn Xaa 25 (26) SEQ I D 2 5號之資料： (i i )序列特徵：㈧長度： 31 (B型式·· 胺基酸〇形勢：線型 (i x)特性： (Α)名稱/ 關鍵 :c -端_睦^胺化之精胺醯基殘基 (B位置： X a a 3 1 (x i )序列說明： SEQ ID 2 5 號—- Ty r Ala Ty r Ala Asp A 1 a lie Phe Thr S e r S e r T y r 1 5 10 A r g L y s Va 1 Leu G 1 y Gin Leu S e r Ala A r g L y s Leu 15 20 Leu Gin Asp lie Leu Asn Xaa 25 30 (27)SEQ ID 26號之資料： (i )序列特徵： ; (A)長度：33 ©型式··胺基酸 _-69 - 甲 4 (210X297 公发） (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. •打. A6B6 五、發明说明（68) 〇形勢：線型 (ix)特性：㈧名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 ©位置：Xaa33 (X i)序列說明：S E Q I D 2 6號 Gly Pro lie Pro Tyr Ala Asp Ain lie Phe Thr Asn 1 5 10 Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Ala Arg 15 20 Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn X a a 25 30 (28)SEQ ID 27 號之資料： __ (i )序列特徵：㈧長度·· 3 5 β型式：胺基酸〇形勢：線型 (i X )特性： ⑼名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 ©位置：Xaa35 (X i )序列說明：S E Q I D 2 7號 Tyr Ala Gly Pro lie Pro Tyr Ala Asp Ala lie Phe 1 5 — 10 Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser 15 20 (請先閑讀背面之注意事項再填寫本页) .¾. •訂. .. ~ 7 0 - 甲 4(210X297 公沒） 2139^^ A6 B6 五、發明說明（69 ) Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn Xaa 25 30 35 (29)SEQID28 號之資料： - (i )序列特徵：灼長度：37 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (i X)特性：㈥名稱/關_: C -端醯胺化之精胺醯基殘基 Θ 位置：X a a 3 7 (x i )序列說明：S E Q I D 2 8號 Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Il_e_Pro Tyr Ala Asp Ala 1 5 10 lie Phe Thr Asn Ser Tyr Ar L-v s Van Leu Gly Gin 15 20 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn 25 30 35 Xaa (3 0 ) S E Q I D 2 9號之資料： (i )序列特徴： (A)長度：33 ®型式：胺基酸 5 〇形勢：線型 (ix)特性： (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .装. •打. _-71 - 甲 4(210X297 公沒） A6 B6 ^13923 五、發明说明（7〇) ㈧名稱/關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B 位置：Xaa33 (xi)序列說明：SEQID29號 -

Gly Pro Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn 1 5 10 S e r Tyr A r g L y s Va 1 Leu Gly Gin Leu S e r A 1 a A r g 15 20 L y s Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn X a a 25 30 (31 ) SEQ ID 30號. 之資ί 4 ： ( i )序列特徵：㈧長度： 35 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (: i x)特性： (A?名稱/ 關鐽：c -端醯胺化之精胺醯基殘基 ®位置： Xaa35 (x i )序列說明： SEQ ID 30號 Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala Tyr A 1 a Asp A 1 a lie Phe 1 5 10 Thr Asn S e r Tyr A r g L y s Va 1 Leu Gly Gin Leu S e r 15 So Ala A r g L y s Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn X a a 25 30 35 甲 4(210X 297 V沒) .....................................(.............¾..............................^.........{ ................Sf (請先《讀背面之注意事項再填寫本页) A6 B6 油S3_ 五、發明说明（71) (32) SEQ ID 31號之資料： (i )序列特徵：趵長度：37 (B型式：胺基酸 Ο形勢：線型 (ix)特性： <A)名稱/關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B 位置：X a a 3 7 (xi)序列說明：SEQ ID 31號 Lys Pro Tyr Ala Gly Pro Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala 1 5 10 lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg^Lys Val Leu Gly Gin 15 20 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Le lu_G-1 n Asp lie Leu Asn 25 30 35 X a a (3 3 ) S E Q I D 3 2號之資料： (i )序列特徵：㈧長度：39 ©型式：胺基酸 (D形勢：線型 (i X)特性： g (A)名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B 位置：X a a 3 9 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. •打. .綠· 甲4(210X 297乂沒) 2139^3 五、發明說明（72) (X i )序列說明： SEQ ID 32號 Phe Ala Lys Pro Ty r Ala G ly Pro Ty r A 1 a T y r A 1 a 1 5 10- Asp A1 a lie Phe Thr A s η S e r T y r A r g L y s Va 1 Leu 15 20 G 1 y Gin Leu S e r Ala Ar g Lys Leu Leu Gin Asp lie 25 30 35 Leu A s n Xa a (34)SEQ ID 33號之資料： (i )序列特徵·· ί/V長度： 41 (Β型式：胺基酸 _ — (D形勢：線型 Πχ)特性： m-— ㈧名稱/ 關鐽：C. -端齒胺化之精胺醯基殘基 (B 位置：Xaa41 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •装. .打. ( x i )序列說明： SEQ ID 33號 G 1 y Pro Phe Ala Lys Pro T y r Ala G 1 y Pro Ty r Ala 1 5 10 Ty r Ala Asp Ala lie Phe Thr A s n S e r Ty r A r g Lys 15 20 Va 1 Leu G 1 y Gin Leu S e r Ala 岛「g Lys Leu Leu G 1 n 25 30 35 Asp lie Leu A s n X a a 甲4(210X 297W匁) A6B6 五、發明說明（7 3) 40 (35) SEQ ID 34號之資料： U )序列特徵： - (A)長度：4 3 ©型式··胺基酸〇形勢：線型 (ix)特性： ίΑ)名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 Θ 位置：X a a 4 3 (xi)序列說明：SEQ ID 34號 Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Ala Gly Pro 1 5 10 Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr 15 _ Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu 25 30 35 Leu Gin Asp lie Leu Asn X a a 40 (36) SEQ ID 35號之資料： (i )序列特徵： (A)長度：45 ©型式：胺基酸 5 〇形勢：線型 (i X )特性： (請先聞讀背面之注意事項再填寫本瓦) .装. •打· 甲 4(210X 297 公发） 75 A6B6 五、發明议明（74 ) 抑名稱/關鍵：C-端醯胺化之精胺醯基殘基 ⑭位置：Xaa45 (xi)序列說明：SEQID35號 - Arg Pro Val Pro Gly Pro Phe Ala Lys Pro Tyr Ala 1 5 10 Gly Pro Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn 15 20 Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin Leu Ser Ala Arg 25 30 35 Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn X a a 40 45 (37)SEQ ID 36 號之資料： __ (i )序列特徵：㈧長度：3 1 .一二- Θ型式：胺基酸〇形勢：線型 (U)特性： •A)名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 Θ 位置：X a a 3 1 (x i )序列說明：S E Q I D 3 6號 Val Ala Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr 1 5 i 10 Arg Lys Val Leu Gly Gin Len Ser Ala Arg Lys Leu 15 20 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) -¾. .打· .線. _- 76 - 甲 4(210X 297i'沒） 213923 A6 B6 五、發明说明（？5) Leu Gin Asp lie Leu A s η X a a 25 30 (38)SEQ ID 37號之資料： - (i )序列特徵：㊇長度： 3 1 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 U χ)特性：趵名稱/ 關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B位置： Xaa3 1 ( χ i )序列說明： SEQ ID 37號 Tyr Thr Tyr Ala Asp Ala I 1一 e_ — Phe Thr A s η S e r Tyr 1 5 10 A r g Lys V a 1 Leu Ala Gin L e r Ala A r g Lys Leu 15 20 Leu Gin A sp lie Leu A s n X a a 25 30 (39)SEQ ID 38號之資料： (i )序列特徵： (A)長度： 31 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 (i χ)特性： (A)名稱/ 關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 -77 - 甲 4(210X‘297i沒) 213923 A6 B6 五、發明说明（7 6* (B 位置：X a a 3 1 (x i )序列說明：S E Q I D 3 8號 Tyr Thr Tyr lie Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr 1 5 10 Arg Lys Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu 15 20 Leu Gin Asp Leu A s η X a a 25 30 (40) SEQ ID 39號之資料：(i )序列特徵： (A)長度：3 1⑭型式：胺基酸 —一〇形勢：線型 (U )特性：㈧名稱/關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 ©位置：X a a 3 1 (x i )序列說明：S E Q I D 3 9號 Tyr Thr Tyr Thr Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr 1 5 10 Arg Lys Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu 15 20 Leu Gin Asp lie Leu Asn Xaair 25 30 (41) SEQ ID 40號之資料： .......................:*·............(.............装..............................打.........(................綠 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 7 8 - 甲 4(210X 297公沒） A6 B6 五、發明说明（77 ) (i )序列特徵： CA)長度：3 1 (B型式：胺基酸 - 〇形勢：線型 (ix)特性：趵名稱/關鍵：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B 位置：X a a 3 1 (x i )序列說明·· SEQ ID 40號 Tyr Ser Tyr Thr Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr 1 5 10 Arg Lys Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu 15 _20 Leu Gin Asp I 1 e Leu Asn X a a 25 30 一丨嗎-- (42)SEQID40號之資料： (i )序列特徵：㈧長度：3 3 ©型式：胺基酸〇形勢：線型 (i X )特性：㈧名稱/關鐽：C -端醯胺化之精胺醯基殘基 (B位置：Xaa33 吴 (χί)序列說明：SEQ ID 41號 Tyr Thr Tyr Thr Tyr Thr Asp Ala lie Phe Thr Asn 213923 (請先閱碛背面之注意事項再填寫本頁) .¾. •打· 79 甲 4(210X 297乂沒） A6 213923 五、發明説明（7 8 ) 1 5 10 S e r T y r A r g L y s Va 1 Le u Ala Gin Leu S e r Ala A r g 15 20 - L y s Leu Leu Gin Asp 11 e A s η X a a 25 30 (43)SEQ ID 42號之資料： ( i )序列特徵： (A)長度： 33 (B型式：胺基酸〇形勢：線型 ( ix)特性：㈧名稱/ 關鍵： c -端_1胺化之精胺醯基殘基 (B位置： X a a 3 1 (x U序列說明： SEQ ID 4 2^^- T y r Ala T y r A 1 a Asp A 1 a lie P h e Thr S e r S e r T y r 1 5 10 A r g L y s V a 1 Leu G 1 y G 1 n Leu S e r Ala A r g L y s Leu 15 20 Leu Gin Asp lie Leu As η X a a 25 30 (44)SEQ ID 43號之資料： ( i )序列特徵：㈧長度： 33 (B型式：胺基酸 80 - 甲 4(210X297乂沒） 2139^ A6B6 五、發明說明（7 9 ) 〇形勢：線型 (ix)特性：㈧名稱/闞鍵：C -端醯胺化之精胺磕基殘基 Θ 位置：Xaa33 (X ί )序列說明：S E Q I D 4 3號 Tyr Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Ser 1 5 10 Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin Leu Ser Ala Arg 15 20 Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Ser X a a 25 30 -81 甲 4(210X297 公沒） #.................................................¾...............................打..........Λ .................^...................................................... {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

!·—種非自然生成之融合蛋白霣*含有一個延伸肽部份， Μ其C-末皤共價鍵结至一個核心蛋白質部份之Ν-末端，該延伸肽部份具下式： Α-Χ-Υ(Χ'-Υ)„ 其中 Α 是視所需的，且當存在時是甲硫胺酸； η 是0至20 ; X 壤自包括除了 His或Cys以外所有自然生成之胺基酸殘基； X’ 選自包括脯胺酸及羥基脯胺酸以外之所有自然生成之胺基酸殘基； Y 埋自包括脯胺酸、羥基脯胺酸、丙胺酸、弱胺酸及蘇胺酸·除了當η是0 ，且Α不存在時，則Υ 選自下列包括丙胺酸、弱胺酸及蘇胺酸。 2. 根據申講專利範園第1項之非自然生成之融合蛋白質* 其中A係存在，且X選自下列包括Pro, Gly, Ala及 S e r ° 3. 根據申謫專利範画第1項之非自然生成之融合蛋白霣，其中η是0 至10。經濟部中央搮準局印製 (請先W讀背面之注意事項再填奪本頁} 4. 根據申謫専利範圃第1項之非自然生成之融合蛋白質，其中該具生物活性之多肽係選自包括：bGRF類似物、 EGF ; IGF-2 *胰高血糖激素；促皮質釋放因子；載諾菲甲 4(210X297 公濩) 2139 O AT B7 C7 D7 經濟部中央搮準局印製六、申請專利Λ® (dynorfin)，生長激素釋放抑制因子-14;内皮素；轉形生長因子α ;血管活性腸肽；人類>9 -酪嗎啡（/?-casomorphin);爾抑肽；爾釋出呔；人類HI;人類肽 YY;類胰高血糖激素肽-1片段7-37;類胰高血耱激素肽 -2;P物質；神經肽Y ;人類胰多肽；類胰島素生長因子-1;人類生長激素；牛生長激素；豬生長激素；催乳激素；人類生長激素釋放因子，牛生長激素釋放因子；豬生長激素釋放因子；羊生長激素釋放因子；間白素 -1召；及間白素-2。 5. 根據申謫專利範園第1項之非自然生成之融合蛋白質，其中該延伸肽部份系選自下列包括： Gly-Pro-Ile-Pro, Tyr-Ala-Gly-Pro-Ile-Pro, Lys-Pro~Tyr-Ala-Gly-Pr〇-Ile-Pro, Tyr-Ala, Gly-Pr〇-Tyr-Ala, Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Lys-Pr〇-Tyr-Ala-Gly-Pr〇-Tyr-Ala, Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pr〇-Tyr-Ala, Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pr〇-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala,Val-Pr〇-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Arg-Pro-Val-Pro-Gly-Pro-Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala, Tyr-Ala-Tyr-Ala, Val-Ala, Met-Pro-Ala-His-Pro-His-Pro-His-Pro-His-Pro, Met-Ala-Pro-His-Ala-His-Ala-His-Ala-His-Ala, Met-Gly-Pro-His-Pro-His-Pro-His-Pro-His-Ala, Phe-Ala-Lys-Pro-Tyr-Ala-Gly-Pro-Tyr-Ala,及 (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 甲 4(210X297 公;¥) ο 3 1 2 A B c D 〜、申請專利範面 6 質白 S § 合融之成生然白 bh 之項 2 第圍。範 5 利至專3 請是申 η 據中根其質白 BR 3 合融之成生然自非。之酸項胺 6姐第為國基範殘利X' 專的請有申所據中根其 8 質白合融之成生然白非之。項酸 7 胺第脯園是範基利殘專 Υ 諝個申三據中根其 (請先«I讀背面之注意事項再填宵本頁) 9 融此的，成法生方然之自質非白之蛋項求 1欲第化園純範中利物専合請混申之據質根雜有及含霣自白 S I 合驟步下 M 括包法方接性擇選料材之 0 白 3 合融該化固可與質白蛋合融該；將觸 •装. 11 12 移去雜質；自該材料中分出融合蛋白質；混合融合蛋白質及DPP IV ;及分離該欲求之蛋白質。根據申請専利範匯第9項之方法層析柱中。根據申謫專利範圈第9項之方法延伸部份结合的一種抗體。根據申請專利範麵第9項之方法其中該材料係固定於其中該材料係可與該其中該材料是一種纆打線經濟部中央揉準 ii 印製固化之金靨離子連鑛的X ’殘基。且延伸部份含有至少3個為姐胺酸之 f 4(210X297 公廣)