CN113278059A - 一种重组人bnp蛋白及其应用 - Google Patents

一种重组人bnp蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113278059A
CN113278059A CN202110792534.2A CN202110792534A CN113278059A CN 113278059 A CN113278059 A CN 113278059A CN 202110792534 A CN202110792534 A CN 202110792534A CN 113278059 A CN113278059 A CN 113278059A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bnp
protein
recombinant
sequence
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110792534.2A
Other languages
English (en)
Inventor
罗奇斌
任毅
廖胜光
申玉林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Qiyun Nord Biomedical Co ltd
Original Assignee
Tianjin Qiyun Nord Biomedical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Qiyun Nord Biomedical Co ltd filed Critical Tianjin Qiyun Nord Biomedical Co ltd
Priority to CN202110792534.2A priority Critical patent/CN113278059A/zh
Publication of CN113278059A publication Critical patent/CN113278059A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Abstract

本发明提供了一种重组人BNP蛋白及其应用。其中所述重组人BNP蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；同时本发明还提供了编码上述重组人BNP蛋白的核苷酸序列，以及制备上述重组人BNP蛋白的方法。上述重组人BNP蛋白具有与天然BNP蛋白相同的免疫原性，而且具有更长的半衰期和更稳定性的活性，可用作天然BNP多肽的替代蛋白，用于后续BNP相关产品的进一步开发，如相关BNP检测试剂盒标准品的开发，制备急性心衰的药物等。

Description

一种重组人BNP蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及多肽化学领域，具体为一种重组人BNP蛋白及其应用。
背景技术
心血管疾病在全世界都是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。世界卫生组织在2004年9月26日第5个“世界心脏日”时，在日内瓦发表的一份公报指出，全球每年有约1700万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3，其中心力衰竭（HeartFailure,HF）是心血管疾病中严重危害人类健康的一种病理综合症。随着人口老龄化进程的加快及高血压、冠心病等心血管疾病发病率的上升，心力衰竭的发病率、死亡率也逐年增加。目前欧洲近10亿人口，至少有1500万心衰患者，2003年中国调查结果显示成人心衰患病率为0.9%，而今70岁以上人群心衰患病率已经大于10%，同时2019年中国心衰患者高达900万左右，心衰患者5年死亡率高达50%，而重度心衰患者1年的死亡率就可能达到50%。
心衰的治疗，一方面应该通过强心、利尿、扩血管来改善症状，另一方面应该抑制神经内分泌系统过度激活、改善心室重构以消除慢性心衰的发病基础。临床中心衰患者存在BNP相对或绝对量不足的情况。目前研究证实，B型人脑利钠肽（BNP）或非活性的N末端前人脑利钠肽（NT-proBNP）是有效检测心衰的心脏标志物，在综合疗法的基础上使用基因重组人脑钠肽（rhBNP）对急性充血性心力衰竭具有可靠的疗效。BNP是利钠肽家族的成员之一，来源于心脏，是一种心脏激素。BNP于1988首次在猪脑中发现，后来在人的心脏中分离纯化出且发现心脏的分泌量高于脑部。当心肌细胞受到压力或牵拉刺激后，首先形成B型利钠肽原前体（pre-proBNP），pre-proBNP 是由134个氨基酸组成的分子，并在心肌细胞内储存，当pre-proBNP在由心肌细胞中向外分泌时或分泌后会被蛋白酶分解为N端的26个氨基酸组成的信号肽和由108个氨基酸组成的B型利钠肽原（proBNP），后者在内切酶的作用下进一步裂解含有32个氨基酸组成的活性B型利钠肽（BNP）和一个由N端76个氨基酸构成的无活性的B型利钠肽（NT-proBNP）。二者均由心肌细胞分泌到血液中，均可作为心血管疾病的标志物，而作为外源性BNP，重组人脑钠肽（rhBNP）和内源性BNP一样，均为有活性的 BNP，其清除方式和速率相似，从而在心衰患者内源性BNP相对或绝对量不足的情况下，补充重组人脑钠肽（rhBNP）以缓解心衰患者的症状。
从临床角度来看，BNP比NT-proBNP更有特异性，更具有临床意义，首先从半衰期来看，BNP是22分钟，而NT-proBNP是120分钟，在一定时间内BNP更加方面临床医生及时的观察病情及治疗效果；其次BNP和NT-proBNP代谢途径差异大，BNP通过受体清除，而NT-proBNP通过肾代谢清除，此时在肾功能不全的前提下，评估NT-proBNP就失去了评估心衰的临床意义。
随着医学检验领域的发展，临床上需要一种兼具高度特异性和半衰期较长的心衰标志物。因此，提出一种重组人BNP蛋白及其应用，具有良好的应用前景和现实意义。
发明内容
针对上述背景技术中的不足，本发明提供一种重组人BNP蛋白及其应用，本发明的重新人BNP蛋白半衰期长，特异性强，可用于制备相关BNP检测试剂盒标准品的开发，以及制备急性心衰的药物等应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种重组人BNP融合蛋白，所述重组人BNP融合蛋白具有半衰期长，特异性强等效果。
所述重组人BNP融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，同时提供一种编码上述重组人BNP融合蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。
第二方面，本发明提供一种重组人BNP融合蛋白的制备方法，其主要步骤如下：
1）根据GENEBANK中提供的BNP成熟蛋白序列，获得BNP的成熟蛋白编码氨基酸及核苷酸序列，因为后续需要在大肠杆菌感受态细胞进行培养，所以根据大肠杆菌的密码子使用偏好，对其进行同义改造，获得改造好的BNP成熟蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸编码序列如SEQ ID NO：4所示；
2）用人工合成的方法按照“改造后BNP序列-接头序列-人工XTEN序列”合成重组BNP-XTEN融合序列，并在融合序列的5’端引入BamH I限制性内切酶位点以及保护碱基，在融合序列的3’端引入Xho I限制性内切酶位点以及保护碱基，得到最终重组BNP-XTEN融合序列，其核苷酸编码序列为SEQ ID NO：2所示，其对应的氨基酸编码序列如SEQ ID NO：1所示；
3）对2）中得到的重组BNP-XTEN融合序列以及PGEX-6P载体质粒进行双酶切反应，然后用连接酶进行连接反应，得到重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒序列；
4）将3）中得到的重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒转入BL21(DE3)感受态细胞并根据要求进行筛选，得到目的融合质粒阳性克隆；
5）将4）中筛选得到的重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒阳性克隆扩大培养，获得表达的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白，并进行重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的表达鉴定；
6）对5）所得的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白进行纯化，并计算其纯度值和浓度值；
7）对6）所得的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白进行体外活性检测；
8）对6）所得的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白进行稳定性检测。
所述的根据大肠杆菌的密码子使用偏好进行改造，是因为如果目的基因的密码子与表达宿主不匹配，会降低mRNA的翻译效率和稳定性，甚至终止翻译，通过对目的基因的密码子改造优化，使的目的基因在后续转化过程中能够稳定的表达。
所述的接头序列含有2-20个氨基酸，存在于BNP序列和XTEN序列之间，其含有多个甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser），优选地，所述的接头序列含有10个氨基酸序列，如SEQ ID NO：5所示。
所述的BamH I和Xho I限制性内切酶位点以及保护碱基分别为BamH I（SEQ IDNO.7:5’-cgcGGATCC-3’）和Xho I（SEQ ID NO.8:5’-ccgCTCGAG-3’）。
所述的重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，具体为重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒使用BamH I和Xho I双酶切后，使用1.5%的琼脂糖凝胶进行鉴定，鉴定结果如图3所示。
所述的重组质粒筛选方法为：在pGEX-6p载体质粒上具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因，其可以在涂有氨苄青霉素（Amp）添加剂的培养基中存活生长，从而筛选得到阳性克隆融合质粒。
所述的重组蛋白的纯化采用亲和层析法及疏水层析法，首先使用镍亲和层析对融合蛋白破菌上清液进行初步洗脱纯化，然后将洗脱后的蛋白溶液过凝胶脱盐柱除去高浓度咪唑，最后用疏水层析柱去处纯化后目标蛋白中的杂质。
所述的重组蛋白的体外活性检测采用离体动脉条测定法检测，具体为采用家兔动脉血管在配置好的台式液平滑肌浴槽中，然后分别给予10-8 ～10-4 mol/L的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白、重组BNP(新活素)的生理盐水溶液(阳性对照)，观察血管片段张力变化，记录相关数值并进行舒张率的计算及作图。
所述的重组蛋白的稳定性检测采用尾静脉注射至家鼠体重，然后在相应的间隔时间后使用ELISA试剂盒测定其血浆中BNP含量，记录相关数值，计算半衰期并作图。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明提供的一种重组人BNP融合蛋白具有显著增长的半衰期，能够在较长的时间内保证较高的特异性；
2.本发明提供的一种重组人BNP融合蛋白具有良好的体外生物学活性，方便后续在体外进行各种应用的开发；
3.本发明提供的一种重组人BNP融合蛋白的方法充分考虑了融合蛋白的结构及特性，具有生产简单、蛋白回收率高等优点。
附图说明
图1 BNP成熟蛋白基因密码子在大肠杆菌中偏性分析图；
图2质粒pGEX-6P物理图谱；
图3重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白质粒核苷酸序列琼脂电泳凝胶图；
图4重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白在BL21细胞内表达的SDS-PAGE的电泳凝胶图；
图5 重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋累计浓度-舒张反应曲线图；
图6重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的稳定性曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不受具体的实施方式所限制，以权利要求书为准，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料及来源
Taq DNA聚合酶，T4连接酶，BamH I， Xho I限制性内切酶，DNAmarkerDL 2000均购自大连TaKaRa生物工程公司；PGEX-6P载体、大肠杆菌BL21菌种购自Novagen公司；质粒纯化试剂盒购自QIAGEN公司；0901-HEIA (Human)购自Sigma公司；IPTG购自Amersco公司；蛋白分子量Marker购自凯基生物科技发展公司。
实施例1.重组人BNP蛋白氨基酸序列优化。
根据GENEBANK中提供的BNP成熟蛋白序列（GI号312207908），获得BNP的成熟蛋白编码氨基酸（32个氨基酸）及核苷酸序列（96个核苷酸），因为后续需要在大肠杆菌感受态细胞进行培养，所以根据大肠杆菌的密码子使用偏好（参考图1为BNP成熟蛋白基因密码子在大肠杆菌中偏性分析图），对其进行同义改造，具体为在BNP成熟蛋白氨基酸序列的第2、3、6、13、14、16、17、30、31位同义置换为大肠杆菌偏好的密码子，获得改造好的BNP成熟蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸编码序列如SEQ ID NO：4所示。
实施例2.人工合成BNP-XTEN融合序列。
采用人工合成的方法按照“改造后BNP序列-接头序列-人工XTEN序列”合成重组BNP-XTEN融合序列，并在融合序列的5’端引入BamH I限制性内切酶位点以及保护碱基，在融合序列的3’端引入Xho I限制性内切酶位点以及保护碱基，得到最终重组BNP-XTEN融合序列，其核苷酸编码序列为SEQ ID NO：2所示，其对应的氨基酸编码序列，如SEQ ID NO：1所示。
其中BamH I限制性内切酶位点以及保护碱基如SEQ ID NO：7所示，具体为5’-cgcGGATCC-3’，其中小写的cgc为保护性碱基，GGATCC为酶切位点，Xho I限制性内切酶位点以及保护碱基如SEQ ID NO：8所示，具体为5’-ccgCTCGAG-3’，同理小写的ccg为保护性碱基，CTCGAG为酶切位点。
其中接头序列含有10个氨基酸，存在于BNP序列和XTEN序列之间，具体为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，如SEQ ID NO:5所示，其对应的核苷酸如SEQ ID NO：6所示。
实施例3. 重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒序列连接。
将实施例2中获得的BNP-XTEN重组质粒和PGEX-6p质粒分别进行BamH I和Xho I双酶切和连接反应，构建重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒，其中具体酶切反应体系和连接反应体系如下：
酶切反应体系： 分别将BNP-XTEN重组质粒和PGEX-6p质粒各10μl，分别加入BamHI和Xho I酶各2μl，通用10xKbuffer 6μl，ddH2O 10μl，共30μl ，37℃水浴4h，65℃水浴15min终止酶切反应，得到各自酶切反应物。
链接反应体系：ddH2O（8.5μl），10 x Ligation Buffer（2.5μl），BNP-XTEN重组质粒酶切反应物（12μl），PGEX-6p质粒酶切反应物（6μl），T4 DNA Ligsase（1μl），共30μl，16℃连接过夜，65℃水浴15min终止连接反应。
上述连接反应物用QIAGEN Plasmid spin kit抽提质粒，用QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒。
最终得到纯化后的重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒。
实施例4. 重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒的转化和筛选。
将上述重组纯化后的PGEX-BNP-XTEN融合质粒转入 BL21(DE3)感受态细胞，筛选目的融合质粒，扩大培养，然后进行目的融合片段的大小鉴定，具体操作如下：
（1）取50μl BL21(DE3)感受态细胞，加入3μl重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒，置于4℃冰箱中冰浴30 min。
（2）在42℃水浴锅中热激90s ，马上放回冰盒上，冰浴2min。
（3）加500μl LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min，使菌体复苏并表达质粒上的抗生素抗性基因。
（4）取100μl转化液涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，完全吸收后，在37℃恒温箱中倒置培养过夜。
（5）次日挑取白色菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基扩大培养。
（6）用裂解法提取质粒，即使用BamH I和Xho I双酶切在前述酶切体系下进行酶切反应。
（7）取上述（6）中酶切反应产物10μl，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行片段序列长度鉴定，经过鉴定其长度与设计值一致，其长度在2.9kb左右，如图3所示。
实施例5. 重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的诱导表达及可溶性鉴定。
在实施例4步骤（5）的基础上，进一步培养至OD 600值约为0.6左右；加入浓度为1mmol/L的IPTG在25℃诱导表达至少6h，收获菌体；用8% SDS-PAGE电泳分析诱导前后总菌体蛋白，观察表达水平；再将IPTG诱导6h后的BL21重组菌用4℃的破菌液在12000r/min转速离心10 min，离心收集诱导表达菌体，分别收集上清和沉淀物，使用8% SDS-PAGE蛋白电泳鉴定，分析目的蛋白在超声裂解的上清还是沉淀中，实验结果证实在上清液中发现特异蛋白条带，而沉淀物中未发现相应特异蛋白条带，说明重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白是可溶性表达的，并进一步估算此蛋白条带大小在100kDa左右，与设计值大小一致，其电泳凝胶图如图4所示。
实施例6. 重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的纯化。
在实施例5收集得到重组融合蛋白的上清液的基础上，组合多种蛋白质纯化技术，从融合蛋白的上清液中分析纯化得到高纯度的目标蛋白，其步骤为：
（1）将蛋白加咪䂳至终浓度20mM，流加至镍柱顶端，用5倍体积30mM的咪䂳溶液洗涤。
（2）再用250mM的咪䂳溶液洗脱，除去绝大多数杂质蛋白，使得融合蛋白得以浓缩，得到高纯度的融合蛋白。
（3）然后将洗脱后的蛋白溶液过凝胶脱盐柱，除去高浓度咪䂳。
（4）利用凝血酶酶切融合蛋白，调整融合蛋白浓度为30 mg/ml，在2000ml酶切体系中，使用1200 U凝血酶37℃酶切4h。
（5）酶切后的蛋白溶液再次使用镍亲和层析柱纯化，使得目标融合蛋白进一步富集于穿透液中。
（6）将上述穿透液用SS-200HR凝胶层析进一步纯化，除去残留融合标签、凝血酶等杂蛋白，进一步富集，得到最终的纯化融合蛋白多肽。
经过以上步骤的纯化最终得到纯度高度95以上的重组PGEX-BNP-XTEN蛋白。
实施例7. 重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的活性检测。
采用离体动脉条测定法检测重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白体外活性，具体步骤如下：家兔耳缘静脉空气推注处死后，取其胸主动脉，制成1.5cm长、3-4mm宽的血管片段，并悬挂于含10ml通氧的37℃台氏液(体系为9.0g NaCl、0.42g KCl、0.24g CaCl2、0.1g NaHCO3、1.0g葡萄糖，用蒸馏水溶解后配制为1000ml溶液，调节pH值为7.4)的麦氏浴槽中，连接生物机能实验系统，记录血管张力的变化。初始张力为3.0g，平衡30min后，使用6μmol/L去甲肾上腺素进行预刺激，稳定1h，待收缩张力稳定后，再分别给予10-8 ～10-4 mol/L的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白、重组BNP(新活素)的生理盐水溶液(阳性对照)，观察血管片段张力变化。舒张率按以下公式计算：
Figure 555015DEST_PATH_IMAGE001
通过逐步增加药物浓度的方式来绘制累计浓度-舒张反应曲线，待药物浓度达到10-4 mol/L时，停止给药并记录舒张反应(参见，例如王跃民等人，[J]中国应用生理学杂志，2001(2)：174-177)，得到如图5所示的累计浓度-舒张反应曲线图。
从所得曲线图可知，重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白对家兔胸主动脉血管片段的舒张效果明显优于重组BNP(新活素)，并且在10-8 ～10-4 mol/L浓度区间内呈良好的剂量依赖性。
实施例8. 重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的稳定性检测。
将纯化的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白以及重组hBNP(新活素，阳性对照) 各自尾静脉注射至4只家鼠中（共8只），注射剂量均为2.8ng/g，注射体积1μl/g。分别于注射后1min、12h、24h、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d抽取静脉血，置于1％肝素抗凝处理过的1.5ml离心管中，37℃静置10min，3000rpm离心10min收集血浆，-20℃保存。采用ELISA试剂盒测定各时间点血浆中BNP含量，得到如图6所示的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的稳定性曲线。
从所得重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的稳定性曲线图6结合半衰期计算公式t1/2=0.693/k，其中k为消除速度常数，k=(Inc0-Inc1)/t，计算得到重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的半衰期平均值达到138h以上，比重组BNP(新活素，阳性对战)的半衰期平均值20min显著增长，能够在较长的时间内保证较高的特异性。
以上结果表明，本发明的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白具有良好的体外生物学活性，同时重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的半衰期138h明显长于重组BNP(新活素)的半衰期20min，可更加方面的进行后续试剂盒标准品的开发以及心衰相关药物研发等应用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津奇云诺德生物医学有限公司
<120> 一种重组人BNP蛋白及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 953
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Gly Ser Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg
1 5 10 15
Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu
20 25 30
Arg Arg His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Gly Glu
35 40 45
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val
50 55 60
Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
85 90 95
Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
100 105 110
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
115 120 125
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
130 135 140
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
180 185 190
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
195 200 205
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
210 215 220
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
225 230 235 240
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
245 250 255
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
260 265 270
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
275 280 285
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser
290 295 300
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
305 310 315 320
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
325 330 335
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser
340 345 350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
355 360 365
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
370 375 380
Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu
385 390 395 400
Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
405 410 415
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
420 425 430
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser
435 440 445
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
450 455 460
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
465 470 475 480
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro
485 490 495
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
500 505 510
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
515 520 525
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
530 535 540
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
545 550 555 560
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
565 570 575
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser
580 585 590
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
595 600 605
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
610 615 620
Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
625 630 635 640
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
645 650 655
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
660 665 670
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
675 680 685
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
690 695 700
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
705 710 715 720
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro
725 730 735
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
740 745 750
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
755 760 765
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro
770 775 780
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
785 790 795 800
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
805 810 815
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
820 825 830
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
835 840 845
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
850 855 860
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro
865 870 875 880
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
885 890 895
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
900 905 910
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
915 920 925
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
930 935 940
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Glu Leu Ala
945 950
<210> 2
<211> 2859
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcggatcca gcccgaaaat ggtgcagggg tctggctgct ttgggcgtaa aatggatcgt 60
atcagctcct ccagtggcct gggctgcaaa gtgctgcgtc gtcacggtgg tggtggtagc 120
ggtggtggtg gtagccacgg cgagggcacc ttcaccagcg acctgagcaa gcagatggag 180
gaggaggccg tgaggctgtt catcgagtgg ctgaagaacg gcggccccag cagcggcgcc 240
ccccccccca gcggcggcag ccccgccggc agccccacca gcaccgagga gggcaccagc 300
gagagcgcca cccccgagag cggccccggc accagcaccg agcccagcga gggcagcgcc 360
cccggcagcc ccgccggcag ccccaccagc accgaggagg gcaccagcac cgagcccagc 420
gagggcagcg cccccggcac cagcaccgag cccagcgagg gcagcgcccc cggcaccagc 480
gagagcgcca cccccgagag cggccccggc agcgagcccg ccaccagcgg cagcgagacc 540
cccggcagcg agcccgccac cagcggcagc gagacccccg gcagccccgc cggcagcccc 600
accagcaccg aggagggcac cagcgagagc gccacccccg agagcggccc cggcaccagc 660
accgagccca gcgagggcag cgcccccggc accagcaccg agcccagcga gggcagcgcc 720
cccggcagcc ccgccggcag ccccaccagc accgaggagg gcaccagcac cgagcccagc 780
gagggcagcg cccccggcac cagcaccgag cccagcgagg gcagcgcccc cggcaccagc 840
gagagcgcca cccccgagag cggccccggc accagcaccg agcccagcga gggcagcgcc 900
cccggcacca gcgagagcgc cacccccgag agcggccccg gcagcgagcc cgccaccagc 960
ggcagcgaga cccccggcac cagcaccgag cccagcgagg gcagcgcccc cggcaccagc 1020
accgagccca gcgagggcag cgcccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcggc 1080
cccggcacca gcgagagcgc cacccccgag agcggccccg gcagccccgc cggcagcccc 1140
accagcaccg aggagggcac cagcgagagc gccacccccg agagcggccc cggcagcgag 1200
cccgccacca gcggcagcga gacccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcggc 1260
cccggcacca gcaccgagcc cagcgagggc agcgcccccg gcaccagcac cgagcccagc 1320
gagggcagcg cccccggcac cagcaccgag cccagcgagg gcagcgcccc cggcaccagc 1380
accgagccca gcgagggcag cgcccccggc accagcaccg agcccagcga gggcagcgcc 1440
cccggcacca gcaccgagcc cagcgagggc agcgcccccg gcagccccgc cggcagcccc 1500
accagcaccg aggagggcac cagcaccgag cccagcgagg gcagcgcccc cggcaccagc 1560
gagagcgcca cccccgagag cggccccggc agcgagcccg ccaccagcgg cagcgagacc 1620
cccggcacca gcgagagcgc cacccccgag agcggccccg gcagcgagcc cgccaccagc 1680
ggcagcgaga cccccggcac cagcgagagc gccacccccg agagcggccc cggcaccagc 1740
accgagccca gcgagggcag cgcccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcggc 1800
cccggcagcc ccgccggcag ccccaccagc accgaggagg gcagccccgc cggcagcccc 1860
accagcaccg aggagggcag ccccgccggc agccccacca gcaccgagga gggcaccagc 1920
gagagcgcca cccccgagag cggccccggc accagcaccg agcccagcga gggcagcgcc 1980
cccggcacca gcgagagcgc cacccccgag agcggccccg gcagcgagcc cgccaccagc 2040
ggcagcgaga cccccggcac cagcgagagc gccacccccg agagcggccc cggcagcgag 2100
cccgccacca gcggcagcga gacccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcggc 2160
cccggcacca gcaccgagcc cagcgagggc agcgcccccg gcagccccgc cggcagcccc 2220
accagcaccg aggagggcac cagcgagagc gccacccccg agagcggccc cggcagcgag 2280
cccgccacca gcggcagcga gacccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcggc 2340
cccggcagcc ccgccggcag ccccaccagc accgaggagg gcagccccgc cggcagcccc 2400
accagcaccg aggagggcac cagcaccgag cccagcgagg gcagcgcccc cggcaccagc 2460
gagagcgcca cccccgagag cggccccggc accagcgaga gcgccacccc cgagagcggc 2520
cccggcacca gcgagagcgc cacccccgag agcggccccg gcagcgagcc cgccaccagc 2580
ggcagcgaga cccccggcag cgagcccgcc accagcggca gcgagacccc cggcagcccc 2640
gccggcagcc ccaccagcac cgaggagggc accagcaccg agcccagcga gggcagcgcc 2700
cccggcacca gcaccgagcc cagcgagggc agcgcccccg gcagcgagcc cgccaccagc 2760
ggcagcgaga cccccggcac cagcgagagc gccacccccg agagcggccc cggcaccagc 2820
accgagccca gcgagggcag cgcccccggc gagctcgcc 2859
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcccgaaaa tggtgcaggg gtctggctgc tttgggcgta aaatggatcg tatcagctcc 60
tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgcgt cgtcac 96
<210> 4
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
20 25 30
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggtggtg gtagcggtgg tggtggtagc 30
<210> 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcggatcc 9
<210> 8
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgctcgag 9

Claims (8)

1.一种重组人BNP蛋白，所述的重组人BNP蛋白多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种编码权利要求1所述的重组人BNP蛋白的基因，其特征在于所述重组人BNP蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
3.一种如权利要求1所述的重组人BNP蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法包含以下步骤：
（1）根据GENEBANK中提供的BNP成熟蛋白序列，获得BNP的成熟蛋白编码氨基酸及核苷酸序列，因为后续需要在大肠杆菌感受态细胞进行培养，所以根据大肠杆菌的密码子使用偏好，对其进行同义改造，获得改造好的BNP成熟蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸编码序列如SEQ ID NO：4所示；
（2）用人工合成的方法按照“改造后BNP序列-接头序列-人工XTEN序列”合成重组BNP-XTEN融合序列，并在融合序列的5’端引入BamH I限制性内切酶位点以及保护碱基，在融合序列的3’端引入Xho I限制性内切酶位点以及保护碱基，得到最终重组BNP-XTEN融合序列，其核苷酸编码序列为SEQ ID NO：2所示，其对应的氨基酸编码序列，如SEQ ID NO：1所示；
（3）对（2）中得到的重组BNP-XTEN融合序列以及PGEX-6P载体质粒进行双酶切反应，然后用连接酶进行连接反应，得到重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒序列；
（4）将（3）中得到的重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒转入BL21(DE3)感受态细胞并根据要求进行筛选，得到目的融合质粒阳性克隆；
（5）将（4）中筛选得到的重组PGEX-BNP-XTEN融合质粒阳性克隆扩大培养，获得表达的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白，并进行重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的表达鉴定；
（6）对（5）所得的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白进行纯化，并计算其纯度值和浓度值；
（7）对（6）所得的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白进行活性检测；
（8）对（6）所得的重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白进行稳定性检测。
4.根据权利要求3所述的重组人BNP蛋白的制备方法，其特征在于所述的蛋白重组融合质粒的通过是否含有氨苄青霉素抗性来进行筛选。
5.根据权利要求3所述的重组人BNP蛋白的制备方法，其特征在于所述的蛋白纯化采用亲和层析法及疏水层析法纯化重组PGEX-BNP-XTEN蛋白。
6.根据权利要求3所述的重组人BNP蛋白的制备方法，其特征在于所述的活性检测采用离体动脉条测定法检测重组PGEX-BNP-XTEN融合蛋白体外活性。
7.根据权利要求3所述的重组人BNP蛋白的制备方法，其特征在于所述的稳定性检测采用ELISA试剂盒测定各时间点血浆中BNP含量。
8.根据权利要求1所述的重组人BNP蛋白，其特征在于所述的重组人BNP蛋白可用于后续BNP相关产品的进一步开发，如相关BNP检测试剂盒标准品的开发，或者制备急性心衰的药物。
CN202110792534.2A 2021-07-14 2021-07-14 一种重组人bnp蛋白及其应用 Pending CN113278059A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110792534.2A CN113278059A (zh) 2021-07-14 2021-07-14 一种重组人bnp蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110792534.2A CN113278059A (zh) 2021-07-14 2021-07-14 一种重组人bnp蛋白及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113278059A true CN113278059A (zh) 2021-08-20

Family

ID=77286726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110792534.2A Pending CN113278059A (zh) 2021-07-14 2021-07-14 一种重组人bnp蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113278059A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350695A (zh) * 2021-12-20 2022-04-15 华南理工大学 一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101280017A (zh) * 2008-05-23 2008-10-08 江南大学 人脑钠肽二联体[(bnp)2]与人血清白蛋白(hsa)的融合蛋白及其制备
US20140301974A1 (en) * 2009-02-03 2014-10-09 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CN104861075A (zh) * 2015-05-08 2015-08-26 成都金凯生物技术有限公司 一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101280017A (zh) * 2008-05-23 2008-10-08 江南大学 人脑钠肽二联体[(bnp)2]与人血清白蛋白(hsa)的融合蛋白及其制备
US20140301974A1 (en) * 2009-02-03 2014-10-09 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CN108530543A (zh) * 2009-02-03 2018-09-14 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
CN104861075A (zh) * 2015-05-08 2015-08-26 成都金凯生物技术有限公司 一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WILLIAM R.STROHL: "Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters", 《BIODRUGS》 *
张瑜等: "融合蛋白技术在长效药物开发中的应用", 《药学进展》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350695A (zh) * 2021-12-20 2022-04-15 华南理工大学 一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113502296B (zh) 一种表达司美鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法
JP5827218B2 (ja) 生理活性物質等の生体内安定性向上のためのペプチド及び生体内安定性が向上した生理活性物質
CN103923937B (zh) 一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用
CN102816244A (zh) 一种Exendin-4肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法
WO2022012020A1 (zh) Glp-1类似物多肽的制备方法及在ⅱ型糖尿病中应用
WO2007034498A1 (en) Atrial natriuretic peptide (anp) splice variants and methods of using same
CN101240033B (zh) 一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法
CN101875700B (zh) 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
CN102690352A (zh) 含有glp-1的融合蛋白、其药物组合物及用途
CN113278059A (zh) 一种重组人bnp蛋白及其应用
JP6612360B2 (ja) 薬用作用を有する融合タンパク質複合体および融合タンパク質
CN103834623A (zh) 具有催化活性的人源尿酸氧化酶
WO2022188444A1 (zh) 一种新型抗代谢紊乱的fgf类似物及其应用
CN110092835A (zh) 一种glp-1类似物-col3a1融合蛋白
CN113292656B (zh) 用于防治肥胖的中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的融合蛋白
KR20230017804A (ko) Rhfgf21 융합 단백질, rhfgf21 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, rhfgf21 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 rhfgf21 융합 단백질의 용도
CN103159847B (zh) 一种利钠肽及其基因与用途
CN107188953B (zh) 胰高血糖素样肽-1类似物及其用途
Hu et al. Cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme PM246 in Pichia pastoris
CN101144081B (zh) 核苷酸分子trail及其在制备治疗肿瘤药物中的应用
CN101307105B (zh) 一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和应用
CN101979576A (zh) 一种通过基因工程重组技术制备血管钠肽(vnp)的方法
RU2488635C1 (ru) Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида
EP0622459A1 (en) Fused proteins for preparing vasoactive intestinal polypeptide analogs, method of preparing same and recombinant plasmids and transformant microorganisms
CN114106194B (zh) 一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210820

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication