CN114350695A - 一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用 - Google Patents

一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用 Download PDF

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杨莎
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景艳芸
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Abstract

一种含二硫键多肽人脑利钠肽rhBNP的生产和纯化方法。该方法包括：将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人脑利钠肽rhBNP的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；培养工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；将融合蛋白的聚集体进行切割，得到所述人脑利钠肽rhBNP。本发明纯化得到的人脑利钠肽rhBNP的产量和纯度都很高，特别是在自切割和离心操作后，只需要2步标准化的柱层析即可达到99％以上的纯度。该纯化方法对设备要求低，步骤少，操作简便，生产效率高，成本低，可应用于人脑利钠肽rhBNP的规模化高效生物制备中。

Description

一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产和纯化方法。
背景技术
自从1982年FDA批准重组胰岛素用于糖尿病治疗以来，越来越多的蛋白质/多肽在欧盟和美国被批准作为治疗药物(Agyei D等人，2017)。多肽药物因其具有特异性高，疗效好，毒副作用小等特点近年来备受关注，其在医药中应用的研发已广泛涉及抗肿瘤药物、心脑血管药物、疫苗和抗病毒药物，以及诊断试剂盒等多个方面(Leader等人，2008)。在20世纪80年代，几乎所有进入临床开发的肽长度都小于10个氨基酸。随后的十年，得益于肽合成生产技术的改进，进入临床开发中的多肽药物平均肽长度在增加。近十年，开发中的多肽药物长度大于30aa的占比越来越高(M.K.Dunn等人，2018)。同迅速增长的市场需求相比，多肽的生产方法在一定程度上限制了其发展。常规的化学固相合成法在生产超过30个氨基酸的中长多肽时，随着肽段长度增大，合成的成本和难度将大幅增加(Bray等人，2003)。
另一种有效的手段是采用重组方法在宿主细胞内产生多肽。在重组产生多肽的方法中，纯化步骤非常关键。据报道，重组多肽的分离与纯化成本约占其全部生产成本的60％-80％(陈浩等人，2002)。重组多肽的纯化方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过90％的高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白纯化方法。常用的亲和纯化技术包括组氨酸标签(his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的多肽的融合表达，为不同目的多肽的生产提供了通用的纯化手段。然而昂贵纯化柱使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。
人脑利钠肽(Human Brain Natriuretic Peptide,hBNP)是利钠尿肽系统的一种肽类激素(Lubien E等，2002)，最先由日本学者Sodoh等从猪的体内发现，随后研究发现其主要在心室心肌中合成并分泌，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的天然拮抗剂，参与血压，血容量，水盐平衡的调节，扩张动脉和静脉，降低血管阻力及血浆容量，升高肾小球滤过率，利钠，利尿，降低心脏前后负荷，起到保护心脏的作用。人脑利钠肽hBNP诊断充血性心力衰竭优于A型利钠肽(B.A.Groenning等人，2001)有替代超声心动图的潜力，是超声心动图之外筛选急性心力梗死最好的指标之一(Choy等人，1994)，同时人脑利钠肽hBNP在治疗心力衰竭方面疗效显著，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准其作为急性心力衰竭的临床用药。
人脑利钠肽hBNP由32个氨基酸组成，含有一个二硫键，相对分子量为3.5KDa。在心肌细胞内先合成其激素原前体，经裂解去除一个26aa氨基酸信号肽，以108aa的激素前体Pro-BNP形式存在，当心肌细胞受到刺激时，在活化酶的作用下裂解为无活性的直线多肽和和有活性的含32aa的C端活性多肽片段-BNP(E.M.Vilela等人,2015)。
人脑利钠肽hBNP原研公司为美国Scios Inc，2001年通过美国FDA批准上市，是过去十年唯一批准用于充血性心力衰竭的药品，具有突破意义。2005年，中国成都诺迪康生物制药有限公司研发的生物制品I类新药-重组人脑利钠肽上市，商品名：新活素，适用于患有休息或者轻微活动时呼吸困难的急性失代偿心力衰竭患者的静脉治疗，按NYHA分级大于II级。我国每年急性心衰病例约200万左右，新活素作为急性心衰的抢救用药，适用于90％以上的患者，2017年7月，新活素通过高价药谈判方式降价40％左右进入医保，2018年实现年收入近6亿元，今后随着市场的渗入，新活素潜在市场空间在30亿元以上。
人脑利钠肽hBNP的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成法成本高，分离纯化困难，效率低下，产业化困难，无法满足大量医用。由于人脑利钠肽hBNP肽链无糖基化修饰，现阶段普遍采用原核表达体系进行生产，大肠杆菌具有遗传背景清晰，生长快，成本低，操作简单等优点，是目前应用最广泛的重组蛋白/多肽表达宿主菌之一。然而，人脑利钠肽hBNP直接在大肠杆菌胞内进行表达时，通常以无活性的包涵体形式存在，需要后续的变复性才能得到具有生物活性的人脑利钠肽hBNP，经过一系列的变性与复性步骤，增加生产过程的难度，工艺复杂且收率较低，极大的提高了生产成本。添加融合标签进行促溶，使其可溶表达(如His tag,Trx标签等)(Chitra Bajji等人，2015；Zhao等人，2008；邹卫等人，2016)。这些技术过程需要进行比较繁琐的纯化步骤，而且需要采用多种柱层析技术，如亲和层析、凝胶排阻层析等，收率低，成本较高，导致人脑利钠肽BNP产品价格高。特别是，目前仍然没有较高效的表达含二硫键多肽的方法。
因此，本领域仍然需要低成本、简便、高效的生产与纯化含二硫键目的多肽如人脑利钠肽hBNP的方法。
发明内容
本发明提供了基于自聚集肽和切割标签的低成本、简便、高效的含二硫键多肽的生产和纯化方法。
本发明技术方案如下。
一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，包括如下步骤：
(1)将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人脑利钠肽hBNP的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；
(2)培养步骤(1)所述工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；
(3)将步骤(2)所述融合蛋白的聚集体进行切割，得到中度纯化的含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP；
(4)将步骤(3)中所获得的中度纯化人脑利钠肽hBNP，经过2步柱层析，获得高纯度(>99％)的人脑利钠肽hBNP。
进一步地，步骤(1)中，所述聚集肽包含一个以上的两亲性自组装短肽；所述两亲性自组装短肽为类表面活性剂短肽、两亲性α螺旋短肽中的一种以上；所述类表面活性剂短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述两亲性α螺旋短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，步骤(1)中，所述切割标签为化学切割位点、酶法切割位点或自切割位点。
进一步地，所述自切割位点为内含肽；
当所述自切割位点为内含肽时，步骤(3)中所述切割，包括：将所述融合蛋白的聚集体分散在缓冲液中，进行切割处理，离心取上清液，得到含人脑利钠肽hBNP的溶液；所述缓冲液的pH值为5.5～6.8，所述切割处理的温度为4～37℃，切割处理的时间为3～48h。
进一步地，所述内含肽为MtuΔI-CM，所述MtuΔI-CM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，所述内含肽为MtuΔI-CM的突变体，所述MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM的m1、m2或m3突变体，所述MtuΔI-CM的m1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述MtuΔI-CM的m2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述MtuΔI-CM的m3突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
进一步地，所述多肽人脑利钠肽hBNP含有1个二硫键；所述人脑利钠肽hBNP的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步地，所述的其他多肽，其氨基酸长度为20-100个氨基酸，且含有1-3个二硫键；
进一步地，所述聚集肽的基因序列与切割标签的基因序列之间通过接头连接，所述接头为PT型接头；所述PT型接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
进一步地，步骤(4)为2步柱层析为标准化的离子交换层析和凝胶排阻层析。
一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP应用于患有休息或轻微活动呼吸困难的急性失代偿心力衰竭患者的静脉治疗。
本发明提供了一种融合多肽，其包含目的多肽部分和自聚集肽部分，其中所述目的多肽部分通过间隔物连接于所述自聚集肽部分，并且其中所述切割标签包含切割位点。所述融合多肽在宿主细胞内表达后可通过所述自聚集肽部分形成活性聚集体。本发明的融合多肽中的目的多肽是人脑利钠肽hBNP。本发明的融合多肽中的目的多肽部分位于所述融合多肽的C端。所述的人脑利钠肽hBNP可为其他多肽，其特征在于氨基酸长度为20-100个氨基酸，且含有1-3个二硫键。
进一步地，本发明的融合多肽中的自聚集肽部分包含两亲性自组装短肽。所述自聚集肽部分包含一个或更多个串联重复的两亲性自组装短肽。
进一步地，本发明的融合多肽中的两亲性自组装短肽选自两亲性α螺旋短肽和类表面活性剂短肽。在一些实施方案中，优选类表面活性剂短肽。
进一步地，所述类表面活性剂短肽具有7-30个氨基酸残基，其从N端到C端具有以下通式表示的氨基酸序列：
A-B或B-A
其中A是由亲水性氨基酸残基组成的肽，所述亲水性氨基酸残基可以是相同的或不同的，且选自Lys、Asp、Arg、Glu、His、Ser、Thr、Asn和Gln；B是由疏水性氨基酸残基组成的肽，所述疏水性氨基酸残基可以是相同的或不同的，且选自Leu、Gly、Ala、Val、Ile、Phe和Trp；A与B通过肽键连接；并且其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是55％-95％。所述类表面活性剂短肽具有8个氨基酸残基，其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是75％。所述类表面活性短肽选自L6KD、L6KK、L6DD、L6DK、KDL6和DKL6。本发明的融合多肽中的类表面活性剂短肽是L6KD，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
进一步地，所述两亲性自组装短肽是两亲性α螺旋短肽的长度为4-30个氨基酸残基；并且其中疏水性氨基酸残基含量为40％-80％。所述两亲性自组装短肽是α三螺旋肽，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:3。
进一步地，本发明的融合多肽中的目的多肽含有至少两个巯基，例如两个巯基、三个巯基、四个巯基或更多个巯基，所述巯基之间可以形成二硫键。在一些实施方案中，本发明的融合多肽中的目的多肽含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，本发明的融合多肽中的目的多肽含有一个或多个分子内二硫键，例如一个二硫键、两个二硫键或更多个二硫键。
进一步地，本发明的融合多肽中的目的多肽的长度为20-100个氨基酸，例如30-60个氨基酸，35-80个氨基酸，40-100个氨基酸。
进一步地，本发明的目的多肽含有1-3个二硫键。
进一步地，本发明的融合多肽中的目的多肽是人脑利钠肽。所述人脑利钠肽hBNP部分包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
进一步地，本发明的融合多肽中的间隔物与目的多肽部分和/或自聚集肽部分直接连接。在另一些实施方案中，所述间隔物在其N端和/或C端进一步包含接头，其通过接头与目的多肽部分和/或自聚集肽部分连接。
进一步地，本发明的融合多肽中的切割位点选自温度依赖性切割位点、pH依赖性切割位点、离子依赖性切割位点、酶切割位点或自切割位点。在一些实施方案中，所述切割标签为自切割位点，所述自切割位点为内含肽。在一些实施方案中，所述内含肽连接于所述目的多肽部分的N端。在一些实施方案中，所述内含肽为MtuΔI-CM，所述MtuΔI-CM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。在一些可选的实施方案中，所述MtuΔI-CM连接于所述脑利钠肽部分的N端。
进一步地，所述MtuΔI-CM包含pH依赖性切割位点，其在酸性条件下被切割，优选在弱酸性条件下被切割，例如在pH 6.0-6.5的条件下被切割，优选在pH 6.2的条件下被切割。所述pH依赖性切割位点在碱性条件下不被切割。
进一步地，所述内含肽为MtuΔI-CM的突变体。所述MtuΔI-CM在第73位和/或430位具有突变。所述MtuΔI-CM的突变体在第73位的突变为H73Y或H73V。所述MtuΔI-CM的突变体在第430位的突变为T430V、T430S或T430C。具有H73Y和T430V的MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM m1,氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。具有H73V和T430S的MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM m2，氨基酸序列示于SEQ ID NO:9。具有H73V和T430C的MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM m3，氨基酸序列示于SEQ ID NO:11。
进一步地，所述聚集肽的基因序列与切割标签的基因序列之间通过接头连接，所述接头为PT型接头；其氨基酸序列示于SEQ ID NO:15。
进一步地，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的融合多肽的核苷酸序列或其互补序列。
进一步地，本发明提供了一种表达构建体，其包含本发明的多核苷酸。
进一步地，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或由本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合多肽。
进一步地，所述宿主细胞选自原核生物、酵母和高等真核细胞。所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。更具体而言，所述原核生物是埃希氏菌属，优选大肠杆菌(E.coli)。
本发明提供了一种生产和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)培养本发明的宿主细胞，从而表达本发明的融合多肽；
(2)裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分；
(3)通过切割所述切割位点从所述不溶部分释放可溶的目的多肽；和
(4)去除步骤(c)中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。
进一步地，所述裂解通过超声、匀浆、高压、低渗、裂解酶、有机溶剂或其组合进行。在另一些实施方案中，所述裂解在弱碱性的pH条件下进行。所述切割是pH依赖性切割，例如在酸性条件下被切割，优选在弱酸性条件下被切割，例如在pH 6.0-6.5的条件下被切割，优选在pH 6.2的条件下被切割。当所述自切割位点为内含肽时，步骤(3)中所述切割，包括：将所述融合蛋白的聚集体分散在缓冲液中，进行切割处理，离心取上清液，得到含人脑利钠肽hBNP的溶液；所述缓冲液的pH值为5.5～6.8，所述切割处理的温度为4～37℃，切割处理的时间为3～48h。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1)以活性聚集体形式表达可保护目的多肽不易被降解；2)纯化简便、快捷，无需额外添加酶去除标签；在自切割和离心操作后，只需要2步标准化的柱层析即可达到99％以上的纯度，大大简化工艺和缩短周期；3)可用于胞内表达含二硫键多肽，自切割后保留目的多肽的结构与功能，无需变复性；4)便于规模放大，有利于商业化。
附图说明
图1A为基于自聚集肽的人脑利钠肽hBNP的表达与纯化策略图；
图1B为ET30-L6KD-MtuΔI-CM-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m1-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m2-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m3-BNP、pET30-α3-MtuΔI-CM-BNP的载体结构图；
图2A为不同MtuΔI-CM突变株LB培养基表达纯化结果；
图2B为不同MtuΔI-CM突变株发酵培养基表达纯化结果；
图2C为LB培养基表达的不同自聚集肽的融合蛋白切割后的上清；
图3为人脑利钠肽hBNP的柱纯化SDS-PAGE分析结果图；
图4为人脑利钠肽hBNP的RP-HPLC分析图；
图5为人脑利钠肽hBNP的质谱分析图；
图6为人脑利钠肽hBNP的圆二色谱分析图；
图7A为人脑利钠肽hBNP的二硫键SDS-PAGE分析图；
图7B为酶解法鉴定人脑利钠肽hBNP的二硫键质谱分析图；
图7C为酶解法鉴定人脑利钠肽hBNP的二硫键质谱分析图；
图8为人脑利钠肽hBNP的氨基酸测序分析图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将通过实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的，本领域技术人员能够基于本发明的原理对实施方式做进一步的调整。
以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook，J.，Russell,David W.，MolecularCloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物均由上海生工生物合成。
实施例1：构建含有内含肽MtuΔI-CM的人脑利钠肽hBNP融合蛋白表达载体
本申请实施例中所使用的表达载体pET30-L6KD-MtuΔI-CM-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m1-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m2-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m3-BNP、pET30-α3-MtuΔI-CM-BNP的构建过程类似，以下以pET30-L6KD-MtuΔI-CM-BNP的构建为例，所需要的引物，通过oligo 6设计并由上海生工合成如表1所示的寡聚核苷酸引物。
表1本实施例所用寡聚核苷酸引物
Figure BDA0003422122770000071
Figure BDA0003422122770000081
以Y200630-BNP-1F，Y200630-BNP-2R，Y200630-BNP-3F，Y200630-BNP-4R，Y200630-BNP-5F，Y200630-BNP-6R，Y200630-BNP-7F，Y200630-BNP-8R引物为模板通过PCR反应(PCR仪(Bio-rad/C1000 Touch))退火拼接得到脑利钠肽BNP多核苷酸片段。PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶(New England Biolab(NEB))，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，60℃30sec，72℃20sec，共15个循环；最后72℃2min。反应结束后，以退火拼接产物为模板，以Y200728-BNP-F,Y200728-Mtu-R为引物，通过PCR反应(PCR仪(Bio-rad/C1000 Touch))扩增得到脑利钠肽BNP多核苷酸片段。PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶(New England Biolab(NEB))，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，65℃30sec，72℃20sec，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用超薄DNA凝胶产物回收试剂盒(Magen，D2110-03)进行回收BNP片段。
以Y200728-LPM-F和Y200728-LPM-R为引物，通过PCR反应(PCR仪(Bio-rad/C1000Touch))扩增得到L6KD-PT-ΔI-CM多核苷酸片段。PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶(New England Biolab(NEB))，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，72℃30sec，72℃1min，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用超薄DNA凝胶产物回收试剂盒(Magen，D2110-03)进行回收。
以Y200728-LPM-F和Y200728-Mtu-R为引物，将上述PCR产物BNP多核苷酸片段以及L6KD-PT-Mtu多核苷酸片段进行重叠PCR反应(PCR仪(Bio-rad/C1000 Touch))扩增得到L6KD-PT-Mtu-BNP多核苷酸片段。重叠PCR反应使用NEB公司的Q5聚合酶(New EnglandBiolab(NEB))，PCR条件为：98℃30sec，98℃10sec，66℃30sec，72℃1min，共30个循环；最后72℃2min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用超薄DNA凝胶产物回收试剂盒(Magen，D2110-03)进行回收。纯化后的片段和pET30a质粒(Novagen)分别用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，然后回收相应的片段进行纯化，纯化后用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对其进行测序。
再将测序正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆用于后续的表达纯化。
采用类似的方法分别获得pET30-L6KD-MtuΔI-CM m1-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m2-BNP、pET30-L6KD-MtuΔI-CM m3-BNP、pET30-α3-MtuΔI-CM-BNP质粒及其表达菌株。所构建的pET30-L6KD-MtuΔI-CM-BNP质粒的结构如图1B所示。
实施例2：LB培养基中人脑利钠肽hBNP融合蛋白的表达与纯化
将实施例1中构建好的菌株(含有如上所述的各个质粒)接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃摇床中培养至对数期(OD600＝0.4-0.6)，加入终浓度0.2mMIPTG，在18℃诱导24小时，收获细胞，并测量菌浓度OD600。以下将1mL的OD600为1的细胞量称为1OD。
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、29.22g的NaCl、0.37g的Na2EDTA·2H2O溶解于800mL水中，调pH至8.5，加水定容至1L)重悬至50OD/mL，进行超声破碎(破碎条件为：功率200W，超声时间3sec，间隔时间3sec，超声次数99次)。在4℃，15000g的条件下离心20min，分别收集上清和沉淀部分。将沉淀用等体积的裂解缓冲液洗涤2次后，使用等体积的切割缓冲液(PBS补加40mM Bis-Tris，2mM EDTA,pH6.2)充分重悬，置于25℃24h，使得内含肽充分进行自切割。之后4℃，15000g的条件下离心20min，用等体积的裂解缓冲液将沉淀重悬，将得到的上清和沉淀与切割前的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测。结果如图2A所示，泳道ES、EP、CP、CS为人脑利钠肽hBNP表达与纯化样品，分别是ES：细胞裂解物上清；EP：细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白表达成的聚集体；CP：切割后分离的沉淀；CS：切割后分离的上清，可检测到清晰的人脑利钠肽hBNP条带；泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA蛋白定量标准品和抑肽酶Aprotinin蛋白定量标准品，上样量依次为2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg。不同聚集肽进行SDS-PAGE检测结果如图2C所示，泳道CS切割后分离的上清，可检测到清晰的人脑利钠肽hBNP条带。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的人脑利钠肽hBNP产量、MtuΔI-CM切割效率、人脑利钠肽hBNP回收率及其在上清中的纯度，结果如表2所示。
表2人脑利钠肽hBNP的表达与纯化情况
Figure BDA0003422122770000101
a蛋白聚集体产量，b内含肽介导的自切割后的人脑利钠肽hBNP产量(每升LB培养基中的大肠杆菌细胞产生的蛋白量计算)，c内含肽介导的自切割效率＝100％×(切割前聚集体表达量-切割后聚集体剩余量)/切割前聚集体产量，d回收率＝100％×BNP实际产量/蛋白聚集体在完全切割的情况下可生产人脑利钠肽hBNP的理论产量。
所采用的4种不同MtuΔI-CM突变株融合蛋白(L6KD-MtuΔI-CM-BNP、L6KD-MtuΔI-CM m1-BNP、L6KD-MtuΔI-CM m2-BNP、L6KD-MtuΔI-CM m3-BNP)和a3聚集肽融合蛋白α3-MtuΔI-CM-BNP均以沉淀形式存在，4种不同MtuΔI-CM聚集体表达量为322～544mg/L LB培养液。4种不同MtuΔI-CM融合蛋白经内含肽MtuΔI-CM自切割，BNP同L6KD-MtuΔI-CM分离，切割效率是37～92％，切割后释放到上清中的人脑利钠肽hBNP的产量为13～27mg/L LB培养液，切割后回收的BNP纯度为87～95％。其中，L6KD-MtuΔI-CM-BNP融合蛋白的人脑利钠肽hBNP产量最高，即通过本基于自聚集肽和自切割标签的纯化技术可一步纯化得到脑利钠肽BNP的产量为27mg/L LB培养液细胞湿重，纯度为93％。a3聚集肽聚集肽聚集体表达量为427mg/L LB培养液，经内含肽MtuΔI-CM自切割，BNP同a3-MtuΔI-CM分离，切割效率是89％，切割后释放到上清中的人脑利钠肽hBNP的产量为21mg/L LB培养液，切割后回收的人脑利钠肽hBNP纯度为95％。
实施例3：发酵培养基中人脑利钠肽hBNP融合蛋白的表达与纯化
将实施例2中构建好的菌株接种到含50μg/mL卡那霉素的发酵培养基(Shao-YangHu等，2004)，并在37℃摇床中培养至对数期(OD600＝0.6-0.8)，加入终浓度为0.2mM IPTG，在18℃诱导24小时，收获细胞，并测量菌浓度OD600以下将1mL的OD600为1的细胞量称为1OD。所用的发酵培养基组分如表3所示。
表3发酵培养基组分
Figure BDA0003422122770000111
将葡萄糖与其他成分分开灭菌，121℃灭菌20min，微量元素溶液用0.22μm的滤头在超净工作台过滤除菌。培养基配好后在使用前加入终浓度50mg/L的卡那霉素。
将菌体用裂解缓冲液B1(2.4g的Tris、29.22g的NaCl、0.37g的Na2EDTA·2H2O溶解于800mL水中，调pH至8.5，加水定容至1L)重悬至50OD/mL，进行超声破碎(破碎条件为：功率200W，超声时间3sec，间隔时间3sec，超声次数99次)。在4℃，15000g的条件下离心20min，分别收集上清和沉淀部分。将沉淀用等体积的裂解缓冲液洗涤2次后，使用等体积的切割缓冲液(PBS补加40mM Bis-Tris，pH6.2，2mM EDTA)充分重悬，置于25℃24h，使得内含肽充分进行自切割。之后4℃，15000g的条件下离心20min，用等体积的裂解缓冲液将沉淀重悬，将得到的上清和沉淀与切割前的上清和沉淀一起进行SDS-PAGE检测。结果如图2B所示。泳道ES、EP、CP、CS为人脑利钠肽hBNP表达与纯化样品，分别是ES：细胞裂解物上清；EP：细胞裂解物沉淀，可检测到清晰的融合蛋白表达成的聚集体；CP：切割后分离的沉淀；CS：切割后分离的上清，可检测到清晰的人脑利钠肽hBNP条带；泳道1-5为含有牛血清蛋白BSA蛋白定量标准品和抑肽酶Aprotinin蛋白定量标准品，上样量依次为2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg。
依照蛋白定量标准品，应用ImageJ凝胶定量分析软件对目的条带进行光密度分析，可计算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的人脑利钠肽hBNP产量、MtuΔI-CM切割效率、人脑利钠肽hBNP回收率及其在上清中的纯度，结果如表4所示。
表4发酵培养基中人脑利钠肽BNP的表达与纯化情况
Figure BDA0003422122770000121
a蛋白聚集体产量，b内含肽介导的自切割后的人脑利钠肽hBNP产量(每升发酵培养基中的大肠杆菌细胞产生的蛋白量计算)，c内含肽介导的自切割效率＝100％×(切割前聚集体表达量-切割后聚集体剩余量)/切割前聚集体产量，d回收率＝100％×BNP实际产量/蛋白聚集体在完全切割的情况下可生产人脑利钠肽hBNP的理论产量。
所采用的4种不同MtuΔI-CM突变株融合蛋白(L6KD-MtuΔI-CM-BNP、L6KD-MtuΔI-CM m1-BNP、L6KD-MtuΔI-CM m2-BNP、L6KD-MtuΔI-CM m3-BNP)均以沉淀形式存在，4种不同MtuΔI-CM聚集体表达量为931～1093mg/L发酵培养液。4种不同MtuΔI-CM融合蛋白经内含肽MtuΔI-CM自切割，BNP同MtuΔI-CM-BNP分离，切割效率是51～92％，切割后释放到上清中的人脑利钠肽hBNP的产量为32～42mg/L发酵培养液，切割后回收的BNP纯度为90～94％。
实施例4：人脑利钠肽hBNP融合蛋白的精纯化
以实施例2中由L6KD自聚集肽得到的脑利钠肽BNP样品为例，取约12mg L6KD自聚集肽得到的脑利钠肽BNP样品用阳离子交换柱(CaptoTM Hitrap S 1ml)和分子筛柱(HiLoad16/600 Superdex 30pg)进行精细纯化。离子交换柱纯化时上样后用Bindingbuffer(50mM醋酸钠，pH 5.0)洗去未结合的蛋白，然后用20CV，50％Elution buffer(50mM醋酸钠，1.0M NaCl，pH 5.0)进行线性洗脱，收集约35％Elution buffer洗脱的峰。将离子交换住纯化后的蛋白进一步用分子筛柱进行纯化，用缓冲液(50mM NaHPO4，150mM NaCl，pH7.2)洗脱120CV，收集约60min的峰。用SDS-PAGE检测收集的洗脱峰，检测结果如图3所示。泳道1为cSAT纯化后的BNP；泳道2为离子交换柱纯化后的BNP；泳道3为分子筛纯化后的BNP。通过离子交换柱和分子筛两步纯化最终可以得到纯度大于99％的重组人脑利钠肽hBNP蛋白。
实施例5：人脑利钠肽hBNP的RP-HPLC测定
以实施例4中由离子交换柱和分子筛纯化得到的人脑利钠肽hBNP样品为例，进行RP-HPLC测定。取商用标准品BNP和纯化后的人脑利钠肽hBNP样品用无菌水配制成0.1mg/mL的BNP样品，采用RP-HPLC进行分析，结果如图4所示。仪器：Agilent 1260；色谱柱：ZORBAXSB-C18；流动相：A液为0.1％(v/v)三氟乙酸的水溶液，B液为0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈溶液，采用的梯度如表5；进样量为99μL，流速为1mL/min，检测温度为30℃，检测波长为215nm。RP-HPLC结果如图4所示。
表5流动相梯度变化设定参数
时间(min) A液比例(％(v/v)) B液比例(％(v/v))
0 5 95
20 95 5
22 100 0
从图4可知，样品BNP出峰时间(6.907min)与商用标准品BNP(新活素)出峰时间(6.903min)相符，证明所得到的BNP序列正确。
实施例6：人脑利钠肽hBNP的分子量测定
以实验例4中由L6KD自聚集肽得到的人脑利钠肽hBNP样品为例，进行分子量测定。
1)点样：取1μL蛋白样品点至样品靶上，自然干燥后，再取0.6μL CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。2)校准：在正离子模式下选择反射方法对样品测试范围进行校准测试。3)相关参数如下：标准物质校准范围为：反射校准物质校准范围为：17,072Da±50.4)。4)测试样品：在正离子模式下选择反射方法测试样品分子量。5)质谱数据及图谱处理：5800 MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由4000 Series Explorer V3.5软件导出。
从图5可看到所得到的样品分子量为3,464.17Da，与商用标准品BNP(新活素)测定的分子量3,464.10Da相符，证明所得到的BNP序列正确。
实施例7：人脑利钠肽hBNP的圆二色谱测定
以实施例4中由离子交换柱和分子筛纯化得到的人脑利钠肽hBNP样品为例，进行二级结构测定。取标准品和纯化后的人脑利钠肽hBNP样品用无菌水配制成0.1mg/mL的BNP样品，采用远紫外圆二色谱分析法对BNP样品进行蛋白质二级结构测定。仪器：ChirascanTMcircular dichroism spectrometer。蛋白样品检测前，在样品池中加入200μL蒸馏水，进行圆二色谱远紫外区(190nm-260nm)扫描，所得色谱信号作为背景信号扣除。采用的扫描参数如表6所示，圆二色谱分析人脑利钠肽hBNP二级结构组成如表7所示。
表6圆二色谱分析扫描设定参数
Pathlength 5mm
Scan speed 0.45s/point
Temperature 25℃
Repeat 3repeats per sample
表7圆二色谱分析BNP的二级结构组成
Figure BDA0003422122770000151
从图6可看到样品BNP所得到二级结构分析图谱与商用标准品BNP的图谱基本相一致，从表7可知，该方法纯化的样品BNP二级结构组成和比例与BNP标准品相符，证明所得到的样品BNP二级结构正确。
实施例8：人脑利钠肽hBNP的二硫键鉴定
以实施例4中由离子交换柱和分子筛纯化得到的脑利钠肽BNP样品为例，进行二硫键结构测定。取纯化后的BNP样品分别使用含与不含DTT的Sample Loading对BNP样品进行制样，然后上样电泳，整个电泳过程在冰上进行，电压为80V。考马斯亮蓝染色结果如图7A所示。从图7A可看到未加还原剂DTT进行制样的跑胶结果与添加还原剂DTT对样品BNP进行制样的条带位置有偏差，初步表明样品BNP中二硫键的存在。
同时进一步使用酶解法结合UPLC-MS/MS对商用标准品BNP及cSAT方法纯化出来的样品BNP进行二硫键的鉴定，具体实验步骤如下：
1)以实施例4中由离子交换柱和分子筛纯化得到的脑利钠肽BNP样品为例，进行二硫键结构测定。先去除蛋白样品中的盐：加入200μl ddH2O到10kD超滤管中，11,000g,离心1min，去除超滤管中少量的甘油。加入蛋白样品，11,000g离心3min。加入200μl ddH2O置换一次去除样品中的盐。
2)NEM封闭自由巯基：加200μl 8M Urea，100mM Tris，pH 6.5，11,000g，离心10min；加入200μl 8M Urea，100mM Tris，pH 6.5，加入终浓度2mM NEM，37℃，孵育2h。
3)酶解：超滤第2步反应液，11,000g，离心10min；加入200μl 100mM Tris，pH 6.5。11,000g，离心10min，重复一次；加入100μl 100mM Tris，pH 6.5，加入4μg Trypsin(1:50)，37℃，孵育过夜。
4)酶解后的样品分成2份：
a)一份加入终浓度1％FA酸化，直接做二硫键分析；
b)另一部分加入终浓度10mM DTT还原，57℃，反应30min，再加入终浓度20mM碘乙酰胺烷基化，避光，室温反应30min，然后加入终浓度1％FA酸化，作为对照样品。
5)上机分析：样品采用超高效液相色谱系统进行分离。液相A液为0.1％FA水溶液，B液为0.1％FA乙腈溶液。色谱柱以A液平衡。样品由自动进样器上样，再经色谱柱梯度分离，流速为0.3ml/min，柱温50℃。质谱条件：样品用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长:30min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：350～2000m/z。
Figure BDA0003422122770000161
结果如图7B所示，样品BNP未经DTT还原进行酶解主要得到一个肽段，由二硫键连着的(MVQGSGCFGR/ISSSSGLGCK)，肽段理论分子量为1,975.89Da，商用标准品BNP实测分子量为:1,975.89Da，样品BNP实测分子量为:1,975.89Da。如图7C所示，样品经DTT还原烷基化酶切后，得到两个肽段，分别为MVQGSGCFGR，ISSSSGLGCK，肽段理论分子量分别为1,097.48Da,994.48Da；实测分子量为:1,097.48Da,994.48Da。由此可见，纯化后的样品BNP中含有二硫键。
实施例9：人脑利钠肽BNP的氨基酸序列测定
委托生工生物工程(上海)股份有限公司通过质谱法测定人脑利钠肽的氨基酸序列，测定结果为：
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His，如图8所示，测定的样品BNP与理论序列相一致。以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法及应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Asp
1 5
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgctgctgc tgctgctgaa agat 24
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ala Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ala Leu Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Ala
20
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggaaaccc tcgcgaaggc tctggagacc ctggcgaaag cgctcgaaac gctcgctaaa 60
gcg 63
<210> 5
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 5
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp His Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Thr Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 6
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 6
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggatcata aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca taccctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 7
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 7
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp Tyr Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Val Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 8
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 8
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggattata aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca tgttctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 9
<211> 168
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 9
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp Val Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Ser Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 10
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 10
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
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<210> 11
<211> 168
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<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 11
Ala Leu Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr
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His Arg Ile Glu Asp Val Val Asp Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Ile Leu Trp Ala Thr Pro Asp Val Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly
65 70 75 80
Trp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro
85 90 95
Arg Arg Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val
100 105 110
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu
115 120 125
Ala Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Cys Leu Val
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Val His Asn
165
<210> 12
<211> 504
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400> 12
gcgctggctg aaggcacgcg catttttgat ccggtcacgg gcacgacgca ccgcattgaa 60
gatgttgttg atggccgcaa gccgattcat gtggttgcgg ccgcaaaaga tggcaccctg 120
cacgcccgtc cggtcgtgag ttggtttgat cagggtacgc gtgacgtcat tggtctgcgt 180
atcgcgggcg gtgcaattct gtgggcaacc ccggatgtta aagtgctgac ggaatatggc 240
tggcgtgctg cgggtgaact gcgtaagggt gaccgtgttg cacagccgcg tcgctttgat 300
ggcttcggtg acagcgcacc gattccggct cgcgttcaag ccctggcaga tgctctggat 360
gacaagttcc tgcacgacat gctggcggaa gaactgcgtt actctgttat ccgcgaagtc 420
ctgccgaccc gtcgcgcccg cacgtttggt ctggaagtgg aagaactgca ttgtctggtt 480
gcggaaggcg ttgtggttca taac 504
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
20 25 30
<210> 14
<211> 96
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 14
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tcttctggtc tgggttgcaa agttctgcgt cgtcac 96
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctttgttag cagccggatc tca 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggaaggcgtt gtggttcata 20
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atccataccg ccagttgttt accctc 26
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggaaggcgtt gtggttcata actctccgaa 30
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caaccagaac cctgaaccat tttcggagag ttatgaacca ca 42
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aatggttcag ggttctggtt gcccgggtcg taaaatggac 40
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agaccagaag aagaagagat acggtccatt ttacgacccg gg 42
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtatctctt cttcttctgg tctgggttgc aaagttctgc gt 42
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtcactgac tcgagcacca ccaccaccac cactga 36
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gctttgttag cagccggatc tcagtggtgg tggtggtg 38

Claims (10)

1.一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将聚集肽的基因序列、切割标签的基因序列及人脑利钠肽hBNP的基因序列依次连接，形成融合蛋白的基因，将所述融合蛋白的基因导入宿主细胞，得到工程菌；
(2)培养步骤(1)所述工程菌表达所述融合蛋白，然后裂解工程菌，离心取沉淀，得到融合蛋白的聚集体；
(3)将步骤(2)所述融合蛋白的聚集体进行切割，得到中度纯化的含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP；
(4)将步骤(3)中所获得的中度纯化人脑利钠肽hBNP，经过2步柱层析，获得高纯度的人脑利钠肽hBNP。
2.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚集肽包含一个以上的两亲性自组装短肽；所述两亲性自组装短肽为类表面活性剂短肽、两亲性α螺旋短肽中的一种以上；所述类表面活性剂短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述两亲性α螺旋短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述切割标签为化学切割位点、酶法切割位点或自切割位点。
4.根据权利要求3所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述自切割位点为内含肽；
当所述自切割位点为内含肽时，步骤(3)中所述切割，包括：将所述融合蛋白的聚集体分散在缓冲液中，进行切割处理，离心取上清液，得到含人脑利钠肽hBNP的溶液；所述缓冲液的pH值为5.5～6.8，所述切割处理的温度为4～37℃，切割处理的时间为3～48h。
5.根据权利要求4所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述内含肽为MtuΔI-CM，所述MtuΔI-CM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求4所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述内含肽为MtuΔI-CM的突变体，所述MtuΔI-CM的突变体为MtuΔI-CM的m1、m2或m3突变体，所述MtuΔI-CM的m1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述MtuΔI-CM的m2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述MtuΔI-CM的m3突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
7.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，所述多肽人脑利钠肽hBNP含有1个二硫键；所述人脑利钠肽hBNP的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
8.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，其他多肽，其氨基酸长度为20-100个氨基酸，且含有1-3个二硫键；
所述聚集肽的基因序列与切割标签的基因序列之间通过接头连接，所述接头为PT型接头；所述PT型接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
9.根据权利要求1所述的一种含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP的生产与纯化方法，其特征在于，步骤(4)为2步柱层析为标准化的离子交换层析和凝胶排阻层析。
10.由权利要求1～9任一项所述方法制备得到的含二硫键多肽人脑利钠肽hBNP应用于患有休息或轻微活动呼吸困难的急性失代偿心力衰竭患者的静脉治疗。
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