CN104861075A - 一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长效重组人脑钠肽融合蛋白(Human Brain Natriumretic-Fc fusion protein，简称hBNP-Fc)及其制备方法，该融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP(hBNP)、肽接头和人IgG4Fc变体。该融合蛋白具有与rhBNP类似或更高的生物学活性，更长的半衰期，更小的副作用。本发明还涉及重组hBNP-Fc融合蛋白组合物在制备治疗和/或预防急性心衰的药物中的用途。

Description

一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人脑钠肽融合蛋白及其制备方法与用途。

背景技术

随着人口老龄化进程的加快及高血压、冠心病等心血管疾病发病率的上升，心力衰竭的发病率、死亡率也逐年增加。目前欧洲近10亿人口，至少有1500万心衰患者；根据中国心血管病报告2011指出，我国目前有心衰患者约420万人。人群中心衰的患病率约为1.5％～2.0％，随着年龄增加，其发病率也在增加，75岁以前为2-3％，75-80岁的发病率为10-20％。在过去的40年中，心衰导致的死亡增加了6倍，年均心衰死亡率已达到30-50％。心衰的预后极差，5年生存率与恶性肿瘤相仿。我国五十家医院住院病例调查报告显示，心力衰竭住院率占同期心血管病的20％；死亡率占40％。

心衰的治疗，一方面应该通过强心、利尿、扩血管来改善症状，另一方面应该抑制神经内分泌系统过度激活、改善心室重构以消除慢性心衰的发病基础。目前治疗心衰的常用药物主要包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂和洋地黄类药物。虽然，这些常规药物对改善心衰症状起到了良好的作用，但是心衰患者的总体预后仍较差，其产生的副作用主要表现在药物耐受性、心动过速及其它心律失常、低血压、以及激活与心力衰竭病理过程有关的神经激素-血管紧张素系统。因此，为了更有效地治疗心衰、逆转心室重构、改善患者的预后、提高患者生存期，新型药物的研究也不断地发展。目前已获得指南推荐的治疗新药有伊伐布雷定、奈西利肽、左西孟旦以及托伐普坦等，为一系列的循证医学提供了依据。

奈西立肽，又称重组人脑利钠肽(rhBNP)，用于治疗急性充血性心衰，属内源性激素物质，与人心室肌分泌的天然BNP具有相同的32个氨基酸序列(如下式)。

Ser Pro Lys Met Val GlnGlySerGlyCysPheGlyArg Lys Met Asp Arg Ile SerSer

SerSerGlyLeuGlyCys Lys Val LeuArgArg His

奈西立肽氨基酸序列

hBNP与血管平滑肌和内皮细胞上的鸟苷酸环化酶受体结合，引起细胞内第二信使环单磷酸鸟苷(cGMP)的水平升高，从而引发一系列生理效应：(1)具有内皮非依赖性的血管舒张活性，扩张动静脉，降低全身血管阻力、充盈压以及肺毛细血管嵌楔压(pulmonary capillarywedge pressure，PCWP)，降低心脏前后负荷；(2)提高肾小球滤过率，产生排钠利尿作用，降低体液负荷，提高心排血量，综合性改善心脏功能；(3)在体内抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活，抑制由于扩血管效应引起的反射性心率增加，避免心律失常的发生；(4)抑制血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的生长，对心肌肥厚有抑制作用。因此，rhBNP有利于减轻心衰患者的呼吸困难程度和全身症状，不同于以前单一的血管扩张药物或利尿剂，是一个具有多种治疗作用的药物。但是，目前临床应用的rhBNP由于体内半衰期短(仅为18min)，须频繁给药才能达到治疗目的，影响患者用药的顺应性，进而影响了产品在临床上的广泛应用。

本发明从解决现有rhBNP半衰期短的不足出发，通过将rhBNP与人IgG4Fc片段绞链区中的半胱氨酸(Cys)残基连接，形成类似IgG4、但缺少CH1区域和轻链的rhBNP-Fc融合蛋白从而达到延长rhBNP的循环半衰期/增加生物活性，并达到延长药物有效时间、减少药物副作用等目的。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种长效重组人脑钠肽融合蛋白(HumanBrain Natriumretic-Fc fusion protein，重组hBNP-Fc融合蛋白，简称hBNP-Fc)，所述hBNP-Fc具有半衰期长、生物活性高等有益效果。

本发明的上述有益效果通过以下技术方案实现：一种重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP(hBNP)、肽接头和人IgG4Fc变体。

具体的，所述融合蛋白为二聚化融合蛋白(如图1b所示)，所述的人IgG4Fc变体为

含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。IgG4Fc变体CH2区域在228、235(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，有利于维持IgG4的空间结构以及降低Fc的效应子功能，并且在纯化融合蛋白时有助于获得均匀完整的制备物(美国专利No.6,797,493、6,900,292、6,204,007)。

所述的肽接头含有2-20个氨基酸，存在于hBNP和人IgG4Fc变体之间，且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸(Gly)和苏氨酸(Thr)的氨基酸。优选的，所述肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

所述的重组hBNP-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。本发明采用的IgG4Fc片段与hBNP融合，可增强hBNP生物活性，并对hBNP蛋白具有稳定作用，而所得融合蛋白具有较低的抗体依赖细胞毒性(Antibody-Dependent Cell-mediatedCytotoxic，ADCC)和补体依赖细胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)活性，副作用较小。

本发明的第二个目的在于提供了一种与本发明重组hBNP-Fc融合蛋白相匹配的制备方法，该制备方法包含如下步骤：

(1)构建编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达载体；

(2)构建高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的工程细胞株；

(3)批次流加培养工程细胞株，以表达重组hBNP-Fc融合蛋白；

(4)重组hBNP-Fc融合蛋白的分离纯化。

具体的，所述步骤(1)的具体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hBNP-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO.：3所示，包含前导肽序列)，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒(如图3所示)。

所述的哺乳动物细胞表达载体可采用但不限于市售的如：pCDNA3.1(+)、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体，优选的，所述哺乳动物细胞表达载体为pCDNA3.1(+)。

所述步骤(2)的具体步骤为：将步骤(1)所得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒转染到合适的哺乳动物宿主细胞，并筛选获得稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株。

所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NS0、Sp2/0细胞。优选的，所述哺乳动物宿主细胞为CHO细胞；更优选的，所述哺乳动物宿主细胞为DHFR(DihydrofolateReductase，二氢叶酸还原酶)缺陷型CHO细胞(简称CHO-DHFR^-)。

所述的转染方法选自磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体转染法，优选电穿孔转染法。

所述的筛选稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株的方法为：先利用筛选标记进行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达哺乳动物细胞株。所述筛选标记是本领域内已知的任何一种合适的选择性抗性标记，如ZEO(Zeocin,博来霉素)、NEO(Neomycin,新霉素)、PUR(puromycin,嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin,潮霉素)，优选NEO；所述筛选标记也可为本领域内已知的任何一个荧光标记基因，包括GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)、RFP(RedFluorescent Protein，红色荧光蛋白)，优选GFP。所述扩增选择性标记是本领域内已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase，谷氨酰胺合成酶)序列，优选DHFR序列。由于CHO-DHFR^-细胞缺失DHFR，无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶(Thymidine)和甘氨酸的培养液中才能存活。而通过目的基因与DHFR基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，而且由于DHFR可被叶酸类似物MTX(Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，因此在MTX高浓度选择压力下，DHFR基因须扩增到很多拷贝数后才能生存，从而得到抗MTX细胞株；又由于与DHFR基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的基因序列也随着DHFR基因的扩增而扩增，从而可得到高表达目的融合蛋白的细胞株。

所述步骤(3)的具体步骤为：将步骤(2)所得稳定高表达的CHO细胞株，经过驯化完全适用于无血清悬浮培养后，转移至更大的(如5L)生物反应器中放大培养得到细胞培养液。本发明可采用本领域常规方法进行细胞培养，以获得重组hBNP-Fc融合蛋白的细胞培养液。本方案的一个优选方案中，所述细胞培养条件是：在37℃，溶氧50％，pH7.0条件下放大培养，当细胞密度达到2.4×10⁶cells/mL时降温至30℃继续培养12天后，细胞密度可达5×10⁶cells/mL。

所述的细胞培养条件所用培养基可为常规的培养基，本方案的一个优选方案中，所述培养基为在EX-CELL^TM 302无血清基础培养基(Sigma，24326C-100L)中添加超滤植物蛋白胨(Kerry，HyPep 7504)或营养物质添加剂(Hyclone，Cell Boost 6)所得到的培养基。

所述步骤(4)的具体步骤为：

a)澄清：将步骤(3)所得到的细胞培养液通过离心、深层过滤以及二者的任意组合方法，以获得上清液；

b)亲和层析：根据融合蛋白含有Fc片段的特性，利用带有可结合Fc片段的配体的填料对步骤a)所得的上清液进行亲和层析；

所述可结合Fc片段的配体包括天然Protein A、天然Protein G、重组ProteinA和重组Protein G；所述的亲和层析填料的基质可选自交联琼脂糖、交联葡聚糖、聚本乙烯/聚笨二乙烯聚合物、多孔玻璃、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯醇/甲基丙烯酸酯共聚物、纤维素或改良纤维素等。优选的，所述配体为重组Protein A。

c)疏水层析：采用疏水层析柱进一步去除步骤b)纯化后目标蛋白中的杂质；

所述的疏水层析柱可选自：Butyl Sepharose4Fast Flow，Octyl Sepharose4FastFlow，Phenyl Sepharose6Fast Flow，Butyl-S Sepharose6Fast Flow，ButylSepharose4B，OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose HP，Phenyl SepharoseF.F。优选的，所述疏水层析柱为Octyl Sepharose4Fast Flow。

d)羟基磷灰石层析：将步骤c)所得目标蛋白经羟基磷灰石层析纯化进一步去除目标蛋白中的杂质；

所述的羟基磷灰石层析柱使用的填料是CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I填料。

e)超滤：采用超滤的方法进一步浓缩目标融合蛋白原液。

本发明所制备的重组hBNP-Fc融合蛋白的制备方法，表达产量高且因与IgGFc变体的偶联，所形成的重组蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。经疏水层析和羟基磷灰石层析进一步纯化后得到的融合蛋白纯度达到99％以上。

现有技术多使用原核细胞表达载体(大肠杆菌)制备hBNP，其在制备过程中易形成无生物活性包涵体，须经体外一系列变性复性过程得到活性蛋白，工艺复杂且收率较低，并且复性得到的重组蛋白因为构象折叠难以完全恢复到天然结构以及受变性剂的影响，导致其一些氨基酸结构变化而影响药物活性和疗效，此外，大肠杆菌表达分离的产物常残留热原。因此参照现有技术所得重组hBNP蛋白存在产品质量及用药安全性的问题。本发明所提供的制备方法可实现重组hBNP-Fc融合蛋白正确折叠，简化了纯化步骤，提高了纯化效率，该方法具有生产工艺更简单，蛋白收率高等优点；同时避免了产品受到内毒素热原的污染，提高了融合蛋白的纯度和活性，保证了产品质量及后续用药的安全性。

在本发明的第三个目的在于提供了一种含有重组hBNP-Fc融合蛋白的药物组合物，其特征在于所述含有重组hBNP-Fc融合蛋白的药物组合物包括重组hBNP-Fc融合蛋白和药学上可接受的载体。

具体的，所述的药学上可接受的载体为本领域公知的常用于蛋白质药物制剂使用的载体，如蔗糖、甘露醇、甘氨酸、丙三醇、吐温20(Tween-20)、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、葡萄糖、甘油等中的任意一种或两种以上的混合物。所述的药物组合物在无菌条件下制造。

本发明的第四个目的在于提供了一种重组hBNP-Fc融合蛋白在制备治疗和/或预防人急性心衰药物中的应用。由于人IgG4Fc变体的引入，使得融合蛋白在保留了hBNP原有活性的基础上，在人体内具有更长的半衰期，可减少临床给药次数/频率，降低药物副反应发生概率，使得重组hBNP-Fc融合蛋白较hBNP(奈西立肽或新活素)更具临床应用前景。

本发明的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

1、提供了一种重组hBNP-Fc融合蛋白，由hBNP、肽接头和人IgG4Fc变体有序偶联形成，该融合蛋白具有更长的半衰期，可减少临床给药次数，进而有效提高患者用药顺应性。

2、提供了一种制备本发明所述组hBNP-Fc融合蛋白的方法，采用哺乳动物细胞表达系统(CHO)，该方法的工艺选择充分考虑了融合蛋白的结构及特性，具有生产工艺更简单、蛋白收率高等优点；

3、提供了一种含有重组hBNP-Fc融合蛋白的药物组合物，该组合物包括重组hBNP-Fc融合蛋白和药学上可接受的载体。

4、提供了一种含有重组hBNP-Fc融合蛋白的在治疗、预防心衰药物中的应用，由于人IgG4Fc变体的引入，使得融合蛋白在保留/或增加hBNP原有生物学活性的基础上，在人体内具有更长的半衰期，可减少临床给药次数/频率，降低药物副反应发生概率。

附图说明

图1重组hBNP-Fc融合蛋白单链及二聚化的结构示意图a)单链hBNP-Fc(从N端到C端)；b)二聚化的hBNP-Fc。

图2编码重组hBNP-Fc融合蛋白的哺乳动物细胞表达质粒图谱。

图3重组hBNP-Fc融合蛋白纯化过程中目标蛋白组分在还原条件和非还原条件下的10％SDS-PAGE电泳图谱。其中Lane1:分子量标准品；Lane2:Protein A亲和层析目标蛋白组分(还原电泳)；Lane3:疏水层析目标蛋白组分(还原电泳)；Lane4:羟基磷灰石层析蛋白组分(还原电泳)；Lane5:纯化后的蛋白原液(还原电泳)；Lane6:亲和层析目标蛋白组分(非还原电泳)；Lane7:疏水层析目标蛋白组分(非还原电泳)；Lane8:羟基磷灰石层析蛋白组分(非还原电泳)；Lane9:纯化后的蛋白原液(非还原电泳)。

图4实施例4所得累计浓度-舒张反应曲线图。

图5重组hBNP-Fc融合蛋白及重组hBNP在小鼠体内的代谢曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.构建编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达质粒

(1)hBNP基因序列的制备

根据hBNP的基因序列(Genebank登记号：U34833.1)，采用人工合成方法制备hBNP的前导肽和成熟蛋白编码区的基因序列，并将合成的hBNP基因片段插入到转移载体PUC57中的EcoRV限制性酶切位点中，获得phBNP质粒，并用DNA测序法验证hBNP基因序列的正确性。

(2)L-vIgG1Fc融合基因序列的制备

分别用人工合成方法合成含有5’端BamH I和3’端EcoR I限制性内切酶位点的编码肽接头(Linker，简称L)和人IgG4Fc变体片段的融合基因L-vIgG4Fc。将制备的融合基因片段插入到转移载体PUC18的BamH I和EcoR I位点中，得到pL-vIgG4Fc质粒，并用DNA测序法验证L-vIgG4Fc融合基因序列的正确性。(3)hBNP-Fc融合基因的制备

分别用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切phBNP质粒、pL-vIgG4Fc质粒，并用琼脂糖凝胶电泳分别纯化所得到的hBNP基因片段和L-vIgG4Fc融合基因片段。再将纯化的hBNP基因片段插入到pL-vIgG4Fc质粒肽接头的5’端，T4连接酶连接后构建为phBNP-Fc质粒。所构建的融合基因由hBNP、肽接头和IgG4Fc变体基因组成，其单链结构如图1a所示，二聚化结构如图1b所示。(4)编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达载体的构建

限制性内切酶Hind III和EcoRI双酶切phBNP-Fc质粒，DNA凝胶纯化得到hBNP-Fc融合基因片段。将纯化后的融合基因片段插入到哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3.1(+)(Invitrogen,Carlsbad，CA)的相应酶切位点中，最终获得含融合基因的表达质粒pCDNA-hBNP-L-vIgG4Fc，简称为pCDNA-hBNP-Fc质粒，如图2所示。该表达质粒含由哺乳动物细胞高效表达外源基因蛋白所需的启动子CMV；该质粒还含有两种选择性标记基因，在细菌中具有氨苄青霉素抗性和在哺乳动物细胞中具有新霉素(Neomycin)抗性。

实施例2.重组hBNP-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

将实施例1构建的表达质粒pCDNA-hBNP-Fc与含有DHFR转录单元的质粒pSV2-dhfr(ATCC)共转染入DHFR酶缺陷型CHO细胞(CHO-DHFR^-)。具体步骤如下：

采用电穿孔转染法进行转染，使用900μFd电容的Gene PulserElectroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，电场设置为240V，在比色杯内的5×10⁷个细胞中加入10μg用Pvu I线性化的pCDNA-hBNP-Fc质粒DNA以及10μgpSV2-dhfr共转染。转染24h后，将培养基改成含100μg/mL G418以及20nM MTX的生长培养基，在96孔细胞培养板有限稀释法进行克隆，获得经抗性初筛的阳性克隆。采用ELISA的方法，用抗IgG 4Fc抗体筛选分泌融合蛋白的转染子。也可通过ELISA利用抗hBNP试验对融合蛋白的表达进行定量分析。

采用与DHFR基因共扩增来增加融合蛋白的基因数量，从而使转染子细胞克隆达到融合蛋白高表达量。具体步骤如下，通过递增浓度MTX的逐步筛选，选出能在高达1μM/mL MTX培养基中生长的转染子，再通过极限稀释法进行亚克隆。对亚克隆细胞系的融合蛋白表达能力作进一步分析。筛选分泌水平超过7μg/10⁶个细胞/24小时的细胞株，从而获得稳定高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的CHO细胞株。

实施例3.重组hBNP-Fc融合蛋白的分离纯化

(1)高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的CHO细胞扩大生产

将实施例2中稳定高表达的CHO细胞株，经过驯化完全适用于无血清悬浮培养之后，将细胞转移到5L生物反应器中放大培养。选择EX-CELL^TM 302无血清培养基(Sigma，24326C-100L)作为基础培养基。

在基础培养基中添加终浓度为6g/L超滤植物蛋白胨(Kerry，HyPep 7504)，或终浓度为8g/L营养物质添加剂(Hyclone，Cell Boost 6)。培养12天后，重组hBNP-Fc融合蛋白的表达量累积达到1.85g/L。

(2)重组hBNP-Fc融合蛋白的纯化；

a)澄清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤上述放大培养生产所得到的细胞培养液，收集滤过液；

b)Protein A亲和层析：用0.1mol/L NaOH+1.0mol/L NaCl溶液清洗液清洗层析柱，再用20mmol/L磷酸盐缓冲液盐水平衡液(pH7.2)平衡rProtein A Sepahrose FastFlow柱，然后将步骤a)收集的细胞上清液调节至pH＝7.2后上样，待重组融合蛋白结合于Protein A后，用PBS平衡液冲洗该柱，直至流出液280nm紫外吸收回收到基线。再用20mmol/L,pH3.5的柠檬酸钠缓冲液洗脱结合的重组hBNP-Fc融合蛋白，收集紫外280nm具有吸收峰的层析液。融合蛋白收集后用1mol/L的Tris缓冲溶液调节pH至7.2±0.2。纯化的重组hBNP-Fc蛋白纯度可达到95％以上。

c)疏水层析：

向步骤b)中收集的重组hBNP-Fc融合蛋白中添加(NH₄)₂SO₄至0.5mol/L，pH7.2±0.2。再将重组hBNP-Fc融合蛋白上样到经20mM PBS+0.5mol/L(NH4)₂SO4缓冲溶液(pH7.2±0.2)平衡过的OctylSepharose 4Fast Flow柱，用相同平衡液冲洗，再用“20mM PBS+0.3mol/L(NH4)₂SO4缓冲溶液(pH7.2±0.2)冲洗，最后用“20mM PBS(pH7.2±0.2)洗脱并收集重组hBNP-Fc融合蛋白。d)羟基磷灰石层析：

将步骤c)中收集的重组hBNP-Fc融合蛋白用10mM PBS(pH7.2±0.2)稀释5倍后，再流经预先用10mM PBS(pH7.2±0.2)平衡过的CHT CeramicHydroxyapatite type I层析柱(Biorad，40μm)，同时收集重组hBNP-Fc融合蛋白流出液。然后用两倍柱床体积的平衡液冲洗，并继续收集流出液。

e)采用超滤的方法将步骤d中收集的重组hBNP-Fc融合蛋白浓缩，并交换为10mmol/L柠檬酸缓冲液(pH6.5)。然后经过0.2um滤膜过滤除菌，最终得到纯度高达99％的重组hBNP-Fc融合蛋白原液。在纯化过程中，重组hBNP-Fc融合蛋白的单体结构和二聚体结构的SDS-PAGE电泳图谱如图3所示。

实施例4.重组hBNP-Fc融合蛋白的体外生物学活性

采用离体动脉条测定法检测重组hBNP-Fc融合蛋白体外活性，具体步骤如下：家兔耳缘静脉空气推注处死后，取其胸主动脉，制成1.5cm长、3-4mm宽的血管片段，并悬挂于含10ml通氧37℃的台氏液(9.0g NaCl、0.42g KCl、0.24gCaCl₂、0.1gNaHCO₃、1.0g葡萄糖，用蒸馏水溶解后配制为1000ml溶液，调节pH值为7.4)的平滑肌浴槽中，连接生物机能实验系统(BL-420，成都泰盟电子有限公司)，记录血管张力的变化。初始张力为2.0g，平衡30min后，6μmol/L去甲肾上腺素预刺激。待收缩张力稳定后，再分别给予10^-8～10^-4mol/L的重组hBNP-Fc融合蛋白、重组hBNP(新活素)的生理盐水溶液(阳性对照)，观察血管片段张力变化。舒张率按以下公式计算：

通过逐步增加药物浓度的方式来绘制累计浓度-舒张反应曲线，待药物浓度达到10^-5mol/L时，停止给药并记录舒张反应(参见，例如王跃民等人，[J]中国应用生理学杂志，2001(2)：174-177)，得到如图4所示的累计浓度-舒张反应曲线图。

从所得曲线图可知，重组hBNP-Fc融合蛋白对家兔胸主动脉血管片段的舒张效果明显优于重组hBNP(新活素)，并且在10^-8～10^-4mol/L浓度区间内呈良好的剂量依赖性。结果表明，本发明的重组hBNP-Fc融合蛋白具有良好的体外生物学活性。

实施例5.重组hBNP-Fc融合蛋白的药代动力学测定

12只10kg Beagle犬，随机分为3组，雌雄各半，分别尾静脉注射重组hBNP-Fc融合蛋白、重组hBNP(新活素，阳性对照)和生理盐水(阴性对照)。重组hBNP-Fc融合蛋白和重组hBNP注射剂量均为3.6μg/kg，注射体积1ml/kg。重组hBNP-Fc融合蛋白注射后0、5min、12、24、48、72、120、168、240、288和360h股静脉取血，置于1％肝素抗凝处理过的1.5ml离心管中，37℃静置10min，3000rpm离心10min收集血浆，-20℃保存。采用ELISA试剂盒(Abcam公司，英国)测定各时间点血浆中BNP含量。结果显示，重组hBNP-Fc融合蛋白静脉注射后5min，血浆中BNP的含量达到峰值，即(8048.19±2475.55)ng/L，随后BNP含量逐渐降低，其血浆半衰期(t_1/2)为168h，远高于重组hBNP(新活素)半衰期18.8min。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白其单链的氨基酸序列从N端到C端依次包含人BNP(hBNP)、肽接头和人IgG 4Fc变体。

2.根据权利要求1所述的重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述人IgG4Fc变体为含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述重组hBNP-Fc融合蛋白为二聚体。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的重组hBNP-Fc融合蛋白，其特征在于所述重组hBNP-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

6.一种编码如权利要求5所述的重组hBNP-Fc融合蛋白的核酸序列，其特征在于所述核酸序列包含如SEQ ID NO.:3所示的核酸序列。

7.一种如权利要求1-5任意一项所述重组hBNP-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法包含如下步骤：

(1)构建编码重组hBNP-Fc融合蛋白的基因表达载体；

(2)构建高表达重组hBNP-Fc融合蛋白的工程细胞株；

(3)批次流加培养工程细胞株，以表达重组hBNP-Fc融合蛋白；

(4)重组hBNP-Fc融合蛋白的分离纯化；

所述步骤(1)的具体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hBNP-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒；

所述步骤(2)的具体步骤为：将步骤(1)所得含有hBNP-Fc目的基因的表达质粒转染到合适的哺乳动物宿主细胞，并筛选获得稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株；

所述步骤(3)的具体步骤为：将步骤(2)所得稳定高表达的CHO细胞株，经过驯化完全适应无血清悬浮培养后，进行放大培养得到细胞培养液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中使用的哺乳动物细胞表达载体为pCDNA3.1(+)、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK或pSPORT。

9.根据权利要求7或8任意一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中使用的哺乳动物宿主细胞为CHO、HEK293、COS、BHK、NS0或Sp2/0细胞；所述转染的方法为磷酸钙法、电穿孔转染法或脂质体转染法；所述的筛选稳定、高表达目的融合蛋白的细胞株的方法为：先利用筛选标记进行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达哺乳动物细胞株；所述筛选标记为ZEO、NEO、PUR、HYP、GFP或RFP；所述扩增选择性标记为DHFR序列或GS序列。

10.根据权利要求7-9任意一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中表达重组hBNP-Fc融合蛋白所用细胞培养条件是：在37℃，溶氧50％，pH7.0条件下放大培养，当细胞密度达到2.4×10⁶cells/mL时降温至30℃继续培养12天，并使用EX-CELL^TM 302无血清基础培养基中添加超滤植物蛋白胨或营养物质添加剂所得到的培养基。

11.根据权利要求7-10任意一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)包含如下步骤：

a)澄清：将步骤(3)所得到的细胞培养液通过离心、深层过滤以及二者的任意组合方法，以获得上清液；

b)亲和层析：根据融合蛋白含有Fc片段的特性，利用带有可结合Fc片段的配体的填料对步骤a)所得的上清液进行亲和层析；

c)疏水层析：采用疏水层析柱进一步去除步骤b)纯化后目标蛋白中的杂质；

d)羟基磷灰石层析：将步骤c)所得目标蛋白经羟基磷灰石层析纯化进一步去除目标蛋白中的杂质；所述的羟基磷灰石层析柱使用的填料是CHT CeramicHydroxyapatite Type I填料；

e)超滤：采用超滤的方法进一步浓缩目标融合蛋白原液。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于所述步骤b)中可结合Fc片段的配体为天然Protein A、天然Protein G、重组Protein A或重组Protein G；所述填料的基质为交联琼脂糖、交联葡聚糖、聚本乙烯/聚笨二乙烯聚合物、多孔玻璃、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯醇/甲基丙烯酸酯共聚物、纤维素或改良纤维素；所述步骤c)中所述的疏水层析柱可选自：Butyl Sepharose4FastFlow，Octyl Sepharose4Fast Flow，Phenyl Sepharose6Fast Flow，Butyl-SSepharose6Fast Flow，Butyl Sepharose4B，OctylSepharose CL-4B，Phenyl SepharoseHP或Phenyl SepharoseF.F。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1-5任意一项所述的重组hBNP-Fc融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

14.权利要求1-5任意一项所述的重组hBNP-Fc融合蛋白在制备治疗和/或预防急性心衰的药物中的应用。