KR102664780B1 - 이중 작용 단백질 및 그의 유도체의 제조방법 - Google Patents

이중 작용 단백질 및 그의 유도체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성 단백질과 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 이중 작용 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 상기 제조방법은 목적 단백질의 분해를 효과적으로 방지하여 목적 단백질을 안정적으로 생산할 수 있어 상업적으로 활용가능성이 높다.

Description

이중 작용 단백질 및 그의 유도체의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING DUAL FUNCTION PROTEINS AND ITS DERIVATIVES}
본 발명은 생리활성 단백질과 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 이중 작용 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
동물세포를 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 경우, 동물세포(숙주세포)로부터 분비되는 단백질 분해효소(프로테아제)에 의해 목적하는 발현 단백질의 특정 부위가 절단되어 재조합 단백질의 이질성(heterogeneity)을 유발하거나 활성 감소 또는 불활성화가 일어나는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 상기 발현 단백질의 절단은 생산 및 정제 과정 동안 "로트간(lot to lot)" 동일성을 유지하기 어렵게 만드는 문제도 유발한다. 이로 인해, 재조합 단백질 생산 배양 중 프로테아제를 낮은 수준으로 유지하거나 프로테아제 활성을 방지하는 것이 필요하다.
상술한 바와 같은 문제의 대안 중, 배양 배지에 세린, 시스테인, 아스파트산 또는 아미노펩티다제에 대한 억제제(예를 들어, 아프로티닌, 베스타틴, 류펩틴, E-64 및 펩스타틴 A 등)를 첨가하여 생산하는 방법이 제안되었다(WO 1990-002175, EP 0,306,968, 및 US 5,851,800 참조). 그러나, 상기 억제제들은 세포 독성 및 최종 제품에서 이들이 완전히 제거되었음을 증명하기 위한 별도의 노력이 필요하기 때문에 상업적 생산에 사용하는 것은 유효하지 않다. 또한, 종래 대안들 중 숙주세포에서 생산되는 모든 목적 단백질에 적용할 수 있는 보편적인 방법은 아직 발견되지 않았다.
국제공개특허 WO 1990-002175 유럽등록특허 EP 0,306,968 미국등록특허 US 5,851,800
본 발명의 목적은 생리활성 단백질 및 FGF21 변이체 단백질을 포함하고, 보다 개선된 약물동태 파라미터를 가지며 안정성이 높고, 응집하여 복합체를 형성할 가능성이 적고, 면역원성 가능성이 적은 이중 작용 단백질을 안정적으로 생산할 수 있는 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 이중 작용 단백질 또는 그의 유도체를 암호화하는 cDNA를 함유하는 발현 DNA 벡터로 형질전환된 포유동물 숙주세포로부터 재조합 이중 작용 단백질을 생산하는 방법으로서,
상기 포유동물 숙주세포를 덱스트란 설페이트가 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고,
상기 이중 작용 단백질이 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 변이체 단백질; 생리활성 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하며,
상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (1) 내지 (7)의 변이들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는, 이중 작용 단백질의 제조방법을 제공한다:
(1) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산이 EIRP(서열번호: 53)로 치환됨;
(2) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAV(서열번호: 54)로 치환됨;
(3) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAN(서열번호: 55)으로 치환됨;
(4) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산이 N으로 치환됨;
(5) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산이 N으로 치환됨;
(6) 상기 (1) 내지 (5)의 변이들 중 하나 이상의 변이와 함께, 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 180번 아미노산이 E로 치환됨; 및
(7) 야생형 FGF21 단백질의 면역원성 감소를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 포함함.
본 발명의 제조방법은 목적 단백질의 분해를 효과적으로 방지하여 목적 단백질을 안정적으로 생산할 수 있다.
도 1은 이중작용 단백질을 발현하는 세포주를 현탁 배양하고 배양 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도식화한 것이다. 배양시간이 경과함에 따라 절단되지 않은 이중작용 단백질 외 보다 작은 크기의 단백질이 함께 발현되는 것이 확인되었다.
도 2는 배양 상등액을 보관온도 조건에 따라 일정시간 경과 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도식화한 것이다. 37℃ 보관 대비 4℃ 또는 -20℃에서 보관한 배양 상등액이 이중 작용 단백질의 절단 현상이 감소하였다. 이로부터 숙주세포로부터 기인한 단백질 분해효소에 의해 이중 작용 단백질의 절단 현상이 유발되는 것을 알 수 있었다.
도 3은 배양 상등액에 단백질 분해효소 저해제를 첨가하고 37℃에서 일정시간 보관 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도식화한 것이다. 주로 세린(serine) 단백질 분해효소 저해제를 첨가한 경우에서 이중 작용 단백질의 절단 현상이 감소함을 보였다. 이로부터 숙주세포로부터 기인한 단백질 분해효소에 의해 이중 작용 단백질의 절단 현상이 유발되는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 세포 배양시 배양 배지에 덱스트란 설페이트를 첨가하고 배양한 후 배양 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과 및 이를 도식화한 그래프이다. 중량평균분자량 1.6 kDa의 덱스트란 설페이트를 첨가한 경우 이중 작용 단백질의 절단 감소효과가 없었으나, 500 kDa의 덱스트란 설페이트를 첨가한 경우 이중 작용 단백질의 절단 현상이 감소하였다.
도 5는 배양 배지에 첨가하는 덱스트란 설페이트의 중량평균분자량을 달리하여 배양한 후 배양 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도식화한 것이다. 중량평균분자량 200 kDa 이상의 덱스트란 설페이트를 배양 배지에 첨가한 경우, 이중 작용 단백질의 절단 현상이 감소하였다.
도 6은 배양 배지에 다양한 농도로 덱스트란 설페이트를 첨가하고 배양한 후 배양 상등액을 SDS-PAGE를 분석한 결과 및 이를 도식화한 그래프이다. 덱스트란 설페이트를 200 내지 1,000 mg/L를 첨가한 경우 이중 작용 단백질의 절단 현상을 감소시킬 수 있었다. 또한, 배양 중 배양온도를 32℃로 전환한 경우, 보다 효과적으로 이중 작용 단백질을 절단 현상을 방지할 수 있었다.
본 발명은 이중 작용 단백질 또는 그의 유도체를 암호화하는 cDNA를 함유하는 발현 DNA 벡터로 형질전환된 포유동물 숙주세포로부터 재조합 이중 작용 단백질을 생산하는 방법으로서,
상기 포유동물 숙주세포를 덱스트란 설페이트가 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고,
상기 이중 작용 단백질이 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 변이체 단백질; 생리활성 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하며,
상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (1) 내지 (7)의 변이들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는, 이중 작용 단백질의 제조방법을 제공한다:
(1) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산이 EIRP(서열번호: 53)로 치환됨(이하 "EIRP"로 기재);
(2) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAV(서열번호: 54)로 치환됨(이하 "TGLEAV"로 기재);
(3) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAN(서열번호: 55)으로 치환됨(이하 "TGLEAN"으로 기재);
(4) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산이 N으로 치환됨(이하, "G170N"으로 기재);
(5) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산이 N으로 치환됨(이하, "G174N"으로 기재);
(6) 상기 (1) 내지 (5)의 변이들 중 하나 이상의 변이와 함께, 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 180번 아미노산이 E로 치환됨(이하, "A180E"로 기재); 및
(7) 야생형 FGF21 단백질의 면역원성 감소를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 포함함.
FGF21 변이체 단백질
상기 야생형 FGF21 단백질은 글루코스 및 지질 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 호르몬으로서, 인간, 마우스, 돼지, 원숭이 등의 포유류에서 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로는, 인간 유래의 FGF21 단백질일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 야생형 FGF21 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 인간 야생형 FGF21 단백질일 수 있다.
구체적으로, 상기 FGF21 변이체 단백질에 포함된 변이는, EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나; TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나와 EIRP의 조합; EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나와 A180E의 조합; 또는 TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나, EIRP 및 A180E의 조합일 수 있다.
상기 EIRP는 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산인 LLLE가 EIRP로 치환되는 변이를 의미한다. 또한, 상기 TGLEAV는 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산인 GPSQG가 TGLEAV로 치환되는 변이를 의미한다. 나아가, 상기 TGLEAN은 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산인 GPSQG가 TGLEAN으로 치환되는 변이를 의미한다. 더불어, 상기 G170N은 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산인 G가 N으로 치환되는 변이를 의미한다. 또한, 상기 G174N은 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산인 G가 N으로 치환되는 변이를 의미한다.
아울러, 상기 FGF21 변이체 단백질은 야생형 FGF21 단백질에 비해 N 말단 또는 C 말단의 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 FGF21 변이체 단백질이 서열번호: 6 내지 23의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 FGF21 변이체 단백질이 서열번호: 6 내지 23의 아미노산 서열 중 어느 하나로 표시되면서, 야생형 FGF21 단백질에 비해 N 말단 또는 C 말단의 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 FGF21 변이체 단백질의 변이에 의해 도입된 N잔기가 당화(glycosylation)된 것일 수 있다.
생리활성 단백질
상기 생리활성 단백질은 인슐린(insulin), C-펩타이드(C-peptide), 렙틴(leptin), 글루카곤(glucagon), 가스트린(gastrin), 가스트린억제폴리펩타이드(gastric inhibitory polypeptide; GIP), 아밀린(amylin), 칼시토닌(calcitonin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 펩타이드 YY(peptide YY), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y), 뼈형성단백질 6(bone morphogenetic protein 6; BMP-6), 뼈형성단백질 9(bone morphogenetic protein 9; BMP-9), 옥신토모듈린(oxyntomodulin), 옥시토신(oxytocin), 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신(irisin), FNDC5(fibronectin type III domain-containing protein 5), 아펠린(apelin), 아디포넥틴(adiponectin), CTRP 패밀리(C1q and tumor necrosis factor related protein), 레지스틴(resistin), 비스파틴(visfatin), 오멘틴(omentin), 레티놀 결합 단백질-4(RBP4), 글리세틴(glicentin), 앙기오포이에틴(angiopoietin), 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4(exendin-4) 및 성장 호르몬(growth hormone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 구체적으로, 상기 생리활성 단백질은 GLP-1, 이의 변이체 및 엑센딘-4 중 선택된 1종일 수 있다.
상기 GLP-1은 장관 내 L 세포에서 음식물 등의 자극을 받아 분비되는 31개의 아미노산으로 구성된 인크레틴 (incretin) 호르몬으로서, 예를 들면, 서열번호: 29의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 GLP-1의 변이체는, 예를 들면, 서열번호: 30 내지 33 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
면역글로불린의 Fc 영역
본원에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 1(CH1), 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은 항체를 구성하는 Fc 영역 전체 또는 이의 단편, 또는 Fc 영역 변이체일 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역은 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함하며, 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 더불어, 상기 Fc의 힌지 서열은 항체 의존 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)이나 보체 의존 세포독성(complemant-dependent cytotoxicity; CDC)을 줄이기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 또한, 상기 Fc의 힌지 서열은 Fab 영역의 재배열을 억제하기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 나아가, Fc C-말단의 라이신(K)은 제거될 수 있다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은, 구체적으로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD의 Fc 영역 중 어느 하나; 또는 이들의 조합으로 이루어진 하이브리드 Fc일 수 있다. 또한, 상기 하이브리드 Fc는, 구체적으로, IgG4 영역 및 IgD의 영역을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 하이브리드 Fc는, IgD Fc의 힌지 서열 일부와 CH2, 및 IgG4 Fc의 CH2와 CH3 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 야생형 당쇄, 야생형에 비해 증가된 당쇄, 야생형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 상기 당쇄의 증가, 감소 또는 제거는 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은, 구체적으로, 서열번호: 24 내지 28 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
이중 작용 단백질
상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 생리활성 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 또한, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 FGF21 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 생리활성 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 GLP-1 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 나아가, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 FGF21 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 GLP-1 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다.
링커
또한, 상기 이중 작용 단백질은 링커를 더 포함할 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린의 Fc 영역의 N 말단 또는 C 말단에 직접 연결된 형태일 수 있으나, 상기 FGF21 변이체 단백질이 링커를 통해 면역글로불린의 Fc 영역에 연결된 형태일 수도 있다.
이때, 상기 링커는 Fc 단편의 N 말단, C 말단 또는 유리기(free radical)에 연결될 수 있고, FGF21 변이체 단백질의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 상기 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 부위에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 링커가 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C 말단 및 상기 FGF21 변이체 단백질의 N 말단에 연결되어, 면역글로불린의 Fc 영역과 FGF21 변이체 단백질의 융합 단백질을 형성할 수 있다. 또한, 본 발명의 이중 작용 단백질은 상기 융합 단백질의 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단에 생리활성 단백질이 결합된 형태일 수 있다.
링커 및 Fc가 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 링커는 당업계에 알려진 가교제일 수 있다. 상기 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄(1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산(4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 디석신이미딜에스테르(disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르(imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드(bifunctional maleimides)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 링커는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 10 내지 30개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드일 수 있다. 나아가, 상기 링커는 말단에 알라닌이 추가적으로 결합된 링커일 수 있다. 상기 링커는, 구체적으로, 서열번호: 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 하나 이상의 FGF21 변이체 단백질이 결합한 형태인 이량체 또는 다량체 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린의 Fc 영역에 결합한 형태일 수 있다. 또한, FGF21 변이체 단백질이 결합된 면역글로불린의 Fc 영역이 두 개 이상 결합된 이량체 또는 다량체 형태일 수 있다.
나아가, 상기 이중 작용 단백질은, 구체적으로, 서열번호: 43 내지 52 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호: 50, 51 또는 52의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 FGF21 변이체 단백질은 면역원성 감소 최소화를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역원성은 공지된 통상의 방법으로 예측할 수 있으며, 예를 들면, iTope™과 TCED™ 방법을 이용하여 단백질의 잠재적인 면역원성을 스크리닝할 수 있다.
또한, 상기 면역원성 감소 최소화를 위한 변이는 공지된 통상의 방법으로 설계할 수 있으며, 예를 들면, EpiScreen™ 분석을 수행하여 면역원성 가능성을 평가한 후 면역원성이 관찰될 경우, T-cell 항원결정부 지도작성(epitope mapping)을 통해 면역원성을 유발하는 아미노산 서열을 확인할 수 있으며, 인실리코 예측을 통해 면역원성이 최소화된 변이체를 설계할 수 있다.
포유동물 숙주세포
상기 포유동물 숙주세포는 재조합 이중 작용 단백질을 발현할 수 있는 임의의 동물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 목적하는 형질전환된 세포를 쉽게 분리할 수 있는 동물세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 포유동물 숙주세포는 불사의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CAP 세포 (인간 양수 유래 세포), 또는 COS 세포일 수 있다.
덱스트란 설페이트
본 발명의 이중 작용 단백질의 세포 배양에 단백질 분해효소 억제제를 적용한 결과, 숙주세포로부터 기인한 단백질 분해효소에 의해 이중 작용 단백질의 절단 현상을 방지하는 효과는 미비했다.
상기 덱스트란 설페이트는 중량평균분자량이 20 내지 5,000 kDa일 수 있다. 구체적으로, 상기 덱스트란 설페이트는 중량평균분자량이 200 내지 5,000 kDa일 수 있다.
또한, 상기 배양 배지는 상기 덱스트란 설페이트를 0.01 내지 10 g/ℓ의 농도로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 배지는 상기 덱스트란 설페이트를 0.1 내지 10 g/ℓ, 또는 0.1 내지 1 g/ℓ의 농도로 포함할 수 있다.
배양
상기 배양은, 상기 포유동물 숙주세포를 덱스트란 설페이트가 보충된 배양 배지에서 34 내지 37 ℃에서 1차 배양하는 단계; 및 1차 배양된 배지를 28 내지 33 ℃에서 2차 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 1차 배양을 24 내지 144 시간 동안 수행할 수 있다. 또한, 상기 2차 배양은 31 내지 33 ℃에서 진행할 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 생리활성 단백질인 GLP-1 및 FGF21 변이체가 면역글로블린의 Fc 영역과 융합된 폴리펩타이드로, 동물세포 배양을 통해 생산시 완전한 형태(intact form)로 발현되어 간염증, 간섬유화 및 간경화 예방 또는 치료용 조성물로서의 활성을 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
[ 실시예 ]
제조예 1. 이중 작용 단백질의 발현을 위한 숙주세포의 제조
1-1: 이중 작용 단백질의 발현을 위한 발현벡터의 제조
FGF21에 도입된 돌연변이의 위치, 서열 정보, 목적 및 각 돌연변이의 기대효과를 하기 표 1에 정리하였다(표 1에서 N은 당화(glycosylation)된 아스파라긴(N)을 나타냄). 또한, 하기 표 2에는 표 1에 기술된 돌연변이를 포함하는 FGF21 변이체 단백질을 나타내었다.
서열 기호 위치 기존 서열 돌연변이 서열 목적 기대 효과
EIRP 98-101 LLLE EIRP FGF19 서열로 교체 안정성, 약물동태 개선
TGLEAV 170-174 GPSQG TGLEAV FGF19 서열로 교체 약물동태 개선
TGLEAN 170-174 GPSQG TGLEAN FGF19 서열로 교체, N-glycosylation 추가 약물동태 개선
G170N 170 G N 점 돌연변이, N-glycosylation 추가 약물동태 개선
G174N 174 G N 점 돌연변이, N-glycosylation 추가 약물동태 개선
A180E 180 A E 점 돌연변이 약물동태 개선
서열번호 FGF21 변이체 단백질 서열
서열번호: 6 FGF21(EIRP)
서열번호: 7 FGF21(TGLEAV)
서열번호: 8 FGF21(TGLEAN)
서열번호: 9 FGF21(G170N)
서열번호: 10 FGF21(G174N)
서열번호: 11 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 12 FGF21(EIRP, TGLEAN)
서열번호: 13 FGF21(EIRP, G170N)
서열번호: 14 FGF21(EIRP, G174N)
서열번호: 15 FGF21(EIRP, A180E)
서열번호: 16 FGF21(TGLEAV, A180E)
서열번호: 17 FGF21(TGLEAN, A180E)
서열번호: 18 FGF21(G170N, A180E)
서열번호: 19 FGF21(G174N, A180E)
서열번호: 20 FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)
서열번호: 21 FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)
서열번호: 22 FGF21(EIRP, G170N, A180E)
서열번호: 23 FGF21(EIRP, G174N, A180E)
하기 표 3에 GLP-1 변이체 단백질 서열을 기술하였고, 표 4에 Fc 융합 GLP-1 변이체 단백질 서열을 기술하였다.
서열번호 GLP-1 변이체 단백질 서열
서열번호: 30 GLP-1(A2G)
서열번호: 31 GLP-1(GE)
서열번호: 32 GLP-1(GG)
서열번호: 33 GLP-1(GEG)
서열번호 Fc 융합 GLP-1 변이체 단백질
서열번호: 34 DFD52: GLP1(A2G)-HyFc5
서열번호: 35 DFD53: GLP1(A2G)-HyFc40
서열번호: 36 DFD54: GLP1(GE)-HyFc5
서열번호: 37 DFD55: GLP1(GE)-HyFc40
서열번호: 38 DFD56: GLP1(GG)-HyFc5
서열번호: 39 DFD57: GLP1(GG)-HyFc40
서열번호: 40 DFD58: GLP1(GEG)-HyFc5
서열번호: 41 DFD59: GLP1(GEG)-HyFc40
표 4에서 HyFc5는 서열번호: 27을, HyFc40은 서열번호: 28을 각각 나타낸다.
또한, 하기 표 5에 GLP-1 변이체 단백질 및 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 이중 작용 단백질 서열을 나타내었다. 각 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 GPL-1 변이체 단백질, 면역로불린의 Fc 영역, 링커, FGF21 변이체 단백질 순서로 연결되어있다.
서열번호 물질
기호		 GLP-1 변이체 단백질 서열 융합 캐리어 링커 서열 FGF21
(서열변화)
서열번호: 43 DFD23 GLP-1(A2G) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 44 DFD24 GLP-1(GE) hyFc5
(서열번호: 27)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 45 DFD25 GLP-1(GE) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 46 DFD26 GLP-1(GG) hyFc5
(서열번호: 27)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 47 DFD27 GLP-1(GG) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 48 DFD28 GLP-1(GEG) hyFc5
(서열번호: 27)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 49 DFD29 GLP-1(GEG) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21
(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 50 DFD69 GLP-1(GEG) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)
서열번호: 51 DFD112 GLP-1(GEG) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)
서열번호: 52 DFD114 GLP-1(GEG) hyFc40
(서열번호: 28)		 GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, G170N, A180E)
구체적으로, 각 이중 작용 단백질의 아미노산 서열을 기초로 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 ㈜바이오니아사에 의뢰하여 합성하였다. 각 이중 작용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단과 3' 말단에 각각 NheI 과 NotI 제한효소 서열을 첨가하였고, 5' 말단의 제한효소 서열 뒤에 단백질 번역을 위한 시작 코돈과 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 유도서열(서열번호: 56, MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA)을 삽입하였다. 각 FGF21 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 뒤에는 종결코돈을 삽입하였다. NheI과 NotI 두 제한효소 서열 이용하여 각 이중 작용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 pTrans-empty 발현벡터에 클로닝하였다. pTrans-empty 발현벡터는 독일의 CEVEC사에서 입수하였으며, CMV 프로모터, pUC 유래 복제기원, SV40 유래 복제기원, 암피실린 내성 유전자를 가지는 발현벡터이다.
1-2: 이중 작용 단백질의 발현을 위한 플라스미드 DNA의 제작
상기 제조예 1-1에서 제작한 각 발현벡터를 대장균에 형질전환하여 발현에 쓰일 다량의 플라스미드 DNA를 얻었다. 각 발현벡터는 세포벽이 약화된 대장균 내에 열쇼크를 통해 형질도입한 후, LB 플레이트에 도말하여 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 LB배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하여 각 발현벡터를 세포내에 가지는 대장균을 각 100 ㎖씩 확보하였다. 확보된 대장균은 원심분리를 통해 배양 배지를 제거한 후 P1, P2, P3 용액(QIAGEN사, cat. no.:12963)을 첨가하여 세포벽을 깬 뒤, 단백질과 DNA를 분리한 DNA 혼탁액을 확보하였다. Qiagen DNA 정제 칼럼을 이용해 확보한 용액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 용출된 DNA는 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였으며, 나노드롭 기기(Thermo scientific사, Nanodrop Lite)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후 발현에 사용하였다.
1-3: 이중 작용 단백질의 발현을 위한 형질전환된 숙주세포의 제작
상기 제조예 1-2에서 분리한 각 플라스미드 DNA로 CHO DG44 세포(중국 햄스터 난소 세포)에 FreeStyleMAX(Invitrogen, Cat. No 16447-100)를 사용하여 형질전환하였다. 상기 형질전환된 중국 햄스터 난소 세포를 배지(CD OptiCHO, Gibco, Cat. No. 12681-011)에 접종하고, 8% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 배양하여, 생존한 세포의 선별 및 계대 배양을 반복하여 실시하였다. 선별된 세포는 96 well plate에 한계희석법(limiting dilution)을 통해 단일 클론으로 최종 선별하였다.
실험예 1. 이중 작용 단백질 발현을 위한 현탁 배양 및 분해 현상
제조예 1-3의 물질기호 DFD112(서열번호: 51)로 형질전환된 CHO 세포주를 8 mM의 글루타맥스(GlutaMAX)가 포함된 CD OptiCHO 배지에서 현탁 배양(working volume 30 ㎖/125 ㎖ flask, 37℃, 8% CO2, 120 rpm)하였다. 이후 배양 상등액을 3개의 각기 다른 보관온도(37℃, 4℃ 또는 -20℃)에서 3일간 보관 후 각 보관조건에서의 단백질 분해현상 정도를 확인하였다. 상기 단백질 분해현상 정도는 배양 상등액을 SDS-PAGE(4~12% Bis-Tris, 비환원 조건) 분석하여 평가하였다. SDS-PAGE 분석 결과를 도 1 및 2에 도식화하여 나타냈다.
도 1에서 보는 바와 같이, 이중 작용 단백질 생산을 위한 세포 배양시 절단되지 않은(intact) 목적 단백질 이외에 보다 작은 크기의 단백질(85 내지 110 kDa)이 함께 발현되는 것을 확인하였다.
도 2에서 보는 바와 같이, 4℃ 및 -20℃에서 보관한 배양 상등액이 37℃에서 보관한 배양 상등액 대비 이중 작용 단백질이 절단된 작은 크기의 단백질이 적었다. 이에, 이중 작용 단백질의 분해 현상은 숙주세포로부터 분비되어 배양 상등액에 존재하는 단백질 분해효소에 기인한 결과로 판단되었다.
실험예 2. 이중 작용 단백질 분해에 관여하는 단백질 분해효소 저해제의 탐색
실험예 1에서 확인한 이중 작용 단백질의 분해에 관여하는 단백질 분해효소의 범주를 확인하기 위하여, 실험예 1의 배양 상등액에 각종 단백질 분해효소 저해제를 첨가하고, 37℃에서 3일간 처리한 후 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 이때 사용한 단백질 분해효소 저해제를 하기 표 6에 나타냈으며, SDS-PAGE 분석 결과를 도 3에 도식화하여 나타냈다.
단백질 분해효소 저해제 처리농도
Culture supernatant (control) N/A
4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride (AEBSF) 1 mM
Antipain 0.1 mM
Bestatin 0.04 mM
E-64 0.01 mM
EDTA disodium salt 1 mM
N-Ethylmaleimide 1 mM
Leupeptin 0.1 mM
Pepstatin 1.46 mM
Phosphoramidon 0.01 mM
Benzamidine-HCl 4 mM
ZnCl2 10 mM
Aprotinin 0.0008 mM
도 3에서 보는 바와 같이, AEBSF, Antipain, Leupeptin, Benzamidine-HCl 및 Aprotin과 같은 세린(serine) 프로테아제 계열의 단백질 분해효소 저해제를 처리한 배양 상등액에서 이중 작용 단백질의 분해 현상이 감소됨을 확인하였다. 이에, 이중 작용 단백질의 분해 현상은 숙주세포 유래 단백질 분해효소에 기인한 결과로 판단되었다.
실시예 1. 덱스트란 설페이트 처리
이중 작용 단백질의 세포 배양시 발생하는 절단 현상을 억제하기 위하여, 제조예 1-3의 형질전환된 CHO 세포주를 6 mM의 글루타민이 포함된 CD Dynamis 배지(Gibco, cat. no.: A2661501)에서 7일간 현탁 배양(working volume 30 mL/125 mL flask, 37℃, 8% CO2, 120 rpm)하였다. 상기 현탁 배양시 배양 배지에 덱스트란 설페이트(dextran sulfate; 중량평균분자량 1.6 kDa 또는 500 kDa)를 200 ㎎/ℓ의 농도로 첨가하고, 유가식으로 32℃에서 저온전환 배양하였다. 이후 배양 상등액을 SDS-PAGE(4 내지 12% Bis-Tris, 비환원 조건) 분석을 수행하였으며, SDS-PAGE 분석 결과 및 이를 도식화한 그래프를 도 4에 나타냈다. 도 4에서 w/o 및 Lane 1은 control이고, 500 kDa 및 Lane 2는 500 kDa의 텍스트란 설페이트를 처리한 배양 상등액이며, 1.6 kDa 및 Lane 3은 1.6 kDa의 덱스트란 설페이트를 처리한 배양 상등액이다.
도 4에서 확인되는 바와 같이, 배양 배지에 중량평균분자량 500 kDa의 덱스트란 설페이트를 첨가한 경우, 이중 작용 단백질의 절단(clipping) 현상이 효과적으로 저해됨을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 덱스트란 설페이트의 분자량에 따른 효과
실시예 1에서 확인한 덱스트란 설페이트의 이중 작용 단백질의 세포 배양시 절단 현상 보호작용에 대한 효과적인 첨가 농도 범위를 확인하였다.
구체적으로, 첨가한 덱스트란 설페이트의 중량평균분자량(1.6 kDa, 8 kDa 또는 200 kDa) 및 첨가 농도(100 ㎎/ℓ, 200 ㎎/ℓ 또는 500 ㎎/ℓ)를 조절한 것을 제외하고는, 실험예 1과 동일한 조건에서 배양하였다. 이후 배양 상등액을 SDS-PAGE(4 내지 12% Bis-Tris, 비환원 조건) 분석을 수행하였으며, SDS-PAGE 분석 결과를 도 5에 도식화하여 나타냈다.
도 5에서 보는 바와 같이, 배양 배지에 200 kDa 이상의 분자량을 갖는 덱스트란 설페이트를 100 내지 500 ㎎/ℓ의 농도로 첨가한 경우, 이중 작용 단백질의 절단 현상을 현저히 감소시킬 수 있었다.
실시예 3. 이중 작용 단백질 분해 방지를 위한 배양 조건 평가
실시예 1 및 2에서 확인된 덱스트란 설페이트에 의한 이중 작용 단백질의 절단 방지효과를 최대화하기 위한 배양조건을 확인하였다.
구체적으로, 500 kDa 덱스트란 설페이트를 0 ㎎/ℓ에서 1,000 ㎎/ℓ의 농도로 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 배양하였다. 이때, 배양 4일차에 배양온도를 32℃로 전환한 실험구를 포함하였다(하기 표 7 참조). 이후 배양 상등액을 SDS-PAGE(4 내지 12% Bis-Tris, 비환원 조건) 분석을 수행하였으며, SDS-PAGE 분석 결과 및 이를 도식화한 그래프를 도 6에 나타냈다.
Lane 덱스트란 설페이트의 첨가 농도 배양조건
1 0 37℃에서 4일 배양 후 32℃ 3일 배양
2 37℃에서 7일 배양
3 200 mg/L 37℃에서 4일 배양 후 32℃ 3일 배양
4 37℃에서 7일 배양
5 600 mg/L 37℃에서 4일 배양 후 32℃ 3일 배양
6 37℃에서 7일 배양
7 1,000 mg/L 37℃에서 4일 배양 후 32℃ 3일 배양
8 37℃에서 7일 배양
도 6에서 보는 바와 같이, 중량평균분자량 500 kDa의 덱스트란 설페이트를 첨가하고 배양한 배양 상등액이, 덱스트란 설페이트를 첨가하지 않고 배양한 배양 상등액보다 이중 작용 단백질의 절단 현상이 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한, 배양 중 온도전환을 수반한 경우, 보다 효과적으로 이중 작용 단백질의 절단 현상이 저해됨을 확인할 수 있었다.
<110> YUHAN CORPORATION <120> METHOD FOR PRODUCING DUAL FUNCTION PROTEINS AND ITS DERIVATIVES <130> FPD201802-0034 <150> KR 2017-51758 <151> 2017-04-21 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> human FGF21 <400> 1 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser 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<213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E) <400> 51 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu 20 25 30 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 50 55 60 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 65 70 75 80 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 85 90 95 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 100 105 110 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 115 120 125 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 130 135 140 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 145 150 155 160 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 165 170 175 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 180 185 190 Asp 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Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu 405 410 415 Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu 420 425 430 Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val 435 440 445 Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser 450 455 460 <210> 52 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, G170N, A180E) <400> 52 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu 20 25 30 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 50 55 60 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 65 70 75 80 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 85 90 95 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 100 105 110 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 115 120 125 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 130 135 140 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 145 150 155 160 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 165 170 175 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 180 185 190 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 195 200 205 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 210 215 220 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 225 230 235 240 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 245 250 255 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu 275 280 285 Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp 290 295 300 Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val 305 310 315 320 Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala 325 330 335 Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe 340 345 350 Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp 355 360 365 Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn 370 375 380 Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn 385 390 395 400 Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu 405 410 415 Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu 420 425 430 Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val 435 440 445 Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser 450 455 460 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 variant <400> 53 Glu Ile Arg Pro 1 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 variant <400> 54 Thr Gly Leu Glu Ala Val 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 variant <400> 55 Thr Gly Leu Glu Ala Asn 1 5 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived sequences <400> 56 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala 20 25

Claims (10)

  1. 이중 작용 단백질 또는 그의 유도체를 암호화하는 cDNA를 함유하는 발현 DNA 벡터로 형질전환된 포유동물 숙주세포로부터 재조합 이중 작용 단백질을 생산하는 방법으로서,
    상기 포유동물 숙주세포를 덱스트란 설페이트가 보충된 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 이중 작용 단백질이 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 변이체 단백질; 생리활성 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하며,
    상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (1)의 변이를 포함하는, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법:
    (1) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산이 EIRP(서열번호: 53)로 치환됨.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (2) 내지 (6)의 변이들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법:
    (2) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAV(서열번호: 54)로 치환됨;
    (3) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAN(서열번호: 55)으로 치환됨;
    (4) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산이 N으로 치환됨;
    (5) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산이 N으로 치환됨; 및
    (6) 상기 (1) 내지 (5)의 변이들 중 하나 이상의 변이와 함께, 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 180번 아미노산이 E로 치환됨.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 단백질은 인슐린(insulin), C-펩타이드(C-peptide), 렙틴(leptin), 글루카곤(glucagon), 가스트린(gastrin), 가스트린억제폴리펩타이드(gastric inhibitory polypeptide; GIP), 아밀린(amylin), 칼시토닌(calcitonin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 펩타이드 YY(peptide YY), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y), 뼈형성단백질 6(bone morphogenetic protein 6; BMP-6), 뼈형성단백질 9(bone morphogenetic protein 9; BMP-9), 옥신토모듈린(oxyntomodulin), 옥시토신(oxytocin), 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신(irisin), FNDC5(fibronectin type III domain-containing protein 5), 아펠린(apelin), 아디포넥틴(adiponectin), CTRP 패밀리(C1q and tumor necrosis factor related protein), 레지스틴(resistin), 비스파틴(visfatin), 오멘틴(omentin), 레티놀 결합 단백질-4(RBP4), 글리세틴(glicentin), 앙기오포이에틴(angiopoietin), 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4(exendin-4) 및 성장 호르몬(growth hormone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종인, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 생리활성 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결된, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 덱스트란 설페이트는 중량평균분자량이 20 내지 5,000 kDa인, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배양 배지가 상기 덱스트란 설페이트를 0.01 내지 10 g/ℓ의 농도로 포함하는, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양이
    상기 포유동물 숙주세포를 덱스트란 설페이트가 보충된 배양 배지에서 34 내지 37 ℃에서 1차 배양하는 단계; 및
    1차 배양된 배지를 28 내지 33 ℃에서 2차 배양하는 단계를 포함하는, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 1차 배양을 24 내지 144 시간 동안 진행하는, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 2차 배양이 31 내지 33 ℃에서 진행하는, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 작용 단백질이 서열번호 50, 서열번호 51 또는 서열번호 52 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 단백질인, 이중 작용 단백질을 생산하는 방법.
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