BR112019021923A2

BR112019021923A2 - Método para produzir proteínas de função dupla e suas derivadas

Info

Publication number: BR112019021923A2
Application number: BR112019021923-4A
Authority: BR
Inventors: Hyun Choi Byung; Hwan Lim In; Young Park Jun; Hyoung Lee Jin; Hong Kim Ki; Yong Jo Hae; Hwan Kim Jun; Young Song Moo; Gyun KIM Jong
Original assignee: Yuhan Corporation
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2020-06-02
Also published as: EP3612637A1; JP7191850B2; MX2019012331A; CA3060934A1; CL2019002848A1; CN110709520A; AU2023203121A1; KR102664780B1; AU2018256256B2; ZA201907115B; RU2019137213A3; CN110709520B; US20210188936A1; KR20180118550A; AU2018256256A1; US20230212249A1; JP2020517265A; PH12019550221A1; RU2019137213A; JP2023036638A

Abstract

a presente invenção proporciona um método para produzir uma proteína de função dupla que compreende uma proteína biologicamente ativa e uma proteína mutante fgf21. o método permite uma produção estável de uma proteína alvo por efetivamente evitar a decomposição da proteína alvo, e assim tem um alto potencial para uso comercial.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR PROTEÍNAS DE FUNÇÃO DUPLA E SUAS DERIVADAS”

Campo da Técnica

[001 ]A presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de função dupla que compreende uma proteína biologicamente ativa e uma proteína mutante de fator de crescimento de fibroblasto 21 (uma FGF21).

Antecedentes da Técnica

[002]Quando uma célula animal é usada para produzir uma proteína recombinante, pode haver um problema de que uma região específica da proteína alvo pode ser recortada por uma protease secretada por uma célula animal (célula hospedeira) para fazer com que heterogeneidade, redução ou inativação da proteína recombinante. Em adição, o referido recorte da proteína expressa também leva ao problema de que se torna difícil manter a homogeneidade “lote a lote” durante os processos de produção e purificação. Por esse motivo, é necessário manter a protease em um nível baixo ou suprimir a atividade da protease durante a produção de uma proteína recombinante.

[003]Como alternativa para resolver o problema, um método de produção no qual inibidores contra serina, cisteína, ácido aspártico ou aminopeptidase (como aprotinina, bestatina, leupeptina, E-64 e pepstatina A, etc.) são adicionados à cultura foi proposto meio (ver WO 1990-002175, EP 0,306,968 e US 5,851,800). No entanto, o uso desses inibidores na produção comercial não é eficaz devido à citotoxicidade e à necessidade de esforços extras para provar que eles foram completamente removidos do produto final. Além disso, entre alternativas convencionais, ainda não foi encontrado um método universal aplicável a todas as proteínas alvo produzidas nas células hospedeiras.

Descrição da Invenção

Problema Técnico

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[004]É um objetivo da presente invenção proporcionar um método de cultura para produzir a proteína de função dupla que compreende a proteína biologicamente ativa e uma proteína mutante FGF21, que tem parâmetros farmacocinéticos aprimorados, alta estabilidade, menos potencial para agregação para formar um complexo, e menos potencial imunogênico.

Solução para o Problema

[005]De acordo com um objetivo da presente invenção, é proporcionado um método para produzir uma proteína recombinante de função dupla a partir de uma célula hospedeira de mamífero transformada com um vetor de expressão contendo cDNA que codifica uma proteína de função dupla ou um derivado da mesma, o método que compreende cultivar a célula hospedeira de mamífero em um meio de cultura suplementado com sulfato de dextrano, em que a proteína de função dupla compreende uma proteína mutante de fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF21); uma proteína biologicamente ativa, ou uma mutante ou fragmento do mesmo; e uma região Fc de uma imunoglobulina, em que a proteína mutante FGF21 compreende pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste das mutações (1) a (7) abaixo:

(1) uma substituição de amino ácidos nas posições 98 a 101 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de EIRP (SEQ ID NO: 53);

(2) uma substituição de amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de TGLEAV (SEQ ID NO: 54);

(3) uma substituição de amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de TGLEAN (SEQ ID NO: 55);

(4) uma substituição de um amino ácido na posição 170 a partir do N

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3/21 terminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido N;

(5) uma substituição de um amino ácido na posição 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido N;

(6) uma substituição de um amino ácido na posição 180 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido E, junto com uma ou mais mutações (1) a (5) acima; e (7) uma mutação de 1 a 10 amino ácidos para reduzir imunogenicidade de uma proteína FGF21 do tipo selvagem.

Efeitos vantajosos da Invenção

[006]O método de produção da presente invenção permite uma produção estável de uma proteína alvo por efetivamente evitar a decomposição da proteína alvo.

Breve Descrição dos Desenhos

[007]A Figura 1 é um diagrama esquemático que mostra o resultado da análise do sobrenadante da cultura por SDS-PAGE após cultura de suspensão de uma linhagem celular que expressa a proteína de função dupla. Foi observado que na medida em que o tempo da cultura decorre, outras proteínas menores do que a proteína de função dupla não recortada foram expressas juntas.

[008]A Figura 2 é um diagrama esquemático que mostra o resultado da análise do sobrenadante da cultura por SDS-PAGE de acordo com as condições de temperatura de armazenamento após um determinado período de tempo. O sobrenadante da cultura armazenada a 4°C ou -20°C mostrou reduzido recorte das proteínas de função dupla em comparação àquelas armazenadas a 37°C. Esse resultado indicou que o fenômeno de recorte das proteínas de função dupla foi induzido pela protease derivada a partir da célula hospedeira.

[009]A Figura 3 é um diagrama esquemático que mostra o resultado da análise por SDS-PAGE após adicionar inibidores de protease ao sobrenadante das culturas e armazenar as misturas por um determinado período de tempo a 37°C. Foi

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4/21 observado que principalmente a adição do inibidor de protease serina reduziu o fenômeno de recorte da proteína de função dupla. Esse resultado indicou que o fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi induzido pela protease derivada a partir da célula hospedeira.

[010]A Figura 4 é o resultado da análise do sobrenadante da cultura por SDS-PAGE após a cultura de célula na qual sulfato de dextrano foi adicionado ao meio de cultura, e o gráfico da mesma. O efeito de reduzir o fenômeno de recorte da proteína de função dupla não foi observado quando sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio ponderado de 1.6 kDa foi adicionado, enquanto que o fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi reduzido quando 500 kDa sulfato de dextrano foi adicionado.

[011]A Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra o resultado da análise do sobrenadante da cultura por SDS-PAGE após cultivar com sulfatos de dextrano tendo diferentes pesos moleculares médios ponderados adicionados ao meio de cultura. Quando sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio ponderado de 200 kDa ou mais foi adicionado ao meio de cultura, o fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi reduzido.

[012]A Figura 6 é o resultado da análise SDS-PAGE do sobrenadante da cultura após a cultura na qual sulfatos de dextrano em várias concentrações foram adicionados ao meio de cultura, e o gráfico da mesma. Quando sulfato de dextrano foi adicionado a 200-1,000 mg/L, o fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi reduzido. Em adição, quando a temperatura da cultura foi mudada para 32°C durante a cultura, o fenômeno de recorte da proteína de função dupla pode ser evitado mais efetivamente.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

[013]De acordo com um objetivo da presente invenção, é proporcionado um método para produzir uma proteína recombinante de função dupla a partir de uma

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5/21 célula hospedeira de mamífero transformada com um vetor de expressão contendo cDNA que codifica a proteína de função dupla ou um derivado da mesma, o método compreendendo cultivar a célula hospedeira de mamífero em um meio de cultura suplementado com sulfato de dextrano, em que a proteína de função dupla compreende uma proteína mutante de fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF21); uma proteína biologicamente ativa, ou uma mutante ou fragmento da mesma; e uma região Fc de uma imunoglobulina, em que a proteína mutante FGF21 compreende pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste das mutações (1) a (7) abaixo:

(1) uma substituição de amino ácidos nas posições 98 a 101 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de EIRP (SEQ ID NO: 53) (daqui em diante, “EIRP”);

(2) uma substituição de amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de TGLEAV (SEQ ID NO: 54) (daqui em diante, “TGLEAV”);

(3) uma substituição de amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de TGLEAN (SEQ ID NO: 55) (daqui em diante, “TGLEAN”);

(4) uma substituição de um amino ácido na posição 170 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido N (daqui em diante, “G170N”);

(5) uma substituição de um amino ácido na posição 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido N (daqui em diante, “G174N”);

(6) uma substituição de um amino ácido na posição 180 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido E, junto com uma ou mais mutações (1) a (5) acima (daqui em diante, “A180E”); e

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6/21 (7)a mutação de 1 a 10 amino ácidos para reduzir imunogenicidade de uma proteína FGF21 do tipo selvagem.

Proteína mutante FGF21

[014]A proteína FGF21 do tipo selvagem, um hormônio conhecido por desempenhar um papel importante na homeostase de glicose e lipídeo, pode ser um derivado a partir de mamíferos tais como seres humanos, camundongos, porcos, macacos, etc., preferivelmente a partir de seres humanos. Mais preferivelmente, a proteína FGF21 do tipo selvagem pode ser a proteína FGF21 humana de tipo selvagem tendo uma sequência de amino ácido representada por SEQ ID NO: 1.

[015]Preferivelmente, a mutação incluída nas proteínas mutantes FGF21 podem ser qualquer uma das mutações de EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N e G174N; uma combinação de qualquer uma das mutações de TGLEAV, TGLEAN, G170N e G174N e a mutação de EIRP; uma combinação de qualquer uma das mutações de EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N e G174N e a mutação de A180E; ou uma combinação de qualquer uma das mutações de TGLEAV, TGLEAN, G170N e G174N, a mutação de EIRP e a mutação de A180E.

[016]A EIRP se refere a uma mutação na qual LLLE, os amino ácidos nas posições 98 a 101 a partir do N-terminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem, é substituída com EIRP. Adicionalmente, a TGLEAV se refere a uma mutação na qual GPSQG, os amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do N-terminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem, é substituída com TGLEAV. Em adição, a TGLEAN se refere a uma mutação na qual GPSQG, os amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do N-terminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem, é substituída com TGLEAN. Adicionalmente, a G170N se refere a uma mutação na qual G, o amino ácido na posição 170 a partir do N-terminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem, é substituída com N. Em adição, a G174N se refere a uma mutação na qual G, o amino ácido na posição 174 a partir do N-terminus de uma proteína FGF21

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7/21 do tipo selvagem, é substituída com N.

[017]Adicionalmente, as proteínas mutantes FGF21 podem ter uma conformação, na qual 1 a 10 amino ácidos no N-terminus ou C-terminus é (são) deletados em comparação à proteína FGF21 do tipo selvagem. Mais preferivelmente, as proteínas mutantes FGF21 podem incluir uma sequência de amino ácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 23. Ainda mais preferivelmente, as proteínas mutantes FGF21 podem incluir uma sequência de amino ácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 23 e adicionalmente ter uma conformação, na qual 1 a 10 amino ácidos no N-terminus ou C-terminus é (são) deletados em comparação à proteína FGF21 do tipo selvagem.

[018]Na proteína de função dupla, um resíduo de amino ácido N de proteína mutante FGF21 introduzido por uma mutação pode ser glicosilado.

Proteína biologicamente ativa

[019]A proteína biologicamente ativa pode ser uma selecionada a partir do grupo que consiste de insulina, C-peptídeo, leptina, glucagon, gastrina, polipeptídeo de inibição gástrica (GIP), amilina, calcitonina, colecistoquinina, peptídeo YY, neuropeptídeo Y, proteína morfogenética óssea 6 (BMP-6), proteína morfogenética óssea 9 (BMP-9), oxintomodulina, oxitocina, peptídeo-1 similar a glucagon (GLP-1), peptídeo-2 similar a glucagon (GLP-2), irisina, proteína 5 contendo domínio de fibronectina tipo III (FNDC5), apelina, adiponectina, C1q e proteína relacionada a fator de necrose tumoral (Família CTRP), resistina, visfatina, omentina, proteína-4 de ligação a retinol (RBP-4), glicentina, angiopoietina, interleucina-22 (IL-22), exendina-4 e hormônio de crescimento. Preferivelmente, a proteína biologicamente ativa pode ser uma selecionada a partir de GLP-1, uma mutante da mesma e exendina-4.

[020]A proteína GLP-1 é um hormônio de incretina que consiste de 31 amino ácidos, que é secretado por L células no trato intestinal estimulado por alimentos, etc. Por exemplo, a proteína GLP-1 pode ser representada pela sequência de amino

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8/21 ácido de SEQ ID NO: 29.

[021 ]Um mutante de GLP-1 pode ser representada, por exemplo, pela sequência de amino ácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30 a 33.

Região Fc de imunoqlobulina

[022]Como usado aqui, o termo Região Fc, Fragmento Fc, ou Fc se refere a uma proteína, que inclui uma região constante de cadeia pesada 1 (CH1), uma região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e uma região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, mas não inclui regiões variáveis das cadeias pesada e leve e uma região constante de cadeia leve 1 (CL1) de uma imunoglobulina. Adicionalmente, como usado aqui, o termo “Região Fc mutante” se refere a uma preparada por substituir parte de amino ácido(s) de uma região Fc ou por combinar regiões Fc de diferentes tipos.

[023]A região Fc de imunoglobulina pode ser toda uma região Fc que constitui um anticorpo, um fragmento da mesma, ou uma região Fc mutante. Adicionalmente, a região Fc inclui uma molécula na forma de um monômero ou multímero, e pode adicionalmente incluir uma região de dobradiça da região constante de cadeia pesada. A região Fc mutante pode ser modificada para evitar divagem na região de dobradiça. Adicionalmente, a sequência de dobradiça da Fc pode ter uma substituição em alguma sequência de amino ácidos para reduzir citotoxicidade mediada à célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em adição, parte da sequência de amino ácido da sequência de dobradiça Fc pode ser substituída para inibir o rearranjo da região Fab. Um resíduo de lisina no C-terminus da Fc pode ser removido.

[024]Preferivelmente, a região Fc de imunoglobulina pode ser qualquer uma das regiões Fc lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 e IgD; ou uma Fc híbrida, que é uma combinação da mesma. Adicionalmente, a Fc híbrida pode incluir uma região lgG4 e uma região IgD. Adicionalmente, a região Fc híbrida pode incluir parte da sequência de

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9/21 dobradiça e CH2 de um IgD Fc, e sequências CH2 e CH3 de lgG4 Fc.

[025]Em adição, o Fragmento Fc da presente invenção pode ser na forma de cadeia glicosilada de tipo selvagem, mais cadeia glicosilada do que o tipo selvagem, menos cadeia glicosilada do que o tipo selvagem, ou de cadeia glicosilada. O aumento, redução, ou remoção de cadeia glicosilada pode ser realizada por um método convencional conhecido na técnica, tal como um método químico, um método enzimático, e um método de engenharia genética usando microrganismos.

[026]Preferivelmente, a região Fc de imunoglobulina pode ser representada por uma sequência de amino ácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 24 a 28.

Proteína de função dupla

[027]A proteína de função dupla pode incluir uma proteína biologicamente ativa, uma região Fc de uma imunoglobulina e uma proteína mutante FGF21, ligada nessa ordem a partir do N-terminus para o C-terminus. Adicionalmente, a proteína de função dupla pode incluir uma proteína mutante FGF21, uma região Fc de uma imunoglobulina e uma proteína biologicamente ativa, ligada nessa ordem a partir do N-terminus para o C-terminus. Preferivelmente, a proteína de função dupla pode incluir uma proteína mutante GLP-1, uma região Fc de uma imunoglobulina e uma proteína mutante FGF21, ligada nessa ordem a partir do N-terminus para o C-terminus. Adicionalmente, a proteína de função dupla pode incluir uma proteína mutante FGF21, uma região Fc de uma imunoglobulina e uma proteína mutante GLP-1, ligada nessa ordem a partir do N-terminus para o C-terminus.

Ligante

[028]Adicionalmente, a proteína de função dupla pode adicionalmente incluir um ligante.

[029]A proteína de função dupla pode ser na forma, na qual a proteína mutante FGF21 está diretamente conectada ao N-terminus ou C-terminus da região Fc de imunoglobulina, ou a proteína mutante FGF21 é conectada à região Fc de imuPetição 870190105437, de 18/10/2019, pág. 22/44

10/21 noglobulina via um ligante.

[030]Em tal caso, o ligante pode ser conectado ao N-terminus, C-terminus, ou um radical livre do Fragmento Fc, e também, pode ser conectado ao N-terminus, C-terminus, ou um radical livre da proteína mutante FGF21. Quando o ligante é um ligante de peptídeo, a conexão pode ocorrer em qualquer região. Por exemplo, o ligante pode ser conectado ao C-terminus da região Fc de imunoglobulina e o Nterminus da proteína mutante FGF21 para formar uma proteína de fusão da região Fc de imunoglobulina e a proteína mutante FGF21. Adicionalmente, a proteína de função dupla da presente invenção pode ser na forma, na qual a proteína biologicamente ativa é ligada ao N-terminus da região Fc de imunoglobulina da proteína de fusão.

[031]Quando o ligante e Fc são separadamente expresso e então conectado, o ligante pode ser um agente de reticulação conhecido na técnica. Exemplos do agente de reticulação podem incluir 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, imidoésteres que inclui éster N-hidroxisuccinimida tal como ácido 4-azidosalicílico e ésteres disuccinimidila tal como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), e maleimidas bifuncionais tal como bis-N-maleimido-1,8-octano, mas não são limitados aos mesmos.

[032]Adicionalmente, o ligante pode ser um peptídeo. Preferivelmente, o ligante pode ser um peptídeo que consiste de 10 a 30 resíduos de amino ácidos.

[033]Adicionalmente, alanina pode ser adicionalmente fixada à extremidade de ligante. Preferivelmente, o ligante pode ser um peptídeo tendo uma sequência de amino ácido representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 5.

[034]A proteína de função dupla pode ser em uma forma na qual um dímero ou multímero de proteínas mutantes FGF21, na qual uma ou mais proteínas mutantes FGF21 ligadas juntas, são conectadas a uma região Fc de imunoglobulina. Adicionalmente, a proteína de função dupla pode ser em uma forma de um dímero ou

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11/21 multímero no qual duas ou mais regiões Fc de imunoglobulina são ligadas, em que as regiões Fc de imunoglobulina têm a proteína mutante FGF21 conectada às mesmas.

Célula hospedeira de mamífero

[035]A célula hospedeira de mamífero pode ser qualquer célula animal capaz de expressar uma proteína recombinante de função dupla, preferivelmente uma célula animal que permite o fácil isolamento de uma célula transformada objetivada. Especificamente, a célula hospedeira de mamíferos pode ser células de hibridoma imortal, células mieloma NS/0, células 293, Células de ovário de hamster Chinês (Células CHO), células HeLa, células CAP (células derivadas de fluido amniótico humano), ou células COS.

Sulfato de dextrano

[036]Como um resultado de aplicar o inibidor de protease para a cultura de célula de uma proteína de função dupla da presente invenção, o efeito de evitar o fenômeno de recorte da proteína de função dupla pela protease derivada a partir da célula hospedeira foi insuficiente.

[037]O sulfato de dextrano pode ter um peso molecular médio ponderado de 20 a 5,000 kDa. Especificamente, o sulfato de dextrano pode ter um peso molecular médio ponderado de 200 a 5,000 kDa.

[038]Em adição, o meio de cultura pode conter o sulfato de dextrano a uma concentração de 0,01 a 10 g/L. Especificamente, o meio de cultura pode conter o sulfato de dextrano a uma concentração de 0,1 a 10 g/L, ou 0,1 a 1 g/L.

Cultura

[039]O cultivo pode compreender uma etapa para cultivo primário da célula hospedeira de mamífero de 34 a 37°C em um meio de cultura suplementado com sulfato de dextrano; e uma etapa para cultivo secundário do meio de cultivo primário a 28 a 33°C. Especificamente, o cultivo primário pode ser conduzido por 24 a 144

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12/21 horas. Também, o cultivo secundário pode ser conduzido a 31 a 33°C.

[040]A proteína de função dupla é um polipeptídeo no qual as variantes GLP-1 e FGF21, proteínas biologicamente ativas, são fundidas a uma região Fc de uma imunoglobulina, e é expressa em uma forma intacta quando produzida por cultura de célula animal, e mostra atividade como uma composição para evitar ou tratar hepatite, fibrose hepática, e cirrose hepática.

Modo para a invenção

[041]Daqui em diante, modalidades exemplificativas da presente invenção serão descritas em detalhes com referência aos exemplos. No entanto, os referidos exemplos de acordo com a presente invenção podem ser modificados em muitas formas diferentes e o âmbito da presente invenção não deve ser construído como limitado aos exemplos determinados aqui.

Exemplos

Exemplo de preparação 1. Preparação de células hospedeiras para expressão de proteínas de função dupla

1-1: Preparação de vetores de expressão para a expressão de proteínas de função dupla

[042]A posição, informação de sequência, efeito alvo e esperado de cada mutação introduzida na proteína FGF21 são listadas na Tabela 1 abaixo (na Tabela 1, N se refere uma asparagina glicosilada (N)). Adicionalmente, proteínas mutantes FGF21 que inclui as mutações descritas na Tabela 1 são listados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 1

Sequência	Posição	Sequência original	Sequência mutante	Alvo	Efeito esperado
EIRP	98-101	LLLE	EIRP	Substituição com sequência FGF19	Aprimoramento de estabilidade e farmacocinéticas
TGLEAV	170- 174	GPSQG	TGLEAV	Substituição com sequência FGF19	Aprimoramento de farmacociné-

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					ticas
TGLEAN	170- 174	GPSQG	TGLEAN	Substituição com sequência FGF19, e adição de N-glicosilação	Aprimoramento de farmacocinéticas
G170N	170	G	N	Mutação pontual, e adição de N-glicosilação	Aprimoramento de farmacocinéticas
G174N	174	G	N	Mutação pontual, e adição de N-glicosilação	Aprimoramento de farmacocinéticas
A180E	180	A	E	Mutação pontual	Aprimoramento de farmacocinéticas

Tabela 2

SEQ ID NO	Sequência de proteína mutante FGF21
6	FGF21 (EIRP)
7	FGF21 (TGLEAV)
8	FGF21 (TGLEAN)
9	FGF21 (G170N)
10	FGF21 (G174N)
11	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
12	FGF21 (EIRP, TGLEAN)
13	FGF21 (EIRP, G170N)
14	FGF21 (EIRP, G174N)
15	FGF21 (EIRP, A180E)
16	FGF21 (TGLEAV, A180E)
17	FGF21 (TGLEAN, A180E)
18	FGF21 (G170N, A180E)
19	FGF21 (G174N, A180E)
20	FGF21 (EIRP, TGLEAV, A180E)
21	FGF21 (EIRP, TGLEAN, A180E)
22	FGF21 (EIRP, G170N, A180E)

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23	FGF21 (EIRP, G174N, A180E)

[043]As sequências de proteína mutante GLP-1 são mostradas na Tabela 3 abaixo, e as sequências de proteína mutante GLP-1 de fusão Fc são mostradas na Tabela 4.

Tabela 3

SEQ ID NO	Sequência de proteína mutante GLP-1
30	GLP-1 (A2G)
31	GLP-1 (GE)
32	GLP-1 (GG)
33	GLP-1 (GEG)

Tabela 4

SEQ ID NO	Proteína de fusão mutante GLP-1 Fc
34	DFD52: GLP1 (A2G)-HyFc5
35	DFD53: GLP1 (A2G)-HyFc40
36	DFD54: GLP1 (GE)-HyFc5
37	DFD55: GLP1 (GE)-HyFc40
38	DFD56: GLP1 (GG)-HyFc5
39	DFD57: GLP1 (GG)-HyFc40
40	DFD58: GLP1 (GEG)-HyFc5
41	DFD59: GLP1 (GEG)-HyFc40

[044]Na Tabela 4, HyFc5 representa SEQ ID NO: 27 e HyFc40 representa

SEQ ID NO: 28.

[045]Adicionalmente, as sequências das proteínas de função dupla que incluem a proteína mutante GLP-1 s e proteínas mutantes FGF21 são listadas na Tabela 5 abaixo. Cada proteína de função dupla contém uma proteína mutante GLP-1, uma região Fc de uma imunoglobulina, um ligante e uma proteína mutante FGF21 conectada nessa ordem a partir do N-terminus para C-terminus.

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Tabela 5

SEQ ID NO	Código do material	Sequência de proteína mutante GLP-1	Veículo de fusão	Sequência de ligante	Mudanças na sequência FGF21
43	DFD23	GLP-1 (A2G)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
44	DFD24	GLP-1 (GE)	hyFc5 (SEQ ID NO: 27)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
45	DFD25	GLP-1 (GE)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
46	DFD26	GLP-1 (GG)	hyFc5 (SEQ ID NO: 27)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
47	DFD27	GLP-1 (GG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
48	DFD28	GLP-1 (GEG)	hyFc5 (SEQ ID NO: 27)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
49	DFD29	GLP-1 (GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21 (EIRP, TGLEAV)
50	DFD69	GLP-1 (GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)
51	DFD112	GLP-1 (GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)	FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)
52	DFD114	GLP-1 (GEG)	hyFc40 (SEQ ID NO: 28)	GS3 (SEQ ID NO: 4)______________	FGF21(EIRP, G170N, A180E)

[046]Especificamente, as sequências de nucleotídeo que codificam cada uma das proteínas de função dupla foram sintetizadas após consulta a Bioneer Corporation (Korea) com base na sequência de amino ácido de cada proteína. As sequências de enzima de restrição Nhel e Notl foram adicionadas ao 5’ terminus e ao 3’ terminus das sequências de nucleotídeo que codificam cada uma das proteínas de função dupla e um códon de início para tradução da proteína e uma sequência líder (SEQ ID NO: 56, MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA) permitindo a secreção

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16/21 da proteína expressa no lado externo de uma célula foram inseridos próximo à sequência de enzima de restrição no 5’ terminus. Um códon de parada foi inserido próximo à sequência de nucleotídeo, que codifica cada uma das proteínas mutantes FGF21. A sequência de nucleotídeo que codifica cada uma das proteínas de função dupla foi clonada em um vetor de expressão pTrans-vazio por usar as duas enzimas de restrição Nhel e Notl. O vetor de expressão pTrans-vazio, que tem um promotor CMV, uma origem de replicação derivada de pUC, uma origem de replicação derivada de SV40 e um gene de resistência a ampicilina, foi adquirido da CEVEC Pharmaceuticals (Germany).

1-2: Construção de DNA de plasmídeo para a expressão de proteínas de função dupla

[047]E. coli foi transformada com cada um dos vetores de expressão construído no Exemplo de preparação 1-1 para obter uma grande quantidade de DNA de plasmídeo a ser usada para a expressão. Células de E. coli, com paredes celulares enfraquecidas através de choque de calor, foram transformadas com cada vetor de expressão, e os transformantes foram laminados em uma placa LB para obter colônias. As colônias assim obtidas foram inoculadas em meio LB, cultivadas a 37°C por 16 horas, e cada cultura de E. coli contendo cada vetor de expressão foi obtida em um volume de 100 mL. A E. coli posteriormente obtida foi centrifugada para remover o meio de cultura, e então soluções P1, P2, P3 (QIAGEN, Cat No.:12963) foram adicionadas para romper as paredes celulares, desse modo obtendo uma suspensão de DNA na qual proteínas e DNA foram separados. O DNA de plasmídeo foi purificado a partir da suspensão de DNA assim obtida por usar uma coluna de purificação de DNA Qiagen. O DNA de plasmídeo eluído foi identificado por eletroforese de gel de agarose, e as concentrações e as purezas foram medidas usando um dispositivo de nanogotas (Thermo Scientific, Nanodrop Lite). O DNA assim obtido foi usado para a expressão.

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-3: Produção de células hospedeiras transformadas para a expressão de proteínas de função dupla

[048]Células CHO DG44 (Células de ovário de hamster Chinês) foram transformadas com cada DNA de plasmídeo isolado no Exemplo de preparação 1-2 usando FreeStileMAX (Invitrogen, Cat. No. 16447-100). As células de ovário de hamster Chinês transformadas foram inoculadas em um meio (CD OptiCHO, Gibco, Cat. No. 12681-011), e cultivadas em uma incubadora sob a condição de 8% CO2 e 37°C, para selecionar e cultivar células sobreviventes com passagens repetidas. As células selecionadas foram finalmente selecionadas como um único clone por limitar a diluição em uma placa de 96 cavidades.

Exemplo Experimental 1. Cultura de suspensão para a expressão de proteínas de função dupla, e fenômeno de decomposição

[049]A linhagem celular CHO transformada com 0 código do material DFD112 (SEQ ID NO: 51) do Exemplo de preparação 1-3 foi cultivada em suspensão em meio CD OptiCHO suplementado com 8 mM de GlutaMAX (volume de trabalho em frascos de 30 mL/125 mL, 37°C, 8% de CO2, 120 rpm). Posteriormente, os sobrenadantes das culturas foram armazenados em três diferentes temperaturas de armazenamento (37°C, 4°C, ou -20°C) por 3 dias, e então os graus do fenômeno de proteólise foram avaliados por SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris, condição de não redução) análise do sobrenadante da cultura. Os resultados da análise SDS-PAGE são mostrados nas Figuras 1 e 2.

[050]Como mostrado na Figura 1, foi observado que proteínas (85 a 110 kDa) menores do que as proteínas alvos foram expressas junto com as proteínas alvos que não foram recortadas (intactas) durante a cultura da célula para produzir proteínas de função dupla.

[051]Como mostrado na Figura 2, 0 sobrenadante das culturas armazenadas a 4°C e -20°C tinha menos proteínas de pequeno tamanho no qual as proteínas de

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18/21 função dupla foram recortadas em comparação ao sobrenadante da cultura armazenada a 37°C. Assim sendo, foi observado que o fenômeno de decomposição da proteína de função dupla foi causado pelas proteases secretadas a partir da célula hospedeira presente no sobrenadante da cultura.

[001]Exemplo Experimental 2. Detecção de inibidores de protease envolvidos na decomposição de proteína de função dupla

[052]De modo a examinar a categoria das proteases envolvidas na decomposição das proteínas de função dupla identificadas no Exemplo Experimental 1, o sobrenadante das culturas do Exemplo Experimental 1 foi adicionado com vários inibidores de protease, e tratado por 3 dias a 37°C, que foi então submetido à análise SDS-PAGE. Os inibidores de protease usados aqui são mostrados na Tabela 6, e os resultados da análise SDS-PAGE são mostrados na Figura 3.

Tabela 6

Inibidores de protease	Concentração do tratamento
Sobrenadante da cultura (controle)	N/A
Fluoreto de 4-(2-Aminoetil)benzenosulfonila (AEBSF)	1 mM
Antipaina	0,1 mM
Bestatina	0,04 mM
E-64	0,01 mM
Sal dissódico EDTA	1 mM
N-Etilmaleimida	1 mM
Leupeptina	0,1 mM
Pepstatina	1,46 mM
Fosforamidon	0,01 mM
Benzamidina-HCI	4 mM
ZnCI₂	10 mM

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Aprotinina

0,0008 mM

[053]Como mostrado na Figura 3, foi observado que o fenômeno de decomposição da proteína de função dupla foi reduzido no sobrenadante das culturas tratadas com inibidores de proteases relacionados à protease serina tal como AEBSF, Antipaina, Leupeptina, Benzamidina-HCI e Aprotina. Assim sendo, foi observado que o fenômeno de decomposição da proteína de função dupla foi causado pelas proteases derivadas a partir da célula hospedeira.

Exemplo 1. Tratamento de Sulfato de dextrano

[054]De modo a inibir o fenômeno de recorte que ocorre durante cultura de célula das proteínas de função dupla, a linhagem celular CHO transformada do Exemplo de preparação 1-3 foi cultivada em suspensão em meio CD Dynamis (Gibco, cat. No. A2661501) suplementado com 6 mM de glutamina por 7 dias (volume de trabalho frasco de 30 mL/125 mL, 37°C, 8% CO2, 120 rpm). De acordo com a cultura de suspensão, sulfato de dextrano (peso molecular médio ponderado: 1,6 kDa ou 500 kDa) foi adicionado ao meio de cultura a uma concentração de 200 mg/L, e a cultura foi conduzida a 32°C por uma conversão em baixa temperatura e método de cultura de lote alimentado. Posteriormente, 0 sobrenadante da cultura foi analisado por SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris, condição de não redução), e 0 resultado da análise SDS-PAGE e um diagrama esquemático da mesma são mostrados na Figura 4. Na Figura 4, w/o e Faixa 1 são controles, 500 kDa e Faixa 2 são 0 sobrenadante da culturas tratado com 500 kDa de sulfato de dextrano, e 1,6 kDa e Faixa 3 são 0 sobrenadante das culturas tratadas com 1,6 kDa de sulfato de dextrano.

[055]Como mostrado na Figura 4, foi observado que 0 fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi efetivamente inibido quando sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio ponderado de 500 kDa foi adicionado ao meio de cultura.

Exemplo 2. Efeito de sulfato de dextrano de acordo com 0 peso molecular

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[056]A faixa de concentração efetiva de sulfato de dextrano a ser adicionado, cujo efeito de proteção contra o fenômeno de recorte da proteína de função dupla durante a cultura de célula foi identificado no Exemplo 1, foi examinado.

[057]Especificamente, a cultura foi conduzida sob a mesma condição que a do Exemplo 1 exceto pelo ajuste do peso molecular médio ponderado (1,6 kDa, 8 kDa ou 200 kDa) e a concentração (100 mg/L, 200 mg/L ou 500 mg/L) do sulfato de dextrano adicionado. Posteriormente, o sobrenadante da cultura foi analisado por SDS-PAGE (4-12% de Bis-Tris, condição de não redução), e o resultado de análise SDS-PAGE e o seu gráfico são mostrados na Figura 5.

[058]Como mostrado na Figura 5, o fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi significantemente reduzido quando o sulfato de dextrano tendo um peso molecular de 200 kDa ou mais foi adicionado ao meio de cultura a uma concentração de 100 a 500 mg/L.

[002]Exemplo 3. Avaliação das condições de cultura para prevenção de decomposição de proteína de função dupla

[059]As condições de cultura para maximizar o efeito de evitar o recorte de proteínas de função dupla por sulfato de dextrano identificadas nos Exemplos 1 e 2 foram examinadas.

[060]Especificamente, a cultura foi conduzida sob a mesma condição que a do Exemplo 1 exceto em que sulfato de dextrano de 500 kDa foi adicionado a concentração de 0 mg/L a 1,000 mg/L. Aqui, o grupo de experimento no qual a temperatura da cultura foi mudada para 32°C no dia 4 de cultura foi incluído (vide Tabela 7 abaixo). Então, o sobrenadante da cultura foi analisado por SDS-PAGE (4-12% de Bis-Tris, condição de não redução), e o resultado de análise SDS-PAGE e o seu gráfico são mostrados na Figura 6.

Tabela 7

Faixa	Concentração do Sulfato de dextrano adicionado	Condição de Cultura
1	0	Cultura a 32 °C por 3 dias após cultura a 37

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		°C por 4 dias
2	Cultura a 37 °C por 7 dias
3	200 mg/L	Cultura a 32 °C por 3 dias após cultura a 37 °C por 4 dias
4	Cultura a 37 °C por 7 dias
5	600 mg/L	Cultura a 32 °C por 3 dias após cultura a 37 °C por 4 dias
6	Cultura a 37°C por 7 dias
7	1,000 mg/L	Cultura a 32 °C por 3 dias após cultura a 37 °C por 4 dias
8	Cultura a 37 °C por 7 dias

[061]Como mostrado na Figura 6, foi observado que o sobrenadante das culturas da cultura com o tratamento de sulfato de dextrano tendo um peso molecular médio ponderado de 500 kDa mostrou fenômeno significantemente reduzido de recorte da proteína de função dupla em comparação ao sobrenadante das culturas da cultura sem o tratamento de sulfato de dextrano. Também, foi observado que quando a temperatura foi mudada durante a cultura, o fenômeno de recorte da proteína de função dupla foi mais efetivamente inibido.

Claims

(1) uma substituição de amino ácidos nas posições 98 a 101 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de EIRP (SEQ ID NO: 53);

1. Método para produzir uma proteína recombinante de função dupla a partir de uma célula hospedeira de mamífero transformada com um vetor de expressão contendo cDNA que codifica a proteína de função dupla ou um derivado da mesma, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de mamífero em um meio de cultura suplementado com sulfato de dextrano, em que a proteína de função dupla compreende uma proteína mutante de fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF21); uma proteína biologicamente ativa, ou um mutante ou fragmento da mesma; e uma região Fc de uma imunoglobulina, em que a proteína mutante FGF21 compreende pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste das mutações (1) a (7) abaixo:
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína biologicamente ativa é uma selecionada a partir do grupo que consiste de insulina, C-peptídeo, leptina, glucagon, gastrina, polipeptídeo de inibição gástrica (GIP), amilina, calcitonina, colecistoquinina, peptideo YY, neuropeptídeo Y, proteína morfogenética óssea 6 (BMP-6), proteína morfogenética óssea 9 (BMP-9), oxintomodulina, oxitocina, peptídeo-1 similar a glucagon (GLP-1), peptídeo-2 similar a glucagon (GLP-2), irisina, proteína 5 contendo domínio de fibronectina tipo III (FNDC5), apelina, adiponectina, C1q e proteína relacionada a fator de necrose tumoral (Família CTRP), resistina, visfatina, omentina, proteína-4 de ligação a retinol (RBP-4), glicentina, angiopoietina, interleucina-22 (IL-22), exendina-4 e hormônio de crescimento.

2/3 (7) uma mutação de 1 a 10 amino ácidos para reduzir imunogenicidade de uma proteína FGF21 do tipo selvagem.

(2) uma substituição de amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de TGLEAV (SEQ ID NO: 54);
3/3 uma etapa para o cultivo secundário do meio de cultivo primário a 28 a 33°C.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de função dupla compreende uma proteína biologicamente ativa, uma região Fc de imunoglobulina e uma proteína mutante FGF21, conectada nessa ordem a partir do N-terminus para o C-terminus.

(3) uma substituição de amino ácidos nas posições 170 a 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com uma sequência de amino ácido de TGLEAN (SEQ ID NO: 55);
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sulfato de dextrano tem um peso molecular médio ponderado de 20 a 5,000 kDa.

(4) uma substituição de um amino ácido na posição 170 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido N;
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de cultura contém o sulfato de dextrano a uma concentração de 0,01 a 10 g/L.

(5) uma substituição de um amino ácido na posição 174 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido N;
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o cultivo compreende:

uma etapa para o cultivo primário da célula hospedeira de mamífero a 34 a 37°C em um meio de cultura suplementado com sulfato de dextrano; e

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(6) uma substituição de um amino ácido na posição 180 a partir do Nterminus de uma proteína FGF21 do tipo selvagem com um amino ácido E, junto com uma ou mais mutações (1) a (5) acima; e

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7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o cultivo primário é conduzido por 24 a 144 horas.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o cultivo secundário é conduzido a 31 a 33°C.