CN103124562A - Fgf21的类似物和衍生物 - Google Patents
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Abstract
可以通过重组方法制备成纤维细胞生长因子21的衍生物，所述衍生物对于治疗糖尿病具有改善的特性。
Description
发明领域
本发明涉及成纤维细胞生长因子21(FGF21)的新的类似物以及具有共价连接的修饰部分的其衍生物。本发明还涉及这些类似物和衍生物，尤其用于治疗糖尿病、血脂异常(dyslipidemia)、肥胖症、心血管疾病、代谢综合症和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)
的药学用途。
本发明的衍生物是持效性的，例如能够维持更长时间期间的低血糖水平，能够增加FGF21的体内半衰期，和/或导致FGF21的更低清除。
发明背景
成纤维细胞生长因子是在发育中的组织和成体组织中表达的多肽。它们参与一些生理机制，包括例如代谢调节和细胞分化。存在超过20种成纤维细胞生长因子的整个家族(FGF家族)。FGF家族的三个成员(包括FGF19、FGF21和FGF23)构成了一个亚家族，起着充当内分泌因子参与代谢调节的作用。
成纤维细胞生长因子21或FGF-21 (本文简称为FGF21)优先在肝脏中表达并已显示出发挥激素样代谢作用。例如，已经表明FGF21能激活小鼠脂肪细胞的葡萄糖摄取，当在转基因小鼠中过量表达时能保护小鼠免于饮食诱导的肥胖症，以及当施用于患糖尿病的啮齿动物时能降低血糖和甘油三酯水平(Kharitonenkov等, J. Clin. Invest.(2005), 115:1627-1635)。在患糖尿病的猴中也显示出FGF21对血糖和甘油三酯的降低效应。在患糖尿病的猴中，FGF21也能够显著地减少LDL和增加HDL
(Kharitonenkov等, Endocrinology (2007),
148(2):774-81)。
此外，在饮食诱导的肥胖小鼠和ob/ob小鼠中，已显示FGF21主要通过能量消耗的增加和肥胖性(adiposity)的减轻来降低体重(Coskun等, Endocrinology (2008), 149(12):6018-6027)。
基于这些结果，已提示FGF21可作为具有治疗糖尿病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病和代谢综合症潜力的药物。代谢综合症包括胰岛素抵抗、血脂异常、内脏肥胖症和高血压等方面，参见例如Grundy等, Circulation (2004), (109):433-438中对代谢综合症的定义。
此外，FGF21可用作具有治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)潜力的药物，参见以上引用的Coskun等,
Endocrinology, 2008；和Xu等, Diabetes (2009), 58(1):250-9，电子文本公开的时间为2008年10月07日，比印刷出版的时间提前)。NAFLD的定义参见Erickson, J.
Lipid Res. (2008)，电子文本公开的时间为2008年12月12日，比印刷出版的时间提前。Yie等研究了FGF21的N-末端和C-末端在受体相互作用和活化中的作用，参见FEBS Letters, 583 (2009),
19-24。
WO
2003/011213 A2公开了应用与FGF21前体氨基酸序列有至少95%同一性的FGF21化合物治疗1型糖尿病、2型糖尿病或肥胖症的方法。WO 2003/061712
A1公开了具有药物特性改进的FGF21突变蛋白，例如A145E。
WO
2005/091944 A2公开了FGF21、FGF21-K59C和FGF21- K122C的聚乙二醇化衍生物。
WO
2005/113606 A2公开了各种具有IgG4免疫球蛋白Fc部分或人血清白蛋白的FGF21融合蛋白。
WO
2006/028595 A2进一步公开了当在酵母中表达时具有O-糖基化能力降低的FGF21突变蛋白，例如L118C-A134C-S167A。
WO
2006/028714 A1公开了当在酵母中表达时具有对蛋白酶降解的敏感性降低的另外的FGF21突变蛋白，例如L153I。
WO
2006/065582 A2再进一步公开了具有脱酰胺作用降低的FGF21突变蛋白，例如des-HPIP-L118C-A134C-N121D。
WO
2006/078463 A2公开了应用天然成熟FGF21或其特定变体治疗心血管疾病的方法。
WO
2008/121563公开了经过修饰以包括非天然编码的氨基酸的FGF21多肽及其衍生物。
发明目的
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一种缺点，或提供有用的替代方案。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，对于糖尿病的治疗，例如与人FGF21相比，该类似物或衍生物具有改善的特性。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，对于肥胖症的治疗，例如与人FGF21相比，该类似物或衍生物具有改善的特性。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，对于非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的治疗，例如与人FGF21相比，该类似物或衍生物具有改善的特性。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，可以相对容易地在大肠杆菌中重组制备该类似物或衍生物。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，该类似物或衍生物可以被保护免于N-末端降解。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，关于3T3-L1细胞中的葡萄糖摄取，例如与人FGF21相比，该类似物或衍生物具有增加的效力。
本发明的另一个方面涉及提供FGF21的类似物或衍生物，例如与Met-FGF-21的平均半衰期时间相比，该类似物或衍生物具有增加的平均半衰期时间，参见下面的实施例9中的测试。
本发明的进一步目的是提供化合物，该化合物可以有效地用于治疗高血压、重大疾病、代谢综合症、癫痫、癌症、肢端肥大症、血脂异常(高TG、高LDL和低HDC)和心血管疾病，例如动脉粥样硬化和高胆固醇血症。
定义
天然人FGF21蛋白的序列可获自UNIPROT数据库，登录号为Q9NSA1。209个氨基酸前体蛋白包括信号肽(氨基酸1-28)和成熟蛋白(氨基酸29-209)。本文中包括作为SEQ ID NO:1 (氨基酸1-181)的成熟蛋白和作为SEQ ID NO:2 (氨基酸1-28)的信号肽。
尤其从US2001012628 A1可得知在成熟蛋白中在本文SEQ
ID NO:1的第146位上具有Pro替代Leu的天然人FGF21同等型(isoform)或等位形式(allelic form) (在已公布的美国申请中SEQ ID NO:2的第174号残基)。
从WO 2003/011213可得知具有较短信号肽(其中本文SEQ ID NO:2的第23位Leu丢失)的另一种同等型(参见WO 2003/011213公布中的SEQ ID NO:2，具有27个氨基酸残基的信号肽)。
因此，天然人FGF21的具体例子是：SEQ ID NO:1，具有取代L146P的SEQ ID NO:1，以及这些序列之前具有上述27或28个氨基酸信号肽的任何序列。天然人FGF21的优选例子是成熟部分，也就是SEQ
ID NO:1及其L146P同等型。
本文在FGF21的上下文中提及的术语“类似物”，即FGF21类似物，是指通过其氨基酸序列的修饰由或者可以由天然FGF21、特别是由或者可以由SEQ
ID NO:1推导出或衍生的多肽。这样的修饰(modification)、修改(amendment)或变化(change)可包括一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。例如，可以在N-末端添加氨基酸。
本文在FGF21的上下文中提及的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括在蛋白质生物合成中被细胞利用的并由遗传密码规定的20种标准α-氨基酸，也就是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(氨基酸残基是从氨基上除去氢和/或从羧基上除去羟基和从任何巯基上除去氢的对应残基)。在本文中，氨基酸优选可以通过基因工程制备的氨基酸。
对于本发明的目的，标准氨基酸的两种公认的密码(单字母和三字母)可互换使用，或者有时把氨基酸名称完整地拼写出来。这些术语当然被认为是完全相等的(例如S = Ser = 丝氨酸)。
本文所用的术语“衍生物”是指已经共价修饰的FGF21的类似物。该术语本身不是限制性的，而是描述性的，因为它意欲突出(mark)构成组分FGF21多肽本身(“类似物”)的变化和侧链与FGF21化合物的共价结合之间的差别，因此所述化合物是“衍生化的”。如果需要，该术语可以用例如化合物等其它通用化学术语替代。
命名法：类似物和衍生物在本文中使用了多肽命名法、有机化学命名法和化学结构式，或它们的混合命名法进行命名，这些命名法可互换使用，不管采用哪种命名法都确实是为了最适合易于对所述技术问题的理解。例如，衍生物名称S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21是指通过{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基在71位Cys中的巯基修饰[71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21。
例如，类似物中的取代可表示为“原始氨基酸-位置-取代的氨基酸”(或表示为“位置-取代的氨基酸”)。可以使用三字母或单字母代码。因此，符号“S71C”或“Ser71Cys”表示，该类似物包含在对应于人FGF21 (SEQ ID
NO:1)中的71位氨基酸的氨基酸位置的丝氨酸被半胱氨酸取代。
多重修饰(例如多个取代)可用逗号分隔开(逗号后用空格)，并且如果需要，再加上括号括住，以便使之更清楚地表示它们属于同一种变体。因此，命名为[-1A, L166F,
M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物是具有-1位的Ala(A)、166位的Phe(F)、168位的Leu(L)、174位的Val(V )和179位的Phe(F)的人FGF21。
延伸可以参照SEQ ID NO:1通过添加位置数(C-末端的连续正数和N-末端的连续负数)进行描述，或者，更简单地说，通过利用其正确序列添加所述延伸的氨基酸至所述化合物上，所述化合物则通常给了一个俗名，例如FGF21，再次为了易于对相关技术要点的理解。因此，[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21也可以命名为[L166F, M168L, G174V, Y179F] Ala-FGF21。
术语“化合物”共同地涵盖类似物和衍生物。
发明概述
简而言之，本发明如下述权利要求和条款所限定。
本发明涉及FGF21的新的类似物和衍生物。在所述衍生物中，修饰基团与FGF21类似物共价连接。本发明还涉及所述类似物和衍生物在药物组合物中的用途，所述药物组合物尤其用于治疗糖尿病、血脂异常(dyslipidemia)、肥胖症、心血管疾病、代谢综合症和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
本发明的衍生物是持效性的，例如能够维持更长时间期间的低血糖水平，能够增加FGF21的体内半衰期，和/或导致FGF21的更低清除。FGF21衍生物保留了令人满意的生物活性并且可以比母体FGF21类似物更低的频率施用。此外，所述衍生物具有降低的脱酰胺的风险。
发明详述
在一个方面，本发明涉及FGF21的类似物。
在一个方面，本发明的类似物和衍生物是[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21，[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 173A和/或des181，任选地具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物包含71位的Cys，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
因此，上述方面涵盖，例如，1)[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物，所述类似物包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 173A和/或des181，2)[-1A, L166F,
M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物，所述类似物具有最多达四个进一步的突变(除了选自71C, 121Q, 173A和/或des181中的任何突变之外)，3)[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物，其中179和/或180氨基酸不存在以及4) 1)，2)和/或3)的任何组合。
上述表述“具有最多达四个进一步的突变”是指除了选自71C, 121Q, 173A和/或des181中的任何突变之外，在FGF-21中替换、插入或缺失最多达四个氨基酸残基。这种替换的例子是146位中Pro的插入。
其中179和/或180氨基酸不存在的FGF-21类似物也可以被命名为des179和/或des 180类似物。
在另一个方面，本发明的类似物和衍生物是[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F]
FGF21，[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F]
FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 173A和/或des181，任选地，具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
在另一个方面，本发明的类似物是[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E]
FGF21和[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V,
Y179F, A180E] FGF21的类似物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q,
171L, 172E, 173A和/或des181。表述“[-1A, L166F,
S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 的类似物，所述类似物还包含以下氨基酸取代 ( 替换 ) 中的一个或多个： 71C, 121Q,
171L, 172E, 173A 和 / 或 des181”的意义是指，与人FGF21
(SEQ ID NO:1)相比，所述类似物包含-1位的Ala
(A)，166位的Phe
(F)，167位的Gly
(G)，168位的Leu
(L)，174位的Val
(V)，179位的Phe
(F)，和180位的Glu
(E)，以及，而且，或71位的Cys
(C)，121位的Gln
(Q)，171位的Leu
(L)，172位的Glu
(E)，173位的Ala
(A)，和/或在181位没有氨基酸残基。
在另一个方面，本发明的类似物是 [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V,
Y179F, A180E] FGF21和[-1A,
S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21的其类似物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 171L, 172E, 173A和/或des181。因此，这些FGF21类似物是[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F,
A180E] FGF21和其FGF21类似物，除了-1位的Ala (A)，71位的Cys (C)，166位的Phe (F)，167位的Gly (G)，168位的Leu (L)，174位的Val (V)，179位的Phe (F)，和180位的Glu (E)，还包含或121位的Gln (Q)，171位的Leu (L)，172位的Glu (E)，173位的Ala (A)，和/或在181位没有氨基酸残基。因此，术语“或 121 位的 Gln (Q) ， 171 位的 Leu (L) ， 172 位的 Glu (E) ， 173 位的 Ala (A) ，和 / 或在 181 位没有氨基酸残基”在本文也表述为“121Q, 171L, 172E, 173A和/或des181”。
因此，本发明的一种类似物是[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F,
A180E] FGF21，其可以另外命名为[S71C, L166F, S167G, M168L, G174V,
Y179F, A180E] Ala-FGF21或[71C, 166F,
167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21。
在另一个方面，本发明涉及FGF21类似物的衍生物。在另一个方面，本发明的衍生物是[-1A,
S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21和[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F,
A180E] FGF21类似物，所述FGF21类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 171L,
172E, 173A和/或des181，具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与所述FGF21类似物的71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。在本文中，通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-的基团被命名为修饰部分，其中n，m，p和q如本文所定义。已经发现，这种修饰部分具有增加体内循环时间的能力。
与FGF21的类似物相比，上述FGF21类似物的衍生物具有延长的作用。
包含FGF21的类似物或衍生物的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。对于注射，载体可以是水，如果需要，还可以补加其它的材料，例如盐水，如生理盐水。也可以使用其它的药学上可接受的物质，例如稀释剂和合适的缓冲剂。如果需要，也可以使用另外的药学上可接受的物质，如乳化剂、助悬剂、溶剂、填充剂、增量剂、佐剂、防腐剂、抗氧剂、着色剂和/或矫味剂。FGF21的类似物或衍生物可以纯化的多肽或其衍生物的形式使用，或者使用合适的药学上可接受的赋形剂进行配制，这都是本领域已知的。所述药物组合物可按本领域已知的任何方式施用，例如注射，例如静脉内(i.v.)注射或皮下(s.c.)注射。
在药物组合物中可包括治疗或预防有效量的FGF21的类似物或衍生物。施用于患者的量取决于是治疗或预防目的，如考虑的适应症、需要治疗的患者的病症、所需的施用途径等。熟练的医务人员可以根据这些因素来调整剂量，修改给药方案，这都是本领域的常规做法。例如，可以每天一次或每周1次或更多次施用本发明的化合物。
本发明的优选特征
为了总结并补充上述说明，本发明的特征和条款如下：
1. [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21，[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 173A和/或des181，任选地具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物包含71位的Cys，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
2.
根据前述条款所述的[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21，[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 173A和/或des181，任选地，具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在。
3.
根据前述条款中任一项所述的[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V,
Y179F] FGF21，[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F]
FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 173A和/或des181，任选地，具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
4.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的[-1A, 71C,
L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21，[-1A,
71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 173A和/或des181，任选地，具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在。
5.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的[-1A, L166F,
S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21，[-1A,
L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q,
171L, 172E, 173A和/或des181，所述衍生物包含71位的Cys，所述衍生物具有通式为 HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-
(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
6.
[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21和[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21的类似物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 171L, 172E, 173A和/或des181。
7.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的[-1A, L166F,
S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21，[-1A,
L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述FGF21的类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 171L, 172E, 173A和/或des181和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物包含71位的Cys，所述衍生物具有通式为 HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-
(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
8.
[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21，[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21的类似物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：71C, 121Q, 171L, 172E, 173A和/或des181和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在。
9.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的[-1A,
S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21或[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F,
A180E] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 171L,
172E, 173A和/或des181，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-
(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
10.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的[-1A,
S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21或[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F,
A180E] FGF21的类似物，所述类似物还包含以下氨基酸取代(替换)中的一个或多个：121Q, 171L,
172E, 173A和/或des181。
11.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，包含下列氨基酸替换中的仅仅一个：121位的Gln (Q)，171位的Leu (L)，172位的Glu (E)，173位的Ala (A)或181位没有氨基酸。
12.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，包含下列氨基酸替换中的仅仅两个：121位的Gln (Q)，171位的Leu (L)，172位的Glu (E)，173位的Ala (A)或181位没有氨基酸。
13.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，包含下列氨基酸替换中的仅仅三个：121位的Gln (Q)，171位的Leu (L)，172位的Glu (E)，173位的Ala (A)或181位没有氨基酸。
14.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，包含下列氨基酸替换中的仅仅四个：121位的Gln (Q)，171位的Leu (L)，172位的Glu (E)，173位的Ala (A)或181位没有氨基酸。
15.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A,
S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21。
16.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, 71C, 121Q,
166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21。
17.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21。
18.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21。
19.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21。
20.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21。
21.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21。
22.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21。
23.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, 121Q,
166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF-21。
24.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, 71C, 121Q,
166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] FGF-21。
25.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, 71C, 121Q,
166F, 168L, 173A, 174V, 179F] FGF-21。
26.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21。
27.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, 71C, 121Q,
166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21。
28.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，所述类似物是[-1A, S71C,
L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C,
L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G,
M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A,
S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E]
FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181]
FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21;
[-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F,
A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L,
S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L,
172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF-21; [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G,
168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] FGF-21, [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L,
173A, 174V, 179F] FGF-21或[-1A, 71C, 121Q,
166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21。
29.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其具有条款1中提到的通式的基团，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
30.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为14。
31.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为16。
32.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为18。
33.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为14，16或18。
34.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中m为2。
35.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中p为2。
36.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为2。
37.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为3。
38.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为4。
39.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为14，m，p和q各自为2。
40.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为16，m，p和q各自为2。
41.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为18，m，p和q各自为2。
42.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的衍生物，其中所述母体FGF21类似物是[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F,
A180E] FGF21。
43.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的类似物，其中所述母体FGF21类似物是[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E,
des181] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E]
FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F,
A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E,
Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L,
G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L,
G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L,
S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q,
L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A,
121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF-21;
[-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] FGF-21,
[-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] FGF-21或[-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
FGF21。
44.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项的衍生物，其中所述母体FGF21类似物是[-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A,
174V, 179F, 180E, des181] FGF21。
45.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
179F, 180E, des181] Ala-FGF21。
46.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
179F, 180E, des181] Ala-FGF21。
47.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
179F, 180E] Ala-FGF21。
48.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
des179-181] Ala-FGF21。
49.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
Ala-FGF21。
50.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21。
51.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F,
180E, des181] Ala-FGF21。
52.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21。
53.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
Ala-FGF21。
54.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A,
174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21。
55.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
FGF21。
56.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其是S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
179F, 180E] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V,
des179-181] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21;
S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 166F,
167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21;
S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 166F,
167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A,
174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21或S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
FGF21。
57.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的类似物或衍生物，相对于Met-FGF21的效力，其效力为至少1%，优选至少5%、更优选至少10%，或最优选至少20%，其中所述效力是通过测量3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取测定的。
58.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的类似物或衍生物，相对于Met-FGF21的效力，其效力为至少30%，优选至少40%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%，或最优选至少70%。
59.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的类似物或衍生物，相对于Met-FGF21的效力，其效力至少为(i)至少80%、优选至少90%、更优选至少100%、甚至更优选至少110%，或最优选至少120%。
60.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的类似物或衍生物，相对于Met-FGF21的效力，其效力为至少100%，优选至少120%、更优选至少140%、甚至更优选至少160%，或最优选至少180%。
61.
在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的类似物或衍生物，相对于Met-FGF21的效力，其效力为至少200%，优选至少250%、更优选至少300%、甚至更优选至少350%，或最优选至少400%。
62.
根据前述条款中任一项所述的化合物，其是在本说明书中如在特定实施例中，尤其是实施例1及如下等等中任一个中具体提到的化合物中的任一个。
63.
根据前述条款中任一项所述的化合物，其用于作为药物使用或用于在药物中使用。
64.
根据前述条款中任一项所述的化合物，其用于治疗或预防糖尿病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合症和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
65.
根据前述条款中任一项所述的化合物在制备用于治疗或预防糖尿病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合症和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的药物中的用途。
66.
根据前述条款中任一项所述的化合物在制备用于治疗糖尿病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合症和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的药物组合物中的用途。
67.
治疗或预防糖尿病、血脂异常、肥胖症、心血管疾病、代谢综合症和/或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据前述条款中任一项所述的化合物施用于需要其的受试者。
68.
本文所述的任何新的特征或特征的组合，尤其是在条款或在权利要求中所述的特征。
组合本文所述的一个或多个条款和实施方案，还有任选的下面的一项或多项权利要求，导致进一步的实施方案，本发明涉及所述条款、实施方案和权利要求的所有可能的组合。在本文的一些条款和权利要求中，提到了：所述权利要求或条款分别在最大可能的程度是根据上述条款或权利要求中任一项。本领域技术人员可以决定这在何种程度上是可能的。因此，这种条款和权利要求可能仅仅是根据上述条款和权利要求中的一些，即使没有明确规定。术语“上述条款或权利要求中任一项”涵盖了任何符合逻辑数量的上述分别的条款和权利要求，例如一项、两项、三项或四项那些上述分别的条款和权利要求。
以示例而非限制地提供下列实施例。
缩写
下列缩写在下文中按字母顺序使用：BG为血糖，BW为体重，DCM为二氯甲烷，DIC为二异丙基碳二亚胺，DIPEA为二异丙基乙胺，DPBS为Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液，DVB为二乙烯基苯，EDAC为(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐，Fmoc为9H-芴-9-基甲氧基羰基，HEPES为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，HOAt为1-羟基-7-氮杂苯并三唑，HOBt为1-羟基苯并三唑，HPβCD为羟丙基β环糊精，HPLC为高效液相色谱，IBMX为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Inp为异哌啶酸，IPTG为异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷检查，LCMS为液相色谱法质谱法联用，MALDI-TOF MS为基质辅助激光解吸/电离—飞行时间质谱法，MeOH为甲醇，NanoES-MS为纳米电喷雾串联质谱法，NMP为1-甲基-吡咯烷-2-酮，OEG为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，OtBu为叔丁酯，PBS为磷酸缓冲盐溶液，RT为室温，TFA为三氟乙酸，TG为甘油三酯，THF为四氢呋喃，TIPS为三异丙基硅烷，Tris为三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇，Trx为凝血酸，TSTU为四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲，和UPLC为超高效(Ultra
Performance)液相色谱法。
通用方法
LCMS
方法
1
(LCMS1)
使用Agilent Technologies LC/MSD TOF (G1969A)质谱仪来鉴定自Agilent 1200系列HPLC系统洗脱之后样品的质量。用Agilent的蛋白质验证软件来计算出蛋白质谱图的解卷积(deconvolution)。
洗脱剂：
A：水中0.1%三氟乙酸
B：乙腈中0.1%三氟乙酸
柱：Zorbax 5u, 300SB-C3, 4.8x50mm
梯度：25% - 95%乙腈，历经15
min。
LCMS
方法
2 (LCMS2)
使用Perkin Elmer Sciex API 3000质谱仪来鉴定自Perkin Elmer系列200
HPLC系统洗脱之后样品的质量。
洗脱剂：
A：水中0.05%三氟乙酸
B：乙腈中0.05%三氟乙酸
柱：Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 µm
梯度：5% - 90%乙腈，历经7.5
min，流速1.5ml/min。
LCMS
方法
3 (LCMS3)
使用Waters Micromass ZQ质谱仪来鉴定自Waters Alliance HT HPLC系统洗脱之后样品的质量。
洗脱剂：
A：水中0.1%三氟乙酸
B：乙腈中0.1%三氟乙酸
柱：Phenomenex, Kinetex C18 50 X 4.60 mm id
2.6 µm, 100AA
梯度：10% - 90% B，历经7.5 min，流速1.0 ml/min。
实施例1：FGF21的克隆和表达
人FGF21的DNA和氨基酸序列已经公开，参见例如Nishimura等, Biochim.
Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000)。序列也可得自公共数据库，登录号分别为EMBL:AB021975和UNIPROT:Q9NSA1。
合成了具有供分泌用的28个氨基酸信号肽的天然多肽：
在所附序列表中包括了信号肽(以上用斜体显示)，称作SEQ ID NO:2。在序列表中包括了由余下的181个氨基酸组成的成熟FGF21多肽，称作SEQ ID NO:1。
将成熟FGF21多肽克隆到大肠杆菌中并表达为胞内蛋白，该胞内蛋白没有信号肽，但具有添加的N-端甲硫氨酸或N-端Met-Ala，该N-端Met-Ala在大肠杆菌中加工导致N-端Ala (-1Ala)。更具体地说，将550 bp编码区(包括位于3’-端的ATG密码子(对于Met)，以及分别位于3’-端和5’-端的Nde1和BamH1限制位点)插入到处于噬菌体T7启动子的控制之下的Nde1-BamH1中的表达载体pET 11c中，然后转化到大肠杆菌B BL21(DE3)。让细胞在LB amp 100 ug/mL中生长至OD450为0.5，在37℃用0.3 mM IPTG诱导表达4小时。通过超声处理制得细胞的粗提取物用于对FGF21表达进行分析。
考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE显示主要在可溶性上清液部分(supernatant fraction)中鉴定的而在可溶性沉淀中非常少见的FGF21的成功表达。尽管如此表达的FGF21 (Met-FGF21) (化合物A)的分子量(MW)计算值为19.5 kD，但是它在凝胶上是作为25 kD蛋白迁移的，这很可能是由于高含量的脯氨酸延迟了蛋白质的移动所致。
实施例2：FGF21类似物的克隆和表达
如本领域已知地制备下列特定的FGF21类似物并如实施例1中一般描述的方法在大肠杆菌中表达：
可以表达并在酿酒酵母中以对于该生物体合适并且本身已知的方式制备相同的FGF21类似物。
实施例3：FGF21类似物的纯化
可以如下或使用相似技术进一步纯化实施例1-2中所述的FGF21类似物：
对大肠杆菌在10 mM磷酸钾缓冲液(pH
7.5)中的浆液(20% w/v)进行超声处理(开/关间隔3秒，在冰上，持续5分钟)。通过离心(10,000 x g, 持续30分钟)使多肽沉淀，通过在50 mM Tris pH
8.0中超声处理使它重新溶解，再通过离心(10,000 x g, 持续30分钟)去除碎片。按照Principles and Practice Series:Springer Advanced Texts in
Chemistry Scopes, Robert K. 第3版, 1994. 蛋白质纯化小节中所述的通用方法，使用Q Sepharose Fast Flow树脂(GE
Healthcare)，所得上清液中的多肽通过阴离子交换色谱法(50 mM Tris pH
8.0, 50-250 mM NaCl)纯化。在一些情况下，使用经50 mM Tris pH
8.0和200 mM NaCl操作的HiLoad 26/60 Superdex pg 75柱(GE
Healthcare)，通过大小排阻色谱法作进一步纯化。对于保存，将多肽转移至DPBS并冷冻保存。
类似物编号11：[-1A, S71C,
N121Q, L166F, M168L, Q173A, G174V, Y179F] FGF21
LCMS1：理论质量：19495.03；实测值：19500.40。
实施例4：可用于修饰FGF21类似物的71位的游离Cys的试剂的制备
17-{(S)-1-
羧基
-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-
碘乙酰基氨基
)
乙基氨基甲酰基
]
甲氧基
}-
乙氧基
)
乙基氨基甲酰基
]
甲氧基
}
乙氧基
)
乙基氨基甲酰基
]
丙基氨基甲酰基
}
十七烷酸的制备
步骤1：17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-氨基乙基氨基甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)甲氧基]-乙氧基}乙基氨基甲酰基)-1-羧基丙基氨基甲酰基]十七烷酸。
向乙醇(10 ml)和乙二胺(1 ml)的溶液中加入17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]-乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸(500 mg，如以前在WO2009/083549中所述制备)。在室温下搅拌过夜之后，混合物于40°C真空浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化(10-65%乙腈, 0.1% TFA, 20
mL/min, C18, 30mmx250mm, 110Å)。产量332 mg (70%)。
LCMS：理论质量：776.0。实测值：776.6 (M+1)。
步骤2：17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰基氨基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸
向碘乙酸(92 mg)的乙腈(1
ml)溶液中加入TSTU (142 mg)和DIPEA (0.085 ml)。于室温下搅拌60分钟之后，加入17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-氨基乙基-氨基甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨基甲酰基)-1-羧基丙基氨基甲酰基]十七烷酸(0.320 g)在Na2CO3 (12 ml)中的溶液。在搅拌120分钟之后，用1N HCl把混合物的pH调到1。滤出沉淀物，用水洗涤后真空干燥。产量350 mg (90%)。
LCMS3：理论质量：943.9，实测值：944.6 (M+1)。
下列试剂可以用于FGF类似物的修饰中，并且它们可以使用类似的方法制备：
实施例5：在71Cys上具有修饰基团的FGF21化合物的衍生化
FGF21类似物的71Cys衍生物的制备
衍生物编号
102. (-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L,
173A, 174V, 179F) FGF21
衍生物
S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-
羧基
-4-(17-
羧基十七烷酰基氨基
)
丁酰基氨基
]-
乙氧基
}
乙氧基
)
乙酰基氨基
]
乙氧基
}
乙氧基
)
乙酰基氨基
]
乙基氨基甲酰基
}
甲基
) [71C, 121Q, 166F, 168L, 73A, 174V, 179F] Ala-FGF21
的制备
如实施例2和3中通常所述的方法制备的(-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F) FGF21类似物11中的71位Cys残基用如上所述制备的下列试剂在71位的巯基上进行修饰：
将17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘乙酰基氨基)乙基-氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸(4.05 mg 0.0035 mmol)加入20 mM
Tris和0.5M NaCl pH 8.28中的[71C, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F]
Ala-FGF21 (17 mg, 0.00087 mmol)中。3h后，加入MiliQ水将导电性降低至8.0 mS / cm。在monoQ 10/100柱上用阴离子交换纯化混合物(使用A-缓冲液：20 mM TRIS, pH
7.5；B-缓冲液：20 mM
TRIS, 500 mM NaCl, pH 7.5，流速0.5 ml，梯度：0-100% B，历经60CV)。用HiPrep 26/10脱盐柱把收集的部分缓冲液交换成磷酸盐缓冲液。收集洗脱液并过滤通过Millex
GV无菌0.22 um。产量:4.65
mg。
MS-TOF：理论质量：20311.03，实测值：20311.44。
在下表中，通过指出特定的FGF21类似物并指出特定的修饰试剂而显示本发明的一些特定的FGF21衍生物。在此表中，通过衍生物编号标识本发明的所有这些化合物。可以以上述类似的方式制备本发明的所有这些化合物。在此表中，通过上面实施例2中的表格中指出的“类似物编号”标识修饰部分共价连接的任何特定的FGF21类似物。而且，在此表中，通过上面实施例4中的表格中指出的“修饰试剂编号”标识用于修饰特定的FGF21类似物的任何试剂。在下表中显示的所有衍生物中，修饰试剂与FGF21类似物中71位的Cys中存在的巯基反应。
例如，可以通过类似物11(-1A, S71C, 121Q, L166F, M168L, Q173A,
G174V, Y179F)-FGF21与17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[4-(2-碘乙酰基氨基)丁基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸一起反应，使得71位的半胱氨酸的游离硫醇变得被修饰部分III({4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丁基氨基甲酰基}甲基)修饰，因此形成S-71-{4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丁基氨基甲酰基}甲基 [S71C,121Q, L166F, M168L, G174V, Y179F] Ala-FGF21，而制备衍生物102。
在本发明的具有上面衍生物编号1-120的化合物中，在下表中用与对应的修饰试剂所用的相同的“修饰试剂编号”指明与71Cys中的巯基的硫原子共价连接的修饰试剂。
| 修饰试剂编号 | 修饰部分 |
| I | {2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基 |
| II | {2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基 |
| III | {2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基 |
| IV | {2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基 |
| V | {3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丙基氨基甲酰基}甲基 |
| VI | {3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丙基氨基甲酰基}甲基 |
| VII | {3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丙基氨基甲酰基}甲基 |
| VIII | {3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丙基氨基甲酰基}甲基 |
| IX | {4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丁基氨基甲酰基}甲基 |
| X | {4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(15-羧基十五酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丁基氨基甲酰基}甲基 |
| XI | {4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丁基氨基甲酰基}甲基 |
| XII | {4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基十九酰基氨基)丁酰基氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]丁基氨基甲酰基}甲基 |
实施例6：效力测定 - 3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取
下列试验用来测定本发明的FGF21化合物的生物活性或效力。
将小鼠3T3-L1成纤维细胞(例如可获自ATCC, 目录号CL-173)维持在基础培养基(含10% 胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的DMEM (4500 mg/l葡萄糖))中。细胞不允许达到完全汇合，而应该在达到约60%汇合(通过目视检查)之前传代(转移至新的小瓶)。
对于葡萄糖摄取试验，将细胞按80,000细胞/孔接种于24孔板或者按20,000细胞/孔接种于96孔板中进行平板培养，当细胞达到汇合(高密度，希望形成的分化脂肪细胞)，将培养基从基础培养基更换为含曲格列酮、IBMX、地塞米松(商业上可获自例如Sigma)和人胰岛素(商业上可获自例如Novo Nordisk A/S)的基础培养基。
所述细胞在分化开始后7-14天，优选7-10天予以使用。所述细胞在基础培养基中用逐渐增加浓度(0-300 nM)的本发明FGF21多肽或衍生物刺激20小时。在加入3H-脱氧葡萄糖(下文称为：示踪剂)之前，细胞用温(约37℃)的测定缓冲液(PBS加上1 mM MgCl2和2 mM
CaCl2)、HEPES和0.1%人血清白蛋白)洗涤后，将细胞与所述示踪剂一起孵育1小时。这一孵育过程通过在冰冷的测定缓冲液中洗涤两次而终止。用Triton
X-100使细胞裂解，把裂解物转移到96孔板，加入microscint-40
(商业上可获自例如Perkin Elmer)后，用TOP-计数器(例如Packard top-counter，得自Perkin
Elmer)对示踪剂的量进行计数。计算出所述多肽的EC50。在下表1中显示的结果表示本发明的FGF21化合物相对于Met-FGF21的EC50
(效力)。
表
1
：
FGF21
化合物的效力
从表1的结果可以看出，通常，与Met-FGF21的效力相比，本发明的FGF21化合物具有改善的效力。
实施例7：HEK293/β-klotho Erk 磷酸化测定
在用人β-Klotho稳定转染的HEK293细胞中进行了Erk磷酸化测定。将HEK293T/b-klotho稳定细胞按30000细胞/孔接种到96孔板上。2天后，加入新鲜培养基，过2小时后，再加入FGF21蛋白。将板孵育12分钟。使用AlphaScreen
SureFire Phospho-ERK1/2测定试剂盒(Perkin Elmer,
Waltham, MA)，按照生产商的说明书评价了总的ERK磷酸化，使用带有AlphaScreen
HTS Turbo option的EnVision多标记微量培养板读出仪(EnVision Multilabel Microplate Reader) 2103型(Perkin Elmer)进行信号检测。数据用平均值+/-
S.E.M表示。根据4-参数逻辑非线性回归分析，使用GraphPad
Prism version 5.02确定EC50值。参考文献：Yie, J.等:FGF21 N- and
C-termini play different roles in receptor interaction and activation (在受体相互作用和活化中FGF21 N-端和C-端起不同的作用), FEBS Letters 583 (2009) 19-24；和Micanovic R.等:Different
roles of N- and C-termini in the functional activity of FGF21 (FGF21功能活性中N-端和C-端的不同作用). J. Cell. Physiol. 2009年5月; 219(2):227-34。
表2：ERK
对于[-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181]
FGF21，Erk值为0.97。例如，可以将上述修饰部分编号III{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙基氨基甲酰基}甲基与来自71Cys中的巯基的硫原子共价连接而衍生化这种类似物。
实施例8：FGF21化合物的体内试验 - 药效动力学
db/db小鼠是2型糖尿病的小鼠模型。该小鼠缺乏瘦蛋白受体，并且它们以高血糖症、胰岛素抵抗、贪食症和肥胖症为特征。
用雄性db/db小鼠(9-10周龄)来测量对下列FGF21类似物和衍生物对血糖和体量的影响。
每天一次皮下(s.c.) 0.1 ml/kg施用50 mM磷酸盐, 145 mM NaCl, 0.05 % Tween-80, pH=7.4 (2 ml/kg)中的化合物，持续7天(n=7-9)。每天一次用50 mM磷酸盐, 145 mM NaCl,
0.05 % Tween-80, pH=7.4 (2 ml/kg)皮下(s.c.)处理各自的媒介处理的组(对照)，持续7天(n=8-9)。给药前以及7天处理后再次，测量体重。在给药前以及第7天给药后2小时再次，测量未禁食性血糖。根据葡萄糖氧化酶方法，使用葡萄糖分析仪(Biosen
5040)测量血糖。结果示于下面的表1中。
表3：△血糖和△体重中与媒介的差异(第1-7天)
# BID给药
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 比较化合物与各自的媒介的△值的Student
t-检验，n=7-9。
表3中的结果显示，本发明的FGF21衍生物在体内具有有效地降低体重和非禁食性/禁食性血糖的生物学活性。
实施例9：FGF21化合物的体内试验 - 药代动力学
小种猪
可以在正常的雄性Göttingen小种猪(n=34，12-15月龄，25 kg)中测试Met-FGF21的药代动力学分布。监测待检测的化合物的血浆浓度，持续14天。Met-FGF21以0.1 mg/kg (约5 nmol/kg)的单一静脉内剂量给药。
已经确定比较化合物Met-FGF21的平均半衰期(T½)为10.8小时，标准偏差为2.7小时。
在正常的雄性Göttingen小种猪，n=34（12-15月龄，25 kg)中测试本发明的FGF21化合物的药代动力学分布。监测血浆浓度，持续19天。化合物以0.05 mg/kg (约2.5
nmol/kg)的单一静脉内剂量给药。
确定待检测的化合物的平均半衰期(T½)。
可以使用成纤维细胞生长因子-21人ELISA (可得自BioVendor, 目录号RD191108200R)测定FGF21化合物的血浆水平。基于PC的软件，来自Pharsight Corportion, Cary N.C的WinNonLin版本5.2可用于药代动力学计算。
该检测将验证本发明的FGF21衍生物的持效性效果。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过援引被完整地并入，其程度如同每份参考文献被单独且明确地指明通过援引并入并且在本文中完整地记载(法律允许的最大程度)。
在本文中专利文件的引用并并入仅仅是为了方便，并不反映专利文件的有效性、可专利性和/或可执行性的任何观点。在本文中引用参考文献是不承认它们构成现有技术。
本文使用的所有的标题和副标题仅仅为了方便，不应当被解释为以任何方式限制本发明。
本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“如”)的使用，除非另有要求，仅仅为了更好地阐明本发明，并不构成对本发明的范围的限制。说明书中任何语言都不应当被解释为指明任何非要求保护的对于本发明的实施所必需的元素。
本文中，词语“包括/包含(comprise)”被广义地解释，是指“包括(include)”、“包含(contain)”或“包含(comprehend)”(参见，EPO指南C, III, 4.13)。
本发明包括如适用法律所允许的随附的权利要求和条款所述主题的所有的修改和等同物。
Claims (15)
1.[-1A,
L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21，[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代（替换）中的一个或多个：71C, 121Q, 173A和/或des181，任选地，具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物包含71位的Cys，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
2.根据前述权利要求所述的[-1A, 71C, L166F, M168L,
G174V, Y179F] FGF21，[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21的类似物以及这种类似物的衍生物，所述类似物任选地包含以下氨基酸取代（替换）中的一个或多个：121Q, 173A和/或des181，任选地，具有最多达四个进一步的突变和/或，任选地，179和/或180氨基酸不存在，所述衍生物具有通式为HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修饰部分)的基团，其中n是10-20范围内的整数，m是1-3范围内的整数，p是1-3范围内的整数，q是2-4范围内的整数，所述基团与71位的半胱氨酸残基中存在的巯基中的硫原子共价连接。
3.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为14。
4.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为16。
5.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中n为18。
6.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为2。
7.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为3。
8.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为3。
9.在最大可能范围内根据前述条款中任一项所述的衍生物，其中q为4。
10.如本文所述的新的方法。
11.在本文，例如，在上述条款中任一项中所述的新的用途。
12.在本文，例如，在上述条款中任一项中所述的新的治疗方法。
13.在上述实施例中任一个，例如在实施例1及以下等等中所述的产物。
14.在上述实施例中任一个，例如在实施例1中所述的方法。
15.本文所述的任何新的特征或特征的组合。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C04 | Withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20130529 |