JP6050927B2

JP6050927B2 - 高シアル酸含量を有する組換えビタミンｋ依存性タンパク質およびその調製方法

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Publication number: JP6050927B2
Application number: JP2010506563A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．グリフィス，マイケル; エヌ．ドロハン，ウィリアム
Original assignee: シーエヌジェイホールディングス，インコーポレイテッド
Priority date: 2007-04-26
Filing date: 2008-04-28
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2028-04-28
Also published as: JP6223319B2; AU2008245524A1; JP2015052016A; CA2683423A1; CA2683423C; US20230272360A1; EP2139499A4; CA3090908A1; EP2517714A1; US20100081187A1; WO2008134665A8; EP2139499A1; US20160244738A1; WO2008134665A1; JP2010525085A

Description

＜関連出願＞
本出願は２００７年５月１０日に提出した米国仮出願第６０／９１７，２７１号および２００７年４月２６日に提出した米国仮出願第６０／９１４，２８１号への優先権を主張する。両出願は参照によりここに取り込まれる。

本発明の実施形態は、増大した生物学的利用能を有する組換え第ＩＸ因子および変異体ならびにその他のビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質および変異体の産生に関する。これらのＶＫＤタンパク質は高シアル酸含量を特徴とする。

実験動物モデルシステムおよびヒトにおける静脈内ボーラス投与後に、組換え第ＩＸ因子（ｒ第ＩＸ因子、Benefix（登録商標））の薬物動態特性とヒト血漿由来第ＩＸ因子（ｐｄ第ＩＸ因子、Mononine（登録商標））の特性とを十分に比較することはできない。ｒ第ＩＸ因子のあまり好ましくない薬物動態特性により、ｐｄ第ＩＸ因子と同等の凝血促進活性レベルを達成するためには一般に２０〜３０％多量のｒ第ＩＸ因子が必要とされる（White, et al. (April 1998) Seminars in Hematology vol. 35, no. 2 Suppl. 2: 33-38; Roth, et al. (December 15, 2001) Blood vol. 98 (13): 3600-3606）。ｒ第ＩＸ因子とｐｄ第ＩＸ因子の間にはＴｙｒ１５５の硫酸化レベルおよびＳｅｒ１５８のリン酸化レベルを初めとする幾つかの相違があり、これらがｉｎｖｉｖｏにおいて異なる挙動を示す理由について厳密には示されていないが（Bond, et al. (April 1998) Seminars in Hematology vol. 35 no. 2 Suppl 2）、血漿由来と組換えの第ＩＸ因子の間でのＴＹＲ１５５硫酸化の相違による主要な理由は推論されている（BENEFIX（登録商標）、Summary of Basis for Approval, Reference no. 96-1048）。最近本発明者はｒ第ＩＸ因子のＮ−グリカンシアル化のレベルを増大させることにより、実験動物モデルシステムへの静脈内ボーラス投与後の増大した生物学的利用能によって評価される実験製剤の治療効力が、以前に報告された市販のｒ第ＩＸ因子製剤のレベルを超えるレベルを達成するが、例えばＴｙｒ１５５硫酸化のようなその他のタンパク質の構造的特性には有意に影響することなく、益々改善される可能性を見出した。

Benefix（登録商標）とMononine（登録商標）の間の主要な相違の一つは、ＡＳＮ１５７およびＡＳＮ１６７に生じるＮ−結合グリカンに関連するオリゴ糖の構造である。Mononine（登録商標）はほとんど完全にトリ−およびテトラ−触角状オリゴ糖から成るＮ−グリカンを含むが、Benefix（登録商標）は主にビ−およびトリ−触角状オリゴ糖構造と共に少量のテトラ−触角状構造を有する。これらの相違はBeneFixが、翻訳後のタンパク質グリコシル化における既知の相違を有する非ヒト哺乳類細胞内で合成される限り意外なことではない。本発明の時点では、ｒ第ＩＸ因子グリコシル化と生物学的利用能の間の関連性について知られている相関はなかった。しかしながらMononineに比較して、静脈内投与されたBenefix（登録商標）の約７０％のみが患者から回収されることは、低い治療効力および自発性出血を制御するための比較的多量の投与計画の必要性をもたらすことは明らかであった。

本発明者は、組織培養により産生されたｒ第ＩＸ因子のＮ−グリカン修飾の範囲および型と、マウス、ラットおよび最終的にはイヌにおけるｒ第ＩＸ因子の回収率との関連性を示すことを決定した。もしも改善された回収率または増大した循環半減期を導くことので
きるＮ−グリカン構造および組成の変化を同定できれば、その結果として臨床的および商業的に優れたｒ第ＩＸ因子製品を合成できるであろう。明らかに、もしも動物におけるよりよい生物学的利用能および／または比較的長い循環半減期を示すｒ第ＩＸ因子分子が合成できれば、この分子を患者へ投与量あたりより少なく投与しなければならないほどに、治療効力はより大きくなる可能性がある。従って、血友病患者の治療のための臨床応用はより安全（投与にはより少ない製品が必要とされる）かつ安価（より多くの投与された製品が回収される）になるであろう。

本発明は組織培養システムにおける組換えＤＮＡ技術による第ＩＸ因子の産生に関わる。本発明の実施形態は、自発性ならびに外傷性出血発症の治療および／または予防のために血友病患者の血液循環中に供給される、ヒト血漿由来物質と同様の物質を産生するｒ第ＩＸ因子の製造方法に関する。解決されるべき問題は、（１）可能な限り多くのｒ第ＩＸ因子物質の初期の回収率および、（２）投与後の患者の血流における、臨床的に有意な濃度でのｒ第ＩＸ因子の可能な限り長時間の循環である。これらの問題は、血液凝固疾患の治療または予防のために使用される、第ＶＩＩａ因子およびプロテインＣのようなその他の組換えタンパク質にも共通である。本発明は生物学的に活性のあるタンパク質の合成のため、これらの組換えタンパク質ならびにビタミンＫ要求特性を共有する、すなわちビタミンＫ依存性タンパク質（ＶＫＤ）であるプロトロンビン、第Ｘ因子、およびプロテインＳのようなその他のタンパク質へ、より一般的に応用される。

定義
「薬物動態特性」との語はその通常および慣例の意味を持ち、ＶＫＤタンパク質の吸収、分布、代謝および排泄に言及する。本発明による改善された薬物動態特性を得るため、ＶＫＤタンパク質の吸収、分布、代謝および排泄の１以上が、通常はヒト血漿中に見出される対応するＶＫＤタンパク質である参照ＶＫＤタンパク質に比較して改善される。

「生物学的利用能」の通常および慣例の意味は、生物学的に活性のある薬剤の投与量の、全身性の循環に到達する割合または量である。本発明の実施形態の状況において、「生物学的利用能」との語は通常および慣例の意味を含むが、それに加えてＶＫＤタンパク質の生物学的有効性の範囲をも含む、より広い意味を持つものとして解釈される。第ＩＸ因子の場合には、例えば「生物学的利用能」の一つの測定値は、投与後の循環中に得られるＶＫＤタンパク質の凝血促進活性である。

「翻訳後修飾」は通常および慣例の意味を持ち、かつリーダー配列の除去、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、アスパラギン酸残基のβ−ヒドロキシル化、アスパラギン残基のＮ−結合グリコシル化、セリンおよび／またはスレオニン残基のＯ−結合グリコシル化、チロシン残基の硫酸化、およびセリン残基のリン酸化を含むがこれらに限定されない。

ここで用いられる「生物学的活性」との語は、ヒト血漿由来の標準物質への参照により決定される。第ＩＸ因子についての標準物質はMONONINE(登録商標）（ZLB Behring）である。標準物質の生物学的活性は１００％と解釈される。

「プロセシング因子」との語は、機能的なビタミンＫ依存性タンパク質の形成を促進するいずれのタンパク質、ペプチド、非ペプチド補助因子、基質または核酸を含む広範な語である。このようなプロセシング因子の例は、対の塩基性アミノ酸変換（または切断）酵素（ＰＡＣＥ）、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）、およびビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）を含むがこれらに限定されない。

表１に記載したＱ−セファロースＨＰカラムからの溶出を示す。ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される第ＩＸ因子の回収率と相関する、シアル酸残基を３以上有する組換え第ＩＸ因子タンパク質のＮ−グリコシル化部位のパーセンテージを示す。様々なレベルのＮ−グリカンシアル化（炭水化物分析の標準化された方法を用いて測定した）を含む組換え第ＩＸ因子の複数のロットを、標準量（０．２ｍｇ／ｋｇ）において正常ラットに静脈内投与した。投与後に定期間隔で採取した血漿サンプルを、第ＩＸ因子タンパク質についてＥＬＩＳＡにより分析した。

本発明の実施形態は、血友病の治療のための組換えＶＫＤタンパク質特に第ＩＸ因子タンパク質を、改善された生物学的利用能および生物活性を伴う高収率において産生することへ方向付けられる。その他のＶＫＤタンパク質は第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、プロテインＣまたはプロテインＳを含む。さらに好ましくは、ビタミンＫ依存性タンパク質は第ＩＸ因子である。

第ＩＸ因子は血漿由来製品（Mononine（登録商標））および組換えタンパク質（Benefix（登録商標））の両方として市販されている。Mononine（登録商標）は、精製手段経由で運ばれる細菌およびウィルス（例えばＨＩＶ、肝炎）による汚染を通じた疾病伝達の可能性という不都合を有する。組換えタンパク質（Benefix（登録商標））の使用はこれらの問題を回避する。しかしながら、Benefix（登録商標）の生物学的利用能はMononine（登録商標）に比べて乏しい。単離タンパク質の高い生物活性を持つ組換えタンパク質の利点を供給することが目標である。

第ＩＸ因子タンパク質はｉｎｖｉｖｏにおいて、４６アミノ酸のプレプロリーダー配列の切断および除去、最初の１２グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、Ａｓｐ６４の部分的β−ヒドロキシル化、位置１５７および１６７のアスパラギンにおけるＮ−結合グリコシル化、セリンおよびスレオニンにおけるＯ−結合グリコシル化、およびセリン１５８におけるリン酸化を含む広範な翻訳後修飾を起こす。組換え第ＩＸ因子の産生のために使用する細胞株はこれらの翻訳後修飾の全てを行なう必要はなく、これらの修飾の全て、および組換えタンパク質の十分な収率も供給するための条件を最適化することは実際的ではない。本発明者は第ＩＸ因子のＮ−グリコシル化の最適化が、予期しない第ＩＸ因子タンパク質の機能性および生物学的利用能における改善を提供することを見出した。

科学界はこれまでに、ヒト血漿由来分子の構造を反映する第ＩＸ因子分子を組織培養において合成することはできなかった。結果として、市販のｒ第ＩＸ因子を疾患治療のため血友病患者に投与したときに、血漿由来タンパク質と同じ挙動を示さないのは意外なことではない。ｐｄ第ＩＸ因子と比較した際の第一の問題は、３０％から５０％（Mononine Comparison Study Group, Transfusion 2002, 424:1-8）を超える注入されたｒ第ＩＸ因子が循環中から速やかに除去されることである。この結果は血友病患者に２つの問題をもたらす。第１に、有効な治療用量に必要とされるよりも多くのｒ第ＩＸ因子を受け取る必要があることから、安全性の問題（免疫原性など）を引き起こすより高いタンパク質濃度に曝されることとなる。第２に、ｒ第ＩＸ因子を用いた有効な治療にかかる費用は、静脈内投与後の循環からのｒ第ＩＸ因子の速やかな減少のため、５０％から１００％まで増加する。

本発明の利点は、ｒ第ＩＸ因子の生物学的利用能がｐｄ第ＩＸ因子の生物学的利用能に近いことである。本発明のｒ第ＩＸ因子分子は、血友病Ｂの治療のための臨床的に優れた製品となり得る幾つかの特徴を有するであろう。第１に、それはBenefix(登録商標）に比較して、患者へ曝露される外来性および汚染タンパク質をより少なく必要とする、注入された第ＩＸ因子のより多くの回収を可能にする。これは、血栓症の誘発および阻害抗体の
形成のような潜在性の有害事象状態にある患者にとっては明らかな利点である。第２に、新しいｒ第ＩＸ因子が患者へ投与されたとき、その患者において著しく多量の第ＩＸ因子が長時間循環することとなる。このような状態は、血友病患者の「応需型」または予防的処置のいずれかにおけるより少ない投与を導く。血友病Ｂ患者における止血を制御するためのより少ない投与は、患者にとっての明らかな臨床的利点である。

（１）Benefix(登録商標）よりも優れ、かつ（２）Mononine(登録商標）により近い臨床特性を有するｒ第ＩＸ因子を組織細胞型システムにおいて産生することが本発明の目標である。このような特性を持つｒ第ＩＸ因子は、安全性、有効性および／または費用の理由から、基本的にはBenefix(登録商標）に商業的に取って代わるであろうというのが我々の信念である。

より高度にシアル化された第ＩＸ因子を産生するものを見出すため、培地／発酵条件が選別されてきた。所定の品質の産物を達成するための培地／発酵条件の選別は、当業者に公知であり日常的である。あるいは、より高度にシアル化された第ＩＸ因子が濃縮された製剤は、所望のシアル化を有する第ＩＸ因子種を濃縮するための組み替え産物の精製によって得られる可能性がある。好ましい実施形態によれば、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも６０％含む第ＩＸ因子が得られる。さらに好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも６２％含む第ＩＸ因子が得られる。さらになお好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも６５％含む第ＩＸ因子が得られる。さらになお好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも７０％含む第ＩＸ因子が得られる。さらになお好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも７５％含む第ＩＸ因子が得られる。さらになお好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも８５％含む第ＩＸ因子が得られる。さらになお好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を少なくとも９５％含む第ＩＸ因子が得られる。最も好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位が３または４のシアル酸を１００％含む第ＩＸ因子が得られる。

好ましい実施形態によれば、組換え第ＩＸ因子タンパク質はここに記述される１以上の方法工程により産生される。さらに好ましくは、記述される方法により産生される組換え第ＩＸ因子タンパク質は医薬組成物に含まれる。幾つかの好ましい実施形態は、ここに記述される方法により産生される組換え第ＩＸ因子タンパク質を含むキットへ方向付けられる。好ましくは組換え第ＩＸ因子タンパク質は、有効量の該組換え第ＩＸ因子タンパク質を患者へ必要性に応じて投与することにより血友病を治療する方法において使用される。

遺伝的に操作された細胞を作り出すために多くの発現ベクターが使用できる。幾つかの発現ベクターは、選択された高発現細胞を支持する多様な条件の下でトランスフェクトされた細胞を増幅した後、大量の組換えタンパク質を発現するように設計されている。幾つかの発現ベクターは、選択の圧力の下での増幅の必要なしに、大量の組換えタンパク質を発現するように設計されている。本発明はいずれの特定の発現ベクターの使用にも依存しない。

所定のビタミンＫ依存性タンパク質を大量に産生する、遺伝的に操作された細胞を作り出すため、タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを細胞にトランスフェクトする。ある実施形態によれば標的タンパク質は、所定の細胞システムにおいて起こる標的タンパク質の適切な翻訳後修飾の原因となる、選択され、共トランスフェクトされた酵素と共に発現する。

ある実施形態によれば、選択された酵素はビタミンＫ依存性タンパク質と共に共トランスフェクトされる。例えば酵素（ＰＡＣＥ）の共発現は、ビタミンＫ依存性タンパク質か
らのプロペプチド領域の除去を促進する。

ある実施形態によれば本発明の方法は、第ＩＸ因子のようなビタミンＫ依存性タンパク質を大量に産生するよう遺伝的に操作され得る細胞の第１の選択に関わる。

該細胞は種々の源から選択されてよいが、そうでなければ核酸、好ましくはビタミンＫ依存性タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトされていても良い細胞である。

トランスフェクトされた細胞のプールから、市販製品の産生に最小限許容される最高レベルから最低レベルまでに及ぶ範囲（標的範囲）を超える量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生するクローンが選択される。標的範囲内の量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンは、単一プール、あるいはクローンを高、中または低レベルの標的範囲内のビタミンＫ依存性タンパク質を産生するクローンの集団に分けた複数のサブプールを得るために併用されてよい。

ある実施形態によれば、ビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾の欠失は、所定のタンパク質のｃＤＮＡを含むさらなる発現ベクターの、細胞クローンへの同時または後の（連続的な）トランスフェクションにより対処されてよい。

ある実施形態によれば、ホスト細胞は最初に１以上のプロセシング因子をコードする遺伝子をトランスフェクトされ、続いてビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクトされてよい。ある実施形態によれば、ホスト細胞は最初にビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクトされ、続いて１以上のプロセシング因子をトランスフェクトされる。ホスト細胞は任意に、先のトランス遺伝子と同じかまたは実質的に同じである、プロセシング因子の遺伝子またはビタミンＫ依存性タンパク質の遺伝子をトランスフェクトされてよい。それぞれの一区切りのトランスフェクションの後、最適レベルのトランス遺伝子を発現するクローンを選択した。

ある好ましい実施形態によれば、このようなタンパク質の一つはビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）の酵素活性を有し得る。ある好ましい実施形態によれば、別のこのような酵素はビタミンＫ依存性ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）の酵素活性を有し得る。ある好ましい実施形態によれば、別のこのような酵素は対のアミノ切断酵素、すなわちＰＡＣＥまたはフューリンの酵素活性を有し得る。ある好ましい実施形態によれば、このような酵素はグリコシル化活性を有し得る。

本発明のある実施形態によれば、標的範囲内のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンのプールは、特定のタンパク質または複数のタンパク質を様々な組み合わせにおいて供給するために引き続きトランスフェクトされる。

本発明の実行は他に表示のない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を用いる。このような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, et al., "Molecular Cloning; A Laboratory
Manual", 2nd ed (1989); "DNA Cloning", Vol. I and II (D. N Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames and S. J. Higgins eds. 1984); "Transcription and Translation" (B. D. Hames and S. J. Higgins eds. 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney ed. 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)のシリーズ、特に Vol. 154 および 155 (各々、Wu and Grossman, および Wu, eds.,);
"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. H. Miller and M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); " Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology", Mayer and Walker, eds. (Academic Press, London, 1987); Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 2nd ed. 1987 (Springer- Verlag, N.Y.); および "Handbook of Experimental Immunology" VoIs I-IV (D. M. Weir および C. C. Blackwell eds 1986)を参照のこと。本背景技術および明細書中に引用された全ての特許、特許出願、および出版物は参照によりここに取り込まれる。

プロペプチドの修飾
ある実施形態によれば、参照によりここに取り込まれる米国特許出願第２００３／０２２０２４７号において考察されているように、天然プロペプチド配列をガンマカルボキシラーゼに対するより低いアフィニティーを有するプロペプチド配列に置き換えることにより、γ−カルボキシル化は増加する。有用なプロペプチド配列は、異種性のビタミンＫ依存性タンパク質の野生型配列またはプロペプチド配列の変化型、あるいはその組み合わせを含む。ビタミンＫ依存性タンパク質中のプロペプチド配列は、タンパク質のガンマカルボキシル化を導く酵素の認識エレメントである。ビタミンＫ依存性タンパク質は、高パーセンテージのガンマカルボキシル化された成分を含まない限り完全に機能的ではない。従って、これらのタンパク質の組換え型を作り出す際には、その完全なガンマカルボキシル化を確保するための機構を導入することが重要である。

幾つかのプロペプチド配列の配列アラインメントを、米国特許出願第２００３／０２２０２４７号の図３に示す。従って、本発明に有用なプロペプチドは図３に示される配列を有するものであり、ここにおいて幾つかの有用なプロペプチドの１８アミノ酸配列が、ガンマカルボキシラーゼに対するこれらのプロペプチドの相対的なアフィニティーと共に示される。低アフィニティーのプロペプチドは、プロトロンビンあるいはプロテインＣにおける−９または−１３アミノ酸のいずれか１を改変することにより作り出されてよい。好ましい改変は、位置−９のＡｒｇまたはＨｉｓ残基の置換、ならびに位置−１３のＰｒｏまたはＳｅｒ残基の置換を含む。その他の好ましいキメラタンパク質は、改変された第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、プロテインＳ、プロテインＣおよびプロトロンビンからなる群より選択されたプロペプチド、あるいは選択されたプロペプチド配列が天然ではない成熟ビタミンＫ依存性タンパク質に結合した、未改変のプロペプチドを含む。

ここで用いられる「完全にガンマカルボキシル化されたタンパク質」との語は、ガンマカルボキシル化されるべきアミノ酸の少なくとも約８０%がカルボキシル化されているタンパク質に関する。好ましくは、ガンマカルボキシル化されるべきアミノ酸の少なくとも約８５%、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、さらになお好ましくは少なくとも約９９％がガンマカルボキシル化されている。

対の塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）
ここで用いられる「ＰＡＣＥ」との語は、対の塩基性アミノ酸変換（または切断）酵素に対する頭字語である。最初にヒト肝細胞株から分離されたＰＡＣＥは、サブチリシン様エンドペプチダーゼ、すなわちポリペプチドの塩基性残基、例えば−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ、または−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−の切断に特異性を示すプロペプチド切断酵素である。ＰＡＣＥはカルシウムイオンによって刺激され、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）によって阻害される。ＰＡＣＥ（またはフューリン）をコードするＤＮＡ配列は、参照によりここに取り込まれる米国特許第５，４６０，９５０号の図１[配列番号１]に示される。ＰＡＣＥと、成熟タンパク質の産生のためにプロセシングを必要とするプロタンパク質との共発現は、成熟タンパク質の高レベルの発現をもたらす。さらに、ＰＡＣＥと、生物学的活性のためにγ−カルボキシル化を必要とするタンパク質との共発現は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における機能的で生物学的に活性のある成熟タ
ンパク質の増加した収率での発現を可能にする。

ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素
ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）は、これを補助因子とする反応の間にビタミンＫがビタミンＫエポキシドに変換されることから、ビタミンＫ依存性タンパク質にとって重要である。ヒト食餌中のビタミンＫの量は限られている。それ故に欠乏を防ぐため、ビタミンＫエポキシドはＶＫＯＲによってビタミンＫへ逆変換されなければならない。ＶＫＯＲ配列は既知であり入手可能である（例えば受入番号ＡＹ５２１６３４、Li, et al. (2004) Nature 427: 541-544を参照のこと）。結果としてＶＫＯＲとの共トランスフェクションは、ビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＣＧ）のようなビタミンＫ依存性酵素の適切な機能のために十分なビタミンＫを供給する。ＶＫＣＧは、ビタミンＫ依存性凝固因子のｇｌａ−ドメインのγ-カルボキシル化を触媒する。

ビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼ
ビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）は、ビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾に関与するＥＲ酵素である。ＶＫＧＣは、ビタミンＫ依存性タンパク質中の複数の残基を修飾するため、プロペプチドの約４０残基中のグルタミン酸にＣＯ₂を取り入れる。３個のカルボキシル化の損失は、ビタミンＫ依存性凝固因子のようなビタミンＫ依存性タンパク質の活性を著しく減少させる。ヒトビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼのｃＤＮＡ配列は、参照によりここに取り込まれる米国特許第５，２６８，２７５号に記載されている。該配列は、米国特許第５，２６８，２７５号の配列番号１５において提供される。

遺伝的操作技術
遺伝的操作による、クローン化された遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換されたホスト細胞、タンパク質およびタンパク質断片の産生は公知である。例えば、Bell et al.への米国特許第４，７６１，３７１号の６列３行から９列６５行まで；Clark et al.への米国特許第４，８７７，７２９号の４列３８行から７列６行まで；Schillingへの米国特許第４，９１２，０３８号の３列２６行から１４列１２行まで；およびWallnerへの米国特許第４，８７９，２２４号の６列８行から８列５９行までを参照のこと。

ベクターは複製可能なＤＮＡコンストラクトである。ここでベクターは、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するため、および／またはビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡを発現するために用いられる。発現ベクターは、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、適切なホスト内でのビタミンＫ依存性タンパク質の発現をもたらすことのできる適切な制御配列に機能的に連結する、複製可能なＤＮＡコンストラクトである。このような制御配列の必要性は、選択されたホストおよび選択された形質転換方法により異なる可能性がある。一般に制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。

増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。必要な全ては、通常は複製開始点により与えられるホスト内での複製能力、および形質転換体の認識を促進する選択遺伝子である。

ベクターはプラスミド、ウィルス（例えばアデノウィルス、サイトメガロウィルス）、ファージ、および組み込み可能なＤＮＡ断片（すなわち組換えによりホストゲノム中へ組み込み可能な断片）を含む。ベクターはホストゲノムとは独立して、またはある場合にはゲノムそのものに組み込まれる可能性により複製および機能する。発現ベクターは、発現される遺伝子に機能的に連結され、かつホスト生物内で機能できるプロモーターおよびＲ
ＮＡ結合部位を含まなければならない。

ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連するとき、機能的に連結または機能的に結合している。例えばプロモーターは、それが配列の転写を制御するとき該配列に機能的に連結しており；あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするために位置するとき、コード配列に機能的に連結する。

形質転換されたホスト細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された１以上のビタミンＫ依存性タンパク質ベクターで形質転換された、または該ベクターをトランスフェクトされた細胞である。

ホスト細胞
適切なホスト細胞は原核生物、酵母、あるいは哺乳類細胞および昆虫細胞のような高等真核細胞を含む。多細胞生物由来の細胞は特に組換えビタミンＫ依存性タンパク質の合成に適したホストであり、哺乳類細胞が特に好ましい。細胞培養によるこのような細胞の増殖は日常的な方法となった（Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)）。有用なホスト細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ならびにＷＩ１３８、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶ、およびＭＤＣＫ細胞株である。このような細胞のための発現ベクターは通常、複製開始点、発現されるビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡの上流に位置し、かつリボソーム結合部位と共にそれと機能的に結合するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位（イントロンを含むゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を（必要であれば）含む。好ましい実施形態によれば、発現はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、参照によりここに取り込まれる米国特許第５，８８８，８０９号の発現システムを用いて行なわれる。

形質転換される脊椎動物細胞において使用される発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は、しばしばウィルス性の源により供給される。例えば、一般に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス２、およびサルウィルス４０（ＳＶ４０）由来である。例えば、米国特許第４，５９９，３０８号を参照のこと。

複製開始点は、例えばＳＶ４０またはその他のウィルス源（例えばポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）由来であってよい外来性の開始点を含むためのベクター構築により供給されてよく、あるいはホスト細胞の染色体複製機構により供給されてよい。ベクターがホスト細胞染色体中に取り込まれた場合は、しばしば後者が十分である。

ウィルス性の複製開始点を含むベクターを使用するよりもむしろ、選択マーカーおよびビタミンＫ依存性タンパク質に対するＤＮＡによる共形質転換法により、哺乳類細胞を形質転換することができる。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。この方法は、参照によりここに取り込まれる米国特許第４，３９９，２１６号にさらに記載されている。

組換え脊椎動物細胞培養におけるビタミンＫ依存性タンパク質合成への適応に適したその他の方法は、M-J. Gething et al., Nature 293, 620 (1981); N. Mantei et al., Nature 281, 40; A. Levinson et al., 欧州特許出願第１１７，０６０Ａ号および第１１７，０５８Ａ号に記載される方法を含む。

Smith et al.への米国特許第４，７４５，０５１号および第４，８７９，２３６号に記載されているように、昆虫細胞（例えば、培養ヨトウガ細胞）のようなホスト細胞およびバキュロウィルス発現ベクター（例えば、オートグラファカリフォルニアＭＮＰＶ、イラ
クサギンウワバＭＮＰＶ、ＲａｃｈｉｐｌｕｓｉａｏｕＭＮＰＶ、またはＧａｌｌｅｒｉａｏｕＭＮＰＶ由来のベクター）のような発現ベクターが、本発明の実施に用いられてよい。一般的にバキュロウィルス発現ベクターは、ポリヘドリン転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位の範囲の位置のポリヘドリン遺伝子中に挿入され、バキュロウィルスポリヘドリンプロモーターによる転写制御下にある、発現される遺伝子を含むバキュロウィルスゲノムを含む。

原核生物ホスト細胞はグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌を含む。高等真核生物細胞は、以下に述べる哺乳類起源の樹立細胞系を含む。代表的なホスト細胞は、Ｅ．ＣｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、Ｅ．ＣｏｌｉＢ、Ｅ．ＣｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、Ｅ．Ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。広範で多様な、適当な原核生物および微生物ベクターが入手可能である。Ｅ．Ｃｏｌｉは典型的にはｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。組換え微生物発現ベクター中で最も一般的に使用されるプロモーターは、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム（Chang et al., Nature 275, 615 (1978); および Goeddel et al., Nature 281 , 544 (1979)）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) および欧州特許出願公開公報第３６，７７６号）およびｔａｃプロモーター（H. De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 (1983)）を含む。プロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列(原核生物ホストの発現のための）は、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡへ機能的に連結する。すなわちそれらはビタミンＫ依存性タンパク質のメッセンジャーＲＮＡのＤＮＡからの転写を促進するように位置する。

酵母培養のような真核微生物もまた、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするベクターにより形質転換され得る。例えば、米国特許第４，７４５，０５７号を参照のこと。出芽酵母は下等な真核微生物ホストのうちで最も一般的に使用されるが、その他の幾つかの系統も一般的に利用できる。酵母ベクターは、２ミクロン酵母プラスミドからの複製開始点、または自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、１以上のビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化配列および転写終結配列、ならびに選択遺伝子を含んでよい。代表的なプラスミドはＹＲｐ７（Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)）である。酵母ベクター中の適切な促進配列は、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al, J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)）またはその他の糖分解酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); および Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)）のプロモーターを含む。酵母での発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、R. Hitzeman et al., 欧州特許出願公開公報第７３，６５７号にさらに記載されている。

本発明のクローン化された遺伝子は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタおよびヒトを含むいずれの起源の種もコードしてよいが、好ましくはヒト起源のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする。ここに開示されたタンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイズ可能な、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡもまた包含される。このような配列のハイブリダイゼーションは緩和されたストリンジェンシーの条件下またはストリンジェントな条件下でも行われてよい（例えば、標準的なｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおける、ここに開示されたビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡに対しての６０℃またはさらには７０℃での０．３ＭＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件。J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)を参照のこと）。

上記のように本発明の好ましい実施形態は、Ｎ−グリコシル化を促進し、かつＮ−末端ｇｌｕ残基のカルボキシル化を任意に含む条件下で組換え細胞を培養することにより、組換えビタミンＫ依存性タンパク質を産生する方法を提供する。この戦略は、ビタミンＫ依存性タンパク質とＶＫＯＲ、ＶＫＧＣおよび／またはＰＡＣＥの単一ホスト細胞内での共発現を含んでよい。一般に該方法は、ビタミンＫ依存性タンパク質および支持タンパク質を発現するホスト細胞を培養すること；およびその後に培養物からタンパク質を回収することを含む。培養はいずれの適切な発酵容器内で、増殖用培地を用い、選択された特定のホスト細胞によるビタミンＫ依存性タンパク質の発現に適した条件下で行うことができる。好ましい実施形態によれば、ビタミンＫ依存性タンパク質は培養液から直接に採取できるか、またはホスト細胞を溶解してそこからビタミンＫ依存性タンパク質を採取できる。好ましい実施形態によれば、ビタミンＫ依存性タンパク質はその後公知の技術に従ってさらに精製できる。

一般的な計画において、本発明に従って産生された組換えタンパク質の純度は、好ましくは該タンパク質を至適活性および安定性へと導くための当業者に公知の適切な純度であろう。例えば、組換えタンパク質が第ＩＸ因子であるとき、該第ＩＸ因子は好ましくは超高純度である。好ましくは組換えタンパク質は、製造、貯蔵および／または使用の間の組換えタンパク質の断片化、活性化および／または分解の原因となる物質を除くため、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび好ましくは免疫アフィニティークロマトグラフィーのような複数のクロマトグラフィー精製工程へ供される。好ましくは精製によって除かれるこのような物質の具体例は、トロンビンおよび第ＩＸａ因子；その他のタンパク質混入物、例えばＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ、ＶＫＯＲ、およびＶＫＧＣのような修飾酵素；組換えタンパク質産生の間に産生細胞から組織培養液中に放出される、ハムスタータンパク質のようなタンパク質；脂質のような非タンパク質混入物；ならびにリポタンパク質のようなタンパク質と非タンパク質の混合物を含む。ビタミンＫ依存性タンパク質の精製手順は当該技術分野において公知である。例えば、参照によりここに取り込まれる米国特許第５，７１４，５８３号を参照のこと。好ましい態様によれば、参照によりここに取り込まれる米国特許第４，９８１，９５２号に記載されているように、分離はカルシウムイオンの存在下で従来のクロマトグラフィーにより行なわれる。カルシウムは一般に、５から５０ｍＭ、好ましくは５から２０ｍＭの範囲の金属塩として存在する。好ましくは、カルシウムは塩化カルシウムの形にあるが、酢酸カルシウムのようなその他のカルシウムの形も用いられてよい。

ある実施形態によれば、ＶＫＤタンパク質製剤はそのグリコシル化様式に基づいてさらに分画される。好ましい態様によれば、シアル化されたモノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−触角状ＶＫＤタンパク質が、好ましくはクロマトグラフィー法により分離される。

第ＩＸ因子ＤＮＡをコードする配列は、その発現のためのベクターおよびホスト細胞と共に、欧州特許出願第３７３０１２号、欧州特許出願第２５１８７４号、ＰＣＴ特許出願第８５０５３７６号、ＰＣＴ特許出願第８５０５１２５号、欧州特許出願第１６２７８２号、およびＰＣＴ特許出願第８４００５６０号に開示されている。その他の凝固因子の遺伝子、例えば第ＩＩ因子（受入番号ＮＭ＿０００５０６）第ＶＩＩ因子（受入番号ＮＭ＿０１９６１６）、および第Ｘ因子（受入番号ＮＭ＿０００５０４）もまた公知であり入手可能である。

実施例１．ｒ第ＩＸ因子製剤のシアル酸の解析
ｒ第ＩＸ因子を含む馴化培地約１０Ｌを得るために、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１５Ｌのバイオリアクター内で１２時間、流加産生モードで増殖させた。回収後、不要な細胞および細胞片を除くために馴化培地を浄化し、タンパク質精製の前に濃縮した。タ
ンパク質精製は、カルシウムイオン結合型のｒ第ＩＸ因子を非結合型から分離するために考案された擬似アフィニティーカラムクロマトグラフィー法を用いて行なった（Yan １９９１、米国特許第４，９８１，９５２号）。

組換え第ＩＸ因子（ｒ第ＩＸ因子）は、カルシウム存在下でＱ−セファロースＨＰに結合したｒ第ＩＸ因子の塩勾配溶出により分画された（図１）。本実施例において、Ｑ−セファロースＨＰクロマトグラフィーカラムが調製され、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０および１０ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された。第ＩＸ因子を吸収するため、同様の組成であるがｒ因子を含む溶液をカラムへアプライした。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、カラムに０から０．４Ｍの塩化ナトリウムによる塩勾配をアプライしてタンパク質を溶出した。カラム画分を採取し、タンパク質濃度を検出するため２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。

選択された画分からのサンプルを、分析用のＮ−結合型オリゴ糖を遊離させるためにＰＮＧａｓｅＦにより消化した。図１で同定された画分中に存在するシアル化Ｎ−グリカンの相対パーセンテージを以下の表１に示す。表１に見られるように画分はＮ−グリカンの組成において異なり、３以上のシアル酸を含むＮ−グリカンをより高いパーセンテージで有するｒ第ＩＸ因子が、より高い塩濃度において、カラムからより多く溶出された。この方法により、トリ−およびテトラ−触角状の第ＩＸ因子が濃縮された画分が同定された。

実施例２．高度にシアル化されたｒ第ＩＸ因子製剤
血友病治療のための高度にシアル化されたｒ第ＩＸ因子製剤を得るため、細胞培養法により得られた馴化培地をタンパク質精製に供し、それにより第ＩＸ因子のカルボキシル化された形から完全にガンマ−カルボキシル化された形を分離するため、擬似アフィニティー条件下で１以上のクロマトグラフィー工程が行なわれる（Yan １９９１、米国特許第４，９８１，９５２号）。Ｎ−グリカンあたり３以上のシアル酸残基を持つタンパク質を多量（相対パーセンテージ）に含む画分を得るため、第ＩＸ因子の完全にガンマ−カルボキシル化された形をカラムクロマトグラフィーによってさらに分画した（実施例１）。３以上のシアル酸残基を持つタンパク質を妥当なパーセンテージ有するｒ第ＩＸ因子製剤を得
るため、基本的に全ての画分がプールされてよい。Ｎ−グリカンあたり３以上のシアル酸残基を持つタンパク質を最大パーセンテージ有するｒ第ＩＸ因子製剤を得るため、カラムから後期に溶出される画分がプールされてよい。一般に、所定の製剤中のシアル酸含量についてのｒ第ＩＸ因子の組成は、表２に例証される所与の標的範囲を達成するために調節されてよい。

実施例３．高度にシアル化されたｒ第ＩＸ因子製剤の生物学的利用能
生物学的利用能のｉｎｖｉｖｏ分析のための第ＩＸ因子の独特の４ロット（ロット１〜４）を得るため、図１に示す画分をプールすることにより組換え第ＩＸ因子製剤を得た。表３に示すように、産生されるｒ第ＩＸ因子のロットはグリカンあたり３以上の（３＋）シアル酸残基を含んだＮ−グリカンのパーセンテージに関して異なる。

ｒ第ＩＸ因子の各ロットならびにBeneFixおよびMononine製剤のための標準化投与溶液を調製し、正常Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへ静脈内投与した。循環中に存在する第ＩＸ因子抗原の量を測定するため、投与後に定期間隔で血漿サンプルを採取した。「初回の」第ＩＸ因子回収率は、２，５、および１５分において循環中に存在する第ＩＸ因子抗原の量として定義され、全体的な生物学的利用能は４８０および１４４０分を超える「曲線下の領域」として定義された。それぞれのｒ第ＩＸ因子製剤は４頭の動物において評価され、その結果は、１００％とみなされるｐｄ第ＩＸ因子（Mononine）から得られた結果との比較のために平均化された。この比較を表３に示す。図２に示すように、正常ラットにおけるｒ第ＩＸ因子の初回の回収率および生物学的利用能（ＡＵＣ）は、３以上のシアル酸残基を含むＮ−グリカンのパーセンテージに依存する。BeneFixよりも低いパーセンテージの３＋シアル酸残基を有するｒ第ＩＸ因子製剤はより低い回収率および生物学的利用能を有するが、高いパーセンテージを有する製剤はより高い回収率および生物学的利用能を有する。

当業者は、多数の様々な改変が本発明の精神から逸脱することなく行なわれてよいことを理解する。従って、本発明の形態は例証のみとなるものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではないことが明瞭に理解されなければならない。

Claims

組換え第ＩＸ因子を分離する方法であって；
組換え第ＩＸ因子を含む馴化培地を準備すること；および
組換え第ＩＸ因子分子中３以上のシアル酸残基を持つＮ−結合型オリゴ糖のパーセンテージが少なくとも６２％である、組換え第ＩＸ因子の画分を、カルシウム存在下で１以上のカラムクロマトグラフィー工程により馴化培地より分離すること、
を含み、前記１以上のカラムクロマトグラフィー工程は、カルシウム存在下でアニオン交換カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーである、方法。
前記アニオン交換カラムが、イオン交換基として第４級アンモニウム基を有する、請求項１に記載の方法。
前記第ＩＸ因子が完全にガンマ−カルボキシル化されている、請求項１または２に記載の方法。