JP7464530B2 - インターロイキン－２／インターロイキン－２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法 - Google Patents

インターロイキン－２／インターロイキン－２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法 Download PDF

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Description

１. 関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月２８日出願の米国仮出願６２／６４９,３７９の利益を請求し、それは引用により全体として本明細書に包含させる。
２. ＥＦＳ－ＷＥＢにより電子的に提出した配列表についての記載
本出願と共にＡＳＣIIテキストファイル(名称：3338_100PC01_Seqlisting_ST25.txt；サイズ：３５４,５４２バイト；および作成日：２０１９年３月２７日)の電子的に提出した配列表の内容を、引用により全体として本明細書に包含させる。
３. 分野
ここに開示する対象は、一般にインターロイキン－２／インターロイキン－２受容体－アルファ融合タンパク質を用いて免疫応答を調節するための方法および組成物に関する。
４. 発明の背景
インターロイキン－２(ＩＬ２またはＩＬ－２)は、免疫系の重要な側面を制御する生物学的サイトカインである。ＩＬ２は、癌、炎症性疾患または自己免疫性疾患を有する患者の免疫応答を押し上げる試みにおいて使用されている。ＩＬ２は、抗原活性化Ｔ細胞のクローン増殖を含む免疫応答を促進し、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー(Ｔｈ)１およびＴｈ２細胞の発展を駆動し、最後にＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬｓ)を分化する強力なＴ細胞増殖因子であり、ＣＤ４＋ Ｔｈ１７およびＴ濾胞性ヘルパー(Ｔｆｈ)細胞の発展に対抗する。ＩＬ２はまたＴ細胞記憶想起応答を形づくる。
臨床治験は、ＩＬ２のＴ細胞活性化性質を、癌およびＨＩＶ／ＡＩＤＳを有する患者に、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を押し上げるために、高用量のＩＬ２(一般に＞５００,０００単位／kgを反復)の点滴により利用している。事実、ＩＬ２は、一部(約５％)が完全寛解を示したとして、ＦＤＡは黒色腫および腎臓細胞癌の患者における使用を承認した。それにも関わらず、これらおよび他の癌で応答率は低く、同時にこの治療には重篤な毒性が付随した。同様に、ＩＬ２はＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の免疫促進に有効ではないとされた。これらの状況における高用量ＩＬ２の有効性の乏しさは、一部Ｔｒｅｇの付随する増大による。
より最近、低用量のＩＬ２が、自己組織の自己免疫様攻撃に関連する望まれない免疫応答を抑制するための耐容性を選択的に押し上げるために使用されている。これらの低用量のＩＬ２は、自己反応性Ｔ細胞の増強または再活性化の徴候を何ら示していない。前臨床試験は、低ＩＬ２Ｒシグナル伝達が、Ｔｒｅｇの重要な活性を選択的に促進するが、Ｔエフェクター(Ｔｅｆｆ)細胞は促進せず、低レベルのＩＬ２でのマウスの処置は、自己免疫を阻止したことを示した。現在、免疫応答が活動亢進した多数の患者が、低用量ＩＬ２(５０万～２００万単位を定期的)で処置されている。現在までの経験では、この治療は安全であり、自己攻撃性Ｔ細胞の再活性化の兆候はなく、臨床的改善にしばしば関連するＴｒｅｇはほぼ全患者で増加する。それにも関わらず、ＩＬ２は、インビボでの極めて短い半減期を含む、治療としての重大な欠点を有し、これは高用量でその有効性および毒性を制限する。これらの理由により、使用のための薬物動態および応答の耐久性が改善された、新規ＩＬ２生物製剤が必要とされる。
５. 発明の概要
本発明は、(ａ)インターロイキン－２(ＩＬ２)ポリペプチドを含む第一ポリペプチド；および(ｂ)インターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドを含む、融合タンパク質であって；ここで、(ｉ)ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン(配列番号７)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない；および／または(ii)ＩＬ２ポリペプチドは、天然ＩＬ２(配列番号２)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない；そして、ここで融合タンパク質はＩＬ２活性を有する、融合タンパク質を含む。ある実施態様において、ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン(配列番号７)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない、グリコシル化が少なくとも二つ少ない、グリコシル化が少なくとも三つ少ない、グリコシル化が少なくとも四つ少ない、グリコシル化が少なくとも五つ少ない、グリコシル化が少なくとも六つ少ない、グリコシル化が少なくとも七つ少ない、グリコシル化が少なくとも八つ少ないまたはグリコシル化が少なくとも九つ少ない。ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドは、天然ＩＬ２(配列番号２)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない。
ある実施態様において、融合タンパク質は第一ポリペプチドを含み、ここで、第一ポリペプチドは,配列番号２に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は第二ポリペプチドを含み、ここで、第二ポリペプチドは,配列番号１２に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、グリコシル化が少なくとも一つ少ないＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、グリコシル化を除去する変異を含む。ある実施態様において、変異は、Ｏ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を除去する。ある実施態様において、変異は、Ｏ－グリコシル化を除去する。ある実施態様において、変異は、Ｎ－グリコシル化を除去する。
ある実施態様において、ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインにおける変異は、配列番号７に対応する、アミノ酸１６７～２１９、アミノ酸１６８～２１９、アミノ酸１６９～２１９、アミノ酸１７０～２１９、アミノ酸１７１～２１９、アミノ酸１７２～２１９、アミノ酸１７３～２１９、アミノ酸１７４～２１９、アミノ酸１７５～２１９、アミノ酸１７６～２１９、アミノ酸１７７～２１９、アミノ酸１７８～２１９、アミノ酸１７９～２１９、アミノ酸１８０～２１９、アミノ酸１８１～２１９、アミノ酸１８２～２１９、アミノ酸１８３～２１９、アミノ酸１８４～２１９、アミノ酸１８５～２１９、アミノ酸１８６～２１９、アミノ酸１８７～２１９、アミノ酸１８８～２１９、アミノ酸１８９～２１９、アミノ酸１９０～２１９、アミノ酸１９１～２１９またはアミノ酸１９２～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は、配列番号７に対応する、１６７、１６９、１７１乃至１９２～２１９のアミノ酸の欠失である。ある実施態様において、変異は、配列番号７に対応する１７０～２１９の欠失を含まない。ある実施態様において、第二ポリペプチドは配列番号１１である。ある実施態様において、第二ポリペプチドは配列番号１２である。
ある実施態様において、変異は、グリコシル化されていないアミノ酸でのグリコシル化されているアミノ酸の１以上の置換である。ある実施態様において、変異は、近くのアミノ酸のグリコシル化をさせないアミノ酸での、アミノ酸の１以上の置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、アミノ酸Ｎ４９、アミノ酸Ｎ６８、アミノ酸Ｔ７４、アミノ酸Ｔ８５、アミノ酸Ｔ１９７、アミノ酸Ｔ２０３、アミノ酸Ｔ２０８およびアミノ酸Ｔ２１６またはこれらの何れかの組み合わせであり、ここで、アミノ酸位置は配列番号７に対応する。ある実施態様において、１以上の置換は、アスパラギンから、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸へである。ある実施態様において、１以上の置換は、スレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸へである。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｎ４９である。ある実施態様において、Ｎ４９は、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｎ６８である。ある実施態様において、Ｎ６８は、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ７４である。ある実施態様において、Ｔ７４は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ８５である。ある実施態様において、Ｔ８５は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ１９７である。ある実施態様において、Ｔ１９７は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ２０３である。ある実施態様において、Ｔ２０３は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ２０８である。ある実施態様において、Ｔ２０８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ２１６である。ある実施態様において、Ｔ２１６は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、１以上の置換は、アミノ酸５０、アミノ酸５１、アミノ酸Ｔ６９、アミノ酸Ｔ７０、アミノ酸Ｃ１９２またはこれらの何れかの組み合わせであり、ここで、アミノ酸位置は配列番号７に対応する。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸５０である。ある実施態様において、Ｓ５０はプロリンに変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸５１である。ある実施態様において、Ｓ５１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ６９である。ある実施態様において、Ｔ６９はプロリンに変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｔ７０である。ある実施態様において、Ｔ７０は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｃ１９２である。ある実施態様において、Ｃ１９２は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、グリコシル化が少なくとも一つ少ないＩＬ２ポリペプチドは、グリコシル化を除去する変異を含む。ある実施態様において、変異は、グリコシル化されていないアミノ酸でのグリコシル化されているアミノ酸の１以上の置換である。ある実施態様において、変異は、近くのアミノ酸のグリコシル化をさせないアミノ酸での、アミノ酸の１以上の置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、アラニンから、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸へである。ある実施態様において、１以上の置換は、スレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸へである。ある実施態様において、１以上の置換は、システインから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸へである。ある実施態様において、１以上の置換は、システインからセリンへである。ある実施態様において、１以上の置換は、システインからアラニンへである。ある実施態様において、１以上の置換は、システインからバリンへである。
ある実施態様において、１以上の置換は、配列番号２と対応させて比較して、アミノ酸Ｔ３である。ある実施態様において、置換の一つは、アミノ酸Ｃ１２５である。ある実施態様において、アミノ酸Ｃ１２５での置換は、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５ＡおよびＣ１２５Ｖからなる群から選択される。
ある実施態様において、変異は欠失である。ある実施態様において、欠失は、アミノ酸Ａ１である。
ある実施態様において、融合タンパク質は酵素的または化学的に脱グリコシル化される。ある実施態様において、融合タンパク質は、アルカリ、ヒドラジノリシス、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｅｎｄｏ Ｈ、Ｏ－グリコシダーゼまたはこれらの何れかの組み合わせにより脱グリコシル化される。
ある実施態様において、融合タンパク質は、さらに第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの間をインフレームで融合させるリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーはグリシン／セリンリンカーである。ある実施態様において、グリシン／セリンリンカーは(ＧＳ)ｎ、(ＧＧＳ)ｎ、(ＧＧＧＳ)ｎ、(ＧＧＧＧＳ)ｎまたは(ＧＧＧＧＳ)ｎのアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の整数である。ある実施態様において、グリシン／セリンリンカーは、(ＧＧＧＳ)３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、融合タンパク質は、さらに第一ポリペプチドおよび／または第二ポリペプチドに融合した異種部分を含む。ある実施態様において、異種部分は、半減期延長部分である。ある実施態様において、異種部分は、非ポリペプチド部分を含む。ある実施態様において、異種部分は、ポリペプチドを含む。ある実施態様において、異種部分は、アルブミン、免疫グロブリン定常領域またはその一部、免疫グロブリン結合ポリペプチド、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)、アルブミン結合ポリペプチド(ＡＢＰ)、PASylation部分、HESylation部分、ＸＴＥＮ、ペグ化部分、Ｆｃ領域およびこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２または配列番号１３からなるポリペプチドより安定である。ある実施態様において、融合タンパク質は、(ｉ)対照タンパク質と比較した熱力学的安定性の増加；(ii)対照タンパク質と比較したＴＭの増加；(iii)対照タンパク質と比較した分解への抵抗性の増加；(iv)対照タンパク質と比較した修飾への抵抗性の増加；(ｖ)対照タンパク質と比較したインビボでの安定性の増加；および(vi)これらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、１以上の性質を有し、ここで、対照タンパク質は(ｉ)インターロイキン－２(ＩＬ２)ポリペプチドを含む第一ポリペプチド；および(ｂ)インターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドを含み、該融合タンパク質と比較してグリコシル化が少なくとも一つ少ないものである。
ある実施態様において、融合タンパク質は、モノマーである。ある実施態様において、融合タンパク質は、ダイマーである。ある実施態様において、ダイマーは２個のモノマーを含み、これらモノマーは互いに共有結合により結合される。ある実施態様において、ダイマーは２個のモノマーを含み、これらモノマーは非共有結合により結合される。
ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２または配列番号１３からなるポリペプチドの薬物動態特性と比較して、半減期延長、Ｃｍａｘ増加、ＡＵＣ増加、Ｃｍｉｎ増加、クリアランス低減、バイオアベイラビリティ改善およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される１以上の薬物動態特性を有する。ある実施態様において、融合タンパク質は延長された半減期を有する。ある実施態様において、延長された半減期は、配列番号２または配列番号１３からなるポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍または少なくとも約２２倍である。
ある実施態様において、ここに開示されるのは、１以上の融合タンパク質である。ある実施態様において、ここに提供されるのは、１以上のここに開示する融合タンパク質を含む組成物である。
ある実施態様において、ここに開示されるのは、ここに開示する融合タンパク質の何れかをコードする核酸である。ある実施態様において、ここに開示されるのは、ここに開示する融合タンパク質の何れかをコードする核酸を含むベクターである。ある実施態様において、ここに開示されるのは、ここに開示する融合タンパク質の何れかをコードする核酸を含む宿主細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は真核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞および植物細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。ある実施態様において、原核生物細胞は細菌細胞である。
ある実施態様において、ここに提供されるのは、(ａ)ここに開示する融合タンパク質、ここに開示する組成物、ここに開示する核酸、ここに開示するベクターまたはここに開示する宿主細胞；および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。
ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに開示する融合タンパク質、ここに開示する組成物、ここに開示する核酸、ここに開示するベクターまたはここに開示する宿主細胞および該融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。
ある実施態様において、ここに提供されるのは、適当な条件下でここに開示する宿主細胞を培養し、該融合タンパク質を回収することを含む、ここに開示する融合タンパク質を製造する方法である。ある実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞または細菌細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＮＳ０細胞、Ｐｅｒ Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、細菌細胞はエシェリキア・コリである。
ある実施態様において、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であって、対象に有効量のここに開示する融合タンパク質、ここに開示する組成物、ここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示する宿主細胞または医薬ここに開示する組成物を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、疾患または障害は癌である。ある実施態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮癌、子宮内膜癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、扁平上皮細胞癌、皮膚癌、中枢神経系新生物、リンパ腫、白血病、肉腫、ウイルス関連癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化器癌、ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、骨髄腫、唾液腺癌、腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌または頭頸部癌およびこれらの何らかの組み合わせである。
ある実施態様において、疾患または障害は、炎症性疾患または自己免疫性疾患である。ある実施態様において、炎症性疾患または自己免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚ループス、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎または全身性硬化症、移植片対宿主病、乾癬、円形脱毛症、ＨＣＶ誘発脈管炎、シェーグレン症候群、天疱瘡、強直性脊椎炎、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫、高安病、自己免疫性肝炎、硬化性胆管炎、グーゲル・シェーグレンおよびマクロファージ活性化症候群からなる群から選択される。
ある実施態様において、疾患または障害は、感染性疾患である。ある実施態様において、感染性疾患は病原性ウイルスが原因である。ある実施態様において、病原性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトＴ細胞白血病(ＨＴＬ)ウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ジョン・カニンガム(ＪＣ)ウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群から選択される。ある実施態様において、感染性疾患は病原性細菌が原因である。ある実施態様において、病原性細菌は、クラミジア、リケッチア目細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア、サルモネラ属、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス症、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌からなる群から選択される。ある実施態様において、感染性疾患は病原性真菌が原因である。ある実施態様において、病原性細菌は、カンジダ(アルビカンス、クルーセイ、グラブラータ、トロピカリスなど)、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ムーコル目(ムコール属、アブシジア属、リゾプス属)、スポロトリックス・シェンキィ、ブラストマイセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムからなる群から選択される。ある実施態様において、感染性疾患は病原性寄生虫が原因である。ある実施態様において、病原性寄生虫は、赤痢アメーバ、大腸バランジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、ブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノヴァン・リーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンディおよびブラジル鉤虫からなる群から選択される。
ある実施態様において、ここに開示する方法は、さらに対象に第二剤を投与することを含む。ある実施態様において、第二剤は、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＴＩＭ３アンタゴニスト、ＧＩＴＲアンタゴニスト、ＫＩＲアンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストまたはこれらの何れかの組み合わせである。ある実施態様において、第二剤は抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＬＡＧ３抗体またはこれらの何れかの組み合わせである。ある実施態様において、第二剤は、サイトカイン阻害剤である。ある実施態様において、サイトカイン阻害剤はＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＩＦＮ－γまたはこれらの何れかの組み合わせの１以上を標的とする。
ある実施態様において、融合タンパク質は、局所、上皮粘膜、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管支、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外または胸骨内経路により投与される。
６. 図面の簡単な説明
図１は、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ静的光散乱で測定して、配列番号１６の分子量が９３kDaであることを示す。ポリペプチド鎖単独の理論的質量は、３７,８１２Da低い。観察される溶液質量は、それが均一ホモダイマーとして存在し、質量の約１９％がグリコシル化によることを示す。
図２は、表面プラズモン共鳴測定を使用したＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質(配列番号１６)のヒトＣＤ２５への原型的結合を示す。
図３は、０.５mg／kg単回静脈内(IV)または皮下(ＳＣ)投与後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおける、示す融合タンパク質血清濃度の経時変化を示す。各時点は、３マウスからのサンプルの平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
図４は、０.５mg／kg単回静脈内(IV)または皮下(ＳＣ)投与後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおける、示す融合タンパク質血清濃度の経時変化を示す。各時点は、３マウスからのサンプルの平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
図５は、０.０７５mg／kg単回皮下(ＳＣ)投与後のカニクイザルにおける、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)の血清濃度の経時変化を示す。各時点は、３サルからのサンプルの平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。
図６は、ＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質が、代表的ドナーからのヒトＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する活性を示す。細胞をＴｒｅｇ(ＣＤ４＋、ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ２５＋)またはＴｃｏｎｖ(ＣＤ４＋、ｆｏｘｐ３－)、ＣＤ８＋およびＮＫ細胞(ＣＤ３－、ＣＤ５６＋)でゲーティングし、インキュベーション後ｐＳＴＡＴ５で陽性に染色された細胞の存在を定量した。これらの実験で決定されたＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５誘導のＥＣ５０は、それぞれｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２４０)、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)およびｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－１８７)について１０ng／ml、４.４ng／mlおよび４.６ng／mlであった。
図７は、切断融合タンパク質が全血におけるＩＬ２Ｒを刺激し、種々の細胞型でリン酸化ＳＴＡＴ５を誘導する能力を示す。ＩＬ２Ｒシグナル伝達を、ｐＳＴＡＴ５で細胞内染色後フローサイトメトリーでの測定により検出し、全血混合物におけるｐＳＴＡＴ５陽性染色細胞のパーセンテージを決定した。ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２４０)の効力を代表的ドナーにおいてｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)と比較した。タンパク質をヒト全血で力価測定し、細胞内ｐＳＴＡＴ５染色強度をフローサイトメトリーで測定した。ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５誘導のＥＣ５０は、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２４０)で２２ng／mlおよびｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)で３６ng／mlであった。
図８Ａ～図８Ｃは、ヒト化免疫系を有するマウスにおけるＴ細胞増加についてのｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２４０)、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)およびｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－１８４)の類似能力を示す。ＮＳＧ－ｈｕＣＤ３４移植マウスへの融合タンパク質投与(ｓ.ｃ.)を、３回、３日毎に実施した。投与マウスの脾臓からのＴｒｅｇ(図８Ａ)、ＣＤ８(図８Ｂ)およびＮＫ細胞(図８Ｃ)の分析を、フローサイトメトリーにより決定した。
図９Ａおよび図９Ｂは、ＰＢＭＣ(図９Ａ)または全血濃度(図９Ｂ)とｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)を含む混合細胞集団で１５分間後のＳＴＡＴ５のリン酸化を示す。
図１０は、インビトロでヒトまたはマウス血清におけるＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)の(Ｇ３Ｓ)３リンカー安定性のＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースの分析を示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用するＩＬ２とＣＤ２５のピーク面積比を、抗ＩＬ２抗体を使用する捕捉後記録する。
図１１は、０.０７５mg／kg単回皮下投与後のサル血清におけるＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)の(Ｇ３Ｓ)３リンカー安定性のＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースの分析を示す。ＬＣ－ＭＳ／Ｍを使用するＩＬ２とＣＤ２５のピーク面積比Ｓを、抗ＩＬ２抗体を使用する捕捉後記録する。
７. 発明の詳細な記載
本開示は、本発明の全てではないが、一部実施態様が示される、添付する図面を参照して、以下にさらに完全に記載される。事実、これらの開示は多くの種々の形態に具現化でき、ここに示す実施態様に限定されると解釈してはならない；むしろ、これらの実施態様は、本開示が適用され得る法的基準を満たすように提供される。全体をとおして、同様の数字は、同様の態様をいう。
ここに示す開示の多くの修飾および他の実施態様が、前記および添付する図面に示される教示の利点を有するとして、本発明が属する分野の当業者には明らかとなる。それ故に、本発明は、開示される特定の実施態様に限定されず、修飾および他の実施態様が添付する特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されると理解されるべきである。特定のものをさす用語がここで用いられるが、それらは、一般的かつ記述的意味でのみ用いられ、限定する目的ではない。
７.１ 概要
免疫系調節に用いられ得る、種々の方法および組成物が提供される。組成物は(ａ)インターロイキン－２(ＩＬ２)ポリペプチドを含む第一ポリペプチド；および(ｂ)インターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み；ここで、(ｉ)ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン(配列番号７)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない；および／または(ii)ＩＬ２ポリペプチドは、天然ＩＬ２(配列番号２)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない；そして、ここで融合タンパク質はＩＬ２活性を有する。
本明細書はまた、ここに開示する融合タンパク質をコードするヌクレオチド、該ヌクレオチドを含むベクター、該ヌクレオチドを含む宿主細胞および該融合タンパク質、ヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含む組成物も開示する。本発明はまた融合タンパク質、ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞もしくは組成物を製造する方法または融合タンパク質、ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞もしくは組成物を使用する方法にも関する。
７.２ 定義
あるものの単数表現は、そのものの１以上をいうことは注意すべきである；例えば、「ヌクレオチド配列」は１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。そのようなものとして、単数表現、「１以上の」および「少なくとも一つ」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。
さらに、「および／または」は、ここで使用されているとき、２つの特定した特性または要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的開示と解釈される。故に、ここで「Ａおよび／またはＢ」などの言い回しで使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」のような表現で使用される用語「および／または」は、次の態様の各々を含むことを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
同様に、単語「または」は、文脈に明らかに反しない限り、「および」を含むことを意図する。核酸またはポリペプチドについて示す全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子量値は近似であり、説明のために提供されることが理解されるべきである。
ここで、態様が「含む」なる用語を用いて記載されているとき、「からなる」および／または「本質的にからなる」の用語以外類似する態様も提供されることが理解される。
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本開示が関連する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本明細書で使用する用語の体部分の一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞および記号は、その国際単位系(ＳＩ)が認めた形態である。数値範囲は、該範囲を定義する数値を含む。特に断らない限り、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向で記載する。ここに提供する表題は、本明細書を全体として参照して得られ得る種々の態様の開示を制限しない。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書をその全体として参照して、より完全に定義される。
用語「約」は、ここでは、おおよそ、大まか、周辺または幅内を意味する。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用されるとき、示す数値の上および下に境界を拡大することにより、その範囲を修飾する。故に、「約１０～２０」は「約１０～約２０」を意味する。一般に、用語「約」は、数値を、例えば、１０パーセント上または下(高または低)の分散により、示す数値を上および下に修飾し得る。
ここで使用する「インターロイキン－２」、「ＩＬ２」または「ＩＬ－２」は、特に断らない限り、霊長類(例えば、ヒト)および齧歯類(例えば、マウスおよびラット)および家庭飼育または農業用哺乳動物などの哺乳動物を含む、あらゆる脊椎動物からのあらゆる天然または組み換えＩＬ２をいう。本用語は、非プロセシングＩＬ２ならびに細胞内でのプロセシングに由来するＩＬ２のあらゆる形態(すなわち、ＩＬ２の成熟形態)を包含する。本用語は、ＩＬ２の天然に存在するバリアントおよびフラグメント、例えばスプライスバリアントまたはアレルバリアントならびに天然に存在するＩＬ２のＩＬ２活性を有する天然に存在しないバリアントも包含する。
ＩＬ２のさらなる核酸およびアミノ酸配列は知られる。例えば、GenBank Accession Nos: Q7JFM2(Aotus lemurinus(Gray-bellied night monkey)); Q7JFM5(Aotus nancymaae(Ma's night monkey)); P05016(Bos taurus(ウシ)); Q29416(イエイヌ(イヌ)(Canis lupus familiaris)); P36835(Capra hircus(ヤギ)); およびP37997(Equus caballus(ウマ))参照。
ＩＬ２活性の生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントは、ＩＬ２活性を保持する。用語「ＩＬ２の生物学的活性」または「ＩＬ２活性」は、ＩＬ２受容体担持リンパ球を刺激する能力を含むが、これに限定されない、ＩＬ２の生物学的活性の１以上をいう。このような活性は、インビトロおよびインビボ両者で測定され得る。ＩＬ２は免疫活性の包括的レギュレーターであり、ここで見られる効果はそのような活性の合計である。例えば、それは生存活性(Ｂｃｌ－２)を制御し、Ｔエフェクター活性(ＩＦＮ－ガンマ、グランザイムＢおよびパーフォリン)を誘導しおよび／またはＴ制御性活性(ＦｏｘＰ３)を促進する。
ＩＬ２の生物学的に活性なバリアントは知られる。例えば、ＵＳ出願公開２００６０２６９５１５および２００６０１６０１８７およびＷＯ９９／６０１２８参照。
ここで使用する用語「ＣＤ２５」、「ＩＬ２受容体α」、「ＩＬ２Ｒα」または「ＩＬ２Ｒａ」は、特に断らない限り、霊長類(例えばヒト)および齧歯類(例えば、マウスおよびラット)および家庭飼育または農業用哺乳動物を含む哺乳動物を含む、あらゆる脊椎動物からのあらゆる天然または組み換えＩＬ２Ｒαをいう。本用語はまたＩＬ２Ｒαの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントまたはＩＬ２Ｒα活性を有する天然に存在しないバリアントも包含する。ヒトＩＬ２は、その受容体系、ＩＬ２Ｒを介するシグナル伝達により生物学的効果を発揮する。ＩＬ２およびその受容体(ＩＬ２Ｒ)は、Ｔ細胞増殖および免疫応答に極めて重要である他の基本的な機能に必要である。ＩＬ２Ｒは、アルファ(ｐ５５)、ベータ(ｐ７５)およびガンマ(ｐ６５)鎖である、３つの非共有性に結合したＩ型膜貫通タンパク質からなる。ヒトＩＬ２Ｒアルファ鎖は、２１９アミノ酸の細胞外ドメイン、１９アミノ酸の膜貫通ドメインおよび１３アミノ酸の細胞内ドメインからなる。ＩＬ２Ｒアルファ(ＩＬ２Ｒ－α)の分泌細胞外ドメインを、ここに記載する融合タンパク質に用い得る。
ＩＬ２Ｒαの核酸およびアミノ酸配列は知られる。例えば、GenBank Accession Nos: NP_001030597.1(Pan troglodytes); NP_001028089.1(Macaca mulatta); NM_001003211.1(Canis lupus); NP_776783.1(Bos taurus); NP_032393.3(Mus musculus);およびNP_037295.1(Rattus norvegicus)参照。
ＩＬ２Ｒα細胞外ドメイン活性の生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントは、ＩＬ２Ｒα細胞外ドメイン活性を保持する。用語「ＩＬ２Ｒα細胞外ドメインの生物学的活性」は、ＩＬ２に結合するおよび／またはＩＬ２受容体応答性細胞における細胞内シグナル伝達を増強する能力を含むが、これらに限定されないＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的活性の１以上をいう。ＩＬ２Ｒαの生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントの非限定的例は、例えば、Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5654-5658, 1988に開示される。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２Ｒαの生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインと比較して、少なくとも一つ少ないグリコシル化を含む。
ここで使用する対象物に適用される用語「天然に存在する」は、当該対象物が天然で見出され得ることをいう。例えば、天然源から単離でき、人の手により実験室で意図的に修飾されていない生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続して結合したアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖長の上限はない。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの、しかしこれらに限定されない修飾を含み得る。「タンパク質」または「融合タンパク質」は、１以上のポリペプチドを含み得る。
本発明にまた包含されるのは、ポリペプチドのフラグメントまたはバリアントおよびこれらの何れかの組み合わせである。用語「フラグメント」または「バリアント」は、本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子をいうとき、対照ポリペプチドの性質の少なくとも一部(例えば、ＩＬ２ＲαについてＩＬ２結合活性)を保持する、あらゆるポリペプチドを含む。ポリペプチドのフラグメントはタンパク分解フラグメントおよび欠失フラグメントを含むが、天然に存在する完全長ポリペプチド(または成熟ポリペプチド)を含まない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントは、上記フラグメントおよびまたアミノ酸置換、欠失または挿入によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドも含む。バリアントは天然に存在しても、しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは、当分野で知られる変異導入技術を使用して製造され得る。バリアントポリペプチドは保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
上記のとおり、ポリペプチドバリアントは、例えば、修飾ポリペプチドを含む。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボース化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、デメチル化、共有架橋形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化(Mei et al., Blood 116:270-79 (2010))、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレニル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在付加およびユビキチン化を含む。
ここで使用するタンパク質またはヌクレオチド配列における「対応する」、「対応するアミノ酸」、「対応する部位」または「等価アミノ酸」は、第一タンパク質配列、例えば、ＩＬ２配列と第二タンパク質配列、例えば、第二ＩＬ２配列の同一性または類似性を最大化するためのアラインメントにより同定される。第二タンパク質配列における等価アミノ酸の同定に使用する数字は、第一タンパク質配列における対応するアミノ酸の同定に使用する数字に基づく。ある実施態様において、用語「対応する」は、ポリペプチドにおける１以上のアミノ酸またはポリヌクレオチドにおける１以上のヌクレオチドでの変異の相関をいう。非限定的例として、ここに開示するポリヌクレオチド(例えば、配列番号７)の特定のアミノ酸(例えば、Ｓ５０)は、配列番号７の５０番目のアミノ酸－ セリン－ をいう。
ここで使用する用語「結合する」は、第一アミノ酸鎖と第二アミノ酸鎖の間で形成される共有または非共有結合をいう。ある実施態様において、用語「結合する」は、共有の非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この結合は、コロン、すなわち、(：)によって示され得る。他の実施態様において、それはペプチド結合以外の共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第二システイン残基上のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域とＣＬ領域はジスルフィド結合により結合され、二つの重鎖はＫａｂａｔナンバリングシステムを使用して２３９および２４２(位置２２６または２２９、ＥＵナンバリングシステム)に対応する位置で、２つのジスルフィド結合により結合される。共有結合の例は、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アグノスティック結合、ベント結合、双極性結合、パイ逆供与結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役結合、超共役結合、芳香族性、ハプト結合または反結合を含むが、これらに限定されない。非共有結合の非限定的例は、イオン結合(例えば、カチオン－パイ結合または塩結合)、金属結合、水素結合(例えば、二水素結合、二水素複合体、低障壁水素結合または対称水素結合)、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力または化学極性を含む。
ここで使用する用語「同等」は、例えば、融合タンパク質の使用によりもたらされる、比較速度またはレベルが、対照速度またはレベルに等しい、実質的に等しいまたは類似することを意味する。ここで使用する用語「類似する」は、比較速度またはレベルと、対照速度またはレベルとの差異が１０％を超えないまたは１５％を超えないことを意味する。用語「実質的に等しい」は、比較速度またはレベルと対照速度またはレベルの差異が０.０１％、０.５％または１％を超えないことを意味する。
ここで使用する用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程をいう。
「融合」または「融合」タンパク質は、第一アミノ酸配列が、天然では自然に結合しない第二アミノ酸配列とインフレームで結合することを意味する。融合ポリペプチド例えば、ＩＬ２タンパク質とＩＬ２－Ｒαタンパク質の融合において、通常タンパク質に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチドで共有できまたは通常同じタンパク質に存在するアミノ酸配列を、新しい配置で置くことができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、または、ペプチド領域が所望の相関でコードされているポリヌクレオチドの作製および翻訳により、産生される。融合タンパク質は、さらに、共有の非ペプチド結合または非共有結合で第一アミノ酸配列に結合した第二アミノ酸配列を含み得る。転写／翻訳により、単一タンパク質が製造される。この方法で、複数タンパク質またはそのフラグメントが単一ポリペプチドに取り込まれ得る。「操作可能に結合」は、２以上の要素間の機能的結合を意味することを意図する。例えば、２ポリペプチド間の操作可能な結合は、両ポリペプチドをインフレームで相互に結合させて、単一ポリペプチド融合タンパク質を産生する。特定の態様において、融合タンパク質は、下にさらに記載するとおり、リンカー配列を含み得る第三ポリペプチドをさらに含む。
「Ｆｃ領域」(結晶化できるフラグメント領域)、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合に介在する、抗体重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)以外の抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第二(ＣＨ２)および第三(ＣＨ３)ドメイン定常ドメイン由来の２つの同一タンパク質フラグメントを含み；ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖の３つの重鎖ドメイン定常ドメイン(ＣＨドメイン２～４)を含む。ＩｇＧアイソタイプはある種でサブクラスに分割される：ヒトでＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスでＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間にヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は変わり得るが、ここで定義されるとおり、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１について重鎖のアミノ酸残基Ｄ２２１、ＩｇＧ２についてＶ２２２、ＩｇＧ３についてＬ２２１およびＩｇＧ４についてＰ２２４からカルボキシ末端までのストレッチをいい、ここで、ナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３７からアミノ酸３４０に伸び、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１～アミノ酸４４７または４４６(Ｃ末端リシン残基がないならば)または４４５(Ｃ末端グリシンおよびリシン残基がないならば)に伸びる。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントを含む天然配列ＦｃまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)であり得る。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これら受容体のアレルバリアントおよび選択的スプライシング形態を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化(マウスにおいてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトにおいてＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１つの阻害性(ＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質は、当分野で知られる。生来のエフェクター細胞型の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲと阻害性ＦｃγＲIIＢを共発現し、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、選択的に１つの活性化Ｆｃ受容体(マウスにおいてＦｃγＲIIIおよびヒトにおいてＦｃγＲIIIＡ)を発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、マウスＩｇＧ２ａと等価と考えられている。
ここで使用する用語「挿入」、「が挿入された」、「への挿入」または文法的に関連する用語は、特定のタンパク質の類似位置に対する、融合ポリペプチドにおける異種部分(例えば、半減期延長部分)の位置をいう。ここで使用する該用語は、ここに開示する組み換えポリペプチドの特徴をいい、融合ポリペプチドを製造した何らかの方法または工程を示さず、含意せずまたは暗示しない。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する「異種」および「異種部分」は、異なるタンパク質またはポリヌクレオチド由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。融合タンパク質のさらなる成分は、融合タンパク質の他のポリペプチド成分と同じ生物由来でよくまたはさらなる成分は、融合タンパク質の他のポリペプチド成分と異なる生物からであってよい。例えば、異種ポリペプチドは合成または異なる種、個体の異なる細胞型または別個の固体の同一または異なるタイプの細胞由来であり得る。ある態様において、異種部分は、融合ポリペプチドまたはタンパク質を産生するために、他のポリペプチドに融合したポリペプチドである。他の態様において、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲートしたＰＥＧなどの非ポリペプチドである。ここに記載する異種部分の非限定的例は、グリシン／セリンリンカー(例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ(配列番号７１)((Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３)とも記す)である。
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、天然で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1: 1参照)。
融合タンパク質を使用するインビトロまたはインビボアッセイの文脈での用語「ＥＣ５０」は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間である応答を誘発する融合タンパク質の濃度をいう。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基の、類似側鎖を有するアミノ酸残基での置換をいう。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ－分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。ある実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質中の予測非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換える。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。
ここで使用する用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
ここで使用する用語「制御領域」は、コード領域の上流(５’非コード配列)、その中または下流(３’非コード配列)に位置し、関連コード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。制御領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含み得る。コード領域が真核生物細胞での発現が意図されるならば、ポリアデニル化シグナルおよび転写停止配列は、通常コード配列に対して３’に位置する。
遺伝子産物、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１以上のコード領域に操作可能に結合したプロモーターおよび／または他の転写または翻訳調節要素を含み得る。プロモーター以外の他の転写調節要素、例えばエンハンサー、オペレーター、レプレッサーおよび転写停止シグナルも、遺伝子産物発現を指示するため、コード領域に操作可能に結合し得る。
多様な転写調節領域が当業者に知られる。これらは、サイトメガロウイルス(イントロン－Ａと関連した最初期プロモーター)、サルウイルス４０(初期プロモーター)およびレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルス)からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントを含むが、これらに限定されない。脊椎動物細胞で機能する転写調節領域を含むが、これらに限定されない。他の転写調節領域は、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ－グロビンなどの脊椎動物遺伝子由来のものならびに真核生物細胞で遺伝子発現制御ができる他の配列を含む。さらなる適当な転写調節領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導され得るプロモーター)を含む。
同様に、多様な翻訳調節要素は、当業者に知られる。これらは、リボソーム結合部位、翻訳開始および停止コドンおよびピコルナウイルス由来の要素(特にリボソーム内部侵入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称する)を含むが、これらに限定されない。
用語「パーセント配列同一性」、「パーセント同一性」、「配列同一性」または「同一性」は相互交換可能に使用し、２つの配列の最適アラインメントのために導入すべきであった付加または欠失(すなわち、ギャップ)を考慮に入れた、比較ウィンドウにわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間で共有される同一マッチ位置の数をいう。マッチ位置は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列および対照配列両者に存在する、あらゆる位置をいう。標的配列に存在するギャップは、ギャップがヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、カウントしない。同様に、対照配列に存在するギャップは、対照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列ヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるため、カウントされない。
２つの配列間の配列比較およびパーセント同一性決定は、下記非限定的例に記載の数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
配列同一性のパーセンテージは、マッチ位置数を得るために両配列で同一アミノ酸残基または核酸塩基が現れる位置の数を決定し、マッチ位置数を比較ウィンドウにおける総数で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性パーセンテージを得ることにより計算される。２つの配列間の配列比較およびパーセント同一性決定は、オンライン用途およびダウンロード両者で容易に利用可能なソフトウェアを使用して、達成され得る。適当なソフトウェアプログラムは、種々の源からならびに両タンパク質およびヌクレオチド配列のアラインメントのために入手可能である。パーセント配列同一性決定のための適当なプログラムの一つは、U.S. government's National Center for Biotechnology Information BLAST web site (blast.ncbi.nlm.nih.gov)から入手可能なＢＬＡＳＴプログラム集の一部であるbl2seqである。bl2seqは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用した、２配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に使用される。他の適当なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティックプログラム集の一部であり、European Bioinformatics Institute (EBI) at www.ebi.ac.uk/Tools/psaからも入手可能なNeedle, Stretcher, WaterまたはMatcherである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド対照配列とアラインした単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の種々の領域が、各々それ自体のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は１／１０の桁で四捨五入していることは注意すべきである。例えば、８０.１１、８０.１２、８０.１３および８０.１４は８０.１に切り捨て、８０.１５、８０.１６、８０.１７、８０.１８および８０.１９は８０.２に切り上げる。長さ値は常に整数であることも注意すべきである。
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(worldwideweb.gcg.comで入手可能)のＧＡＰプログラムで、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して、決定できる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に入れられているE. Meyers and W. Miller(CABIOS, 4: 11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定できる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)のＧＡＰプログラムに入れられているNeedleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して、決定され得る。
ここに記載する核酸およびタンパク質配列は、さらに、例えば、関連配列同定のための、公開のデータベースに対するサーチを実施するための「クエリー配列」として使用され得る。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、単語長＝１２を使用して実施し、ここに記載する核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチサーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、単語長＝３を使用して実施し、ここに記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でのギャップ付きアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり利用できる。ＢＬＡＳＴおよびGapped BLASTプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータが使用され得る。worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov参照。
核酸は全細胞、細胞ライセートまたは部分的に精製したまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準技術によりの細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸(例えば、染色体の他の部分)またはタンパク質から精製されて離されたとき、「単離された」または「実質的に純粋とされた」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
ここで使用する用語「ベクター」は、それに結合している他の核酸を輸送できる核酸分子をいうことを意図する。ベクターの一つのタイプは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう「プラスミド」である。ベクターの他のタイプはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートされ得る。あるベクターは、導入される宿主細胞で自律複製できる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞ゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと同時に複製され得る。さらに、あるベクターは、操作可能に結合している遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、「組み換え発現ベクター」(または単に、「発現ベクター」)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用性のある発現ベクターはしばしばプラスミドの形である。本明細書で、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、相互交換可能に使用され得る。しかしながら、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの発現ベクターの他の形態も包含する。
ここに使用する用語「インビトロ宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、該細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞をいうことを意図し、組み換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も含むことが理解されるべきである。後代で変異または環境的影響により何らかの修飾が起こり得るので、実際、このような子孫は親細胞と同一ではあり得ないが、なおここに使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。宿主細胞の例は、原核生物細胞(例えば、大腸菌)または代替的に、真核生物細胞、例えば、真菌細胞(例えば、酵母細胞、例えば出芽酵母、ピキア酵母または分裂酵母)および種々の動物細胞、例えば、昆虫細胞(例えば、Ｓｆ－９)または哺乳動物細胞(例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＯＳ－７、ＮＩＨ－３Ｔ３)を含む。
ここで使用する用語「アミノ酸の直ぐに下流」は、アミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置をいう。同様に、用語「アミノ酸の直ぐに上流」は、アミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置をいう。それ故に、ここで使用する用語「挿入部位の２つのアミノ酸間」は、異種部分(例えば、半減期延長部分)が２つの隣接アミノ酸間に挿入されたところの位置をいう。
ここで使用する「投与」は、治療剤を含む組成物の、当業者に知られる種々の方法および送達系の何れかを使用する対象への物理的導入をいう。ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の種々の投与経路は、例えば、注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊椎または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管支、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路で投与し得る。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期でも実施し得る。
「免疫応答」は、当分野でおよび一般に外来因子または異常、例えば、癌細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答をいうと理解され、この応答はこれらの因子およびそれが原因の疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１個以上の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞または肝臓が産生する可溶性巨大分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用が介在し、これは侵入病原体、病原体で感染した細胞または組織、癌または他の異常細胞、または自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の哺乳動物身体での選択的標的化、結合、損傷、破壊および／または排除をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞の活性化または阻害または免疫系の何らかの他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化または阻害を含む。
「免疫調節剤」または「イムノレギュレーター」は、ある薬剤、例えば、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得るシグナル伝達経路の成分を標的とする薬剤をいう。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」は、免疫系細胞またはこのような細胞(例えば、Ｔｈ１細胞などのエフェクターＴ細胞)の活性の何らかの改変をいう。より具体的に、ここで使用する用語「調節」は、ある活性または応答の誘発、阻害、増強、上昇、増加または減少を含む。このような調節は、各種細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少または免疫系内で生じ得る他の何らかの変化により顕在化され得る免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両者の免疫調節剤が同定されており、その一部は腫瘍微小環境で機能が増強されている可能性がある。ある実施態様において、免疫調節剤は、Ｔ細胞表面の分子を標的とする。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、薬剤、部分、化合物または分子による結合の標的とされ、結合により活性が変えられる、分子、例えば、細胞表面分子である。免疫調節性標的は、例えば、細胞表面受容体(「免疫調節性受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節性リガンド」)を含む。
「免疫療法」は、免疫系または免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による、疾患を有するまたはその発症もしくは再発のリスクのある対象の処置をいう。
「免疫刺激性治療」または「免疫刺激治療」は、例えば、癌を処置するための、対象の免疫応答の増加(誘発または増強)をもたらす治療をいう。
「内因性免疫応答増強」は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。この有効性および効力の増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序の克服または内因性宿主免疫応答を増強する機序の刺激により達成され得る。
「Ｔエフェクター」(「Ｔｅｆｆ」)細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞)ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指示するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞、例えば、Ｔｈ１細胞をいうが、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)を含まない。あるここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞およびＴｈ１細胞を活性化する。
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激受容体のアゴニスト活性増強および／または阻害性受容体のアンタゴニスト活性増強によりもたらされ得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイでのＥＣ５０または活性の最大レベル、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性(標的細胞で直接またはＣＤ１０７ａまたはグランザイム検出により間接的に決定)および増殖の変化を測定するアッセイの増加倍率により反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
ここで使用する用語「結合」および「融合」は、それぞれ第二アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有的または非共有的に結合された、第一アミノ酸配列またはヌクレオチド配列をいう。第一アミノ酸またはヌクレオチド配列は、第二アミノ酸またはヌクレオチド配列に直接結合されるかまたは並列されてよく、あるいは介在配列が、第一配列を第二配列に共有結合させてよい。用語「結合」は、Ｃ末端またはＮ末端での第一アミノ酸配列の第二アミノ酸配列への融合だけでなく、第一アミノ酸配列(または第二アミノ酸配列)全体の、第二アミノ酸配列(またはそれぞれ第一アミノ酸配列)における何れかの２アミノ酸への挿入も含む。ある実施態様において、第一アミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーにより第二アミノ酸配列に結合される。第一ヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーにより第二ヌクレオチド配列に結合される。リンカーは、ペプチドまたはポリペプチド(ポリペプチド鎖について)またはヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖(ヌクレオチド鎖について)または何らかの化合物部分(ポリペプチドおよびポリヌクレオチド鎖両者について)であり得る。用語「結合」はハイフン(－)によっても表される。
ここで使用する用語「Ｔ細胞介在応答」は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含むＴ細胞が介在する応答をいう。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞毒性および増殖を含む。
ここで使用する用語「細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答」は、細胞毒性Ｔ細胞により誘導される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋ Ｔ細胞により介在される。
ここで使用する用語「阻害」または「遮断」(例えば、ＩＬ２の細胞のＩＬ２Ｒαへの結合の阻害／遮断に関する)は相互交換可能に使用し、部分的および完全な両者の阻害／遮断を包含する。ある実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ２のＩＬ２Ｒαへの結合を、例えば、ここにさらに記載するとおり決定して、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害する。ある実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ２のＩＬ２Ｒαへの結合を、例えば、ここにさらに記載するとおり決定して、５０％未満、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％阻害する。
ここで使用する用語「腫瘍の増殖阻害」は、腫瘍の増殖のあらゆる測定可能な減少を含み、例えば、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％または１００％の腫瘍の増殖阻害を含む。
ここで使用する「癌」は、体内の異常細胞の制御されない増殖により特徴づけられる広い一群の疾患をいう。制御されない細胞分裂は、隣接組織に侵襲し、リンパ系または血流を介して体の遠位部分に転移し得る、悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
ここで使用する用語「処置」、「処置する」および「治療」は、疾患と関連する症状、合併症、状態または生化学的徴候の進行、進展、重症度または再発の反転、軽減、改善、阻止または減速または予防または全生存期間延長を目的として、対象に行うあらゆるタイプの介入または過程または活性剤の投与をいう。処置は、疾患を有する対象または疾患を有していない対象(例えば、予防目的)に対するものであり得る。予防的に提供されるとき、ここに開示する融合タンパク質は、あらゆる症状の前に提供される。物質の予防投与は、その後の何らかの症状の予防または減弱に役立つ。
融合タンパク質、医薬組成物またはワクチンに関連する「有効性増強」または「免疫原性増強」は、例えば、保護的免疫と関連する融合タンパク質、医薬組成物またはワクチンの活性の特定のパラメータの増加または減少などの、特定の値の変化により測定して、転帰を改善することを意図する。ある実施態様において、増強は、特定のパラメータの少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％を超える増加をいう。他の実施態様において、増強は、特定のパラメータの少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％を超える減少をいう。一例において、ワクチンの有効性／免疫原性増強は、疾患進行阻止または処置に対するワクチンの能力の、その目的のワクチンの有効性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％を超えるような増加をいう。さらなる例において、ワクチンの有効性／免疫原性増強は、既に発展している癌に対する対象の自然防御を漸加するためのワクチンの、その目的の融合タンパク質、医薬組成物またはワクチンの有効性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％を超えるような増加をいう。
同様に、融合タンパク質、医薬組成物またはワクチンに関連する「免疫応答抑制を克服」は、例えば、保護的免疫に関連するワクチンの活性の特定のパラメータにおける以前陽性であった値への回復などの、特定の値の変化により測定して、転帰を改善することを意図する。ある実施態様において、克服は、特定のパラメータの少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％を超える増加をいう。一例において、融合タンパク質、医薬組成物またはワクチンに対する免疫応答抑制を克服は、融合タンパク質、医薬組成物またはワクチンが、疾患進行阻止または処置に対する、その目的のワクチンの有効性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、１００％または１００％を超える再生をいう。
ここで(相互交換可能に)使用する「治療有効量」、「治療用量」、「用量」、「有効用量」、「有効投与量」または「投与量」は、ここに記載する治療目標を達成する用量をいう。ある実施態様において、「治療用量」は、対象における免疫耐容性を誘発する用量をいう。ある実施態様において、「治療用量」は、対象に特定の耐容性期間内、例えば、第一用量の投与１２週間以内に免疫耐容性を誘導する用量をいう。ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の「治療有効量」は、所望の生物学的応答の誘発に十分なＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の量をいう。当業者には認識されるとおり、有効である特定のＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の絶対量は、所望の生物学的エンドポイント、送達されるＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質、標的細胞または組織などの因子により変わり得る。当業者は、有効量を一用量で投与してよくまたは複数回用量(すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の用量)の投与により達成してよいことを理解する。治療剤が疾患退縮を促進するまたは疾患の発症もしくは再発を阻害する能力を、治験中のヒト対象で、ヒトでの有効性を予測する動物モデルでまたはインビトロアッセイで薬剤の活性のアッセイによるなど、通常の技術の実施者に知られる多くの方法を使用して、評価し得る。
ここに使用する用語「処置」または「処置する」は、例えば、疾患または状態の重症度低減；状態経過の期間の短縮；疾患または状態に関連する１以上の症状の改善または排除；疾患または状態の治癒は必ずしも必要とせず、対象における疾患または状態の有益な効果の提供をいう。
例として、抗癌剤は、対象における癌退縮を促進する薬物である。ある実施態様において、治療有効量の薬物は、癌除去の点まで癌退縮を促進する。「癌退縮促進」は、有効量の薬物の、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与が、患者における腫瘍増殖またはサイズ減少、腫瘍壊死、少なくとも一つの疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患罹患による機能障害または能力障害の予防または疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。さらに、処置に関連する用語「有効」および「有効性」は、薬理学的有効性および生理学的安全性両者を含む。薬理学的有効性は、薬物が患者において癌退縮を促進する能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与に起因する、細胞、臓器および／または生物レベル(有害作用)での毒性または他の有害生理学的作用のレベルをいう。
例として、腫瘍の処置のために、治療有効量または投与量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を、未処置対象に比して、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％または少なくとも約８０％阻害する。ある実施態様において、治療有効量または投与量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを使用して、評価され得る。あるいは、組成物のこの性質は、化合物が細胞増殖を阻害する能力の試験により評価でき、このような阻害は、熟練した当業者に知られるアッセイによりインビトロで測定され得る。ここに記載するある実施態様において、腫瘍退縮は、少なくとも約２０日、少なくとも約４０日または少なくとも約６０日の期間観察され、継続し得る。
用語「患者」は、予防または治療処置を受ける、ヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
ここで使用する用語「対象」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに記載する方法および組成物を、癌を有する対象の処置に使用し得る。用語「非ヒト動物」は、全脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
ここでいう用語「体重に基づく」用量または投与は、患者に投与される用量が、患者体重に基づき計算されることを意味する。例えば、体重６０kgの患者が３mg／kgの抗ＩＬ２抗体を必要とするとき、投与のための適切な量のＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質(すなわち、１８０mg)を計算し、使用できる。
ここに記載する方法および投与量に関連する用語「一定用量」は、患者の体重または体表面積(ＢＳＡ)と無関係で患者に投与される用量を意味する。一定用量は、それ故に薬剤(例えば、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質)のmg／kg用量ではなく、絶対量として提供される。例えば、６０kgの人および１００kgの人は、同用量の抗体(例えば、４８０mgのＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質)を受ける。
ここで使用する用語「ug」および「uM」は、それぞれ「μg」および「μM」と相互交換可能に使用される。
ここに記載する種々の態様を、次のサブセクションでさらに詳述する。
免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントまたは領域のアミノ酸ナンバリングに関する記載は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MDに基づく。(ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含む数哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎの配列は知られる(Story et al., J. Exp. Med. 180: 2377 (1994)。)Ｆｃは、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、免疫グロブリンのヒンジ領域を伴いまたは伴わずに含み得る。Ｆｃバリアントの例は、ＷＯ２００４／１０１７４０およびＷＯ２００６／０７４１９９に提供される。
７.３ インターロイキン－２／インターロイキン－２受容体アルファ融合タンパク質
ここに開示されるのは、(ａ)インターロイキン－２(ＩＬ２)ポリペプチドを含む第一ポリペプチド；および(ｂ)インターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドの少なくとも２成分を含む、融合タンパク質である。ある実施態様において、ＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン(配列番号７)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない；および／または(ii)ＩＬ２ポリペプチドは、天然ＩＬ２(配列番号２)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない。ある実施態様において、融合タンパク質はＩＬ２活性を有する。
７.３.１ インターロイキン－２
ある実施態様において、インターロイキン－２(ＩＬ２)を含む第一ポリペプチドと、インフレームに融合したインターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)ポリペプチドの細胞外ドメインを含むまたはそれからなる第二ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２を有するＩＬ２を含む、第一ポリペプチドを含む。ある実施態様において、第一ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドは、特に断らない限り、霊長類(例えば、ヒト)および齧歯類(例えば、マウスおよびラット)および家庭飼育または農業用哺乳動物などの哺乳動物を含む、あらゆる脊椎動物源からの天然または組み換えＩＬ２である。
本発明で有用なＩＬ２ポリペプチドは、融合タンパク質で発現される。ここに記載する融合タンパク質は、ヒトＩＬ２Ｒ、より特に、ヒトＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に特異的に結合する。ある実施態様において、ＩＬ２を含む融合タンパク質はアンタゴニストである。ある実施態様において、ＩＬ２を含む融合タンパク質は、高親和性でヒトＩＬ２Ｒαに結合する。
用語ＩＬ２は、プロセシングされていないＩＬ２および細胞におけるプロセシングに由来するあらゆる形態のＩＬ２(すなわち、ＩＬ２の成熟形態)を含む。本用語はまた、ＩＬ２の天然に存在するバリアントおよびフラグメント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントおよび天然に存在しないバリアントも包含する。ヒトＩＬ２の例示的成熟形態のアミノ酸配列(２０アミノ酸シグナル配列を有する)を、配列番号２に示す。プロセシングされていないヒトＩＬ２はさらにＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチドを含み(配列番号１)、これは成熟ＩＬ２分子にはない。マウスＩＬ２の例示的成熟形態のアミノ酸配列(２０アミノ酸シグナル配列を有する)を、配列番号４に示す。プロセシングされていないマウスＩＬ２はさらにＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチド(配列番号３)を含み、これは成熟ＩＬ２分子にはない。「天然ＩＬ２」は、「野生型ＩＬ２」とも称し、天然に存在するまたは組み換えＩＬ２を意図する。
ＩＬ２のさらなる核酸およびアミノ酸配列は知られる。例えば、GenBank Accession Nos: Q7JFM2(Aotus lemurinus(Gray-bellied night monkey))； Q7JFM5(Aotus nancymaae(Ma's night monkey)); P05016 (Bos taurus(ウシ))； Q29416 (Canis familiaris (イヌ)(Canis lupus familiaris)); P36835(Capra hircus(ヤギ))；およびP37997(Equus caballus(ウマ)参照。
ＩＬ２活性の生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントは、ＩＬ２活性を保持する。ＩＬ２の生物学的活性は、ＩＬ２受容体担持リンパ球を刺激する能力を指称し得る。このような活性は、インビトロおよびインビボ両方で測定され得る。ＩＬ２は免疫活性の包括的レギュレーターであり、ここで見られる効果はそのような活性の総和である。例えば、生存活性(Ｂｃｌ－２)を制御し、Ｔエフェクター活性(ＩＦＮ－ガンマ、グランザイムＢおよびパーフォリン)を誘発し、Ｔ制御性活性(ＦｏｘＰ３)を促進する。例えば、Malek et al. (2010) Immunity 33(2):153-65参照。
ＩＬ２の生物学的に活性なバリアントは知られている。例えば、ＵＳ出願公開２００６／０２６９５１５および２００６／０１６０１８７およびＷＯ９９／６０１２８参照。
ＩＬ２の生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントを、ここに開示する融合タンパク質に用い得る。このような機能的フラグメントは、配列番号２の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。あるいは、機能的バリアントは、配列番号２に示す配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含み得る。
ＩＬ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの活性バリアントおよびフラグメントがさらに提供される。このようなポリヌクレオチドは、配列番号２をコードするポリペプチドの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００連続ヌクレオチドを含んでよく、ＩＬ２活性を有するタンパク質をコードし続ける。あるいは、機能的ポリヌクレオチドは、配列番号２に示すアミノ酸をコードするポリペプチドと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含んでよく、機能的ＩＬ２ポリペプチドをコードを維持する。
ＩＬ２のポリペプチド配列例を、下表１に示す。

ある実施態様において、ここに提供する融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン内に少なくとも一つの変異を含み得る。ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドは、天然ＩＬ２(配列番号２)と比較して、グリコシル化部位が少なくとも一つ少ない。ある実施態様において、少なくとも一つ少ないグリコシル化部位は、グリコシル化を除く１以上の変異による。
他の実施態様において、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有しないアミノ酸でのグリコシル化部位を有するアミノ酸の置換である、変異を含む。ある実施態様において、変異は、Ｏ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を除去する。ある実施態様において、変異は、Ｏ－グリコシル化、例えば、配列番号２のアミノ酸３のスレオニンを除去する。他の実施態様において、変異は、Ｎ－グリコシル化を除去する。
ある実施態様において、変異は、ＩＬ２におけるグリコシル化されるアミノ酸のグリコシル化されないアミノ酸での１以上の置換である。ある実施態様において、変異は、ＩＬ２の近くのアミノ酸のグリコシル化を可能とするアミノ酸の近くのアミノ酸のグリコシル化を可能としないアミノ酸での１以上の置換である。
ある実施態様において、ＩＬ２のアミノ酸の１以上の置換は、アラニンから、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換である。
ある実施態様において、ＩＬ２のアミノ酸の１以上の置換は、スレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換である。
ある実施態様において、ＩＬ２のアミノ酸の１以上の置換は、反応性アミノ酸、例えば、システインから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、システインからセリンへの置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、システインからアラニンへの置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、システインからバリンへの置換である。
ある実施態様において、１以上の置換は、配列番号２と対応させて比較して、ＩＬ２のアミノ酸Ｔ３である。
ある実施態様において、置換の一つは、配列番号２のアミノ酸Ｃ１２５である。特定の実施態様において、アミノ酸Ｃ１２５での置換は、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５ＡおよびＣ１２５Ｖからなる群から選択される。
ある実施態様において、変異は欠失である。特に実施態様、欠失は配列番号２のアミノ酸Ａ１である。
本発明はまたＩＬ２ポリペプチドのあらゆる他の変異も含む。他の実施態様において、変異は、ＩＬ２の性質を改善するＩＬ２活性を改善する、例えば、ＩＬ２の半減期を改善する、安定性を改善するなどなどの１以上の置換も含む。
このセクションの下に記載するとおり、ここでいう変異は、配列番号２のアミノ酸位置に対する変異である。本発明により、下記変異の何れも、単独でまたは他に開示された変異もしくは当分野で知られる何れかと組み合わせて、ここに記載するＩＬ２融合タンパク質の１以上に使用される。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Carmenate et al., J Immunol, 200 (10) 3475-3484 (2018)および／またはＵＳ８,７５９,４８６に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｑ２２、Ｑ１２６、Ｉ１２９、Ｓ１３０またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｑ２２Ｖ、Ｑ１２６Ａ、Ｉ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｇまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ８,７５９,４８６Ｂ２に開示の、Ｌ１８Ｎ、Ｑ１２６ＹおよびＳ１３０Ｒの１以上の変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ８,７５９,４８６Ｂ２に開示の、Ｑ１３Ｙ、Ｑ１２６Ｙ、Ｉ１２９ＤおよびＳ１３０Ｒの１以上の変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＷＯ２０１８／０９１００３Ａ１に開示の、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５ＤおよびＫ３５Ｑの１以上の変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Epstein et al. Blood, 101(12):4853-61](2003)および／またはＵＳ７,３７１,３７１に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｒ３８、例えば、Ｒ３８Ｗを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＩＬ２に開示のとおり、Ｒ３８Ｗの変異およびアミノ酸位置２２～５８以外の１以上の変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および/またはＵＳ８,９０６,３５６に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基９１、１２６または両者、例えば、Ｖ９１Ｒ、Ｑ１２６Ｔまたは両者を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)およびまたＵＳ８,９０６,３５６に開示のＥ１５Ｗの変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)およびまたＵＳ８,９０６,３５６に開示のＮ８８ＲおよびＶ９１Ｒの一方または両者の変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／またはＵＳ８,９０６,３５６に開示のＱ１２６ＴまたはＱ１２６Ｉの変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ８,９０６,３５６Ｂ２に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸６９、７４、９１、１２６またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、変異は、ＵＳ８,９０６,３５６Ｂ２に開示のＶ９１Ｒ、Ｑ１２６Ｔ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２７Ｔまたはこれらの何れかの組み合わせである。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／またはＵＳ７,５６９,２１５Ｂ２に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｅ１５、Ｎ３０、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｓ７５、Ｎ９０またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｓ７５Ｐ、Ｎ９０Ｈまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. Biochemistry, Vol. 44, No. 31 (2005)に開示のＥ１５Ｗの変異を含む。ある実施態様において、変異は、ＵＳ７,５６９,２１５Ｂ２に開示のＶ６９Ａである。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／またはＵＳ７,９５１,３６０Ｂ２に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｎ２９、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｎ８８Ｄまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. Biochemistry, Vol. 44, No. 31 (2005)に開示のＥ１５Ｗの変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)および／またはＵＳ８,３４９,３１１Ｂ２に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸６９、７４、１２８またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｖ６９Ａ、Ｉ１２８Ｐまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｓ４、Ｔ１０、Ｑ１１、Ｖ６９、Ｎ８８、Ｔ１３３またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｔ１３３Ａまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｎ３０、Ｖ６９、Ｉ１２８またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｉ１２８Ｔまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Wittrup et al. J Immunother. 32(9):887-94 (2009)に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｋ８、Ｑ１３、Ｎ２６、Ｎ３０、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｖ６９またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、Shanafelt et al., Nat Biotechnol., 18(11):1197-202 (2000)に開示の１以上の変異、例えば、アミノ酸残基Ｎ８８、例えば、Ｎ８８Ｒを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,６１６,１０５Ｂ２に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸２０、８８、１２６またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８ＧまたはＮ８８Ｉを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,６１６,１０５Ｂ２に開示のＮ８８Ｒ、Ｎ８８ＧまたはＮ８８Ｉの変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,６１６,１０５Ｂ２に開示のＤ２０Ｈ、Ｄ２０ＩまたはＤ２０Ｙの変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,６１６,１０５Ｂ２に開示のＱ１２６Ｌの変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ２０１８／０１２５９４１Ａ１に開示の１以上の変異：例えば、Ｄ２０Ｈ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ２０１８／００３７６２４Ａ１に開示の、Ｔ３Ａ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｈ、Ｃ１２５Ｓ、Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆの１以上の変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ２０１７／０３２７５５５Ａ１に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｎ８８、Ｄ２０、Ｃ１２５、Ｑ１２６またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｄ２０Ｈ、Ｃ１２５Ｓ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＷＯ２０１６／０２５３８５Ａ１に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｄ１０９、Ｃ１２５または両者、例えば、Ｄ１０９Ｃ、Ｃ１２５Ｓまたは両者を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＷＯ２０１６／０２５３８５Ａ１に開示の１以上の変異：例えば；アミノ酸残基Ｄ２０、Ｎ８８、Ｑ１２６、Ｃ１２５、Ｑ１２６またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｄ２０Ｈ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｑ１２６Ｌ、Ｃ１２５Ｓ、Ｑ１２６Ｆまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＷＯ２０１６／１６４９３７Ａ１に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｌ１２、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｍ２３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｅ９５またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｅ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｅ９５Ｇまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,９３２,３８０Ｂ２またはＵＳ９,５８０,４８６に開示の１以上の変異：例えば、アミノ酸残基Ｖ９１、例えば、Ｖ９１Ｋを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、さらにＣ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓの変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、さらにＴ３の変異を含む。ある実施態様において、Ｔ３の変異は、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｎの一つである。ある実施態様において、ＩＬ２は、Ｓ５の変異を含む。ある実施態様において、変異はＳ５Ｔである。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,７３２,１３４Ｂ２に開示の１以上の変異：例えば、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５またはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ２０１５／０２１８２６０Ａ１に開示の１以上の変異：例えば、Ｎ８８Ｄを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、ＵＳ９,２６６,９３８Ｂ２に開示の変異：例えば、アミノ酸４２、４５、７２またはこれらの何れかの組み合わせ、例えば、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲまたはＬ７２Ｋを含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２ＲおよびＦ４２Ｋの変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ２は、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５ＲおよびＹ４５Ｋの変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ２は、１～４変異：Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲまたはＬ７２Ｋの第一変異、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２ＲまたはＦ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５ＲまたはＹ４５Ｋの第二変異、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３ＫまたはＴ３Ｐの第三変異および／またはＣ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５ＴまたはＣ１２５Ｖの第四変異を含む。ここに挙げるまたはここで引用する特許、特許公開もしくは何らかの他の引用文献に開示の変異は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
７.３.２ インターロイキン－２受容体アルファ
融合タンパク質は、インターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)の細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインは、配列番号７として示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、第二ポリペプチドは、配列番号７に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ここで使用する用語「ＣＤ２５」または「ＩＬ２受容体ａ」、「ＩＬ２Ｒα」、「ＩＬ２Ｒａ」、「ＩＬ２－Ｒα」および「ＩＬ２－Ｒａ」は、特に断らない限り、霊長類(例えば、ヒト)および齧歯類(例えば、マウスおよびラット)および家庭飼育または農業用哺乳動物などの哺乳動物を含む、あらゆる脊椎動物からのあらゆる天然または組み換えＩＬ２Ｒαをいう。本用語はまた、ＩＬ２Ｒαの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントまたは天然に存在しないバリアントも包含する。ヒトＩＬ２は、その受容体系、ＩＬ２Ｒを介するシグナル伝達により生物学的効果を発揮する。ＩＬ２およびその受容体(ＩＬ２Ｒ)は、Ｔ細胞増殖および免疫応答に重要な他の基本的な機能に必要である。ＩＬ２Ｒは、アルファ(ｐ５５)、ベータ(ｐ７５)およびガンマ(ｐ６５)鎖である３つの非共有性に結合したＩ型膜貫通タンパク質からなる。ヒトＩＬ２Ｒアルファ鎖は、２１９アミノ酸の細胞外ドメイン、１９アミノ酸の膜貫通ドメインおよび１３アミノ酸の細胞内ドメインからなる。ＩＬ２Ｒアルファの分泌細胞外ドメイン(ＩＬ２Ｒα)を、ここに記載する融合タンパク質に用い得る。
ヒトＩＬ２Ｒαの例示的成熟形態のアミノ酸配列を、配列番号６に示す。プロセシングされていないヒトＩＬ２Ｒαを、配列番号５に示す。配列番号５および／または配列番号６の細胞外ドメインを配列番号７に示す。マウスＩＬ２Ｒαの例示的成熟形態のアミノ酸配列を、配列番号９に示す。プロセシングされていないマウスＩＬ２Ｒαを、配列番号８に示す。配列番号８および／または配列番号９の細胞外ドメインを配列番号１０に示す。「天然ＩＬ２Ｒα」、または「野生型ＩＬ２Ｒα」とも称するが、天然に存在するまたは組み換えＩＬ２Ｒαを意味する。
ＩＬ２Ｒαの核酸およびアミノ酸配列は知られている。例えば、GenBank Accession Nos: NP_001030597.1 (P. troglodytes); NP_001028089.1 (M. mulatta); NM_001003211.1 (C. lupus); NP_776783.1 (B. taurus); NP_032393.3 (M. musculus);およびNP_037295.1 (R. norvegicus)参照。
ここで使用するＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインは、特に断らない限り、ＩＬ２への結合での通常の役割における機能的ＩＬ２Ｒα細胞外ドメインをいう。用語ＩＬ２Ｒα ＥＣドメインは、ＩＬ２結合で完全長野生型ＩＬ２Ｒα ＥＣの機能を保持するその機能的フラグメント、バリアント、アナログまたは誘導体を含む。ＩＬ２Ｒα ＥＣドメインは、ヒト、ブタ、イヌ、ラットまたはマウスＩＬ２Ｒα ＥＣドメインであり得る。用語「ＩＬ２Ｒα ＥＣドメインの生物学的活性」は、ＩＬ２受容体応答性細胞における細胞内シグナル伝達増強を含むが、これに限定されない、ＩＬ２ＲαのＥＣドメインの生物学的活性の１以上をいう。ＩＬ２Ｒα ＥＣドメインの生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントの非限定的例は、例えば、Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5654-5658, 1988に記載される。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２Ｒα ＥＣドメインの生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインと比較して、少なくとも一つ少ないグリコシル化を含む。
ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインの生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントを、ここに開示する融合タンパク質に用い得る。このような機能的フラグメントは、配列番号７の細胞外ドメインの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２１５またはそれより多いアミノ酸を含む。あるいは、機能的バリアントは、配列番号７に示す配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含み得る。
ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの活性バリアントおよびフラグメントがさらに提供される。このようなポリヌクレオチドは、配列番号７をコードするポリペプチドの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００またはそれより多いヌクレオチドを含んでよく、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン活性を有するタンパク質のコードを維持する。あるいは、機能的ポリヌクレオチドは、配列番号７に示すアミノ酸のコードするポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含んでよく、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン活性を有するタンパク質のコードを維持する。
ＩＬ２Ｒαのポリペプチド配列を表２に示す。

ある実施態様において、ここに提供する融合タンパク質は、ＩＬ２ＲαのＥＣドメイン内に少なくとも一つの変異を含み得る。
ある実施態様において、ＩＬ２ＲαのＥＣドメインポリペプチドは、天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメイン(配列番号７)に比して、グリコシル化が少なくとも一つ少ない、グリコシル化が少なくとも二つ少ない、グリコシル化が少なくとも三つ少ない、グリコシル化が少なくとも四つ少ない、グリコシル化が少なくとも五つ少ない、グリコシル化が少なくとも六つ少ない、グリコシル化が少なくとも七つ少ない、グリコシル化が少なくとも八つ少ないまたはグリコシル化が少なくとも九つ少ない。
ある実施態様において、グリコシル化が少なくとも一つ少ないＩＬ２ＲαのＥＣドメインポリペプチドは、グリコシル化を除去する変異を含む。他の実施態様において、融合タンパク質は、グリコシル化部位を有しないアミノ酸でのグリコシル化部位を有するアミノ酸の置換である、変異を含む。ある実施態様において、変異は、Ｏ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を除去する。ある実施態様において、変異は、Ｏ－グリコシル化を除去する。他の実施態様において、変異は、Ｎ－グリコシル化を除去する。
ある実施態様において、融合タンパク質の変異は、ＩＬ２ＲαのＣ末端の欠失を含む。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１６７～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１６８～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１６９～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７０～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７１～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７２～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７３～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７４～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７５～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７６～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７７～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７８～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１７９～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８０～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８１～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８２～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８３～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８４～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８５～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８６～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８７～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８８～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１８９～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１９０～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１９１～２１９の欠失である。ある実施態様において、変異は配列番号７のアミノ酸１９２～２１９の欠失である。
ある実施態様において、変異は、配列番号７に対応する、１６７、１６８、１６９または１７１乃至１９２～２１９のアミノ酸の欠失である。ある実施態様において、変異は、配列番号７に対応する１７０～２１９の欠失を含まない。
ある実施態様において、第二ポリペプチドは、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。他の実施態様において、第二ポリペプチドは、配列番号１１および＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４または＋２５アミノ酸を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。ある実施態様において、第二ポリペプチドは、配列番号１１とさらに２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。ある実施態様において、第二ポリペプチドは、配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。
ある実施態様において、融合タンパク質は１以上の変異を含む。ある実施態様において、１以上の変異は、グリコシル化されるＩＬ２Ｒαのアミノ酸のグリコシル化されないアミノ酸での１以上の置換である。
ある実施態様において、ＩＬ２Ｒαのアミノ酸の１以上の置換は、アミノ酸Ｎ４９、アミノ酸Ｎ６８、アミノ酸Ｔ７４、アミノ酸Ｔ８５、アミノ酸Ｔ１９７、アミノ酸Ｔ２０３、アミノ酸Ｔ２０８およびアミノ酸Ｔ２１６またはこれらの何れかの組み合わせであり、ここで、アミノ酸位置は配列番号７に対応する。
ある実施態様において、１以上の置換は、アスパラギンから他のアミノ酸への置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、アスパラギンから、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換である。
ある実施態様において、１以上の置換は、スレオニンから他のアミノ酸への置換である。ある実施態様において、１以上の置換は、スレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換である。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｎ４９である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｎ４９は、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｎ６８である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｎ６８は、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｔ７４である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｔ７４は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｔ８５である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｔ８５は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｔ１９７である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｔ１９７は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｔ２０３である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｔ２０３は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｔ２０８である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｔ２０８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７のアミノ酸Ｔ２１６である。ある実施態様において、配列番号７のアミノ酸Ｔ２１６は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、融合タンパク質は１以上の変異を含む。ある実施態様において、１以上の変異は、ＩＬ２Ｒαのアミノ酸の近くのアミノ酸のグリコシル化を可能とするアミノ酸の近くのアミノ酸のグリコシル化を可能としないアミノ酸での１以上の置換である。
ある実施態様において、置換はアミノ酸５０、アミノ酸５１、アミノ酸Ｔ６９、アミノ酸Ｔ７０、アミノ酸Ｃ１９２またはこれらの何れかの組み合わせであり、ここで、アミノ酸位置は配列番号７に対応する。
ある実施態様において、置換は、配列番号７に対応するアミノ酸５０である。ある実施態様において、配列番号７に対応するアミノ酸５０はプロリンに変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７に対応するアミノ酸５１である。ある実施態様において、配列番号７に対応するアミノ酸５１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７に対応するアミノ酸Ｔ６９である。ある実施態様において、配列番号７に対応するアミノ酸Ｔ６９はプロリンに変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７に対応するアミノ酸Ｔ７０である。ある実施態様において、配列番号７に対応するアミノ酸Ｔ７０は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
ある実施態様において、置換は、配列番号７に対応するアミノ酸Ｃ１９２である。ある実施態様において、配列番号７に対応するアミノ酸Ｃ１９２は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸に変異される。
７.３.３ リンカー
発明の融合タンパク質はさらにリンカーを含み得る。ある実施態様において、リンカーは、第一ポリペプチドを第二ポリペプチドにＮ末端からＣ末端で、例えば、Ｎ－ＩＬ２－リンカー－ＩＬ２Ｒα ＥＣ－Ｃで結合させ得る。他の実施態様において、リンカーは、第二ポリペプチドを第一ポリペプチドにＮ末端からＣ末端で、例えば、Ｎ－ＩＬ２Ｒα ＥＣ－リンカー－ＩＬ２－Ｃで結合させ得る。
ある実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ２ポリペプチドとＩＬ２Ｒαポリペプチドの間に位置するリンカー配列を含む。リンカーは如何なる長さであってよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０または６０またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。他の実施態様において、本発明で有用なリンカーは、少なくとも一つアミノ酸および１００未満のアミノ酸、９０未満のアミノ酸、８０未満のアミノ酸、７０未満のアミノ酸、６０未満のアミノ酸、５０未満のアミノ酸、４０未満のアミノ酸、３０未満のアミノ酸、２０未満のアミノ酸、１９未満のアミノ酸、１８未満のアミノ酸、１７未満のアミノ酸、１６未満のアミノ酸、１５未満のアミノ酸、１４未満のアミノ酸、１３未満のアミノ酸または１２未満のアミノ酸を含み得る。ある実施態様において、リンカー配列はグリシンアミノ酸残基を含む。他の例において、リンカー配列グリシンとセリンアミノ酸残基の組み合わせを含む。
ある実施態様において、融合タンパク質は、第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの間をインフレームで融合させるリンカーを含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、グリシン／セリンリンカーであるリンカーを含む。このようなグリシン／セリンリンカーは、ペプチドＧＧＧＳ(配列番号１７４)またはＧＧＧＧＳ(配列番号７２)またはこれら記載のペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の反復を含むこの反復を含むが、これらに限定されないアミノ酸残基を含む。ここに開示するグリシン／セリンリンカーは(ＧＳ)ｎ、(ＧＧＳ)ｎ、(ＧＧＧＳ)ｎ、(ＧＧＧＧＳ)ｎまたは(ＧＧＧＧＳ)ｎのアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の整数である。特定の実施態様において、リンカー配列は、GGGSGGGSGGGS(配列番号７１)((Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)３とも示す)を含む。他の実施態様において、リンカー配列は、GGGSGGGSGGGSGGGS(配列番号７４)((Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)４とも示す)を含む。他の実施態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)５(GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS)(配列番号７５)、(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)６(GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS)(配列番号７６)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)７(GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS)(配列番号７７)の一つを含む。他の実施態様において、リンカー配列は、配列番号７８に示す(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(GGGGSGGGGSGGGGS)を含む。さらなる実施態様において、リンカー配列は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号７９)((Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４とも示す)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号８０)((Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)５とも示す)；(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)２(GGGGSGGGGS)(配列番号８１)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)１(GGGGS)(配列番号８２)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)６(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号８３)；(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)７(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号９７)；または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)５(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号８４)を含む。
７.３.４ 異種部分
本発明の融合タンパク質は、さらなる要素、例えば、異種部分をさらに含み得る。このような要素は、融合タンパク質発現を助ける、融合タンパク質分泌を助ける、融合タンパク質の安定性を改善する、タンパク質のより効率的精製を可能とするおよび／または融合タンパク質の活性を調節することができる。ある実施態様において、異種部分はポリペプチド部分である。他の実施態様において、異種部分は非ポリペプチド部分である。
ある実施態様において、融合タンパク質は、第一ポリペプチドに融合した異種部分を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、第二ポリペプチドに融合した異種部分を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドに融合した異種部分を含む。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は１以上のさらなる異種部分を含む。ある実施態様において、異種部分は半減期延長部分である。ある実施態様において、異種部分は、アルブミン、免疫グロブリン定常領域またはその一部、免疫グロブリン結合ポリペプチド、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)、アルブミン結合ポリペプチド(ＡＢＰ)、PASylation部分、HESylation部分、ＸＴＥＮ、ペグ化部分、Ｆｃ領域およびこれらの何れかの組み合わせを含む。
１) 免疫グロブリン定常領域またはその一部
免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ(定常重)ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２など)と称されるドメインからなる。アイソタイプ(すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ)によって、定常領域は３または４ＣＨドメインからなる。一部アイソタイプ(例えばＩｇＧ)定常領域はヒンジ領域も含む。Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y参照。
本発明の融合タンパク質を製造するための免疫グロブリン定常領域またはその一部は、多くの種々の起源から得ることができる。好ましい実施態様において、免疫グロブリン定常領域またはその一部はヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、例えば、齧歯類(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、マカク)種を含む、他の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることは理解される。さらに、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むあらゆる免疫グロブリンクラスおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ある実施態様において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
多様な免疫グロブリン定常領域遺伝子配列(例えばヒト定常領域遺伝子配列)は、公開されたアクセス可能な寄託機関から利用可能である。特定のエフェクター機能を有する(または特定のエフェクター機能を欠く)または免疫原性を低減する特定の修飾がされた定常領域ドメイン配列が選択され得る。抗体および抗体コード化遺伝子の多くの配列が公開されており、適当なＩｇ定常領域配列(例えばヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３配列またはその一部)が、当分野で認識されている技術を使用して、これらの配列からもたらされ得る。前記方法の何れかを使用して得た遺伝物質を、その後改変するかまたは合成して、本発明のポリペプチドを得ることができる。さらに、本発明の範囲は定常領域ＤＮＡ配列のアレル、バリアントおよび変異を包含することは認識される。
免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列を、例えば、目的ドメインの増幅のために選択される、ポリメラーゼ連鎖反応およびプライマーを使用して、クローン化できる。免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列を抗体からクローン化するために、ｍＲＮＡをハイブリドーマ、脾臓またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写し、抗体遺伝子をＰＣＲにより増幅し得る。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許４,６８３,１９５；４,６８３,２０２；４,８００,１５９；４,９６５,１８８；および、例えば、“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270)に詳述される。ＰＣＲを、コンセンサス定常領域プライマーまたは公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーにより開始し得る。上記のとおり、ＰＣＲを、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローン単離のためにも使用し得る。この場合、ライブラリーをコンセンサプライマーまたは大型相同プローブ、例えばマウス定常領域プローブを使用して、スクリーニングし得る。抗体遺伝子増幅に適する多数のプライマーセットが当分野で知られる(例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー(Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509)；ｃＤＮＡ末端迅速増幅(Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33)；抗体リーダー配列(Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250)。抗体配列のクローニングは、１９９５年１月２５日出願、Newman et al.、米国特許５,６５８,５７０にさらに詳述される。
ここで使用する免疫グロブリン定常領域は、全ドメインおよびヒンジ領域またはその一部を含み得る。ある実施態様において、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。
ここで使用する用語「Ｆｃ領域」は、天然免疫グロブリンのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分、すなわち、その２つの重鎖の各Ｆｃドメインのダイマー結合により形成されるとして定義される。天然Ｆｃ領域は、他のＦｃ領域とホモダイマーを形成する。
ある実施態様において、「Ｆｃ領域」は、パパイン開裂部位(すなわち、重鎖定常領域の第一残基を１１４として、ＩｇＧにおける残基２１６)の直ぐ上流のヒンジ領域から始まり、抗体のＣ末端で終わる、単一免疫グロブリン重鎖の部分をいう。従って、完全Ｆｃドメインは少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
免疫グロブリン定常領域のＦｃ領域は、免疫グロブリンアイソタイプによって、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインならびにヒンジ領域を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質は安定性増加、血清半減期延長(Capon et al., 1989, Nature 337:525参照)ならびに新生児Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)などのＦｃ受容体への結合(米国特許６,０８６,８７５、６,４８５,７２６、６,０３０,６１３；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１)を含む、いくつかの望ましい性質を融合タンパク質に付与する。
ある実施態様において、「Ｆｃ領域」は、ＦｃドメインのまたはＦｃドメイン由来のアミノ酸配列をいう。ある実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒンジ(例えば、上部、中部および／または下部ヒンジ領域)ドメイン(ＥＵナンバリングにより抗体のアミノ酸約２１６～２３０)、ＣＨ２ドメイン(ＥＵナンバリングにより抗体のアミノ酸凡そ２３１～３４０)、ＣＨ３ドメイン(ＥＵナンバリングにより抗体のアミノ酸約３４１～４３８)、ＣＨ４ドメインまたはそのバリアント、一部もしくはフラグメントの少なくとも一つを含む。他の実施態様において、Ｆｃ領域は、完全Ｆｃドメイン(すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン)を含む。ある実施態様において、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合した(またはその一部)、ＣＨ２ドメイン(またはその一部)に融合したヒンジドメイン(またはその一部)、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したＣＨ２ドメイン(またはその一部)、ヒンジドメイン(またはその一部)およびＣＨ３ドメイン(またはその一部)両者に融合したＣＨ２ドメイン(またはその一部)を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部(例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部)を欠く。特定の実施態様において、Ｆｃ領域は、ＥＵ番号２２１～４４７に対応するアミノ酸を含むまたはそれからなる。
ここでＦ、Ｆ１またはＦ２と称するＦｃドメインは、多くの種々の源から得ることができる。ある実施態様において、ポリペプチドのＦｃ領域はヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Ｆｃ領域は、例えば、齧歯類(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、マカク)種を含む、他の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることも理解される。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むあらゆる免疫グロブリンクラスおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。他の実施態様において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、該野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ領域により付与される少なくとも一つのエフェクター機能(例えば、Ｆｃ領域がＦｃ受容体(例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIまたはＦｃγＲIII)または補体タンパク質(例えばＣ１ｑ)に結合する能力または抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、食作用または補体依存性細胞傷害(ＣＤＣＣ)を誘発する能力の改善または低減)を変化させる。他の実施態様において、Ｆｃバリアントは、エンジニアリングされたシステイン残基を提供する。
本発明のＦｃ領域は、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合を変化(例えば、増強または低減)させることが知られる、当分野で認識されるＦｃバリアントを用い得る。特に、本発明の結合分子は、国際ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許公開ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３１３２９、ＵＳ２００７／０２３７７６５、ＵＳ２００７／０２３７７６６、ＵＳ２００７／０２３７７６７、ＵＳ２００７／０２４３１８８、ＵＳ２００７０２４８６０３、ＵＳ２００７０２８６８５９、ＵＳ２００８００５７０５６；または米国特許５,６４８,２６０；５,７３９,２７７；５,８３４,２５０；５,８６９,０４６；６,０９６,８７１；６,１２１,０２２；６,１９４,５５１；６,２４２,１９５；６,２７７,３７５；６,５２８,６２４；６,５３８,１２４；６,７３７,０５６；６,８２１,５０５；６,９９８,２５３；７,０８３,７８４；７,４０４,９５６および７,３１７,０９１に開示のアミノ酸位置の１以上に、例えば、変化(例えば、置換)を含み得る。ある実施態様において、特定の変化(例えば、文献に開示アミノ酸の１以上の特定の置換)を、開示されるアミノ酸位置の１以上で行い得る。他の実施態様において、開示されるアミノ酸位置の１以上での種々の変化(例えば、文献に開示の１以上のアミノ酸位置での種々の置換)をなし得る。
ＩｇＧのＦｃ領域を、Ｆｃ受容体により結合される修飾ＩｇＧまたはＦｃフラグメントまたはその一部を得るために、部位特異的変異導入などの十分に認識されている方法により修飾し得る。このような修飾は、Ｆｃ受容体への結合を保持するかまたは増強する、Ｆｃ受容体接触部位から遠位の修飾および接触部位内の修飾を含む。例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ(Ｆｃ γ１)における次のＰ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４ＡおよびＫ４４７Ａの単一アミノ酸残基を、Ｆｃ受容体に対するＦｃ結合親和性を顕著に損なうことなく、置換でき、ここで、例えばＰ２３８Ａは、２３８位での野生型プロリンがアラニンに置換されたことを表す。例として、特定の実施態様は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を除去するＮ２９７Ａ変異を含む。アラニンに加えて、他のアミノ酸を、上に特定した位置で野生型アミノ酸について置換し得る。変異は、天然Ｆｃと異なる１００を超えるＦｃ領域を生じるように、Ｆｃに導入され得る。さらに、これら個々の変異の２、３またはそれ以上の組み合わせを、数百を超えるＦｃ領域を生じるように共に導入し得る。さらに、本発明の構築物のＦｃ領域の一つを変異してよく、構築物の他のＦｃ領域は全く変異させないまたは両者を変異させ得るが、異なる変異である。
上記変異の一部は、Ｆｃ領域に新規機能性を付与し得る。例えば、ある実施態様は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を除去するＮ２９７Ａを含む。この変異の効果は免疫原性の減少であり、それにより親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域の循環半減期を延長し、Ｆｃ領域をＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢおよびＦｃγＲIIIＡに結合不可能とする(Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591)。上記変異に起因する新規機能性のさらなる例として、Ｆｃ受容体への親和性が、ある場合、野生型を超えて、増加され得る。この親和性増加は、「オン」速度増加、「オフ」速度減少または「オン」速度増加と「オフ」速度減少両者により反映される。Ｆｃ受容体への親和性増加を与えると考えられる変異の例は、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを含むが、これらに限定されない(Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)。
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマ受容体が、下部ヒンジ領域、一般にアミノ酸２３４～２３７内のＩｇＧの結合部位を認識すると考えられる。それ故に、新規機能性および免疫原性の減少の可能性の他の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１アミノ酸２３３～２３６「ＥＬＬＧ」のＩｇＧ２からの対応する配列「ＰＶＡ」(１アミノ酸欠失を伴う)への置換による、この領域の変異に起因し得る。種々のエフェクター機能に介在するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIが、このような変異が導入されたとき、ＩｇＧ１に結合しないことが示されている。Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77およびArmour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613。
ある実施態様において、免疫グロブリン定常領域またはその一部、例えば、Ｆｃ領域は、配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ(配列番号９８)を含み、所望によりＨＱＳＬＧＴＱ(配列番号９３)、ＨＱＮＬＳＤＧＫ(配列番号９４)、ＨＱＮＩＳＤＧＫ(配列番号９５)またはＶＩＳＳＨＬＧＱ(配列番号９６)から選択される配列をさらに含むポリペプチドである(米国特許５,７３９,２７７)。
ある実施態様において、免疫グロブリン定常領域またはその一部はヘミグリコシル化されている。例えば、２つのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む融合タンパク質は第一、グリコシル化、Ｆｃ領域(例えば、グリコシル化ＣＨ２領域)および第二、アグリコシル化、Ｆｃ領域(例えば、アグリコシル化ＣＨ２領域)を含み得る。ある実施態様において、リンカーは、グリコシル化とアグリコシル化Ｆｃ領域の間に挿入され得る。他の実施態様において、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは完全グリコシル化、すなわち、Ｆｃ領域の全てがグリコシル化されている。他の実施態様において、Ｆｃ領域はアグリコシル化であってよく、すなわち、Ｆｃ部分の何れもグリコシル化されていない。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその一部(例えば、Ｆｃバリアント)にアミノ酸置換を含み、これは、Ｉｇ定常領域の抗原非依存的エフェクター機能、特にタンパク質の循環半減期を変える。
このようなタンパク質は、これらの置換がないタンパク質と比較してＦｃ受容体への結合の増加または減少を示し、それ故に、それぞれ血清半減期が延長または短縮する。Ｆｃ受容体への親和性が改善されたＦｃバリアントは、血清半減期が長いことが予測され、このような分子は、例えば、慢性疾患または障害のために、投与ポリペプチドの半減期が長いことが望まれる、哺乳動物の方法の適用に有用である(例えば、米国特許７,３４８,００４、７,４０４,９５６および７,８６２,８２０参照)。対照的に、Ｆｃ受容体結合親和性が減少したＦｃバリアントは、血清半減期が短いことが予測され、このような分子は、短循環時間が有利であり得る、例えば、インビボ診断的造影またはポリペプチドが長期に循環に存在するとき、毒性副作用を有する状況で、例えば、哺乳動物への投与にまた有用である。Ｆｃ受容体結合親和性が減少したＦｃバリアントはまた胎盤を通過する可能性が低く、それ故に、妊婦の疾患または障害処置にも有用である。さらに、低いＦｃ受容体結合親和性が望まれ得る他の適用は、脳、腎臓および／または肝臓局在化が望まれるときを含む。ある例示的実施態様において、本発明の融合タンパク質は、脈管構造から腎臓糸球体への上皮を通過する輸送の減少が示される。他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、脳から脈管性間隙への血液脳関門(ＢＢＢ)を通過する輸送の減少が示される。ある実施態様において、Ｆｃ受容体結合が改変されたタンパク質は、Ｉｇ定常領域の「Ｆｃ受容体結合ループ」内に１以上のアミノ酸置換を宇ゆする、少なくとも一つのＦｃ領域(例えば、１つまたは２つのＦｃ領域)を含む。Ｆｃ受容体結合ループは、野生型、完全長、Ｆｃ領域のアミノ酸残基２８０～２９９(ＥＵナンバリングによる)からなる。他の実施態様において、Ｆｃ受容体結合親和性が改変された本発明のＩｇ定常領域またはその一部は、次のＥＵ位置２５６、２７７～２８１、２８３～２８８、３０３～３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４(例えば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ)および４３８の何れかに対応するアミノ酸位置に１以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも一つのＦｃ領域を含む。Ｆｃ受容体結合活性を改変したアミノ酸置換の例は、国際ＰＣＴ公開ＷＯ０５／０４７３２７に開示される。
２) アルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアント
ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよび／またはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合した異種部分はアルブミンまたはその機能的フラグメントである。
完全長形態で６０９アミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン(ＨＳＡまたはＨＡ)は、血清浸透圧の相当な部分を担い、また内因性および外因性リガンドの担体として機能する。ここで使用する用語「アルブミン」は、完全長アルブミンまたはその機能的フラグメント、バリアント、誘導体もしくはアナログを含む。
ある実施態様において、融合タンパク質はここに記載するＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインおよびアルブミン、そのフラグメントまたはバリアントを含み、ここで、ＩＬ２ポリペプチドはアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントに結合される。他の実施態様において、融合タンパク質はここに記載するＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインおよびアルブミン、そのフラグメントまたはバリアントを含み、ここで、ＩＬ２Ｒα ＥＣはアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントに結合される。
他の実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合される異種部分はアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントであり、それは、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインの半減期を延長する(または延長する能力がある)。アルブミンまたはフラグメントまたはそのバリアントのさらなる例は、米国公開２００８／０１９４４８１Ａ１、２００８／０００４２０６Ａ１、２００８／０１６１２４３Ａ１、２００８／０２６１８７７Ａ１または２００８／０１５３７５１Ａ１またはＰＣＴ出願公開２００８／０３３４１３Ａ２、２００９／０５８３２２Ａ１または２００７／０２１４９４Ａ２に開示される。
３) アルブミン結合部分
ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合される異種部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体フラグメントまたはこれらの何れかの組み合わせを含むアルブミン結合部分である。例えば、アルブミン結合タンパク質は、ドメイン抗体を含む、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体または抗体フラグメントを含む(米国特許６,６９６,２４５参照)。例えば、アルブミン結合タンパク質は、レンサ球菌プロテインＧの一つなどの細菌アルブミン結合ドメインであり得る(Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83)。共役パートナーとして使用し得るアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、Ｃｙｓ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｃｙｓコンセンサス配列を有するもの(ここで、米国特許出願２００３／００６９３９５またはDennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043)に記載のとおり、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐ；Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ；およびＸａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒである)を有するものである。
４) ＰＡＳ配列
他の実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合される異種部分はＰＡＳ配列である。ある実施態様において、融合タンパク質はここに記載するＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインおよびＰＡＳ配列を含み、ここで、ＩＬ２ポリペプチドおよび／またはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインはＰＡＳ配列に結合される。
ここで使用するＰＡＳ配列は、生理学的条件下で、ランダムコイル二次構造を形成するアミノ酸配列である、主にアラニンおよびセリン残基または主にアラニン、セリンおよびプロリン残基を含む、アミノ酸配列を意味する。従って、ＰＡＳ配列は、融合タンパク質の異種部分の一部として使用され得るアラニン、セリンおよびプロリンを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる、構成要素、アミノ酸ポリマーまたは配列カセットである。さらに、アラニン、セリンおよびプロリン以外の残基がＰＡＳ配列における微量成分として加えられたときも、アミノ酸ポリマーがランダムコイル二次構造を形成し得ることを当業者は認識する。ここで使用する用語「微量成分」は、アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸が、ＰＡＳ配列に、ある程度まで、例えば、約１２％まで、すなわち、１００アミノ酸のＰＡＳ配列の約１２、約１０％まで、すなわち１００アミノ酸のＰＡＳ配列の約１０、約９％まで、すなわち、１００アミノ酸の約９、約８％まで、すなわち、１００アミノ酸の約８、約６％、すなわち、１００アミノ酸の約６、約５％、すなわち、１００アミノ酸の約５、約４％、すなわち、１００アミノ酸の約４、約３％、すなわち、１００アミノ酸の約３、約２％、すなわち、１００アミノ酸の約２、約１％、すなわち、１００アミノ酸の約１で加えられ得ることを意味する。アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選択される。
生理学的条件下、ＰＡＳ配列ストレッチはランダムコイル二次構造を形成し、それによりＩＬ２ポリペプチドのインビボおよび／またはインビトロ安定性増加に介在し得る。ランダムコイルドメインがそれ自体安定な構造または機能を採用しないため、それが融合するＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインが介在する生物学的活性は本質的に保存される。他の実施態様において、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に、血液血漿におけるタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面受容体への結合または内在化に関して生物学的に不活性であるが、なお生分解性であり、これは、ＰＥＧなどの合成ポリマーを超える明らかな利点をもたらす。
ランダムコイル二次構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的例は、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(配列番号８５)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(配列番号８６)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(配列番号８７)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(配列番号８８)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(配列番号８９)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(配列番号９０)およびASAAAPAAASAAASAPSAAA(配列番号９１)またはこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許公開２０１０／０２９２１３０Ａ１およびＰＣＴ出願公開ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１から知られる。
５) ＨＡＰ配列
ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合される異種部分は、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー(ＨＡＰ)である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸または５００アミノ酸長を有する、グリシンの反復配列を含み得る。ある実施態様において、ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合または結合した部分の半減期を延長する能力がある。ＨＡＰ配列の非限定的例は、(Ｇｌｙ)ｎ、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎまたはＳ(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎを含むが、これらに限定されず、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。ある実施態様において、ｎは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である。他の実施態様において、ｎは５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００である。
６) トランスフェリンまたはそのフラグメント
ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合される異種部分は、トランスフェリンまたはそのフラグメントである。あらゆるトランスフェリンを、本発明の融合タンパク質の製造に使用し得る。例として、野生型ヒトＴｆ(Ｔｆ)は、約７５KDa(グリコシル化を考慮しない)の６７９アミノ酸タンパク質であり、遺伝子重複に端を発すると考えられる２つの主ドメイン、Ｎ(約３３０アミノ酸)およびＣ(約３４０アミノ酸)を含む。GenBank accession numbers NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847およびS95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/)参照。トランスフェリンは、２ドメイン、ＮドメインおよびＣドメインを含む。Ｎドメインは、２サブドメイン、Ｎ１ドメインおよびＮ２ドメインを含み、Ｃドメインは２サブドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含む。
ある実施態様において、融合タンパク質のトランスフェリン部分はトランスフェリンスプライスバリアントを含む。一例において、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント、例えば、Genbank Accession AAA61140であり得る。他の実施態様において、融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の１以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
７) ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)
他の実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合した異種部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランまたはポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない、当分野で知られる可溶性ポリマーである。可溶性ポリマーなどの異種部分は、ＩＬ２ポリペプチドまたはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインまたはＮ末端もしくはＣ末端の何れかの位置に結合し得る。
ここにまた提供されるのは、本発明の融合タンパク質の化学的修飾誘導体であり、これは、ポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間増大または免疫原性低減などのさらなる利点を提供し得る(米国特許４,１７９,３３７参照)。修飾のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランおよびポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない水可溶性ポリマーからなる群から選択され得る。融合タンパク質は、分子内またはＮ末端もしくはＣ末端のランダム位置でまたは分子内の予定された位置で修飾され得て、１、２、３またはそれ以上の結合化学部分を含み得る。
ポリマーはあらゆる分子量のものであってよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールについて、ある実施態様において、分子量は、取り扱いおよび製造の容易さから、約１kDa～約１００kDaである。所望のプロファイルにより、他のサイズが使用され得る(例えば、所望の持続放出の時間、もしあるならば、生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠失およびタンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の既知効果)。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０,０００、１０,５００、１１,０００、１１,５００、１２,０００、１２,５００、１３,０００、１３,５００、１４,０００、１４,５００、１５,０００、１５,５００、１６,０００、１６,５００、１７,０００、１７,５００、１８,０００、１８,５００、１９,０００、１９,５００、２０,０００、２５,０００、３０,０００、３５,０００、４０,０００、４５,０００、５０,０００、５５,０００、６０,０００、６５,０００、７０,０００、７５,０００、８０,０００、８５,０００、９０,０００、９５,０００または１００,０００kDaの平均分子量を有し得る。
ある実施態様において、ポリエチレングリコールは分岐構造を有し得る。分岐ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許５,６４３,５７５; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); and Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)に記載される。
本発明の各融合タンパク質、ＩＬ２ポリペプチドまたはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合するポリエチレングリコール部分の数(すなわち、置換の程度)も変わり得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に結合させ得る。同様に、平均の置換の程度は、１～３、２～４、３～５、４～６、５～７、６～８、７～９、８～１０、９～１１、１０～１２、１１～１３、１２～１４、１３～１５、１４～１６、１５～１７、１６～１８、１７～１９または１８～２０ポリエチレングリコール部分／タンパク質分子の範囲内である。置換の程度を決定する方法は、例えば、Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)に記載される。
他の実施態様において、本発明で使用されるＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインは１以上のポリマーにコンジュゲートされる。ポリマーは水可溶性であってよく、ＩＬ２ポリペプチド、ＩＬ２Ｒα ＥＣドメインまたはＩＬ２ポリペプチドまたはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインにコンジュゲートした他の部分に共有結合または非共有結合する。ポリマーの非限定的例は、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリンまたはポリ(アクリロイルモルホリン)であり得る。
８) ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)
ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合される異種部分は、ポリマー、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)またはその誘導体である。ある実施態様において、融合タンパク質はここに記載するＩＬ２ポリペプチドおよびＨＥＳを含み、ここで、ＩＬ２ポリペプチドおよびＩＬ２Ｒα ＥＣドメインはＨＥＳに結合される。
ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)は天然に存在するアミロペクチンの誘導体であり、体内でアルファ－アミラーゼにより分解される。ＨＥＳは、トウモロコシデンプンに９５重量％までの濃度で存在する、炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥＳは、有利な生物学的性質を示し、代用血液剤としておよび血液希釈治療に臨床で使用されている(Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); and Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991))。
アミロペクチンは、主鎖にアルファ－１,４－グリコシド結合が存在し、分岐部位にアルファ－１,６－グリコシド結合が見られる、グルコース部分を含む。この分子の物理化学的性質は、主にグリコシド結合のタイプにより決定される。ニックアルファ－１,４－グリコシド結合により、約６グルコース－モノマー／ターンの螺旋構造が産生される。ポリマーの物理化学的および生化学的性質は、置換により修飾され得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリヒドロキシエチル化により達成され得る。反応条件選択により、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコースモノマーにおける各ヒドロキシ基の種々の反応性を利用することが可能である。この事実により、当業者は、限定的な程度で置換パターンに影響を与えることが可能である。
ＨＥＳは、主に分子量分布および置換の程度により特徴づけられる。ＤＳと称する置換の程度は、モル置換に関し、当業者に知られる。上記引用Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), 特にp. 273参照。
ある実施態様において、ヒドロキシエチルデンプンは、１～３００kD、２～２００kD、３～１００kDまたは４～７０kDの平均分子量(重量平均)を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、さらに、ヒドロキシエチル基に関し、０.１～３、好ましくは０.１～２、より好ましくは、０.１～０.９、好ましくは０.１～０.８の置換のモル程度および２～２０範囲のＣ２：Ｃ６置換比を有する。約１３０kDの平均分子量を有するＨＥＳの非限定的は、０.２～０.８、例えば、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７または０.８、好ましくは０.４～０.７、例えば、０.４、０.５、０.６または０.７の置換の程度を有するＨＥＳである。特定の実施態様において、約１３０kDの平均分子量を有するＨＥＳは、FreseniusからのVOLUVEN(登録商標)である。VOLUVEN(登録商標)は、例えば、血液量減少の治療および予防の治療適応症において、代替血液として使用される、人工コロイドである。VOLUVEN(登録商標)の特徴は、平均分子量１３０,０００±２０,０００Ｄ、モル置換０.４およびＣ２：Ｃ６比約９：１である。他の実施態様において、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量範囲は、例えば、４～７０kDまたは１０～７０kDまたは１２～７０kDまたは１８～７０kDまたは５０～７０kDまたは４～５０kDまたは１０～５０kDまたは１２～５０kDまたは１８～５０kDまたは４～１８kDまたは１０～１８kDまたは１２～１８kDまたは４～１２kDまたは１０～１２kDまたは４～１０kDである。さらに他の実施態様において、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、４kDを超え、７０kD未満の範囲、例えば、約１０kDまたは９～１０kDまたは１０～１１kDまたは９～１１kDまたは約１２kDまたは１１～１２kDの範囲)または１２～１３kDまたは１１～１３kDの範囲または約１８kDまたは１７～１８kDまたは１８～１９kDまたは１７～１９kDの範囲または約３０kDまたは２９～３０または３０～３１kDの範囲または約５０kDまたは４９～５０kDまたは５０～５１kDまたは４９～５１kDの範囲である。
ある実施態様において、異種部分は、種々の平均分子量および／または種々の置換の程度および／または種々のＣ２：Ｃ６置換比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物であり得る。それ故に、種々の平均分子量および種々の置換の程度および種々のＣ２：Ｃ６置換比を有するまたは種々の平均分子量および種々の置換の程度および同じまたはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比を有するまたは種々の平均分子量および同じまたはほぼ同じ置換の程度および種々のＣ２：Ｃ６置換比を有するまたは同じまたはほぼ同じ平均分子量および種々の置換の程度および種々のＣ２：Ｃ６置換比を有するまたは種々の平均分子量および同じまたはほぼ同じ置換の程度および同じまたはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比を有するまたは同じまたはほぼ同じ平均分子量および種々の置換の程度および同じまたはほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比を有するまたは同じまたはほぼ同じ平均分子量および同じまたはほぼ同じ置換の程度および種々のＣ２：Ｃ６置換比を有するまたはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ置換の程度およびほぼ同じＣ２：Ｃ６置換比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物が用いられ得る。
９) ポリシアル酸(ＰＳＡ)
ある実施態様において、非ポリペプチドＩＬ２ポリペプチドおよび／またはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合した異種部分は、ポリマー、例えば、ポリシアル酸(ＰＳＡ)またはその誘導体である。ポリシアル酸(ＰＳＡ)は、ある細菌株および哺乳動物のある細胞で産生される、シアル酸の天然に存在する非分岐ポリマーである(From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhaeuser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348)。それらは、ｎ＝約８０またはそれ以上のシアル酸残基からｎ＝２ほど低い種々の程度重合化で、限定酸加水分解またはノイラミニダーゼでの消化または天然、細菌由来形態のポリマーの分画により産生され得る。種々のポリシアル酸の組成も、ホモ重合形態すなわち大腸菌株Ｋ１およびＢ群髄膜炎菌の莢膜多糖を含むアルファ－２,８結合ポリシアル酸(神経細胞接着分子(Ｎ－ＣＡＭ)の胚形態でも見られる)であるように、変わる。ヘテロ重合形態も存在する － 例えば大腸菌株Ｋ９２および髄膜炎菌Ｃ群多糖の交互アルファ－２,８アルファ－２,９－ポリシアル酸。シアル酸は、髄膜炎菌のグループＷ１３５またはグループＹのように、シアル酸以外のモノマーを伴う交互コポリマーでも見られる。ポリシアル酸は、病原性細菌の免疫および補体系回避および胎児発達中の未成熟神経細胞のグリアの接着の制御(ここで、該ポリマーは、抗接着機能を有する)(ChoおよびTroy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431)を含む重要な生物学的機能を有するが、哺乳動物でポリシアル酸に対する受容体は知られていない。大腸菌株Ｋ１のアルファ－２,８結合ポリシアル酸は‘コロミン酸’としても知られ、本開示を例示するために(種々の長さで)使用される。ポリペプチドにポリシアル酸を結合またはコンジュゲートする種々の方法は記載れている(例えば、米国特許５,８４６,９５１；ＷＯ－Ａ－０１８７９２２およびＵＳ２００７／０１９１５９７Ａ１参照)。
１０) ＸＴＥＮ配列
ここで使用する「ＸＴＥＮ配列」は、主に小親水性アミノ酸からなる、天然に存在しない、実質的に非反復配列を有する、生理的条件下で二次または三次構造の程度は低いかまたはない配列を伴う、伸長ポリペプチドをいう。融合タンパク質パートナーとして、ＸＴＥＮは担体として役立ち、融合タンパク質を作るために、本発明のＩＬ２ポリペプチドおよび／またはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合したとき、ある望ましい薬物動態、物理化学的および薬学的性質を提供する。このような望ましい性質は、薬物動態パラメータおよび溶解度特徴を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、本発明のＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００または２０００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある実施態様において、ＸＴＥＮは、約２０～約３０００アミノ酸残基を超える、３０～約２５００残基を超える、４０～約２０００残基を超える、５０～約１５００残基を超える、６０～約１０００残基を超える、７０～約９００残基を超える、８０～約８００残基を超える、９０～約７００残基を超える、１００～約６００残基を超える、１１０～約５００残基を超えるまたは１２０～約４００残基を超えるペプチドまたはポリペプチドである。
本発明のＸＴＥＮ配列は、９～１４アミノ酸残基の１以上の配列モチーフまたは配列モチーフに少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得て、ここで、該モチーフは、グリシン(Ｇ)、アラニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、スレオニン(Ｔ)、グルタミン酸(Ｅ)およびプロリン(Ｐ)をからなる群から選択される４～６タイプのアミノ酸を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１参照。
ある実施態様において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリーまたはＡＥモチーフファミリーまたはＡＦモチーフファミリーまたはＡＧモチーフファミリーまたはＡＭモチーフファミリーまたはＡＱモチーフファミリーまたはＢＣファミリーまたはＢＤファミリーの非重複配列モチーフの複数単位を含み、ここで、得られたＸＴＥＮは、一定範囲の相同性を有する。他の実施態様において、ＸＴＥＮは、２以上のモチーフファミリーからのモチーフ配列の複数単位を含む。これらの配列は、下にさらに詳述する、モチーフのアミノ酸組成により付与される、正味電荷、親水性、二次構造欠如または反復性欠如などの性質を含む、所望の物理／化学的特徴を達成するように選択され得る。他の実施態様において、ＸＴＥＮに取り込まれるモチーフは、約３６～約３０００アミノ酸残基のＸＴＥＮを達成するように、ここに記載する方法を使用して選択および集合され得る。
さらなる実施態様において、本発明で使用するＸＴＥＮ配列は、本発明の融合タンパク質の物理または化学的性質、例えば、薬物動態に影響する。本発明で使用するＸＴＥＮ配列は、次の配座柔軟性、水性溶解度増強、高度プロテアーゼ抵抗性、低免疫原性、哺乳動物受容体への低結合または流体力学(またはStokes)半径増加の有利な性質の１以上を示し得る。特定の実施態様において、本発明のＩＬ２ポリペプチドおよび／またはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合したＸＴＥＮ配列は、長い末端半減期または曲線下面積(ＡＵＣ)増大などの薬物動態特性を増大し、よって、ここに記載する融合タンパク質はインビボで、野生型ＩＬ２ポリペプチドと比較して、長時間留まる。さらなる実施態様において、本発明で使用するＸＴＥＮ配列は長い末端半減期または曲線下面積(ＡＵＣ)増大などの薬物動態特性を増大し、よって、ＩＬ２ポリペプチドは、インビボ、野生型ＩＬ２と比較して、長時間留まる。
多くの方法およびアッセイを、ＸＴＥＮ配列を含むタンパク質の物理／化学的性質決定に用い得る。このような方法は、分析用遠心、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＨＰＬＣ－逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマンスペクトロスコピー、屈折分析およびＵＶ／可視スペクトロスコピーを含むが、これらに限定されない。さらなる方法は、Amau et al., Prot ExprおよびPurif 48, 1-13 (2006)に記載される。
本発明で使用できるＸＴＥＮ配列のさらなる例は、米国特許公開２０１０／０２３９５５４Ａ１、２０１０／０３２３９５６Ａ１、２０１１／００４６０６０Ａ１、２０１１／００４６０６１Ａ１、２０１１／００７７１９９Ａ１または２０１１／０１７２１４６Ａ１または国際特許公開ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１、ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２、ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１、ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１またはＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２に記載される。
１１) 免疫グロブリン結合ペプチド(またはポリペプチド)
ある実施態様において、非ＩＬ２ポリペプチドおよび／またはＩＬ２Ｒα ＥＣドメインに結合した異種部分は、免疫グロブリン結合ペプチドである。免疫グロブリン結合ペプチドはＦｃ領域に結合でき、ここに記載する融合タンパク質の半減期を改善し得る。
ある実施態様において、本発明に有用な免疫グロブリン結合ペプチドは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。
ある実施態様において、本発明で有用な免疫グロブリン結合ペプチドは、１３量体ＩｇＧ－Ｆｃドメイン結合ペプチド(ＩｇＧＢＰ)を含む。DeLano WL, et al. (2000) Science 287:1279-1283。他の実施態様において、本発明で有用な免疫グロブリン結合ペプチドは、米国特許公開２０１７０３３４９５４、米国特許公開２０１７０２１０７７７またはＰＣＴ公開ＷＯ／２０１７／０６９１５８に開示のペプチドを含む。
７.３.５ 融合タンパク質
ある実施態様において、融合タンパク質は、表３に示す、配列番号１３～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４の何れかを含む。
ＩＬ２は、特記しない限り、成熟(ＩＬ２(２１－１５３))である。ＩＬ２とＣＤ２５の間のリンカーは、特に断らない限り(Ｇ３Ｓ)３である。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１３～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４の何れかに少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα本発明の融合タンパク質は、次の性質／活性の１以上を有し得る：(１)低用量ＩＬ２ベースの治療で制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)活性増加および／または免疫耐容性増加；(２)高用量治療で免疫応答および記憶増加；(３)組み換えＩＬ２と比較したＩＬ２利用能増加；および／または(４)インビボでＩＬ２Ｒ担持リンパ球の永続性ＩＬ２刺激増加。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、ＩＬ２(配列番号２)または配列番号２０４(切断なしの１２量体リンカーを伴うｗｔ ＩＬ２－ＣＤ２５配列)からなるポリペプチドの薬物動態特性と比較して、半減期延長、Ｃｍａｘ増加、ＡＵＣ増加、Ｃｍｉｎ増加、クリアランス低減、バイオアベイラビリティ改善およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、１以上の薬物動態特性を含む。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、ＩＬ２(配列番号２)または配列番号２０４(切断なしの１２量体リンカーを伴うｗｔ ＩＬ２－ＣＤ２５配列)と比較して、長い半減期を宇ゆする。ある実施態様において、延長された半減期は、ＩＬ２(配列番号２)または配列番号２０４(何ら切断なしの１２量体リンカーを伴うｗｔ ＩＬ２－ＣＤ２５配列)からなるポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２１倍または少なくとも約２２倍である。
ある実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質よりもたらされるＴｒｅｇの活性増加は、例えば、(１)ＣＤ４＋ Ｔ細胞区画におけるＴｒｅｇ提示および数増大；(２)ＩＬ２依存性ＣＤ２５上方制御；(３)増殖性マーカーＫｉ６７発現により評価した増殖増加；および(４)ＩＬ２依存性高分化Ｋｌｒｇ１ ＋ Ｔｒｅｇサブセットの分画増加を含む、多様な方法でアッセイされ得る。Ｔｒｅｇにおけるこのような効果は、例えば、脾臓および／または炎症膵臓で観察され得る。
ある実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα本発明の融合タンパク質は、Ｔエフェクター／記憶応答増加により免疫寛容原性および免疫抑制Ｔｒｅｇおよび免疫を増大させ、さらなる実施態様において、(１)天然または組み換えＩＬ２と比較して低いＩＬ２活性有効レベル；および／または(２)天然または組み換えＩＬ２より永続性の生物学的応答を示すなどの応答を送達することにより、薬物動態改善を示す。
特定の実施態様において、融合タンパク質は、天然または組み換えＩＬ２より改善された活性を有する。例えば、ＩＬ２／ＩＬ－２Ｒα融合タンパク質の効果は、免疫寛容原性Ｔｒｅｇを、天然または組み換えＩＬ２と比較して約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍１５０倍、２００倍または低レベルのＩＬ２活性で増大できる。他の実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、Ｔｒｅｇ永続性増大および関連性質誘導に、天然または組み換えＩＬ２より有効である。
多様な生物からの種々のＩＬ２およびＩＬ２Ｒαフラグメントおよびバリアントを、ここに提供するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質の製造に使用できる。このような成分は、本明細書の他の箇所にさらに詳述される。非限定的非プロセシングまたは成熟ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα細胞外ドメイン融合タンパク質の例は、配列番号１３～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４に示される。
用語「分泌シグナル配列」は、大型ポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路に大型ポリペプチドを指向させる、ポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードする、ポリヌクレオチド配列をいう。大型ポリペプチドは、分泌経路を移動中、一般に開裂されて、分泌ペプチドが除去される。ここで使用する「成熟」形態の融合タンパク質またはポリペプチドは、分泌ペプチドが除去されている、ポリペプチドのプロセシングされた形態を含む。ここで使用する「非プロセシング」形態の融合タンパク質は分泌ペプチド配列を保持する。
成熟およびプロセシングされていない形態のＩＬ２／ＩＬ－Ｒａ ＥＣドメイン融合タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよびバリアントならびにそれをコードするポリヌクレオチドも提供される。このような機能的ポリペプチドフラグメントは、配列番号１３～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４の何れかの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。あるいは、機能的ポリペプチドバリアントは、配列番号１３～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４に示す配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含み得る。
ＩＬ２／ＩＬ－Ｒａ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの活性バリアントおよびフラグメントがさらに提供される。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１３～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４に示すポリペプチドをコードする少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、１１００、１２００、１３００、１５００、１８００,２０００連続ヌクレオチドを含み得て、機能的ＩＬ２／ＩＬ－Ｒａ細胞外ドメイン融合タンパク質をコードし続ける。
ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の成分はどの順番であってもよいことは認識される。ある実施態様において、ＩＬ２ポリペプチドは融合タンパク質のＮ末端であり、ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインはＣ末端である。
ある実施態様において、融合タンパク質はダイマーを形成する。他の実施態様において、融合タンパク質は、モノマーである。なお、ある実施態様において、ダイマーは２個のモノマーを含み、これらモノマーは互いに共有結合により結合される。ある実施態様において、ダイマーは２個のモノマーを含み、これらモノマーは非共有結合により結合される。
本発明のある実施態様において、融合タンパク質は、ＩＬ２(配列番号２)または配列番号２０４(切断なしの１２量体リンカーを伴うｗｔ ＩＬ２－ＣＤ２５配列)からなるポリペプチドより安定である。ある実施態様において、融合タンパク質は、(ｉ)対照タンパク質と比較した熱力学的安定性の増加；(ii)対照タンパク質と比較したＴＭの増加；(iii)対照タンパク質と比較した分解への抵抗性の増加；(iv)対照タンパク質と比較した修飾への抵抗性の増加；(ｖ)対照タンパク質と比較したインビボでの安定性の増加；および(vi)これらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、１以上の性質を有し、ここで、対照タンパク質は(ｉ)インターロイキン－２(ＩＬ２)ポリペプチドを含む第一ポリペプチド；および(ｂ)インターロイキン－２受容体アルファ(ＩＬ２Ｒα)ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドを含み、該融合タンパク質と比較してグリコシル化が少なくとも一つ多いものである。
ここに開示する融合タンパク質のグリコシル化部位は、何れも他の機構により除去され得る。ある実施態様において、融合タンパク質は酵素的または化学的に脱グリコシル化される。ある実施態様において、融合タンパク質はアルカリ、ヒドラジノリシス、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ(ＰＮＧａｓｅ Ｆ)、Ｅｎｄｏ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＨ(Ｅｎｄｏ Ｈ)、Ｏ－グリコシダーゼまたはこれらの何れかの組み合わせにより脱グリコシル化される。
ある実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去は、アルカリで融合タンパク質を処理することにより達成される。ある実施態様において、グリカンは、アルカリボロハイドライド処理によりグリコシル化ポリペプチドから除去される。他の実施態様において、ここに開示する融合タンパク質のグリコシル化部位は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩を使用して除去され得る。ある実施態様において、アルカリは、β－脱離処理のために使用する。
ある実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去は、ヒドラジノリシスの手段による、融合タンパク質の化学処理により達成される。ある実施態様において、グリコシル化は、ここに開示する融合タンパク質から融合タンパク質をヒドラジノリシスに付して除去され、遊離糖鎖は、２－アミノピリジンでの蛍光標識に付される。Hase et al. J. Biochem., 95, 197 (1984)参照。ある実施態様において、ヒドラジノリシスを、Oxford GlycoSystems(the GlycoPrep 1000)により提供された装置で行う。
他の実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去を、融合タンパク質をトリフルオロメタンスルホン酸(ＴＦＭＳ)処理に付すことにより達成する。
ある実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去を、融合タンパク質を酵素で処理して達成する。ある実施態様において、酵素はグリコシダーゼである。ある実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去は、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ(ＰＮＧａｓｅ Ｆ)を使用して達成される。ＰＮＧａｓｅ Ｆ濃度は変化し得て、経験的に決定される。ある実施態様において、グリコシダーゼはＰＮＧａｓｅ Ｆである。ＰＮＧａｓｅ Ｆは市販酵素である(例えば、New England Biolabs, Ipswich MA, Cat. #P0704または#P0710)。ある実施態様において、ＰＮＧａｓｅ Ｆは融合タンパク質である。例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、キチン結合ドメイン(ＣＢＤ)でタグ付けされたＰＮＧａｓｅ ＦまたはＰＮＧａｓｅ Ｆ－ＳＮＡＰ融合タンパク質であり得る。ある実施態様において、グリコシダーゼは凍結乾燥物である。ある実施態様において、グリコシダーゼは凍結乾燥ＰＮＧａｓｅ Ｆである。ある実施態様において、グリコシダーゼは、実質的に動物由来成分がない。
ある実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質をＥｎｄｏ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＨ(Ｅｎｄｏ Ｈ)で処理して達成される。Ｅｎｄｏ－Ｈは、ストレプトマイセス・プリカタスおよび他のストレプトマイセス数種から分泌されるグリコヒドロラーゼである(Tarentino et al., 1976)。オリゴ糖のＮ－アセチルグルコサミンコアのβ－ｌ、４－グリコシド結合を開裂し、１つのＮ－アセチルキトビオース結合を、糖タンパク質のアスパラギン残基に残す(Trimble et al., 1978; Muramatsu 1971)。ストレプトマイセス・プリカタスのＥｎｄｏ Ｈ遺伝子は、９３９bp(GenBank accession AAA26738.1)であり、２８.９kDａタンパク質をコードする。ストレプトマイセス・プリカタスのＥｎｄｏ Ｈは、最近ピキア・パストリスで発現され、Ｅｎｄｏ Ｈを産生するピキア・パストリスの脱グリコシル化活性がインビトロで、共発酵および発酵後処理の両方で確認された(Wang et al., 2015)。
ある実施態様において、融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質をＯ－グリコシダーゼで処理して、達成される(New England Biolabs, Ipswich MA)。Ｏ－グリコシドは、ｅｎｄｏ－アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼとも称され、糖タンパク質のコア１およびコア３Ｏ結合二糖除去を触媒する。ある実施態様において、糖タンパク質から非置換Ｓｅｒ－およびＴｈｒ結合を遊離する。
融合タンパク質の１以上のグリコシル化部位の除去は、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質製造後、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は細胞培養で産生されているとき、融合タンパク質採取後および／または融合タンパク質が精製されているとき、細胞培養により達成できるが(例えば、バイオリアクター)。ある実施態様において、１以上のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質発現中、細胞培養の間に１以上の除去剤を加えることにより達成され得る。他の実施態様において、１以上のグリコシル化部位の除去は、グリコシル化を排除するグリコシル化が低減されている特定の細胞型を宿主細胞として選択することにより、達成され得る(例えば、大腸菌またはストレプトマイセス種)。ある実施態様において、１以上のグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質をコードする遺伝子と、１以上のグリコシル化を除去する酵素をコードする遺伝子の共発現により達成される。
下表４は、種々のＩＬ－２アミノ酸配列を示す。ある実施態様において、ここに記載する融合タンパク質は、表４に示す配列番号１０１～配列番号１１５の何れかを含む。


下表５は種々のリンカーアミノ酸配列を示す。ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、表５に示す配列番号１１６～配列番号１２７の何れかから選択される、複数連結配列を含む。

下表６は種々のＣＤ２５アミノ酸配列を示す。ある実施態様において、ここに記載する融合タンパク質は、表６に示す、配列番号１２８～配列番号１６９の何れかを含む。
下表７は種々のリンカーアミノ酸配列を示す。ある実施態様において、ここに記載する融合タンパク質は、表７に示す、配列番号１７０～配列番号１８６の何れかを含む。ある実施態様において、リンカー配列がない(すなわち、表７における「ＴＬ０」)。

下表８は種々のエンハンサーアミノ酸配列を示す。ある実施態様において、ここに記載する融合タンパク質は、表８に示す、配列番号１８７～配列番号２０１の何れかを含む。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、表４から選択されるＩＬ－２配列(すなわち、配列番号１０１～配列番号１１５の一つ)および表６からのＣＤ２５配列(すなわち、配列番号１２８～配列番号１６９の一つ)を含む。ある実施態様において、融合タンパク質はまた、表５から選択される配列または複数連結配列(すなわち、配列番号１１６～配列番号１２７の１以上)も含む。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、上記表４から選択されるＩＬ－２配列(すなわち、配列番号１０１～配列番号１１５の一つ)および表６からのＣＤ２５配列(すなわち、配列番号１２８～配列番号１６９の一つ)、表５から選択される配列または複数連結配列(すなわち、配列番号１１６～配列番号１２７の１以上)および表７からの配列または複数連結配列を含む何れかのリンカー(すなわち、配列番号１７０～配列番号１８６の１以上)を含む。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、上記表４から選択されるＩＬ－２配列(すなわち、配列番号１０１～配列番号１１５の一つ)および表６からのＣＤ２５配列(すなわち、配列番号１２８～配列番号１６９の一つ)、表５からの配列または複数連結配列および表８からの配列または複数連結配列を含む何れかのリンカー(すなわち、配列番号１８７～配列番号２０１の一つ)を含む。
ある実施態様において、ここに開示する融合タンパク質は、順に、表８からのエンハンサー配列(すなわち、配列番号１８７～配列番号２０１の一つ)、表７から選択される配列または複数連結配列(すなわち、配列番号１７０～配列番号１８６の１以上)、表４から選択されるＩＬ－２配列(すなわち、配列番号１０１～配列番号１１５の一つ)および表６からのＣＤ２５配列(すなわち、配列番号１２８～配列番号１６９の一つ)を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、表７から選択される配列または複数連結配列(すなわち、配列番号１７０～配列番号１８６の１以上)を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、表５から選択される配列または複数連結配列(すなわち、配列番号１１６～配列番号１２７の１以上)を含む。
７.４ ポリヌクレオチド
ある態様において、ここに提供されるのは、ＩＬ２活性を有するここに記載する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡならびにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞での効率的発現のための発現ベクターである。ある実施態様において、ここに提供されるのは、配列番号１～配列番号７０および配列番号２０２～配列番号２０４のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列である。
ここで使用する「単離」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然源(例えば、マウスまたはヒトにおける)に存在する他の核酸分子から離されているものをいう。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組み換え技術により産生されたとき、他の細胞物質または培養培地が実質的にないまたは化学合成されたとき化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないものであり得る。例えば、用語「実質的にない」は、他の物質、例えば、細胞物質、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆体および／または他の化学物質が約１５％、１０％、５％、２％、１％、０.５％または０.１％未満(特に約１０％未満)である、ポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。特定の実施態様において、ここに記載する融合タンパク質をコードする核酸分子は単離または精製されている。
ポリヌクレオチドを、当分野で知られる何らかの方法により得て、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定できる。ここに記載する融合タンパク質、例えば、表３に記載する融合タンパク質およびこれら融合タンパク質の修飾体をコードするヌクレオチド配列は、当分野で十分に知られる方法を使用して決定できる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られるヌクレオチドコドンを、該融合タンパク質をコードする核酸が産生されるような方法で、組み立てる。このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ(例えば、Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-6)、これは、簡潔には、融合タンパク質をコードする配列の部分を含む重複オリゴヌクレオチドを合成し、これらオリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲーションし、次いでＰＣＲによりライゲートしたオリゴヌクレオチドを増幅することを含む。
あるいは、ここに記載する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当分野で周知の方法(例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング方法)を使用して、適当な起源(例えば、ハイブリドーマ)からの核酸から産生し得る。例えば、既知配列の３’および５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅を、目的の融合タンパク質を産生するハイブリドーマ細胞から得たゲノムＤＮＡを使用して、実施できる。このようなＰＣＲ増幅方法を使用して、例えば、ＩＬ２、リンカー配列またはＩＬ２－Ｒαをコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅核酸を宿主細胞での発現および、例えば、融合タンパク質を産生するためのさらなるクローニングのために、ベクターにクローン化し得る。
特定の融合タンパク質をコードする核酸を含むクローンが利用可能ではないが、融合タンパク質分子の配列が分かるならば、該融合タンパク質をコードする核酸を化学合成できるかまたは適当な源(例えば、産生されたｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、または、目的のタンパク質を発現する何らかの組織または細胞、例えば、ここに記載する融合タンパク質を発現するよう選択されたハイブリドーマ細胞から単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ ＲＮＡ)から、該配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によりまたは、例えば、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチプローブを使用するクローニングにより得ることができる。次いで、ＰＣＲにより産生された増幅核酸を、当分野で周知の何らかの方法を使用して、複製可能クローニングベクターにクローン化し得る。
ここに記載する融合タンパク質をコードするＤＮＡは、慣用法を使用して、容易に単離および配列決定され得る(例えば、ここに開示する融合タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブの使用による)。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、これを、宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えば、CHO GS SystemTM(Lonza)からのＣＨＯ細胞)または他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞で融合タンパク質を合成させる。
ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質の翻訳を助けるさらなる要素を含み得ることはさらに認識される。このような配列は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に結合したKozak配列である。Kozakコンセンサス配列は、翻訳過程の開始に役割を有し、コンセンサス(ｇｅｅ)ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ(配列番号９２)を有する、真核生物ｍＲＮＡに存在する配列である；ここで、(１)小文字は、最も一般的な塩基を意味し、その塩基の位置は、それにも関わらず変わってよい；(２)大文字は高度に保存的塩基を示し、すなわち‘ＡＵＧＧ’配列は、プリン(アデニンまたはグアニン)が通常その位置で観察されることを示す、ＩＵＰＡＣ曖昧コード‘Ｒ’以外、一定であるか、あるとしても、変化は稀である；そして(３)括弧内の配列((ｇｅｅ))は、意義不明のものである。
一つの非限定的実施態様において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、配列番号９２(gccaccATGGACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT)に示すＩＬ２リーダー最適化Kozak配列または機能的バリアントまたはそのフラグメントを含む。Kozak配列の機能的バリアントまたはフラグメントは、リーダーを欠く配列からの翻訳レベルと比較して、タンパク質の翻訳を増加させる能力を保持する。このような機能的フラグメントは、Kozak配列または配列番号９２もしくは配列番号９９(gccaccATGG)に示す配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０連続ヌクレオチドを含み得る。あるいは、機能的バリアントは、Kozak配列または配列番号９２もしくは配列番号９９に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含み得る。
７.５ 細胞およびベクター
ある態様において、ここに提供されるのは、ここに記載する融合タンパク質を発現(例えば、組み換えにより)する、細胞(例えば、宿主細胞)およびここに記載する融合タンパク質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターである。ここに提供されるのは、宿主細胞での組み換え発現のための融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、ベクター(例えば、発現ベクター)である。
ある実施態様において、宿主細胞は、ここに記載する核酸を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は真核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞および植物細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。ある実施態様において、原核生物細胞は細菌細胞である。
ある実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０(あらゆる免疫グロブリン鎖を内因性に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ(例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ)、ＰＥＲ.Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１.１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたとき、挿入コード配列の転写および翻訳に必要な要素またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳に必要な要素を含む、あらゆる核酸構築物をいう。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスおよびその誘導体を含む。
ここで使用する遺伝子発現調節配列は、操作可能に結合するコード核酸の効率的転写および翻訳を促進する、プロモーター配列またはプロモーター－エンハンサー組み合わせなどのあらゆる制御性ヌクレオチド配列をいう。遺伝子発現調節配列は、例えば、構成的または誘導性プロモーターなどの哺乳動物またはウイルスプロモーターであり得る。構成的哺乳動物プロモーターは、次の遺伝子のためのプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＰＲＴ)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータ－アクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーターを含むが、これらに限定されない。真核生物細胞で構成的に機能するウイルスプロモーターの例は、例えば、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス(例えば、ＳＶ４０)、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスからのプロモーターおよび他のレトロウイルスの長い末端反復(ＬＴＲ)および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターを含む。他の構成的プロモーターは、当業者に知られる。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導因子存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターを、ある金属イオン存在下、転写および翻訳促進のために誘導する。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られる。
本発明の目的で、多数の発現ベクター系が使用され得る。これらの発現ベクターは、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの必須部分として、宿主生物で一般に複製可能である。発現ベクターは、プロモーター(例えば、天然に関連または異種プロモーター)、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサー要素および転写停止配列を含むが、これらに限定されない発現調節配列を含み得る。好ましくは、発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクターにおける、真核生物プロモーター系である。発現ベクターはまた、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルス由来であるＤＮＡ要素も利用できる。その他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン系を含む。
一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の決定を可能とする、選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性)を含む(例えば、Itakura et al., 米国特許４,７０４,３６２参照)。染色体に統合ＤＮＡを有する細胞を、トランスフェクト宿主細胞の選択を可能とする１以上のマーカーの導入により、選択できる。マーカーは、栄養要求性宿主、殺生物剤耐性(例えば、抗生物質)または銅などの重金属に対する抵抗性の表現型について、提供され得る。選択可能マーカー遺伝子を、発現させるＤＮＡ配列に直接結合させても、共形質転換により同じ細胞に導入してもよい。
本発明方法で使用する融合タンパク質の最適化発現に有用なベクターの例は、ＮＥＯＳＰＬＡ(米国特許６,１５９,７３０)である。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビンメジャープロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含む。ベクター系は、米国特許５,７３６,１３７および５,６５８,５７０にも教示される。この系は、高発現レベル、例えば、＞３０pg／細胞／日のために提供される。他の例示的ベクター系は、例えば、米国特許６,４１３,７７７に開示される。
他の実施態様において、本発明のポリペプチドは、ポリシストロン構築物を使用して、発現される。これらの発現系において、マルチマー結合タンパク質の複数ポリペプチドなどの目的の複数遺伝子産物が、単一ポリシストロン構築物から産生され得る。これらの系は、有利にリボソーム内部侵入部位(ＩＲＥＳ)を使用し、真核生物宿主細胞で比較的高レベルのポリペプチドを提供する。適合性のＩＲＥＳ配列は、米国特許６,１９３,９８０に開示される。
より一般に、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されたら、発現ベクターが適切な宿主細胞に導入され得る。すなわち、宿主細胞が形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、上記のような、当業者に周知の種々の技術により達成され得る。形質転換細胞を融合タンパク質の産生に適する条件下で増殖させ、融合タンパク質合成についてアッセイする。アッセイ技術の例は、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)または蛍光標示式細胞分取分析(ＦＡＣＳ)、免疫組織化学などを含む。
７.６ 医薬組成物
種々のここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質(ここでは「活性化合物」とも称する)を、投与に適する医薬組成物に組み込み得る。このような組成物は、一般に融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む。ここで使用する用語「薬学的に許容される担体」は、薬物投与に適合する、全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のための、このような媒体および添加物は、当分野で周知である。慣用の媒体または添加物は活性化合物と不適合でない限り、組成物におけるその使用が考慮される。補助的活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。
ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を含む組成物および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。
ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する核酸および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。
ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するベクターおよび(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。
ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する宿主細胞および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤される。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)および経粘膜を含む。さらに、治療有効量の医薬組成物を処置が必要な領域に局所的に投与することが望ましいことがある。これは、例えば、手術中の局所または領域注入または灌流、局所適用、注射、カテーテル、坐薬またはインプラント(例えば、シアラスティック膜または繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性またはゼラチン様物質から形成されたインプラント)などにより達成され得る。他の実施態様において、治療有効量の医薬組成物は、リポソームなどの小胞で送達される(例えば、Langer, Science 249:1527-33, 1990 and Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-65, 1989参照)。
さらに他の実施態様において、治療有効量の医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一例において、ポンプが使用できる(例えば、Langer, Science 249:1527-33, 1990; Sefton, Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-40, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507-16, 1980; Saudek et al., N Engl. J Med. 321:574-79, 1989参照)。他の例では、ポリマー物質が使用できる(例えば、Levy et al., Science 228:190-92, 1985; During et al., Ann. Neural. 25:351-56, 1989; Howard et al., J Neurosurg. 71:105-12, 1989参照)。他の制御放出系、例えば、Langer(Science 249:1527-33, 1990)に記載のものも使用できる。
許容される担体、添加物または安定化剤は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体)；および／またはTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン界面活性剤を含む。
非経腸製剤で使用される薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、無菌水注射液、デキストロースおよび乳酸・リンゲル注射液を含む。非水性非経腸媒体は、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびピーナツ油を含む。静菌または靜真菌濃度の抗微生物剤を、複数回用容器に封入された非経腸製剤に加えてよく、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む。等張剤は塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。緩衝剤はリン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、Polysorbate 80(TWEEN(登録商標) 80)を含む。金属イオン封鎖または金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。医薬担体は、水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；およびｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含む。
非経腸、皮内または皮下適用で使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸、クエン酸またはリン酸および張性調節用薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節し得る。非経腸製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用バイアルに入れることができる。
注射使用に適する医薬組成物は、無菌水溶液(水可溶性であるとき)または分散体および無菌注射用溶液または分散体の即座の調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与のために、適当な担体は、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor ELS(BASF; Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。全ての場合で、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針通過可能である程度に流動性であるべきである。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染活動に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体である。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持される。微生物の活動の予防は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを入れることによりもたらされ得る。
無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて、上記成分の一つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に溶解し、濾過滅菌することにより、調製できる。一般に、分散体は、活性化合物を、基本的分散媒体および上記からの必要な他の成分を含む、無菌媒体に加えることにより、調製される。無菌注射用溶液調製用無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、予め滅菌濾過した溶液からの活性成分と、何らかのさらなる所望の成分を含む粉末をもたらす、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
吸入による投与のために、化合物は、適当な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスまたはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。全身投与は、経粘膜または経皮手段も含み得る。
経粘膜または経皮投与のために、透過すべきバリアに適する浸透剤が製剤で使用される。このような浸透剤は一般に当分野で知られ、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐薬の使用によって達成される。経皮投与のために、活性化合物は、一般に当分野で知られる、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤される。化合物はまた直腸送達用の坐薬(例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤と)または停留浣腸の形で調製され得る。
ある実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、などの、体内からの迅速な排泄に対して化合物を保護する担体と製剤する。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の製造方法は当業者には明らかである。これら物質はまたAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許４,５２２,８１１に記載のとおり、当業者に知られる方法で製剤され得る。
投与の容易さおよび投与量の一様性のために、経口または非経腸組成物を投与量単位形態で製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置対象への単位投与量として適する物理的に分かれた単位を言い、各単位は必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された予定量の活性化合物を含む。ここに記載される投与量単位形態の詳細は、活性化合物の特有の性質および達成すべき特定の治療効果および個体の感受性による活性化合物の製剤の分野に固有の限界により指示され、依存する。医薬組成物は、投与指示と共に、容器、包装またはディスペンサーに包含され得る。
このような機能の調節に有用なＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の有効量は、処置する対象、苦痛の重症度およびＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の投与方式による。用量の例は、約１０４～約１０７IUのＩＬ２活性／成人、約１０４～１０５IUのＩＬ２活性／成人、約１０５～約１０６IUのＩＬ２活性／成人、約１０６～約１０７IUのＩＬ２活性／成人を含む。他の例において、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の治療的有効用量は、約１０５IUのＩＬ２活性の±１００倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±１０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±２倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±２０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±３０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±４０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±５０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±６０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の±７０倍、約１０５IUのＩＬ２活性の８０倍または約１０５IUのＩＬ２活性の９０倍である。具体的非限定的実施態様において、ヒトＩＬ２融合タンパク質はこの国際単位の投与量で投与される。
７.７ 使用および方法
７.７.１ ここに開示する組成物の製造法
上記のとおり、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を使用して、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒαまたはここに記載する何れかの異種部分配列の修飾により、新規ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を作ることができる。それ故に、ここに記載する他の態様においてここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の構造特性を使用して、ヒトＩＬ２ＲαおよびカニクイザルＩＬ２Ｒαへの結合などのここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の少なくとも一つの機能的性質を保持する、構造的に関連するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を作ることができる。例えば、ＩＬ２、ＩＬ２Ｒαまたはここに記載する何れかの異種部分配列の１以上を、上記のとおり、既知フレームワーク領域および／または他のタンパク質と組み換えにより組み合わせて、さらに、組み換え技術によって作られた、ここに記載する融合タンパク質を作ることができる。
ある実施態様において、ここに開示されるのは、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を製造する方法であって、該融合タンパク質を含む宿主細胞を適当な条件下で培養し、該融合タンパク質を回収することを含む、方法である。ある実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞または細菌細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＮＳ０細胞、Ｐｅｒ Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞およびＣＯＳ細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、宿主細胞は細菌細胞である。特定の実施態様において、細菌細胞はエシェリキア・コリである。
他のタイプの修飾は、先の部分に記載のものを含む。操作(engineering)する方法の出発物質は、ここに提供するＩＬ２またはＩＬ２Ｒα配列の１以上である。操作された融合タンパク質を作るために、ここに提供するＩＬ２またはＩＬ２Ｒα配列の１以上を有する融合タンパク質を実際に製造する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用し、元の配列に由来する「第二世代」配列を作成し、次いで、該「第二世代」配列を調製し、タンパク質として発現される。
従って、ここに提供されるのは、(ａ)ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαを準備し；(ｂ)ＩＬ２およびＩＬ２Ｒα内の少なくとも一つアミノ酸残基を改変させて、少なくとも一つの改変融合タンパク質配列を作製し；そして(ｃ)タンパク質として該改変融合タンパク質配列を発現させることを含む、融合タンパク質の製造法である。
またここに提供されるのは、(ａ)ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαを準備し；(ｂ)ＩＬ２およびＩＬ２Ｒα内の少なくとも一つのグリコシル化を改変させて、少なくとも一つの改変グリコシル化部位を作製し；そして(ｃ)タンパク質として該改変融合タンパク質配列を発現させることを含む、融合タンパク質の製造法である。
改変抗体は、上記(１)～(１０)に示す機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上または全てを示し得る。改変抗体の機能的性質を、当分野で利用可能な標準アッセイを使用して評価し得る。
ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を操作する方法のある実施態様において、変異を、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質コード配列の全てまたは一部に沿って無作為にまたは選択的に導入でき、得られた修飾ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、ここで記載する結合活性および／または他の機能的性質についてスクリーニングし得る。変異方法は文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和変異導入、合成ライゲーションアセンブリーまたはこれらの組み合わせを使用する、変異を作製およびスクリーニングする方法を記載する。あるいは、Lazar et al. のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、タンパク質の物理化学的性質を最適化するための計算スクリーニング方法を使用する方法を記載する。
組成物は、さらに、上記種々のここに記載する融合タンパク質ならびにそのバリアントおよびフラグメントをコードする、単離ポリヌクレオチドを含む。ここに記載するポリヌクレオチドを含むベクターおよび発現カセットがさらに開示される。発現カセットは、一般にポリヌクレオチドに操作可能に結合したプロモーターならびに転写および翻訳停止領域を含む。
用語「ポリヌクレオチド」の使用は、本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定する意図ではない。当業者は、ポリヌクレオチドがリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含むことを認識する。このようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子および合成アナログ両者を含む。
１を超えるプロセシングまたは開裂部位を含む構築物において、このような部位は同一でも異なってもよいことは認識される。
「単離」または「精製」ポリヌクレオチドまたはタンパク質または生物学的に活性なその一部は、その天然に存在する環境で見られるポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常付随するまたは相互作用する成分が実質的にまたは本質的にない。それ故に、単離または精製ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組み換え技術により産生されたとき、他の細胞物質または培養培地が実質的にないまたは化学合成のとき化学前駆体または他の化学物質が実質的にない。最適に、「単離」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡでポリヌクレオチドと天然に隣接する配列(最適にタンパク質コード化配列)(すなわち、ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列)がない。例えば、種々の実施態様において、単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドと天然に隣接するヌクレオチド配列を、約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０.５kbまたは０.１kb未満含む。
細胞物質が実質的にないタンパク質は、汚染タンパク質が約３０％、２０％、１０％、５％または１％(乾燥重量で)未満であるタンパク質製剤を含む。本発明のタンパク質または生物学的に活性なその一部が組み換えにより産生されるとき、培養培地成分は、好ましくは化学的前駆体または非タンパク性化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％または１％(乾燥重量で)未満を占める。
当分野の技術範囲内である慣用の分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術がここで用いられ得る。このような技術は、文献に十分記載されている。例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gaited. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)参照。
プロモーターに操作可能に結合した上記ポリヌクレオチドを含むベクターも、ここで提供される。ヌクレオチド配列は、発現調節配列(例えば、プロモーター)がその配列の転写および翻訳を調節および制御するとき、該発現調節配列に「操作可能に結合」される。ヌクレオチド配列を参照する用語「操作可能に結合」は、発現すべきヌクレオチド配列の前の適切な開始シグナル(例えば、ＡＴＧ)を有することならびに発現調節配列制御下の配列の発現を可能とする正確な読み枠および配列によりコードされる所望の産物の産生が維持されることを含む。組み換え核酸分子に挿入したい遺伝子が適切な開始シグナルを含まないならば、このような開始シグナルを遺伝子の前に挿入し得る。「ベクター」は、結合セグメントの複製がされるように、他の核酸セグメントを結合させ得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。プロモーターは、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物プロモーターと同一であってよく、または同一である。さらに、ベクターはプラスミド、コスミド、酵母人工染色体(ＹＡＣ)、バクテリオファージまたは真核生物ウイルスＤＮＡであり得る。タンパク質発現に有用であるとして当分野で知られる他の多数のベクター主鎖を用い得る。このようなベクターは、アデノウイルス、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、モロニーマウス白血病ウイルス、ＤＮＡ送達系、すなわちリポソームおよび発現プラスミド送達系を含むが、これらに限定されない。さらに、ベクターの一つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスまたはセムリキ森林熱ウイルスなどのウイルスに由来するＤＮＡ要素を含む。このようなベクターは商業的に入手できるか、または記載の配列を既知の方法で組み立て得る。
適当な宿主細胞のベクターを含むポリペプチド産生のための宿主ベクター系がここに提供される。適当な宿主細胞は、原核生物または真核生物細胞、例えば細菌細胞(グラム陽性細胞を含む)、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞および動物細胞を含むが、これらに限定されない。多数の哺乳動物細胞を宿主として使用でき、マウス線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ細胞などを含むが、これらに限定されない。さらなる動物細胞、例えば、Ｒｌ.ｌ、Ｂ－ＷおよびＬ－Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(例えば、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０)、昆虫細胞(例えば、Ｓｆ９)およびヒト細胞および組織培養における植物細胞も使用され得る。
広範な宿主／発現ベクター組み合わせを、ここに示すポリヌクレオチド配列発現に用い得る。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適当なベクターは、ＳＶ４０の誘導体および既知細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えば、ファージＡの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２！ｌプラスミドなどの酵母プラスミドまたはその誘導体；真核生物細胞で有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を用いるように修飾されているプラスミドなどを含む。
広範な発現調節配列(それに操作可能に結合したヌクレオチド配列の発現を調節する配列)の何れも、ここに提供するポリヌクレオチド配列を発現させるために、これらベクターで使用し得る。このような有用な発現調節配列は、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの早期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター(例えば、Ｐｈｏ５)、酵母ａ－接合因子のプロモーターおよび原核生物または真核生物細胞またはそのウイルスで遺伝子発現を調節することが知られる他の配列およびこれらの種々の組み合わせを含む。
全てのベクター、発現調節配列および宿主が、ここに提供するポリヌクレオチド配列の発現に、等しく良好に機能するとは限らないことは理解される。全ての宿主は、同じ発現系で等しく良好に機能しない。しかしながら、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、所望の発現を達成するために、過度の実験なく、適切なベクター、発現調節配列および宿主を選択できる。例えば、ベクターの選択に際し、宿主を、ベクターがそれで機能しなければならないため、考慮すべきである。ベクターのコピー数、そのコピー数抗生物質マーカーなどのベクターによりコードされる何らかの他のタンパク質のおよび発現を調節する能力も考慮される。
発現調節配列選択に際し、多様な因子が通常考慮される。これらは、例えば、系の相対強度、その可制御性および、特に潜在的二次構造に関連して、発現される特定のヌクレオチド配列または遺伝子とのその適合性を含む。適当な単細胞宿主を、例えば、選択ベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正確に折り畳む能力および発酵要求ならびに発現されるヌクレオチド配列によりコードされる産物の宿主に対する毒性および発現産物精製の容易さを考慮して選択する。
発現カセットの調製において、種々のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド配列を、適切な配向でかつ、適当ならば、適切な読み取り枠で提供するように、操作し得る。この目的のために、アダプターまたはリンカーをポリヌクレオチドの連結に用いてよくまたは他の操作が簡便な制限部位、不必要ＤＮＡの除去、制限部位の除去などのために含まれ得る。例えば、２つのグリシンなどのリンカーを、ポリペプチド間に付加し得る。ＡＴＧヌクレオチド配列によりコードされるメチオニン残基を、遺伝子転写を開始させるために付加し得る。この目的で、インビトロ変異導入、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、トランジションおよびトランスバージョンが含まれ得る。
さらに提供されるのは、ここに開示する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞で該ポリペプチドのポリペプチドを可能にする適当な条件下発現させ、およびそうして産生されたポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを製造する方法である。
７.７.２ 治療的使用および方法
ここに記載する融合タンパク質および方法は、例えば、ＩＬ２Ｒα(例えば、シグナル伝達)または阻害(または拮抗)によるなどの、免疫応答の増強またはＩＬ２の検出が関与する、多数のインビトロおよびインビボ有用性がある。例えば、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、培養細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与して、多様な疾患における免疫を増強することができる。従って、ここに提供されるのは、処置を必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であって、対象における免疫応答が修飾されるように、対象にここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、応答は増強、刺激または上方制御される。
本方法に適する対象は、免疫応答増強が望ましいヒト患者を含む。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞介在免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)増強により処置され得る障害を有するヒト患者の処置に特に適する。ある実施態様において、方法は、インビボでの癌処置に特に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を目的の抗原と共に投与できまたは抗原は処置対象に既に存在し得る(例えば、腫瘍担持またはウイルス担持対象)。ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を他の薬剤と共に投与するとき、２剤は別々に投与しても、同時に投与してもよい。
また包含されるのは、サンプルにおけるヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２Ｒαの存在を検出するまたはヒトＩＬ２抗原の量を測定する方法であって、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＩＬ２またはＩＬ２Ｒαに特異的に結合する融合タンパク質またはモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質およびヒトＩＬ２Ｒαの間で複合体の形成を可能とする条件下で接触させることを含む。次いで、複合体形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較したサンプルの複合体形成の差異は、サンプル中のヒトＩＬ２またはＩＬ２Ｒαの存在の指標である。さらに、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質が免疫親和性精製を介するヒトＩＬ２またはＩＬ２Ｒαの精製に使用できる。
ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質が、ＩＬ２またはＩＬ２Ｒαの負の作用の阻害によるなど、Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激または共刺激する能力から、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答の刺激、増強または上方制御のために、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を使用するインビトロおよびインビボ方法である。ある実施態様において、ＣＤ３刺激も提供され(例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との共インキュベーションによる)、この刺激は、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の刺激と同時、前または後に提供され得る。例えば、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、該Ｔ細胞とここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質および所望により抗ＣＤ３抗体を、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように接触させることを含む、方法である。
抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために抗原特異的Ｔ細胞応答を何れかの適当なインディケーターが使用できる。このような適当なインディケーターの非限定的例は、抗体存在下のＴ細胞増殖増加および／または抗体存在下のサイトカイン産生増加を含む。ある実施態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン－２および／またはインターフェロン－γ産生が刺激される。
ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質で増強または共刺激されるＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞はＴｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞(例えば、Ｔｈ１細胞)またはＴ細胞毒性(Ｔｃ)細胞であり得る。
さらに包含されるのは、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を刺激する方法であって、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が刺激されるように、対象にここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある実施態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある実施態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ－Ｌ１陽性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ－Ｌ１陰性である。対象はウイルス担持対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
さらに提供されるのは、対象における腫瘍細胞増殖を阻害する方法であって、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように、対象にここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、方法である。また提供されるのは、対象におけるウイルス感染を処置する方法であって、対象においてウイルス感染が処置されるように、対象にここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、方法である。
ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を補助的治療として対象に与える。ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での癌を有する対象の処置は、現在の標準療法と比較して、長期生存、例えば、長期持続可能応答、少なくとも３か月、６か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の長期生存または少なくとも３か月、６か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれ以上の無再発生存をもたらし得る。ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の癌を有する対象の処置は、例えば、３か月、６か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれ以上、癌再発を予防するかまたは癌再発を遅延させる。ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質処置が第一選択、第二選択または第三選択処置として使用できる。
ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の癌を有する対象の処置は、例えば、疾患安定、部分応答、全生存増加、無疾患生存増加または無進行生存増強をもたらし得る。
ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の毒性は顕著ではない。例えば、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、例えば、臨床治験で決定して、ヒト臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１以上に顕著に毒性ではない。ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を顕著に誘発しない。
ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での対象の処置は、対象の免疫系がその後対象自体を攻撃する(例えば、自己免疫性応答)または、例えば、アナフィラキシーをもたらすほどに免疫系の過剰刺激をもたらさない。それ故に、ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質はアナフィラキシーを引き起こさない。
ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での対象の処置は、顕著な炎症性反応、例えば、免疫介在肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症または他の免疫介在有害反応を引き起こさない。ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での対象の処置は、顕著な心臓障害、例えば、心室性不整脈；眼障害、例えば、虹彩毛様体炎；点滴関連反応；アミラーゼ増加、リパーゼ増加；神経系障害、例えば、めまい、末梢および感覚性ニューロパチー；皮膚および皮下組織障害、例えば、発疹、掻痒、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、白斑症または乾癬；呼吸器、胸部および縦隔障害、例えば、咳嗽；疲労；悪心；食欲減退；便秘；関節痛；または下痢を引き起こさない。
ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、免疫系を刺激する化合物(例えば、腫瘍免疫療法剤)、例えば、ここに記載する化合物またはここに記載する標的を調節する化合物などの他の癌治療と組み合わせて相乗的抗腫瘍効果を提供する。
ある実施態様において、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、局所、上皮粘膜、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管支、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外または胸骨内経路により投与される。
対象における免疫応答のための種々の方法が提供される。このような方法は、免疫応答の増加が必要な対象に、治療有効量のＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。すなわち、特定の実施態様において、高用量ＩＬ２の一時的な適用が、免疫エフェクターおよび記憶応答押し上げのために用いられる。
対象における免疫応答減少のための種々の方法が提供される。このような方法は、免疫応答の減少が必要な対象に、治療有効量のＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。望まれない免疫応答を阻害するために、Ｔｒｅｇの抑制力を利用することに対する興味が高まっている。マウスおよびヒトでのデータは、低用量のＩＬ２でのＩＬ２Ｒシグナル伝達増強が、Ｔｒｅｇを選択的に押し上げ、免疫寛容原性機構を増強することを示している。ＩＬ２／ＩＬ２Ｒαここに提供する融合タンパク質は、Ｔｒｅｇをより強力に増強する、ＩＬ２の新規かつ改善された形態を表す。それ故に、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、自己免疫性疾患、慢性移植片対宿主病、移植片拒絶反応および目的が自己反応抑制である他の状態を有する患者に投与し得る。
ここに記載するこれらおよび他の方法を、下にさらに詳述する。
７.７.２.１ 癌
ある実施態様において、ここに開示されるのは、癌を処置する方法である。ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質によるＩＬ２Ｒα阻害は、癌を有する患者における癌細胞に対する免疫応答を増強し得る。ここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であって、対象が処置される、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻害または低減されるおよび／または腫瘍が退行するおよび／または長期生存が達成されるように、対象にここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、方法である。ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、癌性腫瘍増殖阻害に単独で使用し得る。あるいは、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、下記の、他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と共に使用し得る。
従って、ここに提供されるのは、対象に治療有効量のここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む、対象における、例えば、腫瘍細胞増殖阻害により、癌を処置する方法である。増殖が本発明の抗体を使用して阻害され得る癌は、免疫療法に一般に応答性の癌および免疫療法に一般に応答性ではない癌を含む。癌は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍(液体腫瘍)を伴う癌であり得る。ある実施態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮癌、子宮内膜癌、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、扁平上皮細胞癌、皮膚癌、中枢神経系新生物、リンパ腫、白血病、肉腫、ウイルス関連癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化器癌、ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、骨髄腫、唾液腺癌、腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌または頭頸部癌およびこれらの何らかの組み合わせである。
処置のための癌の他の非限定的例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非扁平ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎癌(例えば、明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、神経膠芽腫(神経膠芽腫多形)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌(gastric cancer)、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫など転移性悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域癌、精巣癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌、外陰部癌腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、上皮小体腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、尿管癌、腎盂癌腫、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含む環境誘導性癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌(例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ関連もしくは起源の腫瘍))および２種の主要な血液細胞系統の何れか、すなわち、骨髄系細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ球系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)に由来する血液悪性腫瘍、例えば、すべての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(ＭＯ)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３変異体[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異体[Ｍ４Ｅ])、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ球系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ １＋)大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病(Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる)およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも呼ばれる)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscaroma)および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫を含めたその他の腫瘍、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病(Ｔ－ＰＬＬ)などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽球性亜種)；血管中心性(鼻腔の)Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記の癌の何らかの組み合せを含む。ここに記載する方法はまた、転移性癌、切除不能な難治性癌(例えば、遮断性ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１抗体を用いる、例えば、先の免疫療法に対して難治性の癌)および／または再発性癌の治療のために使用し得る。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、以前の処置、例えば、腫瘍免疫療法または免疫療法剤を用いた以前の処置に対して難治性な応答を示したかもしくはその後進行した癌を有する患者に、または難治性もしくは抵抗性、本質的に不応性もしくは抵抗性の何れかである(例えば、ＰＤ－１経路アンタゴニストに対して不応性である)癌を有する患者に、または耐性もしくは不応性状態が獲得された場合に、投与する。例えば、第一治療に対して応答性でないかもしくは十分に応答性でない対象を、または処置後、例えば、抗ＰＤ－１での処置後に、疾患の進行が見られる対象を、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の、単独または別の治療法(例えば、抗ＰＤ－１治療法)と組み合わせた投与によって、処置することができる。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、腫瘍免疫療法剤、例えば、ＰＤ－１経路アンタゴニスト先に受けていない(すなわち、処置されていない)患者に投与する。
ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質で癌を有する対象を処置する方法は、ＩＬ２またはＩＬ２Ｒαを発現する癌細胞を有する対象に、治療有効量のここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含み得る。またここに提供されるのは、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での処置に対象が応答するか否かを予測する方法であって、ここで、患者でＩＬ２またはＩＬ２Ｒαレベルを決定することを含み、対象がＩＬ２またはＩＬ２Ｒαが陽性であるならば、対象はここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での処置に応答する可能性があるものである。
ある実施態様において、対象における癌を処置する方法は、まず、対象が、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１陽性である、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を発現する腫瘍細胞またはＴＩＬを有するかどうかを判定し、対象がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１陽性癌細胞またはＴＩＬ細胞を有するならば、対象に、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)を投与することを含む。ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質で癌を有する対象を処置する方法(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を発現する癌細胞またはＴＩＬ細胞を有する対象に、治療有効量のここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)を投与することを含み得る。またここに提供されるのは、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)での処置に対象が応答するか否かを予測する方法、患者の癌またはＴＩＬ細胞におけるＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１レベルを決定することを含み、対象の癌またはＴＩＬ細胞がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１陽性であるならば、対象はここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質(および所望によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト)での処置に応答する可能性があるものである。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を標準治療処置と共に投与する。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を維持治療、例えば、腫瘍の発生または再発を予防することを意図する治療として投与し得る。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、他の処置、例えば、放射線、手術または化学療法と投与する。例えば、ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を使用する補助的治療は、微小転移が存在し得る危険性があるとき、および／または再発の危険性を低減するために、投与され得るが投与される。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を単剤治療としてまたは唯一の免疫刺激治療として投与する。ＩＬ２Ｒαに対する抗体また、免疫原性剤、例えば、癌細胞、精製腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞ならびに免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞と組み合わせることができる(He et al.,(2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む(以下にさらに記載)。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、ワクチン接種プロトコールと組み合わせる。腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738参照; Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Editionも参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ－ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であることが示されている。ＧＭ－ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであることが示されている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43)。
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合には、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ－２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示され得る。これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物とともに使用できる。これらのタンパク質は、正常には、自己抗原として免疫系によって見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％超において、および限定された数の体細胞組織のみにおいて発現されるタンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変更するか、または２種の無関係の配列間の融合タンパク質(すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｃｒ－ａｂｌ)もしくはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプを作製する体細胞突然変異のために癌細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
その他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌に関わるウイルスに由来するタンパク質を含み得る。本発明の融合タンパク質と共に使用できる腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製されたヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達で高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答を発動させるために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載させることができる(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣはまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝的手段によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫処置を目的として腫瘍細胞と直接融合されている(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化するよう、ＤＣ免疫処置を、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と効率的に組み合わせることができる。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を使用する癌を処置する方法を、標準癌処置(例えば、手術、放射線および化学療法)と組み合わせる。このような組み合わせの例は、黒色腫処置のための、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と組み合わせた抗ＴＩＭ３抗体である。ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質および化学療法の組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死によりここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と相乗性をもたらし得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン抑制である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の起源となる。血管形成阻害剤もここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と組み合わせ得る。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
ここに開示するここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質をまた腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせても使用できる(例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同第５,８３７,２４３号を参照のこと)。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ)二重特異性抗体が、腫瘍の部位に対するマクロファージを標的とするために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答を効率的に活性化し得る。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達され得る。
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ－β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ－１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答に有利に働くよう、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と組み合わせて使用できる。
宿主免疫応答性を活性化するその他の抗体を、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、効率的に、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＴＩＭ３抗体とともに使用できる。ＣＴＬＡ－４(例えば、米国特許５,８１１,０９７)、ＯＸ－４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169)、４－１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することはまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供し得る。ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤もまた、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と共に使用してもよい。その他の組合せは、本明細書の別の箇所に提供される。
骨髄移植は、現在造血起源の多様な腫瘍の処置に使用される。移植片対宿主病は、この処置の結果であるが、治療的利益が移植片対腫瘍応答から得られ得る。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を使用して、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大することができる。
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および拡大、および腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含むいくつかの実験治療プロトコールも存在する(Greenberg & RiddellScience 285: 546-51)。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化するよう使用できる。ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質でのエキソビボ活性化は、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大することができる。
７.７.２.２ 炎症性疾患または自己免疫性疾患
ある実施態様において、ここに記載されるのは、処置を必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であり、ここで、疾患または障害は、炎症性疾患または自己免疫性疾患である。ある実施態様において、方法は、対象に治療有効量のここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、先の処置に応答が不適切であるまたは進行した炎症性疾患または自己免疫性疾患を有する患者に投与する。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、炎症性疾患または自己免疫性疾患について先に処置を受けていない(すなわち処置されていない)患者に投与する。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、炎症性疾患または自己免疫性疾患の標準治療処置と投与する。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を炎症性疾患または自己免疫性疾患の維持治療、例えば、炎症の発症または再発を防止することを意図した治療として投与する。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、炎症性疾患または自己免疫性疾患処置の単剤治療としてまたは炎症性疾患または自己免疫性疾患の処置の唯一の免疫刺激治療として投与する。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、炎症性疾患または自己免疫性疾患の処置のためのワクチン接種プロトコールと組み合わせる。ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、炎症性疾患または自己免疫性疾患処置に使用する抗体と組み合わせる。
ある実施態様において、炎症性疾患または自己免疫性疾患は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚ループス、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎または全身性硬化症、移植片対宿主病、乾癬、円形脱毛症、ＨＣＶ誘発脈管炎、シェーグレン症候群、天疱瘡、強直性脊椎炎、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫、高安病、自己免疫性肝炎、硬化性胆管炎、グーゲル・シェーグレンおよびマクロファージ活性化症候群からなる群から選択される。
７.７.２.３ 感染性疾患
ここに記載する方法を、特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置に使用し得る。従って、ある実施態様において、ここに記載されるのは、処置を必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であり、ここで、疾患または障害は、感染性疾患である。ある実施態様において、方法は、感染性疾患を処置するために、対象に治療有効量のここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を投与することを含む。
上記の腫瘍適用に類似して、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での処置を含む方法を、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせで使用する。この治療的アプローチが特に有用である病原体の例は、現在有効なワクチンがない病原体または慣用のワクチンの効果が十分ではない病原体を含み得る。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、Ｂ＆Ｃ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。
ここに記載する方法により処置可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスの例の一部は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バールウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
ここに記載する方法により処置され得る感染を引き起こす病原性細菌の一部例は、クラミジア、リケッチア目細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア、サルモネラ属、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス症、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。
ここに記載する方法により処置され得る感染を引き起こす病原性真菌の一部例は、カンジダ(アルビカンス、クルーセイ、グラブラータ、トロピカリスなど)、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ムーコル目(ムコール属、アブシジア属、リゾプス属)、スポロトリックス・シェンキィ、ブラストマイセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムを含む。
ここに記載する方法により処置され得る感染を引き起こす病原性寄生虫の例は、赤痢アメーバ、大腸バランジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、ブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノヴァン・リーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンディおよびブラジル鉤虫を含む。
上記方法の全てにおいて、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質での処置を、免疫療法の他の形態、例えば、ここに記載のもの、例えばサイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ２)または腫瘍抗原の増強された提示を提供する二特異的抗体治療と組み合わせ得る(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2: 1121-1123参照)。
７.７.２.４ ワクチン
ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与により、抗原特異的免疫応答を刺激するために使用され得る。従って、ここに提供されるのは、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であり、対象に(ｉ)抗原；および(ii)ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように投与することを含む。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上に記載したもの、例えば上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体からの抗原を含む。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質を、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の代わりに、またはそれに加えて、ワクチンとして使用する。
インビボおよびインビトロでここに記載する抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異的および二特異的分子およびイムノコンジュゲート)を投与する適当な経路は当分野で周知であり、当業者により選択され得る。例えば、抗体組成物は注射により投与され得る(例えば、静脈内または皮下)。使用する分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重および抗体組成物の濃度および／または製剤による。
７.７.２.５ 第二剤との共投与
先に記載のとおり、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、１以上の他の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と共投与し得る。抗体を該薬剤と結合でき(免疫複合体として)または該薬剤と別に投与し得る。後者の場合(別の投与)、抗体を、他の既知治療、例えば、抗癌治療、例えば、放射の前、後または同時に投与し得る。このような治療剤は、数ある中で、それ自体、患者に毒性または準毒性であるレベルでしか有効ではない、抗新生物剤、例えばドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素を含む。シスプラチンは、１００mg／ml投与量で４週に１回静脈内投与され、アドリアマイシンは、６０～７５mg／ml投与量で２１日毎に１回静脈内投与される。ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質と化学療法剤の共投与は、異なる作用機序で作用する２つの抗癌剤を提供し、これは、ヒト腫瘍細胞に細胞毒効果を生じる。このような共投与は、薬物への抵抗性獲得または抗体に反応しなくなる腫瘍細胞の抗原性変化による問題を解決し得る。
ここに提供されるのは、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、免疫応答の刺激に有効であり、それにより対象における免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する、１以上のさらなる薬剤(第二治療剤)、例えば、小分子薬物、抗体またはその抗原結合部分と共投与することを含む組み合わせ治療の方法である。
一般に、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、Ｔ細胞などの免疫細胞の(ｉ)刺激(例えば、共刺激)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストおよび／または(ii)阻害性シグナルまたは分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストと組み褪せることができ、この何れも抗原特異的Ｔ細胞応答などの免疫応答を増強させる。ある態様において、腫瘍免疫療法剤は、細胞、例えば、Ｔ細胞活性化を阻害するものまたは自然免疫に関与するもの、例えば、ＮＫ細胞の(ｉ)刺激(共刺激を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストまたは(ii)阻害性(共阻害性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストであり、ここで、腫瘍免疫療法剤は自然免疫を増強する。このような腫瘍免疫療法薬は、しばしば免疫チェックポイント調節剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント刺激剤と称される。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである刺激性または阻害性分子を標的とする薬剤と投与する。例えば、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、対象に、例えば、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤と投与して、免疫応答を増加させ得る。例えば、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１(ＰＤ－Ｌ１)、Ｂ７－ＤＣ(ＰＤ－Ｌ２)、Ｂ７－Ｈ２(ＩＣＯＳ－Ｌ)、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７－Ｈ６を含む膜結合リガンドのＢ７ファミリーのメンバーを標的とする(または特異的に結合する)薬剤または共刺激またはＢ７ファミリーメンバーに特異的結合する共阻害性受容体またはリガンドと共に投与し得る。
ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質は、分子のＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバー(リガンドまたは受容体)、例えばＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－ｌＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ １４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴｐＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンフォトキシンａ／ＴＮＦｐ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦａ、ＬＴｐＲ、リンフォトキシンａ １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹおよびＮＧＦＲを標的とする薬剤とも共投与し得る(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00: 1参照)。
ある実施態様において、ここに開示するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を、抗ＰＤ－１抗体を含む薬剤と投与する。抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＰＤ－１抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＰＤ－１抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、ニボルマブを含む。ある実施態様において、第二治療剤は、ペンブロリズマブを含む。
ある実施態様において、第二治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、アテゾリズマブを含む。ある実施態様において、第二治療剤は、デュルバルマブを含む。ある実施態様において、第二治療剤は、アベルマブを含む。
ある実施態様において、第二治療剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＴＬＡ－４に結合し、その活性を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＣＴＬＡ－４抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、トレメリムマブを含む。ある実施態様において、第二治療剤は、イピリムマブを含む。
ある実施態様において、第二治療剤は、抗ＬＡＧ３抗体を含む。抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ－３に結合し、その活性を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＬＡＧ３抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、２５Ｆ７を含む。
ある実施態様において、第二治療剤は、抗ＣＤ１３７抗体を含む。抗ＣＤ１３７抗体は、ＣＤ１３７に結合し、その活性を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＣＤ１３７抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＣＤ１３７抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、ウレルマブを含む。
ある実施態様において、第二治療剤は、抗ＫＩＲ抗体を含む。抗ＫＩＲ抗体は、ＫＩＲに結合し、その活性を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＫＩＲ抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＫＩＲ抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、リリルマブを含む。
ある実施態様において、第二治療剤は、抗ＧＩＴＲ抗体を含む。抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲに結合し、その活性を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＧＩＴＲ抗体である。ある実施態様において、第二治療剤は、ＭＫ４１６６を含む。ある実施態様において、第二治療剤は、ＴＲＸ５１８を含む。
他の実施態様において、第二治療は、抗ＴＩＭ３抗体の投与を含む。抗ＴＩＭ３抗体は、ＴＩＭ３に結合し、その活性を阻害する、あらゆる抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体は、当分野で知られるあらゆる抗ＴＩＭ３抗体である。
ある実施態様において、第二治療は、化学療法剤の投与を含む。ある実施態様において、化学療法剤は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節性薬物(ＩＭｉＤ)、Ｂｅｔ阻害剤およびこれらの何れかの組み合わせから選択される。ある実施態様において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブおよびマリゾミブから選択される。ある実施態様において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブを含む。
ある実施態様において、第二治療は、放射線療法を含む。当分野で知られるあらゆる放射線療法が第二治療として使用できる。
ある実施態様において、第二治療は、自然免疫細胞を活性化する薬剤の投与を含む。ある実施態様において、自然免疫細胞を活性化する薬剤は、ＮＬＲＰ３アゴニストを含む。ある実施態様において、ＮＬＲＰ３アゴニストは、尿酸ナトリウム水和物(ＭＳＵ)および／またはワクチンアジュバントアルムを含む。ある実施態様において、自然免疫細胞を活性化する薬剤は、ｔｏｌｌ様受容体７(ＴＬＲ７)アゴニストである。ある実施態様において、ＴＬＲ７アゴニストは、イミキモド(Ｒ８３７)、ＧＳ－９６２０(Tsai et al., J. Virology doi:10.1128/JVI.02166-16 (Feb. 8, 2017))、ＯＲＮ Ｒ－２３３６(Miltenyl Biotec参照)またはこれらの何れかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、第二治療は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞または両者の生存を増強する薬剤の投与を含む。
ある実施態様において、第二治療は、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標))、シスプラチン、カルボプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)；NEOSAR(登録商標))、レナリドマイド(レブラミド(登録商標))、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))、デキサメサゾン、ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン、ベンダムスチン(TREANDA(登録商標))、リツキシマブ(リツキサン(登録商標))、イホスファミド、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))、フルダラビン(フルダラ(登録商標))、サリドマイド(サロミド(登録商標))、アレムツズマブ(キャンパス(登録商標))、オファツムマブ(アーゼラ(登録商標))、エベロリムス(アフィニトール(登録商標)、ZORTRESS(登録商標))、カルフィルゾミブ(カイプロリスTM)およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される薬剤の投与を含む。
上記タンパク質の１つを調節し、癌の処置にここに記載する融合タンパク質と組む合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイ(登録商標)(イピリムマブに対する)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ－４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ－９３６５５８(ＰＤ－１に対する)、ＭＫ－３４７５(ＰＤ－１に対する)、アテゾリズマブ(テセントリク(登録商標に対する)に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ－９３６５５９(Ｂ７－Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７－Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ－５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ－３に対する)、ＢＭＳ－６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ－０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ－１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ－８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ((ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ－ＣＤ３(ＣＤ３に対する)；抗ＧＩＴＲ抗体ＭＫ４１６６、ＴＲＸ５１８、Ｍｅｄｉ１８７３、ＩＮＢＲＸ－１１０、ＬＫ２－１４５、ＧＷＮ－３２３、ＧＩＴＲＬ－Ｆｃまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
癌の治療のために融合タンパク質と組み合わせることができるその他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、抗ＴＩＭ３抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせることができる。
Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御され、ここに記載する融合タンパク質は、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストとともに、例えば癌を有する対象に投与され得る。
ある実施態様において、ここに記載する融合タンパク質を、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤もしくは遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ；「免疫抑制性サイトカイン」)のアンタゴニストおよび／または(ii)免疫応答を刺激するための、例えば、癌などの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
組み合わせ治療のためのさらに他の薬剤は、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇する薬剤を含み、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、Ｗ０１３／８７６９９、Ｗ０１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４)またはＦＰＡ－００８(ＷＯ１１／１４０２４９；Ｗ０１３１６９２６４；ＷＯ１４／０３６３５７)を含む、ＣＳＦ－１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ－１Ｒアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。
本発明の融合タンパク質はまた、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する薬剤とともに投与してもよい。
ここに記載する融合タンパク質と組み合わせることができるさらなる薬剤は、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモド、または腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法(例えば、アントラサイクリン)を含む。
ここに記載する融合タンパク質と組み合わせることができる他の治療は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療である。
ここに記載する融合タンパク質とともに使用され得る別のクラスの薬剤は、アデノシンの形成を阻害する薬剤、例えばＣＤ７３阻害剤またはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤を含む。
癌を治療するためにここに記載する融合タンパク質と組み合わせることができる他の治療法は、Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を逆転／防止する治療法ならびに腫瘍部位における自然免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療を含む。
癌を治療するためにここに記載する融合タンパク質と組み合わせることができるその他の治療は、ＩＬ－８を遮断する治療法、例えば、ＨｕＭａｘ－ＩＬ８を用いるものが挙げられる。
ここに記載する融合タンパク質は、１を超える腫瘍免疫療法薬と組み合わせてもよく、例えば、次の：腫瘍抗原の提示を増強する治療(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)；例えば、ＣＴＬＡ－４および／もしくはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を阻害するならびに／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞を枯渇もしくは遮断することによって、負の免疫制御を阻害する治療；例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０および／もしくはＣＤ４０もしくはＧＩＴＲ経路を刺激するアゴニストならびに／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストを用いて、正の免疫調節を刺激する治療；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる治療；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト(例えば、ダクリズマブ)を使用してまたはエクスビボでの抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって腫瘍におけるＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療；腫瘍における抑制骨髄系細胞の機能に影響を及ぼす治療；腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療(例えば、アントラサイクリン)；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞(ＣＡＲ－Ｔ療法)を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療；Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を逆転／防止する治療；腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療；免疫刺激サイトカインの投与；あるいは免疫抑制サイトカインの遮断の１つ以上など、免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせてもよい。
ここに記載する融合タンパク質は、１以上の、陽性共刺激性受容体をライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬、アンタゴニストならびに１以上の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増大する薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路を遮断し(例えば阻害性受容体結合(例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用)を遮断しＴｒｅｇを枯渇または阻害し(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって)、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転させる／防ぐ)薬剤および自然免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症を誘導する薬剤と共に使用できる。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質、対象が、ＢＲＡＦ Ｖ６００突然変異に関して陽性である場合、ＢＲＡＦ阻害剤と一緒に対象に投与される。
例えば、本発明の融合タンパク質およびここに記載する組み合わせ治療は、放射線照射および／または化学療法、(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ－１１)、５－フルオロウラシル(５－ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン－パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５－ＦＵまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘ ｃｏｍｂｏ)を使用する)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ－２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ－２’(ｂｃｌ－ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ－１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ－９１９、またはＦ００１２８７)、ＡＴ－１０１(Ｒ－(－)－ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ－２６３(小分子)、ＧＸ－１５－０７０(オバトクラックス(obatoclax))またはＭＣＬ－１(骨髄系白血病細胞分化タンパク質－１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質の阻害剤)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ－３５１５６(ＧＥＭ－６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管新生阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(Hyer et al, Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと)、ｃ－ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲｙ(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド(Lenalildomide)、ＧＳＫ３Ｐ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて(例えば、同時または別個に)使用できる。
本発明の融合タンパク質およびここに記載する組み合わせ治療は、１以上の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、次のものを含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標))ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む)：メトトレキサート、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカププリン、６－チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
当分野で知られる他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、本発明の融合タンパク質と組み合わせるのに適した、タキサン、パクリタキセル(パクリタキセルは、タキソールTMとして市販されている)、ドセタキセル、ディスコデルモリド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシド(Peloruside)Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]－デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３－シクロプロピル－エポチロンＡ、Ｃ６－Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス－９,１０－デヒドロエポチロンＤ、シス－９,１０－デヒドロエポチロンＤ、１６－デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢＩＯ、ディスコデルモリド(discoderomolide)、パツピロン(patupilone)(ＥＰＯ－９０６)、ＫＯＳ－８６２、ＫＯＳ－１５８４、ＺＫ－ＥＰＯ、ＡＢＪ－７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモリド(discoderomolide))、ＴＺＴ－１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ－６５１(タシドチン塩酸塩(tasidotin hydrochloride))、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩(Eribulin mesylate)(Ｅ－７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ－２８６)、Ｅ－７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ－３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート(ＤＭ－１)、ＭＫＣ－１、ＡＢＴ－７５１、Ｔ１－３８０６７、Ｔ－９００６０７、ＳＢ－７１５９９２(イスピネシブ(ispinesib))、ＳＢ－７４３９２１、ＭＫ－０７３１、ＳＴＡ－５３１２、エリュテロビン、１７β－アセトキシ－２－エトキシ－６－オキソ－Ｂ－ホモ－エストラ－１,３,５(１０)－トリエン－３－オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４－エピ－７－デヒドロキシ－１４,１６－ジデメチル－(＋)－ディスコデルモリドおよびクリプトチロン(cryptothilone)１であるが、これらに限定されない抗増殖性薬剤。
ここに記載する本発明の融合タンパク質を用いる治療とともに、またはそれに先立って異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ－エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル－テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ZOLADEXTM(登録商標)などのホルモンおよびステロイド(合成類似体を含む)も、患者に投与できる。ここに記載する方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
ある実施態様において、ここに記載する本発明の融合タンパク質と第二剤の組み合わせを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の本発明の融合タンパク質および第二剤を有する別個の組成物として同時に、投与できる。ある実施態様において、本発明の融合タンパク質と第二剤の組み合わせは、逐次的に投与され得る。２つの薬剤の投与は、例えば、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、５日間、７日間、または１週間もしくは数週間離れた時点で開始してもよく、または第２の薬剤の投与は、例えば、第１の薬剤を投与した３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、３日後、５日後、７日後、または１週間後もしくは数週間後に開始してもよい。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質および／または第二剤と組み合わせることができる抗新生物抗体としては、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、リンホサイド(Lymphocide)(登録商標)(エプルツズマブ(eprtuzumab))、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)またはこれらの何れかの組合せが挙げられる。ある実施態様において、本発明の融合タンパク質との組み合わせ治療に有用な第二抗体は、抗体薬物コンジュゲートであり得る。
ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、単独または別の薬剤と組み合わせて、造血起源の多様な腫瘍を処置するために、骨髄移植と同時にまたは逐次的に使用される。
ここに提供されるのは、第二剤を伴って、または伴わずに対象に本発明の融合タンパク質を投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患(例えば、癌)の治療と関連する有害事象を変更するための方法である。例えば、ここに記載する方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。ここに記載するある実施態様において、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ENTOCORT EC(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。ある実施態様において、非吸収性ステロイドを伴う本発明の融合タンパク質を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸は、例えば、スルファサラジン(AZULFIDINE(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(DJPENTUM(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(ASACOL(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標)、Solvay)などの５－ＡＳＡ薬剤を含む。
７.８ キット
ここで使用するキットは、本明細書の他の箇所に記載する、免疫応答の調節に使用するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を含む。ここで使用する用語「キット」および「系」は、特定の実施態様において、１以上の他のタイプの要素または成分(例えば、他のタイプの生化学試薬、容器、パッケージ、商業販売用に意図されるパッケージ、使用指示など)と組み合わせることが意図される、少なくとも１以上のＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質をいう。
ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質の１以上、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を含む組成物、ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質をコードする核酸、ベクターおよび／または宿主細胞；および(ｂ)および該融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質および(ｂ)および該融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質を含む組成物および(ｂ)および該組成物のそれを必要とする対象への投与の指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＩＬ２／ＩＬ２Ｒα融合タンパク質をコードする核酸および(ｂ)および該核酸のそれを必要とする対象への投与の指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するベクターおよび(ｂ)および該ベクターのそれを必要とする対象への投与の指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する宿主細胞および(ｂ)および該宿主細胞のそれを必要とする対象への投与の指示を含む、キットである。
特定の実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供する融合タンパク質の１以上などの、ここに記載する医薬組成物の成分の１以上で満たされた１以上の容器を含む、薬学的パックまたはキットである。ある実施態様において、キットは、ここに記載する医薬組成物および何らかの予防または治療剤、例えば、ここに記載のものを含む。ある実施態様において、キットは、例えば、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)および／またはホルボールミリステート酢酸塩(ＰＭＡ)などのＴ細胞有糸分裂促進因子または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などのＴＣＲ複合体刺激抗体を含む。所望により、このような容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の指示書を添付でき、この指示書は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映したものである。
またここに提供されるのは、上記方法に使用できるキットである。ある実施態様において、キットは、ここに記載する融合タンパク質、好ましくは、精製融合タンパク質を１以上の容器に含む。特定の実施態様において、ここに記載するキットは、対照として、実質的に単離された融合タンパク質を含む。他の特定の実施態様において、ここに記載するキットは、さらにＩＬ２および／またはＩＬ２－Ｒα抗原と反応しない対照抗体または融合タンパク質を含む。他の特定の実施態様において、ここに記載するキットは、融合タンパク質のＩＬ２および／またはＩＬ２－Ｒα抗原への結合を検出する１以上の要素を含む(例えば、融合タンパク質を、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物などの検出可能基質と検出できまたは第一抗体を認識する第二抗体を検出可能基質とコンジュゲートし得る)。特定の実施態様において、ここに提供するキットは、組み換えにより産生されたまたは化学合成融合タンパク質を含み得る。キットで提供される、ここに開示する融合タンパク質に対する抗原も、固体支持体に結合させ得る。より特定の実施態様において、上記キットの検出手段は、融合タンパク質の抗原が結合した固体支持体を含む。このようなキットは、非結合レポーター標識抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体も含み得る。この実施態様において、融合タンパク質の抗原への結合は、該レポーター標識抗体の結合により検出され得る。
本開示の実施には、別途示されない限り、細胞生物学、細胞培養学、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来的な技術が用いられ、これらは、当業者の技術の範囲内である。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)、D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II、Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis、Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195、Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization、Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation、Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)、Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)、Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning、the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)、Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155、Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)、Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV、Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); )、Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照のこと。
上記に引用された参考文献のすべておよび本明細書において引用されるすべての参考文献ならびにアミノ酸またはヌクレオチド配列(例えば、GenBank numbersおよび/またはUniprot numbers)は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるものである。
８. 実施例
実施例１. ＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質は、安定な、均一ホモダイマーを形成する
融合タンパク質のサイズおよびオリゴマー状態を、インラインマルチアングル光散乱検出器と連結させたサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ－ＭＡＬＳ)により試験した。３０μgのストックタンパク質サンプルの注入により、サンプルを調製した。定組成分離を、脱ガス装置、定組成ポンプ、注入器を伴う冷却サンプルホルダー、ＵＶ／viｓ検出器およびカラムオーブンからなるProminence Shimadzu UFLC系に接続したGE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GLカラム(１０mm×３００mm)で、４０mM Ｔｒｉｓ、２００mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.５)を含み、０.０２％Ｎａアジドを加え、０.１μm濾過した緩衝液中、流速０.７５mL／分で流して実施した。サンプルをShimadzuオートサンプラーを使用してカラムに注入し、データを、２８０nmでの取得に設定されたShimadzu SPD-20二波長ＵＶ／viｓ分光光度計、続いてWyatt Technologies mini-Dawn TREOS３角度レーザー光散乱検出器および次いでWyatt Optilab T-rEX干渉屈折計の一連に接続された３つのオンライン検出器で得た。データを、Astra 6(Wyatt)およびLabSolutions Lite(Shimadzu)ソフトウェアを使用して、取得し、分析した。
図１のデータは、分析的サイズ排除クロマトグラフィーからの典型的な絶対質量対溶出時間を示す。図１で分析したサンプルは、ポリペプチド鎖の理論的分子量３７,８１２(還元)である、Ｈｉｓタグ(GGHHHHHH(配列番号１００)に融合したＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)についてである。データは、ＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)が、実測絶対的質量９３kDaを有する溶出プロファイル全体にわたり均一種を形成することを示す。溶出ピークは、主ピーク以外のモノマー種の証拠も、高次のオリゴマー種の証拠も示さない。９３kDaの質量値は、分子がホモダイマーを形成し、グリコシル化もされていることを示す(ＩＬ２およびＣＤ２５の既知Ｎ－およびＯ結合グリコシル化部位から約１８％質量)。
実施例２：ＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質は、観察される親和性が減弱して、ｓＣＤ２５およびｓＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγヘテロ受容体に等しく結合する。
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)試験を、Biacore T100および/またはT200装置(GE Healthcare)で、２５℃で実施した。融合タンパク質検体の結合を、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ－Ｔ)(ｐＨ７.１)中、低密度(約３００ＲＵ)の、Ｈｉｓ開裂され(ｈＣＤ２５)、ＳＡセンサーチップ捕捉されたｂｉｏｔ－ｈＣＤ２５－ＢｉｏＰ－ＴＶＭＶ－Ｈｉｓ、ストレプトアビジンまたは標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学とエタノールアミン遮断で、プロテインＡ固定ＣＭ５センサーチップ表面に補足されているｈＣＤ１２２(２７－２４１)－ｈＦｃ－Ｄ／ｈＣＤ１３２(２３－２６３)－ｈＦｃ－ＫヘテロダイマーＦｃ融合(ｈＩＬ２－Ｒｂ／ｇ)からなる表面で試験した。タンパク質検体をタイトレーションシリーズで注入し、ベースラインへの復帰再生を、低ｐＨ緩衝液の２×８秒注射で実施した。データを、Biacore T-200 Evaluationソフトウェアを使用して分析した。
図２は、ＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質(配列番号１６)のヒトＣＤ２５への原型的結合を示す。４.２マイクロモルの観察される見かけの平衡解離定数は、表面プラズモン共鳴により測定した単離ＩＬ２のｓＣＤ２５への親和性より約１５０倍弱かった(Liparoto, S.F., Myszka, D.G., Wu, Z., Goldstein, B., Laue, T.M., and Ciardelli, T.L. (2002) Biochemistry 41, 2543-51.)。

下表１０は、ＩＬ２－ＣＤ２５の単および長バージョンのヒトＣＤ２５およびｓＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγヘテロダイマーの観察された平衡ＫＤ値原型的結合を示す。種々のＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質の観察される見かけの平衡解離定数は、ＩＬ２と比較して、有意に減弱される。ｓＣＤ２５への結合は、ＩＬ２と比較して、ＩＬ２－ＣＤ２５融合体で約１００倍弱い。同様にＩＬ２－ＣＤ２５融合体の結合は、ＩＬ２より、ベータ－ガンマヘテロダイマーに対して約１５０倍弱い。

実施例３：ＩＬ２－ＣＤ２５の切断バージョンは凝集に対する安定性が改善する：加速安定性試験
融合タンパク質の安定性を、４０℃でｐＨ範囲４～８の緩衝液でインキュベートすることにより試験した。融合タンパク質を約１５mg／mlに濃縮し、４℃で次の緩衝液で透析した：１)２０mM 酢酸、２５０mM スクロース、ｐＨ４、２)２０mM クエン酸、２５０mM スクロース、ｐＨ５、３)２０mM ヒスチジン、２５０mM スクロース、ｐＨ６、４)２０mM リン酸、２５０mM スクロース、ｐＨ７および５)２０mM Ｔｒｉｓ、２５０mM スクロース、ｐＨ８.４(室温)。透析から回収後、融合タンパク質の濃度を、透析緩衝液で希釈することにより１０mg／mlに標準化し、４０℃で４週間、モニターするインキュベーターに入れ、一定量をインキュベーション直前(ｔ０)、４０℃インキュベーション１週間後(１ｗ)および４週間後(４ｗ)に取った。各時点を、流速０.３０mL／分の１００mM リン酸ナトリウ、１５０mM 塩化ナトリウム、ｐＨ７.３(０.２μm濾過)の緩衝液中、Agilent 1260 HPLC系に接続したShodex KW403-4Fカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。
表１１および１２に示すとおり、ＩＬ２－ＣＤ２５の切断バージョンは、長いバージョンより、加速安定性試験後はるかに良好な高分子量および低分子量プロファイルを示す。これは、ｐＨ値４、５、６および７で特に当てはまる。サンプルを、種々のｐＨ条件で、４週間および４０℃で置いた。各構築物の高分子量および低分子量フラクションのパーセントとして示す結果は、長構築物と比較した、短構築物の安定性の大きな改善を示す。各構築物の主ピークフラクションのパーセントとして示す結果は、長構築物と比較した、短構築物の安定性の大きな改善を示す。


ここでのＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質は、精製を容易にする目的で、Ｈｉｓタグ(GGHHHHHH、配列番号１００)を含む。

実施例４：非ヒト動物での薬物動態試験
薬物動態試験：全動物プロトコールは、Central New Jersey Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認され、動物をガイドラインに従い、飼育した。体重１９～２０グラムの雌Ｂａｌｂ／Ｃマウを、Charles-River(Wilmington, MA)から購入した。非絶食時Ｂａｌｂ／Ｃマウに、一回０.５mg／kg用量の示す分子を、尾静脈からの静脈内(ＩＶ)経路または皮下(ＳＣ)経路により投与した。薬物動態試験に使用したＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２４０)は、Ｈｉｓ６タグを有する。投与後、次の時点で、尾静脈から採血した：５分(ＩＶのみ)、１時間、７時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間。サルＰＫ試験のために、雄カニクイザルサルをBuckshire Corporation(Perkasie, PA)から得た。サル(Ｎ＝３、平均体重７.８kg)に、一回０.０７５mg／kg皮下用量のｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)を投与した。連続血液サンプルを、大腿動脈から、意識下および椅子に座らせたサルから、投与５時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、１９２時間および２４０時間後採った。血液サンプルを凝集させ、４℃(１５００～２０００×ｇ)で遠心分離して、血清を得た。血清サンプルを、さらなる分析まで－８０℃で保存した。
血清中の融合タンパク質検出：リガンド結合アッセイを使用して、マウスまたはサル血清サンプルの融合タンパク質レベルを検出した。簡潔には、９６ウェルNunc MaxdiSorp平底プレート(Thermo Fisher Scientific, Denmark)を、捕捉剤(ラット抗ヒトＩＬ２抗体、モノクローナルクローン：ＭＱ１－１７Ｈ１２；Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA)で、２μg／mLで、ＰＢＳ中、一夜、４℃で被覆した。プレートを遮断緩衝液(ＰＢＳ中５％ＢＳＡ)で遮断し、２５℃で１時間インキュベートした。標準、ＱＣｓおよびサンプルをアッセイ緩衝液(１％ＢＳＡおよび０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ)で２０倍希釈し、洗浄プレートにデュプリケートで加え、４℃で一夜インキュベートした。洗浄プレートを、検出剤(ヒトＣＤ２５ビオチニル化抗体、R&D Systems, Minneapolis, MNでアッセイ緩衝液中２５０ng／mL)を加え、２時間、２５℃インキュベートした。洗浄プレートに、２５℃で、アッセイ緩衝液中１００ng／mLのNeutrAvidin-HRP(Thermo Scientific, Rockford, IL)を４５分間、続いて化学発光基質ミックス(Thermo Scientific, Rockford, IL)を１分間連続的に加え、その後、SpectraMaxプレートリーダーで発光モードで読んだ。血清サンプル中の検体濃度を、softmax分析プログラム(Molecular Devices)のLog-Log線形曲線フィットアルゴリズムにより作成した標準曲線を使用して、計算した。


ＮＡ＝適用せず、ＮＤ＝決定せず。
実施例５：Ｋｉｔ２２５細胞でのＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質の活性
修飾融合タンパク質の生物学的活性を、Ｔ細胞株、Ｋｉｔ２２５(ＯＫＴ３＋、－Ｔ４＋、－Ｔ８－表現型を有するＴ細胞慢性リンパ球性白血病患者からのＩＬ２依存的ヒトＴ細胞株)で内因性に発現されるＩＬ２Ｒを刺激する能力の測定により決定した。ＩＬ２Ｒのシグナル伝達カスケードに感受性のレポーター系の使用により、活性を測定した。ＩＦＮγ活性化配列(ＩＲＦ１－ＧＡＳ－Ｌｕｃ)制御下、蛍ルシフェラーゼレポーター遺伝子と安定に統合されたＫｉｔ２２５ヒトＴ細胞を、ＲＰＭＩ＋Glutamax、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２０ng／mL 組み換えＩＬ２(Invitrogen PHC0023)、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび０.７mg／mL ジェネテシン含有培地で増殖させた。アッセイ前日、レポーター細胞を洗浄し、アッセイ培地(無フェノールレッドＲＰＭＩ＋Ｌ－グルタミン、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ)に再懸濁し、増殖培地に存在するＩＬ２を除去し、次いで、一夜、３７℃でインキュベートした。アッセイ当日、ＩＬ２分子をアッセイ緩衝液で３倍、１１点濃度応答曲線のために連続希釈し、種々の濃度のＩＬ２分子を、CulturPlate-384アッセイプレート(Perkin Elmer cat. no. 6007688)に加え、続いて７０,０００細胞／ウェルを加えた。アッセイプレートを、５時間、３７℃でＣＯ２インキュベーターでインキュベートし、次いで、２０分間室温で平衡化し、その後ONE-GLOTM基質(Promega E6120)を加えた。プレートを密封し、発光シグナルをPerkin Elmer Envisionで測定した。１１点のＩＬ２用量応答発光シグナルを、GraphPad Priamを使用して、プロットした。ＥＣ５０は、４パラメータロジスティック回帰モデルを使用して決定した、１１点フィット曲線から導かれた５０％活性化に対応する、試験ＩＬ２融合タンパク質の濃度として定義される。初代細胞でのＩＬ２Ｒシグナル伝達に対する融合タンパク質の効力を、融合タンパク質でのヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)または全血刺激により決定した。ｐＳＴＡＴ５のチロシンリン酸化が、ＩＬ２Ｒシグナル伝達の直接の結果であり、フローサイトメトリーにより全血またはＰＢＭＣの種々の細胞集団で検出された。血液サンプルまたはＰＢＭＣを、ｈＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質の連続希釈で１５分間、３７℃で処理した。インキュベーション後、細胞を固定し、血液を溶解／固定緩衝液で１０分間固定した(BD Phosflow)。細胞を２回洗浄し、次いで、氷冷メタノールで氷上３０分間透過性処理し、さらに２回洗浄いた。次いで、サンプルをHuman Fc Block(ebioscience)で処理し、続いてＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ｐＳＴＡＴ５、Ｆｏｘｐ３およびＣＤ５６の標識抗体で染色した。次いで、全サンプルをフローサイトメトリーで分析した。
インビトロ細胞ベースのアッセイで、融合タンパク質は、ＩＬ２受容体活性化の効力を示し、これは、ＩＬ２に比して、有意に右にシフト(効力低下)していた。これは、非共有ダイマー形態の融合タンパク質の見かけの親和性減少に一致する。融合タンパク質へのＦｃテイル付加は、効力の２０～３０倍のさらに低下方向への有意なシフトをもたらした。Ｈｉｓタグ除去またはＣ末端切断は、融合タンパク質の効力に最小限の効果を有した。類似する相対効力結果が全血で得られた。



ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)を含むｈＩＬ２－ＣＤ２５タンパク質の、シグナル伝達のＴｒｅｇに対する他の細胞型を超える選択性を、ＰＢＭＣまたは全血を含む混合細胞集団で１５分間後のＳＴＡＴ５のリン酸化モニターにより測定できる(それぞれ図９Ａおよび９Ｂ)。新たに得た血液サンプルを、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)で１５分間、３７℃で連続希釈した。インキュベーション後、細胞を処理し(固定および透過性処理)、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ｐＳＴＡＴ５、Ｆｏｘｐ３およびＣＤ５６の標識抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析。Ｔｒｅｇは、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)によるＩＬ２Ｒ刺激に極めて感受性であり、最大有効性はＴｒｅｇの９０％がｐＳＴＡＴ５の情報制御による刺激に応答し、７±１１ng／mlの効力であった。Ｔｒｅｇで見られた強固な活性化と対照的に、ＣＤ４非Ｔｒｅｇ(ｆｏｘｐ３－)、ＣＤ８およびＮＫ細胞は、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)による刺激の効率的が低かった；これら細胞の５０％未満が、全ての他の細胞型にわたる平均で、最大２７００ng／mlの濃度でｐＳＴＡＴ５が上方制御された(表１６)。他の細胞型を超えるＴｒｅｇへのＩＬ２Ｒの全体的選択性は、ｒｈＩＬ２に比して、ｈＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)(配列番号１６)で維持または増加された。ＩＬ２－ＣＤ２５を有するＦｃまたはＨＳＡ融合タンパク質は、効力が低いにも関わらず、全血で高Ｔｒｅｇ選択性を維持した(表１６)。

実施例６：切断ＩＬ２－ＣＤ２５融合タンパク質による白血球増加のインビボ活性
融合タンパク質がインビボで白血球を増加させる能力を、ヒト化免疫系を有するマウスで試験した。１６～２０週齢雌ＮＳＧ－ｈｕＣＤ３４移植マウ(ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成されたＮＯＤ.Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ)を、Jackson Laboratoryから購入した。各ヒト化マウスを、移植１４週後、フローサイトメトリーにより末梢血液におけるｈＣＤ４５＋細胞およびマウスＣＤ４５＋細胞(ｍＣＤ４５＋)の存在を試験した。少なくとも２５％ヒトＣＤ４５移植されたマウスを選択した。移植ヒト造血幹細胞は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＬＣＭＶ(リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス)がないことを試験した。動物は使用前最低１週間、標準齧歯類餌および精製水を自由に摂取させ、馴化させた。動物を使用する全ての方法はBMS Institutional Animal Care and Use Committeeによりレビューされ、承認された。３日毎、１６～２０週齢ＮＳＧ－ｈｕＣＤ３４移植マウスに、ＰＢＳを皮下でまたは融合タンパク質ｈｕＩＬ２－ＣＤ２５(２２－１８７)、ｈｕＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２１２)およびＨｕＩＬ２－ＣＤ２５(２２－２４０)を、１０μg／マウスで２００μl体積で皮下投与し、その間動物は麻酔した。計３回皮下投与を０日目、３日目および６日目に行った。最終投与２４後、全処置群を麻酔し、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８ ＴまたはＮＫ細胞のＦＡＣＳ分析のために脾臓をＨＢＳＳに取得した。全３種の融合タンパク質は、脾臓細胞数増加に、類似能力を示した。
実施例７：ヒトまたはマウス血清におけるＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)の(Ｇ３Ｓ)３ペプチドリンカーの安定性
液体クロマトグラフィーと直列マススペクトロメトリー(ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ)ベースの生化学分析法を、インビトロ血清安定性試験およびインビボサルＰＫ試験における(Ｇ３Ｓ)３リンカーの安定性評価の支持のために開発した。ラット抗ＩＬ－２抗体を使用するＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)(すなわち、配列番号１６)捕捉後、２つのシグネチャーペプチド、DLISNINVIVLELK(ＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)のＩＬ－２ドメインから)およびEPPPWENEATER(ＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)のＣＤ２５ドメインから)のピーク面積比を使用して、ＩＬ－２とＣＤ２５の間のリンカー安定性を評価した。リンカー開裂および結果としての血清における循環開裂産物は、ＩＬ２／ＣＤ２５面積比＞１の系統的増加をもたらす。
インビトロでのＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)のリンカー開裂傾向を試験するために、０.５μMのＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)を、ヒト血清(Bioreclamation Cat# HMSRM-M; Lot# BRH1332647)またはマウス血清(Bioreclamation Cat# MSESRM-BALB-M; Lot# MSE264349)中で、総体積１.５mlで最大７２時間、３７℃でインキュベートした。サンプル(２００μL血清)を０時間、４時間、２４時間、４８時間および７２時間に集め、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるピーク面積比分析まで－８０℃で保存した。サルでＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)単回投与後インビボでのリンカー開裂による循環開裂産物の存在を同定するために、投与５時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間後に採取した血清サンプルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりピーク面積比を分析した。
図１０に示すとおり、ＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)のＩＬ２およびＣＤ２５ドメインのシグネチャーペプチドのピーク面積比は、ヒトまたはマウス血清で３７℃で７２時間のインビトロインキュベーション後、ほぼ均一に維持され、それ故に、ヒト血清およびマウス血清両者でＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)のリンカー開裂が無視できることが示される。
さらに、図１１に示すとおり、ＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)０.０７５mg／kg単回皮下投与後のサルから集めた血清サンプルで、抗ＩＬ２を使用する免疫捕捉後のＩＬ２対ＣＤ２５サロゲートペプチドの比はほぼ均一に維持された。データは、ＩＬ２(２１－１５３)－(Ｇ３Ｓ)３－ＣＤ２５(２２－２１２)(すなわち、配列番号１６)投与したサルの血清でリンカー開裂がないことを示唆する。

Claims (23)

  1. （ａ）インターロイキン－２（ＩＬ２）ポリペプチドを含む第一ポリペプチドであって、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第一ポリペプチド；および
    （ｂ）インターロイキン－２受容体アルファ（ＩＬ２Ｒα）ポリペプチドの細胞外ドメインを含む第二ポリペプチドであって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第二ポリペプチド、
    を含む融合タンパク質であって、ここでＩＬ２Ｒαポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号７に記載の天然ＩＬ２Ｒαの細胞外ドメインのアミノ酸１９２～２１９を含まない、およびここで融合タンパク質はＩＬ２活性を有する、融合タンパク質。
  2. 第一ポリペプチドが、配列番号２に対して９５％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 第二ポリペプチドが、配列番号１２に対して９５％～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. 融合タンパク質が第二ポリペプチド内に変異を含み、ここで
    （ａ）変異が1以上の置換であり、ここで１以上の置換がアミノ酸Ｎ４９、アミノ酸Ｎ６８、アミノ酸Ｔ７４、アミノ酸Ｔ８５、アミノ酸Ｔ１９７、アミノ酸Ｔ２０３、アミノ酸Ｔ２０８およびアミノ酸Ｔ２１６またはこれらの何れかの組み合わせであり、ここでアミノ酸の位置は配列番号７に対応する；または
    （ｂ）変異が1以上の置換であり、ここで１以上の置換がアミノ酸Ｓ５０、アミノ酸Ｓ５１、アミノ酸Ｔ６９、アミノ酸Ｔ７０、アミノ酸Ｃ１９２またはこれらの何れかの組み合わせであり、ここでアミノ酸の位置は配列番号７に対応する、
    請求項１～３の何れかに記載の融合タンパク質。
  5. 融合タンパク質が第一ポリペプチド内に変異を含み、ここで第一ポリペプチド内の変異は、配列番号２と対応させて比較して、アミノ酸Ｔ３および／またはＣ１２５における1以上の置換である、請求項１～４の何れかに記載の融合タンパク質。
  6. 融合タンパク質が第一ポリペプチド内に変異を含み、ここで第一ポリペプチド内の変異は、配列番号２と対応させて比較して、アミノ酸Ａ１における欠失である、請求項１～５の何れかに記載の融合タンパク質。
  7. 第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの間にインフレームで融合したリンカーをさらに含む、請求項１～６の何れかに記載の融合タンパク質。
  8. リンカーがグリシン／セリンリンカーである、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. グリシン／セリンリンカーが（ＧＧＧＳ）３のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 融合タンパク質が、第一ポリペプチドおよび／または第二ポリペプチドに融合した異種部分をさらに含む、請求項１～９の何れかに記載の融合タンパク質。
  11. 異種部分が半減期延長部分である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. 異種部分がアルブミン、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、免疫グロブリン結合ポリペプチド、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ部分、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ部分、ＸＴＥＮ、ペグ化部分、Ｆｃ領域、またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 融合タンパク質が、配列番号１６、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３９～４１、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９～５３、配列番号５７～５９、または配列番号６７～７０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  14. モノマーまたはダイマーである、請求項１～１３の何れかに記載の融合タンパク質。
  15. 請求項１～１４の何れかに記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  16. 請求項１５に記載の核酸を含む、ベクター。
  17. 請求項１５に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  18. （ａ）請求項１～１４の何れかに記載の融合タンパク質、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載のベクターまたは請求項１７に記載の宿主細胞；および
    （ｂ）薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
  19. 請求項１～１４の何れかに記載の融合タンパク質、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、または請求項１８に記載の医薬組成物、およびそれを必要とする対象に該融合タンパク質を投与するための指示書を含む、キット。
  20. 融合タンパク質を製造する方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養し、該融合タンパク質を回収することを含む、方法。
  21. 処置を必要とする対象における疾患または障害の処置に使用するための、請求項１～１４の何れかに記載の融合タンパク質、請求項１５に記載の核酸、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、または請求項１８に記載の医薬組成物。
  22. 疾患または障害が炎症性疾患、自己免疫性疾患、または感染性疾患であり、ここで該感染性疾患が病原性ウイルス、病原性細菌、病原性真菌、または病原性寄生虫に起因する、請求項２１に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。
  23. 炎症性疾患または自己免疫性疾患がＩ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、セリアック病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚ループス、若年性特発性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎または全身性硬化症、移植片対宿主病、乾癬、円形脱毛症、ＨＣＶ誘発脈管炎、シェーグレン症候群、天疱瘡、強直性脊椎炎、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫、高安病、自己免疫性肝炎、硬化性胆管炎、グーゲル・シェーグレンおよびマクロファージ活性化症候群からなる群から選択される、請求項２２に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA3094112A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
EP3880698A4 (en) * 2018-11-14 2022-11-30 RubrYc Therapeutics, Inc. MANIPULATED CD25 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
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MX2022012982A (es) * 2020-04-15 2023-03-06 Alkermes Pharma Ireland Ltd Agentes inmunoestimulantes en combinación con inhibidores de la angiogénesis.
WO2021231773A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Good Therapeutics, Inc. Compositions of protein complexes and methods of use thereof
KR20230042014A (ko) * 2020-06-25 2023-03-27 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. 시토카인 접합체
CN115916831A (zh) * 2020-06-30 2023-04-04 Gi 医诺微新 包含抗lag-3抗体和il-2的融合蛋白及其用途
JP2023537412A (ja) * 2020-08-13 2023-08-31 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 目的の細胞を標的とするためのｉｌ－２の向け直し方法
EP4236962A1 (en) 2020-10-29 2023-09-06 Bristol-Myers Squibb Company Fusion proteins for the treatment of disease
WO2022166720A1 (zh) * 2021-02-05 2022-08-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用
US20240199714A1 (en) * 2021-04-16 2024-06-20 Orionis Biosciences, Inc. Il-2 based constructs
TW202317623A (zh) * 2021-06-14 2023-05-01 美商再生元醫藥公司 基於il2之治療劑及其使用方法
CA3229503A1 (en) * 2021-08-25 2023-03-02 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing fusion protein
CN115141283A (zh) * 2022-03-10 2022-10-04 厦门柏慈生物科技有限公司 一种融合蛋白、制备方法及其应用
WO2023183935A2 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 La Jolla Institute For Immunology Herpes virus entry mediator proteins and methods of use thereof
CN114875069B (zh) * 2022-04-22 2023-09-15 四川大学 基因工程修饰的il2细胞因子的重组载体、宿主细胞及其用途
WO2023235790A1 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 University Of Miami Bifunctional il-2 and il-10 fusion proteins and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010020766A2 (en) 2008-08-21 2010-02-25 Asterion Limited Interleukin fusion polypeptides
JP2015525217A (ja) 2012-06-08 2015-09-03 アルカーメス，インコーポレイテッド アゴニストおよびアンタゴニストとしての循環置換により修飾されるリガンド
WO2016164937A2 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of t-regulatory cells
JP2017523789A (ja) 2014-08-06 2017-08-24 ユニバーシティー オブ マイアミＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法
JP2018500328A (ja) 2014-12-19 2018-01-11 アルカーメス，インコーポレイテッド 一本鎖Ｆｃ融合タンパク質

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
GB8308236D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Dna vectors
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5250296A (en) 1990-11-29 1993-10-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Immunostimulant agent containing interleukin-2 and 5'-deoxy-5-fluorouridine
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
US5223408A (en) * 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
CA2149326C (en) 1992-11-13 2007-04-17 Mitchell E. Reff Fully impaired consensus kozak sequences for mammalian expression
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
JPH10511846A (ja) 1994-12-28 1998-11-17 ユニバーシティ オブ ケンタッキー ヒトガン胎児性抗原に関連する組換えモノクローナル抗イディオタイプ抗体３ｈ１配列
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6967092B1 (en) 1996-10-25 2005-11-22 Mc Kearn John P Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998041645A1 (en) 1997-03-14 1998-09-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2256234T3 (es) 2000-05-16 2006-07-16 Lipoxen Technologies Limited Derivatizacion de proteinas en solucion acuosa.
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US7211395B2 (en) 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
AU2002355955A1 (en) 2001-08-13 2003-03-03 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
WO2003029475A1 (en) 2001-09-28 2003-04-10 Dnavec Research Inc. MAMMALIAN CELL-INFECTING VIRUS VECTOR ENCODING EPITOPE-BOUND β2m AND UTILIZATION THEREOF
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
KR20040088572A (ko) 2002-03-01 2004-10-16 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 제거율 증강을 위한 양특이성 항체 점 돌연변이들
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1487992A4 (en) 2002-03-15 2007-10-31 Brigham & Womens Hospital CENTRAL AIRWAY DELIVERY FOR SYSTEMIC DRUG DELIVERY
US7425620B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Scott Koenig FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
SI1562972T1 (sl) 2002-10-15 2010-12-31 Facet Biotech Corp ALTERACIJA FcRn VEZANIH AFINITET ALI SERUMSKIH RAZPOLOVNIH DOB ANTITELESC Z MUTAGENEZO
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
ES2897506T3 (es) 2003-01-09 2022-03-01 Macrogenics Inc Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de utilización de los mismos
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ATE497783T1 (de) 2003-05-06 2011-02-15 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor vii-fc chimäre proteine zur behandlung von hämostatischen krankheiten
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
EP1654290B1 (en) 2003-08-12 2019-03-13 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
WO2005070963A1 (en) 2004-01-12 2005-08-04 Applied Molecular Evolution, Inc Fc region variants
KR20070003934A (ko) 2004-03-05 2007-01-05 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 치료제의 환자 내약성을 예측하기 위한 시험관 내 테스트시스템
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
SI2471813T1 (sl) 2004-07-15 2015-03-31 Xencor, Inc. Optimirane Fc variante
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
PL3263581T3 (pl) 2005-05-17 2021-05-04 University Of Connecticut Kompozycje i sposoby immunomodulacji w organizmie
CA2643182C (en) 2006-03-13 2014-09-02 Tir Technology Lp Adaptive control apparatus and method for a solid-state lighting system
DK2369005T3 (da) 2007-06-21 2013-06-24 Univ Muenchen Tech Biologisk aktive proteiner med forøget stabilitet in vivo og/eller in vitro
CN101148477A (zh) * 2007-09-06 2008-03-26 南方医科大学 链亲和素-白细胞介素2融合蛋白
US8906356B2 (en) 2007-11-05 2014-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
DE102008023820A1 (de) 2008-05-08 2009-11-12 Aicuris Gmbh & Co. Kg Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
CN102348715B (zh) 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
NZ596778A (en) 2009-06-08 2013-11-29 Amunix Operating Inc Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
CN106916229A (zh) 2009-06-08 2017-07-04 阿穆尼克斯运营公司 生长激素多肽及其制备和使用方法
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
CU23734A1 (es) 2009-11-27 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Polipéptidos inmunomoduladores derivados de la il-2 con actividad antagonista de esta citocina útiles en la terapia del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas
NZ599516A (en) 2009-12-10 2013-11-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding preferentially human csf1r extracellular domain 4 and their use
CN102918060B (zh) 2010-03-05 2016-04-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗人csf-1r抗体及其用途
JP5989547B2 (ja) 2010-03-05 2016-09-07 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ヒトｃｓｆ−１ｒに対する抗体及びその使用
AR080698A1 (es) * 2010-04-01 2012-05-02 Imclone Llc Anticuerpo o fragmento del mismo que especificamente enlaza la variante de csf -1r humano, composicion farmaceutica que lo comprende, su uso para la manufactura de un medicamento util para el tratamiento de cancer y metodo para determinar si un sujeto es candidato para tratamiento de cancer basado e
WO2011123683A2 (en) * 2010-04-02 2011-10-06 University Of Rochester Protease activated cytokines
TR201900368T4 (tr) 2010-05-04 2019-02-21 Five Prime Therapeutics Inc Csf1r'ye bağlanan antikorlar.
UA117294C2 (uk) 2011-02-10 2018-07-10 Рош Глікарт Аг Імунокон'югат
WO2013087699A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human csf-1r and uses thereof
EP2812355A4 (en) 2012-02-06 2016-03-02 Hoffmann La Roche COMPOSITIONS AND METHODS OF USE OF CSF1R INHIBITORS
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
RU2670743C9 (ru) 2012-05-11 2018-12-19 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Способы лечения состояний антителами, которые связывают рецептор колониестимулирующего фактора 1 (csf1r)
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
WO2014036357A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind colony stimulating factor 1 receptor (csf1r)
US9580486B2 (en) * 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
SI3102595T1 (sl) 2014-02-06 2019-02-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Fuzijske beljakovine z interlevkinom-2 in njihova uporaba
IL289475B2 (en) 2014-07-21 2023-10-01 Delinia Inc Molecules that activate T cells are selectively regulated for the treatment of autoimmune diseases
EP3482766B1 (en) 2014-08-11 2020-05-20 Delinia, Inc. Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
CA2962241A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Fujifilm Corporation Antibody-binding polypeptide, antibody-binding fusion polypeptide, and adsorption material
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US11208441B2 (en) 2015-10-22 2021-12-28 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin-binding polypeptide
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
EP3458485B1 (en) * 2016-05-19 2021-12-29 The General Hospital Corporation Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
CN110167957A (zh) 2016-11-08 2019-08-23 德里尼亚公司 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体
CU24483B1 (es) 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
CA3094112A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010020766A2 (en) 2008-08-21 2010-02-25 Asterion Limited Interleukin fusion polypeptides
JP2015525217A (ja) 2012-06-08 2015-09-03 アルカーメス，インコーポレイテッド アゴニストおよびアンタゴニストとしての循環置換により修飾されるリガンド
JP2017523789A (ja) 2014-08-06 2017-08-24 ユニバーシティー オブ マイアミＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ インターロイキン−２／インターロイキン−２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法
JP2018500328A (ja) 2014-12-19 2018-01-11 アルカーメス，インコーポレイテッド 一本鎖Ｆｃ融合タンパク質
WO2016164937A2 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of t-regulatory cells

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