BR112020018709A2 - Proteínas de fusão do receptor alfa de interleucina-2/interleucina-2 e métodos de uso - Google Patents

Proteínas de fusão do receptor alfa de interleucina-2/interleucina-2 e métodos de uso Download PDF

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Abstract

são descritas aqui proteínas de fusão compreendendo: (a) um primeiro polipeptídeo compreendendo interleucina-2 (il2); e (b) um segundo polipeptídeo, fundido na estrutura ao primeiro polipeptídeo, em que o segundo polipeptídeo compreende um domínio extracelular do recep-tor alfa de interleucina-2 (il2r), em que il2 ou il2r compreende pelo menos um sítio de glicosilação a menos em comparação com il2 nativa ou il2r nativa. métodos de produção e métodos de uso terapêutico das proteínas de fusão também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍ- NAS DE FUSÃO DO RECEPTOR ALFA DE INTERLEUCINA-2/INTER- LEUCINA-2 E MÉTODOS DE USO".
1. REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Nor- te-americano No. 62/649.379, depositado em 28 de março de 2018, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
2. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELE- TRONICAMENTE VIA EFS-WEB
[002] O conteúdo da listagem de sequência enviada eletronica- mente em arquivo de texto ASCII (Nome: 3338 100PC01 Sedqlis- ting ST25.txt; Tamanho: 354.542 bytes; e Data de Criação: 27 de março de 2019) depositado com o pedido é aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade.
3. CAMPO
[003] O assunto presentemente descrito refere-se geralmente a métodos e composições para modular a resposta imune empregando uma proteína de fusão de Receptor Alfa de Interleucina-2/Interleucina-2.
4. ANTECEDENTES DA DESCRIÇÃO
[004] A interleucina-2 (IL2 ou IL-2) é uma citocina biológica que regula aspectos importantes do sistema imunológico. A IL2 tem sido usada na tentativa de aumentar as respostas imunes em pacientes com câncer, doença inflamatória ou doença autoimune. IL2 é um po- tente fator de crescimento de células T que promove respostas imu- nes, incluindo a expansão clonal de células T ativadas por antígeno, conduz o desenvolvimento de células T auxiliares CD4+ (Th)1 e Th2, diferencia terminalmente os linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs) e se opõe desenvolvimento de células CD4+ Th17 e células auxiliares foli- culares T (Tfh). IL2 também molda as respostas de recuperação da memória das células T.
[005] Os ensaios clínicos aproveitaram as propriedades de ativa- ção de células T de IL2 em pacientes com câncer e HIV/AIDS por infu- são de altas doses de IL2 (tipicamente> 500.000 unidades/Kkg, repeti- damente) para aumentar as células T e NK. Na verdade, a IL2 foi aprovada pelo FDA para uso em pacientes com melanoma e carcino- ma de células renais, pois alguns (aproximadamente 5 %) exibiram remissões completas. No entanto, as taxas de resposta foram baixas nesses e em outros cânceres, enquanto esta terapia foi acompanhada por toxicidade grave. Da mesma forma, a IL2 foi considerada ineficaz na promoção da imunidade em pacientes com HIV/AIDS. A baixa efi- cácia de altas doses de IL2 nesses ambientes se deve em parte à ex- pansão associada de Tregs.
[006] Mais recentemente, doses mais baixas de IL2 foram usadas para aumentar seletivamente a tolerância para suprimir respostas imu- nes indesejadas associadas a ataques de tipo autoimune de tecidos próprios. Essas baixas doses de IL2 não mostraram nenhum sinal de aumento ou reativação de células T autorreativas. Estudos pré-clínicos mostraram que a baixa sinalização de IL2R promoveu seletivamente as principais atividades das células Tregs, mas não das células T efe- toras (Teff) e que o tratamento de camundongos com baixos níveis de IL2 preveniu a autoimunidade. Atualmente, vários pacientes com res- postas imunes hiperativas têm sido tratados com IL2 em baixa dosa- gem (0,5-2 milhões de unidades, periodicamente). A experiência até o momento mostra que essa terapia é segura, sem indicação de reativa- ção de células T autoagressivas, enquanto as Tregs aumentam em quase todos os pacientes, o que costuma ser acompanhado de melho- ra clínica. No entanto, a IL2 tem desvantagens importantes como tera- pêutica, incluindo meia-vida in vivo muito curta, que limita sua eficácia, e toxicidade em altas doses. Por essas relações, novos produtos bio- lógicos de IL2 são necessários com farmacocinética e durabilidade de respostas melhoradas para uso.
5. SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO
[007] A presente descrição inclui uma proteína de fusão compre- endendo (a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de um polipeptídeo do receptor alfa de inter- leucina-2 (IL2Ra); em que (i) o domínio extracelular do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com o domínio extracelular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7); e/ou (ii) o poli- peptídeo de IL2 tem pelo menos uma glicosilação a menos em compa- ração com IL2 nativa (SEQ ID NO: 2); e em que a proteína de fusão tem atividade de IL2. Em algumas modalidades, o domínio extracelular do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos, pelo menos duas glicosilações a menos, pelo menos três glicosilações a menos, pelo menos quatro glicosilações a menos, pelo menos cinco glicosilações a menos, pelo menos seis glicosilações a menos, pelo menos sete glicosilações a menos, pelo menos oito glicosilações a menos ou pelo menos nove glicosilações a menos em comparação com o domínio extracelular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7). Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo de I1L2 tem pelo menos uma glicosi- lação a menos em comparação com IL2 nativa (SEQ ID NO: 2).
[008] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um primeiro polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 60 %, pelo me- nos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % , pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína de fusão com- preende um segundo polipeptídeo, em que o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % , pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à SEQ ID NO: 12.
[009] Em algumas modalidades, o domínio extracelular do poli- peptídeo de IL2Ra tendo pelo menos uma glicosilação a menos com- preende uma mutação que remove uma glicosilação. Em algumas mo- dalidades, a mutação remove uma O-glicosilação e/ou uma N-glico- silação. Em algumas modalidades, a mutação remove uma O-glicosila- ção. Em algumas modalidades, a mutação remove uma N-glicosilação.
[0010] Em algumas modalidades, a mutação no domínio extracelu- lar do polipeptídeo de IL2Ra é uma deleção dos aminoácidos 167 a 219, aminoácidos 168 a 219, aminoácidos 169 a 219, aminoácidos 170 a 219, aminoácidos 171 a 219, aminoácidos 172 a 219, aminoácidos 173 a 219, aminoácidos 174 a 219, aminoácidos 175 a 219, aminoáci- dos 176 a 219, aminoácidos 177 a 219, aminoácidos 178 a 219, ami- noácidos 179 a 219, aminoácidos 180 a 219, aminoácidos 181 a 219, aminoácidos 182 a 219, aminoácidos 183 a 219, aminoácidos 184 a 219, aminoácidos 185 a 219, aminoácidos 186 a 219, aminoácidos 187 a 219, aminoácidos 188 a 219, aminoácidos 189 a 219, aminoácidos 190 a 219, aminoácidos 191 a 219 ou aminoácidos 192 a 219, corres- pondendo a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção de aminoácidos de 167,169, 171 a 192 a 219, corres- pondendo a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação não inclui uma deleção de 170 a 219, correspondendo a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é SEQ ID NO: 12.
[0011] Em algumas modalidades, a mutação é uma ou mais subs-
tituições de um aminoácido que é glicosilado por um aminoácido que não é glicosilado. Em algumas modalidades, a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que permite a glicosilação em um aminoácido próximo com um aminoácido que não permite a glicosila- ção no aminoácido próximo. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições estão no amino ácido N49, aminoácido N68, aminoácido T74, aminoácido T85, aminoácido T197, aminoácido T203, aminoácido T208 e aminoácido T216, ou qualquer combinação dos mesmos, em que as localizações de aminoácidos correspondem a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de aspara- gina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, feni- lalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de treonina para um aminoácido sele- cionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagi- na, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histi- dina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0012] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido N49. Em algumas modalidades, N49 é mutado para um ami- noácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treoni- na, serina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glici- na, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
[0013] Em algumas modalidades, aquele em que as substituições é o aminoácido N68. Em algumas modalidades, N68 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pro-
lina, triptofano, tirosina e valina.
[0014] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T74. Em algumas modalidades, T74 é mutado para um ami- noácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, argini- na, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pro- lina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0015] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T85. Em algumas modalidades, T85 é mutado para um ami- noácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, argini- na, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pro- lina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0016] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T197. Em algumas modalidades, T197 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi- Co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0017] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T203. Em algumas modalidades, T203 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi- Co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0018] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T208. Em algumas modalidades, T208 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi- Co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina,
prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0019] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T216. Em algumas modalidades, T216 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi- Co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0020] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são no aminoácido S50, aminoácido S51, aminoácido T69, aminoácido T70, aminoácido C192 ou qualquer combinação dos mesmos, em que os locais de aminoácidos correspondem a SEQ ID NO: 7.
[0021] Em algumas modalidades, uma das substituições está no aminoácido S50. Em algumas modalidades, S50 é mutado para proli- na.
[0022] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido S51. Em algumas modalidades, S51 é mutado para um ami- noácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, argini- na, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pro- lina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[0023] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T69. Em algumas modalidades, T69 é mutado para prolina.
[0024] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido T70. Em algumas modalidades, T70 é mutado para um ami- noácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, argini- na, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pro- lina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0025] Em algumas modalidades, uma das substituições é o ami- noácido C192. Em algumas modalidades, C192 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, se- rina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0026] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL2 com pelo menos uma glicosilação a menos compreende uma mutação que re- move uma glicosilação. Em algumas modalidades, a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que é glicosilado por um ami- noácido que não é glicosilado. Em algumas modalidades, a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que permite a glicosila- ção em um aminoácido próximo com um aminoácido que não permite a glicosilação no aminoácido próximo. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de uma alanina para um aminoácido seleci- onado a partir do grupo que consiste em arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, iso- leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de uma treonina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, iso- leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tiro- sina e valina. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de uma cisteína para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, gluta- mina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, me- tionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e vali- na. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma serina. Em algumas modalidades, mais substitui- ções são de uma cisteína para uma alanina. Em algumas modalida- des, uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma valina.
[0027] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições estão no aminoácido T3 em comparação com o correspondente à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma das substituições está no ami- noácido C125. Em algumas modalidades, a substituição no aminoáci- do C125 é selecionada a partir do grupo que consiste em C1258S, C125A e C125V.
[0028] Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção. Em algumas modalidades, a deleção é no aminoácido A1.
[0029] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é desglicosi- lada enzimaticamente ou quimicamente. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é desglicosilada por álcali, hidrazinólise, PNGase F, Endo H, O-glicosidase ou qualquer combinação dos mesmos.
[0030] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende ainda um ligante fundido no quadro entre o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o ligante é um ligan- te glicina/serina. Em algumas modalidades, o ligante glicina/serina compreende um aminoácido de (GS)n, (GGS)n, (GGGS)r, (GGGGS), ou (GGGGS),, em que n é um número inteiro de 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9 ou 10. Em algumas modalidades, o tipo de glicina/serina compreende a sequência de aminoácidos de (GGGS):.
[0031] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende ainda uma porção heteróloga fundida ao primeiro polipeptídeo e/ou ao segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, a porção heteróloga é uma porção de prolongamento da meia-vida. Em algumas modalida- des, a porção heteróloga compreende uma porção não polipeptídica. Em algumas modalidades, a porção heteróloga compreende um poli- peptídeo. Em algumas modalidades, a porção heteróloga compreende albumina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção desta, um polipeptídeo de ligação à imunoglobulina, uma imunoglobu- lina G (IgG), polipeptídeo de ligação à albumina (ABP), uma porção de
PASilação, uma porção de HESilação, XTEN, uma porção de PEGui- lação, uma região Fc e qualquer combinação dos mesmos.
[0032] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é mais está- vel do que o polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem uma ou mais propriedades selecionadas do grupo que consiste em (i) estabili- dade termodinâmica aumentada em comparação com uma proteína de referência; (ii) TM aumentada em comparação com uma proteína de referência; (iii) maior resistência à degradação em comparação com uma proteína de referência; (iv) maior resistência a modificações em comparação com uma proteína de referência; (v) estabilidade aumen- tada in vivo em comparação com uma proteína de referência; e (vi) qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de referência compreende (i) um primeiro polipeptídeo compreendendo um polipep- tídeo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo polipeptídeo compre- endendo um domínio extracelular de um polipeptídeo do receptor alfa de interleucina-2 (IL2Ra); e tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com a proteína de fusão.
[0033] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é um mo- nômero. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é um dímero. Em algumas modalidades, o dímero compreende dois monômeros e os monômeros estão associados entre si por meio de ligações cova- lentes. Em algumas modalidades, o dímero compreende dois monô- meros e os monômeros estão associados por meio de ligações não covalentes.
[0034] Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem uma ou mais propriedades farmacocinéticas selecionadas do grupo que con- siste em uma meia-vida aumentada, Cmax aumentada, AUC aumenta- da, Cmin aumentada, depuração diminuída, biodisponibilidade melhora- da e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com a pro-
priedade farmacocinética do polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem uma meia-vida estendida. Em algumas modalidades, a meia-vida estendida é de pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo me- nos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 11 vezes, pelo menos cerca de 12 vezes, pelo menos cerca de 13 vezes, pelo menos cerca de 14 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 16 vezes, pelo menos cerca de 17 vezes, pelo menos cerca de 18 vezes, em pelo menos cerca de 19 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 21 vezes, ou pelo menos cer- ca de 22 vezes em comparação com a meia-vida de um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13.
[0035] Em algumas modalidades, é aqui descrito uma ou mais pro- teínas de fusão. Em algumas modalidades, é fornecida aqui uma com- posição que compreende uma ou mais proteínas de fusão aqui descri- tas.
[0036] Em algumas modalidades, é aqui descrito um ácido nuclei- co que codifica qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Em algumas modalidades, é aqui descrito um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Em algumas modalidades, é descrita aqui uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de fusão aqui descritas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste de uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de leve- dura, uma célula de mamífero transgênica e uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula procarióti- ca. Em algumas modalidades, a célula procariótica é uma célula bacte- riana.
[0037] Em algumas modalidades, é fornecida aqui uma composi- ção farmacêutica que compreende (a) uma proteína de fusão aqui descrita, uma composição aqui descrita, um ácido nucleico aqui des- crito, um vetor aqui descrito ou uma célula hospedeira aqui descrita; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0038] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um Kkit que compreende a proteína de fusão aqui descrita, a composição aqui descrita, o ácido nucleico aqui descrito, o vetor aqui descrito, ou a cé- lula hospedeira aqui descrita e instruções para administrar a proteína de fusão a um indivíduo em necessidade dos mesmos.
[0039] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um método de produção da proteína de fusão aqui descrita, compreendendo: cultivar a célula hospedeira aqui descrita sob condições adequadas e recupe- rar a proteína de fusão. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. Em algumas mo- dalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica, uma célula de planta, uma célula trans- gênica de mamífero ou uma célula bacteriana. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula CHO, uma célula HEK 293, uma célula NSO, uma célu- la Per C6, uma célula BHK e uma célula COS. Em algumas modalida- des, a célula bacteriana é Escherichia coli.
[0040] Em algumas modalidades, é fornecido aqui um método de tratamento de uma doença ou distúrbio de um indivíduo em necessi- dade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantida- de eficaz de uma proteína de fusão aqui descrita, uma composição aqui descrita, um ácido nucleico aqui descrito, um vetor aqui descrito, uma célula hospedeira aqui descrita, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é cân- cer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de bexiga, cân- cer de mama, câncer uterino, carcinoma endometrial, câncer de ová- rio, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de células germinati- vas, câncer ósseo, câncer de células escamosas, câncer de pele, ne- oplasia do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, sarcoma, cân- cer relacionado a vírus, câncer de pulmão de células pequenas, cân- cer de pulmão de células não pequenas, câncer gastrointestinal, linfo- ma de Hodgkin ou não-Hodgkin, câncer de pâncreas, glioblastoma, glioma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, mieloma, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, carcinoma de células basais, melanoma, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de ti- reoide, câncer de testículo, câncer de esôfago ou câncer de cabeça ou pescoço e quaisquer combinações dos mesmos.
[0041] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma do- ença inflamatória ou uma doença autoimune. Em algumas modalida- des, a doença inflamatória ou uma doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em diabetes tipo |, esclerose múltipla, ar- trite reumatoide, doença celíaca, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite lúpica, lúpus cutâneo, artrite idiopática juvenil, doença de Crohn, colite ulcerativa ou esclerose sistêmica, doença do enxerto versus hospedei- ro, psoríase, alopecia areata, vasculite induzida por HCV, síndrome de Sjogren, Pênfigo, Espondilite Anquilosante, doença de Behcet, Granu- lomatose de Wegener, Doença de Takayasu, Hepatite Autoimune, Co- langite Esclerosante, Síndrome de Gougerot-sjôgren e de Ativação Macrófago.
[0042] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma do-
ença infecciosa.
Em algumas modalidades, a doença infecciosa é cau- sada por um vírus patogênico.
Em algumas modalidades, o vírus pato- gênico é selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da imu- nodeficiência humana (HIV), hepatite A, hepatite B, hepatite C, vírus do herpes, adenovírus, vírus influenza, flavivírus, echovírus, rinovírus, vírus Coxsackie, coronavírus, vírus sincicial respiratório, vírus da ca- xumba, rotavírus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus da vacínia, vírus T-linfotrópico humano (HTL), vírus da dengue, vírus do papiloma, vírus do molusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus John Cunningham (JC) e vírus da encefalite arboviral.
Em algumas modali- dades, a doença infecciosa é causada por bactérias patogênicas.
Em algumas modalidades, a bactéria patogênica é selecionada a partir do grupo que consiste em clamídia, bactéria rickettsial, micobactéria, es- tafilococos, estreptococos, pneumonococos, meningococos e gonoco- cos, Kklebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionela, difteria, sal- monela, bacilos, cólera, tétano, botulismo, antraz, peste, leptospirose e bactérias da doença de Lymes.
Em algumas modalidades, a doença in- fecciosa é causada por fungos patogênicos.
Em algumas modalidades, a bactéria patogênica é selecionada a partir do grupo que consiste em Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neo- formans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Gênero Mucorales (mu- cor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma cap- sulatum.
Em algumas modalidades, a doença infecciosa é causada por parasita patogênico.
Em algumas modalidades, o parasita patogênico é selecionado a partir do grupo que consiste em Entamoeba histolyti- ca, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lam- bia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Ba- besia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma ges-
sol.
[0043] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos com- preendem ainda a administração ao indivíduo de um segundo agente. Em algumas modalidades, o segundo agente é um antagonista PD-1, um antagonista CTLA-4, um antagonista TIM3, um antagonista GITR, um antagonista KIR, um antagonista LAG3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o segundo agente é um anti- corpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-KIR, um anticorpo anti- GITR, um anticorpo anti-LAG3 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o segundo agente é um inibidor de citocina. Em algumas modalidades, o inibidor de citocina é direcionado a um ou mais dentre IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF, IFN-y ou qualquer combinação dos mesmos.
[0044] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é adminis- trada por meio de uma via tópica, mucosa epidérmica, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramus- cular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural ou intraesternal.
6. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0045] A FIG. 1 mostra que a massa molecular da SEQ ID NO: 16 é 93 kDa, conforme medido por dispersão de luz estática SEC/MALS. A massa teórica da cadeia polipeptídica sozinha é 37,812 Da reduzida. A massa de solução observada demonstra que existe como um homo- dímero homogêneo com cerca de 19 % da massa devido à glicosila- ção.
[0046] A FIG. 2 mostra a ligação prototípica da proteína de fusão IL2-CD25 (SEQ ID NO: 16) ao sCD25 humano usando medições de ressonância de plasmônio superficial.
[0047] A FIG. 3 mostra perfis de concentração de soro-tempo de proteínas de fusão indicadas em camundongos Balb/C após uma dose única intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) de 0,5 mg/kg. Cada ponto de tempo representa uma média de amostras de 3 camundongos. As barras de erro representam o desvio padrão.
[0048] A FIG. 4 mostra perfis de concentração de soro-tempo de proteínas de fusão indicadas em camundongos Balb/C após uma dose única intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) de 0,5 mg/kg. Cada ponto de tempo representa uma média de amostras de 3 camundongos. As barras de erro representam o desvio padrão.
[0049] A FIG. 5 mostra perfis de concentração de soro-tempo de hIL2-CD25 (22-212) em macaco cinomolgo após uma dose única sub- cutânea (SC) de 0,075 mg/kg. Cada ponto no tempo representa uma média de amostras de 3 macacos. As barras de erro representam o desvio padrão.
[0050] A FIG. 6 mostra a atividade das proteínas de fusão IL2- CD25 para induzir a fosforilação de STAT5 em PBMCs humanos de um doador representativo. As células foram fechadas em células Treg (CD4*, foxp3*, CD25*) ou Tconv (CD4*, foxp3), CD8* e células NK (CD3', CD56*) e a porcentagem de células que coraram positivamente para pSTATS5 após a incubação foi quantificada. A EC5o para a indução de pSTATS5 em Treg determinada a partir dessas experiências foi de ng/ml, 4,4 ng/ml e 4,6 ng/ml para hlL2-CD25 (22-240), hiL2-CD25 (22-212) e hiL2-CD25 (22-187) respectivamente.
[0051] A FIG. 7 mostra a capacidade das proteínas de fusão trun- cadas para estimular IL2R em sangue total, resultando na indução de STATS fosforilado em vários tipos de células. A sinalização de IL2R foi detectada por medição por citometria de fluxo após manchamento in- tracelular para pSTAT5 e determinação da porcentagem de células com manchamento positivo para pPSTAT5 na mistura de sangue total. A potência de hlL2-CD25 (22-240) foi comparada com hlL2-CD25 (22- 212) em um doador representativo. A proteína foi titulada em sangue total humano e a intensidade da manchamento de pSTATS5 intracelular medida por citometria de fluxo. EC para indução de pSTATS5 em Treg foi de 22 ng/ml para hlL2-CD25 (22-240) e 36 ng/ml para hlL2-CD25 (22-212).
[0052] A FIG. 8A-FIG. 8C mostram a capacidade similar de hlL2- CD25 (22-240), hlL2-CD25 (22-212) e hlL2-CD25 (22-184) para au- mentar as células T em camundongos com um sistema imunológico humanizado. A administração (s.c.) da proteína de fusão a camundon- gos enxertados com NSG-huCD34 foi realizada a cada três dias para três doses. A análise das células Treg (FIG. 8A), CD8 (FIG. 8B) e NK (FIG. 8C) do baço de camundongos dosados foi determinada por cito- metria de fluxo.
[0053] As FIG. 9A e FIG. 9B mostram a fosforilação de STATS após 15 min em uma população de células mistas incluindo em PBMCs (FIG. 9A) ou concentração de sangue total (FIG. 9B) com hIL2-CD25 (22-212) (SEQ ID NO: 16).
[0054] A FIG. 10 mostra a análise baseada em LC-MS/MS da es- tabilidade do ligante (G3S) 3 em IL2 (21-153) - (G3S) 3-CD25 (22-212) em soro humano ou de camundongo in vitro. A relação da área do pico de I|L2 e CD25 usando LC-MS/MS é relatada após a captura usando anticorpo anti-IL2.
[0055] A FIG. 11 mostra a análise baseada em LC-MS/MS da es- tabilidade do ligante (G3S) 3 em IL2 (21-153) - (G3S) 3-CD25 (22-212) em soro de macacos após uma dose subcutânea única de 0,075 mg/kg. A relação da área do pico de IL2 e CD25 usando LC-MS/MS é relatada após a captura usando anticorpo anti-IL2.
7. DESCRIÇÃO DETALHADA DA DESCRIÇÃO
[0056] A presente descrição é descrita mais completamente a se- guir com referência aos desenhos anexos, nos quais algumas, mas não todas as modalidades da descrição são mostradas. Na verdade, essas descrições podem ser realizadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas às modalidades aqui apresentadas; em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que esta descrição satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Nú- meros similares referem-se a elementos similares.
[0057] Muitas modificações e outras modalidades das descrições aqui apresentadas virão à mente de alguém versado na técnica à qual essas descrições se referem, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriores e nos desenhos associados. Portanto, deve ser entendido que as descrições não devem ser limita- das às modalidades específicas descritas e que as modificações e ou- tras modalidades se destinam a ser incluídas dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não para fins de limitação.
7.1 Visão geral
[0058] Vários métodos e composições que são fornecidos podem ser empregados para modular o sistema imunológico. As composições incluem uma proteína de fusão compreendendo: (a) um primeiro poli- peptídeo compreendendo o polipeptídeo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular do polipeptídeo do Receptor Alfa de Interleucina-2 (IL2Ra); em que (i) o domínio extracelular do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com o domínio extracelular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7); e/ou (ii) o polipeptídeo de I1L2 tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com IL2 nativa
(SEQ ID NO: 2); e em que a proteína de fusão tem atividade de IL2.
[0059] A presente descrição também descreve um nucleotídeo que codifica a proteína de fusão aqui descrita, um vetor que compreende o nucleotídeo, uma célula hospedeira que compreende o nucleotídeo e uma composição que compreende a proteína de fusão, o nucleotídeo, o vetor ou a célula hospedeira. A descrição também é direcionada a métodos de produção da proteína de fusão, o nucleotídeo, o vetor, a célula hospedeira ou a composição ou métodos de uso da proteína de fusão, o nucleotídeo, o vetor, a célula hospedeira ou a composição.
7.2 Definições
[0060] É de notar que o termo "um" ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, "uma sequência de nu- cleotídeos" é entendida como representando uma ou mais sequências de nucleotídeos. Como tais, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados indistintamente neste documen- to.
[0061] Além disso, "e/ou", onde usado neste documento, deve ser considerado como descrição específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" conforme usado em uma frase como "A e/ou B" neste documen- to se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" (sozinho) e "B" (sozinho). Da mesma forma, o termo "e/ou", conforme usado em uma frase como "A, B e/ou C", pretende abranger cada um dos seguintes aspectos: A, BeC;A,BouC;AouC;AouB;BouC;AeC;AeB;BeC;A (sozi- nho); B (sozinho); e C (sozinho).
[0062] Da mesma forma, a palavra "ou" pretende incluir "e", a me- nos que o contexto indique claramente o contrário. Deve ainda ser en- tendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos, são aproximados e são fornecidos para descrição.
[0063] Entende-se que, sempre que os aspectos são aqui descri- tos com a linguagem "compreendendo", também são fornecidos as- pectos análogos descritos em termos de "consistindo em" e/ou "con- sistindo essencialmente em".
[0064] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual esta descrição está relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2º ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3º ed., 1999, Aca- demic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Bi- ology, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.
[0065] Unidades, prefixos e símbolos são indicados em seu formu- lário aceito Systême International de Unites (SI). Os intervalos numéri- cos incluem os números que definem o intervalo. Salvo indicação em contrário, as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda pa- ra a direita na orientação amino para carbóxi. Os títulos fornecidos neste documento não são limitações dos vários aspectos da descrição, que podem ser tidos por referência ao relatório descritivo como um to- do. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são definidos de forma mais completa por referência ao relatório descritivo em sua totalidade.
[0066] O termo "cerca de" é usado neste documento para signifi- car aproximadamente, a grosso modo, em torno ou nas regiões de. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos apresentados. Assim, "cerca de 10-20" significa "cerca de 10 a cerca de 20". Em geral, o termo "cerca de" po-
de modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variação de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor).
[0067] Quando aqui usado, "Interleucina-2", "IL2" ou "IL-2" refere- se a qualquer IL2 nativa ou recombinante de qualquer fonte de verte- brados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos) e mamíferos domesti- cados ou agrícolas, salvo indicação em contrário. O termo abrange IL2 não processada, bem como qualquer forma de IL2 que resulte do pro- cessamento na célula (isto é, a forma madura de IL2). O termo tam- bém abrange variantes e fragmentos de IL2 de ocorrência natural, por exemplo, variantes de ligação ou variantes alélicas e variantes de ocorrência não natural que têm atividade de IL2 da IL2 de ocorrência natural.
[0068] São conhecidas sequências de ácido nucleico e aminoáci- dos adicionais para I|L2. Veja, por exemplo, números de acesso do GenBank: Q7JFM2 (Aotus lemurinus (macaco noturno de barriga cin- zenta)),;, Q7JFM5 (Aotus nancymaae (macaco noturno de Ma)); PO5016 (Bas taurus (Bovino)); 029416 (Canisfamiliaris (Cão) (Canis lupus familiaris)); P36835 (Capra hircus (Cabra)); e, P37997 (Equus caballus (Cavalo)).
[0069] Fragmentos biologicamente ativos e variantes de IL2 retêm a atividade de |L2. A frase "atividade biológica de IL2" ou "atividade de IL2" refere-se a uma ou mais das atividades biológicas de IL2, incluin- do, mas não se limitando a, a capacidade de estimular linfócitos porta- dores do receptor de IL2. Tal atividade pode ser medida tanto in vitro quanto in vivo. A IL2 é um regulador global da atividade imunológica e os efeitos vistos aqui são a soma dessas atividades. Por exemplo, re- gula a atividade de sobrevivência (Bcl-2), induz a atividade efetora de T (IFN-gama, Granzima B e Perforina) e/ou promove a atividade regu-
ladora de T (FoxP3).
[0070] Variantes biologicamente ativas de IL2 são conhecidas. Veja, por exemplo, Publicações de Pedido Norte-americano 20060269515 e 20060160187 e WO 99/60128.
[0071] O termo "CD25," "receptor de IL2 a," "IL2Ra" ou "IL2Ra", quando aqui usado, refere-se a qualquer IL2Ra nativa ou recombinan- te de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como prima- tas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos) e mamíferos domesticados ou agrícolas, a menos que indicado de outra forma. O termo também abrange variantes de ocorrência na- tural de IL2Ra, por exemplo, variantes de ligação ou variantes alélicas, ou variantes de ocorrência não natural que têm atividade de IL2Ra. À IL2 humana exerce seus efeitos biológicos por meio de sinalização por meio de seu sistema receptor, IL2R. IL2 e seu receptor (IL2R) são ne- cessários para a proliferação de células T e outras funções fundamen- tais que são cruciais para a resposta imune. IL2R consiste em 3 prote- Ínas transmembrana tipo | não covalentemente ligadas, que são as cadeias alfa (p55), beta (p75) e gama (p65). A cadeia alfa IL2R huma- na contém um domínio extracelular de 219 aminoácidos, um domínio transmembrana de 19 aminoácidos e um domínio intracelular de 13 aminoácidos. O domínio extracelular secretado de IL2R alfa (IL2R-a) pode ser empregado nas proteínas de fusão aqui descritas.
[0072] As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos para IL2Ra são conhecidas. Veja, por exemplo, Números de Acesso do GenBank: NP 001030597.1 (Pan troglodytes); NP 001028089.1 (Ma- caca mulatta);) NM 001003211.1 (Canis lupus); NP 776783.1 (Bos taurus); NP 032393.3 (Mus musculus); e NP 037295.1 (Rattus nor- vegicus).
[0073] Fragmentos biologicamente ativos e variantes do domínio extracelular de IL2Ra também são fornecidos. Tais variantes ou frag-
mentos ativos do domínio extracelular de IL2Ra reterão a atividade do domínio extracelular de IL2Ra. A frase "atividade biológica do domínio extracelular de IL2Ra" refere-se a uma ou mais das atividades biológi- cas do domínio extracelular de IL2Ra, incluindo, mas não se limitando a, a capacidade de se ligar a IL2 e/ou realçar a sinalização intracelular em células responsivas ao receptor de IL2. Exemplos não limitantes de fragmentos biologicamente ativos e variantes do IL2Ra são descritos, por exemplo, em Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5654- 5658, 1988. Em algumas modalidades, os fragmentos e variantes bio- logicamente ativos do IL2Ra aqui descritos compreendem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com o domínio extracelular da IL2Ra nativa.
[0074] O termo "ocorrência natural", quando aqui usado, quando aplicado a um objeto, refere-se ao fato de que um objeto pode ser en- contrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência po- linucleotídica que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencio- nalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natu- ral.
[0075] Um "polipeptídeo" refere-se a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácidos ligados consecutivamente, sem limite superior no comprimento da cadeia. Um ou mais resíduos de aminoácidos na proteína podem conter uma modificação, como, mas não se limitando a, glicosilação, fosforilação ou formação de liga- ção dissulfeto. Uma "proteína" ou "proteína de fusão" pode compreen- der um ou mais polipeptídeos.
[0076] Também incluídos na presente descrição estão fragmentos ou variantes de polipeptídeos e qualquer combinação dos mesmos. O termo "fragmento" ou "variante" quando se refere a domínios de liga- ção de polipeptídeo ou moléculas de ligação da presente descrição incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades (por exemplo, atividade de ligação de IL2 para IL2Ra) do polipeptídeo de referência. Fragmentos de polipeptídeos incluem fra- gmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, mas não in- cluem o polipeptídeo de comprimento total de ocorrência natural (ou polipeptídeo maduro). Variantes de domínios de ligação de polipeptí- deo ou moléculas de ligação da presente descrição incluem fragmen- tos como descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes podem ocorrer naturalmente ou não. Va- riantes de ocorrência não natural podem ser produzidas usando técni- cas de mutagênese conhecidas. Os polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições conservativas ou não conservativas de aminoácidos.
[0077] Como afirmado acima, as variantes polipeptídicas incluem, por exemplo, polipeptídeos modificados. As modificações incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação co- valente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação co- valente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação cova- lente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfo- tidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metila- ção, miristoilação, oxidação, peguilação (Mei et a/., Blood 116: 270-79 (2010)), processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemi- zação, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas, como arginilação e ubiquitinação.
[0078] Quando aqui usado, um "correspondente a", "aminoácido correspondente a", "sítio correspondente a" ou "aminoácido equivalen-
te" em uma proteína ou sequência de nucleotídeos é identificado por alinhamento para maximizar a identidade ou similaridade entre uma primeira sequência de proteína, por exemplo, uma sequência de IL2 e uma segunda sequência de proteína, por exemplo, uma segunda se- quência de IL2. O número usado para identificar um aminoácido equi- valente em uma segunda sequência de proteína é baseado no número usado para identificar o aminoácido correspondente na primeira se- quência de proteína. Em algumas modalidades, o termo "correspon- dente a" refere-se à relação de uma mutação em um ou mais aminoá- cidos em um polipeptídeo ou um ou mais nucleotídeos em um polinu- cleotídeo. Por meio de um exemplo não limitante, um aminoácido es- pecífico (por exemplo, S50) de um polinucleotídeo (por exemplo, SEQ ID NO: 7) como aqui descrito refere-se ao 50º aminoácido - uma serina - na SEQ ID NO: 7.
[0079] Quando aqui usado, o termo "associado com" refere-se a uma ligação covalente ou não covalente formada entre uma primeira cadeia de aminoácidos e uma segunda cadeia de aminoácidos. Em uma modalidade, o termo "associado com" significa uma ligação cova- lente, não peptídica ou uma ligação não covalente. Esta associação pode ser indicada por dois pontos, ou seja, (:). Em outra modalidade, significa uma ligação covalente, exceto uma ligação peptídica. Por exemplo, o aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação dissulfeto ou ponte com um grupo tiol em um se- gundo resíduo de cisteína. Na maioria das moléculas de IgG de ocor- rência natural, as regiões CH1 e CL estão associadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão associadas por duas liga- ções dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242 usando o sistema de numeração Kabat (posição 226 ou 229, sistema de nume- ração EU). Exemplos de ligações covalentes incluem, mas não estão limitados a, uma ligação peptídica, uma ligação metálica, uma ligação de hidrogênio, uma ligação dissulfeto, uma ligação sigma, uma ligação pi, uma ligação delta, uma ligação glicosídica, uma ligação agnóstica, uma ligação curva, uma ligação dipolar, uma ligação posterior Pi, uma ligação dupla, uma ligação tripla, uma ligação quádrupla, uma ligação quíntupla, uma ligação sêxtupla, conjugação, hiperconjugação, aroma- ticidade, hapticidade ou antiligação. Exemplos não limitantes de liga- ção não covalente incluem uma ligação iônica (por exemplo, ligação catiônica-pi ou ligação salina), uma ligação de metal, uma ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação di-hidrogênica,y complexo di- hidrogênio, ligação de hidrogênio de baixa barreira ou ligação de hi- drogênio simétrica), força de van der Walls, força de dispersão de London, uma ligação mecânica, uma ligação de halogênio, aurofilici- dade, intercalação, empilhamento, força entrópica ou polaridade quíi- mica.
[0080] O termo "comparável", quando aqui usado, significa uma taxa ou nível comparado resultante do uso, por exemplo, a proteína de fusão é igual a, substancialmente igual ou similar à taxa ou nível de referência. O termo "similar", quando aqui usado, significa que uma taxa ou nível comparado tem uma diferença de não mais do que 10 % ou não mais do que 15 % da taxa ou nível de referência. O termo "substancialmente igual" significa que uma taxa ou nível comparado tem uma diferença de não mais que 0,01 %, 0,5 % ou 1 % da taxa de referência ou nível. O termo "expressão", quando aqui usado, refere-se a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto gêni- co, por exemplo, um ARN ou um polipeptídeo.
[0081] Uma proteína de "fusão" ou "fusão" compreende uma pri- meira sequência de aminoácidos ligada na estrutura a uma segunda sequência de aminoácidos com a qual não está naturalmente ligada na natureza. As sequências de aminoácidos que normalmente existem em proteínas separadas podem ser reunidas no polipeptídeo de fusão,
ou as sequências de aminoácidos que normalmente existem na mes- ma proteína podem ser colocadas em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão, por exemplo, fusão de uma proteína IL2 com uma proteína IL2-Ra. Uma proteína de fusão é criada, por exemplo, por síntese química, ou criando e transladando um polinucleotídeo no qual as re- giões peptídicas são codificadas na relação desejada. Uma proteína de fusão pode compreender ainda uma segunda sequência de amino- ácidos associada à primeira sequência de aminoácidos por uma liga- ção covalente, não peptídica ou não covalente. Após a transcrição/ tradução, uma única proteína é produzida. Desta forma, múltiplas pro- teínas, ou fragmentos das mesmas, podem ser incorporados em um único polipeptídeo. "Ligado operacionalmente" pretende significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma |li- gação operável entre dois polipeptídeos funde ambos os polipeptídeos juntos na estrutura para produzir uma única proteína de fusão polipep- tídica. Em um aspecto particular, a proteína de fusão compreende ain- da um terceiro polipeptídeo que, como discutido em mais detalhes abaixo, pode compreender uma sequência de ligante.
[0082] Uma "região Fc" (região cristalizável do fragmento), "domí- nio Fc" ou "Fc" refere-se à região de terminal C da cadeia pesada de um anticorpo que medeia a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo a ligação a Receptores de Fc locali- zados em várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) ou para o primeiro componente (C1g) do sistema comple- mento clássico. Assim, uma região Fc compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante (por exemplo, CH1 ou CL). Nos isótipos de anticor- pos IgG, IgA e IgD, a região Fc compreende dois fragmentos de prote- ína idênticos, derivados do segundo (CH2) e terceiro (CH3) domínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo; As regiões Fc de
IgM e IgE compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (domínios CH 2-4) em cada cadeia polipeptídica. O isótipo IgG é divi- dido em subclasses em certas espécies: I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4 em humanos e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 em camundongos. Para IgG, a região Fc compreende domínios de imunoglobulina CH2 e CH3 e a articulação entre os domínios CH1 e CH2. Embora a definição dos |i- mites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possa variar, conforme definido neste documento, a região Fc da cadeia pe- sada de IgG humana é definida para se estender a partir de um resí- duo de aminoácido D221 para IgG1, V222 para IgG2, L221 para I9G3 e P224 para IgG4 para o terminal carbóxi da cadeia pesada, em que a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat. O domí- nio CH2 de uma região Fc de IgG humana se estende do aminoácido 237 ao aminoácido 340, e o domínio CH3 está posicionado no lado de terminal C de um domínio CH2 em uma região Fc, ou seja, se estende do aminoácido 341 ao aminoácido 447 ou 446 (se o resíduo de lisina de terminal C estiver ausente) ou 445 (se os resíduos de glicina e lisi- na de terminal C estiverem ausentes) de uma IgG. Quando aqui usa- do, a região Fc pode ser um Fc de sequência nativa, incluindo qual- quer variante alotípica ou um Fc variante (por exemplo, um Fc de ocor- rência não natural).
[0083] Um "receptor Fc" ou "FcR" é um receptor que se liga à regi- ão Fc de uma imunoglobulina. Os FcRs que se ligam a um anticorpo IgG compreendem receptores da família FcyR, incluindo variantes alé- licas e formas de splicing alternativo desses receptores. A família FoeyR consiste em três receptores ativadores (FcyRI, FecyRIll e FcyRIV em camundongos; FCyRIA, FCcyRIIA e FCcyRIIIA em humanos) e um recep- tor inibidor (FCyRIIB). Várias propriedades de FcyRs humanos são co- nhecidas na técnica. A maioria dos tipos de células efetoras inatas co- expressa um ou mais FcyR de ativação e o FcyRIIB inibidor, enquanto as células exterminadoras naturais (NK) expressam seletivamente um receptor Fc de ativação (FcyRIll em camundongos e FCyRIIIA em se- res humanos), mas não o FcyRIIB inibidor em camundongos e huma- nos. A IgG1 humana liga-se à maioria dos receptores de Fc humanos e é considerada equivalente à IgG2a de murino no que diz respeito aos tipos de receptores de Fc ativadores aos quais se liga.
[0084] Os termos "inserido", "é inserido", "inserido em" ou termos gramaticalmente relacionados, quando aqui usados referem-se à posi- ção de uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção de prolon- gamento da meia-vida) em um polipeptídeo de fusão em relação ao análogo posição na proteína especificada. Quando aqui usado, os termos referem-se às características do polipeptídeo recombinante aqui descrito e não indicam, implicam ou inferem quaisquer métodos ou processos pelos quais o polipeptídeo de fusão foi feito.
[0085] "Heterólogo" e "fração heteróloga" em referência a um poli- peptídeo ou polinucleotídeo é um polipeptídeo ou polinucleotídeo que se origina de uma proteína ou polinucleotídeo diferente. Os componen- tes adicionais da proteína de fusão podem ser originários do mesmo organismo que os outros componentes polipeptídicos da proteína de fusão ou os componentes adicionais podem ser de um organismo dife- rente dos outros componentes polipeptídicos da proteína de fusão. Por exemplo, um polipeptídeo heterólogo pode ser sintético ou derivado de uma espécie diferente, tipo de célula diferente de um indivíduo ou o mesmo ou tipo diferente de célula de indivíduos distintos. Em um as- pecto, uma porção heteróloga é um polipeptídeo fundido a outro poli- peptídeo para produzir um polipeptídeo ou proteína de fusão. Em outro aspecto, uma porção heteróloga é um não polipeptídeo, como PEG conjugado a um polipeptídeo ou proteína. Exemplos não limitantes de porções heterólogas aqui descritas são ligantes glicina/serina (por exemplo, GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 71) (também conhecida como (Gly3Ser);)).
[0086] Uma "região Fc de sequência nativa" ou "Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa; região Fc de I9G2 humana de se- quência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e re- gião Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como suas varian- tes de ocorrência natural. A sequência nativa Fc inclui os vários alóti- pos de Fcs (veja, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
[0087] O termo "ECso" no contexto de um ensaio in vitro ou in vivo usando proteína de fusão refere-se à concentração de uma proteína de fusão que induz uma resposta que é 50 % da resposta máxima, ou seja, a meio caminho entre a resposta máxima e a linha de base.
[0088] "Substituições conservadoras de aminoácidos" referem-se a substituições de um resíduo de aminoácido por um resíduo de ami- noácido possuindo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exem- plo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não car- regadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exem- plo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metioni- na), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, vali- na, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em algumas modalidades, um resí- duo de aminoácido não essencial previsto na proteína de fusão IL2/IL2Ra é substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Os métodos de identificação de substituições conservadoras de nucleotídeos e aminoácidos que não eliminam a li- gação ao antígeno são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Pro- tein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)).
[0089] O termo "molécula de ácido nucleico", quando aqui usado, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécu- la de ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla e pode ser cDNA.
[0090] Quando aqui usado, o termo "região reguladora" refere-se às sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região codificante e que influenciam a transcrição, proces- samento de RNA, estabilidade ou translação da região de codificação associada. As regiões regulatórias podem incluir promotores, sequên- cias líderes de translação, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efe- tores e estruturas de tronco-alça. Se uma região de codificação se destina à expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadeni- lação e uma sequência de terminação da transcrição estarão geral- mente localizados a 3' da sequência de codificação.
[0091] Um polinucleotídeo, que codifica um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, pode incluir um promotor e/ou outros ele- mentos de controle de transcrição ou translação operacionalmente as- sociados a uma ou mais regiões de codificação. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, realçado- res, operadores, repressores e sinais de terminação da transcrição, também podem ser operacionalmente associados a uma região de co- dificação para dirigir a expressão do produto gênico.
[0092] Uma variedade de regiões de controle da transcrição é co-
nhecida pelos versados na técnica. Estes incluem, sem limitação, regi- ões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebra- dos, tais como, mas não se limitando a, segmentos promotores e real- çadores de citomegalovírus (o promotor inicial imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o inicial promotor) e retrovírus (como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, como actina, pro- teína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e R&-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a ex- pressão de genes em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e realçadores específicos de tecido, bem como promotores indutíveis por linfocina (por exemplo, promotores indutíveis por interferons ou interleucinas).
[0093] Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de translação é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes in- cluem, mas não estão limitados a sítios de ligação ao ribossoma, có- dons de iniciação e terminação da translação e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de entrada de ribossoma in- terno, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).
[0094] O termo "porcentagem de identidade de sequência", "por- centagem de identidade", "identidade de sequência" ou "identidade" são usados indistintamente e se referem ao número de posições idên- ticas combinadas compartilhadas entre duas sequências polinucleotí- dicas ou polipeptídicas ao longo de uma janela de comparação, levan- do em consideração adições ou deleções (isto é, lacunas) que devem ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequências. Uma posição combinada é qualquer posição onde um nucleotídeo ou ami- noácido idêntico é apresentado na sequência-alvo e de referência. As lacunas apresentadas na sequência-alvo não são contadas, uma vez que as lacunas não são nucleotídeos ou aminoácidos. Da mesma for-
ma, as lacunas apresentadas na sequência de referência não são con- tadas uma vez que os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência-alvo são contados, não os nucleotídeos ou aminoácidos da sequência de referência.
[0095] A comparação de sequências e a determinação da identi- dade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limi- tantes abaixo.
[0096] A porcentagem de identidade de sequência é calculada de- terminando o número de posições em que o resíduo de aminoácido idêntico ou base de ácido nucleico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a por- centagem de identidade de sequência. A comparação de sequências e a determinação da identidade de sequência percentual entre duas se- quências pode ser realizada usando software prontamente disponível para uso online e para download. Os programas de software adequa- dos estão disponíveis a partir de várias fontes e para o alinhamento de sequências de proteínas e de nucleotídeos. Um programa adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência é bl2seq, parte do conjunto de programas BLAST disponível no site do governo dos EUA National Center for Biotechnology Information BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov). BI2seq executa uma comparação entre duas se- quências usando o algoritmo BLASTN ou BLASTP. BLASTN é usado para comparar sequências de ácido nucleico, enquanto BLASTP é usado para comparar sequências de aminoácidos. Outros programas adequa- dos são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water ou Matcher, parte do conjunto EMBOSS de programas de bioinformática e também disponí- veis no European Bioinformatics Institute (EBI) em www.ebi.ac.uk/ To-
ols/psa.
[0097] Diferentes regiões dentro de um único polinucleotídeo ou sequência-alvo de polipeptídeo que se alinha com um polinucleotídeo ou sequência de referência de polipeptídeo podem ter sua própria por- centagem de identidade de sequência. É de notar que o valor de iden- tidade de sequência percentual é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13 e 80,14 são arredondados para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 e 80,19 são arredon- dados para 80,2. Observa-se também que o valor do comprimento sempre será um número inteiro.
[0098] A percentagem de identidade entre duas sequências de nu- cleotídeos pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em worldwideweb.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percen- tual entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 11- 17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de la- cuna de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http: I/www.gcg. com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAMZ250 e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 5ou6.
[0099] As sequências de ácido nucleico e de proteína aqui descri- tas podem ainda ser usadas como uma "sequência de consulta" para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exem-
plo, identificar sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et a/. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. As pesquisas de nucle- otídeos do BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento da palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico aqui des- critas. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína aqui descritas. Obter para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et a/., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exem- plo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Consulte worldwide- web.ncbi.nlm.nih.gov.
[00100] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células in- teiras, em um lisado de células ou em uma forma parcialmente purifi- cada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tor- nado substancialmente puro" quando purificado de outros componen- tes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nu- cleicos celulares (por exemplo, as outras partes do cromossomo) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo alcalino/Tratamento SDS, bandas CsClI, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agaro- se e outros bem conhecidos na técnica. Veja, F. Ausubel, et al., Ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley In- terscience, New York (1987).
[00101] O termo "vetor", quando aqui usado, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nu- cleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de
DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma cé- lula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacte- rianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hos- pedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replica- dos junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ope- rativamente ligados. Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na pre- sente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indistin- tamente, uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumen- te usada. No entanto, também estão incluídas outras formas de veto- res de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus com replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associados), que desempenham funções equivalentes.
[00102] O termo "célula hospedeira in vitro" (ou simplesmente "célu- la hospedeira"), quando aqui usado, destina-se a referir-se a uma célu- la que compreende um ácido nucleico que não está naturalmente pre- sente na célula e pode ser uma célula na qual um o vetor de expres- são recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos se destinam a se referir não apenas à célula em questão em particular, mas à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocor- rer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambien- tais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", quando aqui usado. Células hospedeiras exemplares incluem, mas não estão limitadas a, células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou, alternativa- mente, células eucarióticas, por exemplo, células fúngicas (por exem- plo, células de levedura, tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Schizosaccharomyces pombe), e várias células animais, como células de inseto (por exemplo, Sf-9) ou células de mamíferos (por exemplo, HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3).
[00103] A frase "imediatamente a jusante de um aminoácido", quando aqui usada, refere-se à posição ao lado do grupo carboxila terminal do aminoácido. Da mesma forma, a frase "imediatamente a montante de um aminoácido" refere-se à posição logo ao lado do gru- po amina terminal do aminoácido. Portanto, a frase "entre dois amino- ácidos de um sítio de inserção", quando aqui usada, refere-se a uma posição na qual uma porção heteróloga (por exemplo, uma porção de prolongamento da meia-vida) é inserida entre dois aminoácidos adja- centes.
[00104] Quando aqui usado, "administrar" refere-se à introdução física de uma composição compreendendo um agente terapêutico a um indivíduo, usando qualquer um dos vários métodos e sistemas de liberação conhecidos pelos versados na técnica. Diferentes vias de administração para a proteína de fusão IL2/IL2Ra aqui descrita inclu- em intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parentérica, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parentérica", quando aqui usada, significa modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, in- tralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, injeção e infusão intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal, bem como eletroporação in vivo. Alternativamente, um anticorpo aqui des- crito pode ser administrado por uma via não parentérica, como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intrana- sal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica. A administração também pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes e/ou durante um ou mais períodos prolongados.
[00105] “Uma "resposta imune" é como entendida na técnica e ge- ralmente se refere a uma resposta biológica dentro de um vertebrado contra agentes estranhos ou anormais, por exemplo, células cancero- sas, cuja resposta protege o organismo contra esses agentes e doen- ças causadas por eles. Uma resposta imune é mediada pela ação de uma ou mais células do sistema imunológico (por exemplo, um linfócito T, linfócito B, célula exterminadora natural (NK), macrófago, eosinófilo, mastócito, célula dendrítica ou neutrófilo) e macromoléculas solúveis produzida por qualquer uma dessas células ou do fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em direcionamento seletivo, ligação, dano, destruição e/ou eliminação do corpo do verte- brado de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com pa- tógenos, células cancerosas ou outras células anormais, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos huma- nos normais. Uma reação imune inclui, por exemplo, ativação ou inibi- ção de uma célula T, por exemplo, uma célula T efetora, uma célula Th, uma célula CD4*, uma célula T CD8* ou uma célula Treg, ou ativa- ção ou inibição de qualquer outra célula do sistema imunológico, por exemplo, célula NK.
[00106] Um "imunomodulador" ou "imunorregulador" refere-se a um agente, por exemplo, um agente direcionado a um componente de uma via de sinalização que pode estar envolvido na modulação, regu- lação ou modificação de uma resposta imune. "Modular", "regular" ou "modificar" uma resposta imune refere-se a qualquer alteração em uma célula do sistema imune ou na atividade de tal célula (por exem- plo, uma célula T efetora, como uma célula Th1). Mais particularmente, quando aqui usado, o termo "modulação" inclui induzir, inibir, potenci- ar, elevar, aumentar ou diminuir uma dada atividade ou resposta. Tal modulação inclui estimulação ou supressão do sistema imunológico que pode se manifestar por um aumento ou diminuição no número de vários tipos de células, um aumento ou diminuição na atividade dessas células ou quaisquer outras alterações que podem ocorrer dentro do sistema imunológico. Ambos os imunomoduladores inibidores e esti- muladores foram identificados, alguns dos quais podem ter função me- lhorada em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, o imunomodulador é direcionado a uma molécula na superfície de uma célula T. Um "alvo imunomodulador" ou "alvo imunorregulador" é uma molécula, por exemplo, uma molécula de superfície celular, que é dire- cionada para ligação por e cuja atividade é alterada pela ligação de uma substância, agente, porção, composto ou molécula. Os alvos imunomoduladores incluem, por exemplo, receptores na superfície de uma célula ("receptores imunomoduladores") e ligantes de receptor ("ligantes imunomoduladores").
[00107] "Imunoterapia" refere-se ao tratamento de um indivíduo que sofre de, ou em risco de contrair ou sofrer recorrência de uma doença, por um método que compreende induzir, realçar, suprimir ou de outra forma modificar o sistema imunológico ou uma resposta imune.
[00108] "Terapia imunoestimulante" ou "terapia imunoestimulante" refere-se a uma terapia que resulta no aumento (indução ou realce) de uma resposta imune em um indivíduo para, por exemplo, tratar o cân- cer.
[00109] "Potencializar uma resposta imune endógena" significa re- alçar a eficácia ou potência de uma resposta imune existente em um indivíduo. Este aumento na eficácia e potência pode ser alcançado,
por exemplo, superando os mecanismos que suprimem a resposta imune do hospedeiro endógeno ou estimulando os mecanismos que aumentam a resposta imune do hospedeiro endógeno.
[00110] Células "T efetoras" ("Ter") referem-se a células T (por exemplo, células T CD4* e CD8*) com atividades citolíticas, bem como células T auxiliares (Th), por exemplo, células Th1, cujas células se- cretam citocinas e ativam e direcionam outras células imunes, mas não inclui células T reguladoras (células Treg). Certas proteínas de fusão IL2/IL2Ra aqui descritas ativam células Ter, por exemplo, células Ter CD4* e CD8* e células Th1.
[00111] Uma capacidade aumentada de estimular uma resposta imune ou o sistema imunológico pode resultar de uma atividade ago- nista realçada de receptores coestimuladores de células T e/ou uma atividade antagonista realçada de receptores inibidores. Un aumento da capacidade de estimular uma resposta imune ou o sistema imune pode ser refletido por um aumento da ECso ou nível máximo de ativi- dade em um ensaio que mede uma resposta imune, por exemplo, um ensaio que mede mudanças na liberação de citocina ou quimiocina, atividade citolítica (determinada diretamente nas células alvo ou indire- tamente por meio da detecção de CD107a ou granzimas) e prolifera- ção. A capacidade de estimular uma resposta imune ou a atividade do sistema imune pode ser aumentada em pelo menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais.
[00112] Os termos "ligado" e "fundido", quando aqui usados, refe- rem-se a uma primeira sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos covalentemente ou não covalentemente unida a uma se- gunda sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos, res- pectivamente. O primeiro aminoácido ou sequência de nucleotídeo po- de ser diretamente unido ou justaposto ao segundo aminoácido ou se- quência de nucleotídeo ou, alternativamente, uma sequência interve-
niente pode ligar covalentemente a primeira sequência à segunda se- quência. O termo "ligado" significa não apenas uma fusão de uma pri- meira sequência de aminoácidos com uma segunda sequência de aminoácidos no terminal C ou terminal N, mas também inclui a inser- ção de toda a primeira sequência de aminoácidos (ou a segunda se- quência de aminoácidos) em quaisquer dois aminoácidos na segunda sequência de aminoácidos (ou na primeira sequência de aminoácidos, respectivamente). Em uma modalidade, a primeira sequência de ami- noácidos está ligada a uma segunda sequência de aminoácidos por uma ligação peptídica ou um ligante. A primeira sequência de nucleo- tídeos pode ser ligada a uma segunda sequência de nucleotídeos por uma ligação fosfodiéster ou um ligante. O ligante pode ser um peptí- deo ou um polipeptídeo (para cadeias polipeptídicas) ou um nucleotí- deo ou uma cadeia nucleotídica (para cadeias nucleotídicas) ou qual- quer porção química (para cadeias polipeptídicas e polinucleotídicas). O termo "ligado" também é indicado por um hífen (-).
[00113] “Quando aqui usado, o termo "resposta mediada por células T" refere-se a uma resposta mediada por células T, incluindo células T efetoras (por exemplo, células CD8*) e células T auxiliares (por exem- plo, células CD4*). As respostas mediadas por células T incluem, por exemplo, citotoxicidade e proliferação de células T.
[00114] Quando aqui usado, o termo "resposta de linfócitos T cito- tóxicos (CTL)" refere-se a uma resposta imune induzida por células T citotóxicas. As respostas de CTL são mediadas principalmente por cé- lulas T CD8*.
[00115] Quando aqui usado, os termos "inibe" ou "bloqueia" (por exemplo, referindo-se à inibição/bloqueio da ligação de IL2 a IL2PRa nas células) são usados indistintamente e abrangem inibição/bloqueio parcial e total. Em algumas modalidades, a proteína de fusão IL2/IL2Ra inibe a ligação de IL2 a IL2Ra em pelo menos cerca de 50
%, por exemplo, cerca de 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 %, determinado, por exemplo, como descrito adicionalmente aqui. Em algumas modalidades, a proteína de fusão IL2/IL2Ra inibe a ligação de IL2 a IL2PRa em não mais que 50 %, por exemplo, em cerca de 40 %, %, 20 %, 10 %, 5 % ou 1 %, determinado, por exemplo, conforme descrito adicionalmente aqui.
[00116] Quando aqui usado, a frase "inibe o crescimento de um tu- mor" inclui qualquer diminuição mensurável no crescimento de um tu- mor, por exemplo, a inibição do crescimento de um tumor em pelo me- nos cerca de 10 %, por exemplo, pelo menos cerca de 20 %, em pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 99 % ou 100 %.
[00117] Quando aqui usado, "câncer" refere-se a um amplo grupo de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais no corpo. A divisão celular desregulada pode resultar na formação de tumores malignos ou células que invadem os tecidos vizi- nhos e podem metastatizar para partes distantes do corpo através do sistema linfático ou corrente sanguínea.
[00118] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", quando aqui usados, referem-se a qualquer tipo de intervenção ou processo reali- zado em, ou administrando um agente ativo, ao indivíduo com o objeti- vo de reverter, aliviar, melhorar, inibir, ou desacelerar ou prevenir a progressão, desenvolvimento, gravidade ou recorrência de um sinto- ma, complicação, condição ou indícios bioquímicos associados a uma doença ou aumento da sobrevida geral. O tratamento pode ser de um indivíduo com uma doença ou de um indivíduo que não tem uma do- ença (por exemplo, para profilaxia). Quando fornecida profilaticamente, a proteína de fusão aqui descrita é fornecida antes de qualquer sinto-
ma. A administração profilática da substância serve para prevenir ou atenuar qualquer sintoma subsequente.
[00119] Por "realçar a eficácia" ou "realçar a imunogenicidade" em relação a uma proteína de fusão, composição farmacêutica ou vacina pretende-se melhorar um resultado, por exemplo, medido por uma mudança em um valor específico, tal como um aumento ou uma dimi- nuição em um parâmetro particular de uma atividade de uma proteína de fusão, composição farmacêutica ou vacina associada à imunidade protetora. Em uma modalidade, o aumento se refere a pelo menos 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100 % ou mais de 100 % de aumento em um parâmetro particular. Em outra modalidade, o realce se refere a pelo menos 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100 % ou mais de 100 % de diminui- ção em um parâmetro específico. Em um exemplo, o aumento da efi- cácia/imunogenicidade de uma vacina refere-se a um aumento na ca- pacidade da vacina para inibir ou tratar a progressão da doença, tal como pelo menos 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100 %, ou aumento superior a 100 % na eficácia da vacina para esse fim. Em outro exemplo, o au- mento da eficácia/imunogenicidade de uma vacina refere-se a um au- mento na capacidade da vacina de recrutar as defesas naturais do in- divíduo contra cânceres que já se desenvolveram, como pelo menos 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100 % ou maior que 100 % de aumento na efi- cácia da proteína de fusão, composição farmacêutica ou vacina para esse fim.
[00120] Da mesma forma, ao "superar uma resposta imune supri- mida" em relação a uma proteína de fusão, composição farmacêutica ou vacina, pretende-se melhorar um resultado, por exemplo, medido por uma mudança em um valor específico, como um retorno a um va- lor anteriormente positivo em um parâmetro particular de uma ativida- de de uma vacina associada à imunidade protetora. Em uma modali- dade, a superação se refere a pelo menos 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 100
% ou mais de 100 % de aumento em um parâmetro específico. Em um exemplo, superar uma resposta imune suprimida a uma proteína de fusão, composição farmacêutica ou vacina refere-se a uma capacida- de renovada da proteína de fusão, composição farmacêutica ou vacina para inibir ou tratar a progressão da doença, tal como pelo menos 5 %, %, 25 %, 50 %, 100 % ou mais de 100 % de renovação na eficácia da vacina para esse fim.
[00121] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz", "dose terapêuti- ca", "dose", "dose eficaz", "dosagem eficaz" ou "quantidade de dosa- gem" quando aqui usada (indistintamente), significa uma dose que atinge um objetivo terapêutico, como aqui descrito . Em algumas mo- dalidades, uma "dose terapêutica" significa uma dose que induz uma tolerância imune em um indivíduo. Em certas modalidades, uma "dose terapêutica" significa uma dose que induz uma tolerância imune em um indivíduo dentro de um período de tempo de tolerância especifica- do, por exemplo, dentro de 12 semanas de administração da primeira dose. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma proteína de fusão IL2/IL2Ra refere-se à quantidade da proteína de fusão IL2/IL2Ra suficiente para induzir uma resposta biológica desejada. Como será apreciado por alguém versado na técnica, a quantidade absoluta de uma proteína de fusão IL2/IL2Ra particular que é eficaz pode variar dependendo de fatores como o ponto final biológico desejado, a prote- ína de fusão IL2/IL2Ra a ser entregue, a célula ou tecido-alvo e simila- res. Um versado na técnica compreenderá ainda que uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma dose única ou pode ser alcan- çada pela administração de doses múltiplas (isto é, 1, 2, 3, 4,5,6,7,8, 9, 10 ou mais doses). A capacidade de um agente terapêutico para promover a regressão da doença ou inibir o desenvolvimento ou recor- rência da doença pode ser avaliada usando uma variedade de méto- dos conhecidos do médico especialista, como em seres humanos du-
rante os ensaios clínicos, em sistemas de modelo animal preditivos de eficácia em seres humanos, ou através do ensaio da atividade do agente em ensaios in vitro.
[00122] "Tratar", "tratamento" ou "tratando", quando aqui usado re- fere-se a, por exemplo, a redução da gravidade de uma doença ou condição; a redução na duração de um curso de condição; a melhoria ou eliminação de um ou mais sintomas associados a uma doença ou condição; o fornecimento de efeitos benéficos a um indivíduo com uma doença ou condição, sem necessariamente curar a doença ou condi- ção.
[00123] A título de exemplo, um agente anticâncer é um fármaco que promove a regressão do câncer em um indivíduo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco promove a regressão do câncer ao ponto de eliminar o câncer. "Pro- mover a regressão do câncer" significa que a administração de uma quantidade eficaz do fármaco, sozinha ou em combinação com um agente antineoplásico, resulta em uma redução no crescimento ou ta- manho do tumor, necrose do tumor, uma diminuição na gravidade de pelo menos um sintoma de doença, um aumento na frequência e du- ração dos períodos sem sintomas da doença, uma prevenção da defi- ciência ou incapacidade devido à aflição da doença ou de outra forma a melhoria dos sintomas da doença no paciente. Além disso, os ter- mos "eficaz" e "eficácia" em relação a um tratamento incluem tanto a eficácia farmacológica quanto a segurança fisiológica. A eficácia far- macológica refere-se à capacidade do fármaco de promover a regres- são do câncer no paciente. A segurança fisiológica se refere ao nível de toxicidade ou outros efeitos fisiológicos adversos no nível celular, de órgão e/ou organismo (efeitos adversos) resultantes da administra- ção do fármaco.
[00124] A título de exemplo para o tratamento de tumores, uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz do fármaco inibe o crescimento celular ou tumoral em pelo menos cerca de 20 %, em pelo menos cerca de 40 %, em pelo menos cerca de 60 % ou em pelo me- nos cerca de 80 % em relação a indivíduos não tratados. Em algumas modalidades, uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz do fármaco inibe completamente o crescimento celular ou tumoral, ou se- ja, inibe o crescimento celular ou tumoral em 100 %. A capacidade de um composto para inibir o crescimento do tumor pode ser avaliada usando os ensaios descritos infra. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto para inibir o crescimento celular, tal inibição pode ser medi- da in vitro por ensaios conhecidos do especialista. Em algumas moda- lidades aqui descritas, a regressão do tumor pode ser observada e continuar por um período de pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 40 dias ou pelo menos cerca de 60 dias.
[00125] O termo "paciente" inclui humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.
[00126] Quando aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composi- ções aqui descritos podem ser usados para tratar um indivíduo com câncer. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
[00127] O termo dose ou dosagem "com base no peso", quando aqui referido, significa que uma dose que é administrada a um pacien- te é calculada com base no peso do paciente. Por exemplo, quando um paciente com 60 kg de peso corporal requer 3 mg/kg de um anti- corpo anti-IL2, pode-se calcular e usar a quantidade apropriada da proteína de fusão IL2/IL2Ra (ou seja, 180 mg) para administração.
[00128] O uso do termo "dose plana" em relação aos métodos e dosagens aqui descritos significa uma dose que é administrada a um paciente sem levar em conta o peso ou a área de superfície corporal (BSA) do paciente. A dose fixa, portanto, não é fornecida como uma dose de mg/kg, mas sim como uma quantidade absoluta do agente (por exemplo, a proteína de fusão IL2/IL2Ra). Por exemplo, uma pessoa de 60 kg e uma pessoa de 100 kg receberiam a mesma dose de um anti- corpo (por exemplo, 480 mg de uma proteína de fusão IL2/IL2Ra).
[00129] “Quando aqui usado, os termos "ug" e "uM" são usados in- distintamente com "ug" e "uM", respectivamente.
[00130] Vários aspectos aqui descritos são descritos em mais deta- lhes nas seguintes subseções.
[00131] As referências feitas à numeração de aminoácidos de imu- noglobulinas ou fragmentos de imunoglobulinas, ou regiões, são todas baseadas em Kabat et a/. 1991, Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. (O re- ceptor FcRn foi isolado de várias espécies de mamíferos, incluindo humanos. As sequências do FcRn humano, FcRn de rato e FcRn de camundongo são conhecidas (Story et al., J. Exp. Med. 180: 2377 (1994).) Fc pode compreender os domínios CH2 e CH3 de uma imu- noglobulina com ou sem a região de articulação da imunoglobulina. Variantes Fc exemplares são fornecidas em WO 2004/101740 e WO 2006/074199.
7.3 Proteínas de fusão do receptor alfa de interleucina-2/inter- leucina-2
[00132] É aqui descrita uma proteína de fusão compreendendo pelo menos dois componentes: (a) um primeiro polipeptídeo compreenden- do um polipeptídeo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo polipeptí- deo compreendendo um domínio extracelular de um polipeptídeo de receptor alfa de interleucina-2 (IL2Ra). Em algumas modalidades, o domínio extracelular do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com o domínio extracelular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7); e/ou (ii) o polipeptídeo de I1L2 tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com IL2 nativa (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem atividade de IL2.
7.3.1 Interleucina-2
[00133] Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína de fu- são que compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo inter- leucina-2 (IL2) fundido no quadro com um segundo polipeptídeo com- preendendo ou consistindo no domínio extracelular do polipeptídeo do Receptor Alfa de Interleucina-2 (IL2Ra). Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um primeiro polipeptídeo compreen- dendo IL2 tendo SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à SEQ ID NO: 2.
[00134] Em uma modalidade, o polipeptídeo de IL2 é uma |IL2 nati- va ou recombinante de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamí- feros como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exem- plo, camundongos e ratos) e mamíferos domesticados ou agrícolas, a menos que indicado de outra forma.
[00135] Os polipeptídeos IL2 úteis para esta descrição são expres- sos em uma proteína de fusão. As proteínas de fusão aqui descritas ligam-se especificamente a IL2R humana e, mais especificamente, a um domínio particular (por exemplo, um domínio funcional) dentro do domínio extracelular de IL2Ra humana. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreendendo IL2 é um antagonista. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreendendo IL2 se liga à IL2Ra humana com alta afinidade.
[00136] O termo |IL2 abrange IL2 não processada, bem como qual- quer forma de IL2 que resulte do processamento na célula (ou seja, a forma madura de IL2). O termo também abrange variantes de ocorrên- cia natural e fragmentos de IL2, por exemplo, variantes de ligação ou variantes alélicas e variantes de ocorrência não natural. A sequência de aminoácidos de uma forma madura exemplar de IL2 humana (pos- suindo a sequência de sinal de 20 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 2. A IL2 humana não processada compreende adicionalmente um peptídeo de sinal de 20 aminoácidos de terminal N (SEQ ID NO: 1), que está ausente na molécula de IL2 madura. A sequência de ami- noácidos de uma forma madura exemplar de IL2 de camundongo (possuindo a sequência de sinal de 20 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 4. IL2 de camundongo não processada compreende adi- cionalmente um peptídeo de sinal de 20 aminoácidos de terminal N (SEQ ID NO: 3), que está ausente na molécula de IL2 madura. Por "IL2 nativa", também denominada "IL2 tipo selvagem", entende-se uma IL2 de ocorrência natural ou recombinante.
[00137] São conhecidas sequências de ácido nucleico e aminoáci- dos adicionais para I|L2. Veja, por exemplo, números de acesso do GenBank: Q7JFM2 (Aotus lemurinus (macaco noturno de barriga cin- zenta)),;, Q7JFM5 (Aotus nancymaae (macaco noturno de Ma)); PO5016 (Bas taurus (Bovino)); 029416 (Canis familiaris (Cachorro) (Canis lupus familiaris)); P36835 (Capra hircus (Cabra)); e P37997 (Equus caballus (Cavalo).
[00138] Fragmentos biologicamente ativos e variantes de IL2 tam- bém são fornecidos. Tais variantes ou fragmentos ativos de IL2 reterão a atividade de IL2. A atividade biológica de IL2 pode referir-se à capa- cidade de estimular linfócitos portadores do receptor de IL2. Tal ativi-
dade pode ser medida tanto in vitro quanto in vivo. A IL2 é um regula- dor global da atividade imunológica e os efeitos vistos aqui são a soma dessas atividades. Por exemplo, regula a atividade de sobrevivência (Bcl-2), induz a atividade efetora de T (IFN-gama, Granzima B e Perfo- rina) e promove a atividade reguladora de T (FoxP3). Veja, por exem- plo, Malek et a/. (2010) Immunity 33 (2): 153-65.
[00139] Variantes biologicamente ativas de IL2 são conhecidas. Veja, por exemplo, Publicações de Pedido Norte-americano 2006/0269515 e 2006/0160187 e WO 99/60128.
[00140] Fragmentos biologicamente ativos e variantes de IL2 po- dem ser empregados nas proteínas de fusão aqui descritas. Tal frag- mento funcional pode compreender pelo menos 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150 ou mais aminoácidos contínuos de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, uma variante funcional pode compreender pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de se- quência à sequência apresentada na SEQ ID NO: 2.
[00141] Variantes e fragmentos ativos de polinucleotídeos que codi- ficam as proteínas IL2 são ainda fornecidos. Tal polinucleotídeo pode compreender pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleotí- deos contínuos do polipeptídeo que codifica a SEQ ID NO: 2 e conti- nua a codificar uma proteína com atividade de IL2. Alternativamente, um polinucleotídeo funcional pode compreender pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência para o polipeptídeo que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e continua a codificar um polipeptídeo de IL2 funcional.
[00142] Sequências polipeptídicas exemplares de IL2 são apresen- tadas na Tabela 1, abaixo.
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[00143] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão aqui for- necidas podem compreender pelo menos uma mutação dentro do do- mínio extracelular de IL2Ra. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL2 tem pelo menos um sítio de glicosilação a menos em compara- ção com IL2 nativa (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o pelo menos um sítio de glicosilação a menos é devido a uma ou mais mu- tações que removem uma glicosilação.
[00144] Em outras modalidades, a proteína de fusão compreende uma mutação que é uma substituição de um aminoácido com um sítio de glicosilação por um aminoácido que não possui um sítio de glicosi- lação. Em algumas modalidades, a mutação remove uma O-glicosila- ção e/ou uma N-glicosilação. Em uma modalidade, a mutação remove uma O-glicosilação, por exemplo, treonina no aminoácido 3 da SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a mutação remove uma N-glicosilação.
[00145] Em algumas modalidades, a mutação é uma ou mais subs- tituições de um aminoácido de IL2 que é glicosilado por um aminoáci- do que não é glicosilado. Em algumas modalidades, a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido de IL2 que permite a glicosi- lação em um aminoácido próximo com um aminoácido que não permi- te a glicosilação no aminoácido próximo.
[00146] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de um aminoácido de IL2 são de uma alanina para um aminoácido seleci- onado a partir do grupo que consiste em arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, iso- leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[00147] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de um aminoácido de IL2 são de treonina para um aminoácido seleciona- do a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina,
isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
[00148] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de um aminoácido de IL2 são de um aminoácido reativo, por exemplo, uma cisteína, para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma serina. Em algumas modalidades, uma ou mais substitui- ções são de uma cisteína para uma alanina. Em algumas modalida- des, uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma valina.
[00149] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são no aminoácido T3 de I|L2 em comparação com o correspondente a SEQ ID NO: 2.
[00150] Em algumas modalidades, uma das substituições está no aminoácido C125 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade particular, a substituição no aminoácido C125 é selecionada a partir do grupo que consiste em C1258S, C125A e C125V.
[00151] Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção. Em modalidades particulares, a deleção é no aminoácido A1 da SEQ ID NO: 2.
[00152] A presente descrição também inclui quaisquer outras muta- ções no polipeptídeo de I1L2. Em outras modalidades, as mutações também incluem uma ou mais substituições que melhoram as proprie- dades de IL2, por exemplo, melhoram a atividade de IL2, melhoram a meia-vida de IL2, melhoram a estabilidade, etc.
[00153] Conforme descrito abaixo nesta seção, as mutações aqui citadas são mutações em relação às posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. De acordo com a presente invenção, qualquer uma das mu-
tações abaixo sozinha ou em combinação com as outras mutações descritas ou qualquer outra conhecida na técnica pode ser usada em uma ou mais das proteínas de fusão IL2 como aqui descritas.
[00154] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Carmenate et al., J Immunol, 200 (10) 3475- 3484 (2018) e/ou em US 8.759.486: por exemplo, no resíduo de ami- noácido Q22, Q126, 1129, S130, ou qualquer combinação dos mes- mos, por exemplo, Q22V, Q126A, 1129D, S130G ou qualquer combi- nação dos mesmos. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações de L18N, Q126Y e S130Ras descritas em US
8.759.486 B2. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações de Q13Y, Q126Y, 1129D e S130R conforme descrito em US 8.759.486 B2. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações de K35E, K35D e K35Q conforme descrito em WO 2018/091003 A1.
[00155] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Epstein et al. Blood, 101 (12): 4853-61] (2003) e/ou em US 7.371.371: por exemplo, no resíduo de aminoácido R38, por exemplo, R38W. Em algumas modalidades, IL2 compreende a mu- tação de R38W e uma ou mais mutações fora das posições de amino- ácidos 22 a 58 de IL2, conforme descrito em US 7.371.371 B2.
[00156] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e/ou em US 8.906.356: por exemplo, resíduo de aminoácido 91, 126, ou ambos, por exemplo, V91R, Q126T ou ambos. Em algumas modalidades, IL2 compreende a mutação de E15W conforme descrito em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e também em US 8.906.356. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou ambas as mutações de N88R e V91R, conforme descrito em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e também em US 8.906.356.
Em algumas modalidades, IL2 compreende a mutação de Q126T ouQ126| conforme descrito em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e/ou em US 8.906.356.
[00157] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US 8.906.356 B2: por exemplo, no aminoácido 69, 74, 91, 126 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a mutação é V91R, Q126T, Q126L, Q127T ou qualquer combinação dos mesmos, conforme descrito em US 8.906.356 B2.
[00158] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e/ou em US 7.569.215 B2: por exemplo, no resíduo de aminoá- cido E15, N30, E68, V69, N71, S75, N90, ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, N30S, E68D, V69A, N71A, S75P, N90H ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, IL2 compreende a mutação de E15W conforme descrito em Wittrup et al. Biochemistry, Vol. 44, No. 31 (2005). Em algumas modalidades, a mu- tação é V69A, conforme descrito em US 7.569.215 B2.
[00159] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e/ou em US 7.951.360 B2: por exemplo, no resíduo de aminoá- cido N29, Y31, K35, T37, K48, V69, N71, N88, ou qualquer combina- ção dos mesmos, por exemplo, N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, N88D ou qualquer combinação dos mesmos. Em algu- mas modalidades, IL2 compreende a mutação de E15W conforme descrito em Wittrup et al. Biochemistry, Vol. 44, No. 31 (2005).
[00160] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009) e/ou em US 8.349.311 B2: por exemplo, no aminoácido 69, 74, 128 ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, V69A, 1128P ou qualquer combinação dos mesmos.
[00161] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009): por exemplo, no resíduo de aminoácido S4, T10, Q11, V69, N88, T133 ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, S4P, T10A, Q11R, V69A, N88D, T133A, ou qualquer combinação dos mes- mos.
[00162] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009): por exemplo, no resíduo de aminoácido N30, V69, 1128, ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, N30S, V69A, 1128T ou qualquer combinação dos mesmos.
[00163] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Wittrup et al. J Immunother. 32 (9): 887-94 (2009): por exemplo, no resíduo de aminoácido K8, Q13, N26, N30, K35, T37, V69, ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, K8R, Q13R, N26D, N30T, K35R, T37R, V69A ou qualquer combinação dos mesmos.
[00164] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em Shanafelt et al., Nat Biotechnol., 18 (11): 1197- 202 (2000), por exemplo, no resíduo de aminoácido N88, por exemplo, N88R.
[00165] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US 9.616.105 B2: por exemplo, aminoácidos 20, 88, 126 ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, N88R, N88G ou N881I. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma mutação de N88R, N88G ouN88I conforme descrito em US 9.616.105 B2. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma mutação de D20H, D20Il ou D20Y conforme descrito em US 9.616.105 B2. Em al- gumas modalidades, IL2 compreende a mutação de Q126Las descrita em US 9.616.105 B2.
[00166] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US 2018/0125941 A1: por exemplo, D20H, N881, N88G, N88R, Q126L, Q126F ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações de T3A, N88G, N88R, D20H, C125S, Q126L e Q126F con- forme descrito em US 2018/0037624A1.
[00167] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US 2017/0327555 A1: por exemplo, no resíduo de aminoácido N88, D20, C125, Q126 ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, N88G, N88R, D20H, C125S, Q126L, Q126F, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00168] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em WO 2016/025385 A1: por exemplo, no resíduo de aminoácido D109, C125 ou ambos, por exemplo, D109C, C1258S ou ambos. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mu- tações descritas em WO 2016/025385 A1: por exemplo; no resíduo de aminoácido D20, N88, Q126, C125, Q126, ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, D20H, N881, N88G, N88R, Q126L, C125S, Q126F ou qualquer combinação dos mesmos.
[00169] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em WO 2016/164937 A1: por exemplo, no resíduo de aminoácido L12, Q13, E15, H16, L19, D20, M23, D84, S87, N88, V91, E95 ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, L12G, L12K, L12Q, L128S, Q13G, E15A, E15G, E15S, H16A, H16D, H16G, H16K, H16M, H16N, H16R, H16S, H16T, H16V, H16Y, L19A, L19D, L19E, L19G, L19N, L19S, L19T, L19V, D20A, D20E, D20F, D20G, D20T, D20W, M23R, D84A, D84E, D84G, D841I, D84M, D84Q, D84R, D84S, D84T, S87E, N88A, N88E, N88E N88F, N88G, N88M, N88R, N88S, N88V, N88W, V91D, V91E, V91G, V91S, E95G ou qualquer combinação dos mesmos.
[00170] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US 9.932.380B2 ou US 9.580.486: para exem- plo, no resíduo de aminoácido V91, por exemplo, V91K. Em algumas modalidades, IL2 compreende ainda uma mutação de C125A ou C1258. Em algumas modalidades, IL2 compreende ainda uma muta- ção em T3. Em algumas modalidades, a mutação em T3 é uma dentre T3A ou T3N. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma mutação em S5. Em algumas modalidades, a mutação é S5T.
[00171] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US 9.732.134 B2: por exemplo, E15, H16, Q22, D84, N88, E95 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00172] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma ou mais mutações descritas em US2015/0218260 A1: por exemplo, N88D. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma mutação descrita em US
9.266.938 B2: por exemplo, no aminoácido 42, 45, 72, ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, ou L72K. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma mutação de F42A, F42G, F42S, F42T, F420Q, F42E, F42N, F42D, F42R e F42K. Em algumas modalidades, IL2 compreende uma mutação de Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R e Y45K.
[00173] Em algumas modalidades, IL2 compreende uma a quatro mutações: a primeira mutação de L72G, L72A, L72S, L72T, L720Q, L72E, L72N, L72D, L72R ou L72K, a segunda mutação de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R ou F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R ou Y45K, a ter- ceira mutação de T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K, ou T3P e/ou a quarta mutação de C125A, C1258S, C125Tou C125V. As muta- ções listadas aqui ou descritas nas patentes, publicações de patentes ou quaisquer outras referências aqui citadas são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
7.3.2 Receptor Alfa de Interleucina-2
[00174] A proteína de fusão compreende um segundo polipeptídeo compreendendo o domínio extracelular do Receptor Alfa de Interleuci- na-2 (IL2Ra). Em algumas modalidades, o domínio extracelular de IL2Ra compreende a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à SEQ ID NO: 7.
[00175] O termo "CD25" ou "receptor a de IL2," "IL2Ra," "IL2Ra," "IL2-Ra" e "IL2-Ra", quando aqui usado, refere-se a qualquer IL2Ra nativa ou recombinante de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos) e mamíferos domesticados ou agríco- las, a menos que indicado de outra forma. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de IL2Ra, por exemplo, variantes de ligação ou variantes alélicas ou variantes de ocorrência não natural. À IL2 humana exerce seus efeitos biológicos por meio de sinalização por meio de seu sistema receptor, IL2R. IL2 e seu receptor (IL2R) são ne- cessários para a proliferação de células T e outras funções fundamen- tais que são cruciais para a resposta imune. A IL2R consiste em 3 pro- teínas transmembrana do tipo | ligadas não covalentemente que são as cadeias alfa (p55), beta (p75) e gama (p65). A cadeia alfa IL2R hu- mana contém um domínio extracelular de 219 aminoácidos, um domí- nio transmembrana de 19 aminoácidos e um domínio intracelular de 13 aminoácidos. O domínio extracelular secretado de IL2R alfa (IL2Ra)
pode ser empregado nas proteínas de fusão aqui descritas.
[00176] A sequência de aminoácidos de uma forma madura exem- plar de IL2Ra humana é mostrada na SEQ ID NO: 6. IL2Ra humana não processada é mostrada na SEQ ID NO: 5. O domínio extracelular da SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ ID NO: 6 é apresentado na SEQ ID NO: 7. A sequência de aminoácidos de uma forma madura exemplar de IL2Ra de camundongo é mostrada na SEQ ID NO: 9. A IL2Ra de ca- mundongo não processada é mostrada na SEQ ID NO: 8. O domínio extracelular da SEQ ID NO: 8 e/ou SEQ ID NO: 9 é apresentado na SEQ ID NO: 10. Por uma "IL2Ra nativa", também denominada "IL2Ra tipo selvagem", entende-se uma IL2Ra de ocorrência natural ou re- combinante.
[00177] As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos para IL2Ra são conhecidas. Veja, por exemplo, Números de Acesso Gen- Bank: NP 001030597.1 (P. troglodytes); NP 001028089.1 (M. mulat- ta) NM 001003211.1 (C. lupus) NP 7767831 (B. taurus); NP 032393.3 (M. musculus); e NP 037295.1 (R. norvegicus).
[00178] O domínio extracelular de IL2Ra, quando aqui usado, signi- fica um domínio extracelular de IL2Ra funcional em seu papel normal na ligação à IL2, a menos que especificado de outra forma. O termo um domínio de IL2Ra EC inclui um fragmento funcional, variante, aná- logo ou derivado do mesmo que retém a função de EC de IL2Ra tipo selvagem de comprimento completo na ligação de IL2. O domínio de IL2Ra EC pode ser o domínio de IL2Ra EC humana, porcino, canino, rato ou murino. A frase "atividade biológica do domínio de IL2Ra EC" refere-se a uma ou mais das atividades biológicas do domínio de IL2Ra EC, incluindo, mas não se limitando a, a capacidade de realçar a sinalização intracelular em células responsivas ao receptor de IL2. Exemplos não limitantes de fragmentos biologicamente ativos e varian- tes do domínio de IL2Ra EC são descritos, por exemplo, em Robb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 85:56 54-5658, 1988. Em algumas mo- dalidades, os fragmentos e variantes biologicamente ativos do domínio de IL2Ra EC aqui descritos compreendem pelo menos uma glicosila- ção a menos em comparação com o domínio extracelular de IL2Ra nativa.
[00179] Fragmentos biologicamente ativos e variantes do domínio extracelular de IL2Ra podem ser empregados nas proteínas de fusão aqui descritas. Tal fragmento funcional pode compreender pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 215 ou aminoácidos contínuos maiores do domínio extrace- lular de qualquer uma das SEQ ID NO: 7. Alternativamente, uma vari- ante funcional pode compreender pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade de sequência à sequência apresentada na SEQ ID NO: 7.
[00180] Variantes e fragmentos ativos de polinucleotídeos que codi- ficam o domínio extracelular de IL2Ra são ainda fornecidos. Esse poli- nucleotídeo pode compreender pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600 ou mais nucleotídeos contínuos do polipeptídeo que codifica a SEQ ID NO: 7 e continua a codificar uma proteína com a atividade do domínio extracelular de IL2Ra. Alternativamente, um polinucleotídeo funcional pode compreender pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de se- quência com o polipeptídeo que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 e continua a codificar uma proteína com a atividade do domínio extracelular de IL2Ra.
[00181] As sequências polipeptídicas de IL2Ra são citadas na Ta- bela 2.
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[00182] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão aqui for- necidas podem compreender pelo menos uma mutação dentro do do- mínio de IL2Ra EC.
[00183] Em algumas modalidades, o domínio EC do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos, pelo menos duas glicosilações a menos, pelo menos três glicosilações a menos, pelo menos quatro glicosilações a menos, pelo menos cinco glicosilações a menos, pelo menos seis glicosilações a menos, pelo menos sete glico- silações a menos, pelo menos oito glicosilações a menos ou pelo me- nos nove glicosilações a menos em comparação com o domínio extra- celular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7).
[00184] Em algumas modalidades, o domínio EC do polipeptídeo de IL2Ra tendo pelo menos uma glicosilação a menos compreende uma mutação que remove uma glicosilação. Em outras modalidades, a pro- teína de fusão compreende uma mutação que é uma substituição de um aminoácido com um sítio de glicosilação por um aminoácido que não possui um sítio de glicosilação. Em algumas modalidades, a mu- tação remove uma O-glicosilação e/ou uma N-glicosilação. Em uma modalidade, a mutação remove uma O-glicosilação. Em outra modali- dade, a mutação remove uma N-glicosilação.
[00185] Em algumas modalidades, a mutação na proteína de fusão compreende uma deleção da extremidade de terminal C de IL2Ra. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 167 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 168 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 169 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma dele- ção dos aminoácidos 170 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas moda- lidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 171 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 172 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 173 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 174 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 175 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algu- mas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 176 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 177 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 178 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma dele- ção dos aminoácidos 179 a 219 de SEQ ID NO: 7. Em algumas moda- lidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 180 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 181 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 182 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 183 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 184 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algu- mas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 185 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 186 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 187 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma dele- ção dos aminoácidos 188 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas moda- lidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 189 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 190 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 191 a 219 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção dos aminoácidos 192 a 219 da SEQ ID NO: 7.
[00186] Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção de aminoácidos de 167, 168, 169 ou 171 até 192 a 219, correspondendo a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a mutação não inclui uma deleção de 170 a 219, correspondendo a SEQ ID NO: 7.
[00187] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compre- ende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11. Em outras modalidades, o segundo polipeptídeo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO: 11 e +1, +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, + 10, +11, +12, +13, +14, +15, +16, +17, +18, +19, +20, +21, +22, +23, +24 ou +25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo polipeptí- deo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO: 11 com não mais do que 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compreende, consiste essenci- almente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo me- nos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em SEQID NO: 12.
[00188] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, uma ou mais mu- tações são uma ou mais substituições de um aminoácido de IL2Ra que é glicosilado por um aminoácido que não é glicosilado.
[00189] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos de substituição de IL2Ra estão no aminoácido N49, aminoácido N68, aminoácido T74, aminoácido T85, aminoácido T197, aminoácido T203, aminoácido T208 e aminoácido T216 ou qualquer combinação dos mesmos, em que as localizações dos aminoácidos correspondem à SEQ ID NO: 7.
[00190] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de asparagina para outro aminoácido. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições é de asparagina para um aminoácido seleciona- do a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, argini- na, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, iso- leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tiro- sina e valina.
[00191] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições são de treonina para outro aminoácido. Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições é de treonina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, iso- leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofa- no, tirosina e valina.
[00192] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido N49 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido N49 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido as- pártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leuci- na, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
[00193] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido N68 de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido N68 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido as- pártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leuci-
na, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
[00194] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T74 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T74 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspárti- co, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosi- na e valina.
[00195] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T85 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T85 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspárti- co, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosi- na e valina.
[00196] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T197 de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T197 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspárti- co, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosi- na e valina.
[00197] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T203 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T203 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspárti- co, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosi- na e valina.
[00198] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido
T208 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T208 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspárti- co, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosi- na e valina.
[00199] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T216 da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T216 da SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspárti- co, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosi- na e valina.
[00200] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, uma ou mais mu- tações são uma ou mais substituições de um aminoácido de IL2Ra que permite a glicosilação em um aminoácido próximo com um amino- ácido que não permite a glicosilação no aminoácido próximo.
[00201] Em algumas modalidades, a substituição é no aminoácido S50, aminoácido S51, aminoácido T69, aminoácido T70, aminoácido C192, ou qualquer combinação dos mesmos, em que os sítios de ami- noácidos correspondem a SEQ ID NO: 7.
[00202] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido S50 correspondente à SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido S50 correspondente a SEQ ID NO: 7 é mutado para proli- na.
[00203] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido S51 correspondente à SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido S51 correspondente à SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar-
ginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi- co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
[00204] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T69 correspondente à SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T69 correspondente a SEQ ID NO: 7 é mutado para proli- na.
[00205] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido T70 correspondente a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido T70 correspondente à SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmi- co, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[00206] Em algumas modalidades, a substituição é o aminoácido C192 correspondente à SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o aminoácido C192 correspondente à SEQ ID NO: 7 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ar- ginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, se- rina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
7.3.3 Ligante
[00207] A proteína de fusão da presente descrição pode compreen- der ainda um ligante. Em algumas modalidades, o ligante pode ligar o primeiro polipeptídeo ao segundo polipeptídeo do terminal N ao terminal C, por exemplo, N-IL2-ligante-IL2Ra EC-C. Em outras modalidades, o ligante pode ligar o segundo polipeptídeo ao primeiro polipeptídeo do terminal N ao terminal C, por exemplo, N-IL2Ra EC-ligante-lL2-C.
[00208] Em uma modalidade, a proteína de fusão IL2/IL2Ra com- preende uma sequência ligante localizada entre o polipeptídeo de IL2 e o polipeptídeo de IL2Ra. O ligante pode ser de qualquer comprimen- to e pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50 ou 60 ou mais aminoácidos. Em outras modalidades, um ligante útil para a presente descrição tem pelo menos um aminoácido e me- nos que 100 aminoácidos, menos que 90 aminoácidos, menos que 80 aminoácidos, menos que 70 aminoácidos, menos que 60 aminoácidos, menos que 50 aminoácidos, menos de 40 aminoácidos, menos de 30 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos, menos de 19 aminoácidos, menos de 18 aminoácidos, menos de 17 aminoácidos, menos de 16 aminoácidos, menos de 15 aminoácidos, menos de 14 aminoácidos, menos de 13 aminoácidos ou menos de 12 aminoácidos. Em uma mo- dalidade, a sequência de ligante compreende resíduos de aminoácidos de glicina. Em outros casos, a sequência de ligação compreende uma combinação de resíduos de aminoácidos glicina e serina.
[00209] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um ligante fundido no quadro entre o primeiro polipeptídeo e o segun- do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão com- preende um ligante é um ligante glicina/serina. Esses ligantes glici- na/serina podem compreender qualquer combinação dos resíduos de aminoácidos, incluindo, mas não se limitando, ao peptídeo GGGS (SEQ ID NO: 174) ou GGGGS (SEQ ID NO: 72) ou repetições dos mesmos, incluindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais repetições destes peptídeos dados. Os ligantes glicina/serina aqui descritos compreen- dem uma sequência de aminoácidos de (GS)n, (GGS)n, (GGGS)r, (GGGGS)r, ou (GGGGS)r, em que n é um número inteiro de 1,2,3,4,5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade particular, a sequência de ligante compreende GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 71) (também conhecida como (Gly3Ser)3s). Em outra modalidade, a sequência de ligante compre- ende GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 74) (também conhecida como (Gly;3Ser)s). Em outras modalidades, a sequência de ligante compreende um dentre (GlysSer)s (GGGSGGGSGSGSCGGSGGGS) (SEQ ID NO: 75), (Gly;Ser)s (SGGGSGSCSESCGEGSGSGGSCGGGSCGGS) (SEQ ID NO: 76), ou (GlysSer)) (GGGSGEGGSCGSGESCGGGSCGES GGGSGGGS) (SEQ ID NO: 77). Em outras modalidades, a sequência ligante compreende (Gly1Ser); (GGGGSGGGGSGGGGS) como apre- sentado em SEQ ID NO: 78. Em modalidades adicionais, a sequência ligante compreende GGGGSGGGGSCGGGGSGCGGGGS (SEQ ID NO: 79) (também conhecida como (GlysSer)a)); GGGGSGGGGSCGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 80) (também conhecida como (Gly1sSer)s); (GlyaSer)- (GGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 81), (GlysSer), (GGGGS) (SEQ ID NO: 82), (GlyaSer)s (GCGGGSCGSSGSCSG6ESEG GGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 83); (GlyaSer);, (GCGGGSCGGGCGGE SGCGGEGSCGGGESCGGGGSCGGGGSCGGGGS) (SEQ ID NO: 97); ou (GlyaSer)s (GCGGGSGGGGSGCGGGSGGGGSCGGGGS) (SEQ ID NO: 84).
7.3.4 Porção Heteróloga
[00210] A proteína de fusão da presente descrição pode compreen- der ainda um elemento adicional, por exemplo, porção heteróloga. Tais elementos podem auxiliar na expressão da proteína de fusão, auxiliar na secreção da proteína de fusão, melhorar a estabilidade da proteína de fusão, permitir uma purificação mais eficiente da proteína e/ou mo- dular a atividade da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a porção heteróloga é uma porção polipeptídica. Em outras modalida- des, a porção heteróloga é uma porção não polipeptídica.
[00211] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma porção heteróloga fundida ao primeiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma porção heteróloga fundida ao segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, a proteí- na de fusão compreende uma porção heteróloga fundida ao primeiro polipeptídeo e ao segundo polipeptídeo.
[00212] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão aqui des- critas compreendem uma ou mais porções heterólogas adicionais. Em algumas modalidades, as porções heterólogas são porções que es- tendem a meia-vida. Em algumas modalidades, a porção heteróloga compreende albumina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção desta, um polipeptídeo de ligação à imunoglobulina, uma imunoglobulina G (IgG), polipeptídeo de ligação à albumina (ABP), uma porção de PASilação, uma porção de HESilação, XTEN, uma porção de PEGuUilação, uma região Fc e qualquer combinação das mesmas. 1) Região Constante de Imunoglobulina ou Porção da mesma
[00213] Uma região constante de imunoglobulina é composta por domínios denotados como domínios CH (constante pesado) (CH1, CH2, etc.). Dependendo do isótipo (isto é, IgG, IgM, IgA I1gD ou IgE), a região constante pode ser composta por três ou quatro domínios CH. Algumas regiões constantes de isótipos (por exemplo, IgG) também contêm uma região de articulação. Veja, Janeway et al. 2001, Immun- obiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
[00214] “Uma região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma para produzir a proteína de fusão da presente descrição pode ser obtida a partir de uma série de fontes diferentes. Em modalidades preferidas, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção dela é derivada de uma imunoglobulina humana. Entende-se, no en- tanto, que a região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma pode ser derivada de uma imunoglobulina de outra espécie de mamífero, incluindo, por exemplo, um roedor (por exemplo, um ca- mundongo, rato, coelho, porquinho da índia) ou primata não humano (por exemplo, espécies de chimpanzés, macacos). Além disso, a regi- ão constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma pode ser derivada de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isótipo de imunoglobulina, incluindo I9G1, I9G2, I19G3 e IgG4. Em uma modalidade, o isótipo IIG1 humano é usado.
[00215] Uma variedade de sequências de genes da região constan- te de imunoglobulina (por exemplo, sequências de genes da região constante humana) está disponível na forma de depósitos acessíveis ao público. A sequência de domínios de região constante pode ser se- lecionada tendo uma função efetora particular (ou sem uma função efetora particular) ou com uma modificação particular para reduzir a imunogenicidade. Muitas sequências de anticorpos e genes que codifi- cam anticorpos foram publicadas e as sequências de região constante de lg adequadas (por exemplo, sequências de articulação, CH2 e/ou CH3, ou porções das mesmas) podem ser derivadas dessas sequên- cias usando técnicas reconhecidas na técnica. O material genético ob- tido usando qualquer um dos métodos anteriores pode então ser alte- rado ou sintetizado para obter polipeptídeos da presente descrição. Será ainda apreciado que o escopo desta descrição abrange alelos, variantes e mutações de sequências de DNA de região constante.
[00216] As sequências da região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma podem ser clonadas, por exemplo, usando a reação em cadeia da polimerase e iniciadores que são selecionados para amplificar o domínio de interesse. Para clonar uma sequência da região constante da imunoglobulina ou uma porção desta de um anticor- po, o MRNA pode ser isolado de hibridoma, baço ou células linfáticas, transcrito reversamente em DNA e genes de anticorpos amplificados por PCR. Os métodos de amplificação por PCR são descritos em detalhes na Patente Norte-americana 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159;
4.965.188; e em, por exemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” Innis et a/. eds., Academic Press, San Diego, CA
(1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et a/. 1993. Methods Enzymol. 217: 270). A PCR pode ser iniciada por iniciadores de região constante de consenso ou por iniciadores mais específicos com base nas sequências de DNA e de aminoácidos de cadeia pesada e leve publicadas. Conforme discutido acima, a PCR também pode ser usada para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser rastreadas por inicia- dores de consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas de região constante de camundongo. Numerosos conjuntos de inicia- dores adequados para a amplificação de genes de anticorpos são co- nhecidos na técnica (por exemplo, iniciadores 5' baseados na sequên- cia de terminal N de anticorpos purificados (Benhar e Pastan. 1994. Protein Engineering 7: 1509); amplificação rápida de extremidades de cCDNA (Ruberti, F. et al. 1994. J. Imnmunol. Methods 173: 33); sequên- cias líderes de anticorpos (Larrick et a/. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1250). A clonagem de sequências de anticorpos é ain- da descrita em Newman et al., Pat. No. 5.658.570, depositado em 25 de janeiro de 1995.
[00217] Uma região constante de imunoglobulina usada aqui pode incluir todos os domínios e a região de articulação ou porções desta. Em uma modalidade, a região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma compreende o domínio CH2, o domínio CH3 e uma região de articulação, isto é, uma região Fc ou um parceiro de ligação FecRn.
[00218] “Quando aqui usado, o termo "região Fc" é definido como a porção de um polipeptídeo que corresponde à região Fc da imunoglo- bulina nativa, isto é, como formada pela associação dimérica dos res- pectivos domínios Fc de suas duas cadeias pesadas. Uma região Fc nativa forma um homodímero com outra região Fc.
[00219] Em uma modalidade, a "região Fc" refere-se à porção de uma única cadeia pesada de imunoglobulina começando na região de articulação logo a montante do sítio de clivagem da papaína (isto é, resíduo 216 em IgG, considerando o primeiro resíduo da região cons- tante da cadeia pesada ser 114) e terminando no terminal C do anti- corpo. Consequentemente, um domínio Fc completo compreende pelo menos um domínio de articulação, um domínio CH2 e um domínio CcH3.
[00220] A região Fc de uma região constante de imunoglobulina, dependendo do isótipo de imunoglobulina, pode incluir os domínios CH2, CH3 e CH4, bem como a região de articulação. As proteínas de fusão compreendendo uma região Fc de uma imunoglobulina confe- rem várias propriedades desejáveis em uma proteína de fusão, inclu- indo estabilidade aumentada, meia-vida sérica aumentada (veja, Ca- pon et al., 1989, Nature 337: 525), bem como ligação a receptores de Fc, como o receptor Fc neonatal (FcRn) (Patentes Norte-americanas Nos. 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; WO 03/077834; US2003- 0235536A1).
[00221] Em algumas modalidades, a "região Fc" inclui uma sequên- cia de aminoácidos de um domínio Fc ou derivada de um domínio Fc. Em certas modalidades, uma região Fc compreende pelo menos um de: um domínio de articulação (por exemplo, região de articulação su- perior, média e/ou inferior) (sobre os aminoácidos 216-230 de uma re- gião Fc de anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH2 (cerca de aminoácidos 231-340 de uma região Fc de anticorpo de acordo com a numeração EU), um domínio CH3 (cerca de aminoáci- dos 341-438 de uma região Fc de anticorpo de acordo com a numera- ção EU), um domínio CH4 ou uma variante, porção ou fragmento do mesmo. Em outras modalidades, uma região Fc compreende um do- mínio Fc completo (ou seja, um domínio de articulação, um domínio CH2 e um domínio CH3). Em algumas modalidades, uma região Fc compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um domínio de articulação (ou uma parte dele) fundido a um domínio CH3 (ou uma parte dele), um domínio de articulação (ou uma parte dele) fundido a um domínio CH2 (ou uma parte dele), um domínio CH2 (ou uma parte dele) fundido a um domínio CH3 (ou uma parte dele), um domínio CH2 (ou uma parte dele) fundido a um domínio de articulação (ou uma par- te dele) e um domínio CH3 (ou uma porção dele). Em ainda outras modalidades, uma região Fc carece de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em uma modalidade particular, uma região Fc compreende ou consiste em aminoácidos correspondentes aos números EU 221 a 447.
[00222] Os domínios Fc denotados como F, F1 ou F2 neste docu- mento podem ser obtidos a partir de várias fontes diferentes. Em uma modalidade, uma região Fc do polipeptídeo é derivada de uma imuno- globulina humana. Entende-se, no entanto, que uma região Fc pode ser derivada de uma imunoglobulina de outra espécie de mamífero, incluindo, por exemplo, uma espécie de roedor (por exemplo, um ca- mundongo, rato, coelho, porquinho da índia) ou primata não humano (por exemplo, chimpanzé, macaco). Além disso, o polipeptídeo dos domínios Fc ou porções dos mesmos pode ser derivado de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qual- quer isótipo de imunoglobulina, incluindo I9G1, I9gG2, I9gG3 e IgG4. Em outra modalidade, o isótipo I9G1 humano é usado.
[00223] Em certas modalidades, a variante Fc confere uma mudan- ça em pelo menos uma função efetora transmitida por uma região Fc que compreende o referido domínio Fc tipo selvagem (por exemplo, uma melhoria ou redução na capacidade da região Fc de se ligar a re- ceptores de Fc (por exemplo, FeyRI, FeyRII ou FeyRiIll) ou proteínas do complemento (por exemplo, C1q), ou para desencadear a citotoxi- cidade dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose ou citotoxicidade dependente do complemento (CDCC)). Em outras modalidades, a va- riante Fc fornece um resíduo de cisteína modificado.
[00224] As regiões Fc da descrição podem empregar variantes Fc reconhecidas na técnica que são conhecidas por transmitir uma mu- dança (por exemplo, um realce ou redução) na função efetora e/ou li- gação de FcR. Especificamente, uma molécula de ligação da descri- ção pode incluir, por exemplo, uma mudança (por exemplo, uma subs- tituição) em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas nas Publicações PCT Internacionais WO88/07089A1, WOS96/14339A1, WOS98/05787A1, WO98/23289A1, WOS99/51642A1, WOS99/58572A1, WOO00/09560A2, WOO00/32767A1, WOO00/42072A2, WO02/44215A2, WOO02/060919A2, — WO03/074569A2, “WO04/016750A2, WOO4/ 029207A2, WOO4/035752A2, WOO4/063351A2, WO0O4/074455A2, WOO04/099249A2, WOO05/040217A2, WOO04/044859, WOO05/070963A1, WOO5/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A42, WOO6/ 019447A1, WOO06/047350A2 e WOO06/085967A2; Publicação de Pa- tente Norte-americana Nos. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/ 0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; ou Patentes — Norte-americanas — 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250;
5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375;
6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784;
7.404.956. e 7.317.091. Em uma modalidade, a mudança específica (por exemplo, a substituição específica de um ou mais aminoácidos descritos na técnica) pode ser feita em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas. Em outra modalidade, uma mudança diferente em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas (por exemplo, a substituição diferente de uma ou mais posições de aminoácidos des- critas na técnica) pode ser feita.
[00225] A região Fc de IgG pode ser modificada de acordo com procedimentos bem reconhecidos, tais como mutagênese direcionada ao sítio e similares para produzir IgG modificada ou fragmentos Fc ou porções dos mesmos que serão ligados por receptores de Fc.
Tais modificações incluem modificações remotas dos sítios de contato do receptor Fc, bem como modificações dentro dos sítios de contato que preservam ou mesmo aumentam a ligação aos receptores de Fc.
Por exemplo, os seguintes resíduos de aminoácidos únicos em Fc de Ig9G1 humana (Fcy1) podem ser substituídos sem perda significativa de afi- nidade de ligação de Fc para receptores de Fc: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A3300Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, ES56A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A e K447A, onde por exemplo, P238A representa prolina tipo selvagem substituída por alanina na posição número 238. Como um exemplo, uma modalidade específica incorpora a mutação N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado.
Além da alanina, outros aminoácidos podem ser substituídos pelos aminoáci- dos tipo selvagem nas posições especificadas acima.
As mutações podem ser introduzidas em Fc dando origem a mais de cem regiões Fc distintas do Fc nativo.
Além disso, combinações de duas, três ou mais dessas mutações individuais podem ser introduzidas juntas, dando origem a mais centenas de regiões Fc. Além disso, uma da região Fc de um construto da descrição pode ser mutada e a outra região Fc do construto não mutado, ou ambos podem estar mutados, mas com mu- tações diferentes.
[00226] Algumas das mutações acima podem conferir uma nova funcionalidade à região Fc. Por exemplo, uma modalidade incorpora N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado. O efeito desta mutação é reduzir a imunogenicidade, aumentando as- sim a meia-vida de circulação da região Fc e tornar a região Fc inca- paz de se ligar a FoyRI, FoyRIIA, FoyRIIB e FeyRIIIA, sem comprome- ter afinidade (Routledge et a/. 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Como mais um exemplo de nova funcionalidade decorren- te de mutações descritas acima, a afinidade para os receptores de Fc pode ser aumentada além do tipo selvagem em alguns casos. Essa afinidade aumentada pode refletir uma taxa "ligada" aumentada, uma taxa "desligada" diminuída ou tanto uma taxa "ligada" aumentada quanto uma taxa "desligado" diminuída. Exemplos de mutações que se acredita conferir uma afinidade aumentada para os receptores de Fc incluem, mas não se limitam a, T256A, T307A, ES80A e N434A (Shi- elds et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591).
[00227] — Além disso, pelo menos três receptores de Fc gama huma- nos parecem reconhecer um sítio de ligação em IgG dentro da região de articulação inferior, geralmente aminoácidos 234-237. Portanto, ou- tro exemplo de nova funcionalidade e potencial diminuição da imuno- genicidade pode surgir de mutações desta região, como, por exemplo, substituindo os aminoácidos 233-236 de IgG1 humana "ELLG" pela sequência correspondente de IgG2 "PVA" (com uma deleção de ami- noácido) Foi demonstrado que FcyRI, FcyRIl e FeyRill, que mediam várias funções efetoras, não se ligam a IgG1 quando tais mutações foram introduzidas. Ward e Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 e Armor et a/. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613.
[00228] Em uma modalidade, a região constante de imunoglobulina ou uma porção desta, por exemplo, uma região Fc, é um polipeptídeo incluindo a sequência PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 98) e opcional- mente incluindo ainda uma sequência selecionada de HOSLGTQ (SEQ ID NO: 93), HONLSDGK (SEQ ID NO: 94), HQNISDGK (SEQ ID NO: 95) ou VISSHLGOQ (SEQ ID NO: 96) (Pat. US No. 5,739,277).
[00229] Em certas modalidades, a região constante de imunoglobu- lina ou uma porção da mesma é hemiglicosilada. Por exemplo, a prote- ína de fusão compreendendo duas regiões Fc ou parceiros de ligação FcRn pode conter uma primeira região Fc glicosilada (por exemplo, uma região CH2 glicosilada) e uma segunda região Fc aglicosilada (por exemplo, uma região CH2 aglicosilada). Em uma modalidade, um ligante pode ser interposto entre as regiões Fc glicosiladas e aglicosi- ladas. Em outra modalidade, a região Fc ou parceiro de ligação FcRn é totalmente glicosilada, isto é, todas as regiões Fc são glicosiladas. Em outras modalidades, a região Fc pode ser aglicosilada, isto é, ne- nhuma das porções Fc é glicosilada.
[00230] Em certas modalidades, uma proteína de fusão da descri- ção compreende uma substituição de aminoácido por uma região constante de imunoglobulina ou uma porção dela (por exemplo, varian- tes Fc), que altera as funções efetoras independentes de antígeno da região constante de lg, em particular a meia-vida circulante da proteí- na.
[00231] Essas proteínas exibem ligação aumentada ou diminuída a um receptor Fc quando comparadas com proteínas sem essas substi- tuições e, portanto, têm uma meia-vida aumentada ou diminuída no soro, respectivamente. Variantes de Fc com afinidade melhorada para um receptor de Fc são antecipados para terem meias-vidas séricas mais longas, e tais moléculas têm aplicações úteis em métodos de tra- tamento de mamíferos onde a meia-vida longa do polipeptídeo admi- nistrado é desejada, por exemplo, para tratar uma doença crônica ou distúrbio (veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos.
7.348.004, 7.404.956 e 7.862.820). Em contraste, as variantes Fc com afinidade de ligação ao receptor Fc diminuída devem ter meias-vidas mais curtas, e tais moléculas também são úteis, por exemplo, para administração a um mamífero onde um tempo de circulação reduzido pode ser vantajoso, por exemplo, para imageamento diagnóstico in vivo ou em situações onde o polipeptídeo inicial tem efeitos colaterais tóxicos quando presente na circulação por períodos prolongados. Va- riantes de Fc com afinidade de ligação ao receptor de Fc diminuída também são menos propensas a atravessar a placenta e, portanto, também são úteis no tratamento de doenças ou distúrbios em mulhe- res grávidas. Além disso, outras aplicações em que a afinidade de |i- gação ao receptor Fc reduzida pode ser desejada incluem aquelas aplicações em que a localização no cérebro, rim e/ou fígado é deseja- da. Em uma modalidade exemplar, a proteína de fusão da descrição exibe transporte reduzido através do epitélio dos glomérulos renais da vasculatura. Em outra modalidade, a proteína de fusão da descrição exibe transporte reduzido através da barreira hematoencefálica (BBB) do cérebro para o espaço vascular. Em uma modalidade, uma proteína com ligação ao receptor Fc alterada compreende pelo menos uma re- gião Fc (por exemplo, uma ou duas regiões Fc) tendo uma ou mais substituições de aminoácidos dentro da "alça de ligação ao receptor Fc" de uma região constante de lg. A alça de ligação ao receptor Fc é composta pelos resíduos de aminoácidos 280-299 (de acordo com a numeração EU) de uma região Fc tipo selvagem, de comprimento to- tal. Em outras modalidades, uma região constante de Ig ou uma por- ção da descrição com afinidade de ligação ao receptor Fc alterada compreende pelo menos uma região Fc com uma ou mais substitui- ções de aminoácidos em uma posição de aminoácido correspondente a qualquer uma das seguintes posições EU: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por exemplo, N434A ou N434K) e 438. Substituições de aminoácidos exemplares que alteraram a atividade de ligação ao receptor Fc são descritas na Publicação PCT Internacional No. WO05/047327. 2) Albumina ou fragmento, ou variante do mesmo
[00232] Em certas modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e/ou ao domínio de IL2Ra EC é albumina ou um frag- mento funcional da mesma.
[00233] A albumina sérica humana (HSA, ou HA), uma proteína de 609 aminoácidos em sua forma completa, é responsável por uma pro- porção significativa da pressão osmótica do soro e também funciona como veículo de ligantes endógenos e exógenos. O termo "albumina", quando aqui usado, inclui albumina de comprimento total ou um frag- mento funcional, variante, derivado ou análogo deste.
[00234] Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende o polipeptídeo de IL2 e o domínio de IL2Ra EC aqui descrito e albumina, fragmento ou variante do mesmo, em que o polipeptídeo de IL2 está ligado à albumina ou um fragmento ou variante do mesmo. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o polipeptídeo de IL2 e o domínio de IL2Ra EC aqui descrito e albumina, fragmento ou variante do mesmo, em que IL2Ra EC está ligado à albumina ou um fragmento ou variante deste.
[00235] Em outras modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é albumina ou um fragmen- to ou variante da mesma, que estende (ou é capaz de estender) a meia-vida do polipeptídeo de IL2 e do domínio de IL2Ra EC. Outros exemplos de albumina ou seus fragmentos ou variantes são descritos na Publ. de Pat. Nos. 2008/0194481 A1, 2008/0004206 A1, 2008/ 0161243 A1, 2008/0261877 A1 ou 2008/0153751 A1 ou Publ. de Pedi- do PCT Nos. 2008/033413 A2, 2009/058322 A1 ou 2007/021494 A2. 3) Porção de ligação à albumina
[00236] Em certas modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é uma porção de ligação à albumina, que compreende um peptídeo de ligação à albumina, um domínio de ligação à albumina bacteriana, um fragmento de anticorpo de ligação à albumina ou quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, a proteína de ligação à albumina pode ser uma proteína de ligação à albumina bacteriana, um anticorpo ou um fragmento de anti- corpo incluindo anticorpos de domínio (veja, Patente Norte-americana No. 6.696.245). Uma proteína de ligação à albumina, por exemplo, po- de ser um domínio de ligação à albumina bacteriana, tal como o da proteína G estreptocócica (Konig, T. e Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Outros exemplos de peptídeos de ligação de al- bumina que podem ser usados como parceiros de conjugação são, por exemplo, aqueles que têm uma sequência de consenso Cys-Xaa 1 - Xaa 2 -Xaa 3; -Xaa 1 -Cys, em que Xaa ; é Asp, Asn, Ser, Thr, ou Trp; Xaa 2 é Asn, Gln, H é, Ile, Leu ou Lys; Xaa ; é Ala, Asp, Phe, Trp ou Tyr; e Xaa 1 é Asp, Gly, Leu, Phe, Ser ou Thr conforme descrito no pe- dido de patente Norte-americana 2003/0069395 ou Dennis et al. (Den- nis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043). 4) Sequência PAS
[00237] Em outras modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é uma sequência PAS. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende o polipeptídeo de IL2 e o domínio de IL2Ra EC aqui descrito e uma sequência PAS, em que o polipeptídeo de IL2 e/ou o domínio de IL2Ra EC está ligado à sequência PAS.
[00238] “Uma sequência PAS, quando aqui usada, significa uma se- quência de aminoácidos compreendendo principalmente resíduos de alanina e serina ou compreendendo principalmente resíduos de alani- na, serina e prolina, a sequência de aminoácidos formando uma con- formação helicoidal aleatória sob condições fisiológicas. Consequen- temente, a sequência PAS é um bloco de construção, um polímero de aminoácidos ou um cassete de sequência compreendendo, consistin- do essencialmente em, ou consistindo em alanina, serina e prolina que pode ser usada como uma parte da porção heteróloga na proteína de fusão. No entanto, a pessoa versada está ciente de que um polímero de aminoácidos também pode formar uma conformação espiral aleató- ria quando outros resíduos além de alanina, serina e prolina são adici- onados como um constituinte menor na sequência PAS. O termo "constituinte menor", quando aqui usado, significa que aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser adicionados na se- quência PAS até um certo grau, por exemplo, até cerca de 12 %, ou seja, cerca de 12 de 100 aminoácidos de a sequência PAS, até cerca de 10 %, ou seja, cerca de 10 de 100 aminoácidos da sequência PAS, até cerca de 9 %, ou seja, cerca de 9 de 100 aminoácidos, até cerca de 8 %, ou seja, cerca de 8 de 100 aminoácidos, cerca de 6 %, ou se- ja, cerca de 6 de 100 aminoácidos, cerca de 5 %, ou seja, cerca de 5 de 100 aminoácidos, cerca de 4 %, ou seja, cerca de 4 de 100 amino- ácidos, cerca de 3 %, ou seja, cerca de 3 de 100 aminoácidos, cerca de 2 %, ou seja, cerca de 2 de 100 aminoácidos, cerca de 1 %, ou se- ja, cerca de 1 de 100 dos aminoácidos. Os aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, e Val.
[00239] Sob condições fisiológicas, o trecho da sequência PAS for- ma uma conformação espiral aleatória e, portanto, pode mediar um aumento da estabilidade in vivo e/ou in vitro para o polipeptídeo de IL2. Uma vez que o domínio da bobina aleatória não adota uma estru- tura ou função estável por si só, a atividade biológica mediada pelo polipeptídeo de IL2 e o domínio de IL2Ra EC ao qual está fundido é essencialmente preservada. Em outras modalidades, as sequências PAS que formam o domínio da bobina aleatória são biologicamente inertes, especialmente no que diz respeito à proteólise no plasma san- guíneo, imunogenicidade, ponto isoelétrico/comportamento eletrostáti- co, ligação a receptores de superfície celular ou internalização, mas ainda são biodegradáveis, o que fornece vantagens claras sobre polí- meros sintéticos, como PEG.
[00240] Exemplos não limitantes das sequências PAS que formam a conformação de bobina aleatória compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em ASPAA- PAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 85), AAPASPAPAAPSAPA- PAAPS (SEQ ID NO: 86), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 87), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 88), SSPSAPSPSS PASPSPSSPA (SEQ ID NO: 89), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 90) e ASARMAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 91) ou qualquer combinação das mesmas. Exemplos adicionais de sequên- cias PAS são conhecidos de, por exemplo, Publ. de Pat. No. 2010/0292130 A1 e Publ. de Pedido PCT No. WO 2008/155134 A1. 5) Sequência HAP
[00241] Em certas modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é um polímero homoami- noácido (HAP) rico em glicina. A sequência HAP pode compreender uma sequência repetitiva de glicina, que tem pelo menos 50 aminoáci- dos, pelo menos 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoáci- dos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 ami- noácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos ou 500 aminoácidos de comprimento. Em uma modalida- de, a sequência HAP é capaz de estender a meia-vida de uma porção fundida ou ligada à sequência HAP. Exemplos não limitantes da se- quência HAP incluem, mas não estão limitados a (Gly)n, (GlyaSer)) ou S(GlysSer)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Em uma modalidade, n é 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40. Em outra modalidade, n é 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200. 6) Transferrina ou fragmento desta
[00242] Em certas modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é transferrina ou um frag- mento da mesma. Qualquer transferrina pode ser usada para fazer as proteínas de fusão da descrição. Como exemplo, a Tf (Tf) humana tipo selvagem é uma proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 KDa (não contabilizando a glicosilação), com dois domínios princi- pais, N (cerca de 330 aminoácidos) e C (cerca de 340 aminoácidos), que parecem se originar de uma duplicação de genes. Consulte os números de acesso do GenBank NMOO01063, XMO002793, M12530, XMO39845, XM 039847 e S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/). A transfer- rina compreende dois domínios, domínio N e domínio C. O domínio N compreende dois subdomínios, domínio Ni e domínio N2, e o domínio C compreende dois subdomínios, domínio C1 e domínio C2.
[00243] Em uma modalidade, a porção de transferrina da proteína de fusão inclui uma variante de ligação de transferrina. Em um exem- plo, uma variante de ligação de transferrina pode ser uma variante de ligação de transferrina humana, por exemplo, Genbank Accession AAAG61140. Em outra modalidade, a porção de transferrina da proteína de fusão inclui um ou mais domínios da sequência de transferrina, por exemplo, domínio N, domínio C, domínio N1, domínio N2, domínio C1,
domínio C2 ou quaisquer combinações dos mesmos. 7) Polímero, por exemplo, Polietileno Glicol (PEG)
[00244] Em outras modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é um polímero solúvel co- nhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a, polietileno gli- col/copolímeros de propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano ou álcool polivinílico. A porção heteróloga, tal como polímero solúvel, po- de ser ligada a qualquer posição dentro do polipeptídeo de IL2 ou do domínio de IL2Ra EC ou do terminal Nou C.
[00245] “Também fornecidos pela descrição são derivados quimica- mente modificados da proteína de fusão da descrição que podem for- necer vantagens adicionais, tais como aumento da solubilidade, esta- bilidade e tempo de circulação do polipeptídeo, ou diminuição da imu- nogenicidade (veja, Patente Norte-americana 4.179.337). As porções químicas para modificação podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em polímeros solúveis em água incluindo, mas não se limitando a, polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano e álcool polivinílico. A proteína de fusão pode ser modificada em posições aleatórias dentro da molécula ou no terminal N ou C, ou em posições predeterminadas dentro da mo- lécula e pode incluir uma, duas, três ou mais porções químicas liga- das.
[00246] O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramiíficado. Para o polietileno glicol, em uma moda- lidade, o peso molecular está entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa para facilidade de manuseio e fabricação. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil desejado (por exemplo, a duração da liberação prolongada desejada, os efeitos, se houver, na atividade bio- lógica, a facilidade de manuseio, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietileno glicol para uma proteína ou análogo). Por exemplo, o polietileno glicol pode ter um peso molecular médio de cerca de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9.000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500,
14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500,
18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000,
40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000,
80.000, 85.000, 90.000, 95.000 ou 100.000 kDa.
[00247] Em algumas modalidades, o polietileno glicol pode ter uma estrutura ramificada. Polietilenoglicóis ramificados são descritos, por exemplo, na Pat. No. 5.643.575; Morpurgo et a/l., Appl. Biochem. Bio- technol. 56: 59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18: 2745-2750 (1999); e Caliceti et a/., Bioconjug. Chem. 10: 638-646 (1999).
[00248] O número de porções de polietileno glicol ligadas a cada proteína de fusão, o polipeptídeo de IL2 ou o domínio de IL2Ra EC da descrição (isto é, o grau de substituição) também pode variar. Por exemplo, as proteínas peguiladas da descrição podem ser ligadas, em média, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 ou mais moléculas de polietileno glicol. Da mesma forma, o grau médio de substituição dentro de intervalos como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 92-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 ou 18-20 uni- dades de polietileno glicol por molécula de proteína. Os métodos para determinar o grau de substituição são discutidos, por exemplo, em Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9: 249-304 (1992).
[00249] Em outras modalidades, o polipeptídeo de IL2 e o domínio de IL2Ra EC usados na descrição são conjugados a um ou mais polí- meros. O polímero pode ser solúvel em água e covalentemente ou não covalentemente ligado ao polipeptídeo de IL2, ao domínio de IL2Ra EC ou outras porções conjugadas ao polipeptídeo de IL2 ou ao domí-
nio de IL2PRa EC. Exemplos não limitantes do polímero podem ser óxi- do de poli(alquileno), poli(vinil pirrolidona), álcool poli(vinílico), polioxa- zolina ou poli(acriloilmorfolina). 8) Hidroxietilamido (HES)
[00250] Em certas modalidades, a porção heteróloga ligada ao poli- peptídeo de IL2 e ao domínio de IL2Ra EC é um polímero, por exem- plo, hidroxietilamido (HES) ou um derivado deste. Em uma modalida- de, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo de IL2 aqui descrito e HES, em que o polipeptídeo de IL2 e o domínio de IL2Ra EC estão ligados a HES.
[00251] O hidroxietilamido (HES) é um derivado da amilopectina que ocorre naturalmente e é degradado pela alfa-amilase no corpo. HES é um derivado substituído do polímero de carboidrato amilopectina, que está presente no amido de milho em uma concentração de até 95 % em peso. HES exibe propriedades biológicas vantajosas e é usado como um agente de reposição de volume sanguíneo e na terapia de hemodi- luição nas clínicas (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278 (1987); e Weidler et al., Arzneim.-Forschung/ Drug Res., 41, 494-498 (1991)).
[00252] A amilopectina contém porções de glicose, em que as liga- ções alfa-1,4-glicosídicas da cadeia principal estão presentes e as |i- gações alfa-1,6-glicosídicas nos sítios de ramificação são encontradas. As propriedades físico-químicas desta molécula são determinadas principalmente pelo tipo de ligações glicosídicas. Devido à ligação alfa- 1,4-glicosídica cortada, são produzidas estruturas helicoidais com cer- ca de seis monômeros de glicose por volta. As propriedades físico- químicas, bem como as propriedades bioquímicas do polímero podem ser modificadas via substituição. A introdução de um grupo hidroxietil pode ser realizada por meio de hidroxietilação alcalina. Ao adaptar as condições de reação, é possível explorar a reatividade diferente do respectivo grupo hidróxi no monômero de glicose não substituído em relação a uma hidroxietilação. Devido a este fato, a pessoa versada é capaz de influenciar o padrão de substituição de forma limitada.
[00253] OHES é caracterizado principalmente pela distribuição do peso molecular e pelo grau de substituição. O grau de substituição, denominado DS, refere-se à substituição molar, é conhecido pela pes- soa versada. Veja, Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278 (1987), como citado acima, em particular p. 273.
[00254] Em uma modalidade, o hidroxietilamido tem um peso mole- cular médio (peso médio) de 1 a 300 kD, de 2 a 200 kD, de 3 a 100 kD ou de 4 a 70 kD. hidroxietilamido pode ainda exibir um grau molar de substituição de 0,1 a 3, de preferência 0,1 a 2, mais preferido, 0,1 a 0,9, de preferência 0,1 a 0,8, e uma relação entre a substituição de C2:C6 na faixa de 2 a 20 com em relação aos grupos hidroxietila. Um exemplo não limitante de HES com um peso molecular médio de cerca de 130 kD é um HES com um grau de substituição de 0,2 a 0,8, tal como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8, de preferência de 0,4 a 0,7 co- mo 0,4, 0,5, 0,6 ou 0,7. Em uma modalidade específica, HES com um peso molecular médio de cerca de 130 kD é VOLUVENO da Frese- nius. VOLUVENO é um coloide artificial, empregado, por exemplo, pa- ra reposição de volume utilizado na indicação terapêutica para terapia e profilaxia de hipovolemia. As características do VOLUVENO são um peso molecular médio de 130.000 +/- 20.000 D, uma substituição mo- lar de 0,4 e uma relação C2:C6 de cerca de 9: 1. Em outras modalida- des, as faixas de peso molecular médio de hidroxietilamido são, por exemplo, 4 a 70 kD ou 10 a 70 kD ou 12 a 70 KkKD ou 18 a 70 kD ou 50 a 70 kD ou 4 a 50 kKD ou 10 a 50 kD ou 12 a 50 kD ou 18 a 50 kD ou 4 a 18 k;D ou 10 a 18 kD ou 12 a 18 kKD ou 4 a 12 kD ou 10 a 12 kD ou 4 a 10 kD. Em ainda outras modalidades, o peso molecular médio de hidroxietilamido empregado está na faixa de mais de 4 kD e abaixo de
70 kD, tal como cerca de 10 kD, ou na faixa de 9 a 10 kD ou de 10 a 11 kD ou de 9 a 11 kD, ou cerca de 12 kD, ou na faixa de 11 a 12 kD) ou de 12 a 13 kD ou de 1 1 a 13 kD, ou cerca de 18 kD, ou na faixa de 17 a 18 kD ou de 18 a 19 kD ou de 17 a 19 kD, ou cerca de 30 kD, ou na faixa de 29 a 30, ou de 30 a 31 kD, ou cerca de 50 kD, ou na faixa de 49 a 50 kD ou de 50 a 51 kD ou de 49 a 51 kD.
[00255] Em certas modalidades, a porção heteróloga pode ser mis- turas de hidroxietilamidos com pesos moleculares médios diferentes e/ou diferentes graus de substituição e/ou diferentes relações de subs- tituição C2:C6. Portanto, as misturas de hidroxietilamidos podem ser empregadas tendo diferentes pesos moleculares médios e diferentes graus de substituição e diferentes relações de substituição C2:C6, ou tendo diferentes pesos moleculares médios e diferentes graus de substituição e a mesma ou aproximadamente a mesma relação de substituição C2:C6, ou tendo diferentes pesos moleculares médios e o mesmo ou quase o mesmo grau de substituição e diferentes relações de substituição C2:C6, ou tendo o mesmo ou aproximadamente o mesmo peso molecular médio e diferentes graus de substituição e di- ferentes relações de substituição C2:C6, ou tendo pesos moleculares médios diferentes e o mesmo ou quase o mesmo grau de substituição e a mesma ou aproximadamente a mesma relação de substituição C2:C6, ou tendo os mesmos ou aproximadamente os mesmos pesos moleculares médios e diferentes graus de substituição e a mesma ou aproximadamente a mesma relação de substituição C2:C6, ou tendo o mesmo ou aproximadamente o mesmo peso molecular médio e o mesmo ou acima do mesmo grau de substituição e diferentes relações de substituição C2:C6, ou tendo aproximadamente o mesmo peso mo- lecular médio e aproximadamente o mesmo grau de substituição e aproximadamente a mesma relação de substituição C2:C6.
9) Ácidos Polissiálicos (PSA)
[00256] Em certas modalidades, a porção heteróloga não polipeptí- dica ligada ao polipeptídeo de IL2 e/ou ao domínio de IL2Ra EC é um polímero, por exemplo, ácidos polissiálicos (PSAs) ou um derivado dos mesmos. Os ácidos polissiálicos (PSAs) são polímeros não ramifica- dos de ocorrência natural de ácido siálico produzidos por certas cepas bacterianas e em mamíferos em certas células Roth J., et al. (1993) em Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy FA (Birkhâuser Verlag, Basel, Suíça), pp 335-348. Eles po- dem ser produzidos em vários graus de polimerização de n = cerca de 80 ou mais resíduos de ácido siálico até n = 2 por hidrólise ácida limi- tada ou por digestão com neuraminidases, ou por fracionamento das formas naturais derivadas de bactérias do polímero. A composição de diferentes ácidos polissiálicos também varia, de modo que existem formas homopoliméricas, isto é ácido polissiálico ligado a alfa-2,8 compreendendo o polissacarídeo capsular de E. coli cepa K1 e os me- ningococos do grupo B, que também é encontrado na forma embrioná- ria da molécula de adesão celular neuronal (N-CAM). As formas hete- ropoliméricas também existem - como o ácido alfa-2,8 alfa-2,9 polissiá- lico alternado de cepa K92 de E. coli e polissacarídeos do grupo C de N. meningitidis. O ácido siálico também pode ser encontrado em copo- límeros alternados com monômeros diferentes do ácido siálico, como o grupo W135 ou o grupo Y de N. meningitidis. Os ácidos polissiálicos têm funções biológicas importantes, incluindo a evasão dos sistemas imunológico e complemento por bactérias patogênicas e a regulação da adesividade glial de neurônios imaturos durante o desenvolvimento fetal (em que o polímero tem uma função antiadesiva) Cho e Troy, P.N.A.S, USA, 91 (1994) 11427-11431, embora não existam recepto- res conhecidos para ácidos polissiálicos em mamíferos. O ácido polis- siálico ligado a alfa-2,8 da cepa K1 de E. coli também é conhecido como "ácido colomínico" e é usado (em vários comprimentos) para exemplificar a presente descrição. Vários métodos de ligação ou con- jugação de ácidos polissiálicos a um polipeptídeo foram descritos (por exemplo, veja a Patente Norte-americana 5.846.951; WO-A-0187922 e US 2007/0191597 A1. 10) Sequências de XTEN
[00257] “Quando aqui usado, "sequência de XTEN" refere-se a poli- peptídeos de comprimento estendido com sequências de ocorrência não natural, substancialmente não repetitivas, que são compostas principalmente de pequenos aminoácidos hidrofílicos, com a sequên- cia tendo um baixo grau ou nenhuma estrutura secundária ou terciária em condições fisiológicas. Como um parceiro de proteína de fusão, os XTENs podem servir como um veículo, conferindo certas propriedades farmacocinéticas, físico-químicas e farmacêuticas desejáveis quando ligadas ao polipeptídeo de IL2 e/ou ao domínio de IL2Ra EC da des- crição para criar uma proteína de fusão. Essas propriedades desejá- veis incluem, mas são não se limita a parâmetros farmacocinéticos e características de solubilidade realçadas.
[00258] Em algumas modalidades, a sequência de XTEN da descri- ção é um peptídeo ou polipeptídeo com mais do que cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ou 2000 resíduos de aminoácidos. Em certas modalidades, XTEN é um peptídeo ou um polipeptídeo tendo maior do que cerca de a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, maior do que 30 a cerca de 2500 resíduos, maior do que 40 a cerca de 2000 resíduos, maior do que 50 a cerca de 1500 resíduos, maior do que 60 a cerca de 1000 resíduos, maior do que 70 a cerca de 900 resíduos, maior que 80 a cerca de 800 resíduos, maior que 90 a cerca de 700 resíduos, maior que 100 a cerca de 600 resíduos, maior que 110 a cerca de 500 resí-
duos ou maior que 120 a cerca de 400 resíduos.
[00259] A sequência de XTEN da descrição pode compreender um ou mais motivos de sequência de 9 a 14 resíduos de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos de pelo menos 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico ao motivo da sequência, em que o motivo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glu- tamato (E) e prolina (P). Veja, US 2010-0239554 A1.
[00260] Em algumas modalidades, uma sequência de XTEN com- preende várias unidades de motivos de sequência não sobrepostos da família de motivos AD, ou da família de motivos AE, ou da família de motivos AF, ou da família de motivos AG, ou da família de motivos AM, ou da família de motivos AQ, ou da família BC, ou da família BD, com o XTEN resultante exibindo a faixa de homologia. Em outras modali- dades, o XTEN compreende várias unidades de sequências de moti- vos de duas ou mais famílias de motivos. Essas sequências podem ser selecionadas para atingir as características físicas/químicas dese- jadas, incluindo propriedades como carga líquida, hidrofilicidade, falta de estrutura secundária ou falta de repetitividade que são conferidas pela composição de aminoácidos dos motivos, descritos mais detalha- damente abaixo. Em outras modalidades, os motivos incorporados no XTEN podem ser selecionados e montados usando os métodos aqui descritos para atingir um XTEN de cerca de 36 a cerca de 3000 resí- duos de aminoácidos.
[00261] Em outras modalidades, a sequência de XTEN usada na descrição afeta a propriedade física ou química, por exemplo, farma- cocinética, da proteína de fusão da presente descrição. A sequência de XTEN usada na presente descrição pode exibir uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solu-
bilidade aquosa aumentada, alto grau de resistência à protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação à receptores de mamíferos ou raios hidrodinâmicos (ou de Stokes) aumentados. Em uma modalidade es- pecífica, a sequência de XTEN ligada ao polipeptídeo de IL2 e/ou ao domínio de IL2Ra EC nesta descrição aumenta as propriedades far- macocinéticas, como meia-vida terminal mais longa ou área sob a cur- va aumentada (AUC), de modo que a proteína de fusão aqui descrita permanece in vivo por um período de tempo aumentado em compara- ção com o polipeptídeo de IL2 tipo selvagem. Em outras modalidades, a sequência de XTEN usada nesta descrição aumenta as proprieda- des farmacocinéticas, como meia-vida terminal mais longa ou área aumentada sob a curva (AUC), de modo que o polipeptídeo de IL2 permanece in vivo por um período de tempo maior em comparação com IL2 tipo selvagem.
[00262] “Uma variedade de métodos e ensaios podem ser emprega- dos para determinar as propriedades físicas/químicas de proteínas que compreendem a sequência de XTEN. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, centrifugação analítica, EPR, HPLC de permuta de íons, HPLC de exclusão por tamanho, HPLC de fase reversa, dis- persão de luz, eletroforese capilar, dicroísmo circular, calorimetria de varredura diferencial, fluorescência, HPLC de permuta de íons, HPLC de exclusão por tamanho, IR, NMR, espectroscopia Raman, refratome- tria e espectroscopia UV/Visível. Métodos adicionais são descritos em Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).
[00263] Exemplos adicionais de sequências XTEN que podem ser usadas de acordo com a presente descrição e são descritos na Publica- ção de Patente Norte-americana Nos. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 ou 2011/ 0172146 A1, ou Publicação de Patente Internacional Nos. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO
2011028228 A1, WO 2011028229 A1 ou WO 2011028344 A2. 11) Peptídeo de Ligação à Imunoglobulina (ou polipeptídeo)
[00264] Em certas modalidades, a porção não heteróloga ligada ao polipeptídeo de IL2 e/ou ao domínio de IL2PRa EC é um peptídeo de ligação à imunoglobulina. Os peptídeos de ligação de imunoglobulina podem se ligar a uma região Fc e podem melhorar a meia-vida da pro- teína de fusão aqui descrita.
[00265] Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação à imuno- globulina útil para a descrição é um peptídeo ou polipeptídeo com mais do que cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 resíduos de aminoácidos.
[00266] Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação à imuno- globulina útil para a descrição compreende um peptídeo de ligação ao domínio IgG-Fc de 13-mer (I9gGBP). DeLano WL, et a/. (2000) Science 287//1279-1283. Em outras modalidades, o peptídeo de ligação à imunoglobulina útil para a descrição compreende os peptídeos descri- tos na Publicação de Patente Norte-americana 20170334954, Publica- ção de Patente Norte-americana No. 20170210777 ou Publicação PCT No. WO/2017/069158.
7.3.5 Proteína de Fusão
[00267] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão compre- endem qualquer uma das SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204 conforme recitado na Tabela 3.
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Ê á 516 Petição 870200116327, de 14/09/2020, pág. 383/º etic:
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[00268] 1IL2 é madura (IL2 (21-153) a menos que indicado de outra forma. O ligante entre IL2 e CD25 é (G3S)3 a menos que indicado de outra forma.
[00269] Em algumas modalidades, a proteína de fusão da presente descrição compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204.
[00270] A proteína de fusão IL2-IL2Ra da presente descrição pode ter uma ou mais das seguintes propriedades/atividades: (1) aumento da atividade de células T reguladoras (Tregs) e/ou aumento da tole- rância imune em terapias baseadas em IL2 de baixa dosagem; (2) aumentar a resposta imune e a memória em terapias com doses mais altas; (3) aumentar a disponibilidade de IL2 quando comparado com IL2 recombinante; e/ou (4) aumento da estimulação persistente de IL2 de linfócitos portadores de IL2R in vivo.
[00271] Em uma modalidade, as proteínas de fusão aqui descritas compreendem uma ou mais propriedades farmacocinéticas seleciona- das do grupo que consiste em uma meia-vida aumentada, Cmax au- mentada, AUC aumentada, Cmin aumentada, depuração diminuída, bi- odisponibilidade melhorada e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com a propriedade farmacocinética do polipeptídeo que consiste em IL2 (SEQ ID NO: 2) ou SEQ ID NO: 204 (sequência IL2- CD25 em peso com o ligante 12mer sem truncamento).
[00272] Em uma modalidade, as proteínas de fusão aqui descritas têm uma meia-vida estendida em comparação com IL2 (SEQ ID NO: 2) ou SEQ ID NO: 204 (sequência IL2-CD25 em peso com o ligante 12mer sem truncamento). Em algumas modalidades, a meia-vida es-
tendida é pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 ve- zes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 11 ve- zes, pelo menos cerca de 12 vezes, pelo menos cerca de 13 vezes, pelo menos cerca de 14 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 16 vezes, pelo menos cerca de 17 vezes, pelo menos cerca de 18 vezes, pelo menos cerca de 19 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 21 vezes, ou pelo menos cerca de 22 vezes em comparação com a meia-vida de um polipeptídeo que consiste em IL2 (SEQ ID NO: 2) ou SEQ ID NO: 204 (sequência IL2- CD25 em peso com o ligante 12mer sem qualquer truncamento).
[00273] Em algumas modalidades, uma atividade aumentada de Tregs que resulta da proteína de fusão IL2/IL2Ra pode ser testada de uma variedade de maneiras, incluindo, por exemplo, (1) uma represen- tação aumentada e número de Tregs no compartimento de células T CD4+; (2) regulação positiva de CD25 dependente de IL2; (3) prolife- ração aumentada conforme avaliado pela expressão do marcador pro- liferativo Ki67; e (4) uma fração aumentada de subconjunto de Klrg1 + Treg terminalmente diferenciado dependente de IL2. Tais efeitos nas Tregs podem ser observados, por exemplo, no baço e/ou no pâncreas inflamado.
[00274] Em algumas modalidades, a proteína de fusão IL2/IL2Ra da presente descrição aumenta Tregs tolerogênicas e imunossupressoras e imunidade por meio do aumento das respostas T efetoras/de memó- ria e, em outras modalidades, exibe farmacocinética melhorada ao li- berar tais respostas em (1) níveis eficazes mais baixos da atividade de IL2 em comparação com IL2 nativa ou recombinante; e/ou (2) exibe mais respostas biológicas persistentes do que IL2 nativa ou recombi-
nante.
[00275] Em modalidades específicas, a proteína de fusão tem uma atividade melhorada sobre a IL2 nativa ou recombinante. Por exemplo, o efeito da proteína de fusão IL2/IL-2Ra pode aumentar as Tregs tole- rogênicas em cerca de 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 ve- zes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes 150 vezes, 200 vezes ou atividade de IL2 de nível inferior em comparação com IL2 nativa ou recombinante. Em outras modalidades, a proteína de fusão IL2/IL2Ra é mais eficaz do que a IL2 nativa ou re- combinante na indução de aumento persistente de Tregs e proprieda- des relacionadas.
[00276] Vários fragmentos de IL2 e IL2Ra e variantes de uma vari- edade de organismos podem ser usados para gerar as proteínas de fusão de domínio extracelular de IL2/IL2Ra fornecidas neste documen- to. Tais componentes são discutidos em mais detalhes em outro lugar neste documento. Exemplos de proteínas de fusão de domínio extra- celular de IL2/IL2Ra não limitante não processado ou maduro são apresentados em SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204.
[00277] O termo "sequência de sinal secretora" denota uma se- quência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo (um "peptídeo secretor") que, como um componente de um polipeptídeo maior, dire- ciona o polipeptídeo maior através de uma via secretora da célula na qual é sintetizado. O polipeptídeo maior é comumente clivado para remover o peptídeo secretor durante o trânsito pela via secretora. Quando aqui usado, uma forma "madura" de uma proteína de fusão ou polipeptídeo compreende a forma processada do polipeptídeo que te- ve o peptídeo secretor removido. Quando aqui usado, a forma "não processada" da proteína de fusão retém a sequência peptídica secre- tora.
[00278] Também são fornecidos fragmentos e variantes biologica- mente ativos da forma madura e não processada das proteínas de fu- são do domínio EC IL2/IL-Ra e o polinucleotídeo que as codifica. Tal fragmento de polipeptídeo funcional pode compreender pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou mais aminoácidos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO : 204. Alternativamente, uma variante de polipeptídeo funcional pode compreender pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % da sequência identidade com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204.
[00279] Variantes e fragmentos ativos de polinucleotídeos que codi- ficam as proteínas de fusão de domínio extracelular de IL2/IL-Ra são ainda fornecidos. Tal polinucleotídeo pode compreender pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1100, 1200, 1300, 1500, 1800,2000 nucleotídeos contínuos que codificam os polipeptídeos apresentados em SEQ ID NOs: SEQ ID NO : 13 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204 e continuar a codificar uma proteí- na de fusão de domínio extracelular de IL2/IL-Ra funcional.
[00280] É ainda reconhecido que os componentes da proteína de fusão IL2/IL2Ra podem ser encontrados em qualquer ordem. Em uma modalidade, o polipeptídeo de IL2 está no terminal N e o domínio ex- tracelular de IL2Ra está no terminal C da proteína de fusão.
[00281] Em algumas modalidades, a proteína de fusão forma um dímero. Em outras modalidades, a proteína de fusão é um monômero. Ainda assim, em algumas modalidades, o dímero compreende dois monômeros e os monômeros estão associados entre si por meio de ligações covalentes. Em algumas modalidades, o dímero compreende dois monômeros e os monômeros estão associados por meio de liga- ções não covalentes.
[00282] Em alguma modalidade da descrição, a proteína de fusão é mais estável do que o polipeptídeo que consiste em IL2 (SEQ ID NO: 2) ou SEQ ID NO: 204 (sequência IL2-CD25 em peso com o ligante 12mer sem truncamento). Em algumas modalidades, a proteína de fu- são tem uma ou mais propriedades selecionadas do grupo que consis- te em (i) estabilidade termodinâmica aumentada em comparação com uma proteína de referência; (ii) TM aumentada em comparação com uma proteína de referência; (iii) maior resistência à degradação em comparação com uma proteína de referência; (iv) maior resistência a modificações em comparação com uma proteína de referência; (v) es- tabilidade aumentada in vivo em comparação com uma proteína de referência; e (vi) qualquer combinação dos mesmos, em que a proteí- na de referência compreende (i) um primeiro polipeptídeo compreen- dendo um polipeptídeo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo poli- peptídeo compreendendo um domínio extracelular de um polipeptídeo do receptor alfa de interleucina-2 (IL2Ra); e tem pelo menos mais uma glicosilação em comparação com a proteína de fusão.
[00283] “Qualquer um dos sítios de glicosilação das proteínas de fusão aqui descritas pode ser removido por outros mecanismos. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é desglicosilada enzimati- camente ou quimicamente. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é desglicosilada por álcali, hidrazinólise, Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F), Endo-B-N-acetilglicosaminidase H (Endo H), O-glicosi- dase ou qualquer combinação dos mesmos.
[00284] Em algumas modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é obtida por tratamento da proteí- na de fusão com um álcali. Em algumas modalidades, os glicanos são removidos dos polipeptídeos glicosilados por tratamento com boro-
hidreto alcalino. Em outras modalidades, os sítios de glicosilação das proteínas de fusão aqui descritos podem ser removidos usando carbo- natos de metais alcalinos, como carbonato de sódio e carbonato de potássio. Em algumas modalidades, o álcali é usado para o tratamento de eliminação É.
[00285] Em algumas modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é alcançada por tratamento quíi- mico da proteína de fusão por meio de hidrazinólise. Em uma modali- dade, as glicosilações são liberadas a partir de uma proteína de fusão aqui descrita submetendo a proteína de fusão à hidrazinólise, e a ca- deia de açúcar liberada é submetida a marcação por fluorescência com 2-aminopiridina. Veja Hase et al. J. Biochem., 95, 197 (1984). Em algumas modalidades, a hidrazinólise é realizada usando um instru- mento fornecido pela Oxford GlycoSystems (o GlycoPrep 1000).
[00286] Em outra modalidade, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é alcançada submetendo a proteína de fusão ao ácido trifluorometanossulfônico (TFMS).
[00287] Em algumas modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é alcançada por tratamento da proteína de fusão com uma enzima. Em algumas modalidades, a en- zima é uma glicosidase. Em algumas modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é alcançada usan- do Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F). A concentração de PNGase F pode variar e deve ser determinada empiricamente. Em algumas modalidades, a glicosidase é PNGase F. PNGase F é uma enzima disponível comercialmente (por exemplo, New England Biolabs, Ipswich MA, Cat. tPO704 ou tHPO0710). Em algumas modalidades, a PNGase F é uma proteína de fusão. Por exemplo, a PNGase F pode ser PNGase F marcada com um domínio de ligação de quitina (CBD) ou uma proteína de fusão PNGase F-SNAP. Em algumas modalida-
des, a glicosidase é liofilizada. Em algumas modalidades, a glicosidase é uma PNGase F liofiizada. Em algumas modalidades, a glicosidase é substancialmente livre de reagentes derivados de animais.
[00288] Em algumas modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é obtida por tratamento da proteí- na de fusão com Endo-B-N-acetilglucosaminidase H (Endo H). Endo-H é uma glico-hidrolase secretada por Streptomyces plicatus e algumas outras espécies de Streptomyces (Tarentino et al., 1976). Ele cliva a ligação B-1,4-glicosídica do núcleo de N-acetil glicosamina dos oligos- sacarídeos e deixa uma N-acetilquitobiose ligada ao resíduo de aspa- ragina da glicoproteína (Trimble et a/., 1978; Muramatsu 1971). O gene Endo H de S. plicatus tem 939 pb (acesso GenBank AAA2Z6738.1) co- difica uma proteína de 28,9 kDa. Endo H de S. plicatus foi recentemen- te expresso em Pichiapastoris e a atividade desglicosilada de Endo H produzido por P. pastoris foi demonstrada in vitro, por meio de ambos tratamentos de cofermentação e pós-fermentação (Wang et al., 2015).
[00289] Em algumas modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão é alcançada por tratamento da proteína de fusão com O-glicosidase (New England Biolabs, Ipswich MA). O-glicosídeos, também chamados de endo-alfa-N-acetilgalacto- saminidase, catalisa a remoção de dissacarídeos ligados a O do Nú- cleo 1 e Núcleo 3 das glicoproteínas. Em algumas modalidades, ele libera os ligados à Ser e Thr não substituídas das glicoproteínas.
[00290] A remoção de um ou mais sítios de glicosilação da proteína de fusão pode ser alcançada após a proteína de fusão de IL2/IL2Ra ser produzida em uma cultura de células (por exemplo, biorreator), en- quanto a proteína de fusão de IL2/IL2Ra é produzida em uma cultura de células, após a proteína de fusão ser colhida e/ou enquanto a pro- teína de fusão está sendo purificada. Em algumas modalidades, a re- moção de um ou mais sítios de glicosilação pode ser alcançada adici-
onando um ou mais agentes de remoção durante a cultura de células enquanto a proteína de fusão é expressa. Em outras modalidades, a remoção de um ou mais sítios de glicosilação pode ser alcançada se- lecionando um tipo de célula particular como uma célula hospedeira que elimina a glicosilação ou tem glicosilação reduzida (por exemplo, espécies de E. coli ou Streptomyces). Em certas modalidades, a re- moção de um ou mais sítios de glicosilação é alcançada pela coex- pressão de um gene que codifica a proteína de fusão com um gene que codifica uma enzima que remove uma ou mais glicosilação.
[00291] A Tabela 4 abaixo descreve várias sequências de aminoá- cidos de IL-2. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão aqui descritas compreendem qualquer uma das SEQ ID NO: 101 a SEQ ID NO: 115 conforme descrito na Tabela 4.
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Tabela 7: [PToROs ementas —
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[00295] A Tabela8 abaixo descreve várias sequências de aminoá- cidos realçadoras. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão aqui descritas compreendem qualquer uma das SEQ ID NO: 187 a SEQ ID NO: 201 conforme descrito na Tabela 8.
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[00296] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão aqui des- crita compreende uma sequência de IL-2 selecionada da Tabela 4 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 101 a SEQ ID NO: 115) e uma sequência de CD25 da Tabela 6 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 128 a SEQ ID NO: 169). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão também compreende uma sequência, ou múltiplas sequências concatenadas, escolhidas da Tabela 5 (isto é, uma ou mais dentre SEQ ID NO: 116 a SEQ ID NO: 127).
[00297] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão aqui des- crita compreende uma sequência de IL-2 selecionada da Tabela 4 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 101 a SEQ ID NO: 115) acima e uma se- quência de CD25 da Tabela 6 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 128 a SEQ ID NO: 169), uma sequência ou múltiplas sequências concatena- das, escolhidas da Tabela 5 (isto é, uma ou mais dentre SEQ ID NO: 116 a SEQ ID NO: 127) e um ligante opcional compreendendo um se- quência, ou múltiplas sequências concatenadas, da Tabela 7 (isto é, uma ou mais dentre SEQ ID NO: 170 a SEQ ID NO: 186).
[00298] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão aqui des- crita compreende uma sequência de IL-2 selecionada da Tabela 4 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 101 a SEQ ID NO: 115) acima e uma se- quência de CD25 da Tabela 6 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 128 a SEQ ID NO: 169), uma sequência ou múltiplas sequências concatena- das, escolhidas da Tabela 5, e um ligante opcional compreendendo uma sequência, ou múltiplas sequências concatenadas, da Tabela 8 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 187 a SEQ ID NO: 201).
[00299] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão aqui des- crita compreende, em ordem, uma sequência realçadora da Tabela 8 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 187 a SEQ ID NO: 201), uma sequên- cia ou múltiplas sequências concatenadas, escolhidas da Tabela 7 (is- to é, uma ou mais dentre SEQ ID NO: 170 a SEQ ID NO: 186), uma sequência de IL-2 selecionada da Tabela 4 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 101 a SEQ ID NO: 115) e uma sequência CD25 da Tabela 6 (isto é, uma dentre SEQ ID NO: 128 a SEQ ID NO: 169). Em algumas mo- dalidades, a proteína de fusão compreende uma sequência, ou múlti- plas sequências concatenadas, escolhidas da Tabela 7 (isto é, uma ou mais dentre SEQ ID NO: 170 a SEQ ID NO: 186). Em algumas moda- lidades, a proteína de fusão compreende uma sequência, ou múltiplas sequências concatenadas, escolhidas da Tabela 5 (isto é, uma ou mais dentre SEQ ID NO: 116 a SEQ ID NO: 127).
7.4 Polinucleotídeos
[00300] Em certos aspectos, são fornecidos aqui polinucleotídeos, por exemplo, DNA ou RNA, compreendendo uma sequência nucleotí- dica que codifica uma proteína de fusão aqui descrita que tem ativida- de de IL2, bem como vetores que compreendem tais sequências poli- nucleotídicas, por exemplo, vetores de expressão para sua expressão eficiente em células hospedeiras, por exemplo, células de mamíferos. Em algumas modalidades, são fornecidas aqui sequências polinucleo- tídicas que codificam sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204.
[00301] “Quando aqui usado, um polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico "isolado" é aquele que é separado de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural (por exemplo, em um camundongo ou um humano) da molécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", como uma mo- lécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material ce- lular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livres de precursores químicos ou outros produ- tos químicos quando sintetizados quimicamente. Por exemplo, a lin- guagem "substancialmente livre" inclui preparações de polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico tendo menos de cerca de 15 %, 10%, 5
%, 2 %, 1 %, 0,5 % ou 0,1 % (em particular menos de cerca de 10% ) de outro material, por exemplo, material celular, meio de cultura, ou- tras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos e/ou outros produtos químicos. Em uma modalidade específica, uma(s) molécu- la(s) de ácido nucleico que codifica(m) uma proteína de fusão aqui descrita é(são) isolada(s) ou purificada(s).
[00302] Os polinucleotídeos podem ser obtidos e a sequência nu- cleotídica dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método co- nhecido na técnica. As sequências nucleotídicas que codificam proteí- nas de fusão aqui descritas, por exemplo, as proteínas de fusão des- critas na Tabela 3, e as versões modificadas dessas proteínas de fu- são podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica, isto é, códons de nucleotídeos conhecidos por codificarem aminoácidos particulares são montados de uma tal forma de gerar um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão. Um tal polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão pode ser montado a partir de oligonu- cleotídeos sintetizados quimicamente (por exemplo, conforme descrito em Kutmeier G et a/., (1994), BioTechniques 17: 242-6), que, resumi- damente, envolve a síntese de oligonucleotídeos sobrepostos conten- do porções da sequência que codifica a proteína de fusão, anelamento e ligação desses oligonucleotídeos e, em seguida, a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.
[00303] —Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica uma pro- teína de fusão aqui descrita pode ser gerado a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, um hibridoma) usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, PCR e outros métodos de clonagem molecular). Por exemplo, a amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' de uma sequência conhecida pode ser realizada usando DNA genômico obtido a partir de células de hibridoma produzindo a proteína de fusão de in-
teresse. Esses métodos de amplificação por PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos compreendendo a sequência que codifica, por exemplo, IL2, uma sequência de ligante ou IL2-Ra. Os ácidos nu- cleicos amplificados podem ser clonados em vetores para expressão em células hospedeiras e para posterior clonagem, por exemplo, para gerar proteínas de fusão.
[00304] Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão específica não estiver disponível, porém, a sequên- cia da molécula da proteína de fusão for conhecida, um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão pode ser sintetizado quimicamente ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácido nucleico, pre- ferivelmente poli A+ RNA, isolado de, qualquer tecido ou células que expressam as proteínas de interesse, como células de hibridoma sele- cionadas para expressar uma proteína de fusão aqui descrita) por am- plificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma son- da oligonucleotídica específica para a sequência do gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de CDNA que codifica as proteínas de fusão. Os ácidos nucleicos amplifi- cados gerados por PCR podem, então, ser clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na téc- nica.
[00305] O DNA que codifica as proteínas de fusão aqui descritas pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as proteínas de fusão aqui descritas). As células de hibridoma podem servir como uma fonte desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são, então, transfectados em células hospedeiras, como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster Chinês (CHO) (por exemplo, células CHO de CHO GS System" (Lonza)), ou células de mieloma que não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de proteí- nas de fusão nas células hospedeiras recombinantes.
[00306] É ainda reconhecido que o polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de IL2/IL2Ra pode compreender elementos adicio- nais que auxiliam na translação da proteína de fusão. Essas sequên- cias incluem, por exemplo, sequências de Kozak ligadas à extremida- de 5' do polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão. A sequência de consenso de Kozak é uma sequência que ocorre no mMRNA eucarió- tico que desempenha um papel no início do processo de translação e tem a (gee)gcecRccAUGG de consenso (SEQ ID NO: 92); em que (1) uma letra minúscula indica a base mais comum em uma posição onde a base pode, não obstante, variar; (2) letras maiúsculas indicam bases altamente conservadas, isto é, a sequência 'AUGG' é constante ou ra- ramente, ou nunca, muda, com exceção do código de ambiguidade de IUPAC 'R' que indica que uma purina (adenina ou guanina) é normal- mente observada nesta posição; e (3) a sequência entre parênteses ((gee)) é de significado incerto.
[00307] Em uma modalidade não limitativa, a proteína de fusão de IL2/IL2Ra compreende uma sequência de Kozak otimizada líder de IL2 como mencionado em SEQ ID NO: 92 (gccaccATGGACAGGATG- CAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAA- CAGT) ou uma variante funcional ou fragmento da mesma. Uma vari- ante ou fragmento funcional de uma sequência de Kozak reterá a ca- pacidade de aumentar a translação da proteína quando comparada ao nível de translação de uma sequência sem a líder. Tal fragmento fun- cional pode compreender pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 nucleotídeos contínuos de uma sequên-
cia de Kozak ou a sequência mencionada em SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 99 (gccaccATGG). Alternativamente, uma variante funcional pode compreender pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de Kozak ou a sequência mencionada em SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 99.
7.5 Células e Vetores
[00308] Em certos aspectos, são fornecidos aqui células (por exemplo, células hospedeiras) que expressam (por exemplo, de forma recombinante) proteínas de fusão aqui descritas e vetores de expres- são compreendendo nucleotídeos que codificam proteínas de fusão aqui descritas. São fornecidos aqui vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo polinucleotídeos compreendendo sequên- cias nucleotídicas que codificam uma proteína de fusão para expres- são recombinante em células hospedeiras.
[00309] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende os ácidos nucleicos aqui descritos.
[00310] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é selecio- nada a partir do grupo que consiste em uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de mamífero transgênica e uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Em algumas modalidades, a cé- lula procariótica é uma célula bacteriana.
[00311] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Essas células hospedeiras de mamífero incluem, porém, não estão limitadas a células CHO, VERO, BHK, HeLa, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, NSO (uma linhagem celular de mieloma de murino que não produz endogena- mente quaisquer cadeias de imunoglobulina), CRL7O030O, COS (por exemplo, COS1 ou COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, BW, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 e HsS78Bst.
[00312] Quando aqui usado, um vetor de expressão refere-se a qualquer construto de ácido nucleico que contém os elementos neces- sários para a transcrição e translação de uma sequência de codifica- ção inserida, ou no caso de um vetor viral de RNA, os elementos ne- cessários para replicação e translação, quando introduzidos em uma célula hospedeira apropriada. Os vetores de expressão podem incluir plasmídeos, fagomídeos, vírus e seus derivados.
[00313] Uma sequência de controle de expressão gênica, quando aqui usada, é qualquer sequência nucleotídica reguladora, tal como uma sequência de promotor ou combinação promotor-realçador, que facilita a transcrição e translação eficientes do ácido nucleico codifica- dor ao qual está operacionalmente ligado. A sequência de controle de expressão gênica pode, por exemplo, ser um promotor de mamífero ou viral, tal como um promotor constitutivo ou induzível. Os promotores de mamíferos constitutivos incluem, porém, não estão limitados a, promo- tores para os seguintes genes: hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT), adenosina desaminase, piruvato cinase, promotor de beta- actina e outros promotores constitutivos. Promotores virais exemplares que funcionam constitutivamente em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do citomegalovírus (CMV), vírus símio (por exemplo, SV40), papiloma vírus, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, as repeti- ções terminais longas (LTR) do vírus da leucemiade Moloney e outros retrovírus, e o promotor da timidina cinase do vírus do herpes simples. Outros promotores constitutivos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os promotores úteis como sequências de expressão gêni- ca da descrição também incluem promotores induzíveis. Os promoto-
res induzíveis são expressos na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor da metalotioneína é induzido para promover a transcrição e translação na presença de certos íons de metal. Outros promotores induzíveis são conhecidos por aqueles versados na técni- ca.
[00314] Para os fins desta descrição, vários sistemas de vetores de expressão podem ser empregados. Esses vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro. Os vetores de expressão podem incluir sequências de controle de expres- são, incluindo, porém, não se limitando a, promotores (por exemplo, promotores naturalmente associados ou heterólogos), realçadores, sequências de sinal, sinais de ligação, elementos realçadores e se- quências de terminação da transcrição. Preferivelmente, as sequên- cias de controle de expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Os vetores de expressão também podem utilizar elemen- tos de DNA que são derivados de vírus animais, como vírus do papi- loma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus da vacínia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV), citomegalovírus (CMV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação ao ribossoma internos.
[00315] “Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à higro- micina, resistência à tetraciclina ou resistência à neomicina) para per- mitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (veja, por exemplo, ltakuraet al., Patente Norte- americana No. 4.704.362). As células que integraram o DNA em seus cromossomas podem ser selecionadas pela introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfec-
tadas. O marcador pode fornecer prototrofia para um hospedeiro auxo- trófico, resistência a biocidas (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados, como cobre. O gene marcador selecionável pode estar diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por cotransformação.
[00316] Um exemplo de um vetor útil para a expressão otimizada das proteínas de fusão usadas nos métodos da presente descrição é NEOSPLA (Patente Norte-americana No. 6.159.730). Este vetor con- tém o promotor/realçador de citomegalovírus, o promotor principal da beta globina de camundongo, a origem de replicação do SV40, a se- quência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, o exon 1eoexon2 da neomicina fosfotransferase, o gene da di-hidrofolato redutase e a sequência líder. Os sistemas de vetores também são en- sinados na Patente Norte-americana Nos. 5.736.137 e 5.658.570. Este sistema fornece níveis de expressão elevados, por exemplo, > 30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetores exemplares são descritos, por exemplo, na Patente Norte-americana No. 6.413.777.
[00317] Em outras modalidades, os polipeptídeos da presente des- crição são expressos usando construtos policistrônicos. Nestes siste- mas de expressão, vários produtos gênicos de interesse, tais como vários polipeptídeos de proteína de ligação de multímero, podem ser produzidos a partir de um único construto policistrônico. Estes siste- mas usam vantajosamente um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) para fornecer níveis relativamente altos de polipeptídeos em células hospedeiras eucarióticas. As sequências de IRES compatíveis são descritas na Patente Norte-americana No. 6.193.980.
[00318] Mais geralmente, uma vez que o vetor ou sequência de DNA que codifica um polipeptídeo foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Ou seja, as células hospedeiras podem ser transformadas. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica, como discutido aci- ma. As células transformadas são cultivadas em condições apropria- das para a produção da proteína de fusão e analisadas quanto à sín- tese da proteína de fusão. Técnicas de ensaio exemplares incluem en- saio de imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) ou análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica e similares.
7.6 Composições Farmacêuticas
[00319] As várias proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas (também aqui referidas como "compostos ativos") podem ser incorpo- radas em composições farmacêuticas adequadas para administração. Essas composições tipicamente compreendem a proteína de fusão e um veículo farmaceuticamente aceitável. Quando aqui usado, a lin- guagem "veículo farmaceuticamente aceitável" destina-se a incluir to- dos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agen- tes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retarda- mento da absorção, e similares, compatíveis com a administração far- macêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceu- ticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o com- posto ativo, o uso deste nas composições é contemplado. Os compos- tos ativos suplementares também podem ser incorporados nas com- posições.
[00320] Em algumas modalidades, é descrita uma composição far- macêutica que compreende (a) uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra como aqui descrito e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00321] Em algumas modalidades, é descrita uma composição far- macêutica que compreende (a) uma composição que compreende uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra como aqui descrito e (b) um exci-
piente farmaceuticamente aceitável.
[00322] Em algumas modalidades, é descrita uma composição far- macêutica que compreende (a) um ácido nucleico como aqui descrito e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00323] Em algumas modalidades, é descrita uma composição far- macêutica que compreende (a) um vetor como aqui descrito e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00324] Em algumas modalidades, é descrita uma composição far- macêutica que compreende (a) uma célula hospedeira como aqui des- crito e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00325] Uma composição farmacêutica da descrição é formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Exem- plos de vias de administração incluem parenteral, por exemplo, intra- venosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), trans- dérmica (tópica) e transmucosal. Além disso, pode ser desejável ad- ministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição far- macêutica localmente em uma área em necessidade de tratamento. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por infusão local ou regional ou perfusão durante a cirurgia, aplicação tópica, injeção, cateter, suposi- tório ou implante (por exemplo, implantes formados de materiais poro- sos, não porosos ou gelatinosos, incluindo membranas, como mem- branas ou fibras sialásticas) e similares. Em outra modalidade, a quan- tidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica é liberada em uma vesícula, como lipossomas (veja, por exemplo, Langer, Scien- ce 249:1527-33, 1990 e Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease e Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-65, 1989).
[00326] Em ainda outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica pode ser liberada em um sistema de liberação controlada. Em um exemplo, uma bomba pode ser usada
(veja, por exemplo, Langer, Science 249:1527-33, 1990; Sefton, Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-40, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507- 16, 1980; Saudek et al., N Engl. J Med. 321:574-79, 1989). Em outro exemplo, materiais poliméricos podem ser usados (veja, por exemplo, Levy et al., Science 228:190-92, 1985; Durante et al., Ann. Neural. 25:351-56, 1989; Howard et al., J Neurosurg. 71:105-12, 1989). Outros sistemas de liberação controlada, como aqueles discutidos por Langer (Science 249:1527-33, 1990), também podem ser usados.
[00327] Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos aos recipientes destinatários nas dosagens e concentra- ções empregadas e incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil pa- rabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); po- lipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; políme- ros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dex- trinas; agentes de quelação como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, como só- dio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, como TWEENTY, PLURONICS'Y ou polietile- no glicol (PEG).
[00328] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em pre- parações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquo- sos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxi- dantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agen-
tes emulsificantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras subs- tâncias farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringers, Injeção de Dextrose Isotônica, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e Ringers Lactados. Os veículos parenterais não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de caroço de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Agentes antimicrobianos em concen- trações bacteriostáticas ou fungistáticas podem ser adicionados a pre- parações parenterais embaladas em recipientes de dose múltipla que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Os agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Os tampões incluem fosfato e citrato. Os antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais inclu- em cloridrato de procaína. Os agentes de suspensão e dispersão in- cluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e poli- vinilpirrolidona. Os agentes emulsificantes incluem Polissorbato 80 (TWEENGO 80). Um agente sequestrante ou de quelação de íons metá- licos inclui EDTA. Os veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água; e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático para ajuste de pH.
[00329] As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação pa- renteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes com- ponentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros sol- ventes sintéticos; agentes antibacterianos, como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes de quelação, como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajus- tado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de só- dio. A preparação parenteral pode estar contida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses feitos de vidro ou plástico.
[00330] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetá- vel incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de solu- ções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intraveno- sa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELS (BASF; Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada por fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista fácil serin- gabilidade. Deve ser estável nas condições de fabricação e armaze- namento e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro- organismos como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares) e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manuten- ção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, como manitol, sorbitol, cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições inje- táveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que re- tarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00331] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas in- corporando o composto ativo na quantidade necessária em um solven-
te apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumera- dos acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtra- ção. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o com- posto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetá- veis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a secagem por congelamento, o que produz um pó do ingre- diente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril.
[00332] Para administração por inalação, os compostos são libera- dos na forma de um spray de aerossol a partir de um recipiente pres- surizado ou distribuidor que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás como dióxido de carbono ou um nebulizador. A ad- ministração sistêmica também pode ser por meios transmucosais ou transdérmicos.
[00333] Para administração transmucosal ou transdérmica, pene- trantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergen- tes, sais biliares e derivados do ácido fusídico. A administração trans- mucosal pode ser realizada através do uso de sprays nasais ou supo- sitórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes como geralmente conhecidos na técnica. Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório con- vencionais, como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para administração retal.
[00334] Em uma modalidade, os compostos ativos são preparados com veículos que protegerão o composto contra a eliminação rápida do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo im- plantes e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biode- gradáveis, biocompatíveis podem ser usados, como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e áci- do polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações fica- rão evidentes àqueles versados na técnica. Os materiais também po- dem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation and Nova Phar- maceuticals, Inc. As suspensões lipossomais também podem ser usa- das como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente Norte-americana No. 4.522.811.
[00335] É especialmente vantajoso formular composições orais ou parenterais na forma de dosagem unitária para facilidade de adminis- tração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária, quando aqui usada, refere-se a unidades fisicamente discretas ade- quadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado com cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associ- ação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da descrição são ditadas por e direta- mente dependentes das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e das limitações inerentes à técnica de composição de tal composto funcional para o tratamento de indivíduos. As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor juntamente com instruções para administração.
[00336] A quantidade eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra útil para modular tais funções dependerá do indivíduo a ser tratado, da gravidade da doença e do modo de administração da proteína de fu-
são de IL2/IL2Ra. Doses exemplares incluem cerca de 104 a cerca de 107 IU de atividade de IL2 por adulto, cerca de 104 a 105 IU de ativi- dade de IL2 por adulto, cerca de 105 a cerca de 106 IU de atividade de IL2 por adulto, cerca de 106 a cerca de 107 IU de atividade de IL2 por adulto. Em outros casos, a dose terapeuticamente eficaz da proteína de fusão de IL2/IL2Ra é de cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 100 vezes, é cerca de 105 |U de atividade de IL2 + 10 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 2 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + vezes, cerca de 105 |U de atividade de IL2 + 30 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 40 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 50 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 60 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 70 vezes, cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 80 vezes, ou cerca de 105 IU de atividade de IL2 + 90 vezes. Em uma modalidade não limitante específica, uma proteína de fusão de IL2 humana é administrada nesta dosagem.
7.7 Usos e Métodos
7.7.1 Métodos de Produzir Composições Aqui Descritas
[00337] “Como discutido acima, as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra descritas aqui podem ser usadas para criar novas proteínas de fusão de IL2/IL2Ra modificando IL2, IL2Ra ou qualquer sequência de porção heteróloga aqui descrita. Assim, em outro aspecto aqui descrito, as características estruturais de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita são usadas para criar proteínas de fusão de IL2/IL2Ra estru- turalmente relacionadas que mantêm pelo menos uma propriedade funcional da proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita, tal como ligação à IL2Ra humano e IL2Ra de cinomolgo. Por exemplo, uma ou mais dentre IL2, IL2Ra ou qualquer sequência de porção heteróloga aqui descrita podem ser combinados de forma recombinante com regi- ões de estrutura conhecidas e/ou outras proteínas para criar proteína de fusão adicional, modificada de forma recombinante, aqui descrita,
como discutido acima.
[00338] Em algumas modalidades, são descritos aqui métodos de produção de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra compreendendo a cultura de uma célula hospedeira compreendendo a proteína de fusão sob condições adequadas e a recuperação da proteína de fusão. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é um uma célula eucarióti- ca ou uma célula procariótica. Em algumas modalidades, a célula hos- pedeira é uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de fungo, uma célula de planta, uma célula de mamífero transgênica ou uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, a célula hospe- deira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula CHO, uma célula HEK 293, uma célula NSO, uma célula Per C6, uma célula BHK e uma célula COS. Em uma modalidade, a célula hospe- deira é uma célula bacteriana. Em uma modalidade particular, a célula bacteriana é Escherichia coli.
[00339] Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de modificação é uma ou mais das sequências de IL2 ou IL2Ra fornecidas aqui. Para criar a proteína de fusão modificada, não é necessário realmente pre- parar (isto é, expressar como uma proteína) uma proteína de fusão tendo uma ou mais das sequências de IL2 ou IL2Ra fornecidas aqui. Em vez disso, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como material de partida para criar uma sequência9s) de "segunda geração" derivada(s) da(s) sequência(s) original(ais) e, em seguida, a(s) se- quência(s) de "segunda geração" é(são) preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.
[00340] Por conseguinte, são fornecidos aqui métodos para prepa- rar uma proteína de fusão compreendendo: (a) fornecer IL2 e IL2Ra; (b) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro de IL2 e IL2Ra para criar pelo menos uma sequência de proteína de fusão alte-
rada; e (c) expressar a sequência alterada da proteína de fusão como uma proteína.
[00341] “Também são fornecidos aqui métodos para preparar uma proteína de fusão compreendendo: (a) fornecer IL2 e IL2Ra; (b) alterar pelo menos uma glicosilação dentro de IL2 e IL2Ra para criar pelo menos um sítio de glicosilação alterado; e (c) expressar a sequência alterada da proteína de fusão como uma proteína.
[00342] O anticorpo alterado pode exibir um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou todas as propriedades funcionais mencionadas como (1) a (10) acima. As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando ensaios-padrão dis- poníveis na técnica.
[00343] Em algumas modalidades dos métodos de modificação das proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas, as mutações podem ser introduzidas randomizadamente ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação da proteína de fusão de IL2/IL2Ra e as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra modificadas resultan- tes podem ser rastreadas para atividade de ligação e/ou outras propri- edades funcionais, conforme descrito aqui. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 de Short descreve métodos para criar e rastrear mutações usando mutagê- nese de saturação, montagem de ligação sintética ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar et al. descreve métodos de uso de métodos de rastreamento computacional para otimizar propriedades físico-químicas de proteí- nas.
[00344] As composições incluem ainda polinucleotídeos isolados que codificam as várias proteínas de fusão aqui descritas acima e su- as variantes e fragmentos dos mesmos. Vetores e cassetes de ex-
pressão compreendendo os polinucleotídeos aqui descritos são ainda descritos. Os cassetes de expressão incluirão geralmente um promotor operativamente ligado a um polinucleotídeo e uma região de termina- ção transcricional e translacional.
[00345] O uso do termo "polinucleotídeo" não se destina a limitar a presente descrição a polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles versados na técnica reconhecerão que os polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Esses desoxirribonucleotídeos e ribonucleotí- deos incluem igualmente moléculas de ocorrência natural e análogos sintéticos.
[00346] Em construtos que incluem mais de um sítio de processa- mento ou clivagem, será entendido que tais sítios podem ser iguais ou diferentes.
[00347] “Um polinucleotídeo ou proteína "isolado" ou "purificado", ou porção biologicamente ativa do mesmo, é substancialmente ou essen- cialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Assim, um polinucleotídeo ou proteína isolado ou purificado é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Idealmente, um polinu- cleotídeo "isolado" está livre de sequências (idealmente sequências de codificação de proteína) que flanqueiam naturalmente o polinucleotí- deo (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinu- cleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinu- cleotídeo é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, o polinu- cleotídeo isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequência nucleotídica que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado.
[00348] “Uma proteína que é substancialmente livre de material celu- lar inclui preparações de proteína tendo menos de cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5 % ou 1 % (em peso seco) de proteína contaminante. Quando a proteína da descrição ou porção biologicamente ativa da mesma é produzida de forma recombinante, o meio de cultura de for- ma ideal representa menos do que cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5% ou 1 % (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos de interesse não proteicos.
[00349] “Técnicas de biologia molecular, microbiologia e de DNA re- combinante convencionais dentro dos versados na técnica podem ser aqui empregadas. Tais técnicas são explicadas por completo na litera- tura. Veja, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volu- mes |-Ill [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes |-Ill [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes |-1ll [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gaited. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.l. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
[00350] Um vetor que compreende os polinucleotídeos acima des- critos operacionalmente ligados a um promotor também é fornecido aqui. Uma sequência nucleotídica está "operacionalmente ligada" a uma sequência de controle de expressão (por exemplo, um promotor) quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e translação dessa sequência. O termo "operacionalmente ligado" quando se refere a uma sequência nucleotídica inclui ter um sinal de partida apropriado (por exemplo, ATG) na frente da sequência nucleotídica a ser expressa e manter a estrutura de leitura correta para permitir a expressão da sequência sob o controle da sequência de controle de expressão e produção do produto desejado codificado pela sequência. Se um gene que se deseja inserir em uma molécula de ácido nucleico recombinante não contém um sinal de partida apropria- do, esse sinal de partida pode ser inserido na frente do gene. Um "ve- tor" é um réplicon, como plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de ácido nucleico pode ser ligado de modo a realizar a repli- cação do segmento ligado. O promotor pode ser, ou é idêntico a, um promotor bacteriano, de levedura, de inseto ou de mamífero. Além dis- so, o vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, cromossomo artificial de levedura (YAC), bacteriófago ou DNA viral eucariótico. Outras nu- merosas cadeias principais de vetor conhecidas na técnica como úteis para a expressão de proteínas podem ser empregadas. Tais vetores incluem, porém, não estão limitados a: adenovírus, vírus símio 40 (SV40), citomegalovírus (CMV), vírus do tumor mamário de camun- dongo (MMTV), vírus da leucemia de murino de Moloney, sistemas de liberação de DNA, isto é, lipossomas e sistemas de liberação de plas- mídeo de expressão. Além disso, uma classe de vetores compreende elementos de DNA derivados de vírus, como papiloma vírus bovino, polioma vírus, baculovírus, retrovírus ou vírus de Semliki Forest. Esses vetores podem ser obtidos comercialmente ou montados a partir das sequências descritas por métodos bem conhecidos na técnica.
[00351] Um sistema de vetor hospedeiro para a produção de um polipeptídeo que compreende o vetor de uma célula hospedeira ade- quada é fornecido aqui. As células hospedeiras adequadas incluem, porém, não estão limitadas a, células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, células bacterianas (incluindo células gram positivas), células de levedura, células de fungos, células de insetos e células animais.
Numerosas células de mamíferos podem ser usadas como hospedei- ros, incluindo, porém, não se limitando a, células de fibroblastos de camundongo NIH 3T3, células CHO, células HeLa, células Ltk, etc. Células animais adicionais, como células RI.l, B-W e L-M, células de rim de Macaco Verde Africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9) e células hu- manas e células de planta em cultura de tecidos também podem ser usadas.
[00352] Uma ampla variedade de combinações hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada na expressão das sequências polinu- cleotídicas aqui apresentadas. Os vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de sequências de DNA cro- mossômicas, não cromossômicas e sintéticas. Os vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos como RP4; DNAS de fago, por exemplo, os numerosos derivados do fago A, por exemplo, NM989 e outro DNA de fago, por exemplo, M13 e DNA de fago de fita simples filamentoso; plasmídeos de levedura, como o plasmídeo 2!1 ou seus derivados; ve- tores úteis em células eucarióticas, como vetores úteis em células de inseto ou mamífero; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fago, como plasmídeos que foram modificados para em- pregar DNA de fago ou outras sequências de controle de expressão; e similares.
[00353] “Qualquer uma de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão (sequências que controlam a expressão de uma sequência nucleotídica operativamente ligada a ela) pode ser usada nestes vetores para expressar as sequências polinucleotídicas aqui fornecidas. Essas sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores iniciais ou tardios de SV40, CMV, vacínia,
polioma ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, o operador principal e as regiões promo- toras do fago A, as regiões de controle da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de acasalamento a de levedura e outras sequências co- nhecidas para controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações dos mesmos.
[00354] Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expressar as sequências polinucleotídicas aqui fornecidas. Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, alguém versado na técnica será capaz de se- lecionar os vetores apropriados, sequências de controle de expressão e hospedeiros sem experimentação indevida para realizar a expressão desejada sem se afastar do escopo desta descrição. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro deve ser considerado porque o ve- tor deve funcionar nele. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar esse número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, como marcadores de antibióticos, também serão considerados.
[00355] Ao selecionar uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores será normalmente considerada. Estes inclu- em, por exemplo, a força relativa do sistema, sua controlabilidade e sua compatibilidade com a sequência nucleotídica particular ou gene a ser expresso, particularmente no que diz respeito a estruturas secun- dárias potenciais. Hospedeiros unicelulares adequados serão selecio- nados levando em consideração, por exemplo, sua compatibilidade com o vetor escolhido, suas características de secreção, sua capaci- dade de dobrar proteínas corretamente e seus requisitos de fermenta-
ção, bem como a toxicidade para o hospedeiro do produto codificado pelas sequências de nucleotídeo a serem expressas e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.
[00356] Na preparação da cassete de expressão, os vários polinu- cleotídeos podem ser manipulados, de modo a fornecer as sequências polinucleotídicas na orientação adequada e, conforme apropriado, na estrutura de leitura adequada. Para este fim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os polinucleotídeos ou outras mani- pulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição con- venientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Por exemplo, ligantes como duas glicinas podem ser adi- cionados entre polipeptídeos. Os resíduos de metionina codificados pelas sequências de nucleotídeos ATG podem ser adicionados para permitir a iniciação da transcrição do gene. Para este propósito, muta- gênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, anelamento, ressubsti- tuições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvi- dos.
[00357] É ainda fornecido um método de produção de um polipeptí- deo que compreende a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão aqui descrita em uma célula hospedeira sob condições adequadas que permitem a produção do polipeptídeo e a recuperação do polipeptídeo assim produzido.
7.7.2 Usos e Métodos Terapêuticos
[00358] As proteínas de fusão e métodos aqui descritos têm inúme- ras utilidades in vitro e in vivo envolvendo, por exemplo, o realce da resposta imune, como inibição (ou antagonização) de IL2Ra (por exemplo, sinalização) ou detecção de IL2. Por exemplo, as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas podem ser administradas a célu- las em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exem- plo, in vivo, para realçar a imunidade em uma variedade de doenças.
Por conseguinte, são fornecidos aqui métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio de um indivíduo em necessidade dos mesmos, compreendendo a administração ao indivíduo de uma proteína de fu- são de IL2/IL2Ra aqui descrita de modo que a resposta imune no indi- víduo seja modificada. Em algumas modalidades, a resposta é realça- da, estimulada ou super-regulada.
[00359] Os indivíduos adequados para os presentes métodos inclu- em pacientes humanos nos quais seria desejável o realce de uma res- posta imune. Os métodos são particularmente adequados para o tra- tamento de pacientes humanos tendo um distúrbio que pode ser trata- do pelo aumento de uma resposta imune (por exemplo, uma resposta imune mediada por células T, por exemplo, uma resposta de célula T específica do antígeno). Em algumas modalidades, os métodos são particularmente adequados para o tratamento de câncer in vivo. Para atingir o realce específico de antígeno da imunidade, as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas podem ser administradas juntamen- te com um antígeno de interesse ou o antígeno já pode estar presente no indivíduo a ser tratado (por exemplo, um indivíduo portador de tu- mor ou portador de vírus). Quando as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas são administradas em conjunto com outro agente, os dois podem ser administrados separadamente ou simultaneamente.
[00360] “Também englobados estão métodos para detectar a pre- sença de I|L2 humana ou IL2Ra humana em uma amostra, ou medir a quantidade de antígeno I|L2 humano, compreendendo o contato da amostra, e uma amostra de controle com uma proteína de fusão ou anticorpo monoclonal, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especifi- camente à IL2 ou IL2Ra humana, sob condições que permitem a for- mação de um complexo entre as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas e IL2Ra humana. A formação de um complexo é, então, de-
tectada, em que uma formação de complexo de diferença entre a amostra em comparação com a amostra de controle é indicativa da presença de IL2 ou IL2Ra humana na amostra. Além disso, as proteí- nas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas podem ser usadas para puri- ficar IL2 ou IL2Ra humana por meio de purificação por imunoafinidade.
[00361] Dada a capacidade das proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas para estimular ou coestimular as respostas de células T, por exemplo, respostas de células T específicas para antígenos, como inibição dos efeitos negativos de IL2 ou IL2Ra, fornecidos aqui são métodos in vitro e in vivo de usar as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas para estimular, realçar ou super-regular as respostas de células T específicas do antígeno, por exemplo, respostas de células T antitumorais. Em algumas modalidades, a estimulação de CD3 tam- bém é fornecida (por exemplo, por coincubação com uma célula que expressa CD3 de membrana), cuja estimulação pode ser fornecida ao mesmo tempo, antes ou após a estimulação com proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas. Por exemplo, são fornecidos aqui méto- dos de estimulação de uma resposta de célula T específica do antíge- no compreendendo o contato da referida célula T com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita e, opcionalmente, com um anticorpo anti-CD3, de modo que uma resposta de célula T específica do antí- geno seja estimulada.
[00362] Qualquer indicador adequado de uma resposta de célula T específica do antígeno pode ser usado para medir a resposta de célula T específica do antígeno. Exemplos não limitantes de tais indicadores adequados incluem proliferação aumentada de células T na presença do anticorpo e/ou aumento da produção de citocina na presença do anticorpo. Em algumas modalidades, a produção de interleucina-2 e/ou interferon-y pela célula T específica do antígeno é estimulada.
[00363] As células T que podem ser aumentadas ou coestimuladas com proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas incluem células T CD4'* e células T CD8*. As células T podem ser células Tef, por exem- plo, células Tef CD4*, células Tef CD8*, células Tauxiliares (Th) (por exemplo, células Th1) ou células T citotóxicas (Tc).
[00364] Além disso, são abrangidos métodos de estimulação de uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de célula T específi- ca do antígeno) em um indivíduo, compreendendo a administração de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita ao indivíduo, de mo- do que uma resposta imune (por exemplo, uma resposta da célula T específica do antígeno) no indivíduo seja estimulada. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo portador de tumor e uma res- posta imune contra o tumor é estimulada. Um tumor pode ser um tu- mor sólido ou um tumor líquido, por exemplo, uma malignidade hema- tológica. Em algumas modalidades, um tumor é um tumor imunogêni- co. Em algumas modalidades, um tumor não é imunogênico. Em al- gumas modalidades, um tumor é positivo para PD-L1. Em algumas modalidades, um tumor é negativo para PD-L1. Um indivíduo também pode ser um indivíduo portador de vírus e uma resposta imune contra o vírus é estimulada.
[00365] São fornecidos ainda métodos para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita, de mo- do que o crescimento do tumor seja inibido no indivíduo. Também são fornecidos métodos de tratamento de uma infecção viral em um indiví- duo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita, de modo que a infecção viral seja tratada no indivíduo.
[00366] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita é dada a um indivíduo como uma terapia adju- vante. Os tratamentos de indivíduos com câncer com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita podem levar a uma sobrevida prolon- gada, por exemplo, resposta durável de longo prazo em relação ao padrão atual de tratamento; sobrevida a longo prazo de pelo menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais anos, ou sobrevida livre de recorrência de pelo menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5 ou 10 ou mais anos. Em algumas modalidades, o tratamento de um indivíduo tendo câncer com proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas evita a recorrência do câncer ou retarda a recorrência do câncer em, por exemplo, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3,4, 5, ou ou mais anos. Um tratamento com proteína de fusão de IL2/IL2Ra pode ser usado como um tratamento de primeira, segunda ou terceira linha.
[00367] O tratamento de um indivíduo tendo câncer com uma prote- ína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita pode resultar em, por exemplo, doença estável, resposta parcial, sobrevida global aumentada, sobre- vida livre de doença aumentada ou sobrevida livre de progressão real- çada.
[00368] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita não é significativamente tóxica. Por exemplo, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita não é significativa- mente tóxica para um órgão de um humano, por exemplo, um ou mais dentre o fígado, rim, cérebro, pulmões e coração, conforme determi- nado, por exemplo, em ensaios clínicos. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita não ativa significati- vamente uma resposta imune indesejável, por exemplo, autoimunida- de ou inflamação.
[00369] Em algumas modalidades, o tratamento de um indivíduo com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita não resulta em superestimulação do sistema imunológico na medida em que o siste- ma imunológico do indivíduo ataca, então, o próprio indivíduo (por exemplo, resposta autoimune) ou resulta em, por exemplo, anafilaxia. Assim, em algumas modalidades, as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas não causam anafilaxia.
[00370] Em algumas modalidades, o tratamento de um indivíduo com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita não causa rea- ções inflamatórias significativas, por exemplo, pneumonite imunomedi- ada, colite imunomediada, hepatite imunomediada, nefrite imunomedi- ada ou disfunção renal, hipofisite imunomediada, hipotireoidismo e hi- pertireoidismo imunomediados ou outras reações adversas imunome- diadas. Em algumas modalidades, o tratamento de um indivíduo com as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas não causa distúrbios cardíacos significativos, por exemplo, arritmia ventricular; distúrbios oculares, por exemplo, iridocíclite; reações relacionadas à infusão; amilase aumentada, lípase aumentada; distúrbios do sistema nervoso, por exemplo, tonturas, neuropatia periférica e sensorial; distúrbios da pele e do tecido subcutâneo, por exemplo, erupção cutânea, prurido, dermatite esfoliativa, eritema multiforme, vitiligo ou psoríase; distúrbios respiratórios, torácicos e mediastinais, por exemplo, tosse; fadiga; náusea; apetite diminuído; constipação; artralgia; ou diarreia.
[00371] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra aqui descritas fornecem efeitos antitumorais sinérgicos em combinação com outra terapia contra o câncer, como um composto que estimula o sistema imunológico (por exemplo, um agente imuno- oncológico), por exemplo, um composto aqui descrito ou um composto modulando um alvo aqui descrito.
[00372] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão de IL2/ IL2Ra aqui descritas são administradas por via tópica, mucosal epi- dérmica, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, in- tralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, trans-
traqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, suba- racnoide, intraespinal, epidural ou intraesternal.
[00373] Vários métodos são fornecidos para aumentar a resposta imune em um indivíduo. Tais métodos compreendem a administração a um indivíduo em necessidade de um aumento na resposta imune de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra. Como tal, em modalidades específicas, a aplicação transitó- ria de doses mais elevadas de I|L2 é empregada para o efetor imune reforçado e as respostas de memória.
[00374] Vários métodos são fornecidos para diminuir a resposta imune em um indivíduo. Tais métodos compreendem a administração a um indivíduo em necessidade de uma diminuição na resposta imune de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra. Há muito interesse em aproveitar o poder supressor das Tregs para inibir respostas imunes indesejadas. Dados em camundon- gos e humanos mostram que o realce da sinalização de IL2R com uma dose baixa de IL2 seletivamente reforça as Tregs e realça os meca- nismos tolerogênicos imunes. As proteínas de fusão de IL2/IL2Ra for- necidas aqui representam uma forma nova e melhorada de IL2 que reforça mais potencialmente as Tregs. Assim, as proteínas de fusão de IL2/IL2Ra podem ser administradas a pacientes com doenças autoi- munes, doença do enxerto versus hospedeiro crônica, reações de re- jeição de transplante e outras condições em que o objetivo é suprimir a autorreatividade.
[00375] Estes e outros métodos descritos aqui são discutidos em mais detalhes abaixo.
7.7.2.1 Câncer
[00376] Em algumas modalidades, são descritos aqui métodos de tratamento do câncer. A inibição de IL2Ra por uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra pode realçar a resposta imune a células cancerosas em um paciente tendo câncer. São fornecidos aqui métodos para tratar um indivíduo com câncer, compreendendo a administração ao indivíduo de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita, de modo que o indivíduo seja tratado, por exemplo, de modo que o crescimento de tumores cancerosos seja inibido ou reduzido e/ou que os tumores re- gredam e/ou que sobrevida prolongada seja alcançada. Uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra pode ser usada sozinha para inibir o crescimen- to de tumores cancerígenos. Alternativamente, uma proteína de fusão de IL2/IL2PRa pode ser usada em conjunto com outro agente, por exemplo, outro agente imunogênico, um tratamento de câncer padrão ou outro anticorpo, conforme descrito abaixo.
[00377] Por conseguinte, são fornecidos aqui métodos de tratamen- to de câncer, por exemplo, inibindo o crescimento de células tumorais, em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui. Os cânceres cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos da descrição incluem cânceres tipicamente res- ponsivos à imunoterapia e aqueles que não são tipicamente responsi- vos à imunoterapia. Os cânceres podem ser cânceres com tumores sólidos ou malignidades do sangue (tumores líquidos). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de bexiga, câncer de mama, cân- cer uterino, carcinoma endometrial, câncer ovariano, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, cân- cer de estômago, câncer de células germinativas, câncer ósseo, cân- cer de células escamosas, câncer de pele, neoplasia do sistema ner- voso central, linfoma, leucemia, sarcoma, câncer relacionado a vírus, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin ou não Ho- dgkin, câncer pancreático, glioblastoma, glioma, câncer cervical, cân- cer ovariano, câncer de fígado, mieloma, carcinoma de glândula sali-
var, câncer de rim, carcinoma basocelular, melanoma, câncer de prós- tata, câncer de vulva, câncer de tireoide, câncer testicular, câncer eso- fágico ou câncer de cabeça ou pescoço e quaisquer combinações dos mesmos.
[00378] Outros exemplos não limitantes de cânceres para o trata- mento incluem carcinoma de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas escamosas (NSCLC), NSCLC não escamoso, glioma, câncer gastrointestinal, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer ovariano, câncer de fí- gado, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim (por exem- plo, carcinoma de células renais (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), câncer de tireoide, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblas- toma multiforme), câncer cervical, câncer de estômago, câncer de be- xiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon e câncer de ca- beça e pescoço (ou carcinoma), câncer gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediátrico, exterminador natural sinonasal, me- lanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático, como melano- ma maligno cutâneo ou intraocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer uterino, câncer da região anal, câncer testicular, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasia do sistema ner- voso central (CNS), linfoma primário do CNS, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, câncer de cérebro, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo aqueles induzidos por amianto, cânceres relacio- nados a vírus ou cânceres de origem viral (por exemplo, papiloma ví- rus humano (por exemplo, tumores relacionados ou originados do HPV)) e malignidades hematológicas derivadas de qualquer uma das duas principais linhagens de células sanguíneas, isto é, a linhagem celular mieloide (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, ma- crófagos e mastócitos) ou linhagem celular linfoide (que produz células B, T, NK e plasmáticas), como todos os tipos de leucemias, linfomas e mielomas, por exemplo, leucemias agudas, crônicas, linfocíticas e/ou mielogenosas, como leucemia aguda ( ALL), leucemia mielogenosa aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mielogeno- sa crônica (CML), AML não diferenciada (MO), leucemia mieloblástica (MI), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou variante de M3 [M3V]), leucemia mielomonociti- ca (M4 ou variante de M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico isolado e cloroma; linfomas, como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Hodgkin (NHL), malignidade hematológica de células B, por exemplo, linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células B monocitoide, linfoma de tecido linfoide associado à mucosa ( MALT), linfoma de células grandes ana- plásico (por exemplo, Ki 1+), linfoma/leucemia de células T do adulto, linfoma de células de revestimento, linfoma de células T angioimuno- blástico, linfoma angiocêntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma linfoblástico T precursor, lin- foblástico T; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periférico, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoproliferativo pós-trans- plante, linfoma histiocítico verdadeiro, linfoma primário do sistema ner- voso central, linfoma de efusão primária, linfoma de células B, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoéticos de linhagem linfoide, leu- cemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma imunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de células B precursor, linfoma de células T cutâneo (CTLC) (também chamado de micose fungoide ou síndrome de Sezary) e linfoma linfoplasmacitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, como mi- eloma de IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também chamado de mieloma indolente), plasmocitoma solitá- rio e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células pilosas; tumores hematopoéticos de linhagem mieloide, tumo- res de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiosscar- coma; seminoma, teratocarcinoma, tumores do sistema nervoso cen- tral e periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteos- sarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmento- so, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e terato- carcinoma, tumores hematopoéticos de linhagem linfoide, por exem- plo, tumores de células T e células B, incluindo, porém, não se limitan- do a distúrbios de células T, como leucemia T-prolinfocítica (T-PLL), incluindo do tipo de células pequenas e células cerebriformes; leuce- mia de linfócitos granular grande (LGL) do tipo de células T; linfoma hepatoesplênico a/d T-NHL; linfoma de células T periférico/pós-tímico (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma de células T angiocên- trico (nasal); câncer de cabeça ou pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como quais- quer combinações dos referidos cânceres.
Os métodos aqui descritos também podem ser usados para o tratamento de cânceres metastáti- cos, cânceres irressecáveis, refratários (por exemplo, cânceres refratá- rios à imunoterapia anterior, por exemplo, com um anticorpo bloquea-
dor CTLA-4 ou PD-1) e/ou cânceres recorrentes.
[00379] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/ IL2Ra descrita aqui é administrada a pacientes tendo câncer que exi- biu uma resposta inadequada a, ou progrediu em, um tratamento ante- rior, por exemplo, um tratamento anterior com um fármaco para imuno- oncologia ou imunoterapia, ou pacientes tendo um câncer que é refra- tário ou resistente, intrinsecamente refratário ou resistente (por exem- plo, refratário a um antagonista da via de PD-1), ou um em que a resis- tência ou estado refratário é adquirido. Por exemplo, os indivíduos que não são responsivos ou não suficientemente responsivos a uma pri- meira terapia ou que observam a progressão da doença após o trata- mento, por exemplo, tratamento anti-PD-1, podem ser tratados pela administração de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui sozinha ou em combinação com outra terapia (por exemplo, com uma terapia anti-PD-1).
[00380] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/ IL2Ra descrita aqui é administrada a pacientes que não receberam (isto é, foram tratados com) um agente imuno-oncológico, por exem- plo, um antagonista da via de PD-1.
[00381] Um método de tratamento de um indivíduo tendo câncer com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui pode compre- ender a administração a um indivíduo que tem células cancerosas que expressam IL2 ou IL2Ra, uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui. Também são fornecidos aqui métodos para prever se um indivíduo responderá ao tratamento com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui, em que os mé- todos compreendem a determinação do nível de IL2 ou IL2Ra em um paciente e se o indivíduo é positivo para IL2 ou IL2Ra, então, é prová- vel que o indivíduo responda a um tratamento com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita.
[00382] Em algumas modalidades, um método de tratamento de câncer em um indivíduo compreende primeiro determinar se o indiví- duo é positivo para PD-L1 ou PD-1, por exemplo, tem células tumorais ou TlLs que expressam PD-L1 ou PD-1, e se o indivíduo tem câncer positivo para PD-L1 ou PD-1 ou células TIL, em seguida, administran- do ao indivíduo uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui (e opcionalmente um antagonista de PD-1 ou PD-L1). Um método de tra- tamento de um indivíduo tendo câncer com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui (e opcionalmente um antagonista de PD-1 ou PD-L1) pode compreender a administração a um indivíduo que tem células cancerosas ou células TIL que expressam PD-L1 ou PD-1, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui (e opcionalmente um antagonista de PD-1 ou PD-L1). Também são fornecidos aqui métodos para prever se um indi- víduo responderá ao tratamento com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui (e opcionalmente um antagonista de PD-1 ou PD-L1), em que os métodos compreendem a determinação do nível de PD-L1 ou PD-1 em células cancerosas ou TIL do paciente, e se as cé- lulas cancerosas ou TIL do indivíduo são positivas para PD-L1 ou PD- 1, então, o indivíduo provavelmente responderá a um tratamento com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui (e, opcionalmente, um antagonista de PD-1 ou PD-L1).
[00383] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/ IL2Ra aqui descrita é administrada com um tratamento padrão de cui- dado. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é administrada como uma terapia de manutenção, por exemplo, uma terapia que se destina a prevenir a ocorrência ou recor- rência de tumores.
[00384] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/ IL2Ra aqui descrita é administrada com outro tratamento, por exemplo,
radiação, cirurgia ou quimioterapia. Por exemplo, em algumas modali- dades, a terapia adjuvante usando uma proteína de fusão de IL2/ IL2Ra descrita aqui é administrada quando há um risco de que micro- metástases possam estar presentes e/ou a fim de reduzir o risco de uma recaída.
[00385] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/ IL2Ra descrita aqui é administrada como uma monoterapia ou como a única terapia imunoestimulante. Os anticorpos para IL2Ra também podem ser combinados com um agente imunogênico, como células cancerosas, antígenos tumorais purificados (incluindo proteínas re- combinantes, peptídeos e moléculas de carboidratos), células, e célu- las transfectadas com genes que codificam citocinas de estimulação imune (He et al., (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Exemplos não limi- tativos de vacinas tumorais que podem ser utilizadas incluem peptí- deos de antígenos de melanoma, como peptídeos de gp100, antíge- nos MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase, ou células tumorais trans- fectadas para expressar a citocina GM-CSF (discutido posteriormente abaixo).
[00386] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é combinada com um protocolo de vacinação. Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores foram planejadas (veja, Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vacci- nes, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, AS- CO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educa- tional Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; veja também Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vac- cines, Ch. 61, pp. 3023 -3043 em DeVita et al. (Eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition). Em uma dessas es- tratégias, uma vacina é preparada usando células tumorais autólogas ou alogênicas. Estas vacinas celulares demonstraram ser mais efica-
zes quando as células tumorais são transduzidas para expressar GM- CSF. GM-CSF mostrou ser um ativador potente da apresentação de antígeno para vacinação de tumor (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43).
[00387] O estudo da expressão gênica e dos padrões de expressão gênica em grande escala em vários tumores levou à definição dos chamados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10:281-7). Em muitos casos, esses antígenos específicos de tumor são antígenos de diferenciação expressos nos tumores e na cé- lula da qual o tumor surgiu, por exemplo, antígenos de melanócitos gp100, antígenos MAGE e Trp-2. Mais importante, muitos desses antí- genos podem ser os alvos de células T específicas de tumor encontra- das no hospedeiro. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é usada em conjunto com uma coleção de pro- teínas e/ou peptídeos recombinantes expressos em um tumor a fim de gerar uma resposta imune a essas proteínas. Essas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imune como autoantígenos e, portan- to, são tolerantes a eles. O antígeno tumoral pode incluir a proteína telomerase, que é necessária para a síntese de telômeros de cromos- somos e que é expressa em mais de 85 % dos cânceres humanos e apenas em um número limitado de tecidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). O antígeno tumoral também pode ser "neo- antígenos" expressos em células cancerosas por causa de mutações somáticas que alteram a sequência da proteína ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (isto é, bcr-abl no cro- mossoma Filadélfia) ou idiótipo de tumores de células B.
[00388] Outras vacinas tumorais podem incluir as proteínas de vírus implicados em cânceres humanos, como Papiloma Vírus Humano (HPV), Vírus da Hepatite (HBV e HCV) e Vírus do Sarcoma do Herpes de Kaposi (KHSV). Outra forma de antígeno específico de tumor que pode ser usada em conjunto com a proteína de fusão da presente descrição é as proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. Essas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e essas HSPs são alta- mente eficientes na liberação em células apresentadoras de antígenos para induzir imunidade tumoral (Suot & Srivastava (1995) Science 269: 1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278: 117-120).
[00389] As células dendríticas (DC) são células apresentadoras de antígenos potentes que podem ser usadas para iniciar respostas es- pecíficas do antígeno. As DCs podem ser produzidas ex vivo e carre- gadas com vários antígenos de proteínas e peptídeos, bem como com extratos de células tumorais (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). As DCs também podem ser transduzidas por meios genéti- cos para expressar esses antígenos tumorais também. As DCs tam- bém foram fundidas diretamente a células tumorais para fins de imuni- zação (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como um mé- todo de vacinação, a imunização com DC pode ser efetivamente com- binada com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui para ati- var respostas antitumorais mais potentes.
[00390] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento do câncer usando uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui são combinados com tratamentos de câncer padrão (por exemplo, cirurgia, radiação e quimioterapia). Um exemplo de tal combinação é um anti- corpo anti-TIM3 em combinação com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui para o tratamento de melanoma. O fundamen- to científico por trás do uso combinado de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita e a quimioterapia é que a morte celular, que é uma consequência da ação citotóxica da maioria dos compostos qui- mioterápicos, deve resultar em níveis aumentados de antígeno tumoral na via de apresentação do antígeno. Outras terapias de combinação que podem resultar em sinergia com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui através da morte celular são radiação, cirurgia e privação de hormônio. Cada um desses protocolos cria uma fonte de antígeno tumoral no hospedeiro. Inibidores da angiogênese também podem ser combinados com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita. A inibição da angiogênese leva à morte de células tumorais que podem alimentar o antígeno tumoral nas vias de apresentação do antígeno hospedeiro.
[00391] A proteína de fusão de IL2/IL2Ra divulgada aqui, descrita aqui também pode ser usada em combinação com anticorpos biespe- cíficos que se direcionam às células efetoras de expressão do receptor Fca ou Fcy para células tumorais (veja, por exemplo, Patentes Norte- americana Nos. 5.922.845 e 5.837.243). Os anticorpos biespecíficos podem ser usados para direcionar dois antígenos separados. Por exemplo, anticorpos biespecíficos de receptor anti-Fc/antígeno antitu- moral (por exemplo, Her-2/neu), têm sido usados para direcionar ma- crófagos para sítios de tumor. Este direcionamento pode ativar mais eficazmente as respostas específicas do tumor. Alternativamente, o antígeno pode ser liberado diretamente às DCs pelo uso de anticorpos biespecíficos que se ligam ao antígeno tumoral e um marcador de su- perfície celular específico para células dendríticas.
[00392] Os tumores escapam à vigilância imune do hospedeiro por uma grande variedade de mecanismos. Muitos desses mecanismos podem ser superados pela inativação de proteínas que são expressas pelos tumores e que são imunossupressoras. Estes incluem, entre ou- tros, TGF-B (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) e ligante Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Os anticorpos para cada uma dessas entidades podem ser usados em combinação com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita para neutralizar os efeitos do agente imunossupressor e favorecer as respostas imunes tumorais pelo hospedeiro.
[00393] Outros anticorpos que ativam a responsividade imune do hospedeiro podem ser usados em combinação com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita. Estes incluem moléculas na superfí- cie das células dendríticas que ativam a função da DC e apresentação de antígeno. Os anticorpos anti-CD40 são capazes de substituir efi- cazmente a atividade das células T auxiliares (Ridge et al. (1998) Na- ture 393: 474-478) e podem ser usados em conjunto com uma proteí- na de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita. A ativação de anticorpos para moléculas coestimuladoras de células T, como CTLA-4 (por exemplo, Patente Norte-americana 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) também pode fornecer níveis aumentados da ativação de células T. Inibidores de PD1 ou PD-L1 podem também pode ser usado em con- junto com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui. Outras combinações são fornecidas em outro lugar aqui.
[00394] O transplante de medula óssea está sendo usado atual- mente para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoéti- ca. Embora a doença do enxerto versus o hospedeiro seja uma con- sequência deste tratamento, o benefício terapêutico pode ser obtido a partir das respostas do enxerto versus tumor. Em algumas modalida- des, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é usada para aumentar a eficácia das células T específicas de tumor enxertadas de doador.
[00395] Existem também vários protocolos de tratamento experi- mental que envolvem a ativação ex vivo e expansão de células T es- pecíficas do antígeno e transferência adotiva dessas células em recep- tores a fim de estimular as células T específicas do antígeno contra o tumor (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546- 51). Esses mé- todos também podem ser usados para ativar as respostas das células T a agentes infecciosos, como o CMV. Em algumas modalidades, a ativação ex vivo na presença de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui pode aumentar a frequência e a atividade das células T transferidas de forma adotiva.
7.7.2.2 Doença Inflamatória ou Doença Autoimune
[00396] Em algumas modalidades, são descritos aqui métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio de um indivíduo em necessi- dade dos mesmos, em que a doença ou distúrbio é uma doença infla- matória ou uma doença autoimune. Em algumas modalidades, os mé- todos compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita.
[00397] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é administrada a pacientes tendo uma doença inflamatória ou uma doença autoimune que exibiu uma resposta ina- dequada a, ou progrediu em, um tratamento anterior. Em algumas mo- dalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é admi- nistrada a pacientes que não receberam previamente (isto é, foram tratados com) tratamento para uma doença inflamatória ou doença au- toimune.
[00398] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é administrada com um tratamento padrão pa- ra uma doença inflamatória ou uma doença autoimune. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é ad- ministrada como uma terapia de manutenção para uma doença infla- matória ou uma doença autoimune, por exemplo, uma terapia que se destina a prevenir a ocorrência ou recorrência da inflamação.
[00399] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/
IL2Ra descrita aqui é administrada como uma monoterapia para o tra- tamento de uma doença inflamatória ou uma doença autoimune, ou como a única terapia imunoestimulante para o tratamento de uma do- ença inflamatória ou uma doença autoimune. Em algumas modalida- des, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é combinada com um protocolo de vacinação para o tratamento de uma doença in- flamatória ou uma doença autoimune. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é combinada com um an- ticorpo usado para o tratamento de uma doença inflamatória ou uma doença autoimune.
[00400] Em algumas modalidades, a doença inflamatória ou uma doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em diabetes tipo |, esclerose múltipla, artrite reumatoide, doença celíaca, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite por lúpus, lúpus cutâneo, artrite idiopática juvenil, doença de Crohn, colite ulcerativa ou esclerose sis- têmica, doença do enxerto versus hospedeiro, psoríase, alopecia em áreas, vasculite induzida pelo HCV, síndrome de Sjogren, Pênfigo, Es- pondilite Ancilosante, Doença de Behcet, Granulomatose de Wegener, Doença de Takayasu, Hepatite Autoimune, Colangite Esclerosante, Gougerot-sjógren e Síndrome de Ativação de Macrófago.
7.7.2.3 Doença Infecciosa
[00401] Os métodos aqui descritos também podem ser usados para tratar pacientes que foram expostos a toxinas ou patógenos especiífi- cos. Por conseguinte, em algumas modalidades, são descritos aqui métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio de um indivíduo em necessidade dos mesmos, em que a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa. Em algumas modalidades, os métodos compreen- dem a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui para tra- tar a doença infecciosa.
[00402] “Semelhante à sua aplicação a tumores conforme discutido acima, métodos compreendendo o tratamento com uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui são usados isoladamente ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para estimular a resposta imune a patógenos, toxinas e autoantígenos. Exemplos de patógenos para os quais esta abordagem terapêutica pode ser particularmente útil, incluem patógenos para os quais não existe atualmente uma vaci- na eficaz, ou patógenos para os quais as vacinas convencionais são menos do que completamente eficazes. Estes incluem, porém, não estão limitados a HIV, Hepatite (A, B e C), Influenza, Herpes, Giárdia, Malária, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerugino- sa.
[00403] Alguns exemplos de vírus patogênicos que causam infec- ções tratáveis por métodos descritos aqui incluem HIV, hepatite (A, B ou C), vírus do herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-lIl e CMV, vírus Epstein Barr), adenovírus, vírus influenza, flavivírus, echo- vírus, rinovírus, vírus coxsackie, coronavírus, vírus sinciícial respirató- rio, vírus da caxumba, rotavírus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus da vacínia, vírus HTLV, vírus da dengue, papiloma vírus, vírus do molusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus da encefalite arboviral.
[00404] — Alguns exemplos de bactérias patogênicas que causam in- fecções tratáveis por métodos descritos aqui incluem clamídia, bacté- rias rickettsiais, micobactérias, estafilococos, estreptococos, pneumo- Nnococos, meningococos e gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseu- domonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera tétano, botu- lismo, antraz, peste, leptospirose e bactérias da doença de Lymes.
[00405] — Alguns exemplos de fungos patogênicos que causam infec- ções tratáveis por métodos descritos aqui incluem Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus
(fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasi- liensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
[00406] Alguns exemplos de parasitas patogênicos que causam in- fecções tratáveis por métodos descritos aqui incluem Entamoeba his- tolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, e Nippostrongylus brasiliensis.
[00407] Em todos os métodos acima, o tratamento com uma proteí- na de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui pode ser combinado com ou- tras formas de imunoterapia, por exemplo, aquelas aqui descritas, co- mo tratamento com citocinas (por exemplo, interferons, GM-CSF, G- CSF, IL2 ), ou terapia com anticorpo biespecífico, que fornece apre- sentação realçada de antígenos tumorais (veja, por exemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Struc- ture 2: 1121-1123).
7.7.2.4 Vacinas
[00408] As proteínas de fusão de IL2/IL2Ra descritas aqui podem ser usadas para estimular respostas imunes específicas do antígeno por coadministração de uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui com um antígeno de interesse (por exemplo, uma vacina). Por conseguinte, são fornecidos aqui métodos para realçar uma resposta imune a um antígeno em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo: (i) o antígeno; e (ii) uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita, de modo que uma resposta imune ao antígeno no indivíduo seja realçada. O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumo- ral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno de um patógeno. Exemplos não limitantes de tais antígenos incluem aqueles discutidos nas seções acima, como os antígenos tumorais (ou vacinas tumorais) discutidos acima, ou antígenos dos vírus, bactérias ou outros patógenos descritos acima.
[00409] Em algumas modalidades, um peptídeo ou proteína de fu- são compreendendo o epítopo ao qual uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita se liga é usado como uma vacina em vez de, ou além de, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra aqui descrita.
[00410] As rotinas adequadas de administração das composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, molé- culas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) aqui descri- tas in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser sele- cionadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, as composi- ções de anticorpos podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e do peso do indivíduo e da concen- tração e/ou formulação da composição do anticorpo.
7.7.2.5 Coadministração com um Segundo Agente
[00411] Conforme descrito anteriormente, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui pode ser coadministrada com um ou outros mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. A proteína de fu- são de IL2/IL2Ra descrita aqui pode ser ligada ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrada separada do agente. No último caso (administração separada), a proteína de fusão de IL2/ IL2Ra descrita aqui pode ser administrada antes, depois ou simultane- amente com o agente ou pode ser coadministrada com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, radia- ção. Esses agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti- neoplásicos, como doxorrubicina (adriamicina), cisplatina, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucila, dacarbazina e ciclofosfamida hidroxiureia que, por si só, são eficazes apenas em níveis que são tó-
xicos ou subtóxicos para um paciente. A cisplatina é administrada por via intravenosa como uma dose de 100 mg/ml uma vez a cada quatro semanas e adriamicina é administrada por via intravenosa na dose de 60-75 mg/ml uma vez a cada 21 dias. A coadministração de uma pro- teína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui com agentes quimioterápicos fornece dois agentes anticâncer que operam por meio de diferentes mecanismos que produzem um efeito citotóxico para células tumorais humanas. Essa coadministração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma alteração na anti- genicidade das células tumorais que as tornaria não reativas com o anticorpo.
[00412] São fornecidos aqui métodos de terapia de combinação em que uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui é coadministra- da com um ou mais agentes adicionais (um segundo agente terapêuti- co), por exemplo, fármacos de moléculas pequenas, anticorpos ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que são eficazes na es- timulação de respostas imunes para, assim, realçar, estimular ou su- per-regular as respostas imunes em um indivíduo.
[00413] Geralmente, uma proteína de fusão de IL2/IL2Ra descrita aqui pode ser combinada com (i) um agonista de uma molécula esti- muladora (por exemplo, coestimuladora) (por exemplo, receptor ou |li- gante) e/ou (ii) um antagonista de um sinal inibidor ou molécula (por exemplo, receptor ou ligante) em células imunes, como células T, am- bos dos quais resultam na amplificação de respostas imunes, como respostas de células T específicas do antígeno. Em alguns aspectos, um agente imuno-oncológico é (i) um agonista de uma molécula esti- muladora (incluindo um coestimulador) (por exemplo, receptor ou li- gante) ou (ii) um antagonista de uma molécula inibidora (incluindo um coinibidor) (por exemplo, receptor ou ligante) em células, por exemplo, aquelas que inibem a ativação de células T ou aquelas envolvidas na imunidade inata, por exemplo, células NK, e em que o agente imuno- oncológico aumenta a imunidade inata. Esses agentes imuno-oncoló- gicos são frequentemente referidos como reguladores de ponto de checagem imune, por exemplo, inibidor de ponto de checagem imune ou estimulador de ponto de checagem imune.
[00414] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão IL2/IL2Ra aqui descrita é administrada com um agente que é direcionado a uma molécula estimuladora ou inibidora que é um membro da superfamília de imunoglobulina (I9SF). Por exemplo, uma proteína de fusão |IL2/ IL2Ra aqui descrita pode ser administrada a um indivíduo com um agente que é direcionado a um membro da família IISF para aumentar uma resposta imune. Por exemplo, uma proteína de fusão IL2/IL2Ra aqui descrita pode ser administrada com um agente que é direcionado a (ou se liga especificamente a) um membro da família B7 de ligantes ligados à membrana que inclui B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) e B7-H6 ou um coestimulador ou correceptor inibidor ou ligando que se liga espe- cificamente a um membro da família B7.
[00415] Uma proteína de fusão IL2/IL2Ra aqui descrita também po- de ser administrada com um agente que é direcionado a um membro da família de moléculas TNF e TNFR (ligantes ou receptores), como CDA40 e CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-IBBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILRI/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILRA4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn 14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, ABRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TLI1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, Linfotoxina a 182, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, e NGFR (veja, por exemplo, Tansey 2009) Drug Discovery To- day 00:1).
[00416] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão IL2/IL2Ra aqui descrita é administrada com um agente que compreende um anti- corpo anti-PD-1. O anticorpo anti-PD-1 pode ser qualquer anticorpo que se liga a PD-1 e inibe a interação de PD-1 e PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é qualquer anticorpo anti-PD-1 co- nhecido na técnica. Em algumas modalidades, o segundo agente tera- pêutico compreende nivolumabe. Em algumas modalidades, o segun- do agente terapêutico compreende pembrolizumabe.
[00417] Em algumas modalidades, em que o segundo agente tera- pêutico compreende um anticorpo anti-PD-L1. O anticorpo anti-PD-L1 pode ser qualquer anticorpo que se liga a PD-L1 e inibe a interação de PD-1 e PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é qualquer anticorpo anti-PD-L1 conhecido na técnica. Em algumas mo- dalidades, o segundo agente terapêutico compreende atezolizumabe. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende durvalumabe. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêuti- co compreende avelumabe.
[00418] Em algumas modalidades, em que o segundo agente tera- pêutico compreende um anticorpo anti-CTLA-4. O anticorpo anti- CTLA-4 pode ser qualquer anticorpo que se liga a CTLA-4 e inibe sua atividade. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é qual- quer anticorpo anti-CTLA-4 conhecido na técnica. Em algumas moda- lidades, o segundo agente terapêutico compreende tremelimumabe. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende ipilimumabe.
[00419] Em algumas modalidades, em que o segundo agente tera- pêutico compreende um anticorpo anti-LAG3. O anticorpo anti-LAG3 pode ser qualquer anticorpo que se liga a LAG-3 e inibe sua atividade. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG3 é qualquer anticorpo anti-LAG3 conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende 25F7.
[00420] Em algumas modalidades, em que o segundo agente tera- pêutico compreende um anticorpo anti-CD137. O anticorpo anti-CD137 pode ser qualquer anticorpo que se liga ao CD137 e inibe sua ativida- de. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD137 é qualquer anti- corpo anti-CD137 conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende urelumabe.
[00421] Em algumas modalidades, em que o segundo agente tera- pêutico compreende um anticorpo anti-KIR. O anticorpo anti-KIR pode ser qualquer anticorpo que se liga a KIR e inibe sua atividade. Em al- gumas modalidades, o anticorpo anti-KIR é qualquer anticorpo anti- KIR conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o segundo agen- te terapêutico compreende lirilumabe.
[00422] Em algumas modalidades, em que o segundo agente tera- pêutico compreende um anticorpo anti-GITR. O anticorpo anti-GITR pode ser qualquer anticorpo que se liga ao GITR e inibe sua atividade. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-GITR é qualquer anticorpo anti-GITR conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende MK4166. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende TRX518.
[00423] Em outras modalidades, a segunda terapia compreende a administração de um anticorpo anti-TIM3. O anticorpo anti-TIM3 pode ser qualquer anticorpo que se liga a TIM3 e inibe sua atividade. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TIM3 é qualquer anticorpo anti- TIM3 conhecido na técnica.
[00424] Em certas modalidades, a segunda terapia compreende a administração de um agente quimioterápico. Em algumas modalida- des, o agente quimioterápico é selecionado a partir de um inibidor de proteassoma, um fármaco imunomodulador (IMiD), um inibidor de Bet e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o ini- bidor de proteassoma é selecionado de bortezomibe, ixazomibe, carfil-
zomibe, oprozomibe e marizomibe. Em certas modalidades, o inibidor de proteassoma compreende bortezomibe.
[00425] Em algumas modalidades, a segunda terapia compreende uma radioterapia. Qualquer radioterapia conhecida na técnica pode ser usada como segunda terapia.
[00426] Em algumas modalidades, a segunda terapia compreende a administração de um agente que ativa as células imunes inatas. Em algumas modalidades, o agente que ativa as células imunes inatas compreende um agonista de NLRP3. Em algumas modalidades, o agonista de NLRP3 compreende urato monossódico mono-hidratado (MSU) e/ou o adjuvante de vacina alúmen. Em algumas modalidades, o agente que ativa as células imunes inatas é um agonista do receptor 7 do tipo toll (TLR7). Em algumas modalidades, o agonista de TLR7 compreende imiquimode (R837), GS-9620 (veja, Tsai et al., J. Virology doi: 10.1128/JVI.02166-16 (8 de fevereiro de 2017)), ORN R-2336 (Mil- tenyl Biotec), ou qualquer combinação dos mesmos.
[00427] Em algumas modalidades, a segunda terapia compreende a administração de um agente que realça a sobrevivência de células exterminadoras naturais (NK), células T CD8* ou ambas.
[00428] Em certas modalidades, a segunda terapia compreende a administração de um agente selecionado a partir do grupo que consis- te em doxorrubicina (ADRIAMYCINO), cisplatina, carboplatina, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucila (LEUKERANO), ciclofosfamida (CYTOXANG; NEOSARO), lenalidomida (REVLIMID) &), bortezomibe (VELCADEO), dexametasona, mitoxantrona, etoposídeo, citarabina, bendamustina (TREANDAGO), rituximabe (RITUXANO), ifosfamida, vin- cristina (ONCOVINO), fludarabina (FLUDARAGO), talidomida (THA- LOMIDO), alentuzumabe (CAMPATHO), ofatumumabe (ARZITOR- RAG, everolessO), O), carfilzomibe (KYPROLISTM) e qualquer combi- nação dos mesmos.
[00429] Agentes exemplares que modulam uma das proteínas aci- ma e podem ser combinados com a proteína de fusão aqui descrita, para o tratamento do câncer, incluem: YERVOYO (ipilimumabe) ou Tremelimumabe (para CTLA-4), galiximabe (para B7.1), BMS- 936558 (para PD-1), MK-3475 (para PD-1), atezolizumabe (TECENTRIQO), AMP224 (para B7DC), BMS-936559 (para B7-H1), MPDL3280A (para B7-H1), MEDI- 570 (para ICOS), AMG557 (para B7H2), MGA271 (para B7H3), IMP321 (para LAG-3), BMS-663513 (para CD137), PF- 05082566 (para CD137), CDX-1127 (para CD27), anti-OX40 (Provi- dence Health Services), nuMAbOX40L (para OX40L), Atacicepte (para TACI), CP-870893 (para CD40), Lucatumumabe (para CD40), Dacetu- zumabe (para CD40), Muromonabe-CD3 (para CD3); anticorpos anti- GITR MK4166, TRX518, Medi1873, INBRX-110, LK2-145, GWN-323, GITRL-Fc ou qualquer combinação dos mesmos.
[00430] Outras moléculas que podem ser combinadas com a prote- ína de fusão para o tratamento de uma doença ou distúrbio incluem antagonistas de receptores inibidores em células NK ou agonistas de receptores ativadores em células NK. Por exemplo, as proteínas de fusão aqui descritas podem ser combinadas com antagonistas de KIR (por exemplo, lirilumabe).
[00431] A ativação de células T também é regulada por citocinas solúveis e as proteínas de fusão aqui descritas podem ser administra- das a um indivíduo, por exemplo, com câncer, com antagonistas de citocinas que inibem a ativação de células T ou agonistas de citocinas que estimulam a ativação de células T.
[00432] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão aqui des- critas podem ser usadas em combinação com (i) antagonistas (ou ini- bidores ou agentes de bloqueio) de proteínas da família IQSF ou famí- lia B7 ou a família TNF que inibem a ativação de células T ou antago- nistas de citocinas que inibem Ativação de células T (por exemplo, IL-6,
IL-10, TGF-B, VEGF; "citocinas imunossupressoras") e/ou (ii) agonis- tas de receptores estimuladores da família I9SF, família B7 ou família TNF ou de citocinas que estimulam a ativação de células T, para esti- mular uma resposta imune, por exemplo, para tratar doenças prolifera- tivas, como o câncer.
[00433] Ainda outros agentes para terapias de combinação incluem agentes que inibem ou esgotam macrófagos ou monócitos, incluindo, mas não se limitando a antagonistas de CSF-1R, tais como anticorpos antagonistas de CSF-1R, incluindo RG7155 (WO11/70024, WO11/ 107553, WO11/131407, W013/87699, WO013/119716, WO13/132044) ou FPA-008 (WO11/140249; W013169264; WO14/036357).
[00434] A proteína de fusão da presente descrição também pode ser administrada com agentes que inibem a sinalização de TGF-EB.
[00435] Agentes adicionais que podem ser combinados com uma proteína de fusão aqui descrita incluem agentes que aumentam a apresentação do antígeno tumoral, por exemplo, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleotí- deos CpG e imiquimode, ou terapias que aumentam a imunogenicida- de das células tumorais (por exemplo, antraciclinas).
[00436] Outra terapia que pode ser combinada com a proteína de fusão aqui descrita é uma terapia que inibe uma enzima metabólica, como indolamina dioxigenase (IDO), dioxigenase, arginase ou óxido nítrico sintetase.
[00437] Outra classe de agentes que podem ser usados com a pro- teína de fusão aqui descrita inclui agentes que inibem a formação de adenosina, por exemplo, inibidores de CD73, ou inibem o receptor A2A de adenosina.
[00438] Outras terapias que podem ser combinadas com a proteína de fusão aqui descrita para o tratamento de uma doença ou distúrbio, por exemplo, câncer, incluem terapias que revertem/previnem anergia ou exaustão de células T e terapias que desencadeiam uma ativação imune inata e/ou inflamação em um sítio de tumor.
[00439] Outras terapias que podem ser combinadas com a proteína de fusão aqui descrita para o tratamento de uma doença ou distúrbio, por exemplo, câncer, incluem terapias que bloqueiam IL-8, por exem- plo, com HuMax-IL8.
[00440] “Uma proteína de fusão aqui descrita pode ser combinada com mais de um agente imuno-oncológico e pode ser, por exemplo, combinada com uma abordagem combinatória que é direcionado a vá- rios elementos da via imunológica, como um ou mais dos seguintes: uma terapia que melhora apresentação de antígeno tumoral (por exemplo, vacina de células dendríticas, vacinas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleotídeos CpG, imiquimode); uma terapia que inibe a regulação imunológica negativa, por exemplo, pela inibição da via CTLA-4 e/ou PD1/PD-L1/PD-L2 e/ou depleção ou bloqueio de Tregs ou outras células imunossupressoras; uma terapia que estimula a regulação imunológica positiva, por exemplo, com agonistas que es- timulam a via CD-137, OX-40 e/ou CD40 ou GITR e/ou estimulam a função efetora das células T; uma terapia que aumenta sistemicamen- te a frequência de células T antitumorais; uma terapia que esgota ou inibe Tregs, como Tregs no tumor, por exemplo, usando um antagonis- ta de CD25 (por exemplo, daclizumabe) ou por esgotamento de grânu- los anti-CD25 ex vivo; uma terapia que impacta a função das células mieloides supressoras no tumor; uma terapia que realça s imunogeni- cidade de células tumorais (por exemplo, antraciclinas); transferência de células T adotivas ou células NK incluindo células geneticamente modificadas, por exemplo, células modificadas por receptores de antí- genos quiméricos (terapia CAR-T); uma terapia que inibe uma enzima metabólica, como indoleamina dioxigenase (IDO), dioxigenase, argi- nase ou óxido nítrico sintetase; uma terapia que reverte/previne a ane-
rgia ou exaustão das células T; uma terapia que desencadeia uma ati- vação imune inata e/ou inflamação no local do tumor; administração de citocinas imunoestimulantes; ou bloqueio de citocinas imunorrepressi- vas.
[00441] As proteínas de fusão aqui descritas podem ser usadas em conjunto com um ou mais dos agentes agonísticos que ligam os recep- tores coestimuladores positivos, agentes bloqueadores que atenuam a sinalização através de receptores inibidores, antagonistas e um ou mais agentes que aumentam sistemicamente a frequência de células T antitumorais, agentes que superam vias imunossupressoras distintas dentro do microambiente tumoral (por exemplo, bloqueiam o envolvi- mento do receptor inibidor (por exemplo, interações PD-L1/PD-1), es- gotam ou inibem Tregs (por exemplo, usando um anticorpo monoclo- nal anti-CD25 (por exemplo, daclizumabe) ou por esgotamento de grâ- nulos anti-CD25 ex vivo), inibir enzimas metabólicas, como IDO, ou reverter/prevenir a anergia ou exaustão de células T) e agentes que desencadeiam a ativação imune inata e/ou inflamação em sítios de tumor.
[00442] Em algumas modalidades, a proteína de fusão da presente descrição é administrada a um indivíduo juntamente com um inibidor de BRAF se o indivíduo for positivo para a mutação BRAF V600.
[00443] Por exemplo, a proteína de fusão da presente descrição e as terapias de combinação aqui descritas podem ser usadas em com- binação (por exemplo, simultaneamente ou separadamente) com um tratamento adicional, tal como irradiação e/ou quimioterapia, por exemplo, usando camptotecina (CPT-11), 5-fluorouracila (5-FU), cis- platina, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel, gencitabina, cisplatina, paclitaxel, carboplatina-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina ou camptote- cina + apo21/TRAIL (um ou mais inibidores de apo21/TRAIL (uma ou mais combinações de 6X), (por exemplo, bortezomibe ou MG132), um ou mais inibidores Bcl-2 (por exemplo, BH31-2 '(inibidor bcl-xl), inibidor de indoleamina dioxigenase-1 (por exemplo, INCB24360, indoximode, NLG-919 ou FO01287), AT -101 derivado de (R-(-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequena), antagonistas de GX-15-070 (obatoclax) ou MCL-1 (proteína de diferenciação de células de leucemia mieloide-1)), anta- gonistas de iAP (inibidor de proteína de apoptose) (por exemplo, smac7, smac4, mimético de smac de molécula pequena, peptídeos smac sintéticos (veja, Fulda et al, Nat Med 2002; 8: 80 8-15), ISIS23722 (LY2181308), ou AEG-35156 (GEM-640)), inibidores de HDAC (histona desacetilase), anticorpos anti-CD20 (por exemplo, ritu- ximabe), inibidores da angiogênese (por exemplo, bevacizumabe), agentes antiangiogênicos visando VEGF e VEGFR (por exemplo, Avastin), triterpenoides sintéticos (veja, Hyer et al, Cancer Research 2005; 65: 4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína inibidora de FLICE celular) (por exemplo, ligantes naturais e sintéticos de PPARy (receptor y ativado por proliferador de peroxissoma), 5809354 ou 5569100), inibidores de cinase (por exemplo, Sorafenibe), Trastuzu- mabe, Cetuximabe, Tensirolimo, inibidores de MTOR, como rapamici- na e tensirolimo, Bortezomibe, inibidores de JAK2, inibidores de HSP90, inibidores de PISK-AKT, Lenalildomida, inibidores de GSK3P, inibidores de IAP e/ou fármacos genotóxicos.
[00444] A proteína de fusão da presente descrição e as terapias de combinação aqui descritas podem ainda ser usadas em combinação com um ou mais agentes citotóxicos antiproliferativos. As classes de compostos que podem ser usados como agentes citotóxicos antiproli- ferativos incluem, mas não estão limitados, ao seguinte: Agentes alquilantes (incluindo, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos): mostarda de uracila, clormetina, ciclofosfamida (CYTO- XANO) fosfamida, melfalano, clorambucila, pipobromano, Trietilenome-
lamina, Trietilenotiofosforamina, Bulsufano, Carmustina, Lamustina, Estreptozocina, Dacarbazina e Temozolomida.
Antimetabólitos (incluindo, sem limitação, antagonistas do ácido fólico, análogos da pirimidina, análogos da purina e inibidores da adenosina desaminase): Metotrexato, 5-Fluorouracila, Floxuridina, Ci- tarabina, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Fosfato de fludarabina, Pen- tostatina e Gencitabina.
[00445] — Agentes antiproliferativos adequados para combinação com a proteína de fusão da presente descrição, sem limitação, taxanos, paclitaxel (paclitaxel está disponível comercialmente como TAXOLY), docetaxel, discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT), Pelorusídeo A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona Bl, [17]-desidrode- soxiepotilona B, [18]desidrodesoxiepotilonas B, C12,13-ciclopropil- epotilona A, C6-C8 A, trans-9,10-desidroepotilona D, cis-9,10-desi- droepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona BIO, discoderomoli- da, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAAZ96A (Discodermolida), TZT-1027 (soblidotina), ILX-651 (cloridra- to de tasidotina), Halicondrina B, Mesilato de eribulina (E-7389), Hemi- asterlina (HTI-286), E-7974, Cirptoficinas, LY-355703, imunoconjuga- dos de maitansinoide (DM-1), MKC-1, ABT- 751, TI-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesibe), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobi- na, 17beta-acetóxi-2-etóxi-6-0x0-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ci- clostreptina, isolaulimalide, laulimalide, 4-epi-7-desidróxi-14,16-dide- metil-(+)-discodermolidas e criptotilona 1, além de outros agentes es- tabilizadores de microtubulina conhecidos na técnica.
[00446] Nos casos em que é desejável tornar as células aberrante- mente proliferativas quiescentes em conjunto com ou antes do trata- mento com a proteína de fusão da presente descrição aqui descrita, hormônios e esteroides (incluindo análogos sintéticos), tais como 17a-
Etinilestradiol, Dietilestilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximes- terona, Propionato de dromostanolona, Testolactona, Megestrolaceta- to, Metilprednisolona, Metil-testosterona, Prednisolona, Triancinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Medroxiprogutona, Medroxiprogesterona, também pode ser adminis- trado ao paciente, Leifuprolacetato, Torifuprolida&, Leifuprolida&. Ao empregar os métodos ou composições aqui descritos, outros agentes usados na modulação do crescimento tumoral ou metástase em um ambiente clínico, como os antimiméticos, também podem ser adminis- trados conforme desejado.
[00447] Em algumas modalidades, a combinação da proteína de fusão da presente descrição e um segundo agente discutido neste do- cumento pode ser administrada simultaneamente como uma única composição em um veículo farmaceuticamente aceitável, ou simulta- neamente como composições separadas com a proteína de fusão da presente descrição e a segunda agente num transportador farmaceuti- camente aceitável. Em algumas modalidades, a combinação da prote- ína de fusão da presente descrição e o segundo agente pode ser ad- ministrada sequencialmente. A administração dos dois agentes pode começar em horários que são, por exemplo, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 ho- ras, 48 horas, 3 dias, 5 dias, 7 dias ou uma ou mais semanas de inter- valo, ou a administração do segundo agente pode começar, por exem- plo, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 3 horas, 6 ho- ras, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 dias, 5 dias, 7 dias ou uma ou mais semanas após o primeiro agente ter sido administrado.
[00448] Em algumas modalidades, um anticorpo antineoplásico que pode ser combinado com uma proteína de fusão da presente descri- ção e/ou um segundo agente inclui RITUXANO (rituximabe), HER- CEPTINO (trastuzumabe), BEXXARO (tositumomabe), ZEVALINO
(ibritumomabe), CAMPATHO (alentuzumabe), LYMPHOCIDEO (epr- tuzumabe), AVASTINO (bevacizumabe) e TARCEVAGO (erlotinibe) ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o se- gundo anticorpo útil para a terapia de combinação com uma proteína de fusão da presente descrição pode ser um conjugado de fármaco de anticorpo.
[00449] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão da pre- sente descrição sozinha ou em combinação com outro agente é usada simultaneamente ou sequencialmente com o transplante de medula óssea para tratar uma variedade de tumores de origem hematopoiéti- ca.
[00450] São fornecidos aqui métodos para alterar um evento adver- so associado ao tratamento de uma doença hiperproliferativa (por exemplo, câncer) com um agente imunoestimulador, compreendendo a administração de uma proteína de fusão da presente descrição com ou sem um segundo agente, a um indivíduo. Por exemplo, os métodos aqui descritos fornecem um método para reduzir a incidência de colite ou diarreia induzida por anticorpos terapêuticos imunoestimulantes por administração de um esteroide não absorvível ao paciente. Quando aqui usado, um "esteroide não absorvível" é um glicocorticoide que exibe extenso metabolismo de primeira passagem de modo que, após o metabolismo no fígado, a biodisponibilidade do esteroide é baixa, isto é, menos de cerca de 20 %. Em algumas modalidades aqui descri- tas, o esteroide não absorvível é budesonida. A budesonida é um gli- cocorticosteroide de ação local, que é extensamente metabolizado, principalmente pelo fígado, após administração oral. ENTOCORT ECO (Astra-Zeneca) é uma formulação oral de budesonida dependente do pH e do tempo desenvolvida para otimizar a administração do medi- camento ao leo e ao longo do cólon. ENTOCORT ECQG é aprovado nos EUA para o tratamento da doença de Crohn leve a moderada en-
volvendo o íleo e/ou cólon ascendente. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão da presente descrição em conjunto com um es- teroide não absorvível pode ser ainda combinada com um salicilato. Os salicilatos incluem agentes 5-ASA, tais como, por exemplo: sulfas- salazina (AZULFIDINEG, Pharmacia & Up John); olsalazina (DJPEN- TUMO, Pharmacia & Up John); balsalazida (COLAZALO, Salix Phar- maceuticals, Inc.); e mesalamina (ASACOLGO, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASAGO, Shire US; CANASAGO, Axcan Scan- dipharm, Inc .; ROWASAG, Solvay).
7.8 Kits
[00451] “Quando aqui usado, um kit compreende uma proteína de fusão IL2/IL2Ra para uso na modulação da resposta imune, conforme descrito em outro lugar neste documento. Os termos "kit" e "sistema", quando aqui usados, destinam-se a referir-se a pelo menos uma ou mais proteínas de fusão IL2/IL2Ra que, em modalidades específicas, estão em combinação com um ou mais outros tipos de elementos ou componentes (por exemplo, outros tipos de reagentes bioquímicos, recipientes, embalagens, tais como embalagens destinadas à venda comercial, instruções de uso e similares).
[00452] Em algumas modalidades, é descrito um kit compreenden- do (a) um ou mais de uma proteína de fusão IL2/IL2Ra como aqui descrito, uma composição compreendendo uma proteína de fusão IL2/IL2Ra como aqui descrito, um ácido nucleico que codifica para uma proteína de fusão IL2/IL2Ra como aqui descrito, um vetor e/ou uma célula hospedeira; e (b) e instruções para administrar a proteína de fusão a um indivíduo em necessidade da mesma. Em algumas mo- dalidades, é descrito um kit compreendendo (a) uma proteína de fusão IL2/IL2Ra como aqui descrito e (b) e instruções para administrar a pro- teína de fusão a um indivíduo em necessidade da mesma. Em algu- mas modalidades, é descrito um kit compreendendo (a) uma composi-
ção compreendendo uma proteína de fusão IL2/IL2Ra como aqui des- crito e (b) e instruções para administrar a composição a um indivíduo em necessidade da mesma. Em algumas modalidades, é descrito um kit que compreende (a) um ácido nucleico que codifica para uma prote- ína de fusão IL2/IL2Ra como aqui descrito e (b) e instruções para ad- ministrar o nucleico a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, é descrito um Kit compreendendo (a) um vetor conforme aqui descrito e (b) e instruções para administrar o vetor a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, é descrito um kit compreendendo (a) uma célula hospedeira como aqui descrito e (b) e instruções para administrar a célula hospedeira a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00453] Em uma modalidade específica, é fornecido aqui um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes preenchi- dos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas aqui descritas, como uma ou mais proteínas de fusão aqui fornecidas. Em algumas modalidades, os kits contêm uma composição farmacêu- tica aqui descrita e qualquer agente profilático ou terapêutico, como aqueles aqui descritos. Em certas modalidades, os kits podem conter um mitógeno de células T, como, por exemplo, fito-hemaglutinina (PHA) e/ou acetato de miristato de forbol (PMA), ou um anticorpo es- timulador do complexo de TCR, como um anticorpo anti-CD3 e anti- corpo anti-CD28. Opcionalmente associado a tal(is) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.
[00454] “Também são fornecidos aqui kits que podem ser usados nos métodos acima. Em uma modalidade, um kit compreende uma proteína de fusão aqui descrita, preferivelmente uma proteína de fusão purificada, em um ou mais recipientes. Em uma modalidade específi- ca, os kits aqui descritos contêm uma proteína de fusão substancial- mente isolada como um controle. Em outra modalidade específica, os kits aqui descritos compreendem ainda um anticorpo de controle ou proteína de fusão que não reage com um antígeno de IL2 e/ou IL2-Ra. Em outra modalidade específica, os kits aqui descritos contêm um ou mais elementos para detectar a ligação da proteína de fusão a um an- tígeno de IL2 e/ou IL2-Ra (por exemplo, a proteína de fusão pode ser conjugada a um substrato detectável, como um composto fluorescen- te, um substrato enzimático, um composto radioativo ou um composto luminescente, ou um segundo anticorpo que reconhece o primeiro an- ticorpo pode ser conjugado a um substrato detectável). Em modalida- des específicas, um kit fornecido aqui pode incluir uma proteína de fu- são produzida de forma recombinante ou sintetizada quimicamente. O antígeno para uma proteína de fusão descrita aqui, conforme fornecido no kit, também pode ser ligado a um suporte sólido. Em uma modali- dade mais específica, o meio de detecção do kit descrito acima inclui um suporte sólido ao qual um antígeno da proteína de fusão está liga- do. Um tal kit também pode incluir um anticorpo anti-humano marcado com repórter não ligado ou anticorpo anti-ccamundongo/rato. Nesta modalidade, a ligação da proteína de fusão a um antígeno pode ser detectada pela ligação do referido anticorpo marcado com repórter.
[00455] A prática da presente descrição empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura de células, biologia molecular, biologia transgênica, microbiolo- gia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro dos conheci- mentos da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na lite- ratura. Veja, por exemplo, Sambrook et a/., ed. (1989) Molecular Clon- ing A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrooket al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed,, (1985) DNA Cloning, Volumes | and Il; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et a/. Pat. Norte-americana No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Hig- gins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Cul- ture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And En- zymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecu- lar Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Aca- demic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes |-IV; Manipulating the Mouse Em- bryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2ºº Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
[00456] Todas as referências citadas acima, bem como todas as referências aqui citadas e as sequências de aminoácidos ou nucleotí- deos (por exemplo, números GenBank e/ou números Uniprot), são in- corporadas aqui por referência em sua totalidade.
[00457] Os seguintes exemplos são apresentados a título de ilus- tração e não de limitação.
8. EXEMPLOS Exemplo 1. proteína de fusão DE IL2-CD25 forma um homodímero homogêneo, estável
[00458] O tamanho e o estado oligomérico das proteínas de fusão foram estudados por cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a um detector de dispersão de luz de múltiplos ângulos em linha (SEC- MALS). As amostras foram preparadas pela injeção de 30 ug de amos- tra de proteína de matéria-prima. As separações isocráticas foram rea- lizadas em uma coluna GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL (10 mm X 300 mm) conectada a um sistema Prominence Shi- madzu UFLC que consiste em um desgaseificador, bomba isocrática, suporte de amostra resfriado com injetor, detector UV/vis e forno de coluna em tampão contendo Tris 40 mM, NaCl 200 mM (pH 7,5), com de azida de Na 0,02 % adicionada e 0,1 um filtrado funcionando em uma taxa de fluxo de 0,75 mL/min. As amostras foram injetadas na co- luna usando um amostrador automático Shimadzu, e os dados foram obtidos de três detectores online conectados em série: um espectrofo- tômetro UVWV/vis de comprimento de onda duplo Shimadzu SPD-20 defi- nido para coleta em 280 nm, seguido por um detector de dispersão de luz a laser de três ângulos Wyatt Technologies mini:-Dawn TREOS e, em seguida, um refratômetro interferométrico Wyatt Optilab T-rEX. Os dados foram coletados e analisados usando os softwares Astra 6 (Wyatt) e LabSolutions Lite (Shimadzu).
[00459] Os dados da FIG. 1 mostra massa absoluta típica versus tempo de eluição de cromatografia por exclusão de tamanho analítica. A amostra analisada na FIG. 1 é para I1L2-CD25(22-212) (SEQ ID NO: 16) fundida a um marcador His (GGHHHHHH (SEQ ID NO: 100), que tem uma massa molecular teórica de 37.812 (reduzida) para a cadeia polipeptídica. Os dados indicam que IL2-CD25(22-212) forma uma es- pécie homogênea ao longo do perfil de eluição tendo uma massa ab- soluta medida de 93 kDa. O pico de eluição não mostra nenhuma evi- dência de espécies monoméricas nem de espécies oligoméricas de ordem superior ao pico principal. O valor de massa de 93 kDa indica que a molécula forma um homodímero e também é glicosilada (cerca de 18 % da massa de sítios de glicosilação ligados a Ne O em IL2 e
CD25). Exemplo 2: Proteínas de fusão de IL2-CD25 ligam-se de forma equivalente aos heterorreceptores sCD25 e sIL2RRB/IL2Ry com afi- nidade observada atenuada.
[00460] Os estudos de ressonância de plasmônio superficial (SPR) foram realizados em um instrumento Biacore T100 e/ou T200 (GE Healthcare) a 25 ºC. A ligação dos analisados da proteína de fusão foi testada em solução salina tamponada por fosfato (PBS-T) (pH 7,1) em superfícies que consistem em uma densidade baixa (- 300RU) de biot- hCD25-BioP-TVMV-His que tinha sido clivado por His (hnCD25 ) e cap- turado em uma estreptavidina, chip sensor SA ou proteína de fusão de Fc —heterodimérica hCD122(27-241)-hFc-D/hCD132(23-263)-hFe-K (hlL2-Rb/g) que foi capturado via superfície do chip sensor de CM5 imobilizada da Proteína A usando química de etil(dimetilaminopropil) carbodiimida/N-hidroxissuccinimida (NHS) padrão, com bloqueio de etanolamina. Os analisados de proteína foram injetados em uma série de titulação e a regeneração de volta à linha de base foi realizada por injeções de 2 X 8s do tampão de pH baixo. Os dados foram analisados usando o software de Avaliação Biacore T-200.
[00461] FIG.2 mostra a ligação prototípica da proteína de fusão de IL2-CD25 (SEQ ID NO: 16) a sSCD25 humano. A constante de dissoci- ação de equilíbrio aparente observada de 4,2 micromolar é aproxima- damente 150 vezes mais fraca do que a afinidade de IL2 isolada para sCD25 conforme medido por ressonância de plasmônio superficial (Li- paroto, SF, Myszka, DG, Wu, Z., Goldstein, B., Laue, T.M., e Ciardelli, T.L. (2002) Biochemistry 41, 2543-51.). Tabela 9: Farmacocinética da ligação da proteína de fusão de |IL2- CD25 (SEQ ID NO: 16) a SCD25 humano.
[00462] A Tabela 10 abaixo mostra valores de Kp de equilíbrio ob- servados por ligação prototípica para versões curtas e longas de |IL2- CD25 para sSCD25 humano e heterodímero sIL2REB/IL2Ry.
As constan- tes de dissociação de equilíbrio aparente observadas para as várias proteínas de fusão de IL2-CD25 são marcadamente atenuadas em comparação com IL2. A ligação a sSCD25 é aproximadamente 100 ve- zes mais fraca para as fusões de IL2-CD25 em comparação com a IL2. Da mesma forma, a ligação das fusões de IL2-CD25 é cerca de 150 vezes mais fraca para o heterodímero beta-gama do que IL2. Tabela 10: Valores de Kp de equilíbrio observados para a ligação de construtos de IL2 e IL2-CD25 a sCD25 ou heterodímero sIL2REB/IL2Ry conforme medido por ressonância de plasmônio superficial.
Ko para | Ko para heterodímero Receptor sCD25, uM | sIL2R$/IL2Ry, uM I1L2-CD25(22-212) 0,065 I1L2-CV-CD25(22-240) 0,063 I1L2-CD25(22-240) 0,044 SEQ ID NO: 67 Bivalente de Fc1.1-7ligante-lL2- 5,6 ND, CD25(22-212) IL2-CD25(22-212)-Fc1.1 SEQ ID NO: 68 IL2-T3A-CD25(22-187)-N89Q-T95A-T106A (SEQ ID 19 ND NO: 202) ' VD SEQ ID NO: 203 bivalente de Fc-(IL2(V91K)CD25)2 [ao HSAHGA4S)3- IL2-CD25(22-187) SEQ ID NO: 19 IL2(C145A)-CD25(22-212)-GG-HSA SEQ ID NO: 20 Fc1.1(f)-AZ1-IL2(C1458)-CD25(22-187)-G Humano 30 015 SEQ ID NO: 26 ' IL2(C1458)-CD25(22-187)- HuFc1.1(f)-AZ1 20 015 SEQ ID NO: 27 '
Exemplo 3: Versões truncadas de IL2-CD25 têm estabilidade me- lhorada contra agregação: teste de estabilidade acelerado
[00463] A estabilidade das proteínas de fusão foi testada incubando a 40 ºC em tampões de faixa de pH 4-8. As proteínas de fusão foram concentradas a cerca de 15 mg/ml e dialisadas a 4 ºC nos seguintes tampões: 1) Acetato 20 mM, Sacarose 250 mM, pH 4, 2) Citrato 20mM, Sacarose 250mM, pH 5, 3) Histidina 20mM, Sacarose 250mM, pH 6, 4) Fosfato 20mM, Sacarose 250mM, pH 7 e 5) Tris 20mM, Sacarose 250mM, pH 8,4 (temperatura ambiente ). Após a recuperação da diálise, a concentração das proteínas de fusão foi normalizada para 10 mg/ml por diluição com tampão de diálise e colocada em uma incubadora moni- torada a 40 ºC por quatro semanas, com alíquotas removidas imediata- mente antes da incubação (t0), após uma semana (1s) e após quatro semanas (4s) de incubação de 40ºC. Cada ponto de tempo foi analisado por Cromatografia de Exclusão por Tamanho em uma coluna Shodex KWA403-4F, conectada a um sistema de HPLC Agilent 1260 em tam- pão contendo fosfato sódico 100 mM, Cloreto Sódico 150 mM, pH 7,3 (0,2 um filtrado) operando em uma taxa de fluxo de 0,30 mL/min.
[00464] “Como visto nas Tabelas 11 e 12, as versões truncadas de IL2-CD25 exibem perfis de alto peso molecular e baixo peso molecular muito melhores após estudos de estabilidade acelerados do que as versões mais longas. Isso é especialmente verdadeiro para valores de pH 4, 5, 6 e 7. Amostras foram mantidas em diferentes condições de pH por quatro semanas e quarenta graus Celsius. Os resultados mos- trados como porcentagem de frações de alto peso molecular e de bai- xo peso molecular de cada construto indicam uma estabilidade muito melhorada dos construtos curtas em comparação com os longos. Os resultados mostrados como porcentagem das frações do pico principal de cada construto indicam uma estabilidade muito melhorada dos construtos curtos em comparação com os longos.
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Exemplo 4: Estudos Farmacocinéticos em Animais Não Humanos
[00466] Estudos farmacocinéticos. Todos os protocolos de ani- mais foram aprovados pelo Central New Jersey Institutional Animal Care and Use Committe e os animais foram alojados de acordo com as diretrizes. Camundongos Balb/C fêmeas pesando 19-20 gramas foram adquiridos de Charles-River (Wilmington, MA). Camundongos Balb/C não jejuados foram administrados com uma dose única de 0,5 mg/kg da molécula indicada, por rotina intravenosa (IV) por meio de rotina da veia da cauda ou subcutânea (SC). I1L2(21-153)-(G3S)3- CD25(22-240) usado em estudos farmacocinéticos tem um marcador His6. O sangue foi coletado da veia da cauda nos seguintes pontos de tempo após a dose: 5 minutos (apenas IV), 1h, 7h, 24h, 48h, 72h, 96h e 168h. Para o estudo PK em macacos, macacos cinomolgo machos foram obtidos da Buckshire Corporation (Perkasie, PA). Macacos (N = 3, peso corporal médio 7,8 kg) receberam uma dose única subcutânea de 0,075 mg/kg de hlL2-CD25 (22-212). Amostras de sangue em série foram coletadas de uma artéria femoral de macacos conscientes e presididos em 5h, 24h, 48h, 72h, 96h, 168h, 192h e 240h após a do- sagem. As amostras de sangue foram coaguladas e centrifugadas a 4ºC (1500-2000 * g) para obter o soro. As amostras de soro foram armazenadas a -80 ºC até análise posterior.
[00467] Detecção da proteína de fusão no soro: Um ensaio de ligação ao ligante foi usado para detectar os níveis da proteína de fu- são em amostras de soro de camundongo ou macaco. Resumidamen- te, placas de fundo plano Nunc MaxdiSorp de 96 cavidades (Thermo Fisher Scientific, Denmark) foram revestidas com reagente de captura (anticorpo IL2 anti-humano de rato, clone monoclonal: MQ1-17H12; Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA), a 2 ug/mL em PBS durante a noite a 4 ºC. As placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio (BSA 5 % em PBS) e incubadas a 25 ºC por uma hora. Os padrões,
CQs e amostras foram diluídos 20 vezes com tampão de ensaio (PBS com BSA 1 % e Tween 20 0,05 %) e adicionados às placas lavadas em duplicata e incubadas a 4 ºC durante a noite.
As placas lavadas foram incubadas com reagente de detecção (anticorpo biotinilado CD25 humano, R&D Systems, Minneapolis, MN em 250 ng/ml em tampão de ensaio) e incubadas durante 2 horas a 25 ºC.
Às placas lavadas foram adicionados sequencialmente, a 25 ºC, NeutrAvidin- HRP (Thermo Scientific, Rockford, IL) 100 ng/ml em tampão de en- saio por 45 minutos seguido por mistura de substrato quimiolumines- cente (Thermo Scientific, Rockford, IL) por um minuto antes de ler no leitor de placas SpectraMax no modo de luminescência.
A concentra- ção do analisado em amostras de soro foi calculada usando a curva padrão feita pelo algoritmo de ajuste de curva linear Log-Log do pro- grama de análise softmax (Molecular Devices).
o o o = 2 as s - F Fr a 3 ar lLRERLELE 2 e = m * 2 2 Z 5 2 S 2 5 28 8 z z e jo o o jo x ba O = O |O = | o co IN = o Fr = | E É =? Ss | | - bx . Pr a 3 ; S | o E < < < < < & E ZE ZKZR=ZNZ|S Ss o E Ô |x Ss o | S E É £ o gg Sage S5 < 8 |ó Z IR 2 É 2 2 2 S 22 un S 8 E | 8 Re & |E & E õ E E | Ee |? =s o |& | ale = = na jo =) mn lo E l€ SS | lá E 18 lar [8 = | o x o 6 2 =| 3 8/8/8256 FT 8 RS Ns Ss ;D << E lo ló lá É jo at = lo e = anjo el fo = j< - o = V 5 Pl q | fe] de QN E BE SE EFEBESE FS a nn > [E |$ 2 |3 [2 | 2 |º (2 (2 |Z o o a 3 > o o = O O > ES le é | else igdas q o aê . 2 jo [E |= [2 |« [2 | 2 | [2 |2 |Z = o nn 8 oo "O 8 > Do o o o o o oj E 8 = |s 8 2 jo 2 lo 2 o 2682 / E 8 ao = ES E lo = E = o > = o Cc = o & s 2/2 12 1º jo jo o o o lo lo | E 8 o E |o |ó |óo lo lo lo lo lo lo o 6 8 — 3 gil | E ss E | q & E RS = EA = o — mm S & Ss zw E 8 nu E RS — o o AR sw e ss 8 sã ao ao e ja 28 QN o 6 6 6 D o Z | Qo =) a a a Ss a LS o o Q Q & A x o o É o | | lNahb $ E = “o 2 2 2 T Ne Ç o o = PD PD PD o à io O ço o o o o oO à jo = oO & [2 [2 [2 Re Ss Da ão = = = a & Fa co & & & o à o E 8 = e e e goes w o z z z [Pak ec. = Pv Ss a a = oR: "e o O| S S o o 3 3 3 2 oNfi<g 3 | - - - = | 2 Fr =
Exemplo 5: Atividade da proteína de fusão de IL2-CD25 em células Kit225
[00468] A atividade biológica das proteínas de fusão modificadas foi determinada medindo a capacidade de estimular IL2R endogenamente expressa na linhagem de células T, Kit225 (uma linhagem de células T humanas dependentes de IL2 de um paciente com leucemia linfocítica crônica de células T com OKT3+, -T4+, -T8- fenótipo). A atividade foi medida pelo uso de um sistema repórter sensível à cascata de sinali- zação de IL2R. Células T humanas Kit225 integradas de forma estável com o gene repórter de vagalume luciferase sob o controle da sequên- cia de ativação de IFNy (IRFI-GAS-Luc) foram cultivadas em meio contendo RPMI + Glutamax, FBS inativado pelo calor 10 %, 20 ng/mL de IL2 recombinante (Invitrogen PHCO0023), Pen/Estrep 1 % e 0,7 mg/mL de Geneticina. Um dia antes do ensaio, as células repórter fo- ram lavadas e ressuspensas em meio de ensaio (RPMI livre de verme- lho Fenol + L-glutamina, FBS inativada pelo calor 10 %, Pen/Estrep 1 %) para remover IL2 presente no meio de crescimento, depois incuba- das durante a noite a 37 ºC. No dia do ensaio, as moléculas de IL2 fo- ram diluídas em série no tampão de ensaio para uma curva de respos- ta de concentração de 11 pontos, 3 vezes, várias concentrações de moléculas de IL2 foram adicionadas a uma placa de ensaio CulturPla- te-384 (Perkin Elmer cat. No. 6007688) seguido pela adição de 70.000 células/cavidade. As placas de ensaio foram incubadas durante 5 ho- ras em uma incubadora de CO, a 37 “ºC e depois equilibradas à tempe- ratura ambiente durante 20 minutos antes de adicionar o substrato ONE-GLO'Y (Promega E6120). As placas foram seladas e os sinais luminescentes foram medidos em um Perkin Elmer Envision. 11 pon- tos de sinais luminescentes de resposta à dose de IL2 foram plotados usando GraphPad Priam. A EC50 é definida como a concentração das proteínas de fusão de IL2 de teste correspondendo a 50 % de ativação derivada da curva ajustada de 11 pontos, conforme determinado usando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros. A po- tência das proteínas de fusão na sinalização de IL2R em células pri- márias foi determinada por estimulação de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) ou sangue total com proteínas de fusão. A fosforilação da tirosina de PpSTAT5 é uma consequência ime- diata da sinalização de IL2R e foi detectada em várias populações de células no sangue total ou PBMCs por citometria de fluxo. Amostras de sangue ou PBMCs foram tratadas com diluições em série de proteínas de fusão de hlL2-CD25 por 15 minutos a 37 ºC. Após a incubação, as células foram fixadas e o sangue lisado com tampão Lyse/Fix por 10 minutos (BD Phosflow). As células foram lavadas duas vezes e, em seguida, permeabilizadas em metanol gelado em gelo durante 30 min, posteriormente lavadas duas vezes. As amostras foram, então, trata- das com Bloco de Fc Humano (ebioscience), seguido de manchamen- to com anticorpos marcados para CD3, CD4, CD8, CD25, pSTATS5, Foxp3 e CD56. Todas as amostras foram, então, analisadas por cito- metria de fluxo.
[00469] Em ensaios baseados em células in vitro, a proteína de fusão exibiu potência de ativação do receptor de IL2 que foi significati- vamente deslocada para a direita (potência mais fraca) em relação à IL2 wt. Isso é consistente com a afinidade aparente reduzida da prote- ína de fusão na forma dimérica não covalente. A adição de uma cauda de Fc à proteína de fusão produziu uma mudança adicional para uma potência mais fraca em 20-30 vezes. A remoção do marcador His ou o truncamento do terminal C teve um efeito mínimo na potência das pro- teínas de fusão. Resultados de potência relativa similares foram obti- dos no sangue total. Tabela 15A: Atividade da proteína de fusão de IL2-CD25 em células Kit225.
Proteína de Fusão EC5o (ng/ml)
1.2 WT 0,41 N=9 hIL2-CD25 (22-240)-His 138 n=2 hIL2-C145V-CD25 (22-240)-His 166 n=2 hIL2-CD25(22-212)-His 210 n=2 hIL2-CD25(22-212) 139 n=12 hIL2-CD25(22-187)-His 145 n=2 Fc1.1-7ligante-IL2-CD25(22-212 (bivalente) | 3414 n=2 hIL2-CD25(22-212)-Fc1.1 (bivalente) 3413 n=2 Table 15B. Atividade da proteína de fusão de IL2-CD25 em células Kit225.
EC50 ng/ml | STDEV % da resposta de 12 mt pe Tg Ts TT macae 5 e mm Fc-(hIL2-CD25 (22-187))2 | 67 737 264 4 97% bivalente hiL2-CD25 (quad aglicosi- | 202 | 39,4 31 3 85% lado)
[00470] A seletividade de proteínas de hlL2-CD25 incluindo hIL2- CD25 (22-212) (SEQ ID NO: 16) sinalizando em Treg sobre outros ti- pos de células pode ser medida por fosforilação monitorada de STATS após 15 min em uma população de células mistas incluindo em PBMCs ou sangue total (FIGs. 9A e 9B, respectivamente). Amostras de sangue recentemente adquiridas foram tratadas com diluições em série de hlL2-CD25 (22-212) (SEQ ID NO: 16) por 15 min a 37 ºC.
Após a incubação, as células foram processadas (fixadas e permeabi- lizadas), coradas com anticorpos marcados para CD3, CD4, CDB8, CD25, pSTAT5, Foxp3 e CD56 e analisadas por citometria de fluxo.
Treg são muito sensíveis à estimulação de IL2R por hlL2-CD25(22- 212) (SEQ ID NO: 16) com eficácia máxima de 90% de Treg respon- dendo à estimulação por super-regulação de pSTAT5 e com uma po- tência de 7 +/- 11 ng/ml.
Em contraste com a ativação robusta obser- vada em Treg, células CD4 não Treg (foxp3-), CD8 e NK foram menos efetivamente estimuladas por hlL2-CD25 (22-212) (SEQ ID NO: 16); abaixo de 50 % dessas células super-regularam pSTAT5 mesmo em concentrações de até 2700 ng/ml em média em todos os outros tipos de células (Tabela 16). No geral, a seletividade de IL2R em Treg sobre outros tipos de células é mantida ou aumentada para hlL2-CD25 (22- 212) (SEQ ID NO: 16) em relação a rhlL2. As proteínas de fusão de Fc ou HSA com IL2-CD25 mantiveram alta seletividade para Tregs no sangue total, embora com menor potência (Tabela 16).
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Exemplo 6: Atividade in vivo de Aumento de Leucócitos por Pro- teínas de Fusão de IL2-CD25 Truncadas
[00471] A capacidade das proteínas de fusão de aumentar os leu- cócitos in vivo foi testada em camundongos com sistema imunológico humanizado. Camundongos enxertados NSG-huCD34 fêmeas com 16-20 semanas de idade (NOD.Cg-Prkdc*º* IL2rgimWivSzJ, que são reconstituídos com células tronco hematopoéticas CD34+ humanas) foram adquiridos de Jackson Laboratory. Cada camundongo humani- zado foi examinado quanto à presença de células hoD45+ e células CD45+ de murino (mMCD45+) no sangue periférico por citometria de fluxo 14 semanas após o enxerto. Os camundongos foram seleciona- dos com pelo menos 25 % de enxertos de CD45 humana. As células- tronco hematopoéticas humanas enxertadas foram testadas para esta- rem livres de HIV, HBV, HCV e LOCMV (vírus da coriomeningite linfocí- tica). Os animais receberam ração padrão para roedores e água purifi- cada ad libitum e aclimatados por no mínimo 1 semana antes do uso. Todos os procedimentos usando animais foram revisados e aprovados pelo BMS Institucional Animal Care and Use Committee. A cada tercei- ro dia, camundongos enxertados NSG-huCD34 com 16-20 semanas de idade foram dosados por via subcutânea com PBS ou com proteína de fusão hulL2-CD25 (22-187), hulL2-CD25 (22-212) e HulL2-CD25 (22-240) em 10 ug/camundongo em um volume de 200 ul via subcutã- nea enquanto os animais estavam sob anestesia. Um total de três do- ses subcutâneas foram administradas no Dia 0, 3 e 6. 24 horas após a última dose, todos os grupos tratados foram anestesiados, o baço foi colhido em HBSS para análise por FACS de células Treg, T CD8 ou NK. Todas as três proteínas de fusão mostraram capacidade similar para aumentar o número de células do baço.
Exemplo 7: Estabilidade do ligante de peptídeo (G3S)3 em IL2(21- 153)-(G3S)3-CD25(22-212) em soro humano ou de camundongo
[00472] “Cromatografia líquida com o método bioanalítico baseado em espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) foi desenvolvida para apoiar a avaliação da estabilidade do ligante (G3S)3 em estudos de estabilidade sérica in vitro e em estudo PK em macaco in vivo. Após a captura de 11L2(21-153)-(G3S)3-CD25(22-212) (isto é, SEQ ID NO: 16) usando anticorpo anti-IL-2 de rato, a relação da área do pico de dois peptídeos de assinatura, DLISNINVIVLELK (do domínio de IL- 2 de 112(21-153)-(G3S)3-CD25(22-212)) e EPPPWENEATER (do do- mínio de CD25 de I1L2(21-153)-(G3S)3-CD25(22- 212)), foi usado para avaliar a estabilidade do ligante entre IL-2 e CD25. A clivagem do |i- gante e o produto clivado circulante resultante no soro resultariam em um aumento sistemático na relação de área de IL2/CD25 > 1.
[00473] Para testar o risco de clivagem do ligante de 112(21-153)- (G3S)3-CD25(22-212) in vitro, 0,5 uM de I1L2(21-153)-(G3S)3-CD25 (22-212 ) foi incubado em soro humano (Bioreclamation Cattt HMSRM- M; Lotett BRH1332647) ou soro de camundongo (Bioreclamation Cat MSESRM-BALB-M; Lotett MSE264349) em um volume total de 1,5 ml por até 72 horas a 37 ºC. As amostras (200 uL de soro) foram coleta- das em O, 4, 24, 48 e 72 horas e armazenadas a -80ºC até a análise da relação da área de pico por LC-MS/MS. Para identificar a presença de produto de clivagem circulante devido à clivagem do ligante in vivo após uma dose única de IL2(21-153)-(G3S)3-CD25(22-212) em maca- co, amostras de soro coletadas em 5, 24, 48, 72, 96 e 168 horas após a dose foram analisadas quanto à relação da área do pico por LC- MS/MS.
[00474] “Como mostrado na FIG. 10, a relação da área do pico de peptídeos de assinatura em domínios IL2 e CD25 de 1L2(21-153)- (G3S)3-CD25(22-212) permaneceu perto da unidade ao longo de 72 horas de incubação in vitro em soro humano ou de camundongo a 37ºC, portanto indicando clivagem do ligante desprezível em 1L2(21- 153)-(G3S)3-CD25(22-212) tanto no soro humano quanto no soro de camundongo.
[00475] Além disso, como mostrado na FIG. 11, em amostras de soro coletadas do macaco após uma única dose subcutânea de 0,075 mg/kg de IL2(21-153)-(G3S)3-CD25(22-212), relação de peptídeos substitutos de IL2 e CD25 após imunocaptura usando anti-IL2, perma- neceu próxima da unidade. Os dados sugerem ausência da clivagem do ligante no soro de macacos dosados com IL2(21-153)-(G3S)3- CD25(22-212) (isto é, SEQ ID NO: 16).

Claims (115)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que com- preende: (a) um primeiro polipeptídeo compreendendo um polipeptí- deo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de um polipeptídeo do Receptor alfa de Interleucina-2 (IL2Ra); em que (i) o domínio extracelular do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com o do- mínio extracelular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7); e/ou (ii) o polipep- tídeo de I|L2 tem pelo menos uma glicosilação a menos em compara- ção com IL2 nativa (SEQ ID NO: 2); e em que a proteína de fusão tem atividade de IL2.
2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que o domínio extracelular do polipeptídeo de IL2Ra tem pelo menos uma glicosilação a menos, pelo menos duas glicosilações a menos, pelo menos três glicosilações a menos, pelo menos quatro glicosilações a menos, pelo menos cinco glicosilações a menos, pelo menos seis glicosilações a menos, pelo menos sete glico- silações a menos, pelo menos oito glicosilações a menos ou pelo me- nos nove glicosilações a menos em comparação com o domínio extra- celular de IL2Ra nativa (SEQ ID NO: 7).
3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de IL2 tem pelo menos uma glicosilação a menos em comparação com |IL2 nativa (SEQ ID NO: 2).
4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptí- deo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de
60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à SEQ ID NO: 2.
5. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptí- deo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 % idêntica à SEQ ID NO: 12.
6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o domínio extracelu- lar do polipeptídeo de IL2Ra tendo pelo menos uma glicosilação a me- nos compreende uma mutação que remove uma glicosilação.
7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a mutação remove uma O-glicosilação e/ou uma N-glicosilação.
8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizada pelo fato de que a mutação remove uma O-glicosilação.
9. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizada pelo fato de que a mutação remove uma N-glicosilação.
10. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a mutação é uma deleção dos aminoácidos 167 a 219, aminoácidos 168 a 219, aminoá- cidos 169 a 219, aminoácidos 170 a 219, aminoácidos 171 a 219, ami- noácidos 172 a 219, aminoácidos 173 a 219, aminoácidos 174 a 219, aminoácidos 175 a 219, aminoácidos 176 a 219, aminoácidos 177 a
219, aminoácidos 178 a 219, aminoácidos 179 a 219, aminoácidos, 180 a 219 aminoácidos, 181 a 219 aminoácidos, 182 a 219 aminoáci- dos, 183 a 219 aminoácidos, 184 a 219 aminoácidos, 185 a 219 ami- noácidos, 186 a 219 aminoácidos, 187 a 219 aminoácidos, 188 a 219 aminoácidos, 189 a 219 aminoácidos, 190 a 219 aminoácidos, 191 a 219 aminoácidos ou 192 a 219 aminoácidos, correspondendo a SEQ ID NO: 7.
11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptídeo é SEQ ID NO:
11.
12. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o segundo polipeptídeo é SEQ ID NO:
12.
13. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que é glicosilado com um aminoácido que não é glicosilado.
14. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que permite a glicosilação em um aminoácido próximo com um aminoácido que não permite a glicosi- lação no aminoácido próximo.
15. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições estão no aminoácido N49, aminoácido N68, aminoácido T74, aminoácido T85, aminoácido T197, aminoácido T203, aminoácido T208 e aminoácido T216, ou qualquer combinação dos mesmos, em que as localizações dos aminoácidos correspondem à SEQ ID NO: 7.
16. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de aspa-
ragina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, feni- lalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
17. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de treo- nina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
18. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido N49.
19. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que N49 é mutado para um aminoácido se- lecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
20. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido N68.
21. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que N68 é mutado para um aminoácido se- lecionado a partir do grupo que consiste em alanina, treonina, serina, arginina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
22. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizada pelo fato de que uma das substi-
tuições é o aminoácido T74.
23. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que T74 é mutado para um aminoácido se- lecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspara- gina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, his- tidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
24. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T85.
25. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que T85 é mutado para um aminoácido se- lecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspara- gina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, his- tidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
26. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T197.
27. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que T197 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, se- rina, triptofano, tirosina e valina.
28. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 27, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T203.
29. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que T203 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, se- rina, triptofano, tirosina e valina.
30. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T208.
31. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que T208 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, se- rina, triptofano, tirosina e valina.
32. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 31, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T216.
33. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que T216 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, se- rina, triptofano, tirosina e valina.
34. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições estão no aminoácido S50, aminoácido S51, aminoácido T69, aminoácido T70, aminoácido C192 ou qualquer combinação dos mesmos, em que as localizações dos aminoácidos correspondem à SEQ ID NO: 7.
35. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que uma das substituições está no aminoá- cido S50.
36. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que S50 é mutado para prolina.
37. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido S51.
38. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que S51 é mutado para um aminoácido se- lecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspara- gina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, his- tidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, tirosina e valina.
39. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T69.
40. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que T69 é mutado para prolina.
41. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido T70.
42. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que T70 é mutado para um aminoácido se- lecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspara- gina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, his- tidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, treo- nina, triptofano, tirosina e valina.
43. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 42, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições é o aminoácido C192.
44. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que C192 é mutado para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treo- nina, triptofano, tirosina e valina.
45. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de IL2 tendo pelo menos uma glicosilação a menos compreende uma mu- tação que remove uma glicosilação.
46. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que é glicosilado com um aminoácido que não é glicosilado.
47. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a mutação é uma ou mais substituições de um aminoácido que permite a glicosilação em um aminoácido pró- ximo com um aminoácido que não permite a glicosilação no aminoáci- do próximo.
48. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de uma alanina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
49. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de uma treonina para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.
50. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46 ou
47, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de uma cisteína para um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
51. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma serina.
52. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma alanina.
53. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições são de uma cisteína para uma valina.
54. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que uma ou mais substituições estão no aminoácido T3 em comparação com o correspondente à SEQ ID NO:
2.
55. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 54, caracterizada pelo fato de que uma das substi- tuições está no aminoácido C125.
56. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que a substituição no aminoácido C125 é selecionada a partir do grupo que consiste em C1258S, C125A e C125V.
57. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a mutação é uma deleção.
58. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a deleção está no aminoácido A1.
59. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizada pelo fato de que a proteína de fu- são é desglicosilada enzimaticamente ou quimicamente.
60. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é desglicosilada por álcali, hidrazinólise, PNGase F, Endo H, O-glicosidase ou qualquer combinação dos mesmos.
61. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de que compreende ain- da um ligante fundido na estrutura entre o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo.
62. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que o ligante é um ligante de glicina/serina.
63. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que o ligante de glicina/serina compreende uma sequência de aminoácidos de (GS)n, (GGS)n, (GGGS)n, (GGGGS), ou (GGGGS)r, em que n é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9 ou 10.
64. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que o ligante de glicina/serina compreende a sequência de aminoácidos de (GGGS):.
65. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizada pelo fato de que a proteína de fu- são compreende ainda uma porção heteróloga fundida ao primeiro po- lipeptídeo e/ou ao segundo polipeptídeo.
66. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que a porção heteróloga é uma porção de prolongamento da meia-vida.
67. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizada pelo fato de que a porção heteróloga compreende uma porção não polipeptídica.
68. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizada pelo fato de que a porção heteróloga compreende um polipeptídeo.
69. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que a porção heteróloga compreende albu- mina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção desta, um polipeptídeo de ligação à imunoglobulina, uma imunoglobulina G (IgG), polipeptídeo de ligação à albumina (ABP), uma porção de PASi- lação uma porção de HESilação, XTEN, uma porção de PEGilação, uma região Fc e qualquer combinação dos mesmos.
70. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizada pelo fato de que a proteína de fu- são é mais estável do que o polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13.
71. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem uma ou mais propriedades selecionadas a partir do grupo que consiste em (i) estabi- lidade termodinâmica aumentada em comparação com uma proteína de referência; (ii) TM aumentada em comparação com uma proteína de referência; (ili) resistência aumentada à degradação em compara- ção com uma proteína de referência; (iv) resistência aumentada a mo- dificações em comparação com uma proteína de referência; (v) estabi- lidade aumentada in vivo em comparação com uma proteína de refe- rência; e (vi) qualquer combinação dos mesmos, em que a proteína de referência compreende (i) um primeiro polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de Interleucina-2 (IL2); e (b) um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de um polipeptídeo do Re- ceptor alfa de Interleucina-2 (IL2Ra); e tem pelo menos mais uma gli- cosilação em comparação com a proteína de fusão.
72. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizada pelo fato de que é um monômero.
73. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72, caracterizada pelo fato de que é um dímero.
74. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o dímero compreende dois monômeros e os monômeros estão associados entre si por meio de ligações cova- lentes.
75. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o dímero compreende dois monômeros e os monômeros estão associados por meio de ligações não covalen- tes.
76. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizada pelo fato de que tem uma ou mais propriedades farmacocinéticas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma meia-vida aumentada, Cmáx aumentada, AUC aumen- tada, Cmin aumentada, depuração diminuída, biodisponibilidade melho- rada e qualquer combinação dos mesmos, em comparação com a propriedade farmacocinética do polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13.
77. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que tem meia-vida prolongada.
78. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que a meia-vida prolongada é pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 ve- zes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 11 vezes, pelo menos cerca de 12 vezes, pelo menos cerca de 13 vezes, pelo menos cerca de 14 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 16 vezes,
pelo menos cerca de 17 vezes, pelo menos cerca de 18 vezes, pelo menos cerca de 19 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 21 vezes, ou pelo menos cerca de 22 vezes em comparação com a meia-vida de um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 13.
79. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de a proteína de fusão como definida na reivindicação 72 e a proteína de fusão como definida na reivindicação 73.
80. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
78.
81. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 80.
82. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 80.
83. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de ser uma célula eucariótica.
84. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 82, a célula hospedeira caracterizada pelo fato de ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula de mamífero, uma célula de in- seto, uma célula de levedura, uma célula de mamífero transgênica e uma célula de planta.
85. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 84, a célula hospedeira caracterizada pelo fato de ser uma célula de mamí- fero.
86. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de ser uma célula procariótica.
87. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 86, caracterizada pelo fato da célula procariótica ser uma célula bacteria- na.
88. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (a) a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 78, a composição como definida na reivin- dicação 79, o ácido nucleico como definido na reivindicação 80, o vetor como definido na reivindicação 81 ou a célula hospedeira como defini- da em qualquer uma das reivindicações 82 a 87; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
89. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a prote- ína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 78, a composição como definida na reivindicação 79, o ácido nucleico como definido na reivindicação 80, o vetor como definido na reivindi- cação 81 ou a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 87 e instruções para administrar a proteína de fu- são a um indivíduo em necessidade do mesmo.
90. Método de produção da proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar a célula hospedeira, como definida em qualquer uma das reivindicações 82 a 87, sob condições adequadas e recuperar a proteína de fusão.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou uma célula procariótica.
92. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de fungo, uma célula de planta, uma célula de mamífero transgênica ou uma célula bacteriana.
93. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula CHO, uma célula HEK 293, uma célula NSO, uma célula Per C6, uma célula BHK e uma célula COS.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana.
95. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 87 ou método, como definido na reivindicação 94, caracterizada pelo fato de que a célula bacteriana é Escherichia coli.
96. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio de um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade efi- caz da proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 78, a composição como definida na reivindicação 79, o áci- do nucleico como definido na reivindicação 80, o vetor como definido na reivindicação 81, a célula hospedeira como definida na reivindica- ção 82, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação
88.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio é câncer.
98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma endometrial, câncer ovariano, câncer color- retal, câncer de cólon, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pul- mão, câncer de estômago, câncer de células germinativas, câncer ós- seo, câncer de células escamosas, câncer de pele, neoplasia do sis- tema nervoso central, linfoma, leucemia, sarcoma, câncer relacionado a vírus, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin ou não Hodgkin, câncer pancreático, glioblastoma, glioma, câncer cervi- cal, câncer ovariano, câncer de fígado, mieloma, carcinoma de glându- la salivar, câncer de rim, carcinoma basocelular, melanoma, câncer de próstata, câncer vulval, câncer de tireoide, câncer de testículo, câncer de esôfago, ou câncer de cabeça ou pescoço, e quaisquer combina-
ções dos mesmos,
99. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença inflamatória ou uma doença autoimune.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que a doença inflamatória ou uma doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em diabetes tipo |, escle- rose múltipla, artrite reumatoide, doença celíaca, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite por lúpus, lúpus cutâneo, artrite idiopática juvenil, doença de Crohn, colite ulcerativa ou esclerose sistêmica, doença do enxerto versus hospedeiro, psoríase, alopecia em áreas, vasculite in- duzida por HCV, síndrome de Sjogren, Pênfigo, Espondilite Ancilo- sante, Doença de Behcet, Granulomatose de Wegener, Doença de Takayasu, Hepatite Autoimune, Colangite Esclerosante, Gougerot- sjógren e Síndrome da Ativação de Macrófagos.
101. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteri- zado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que a doença infecciosa é causada por um vírus pa- togênico.
103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracteri- zado pelo fato de que o vírus patogênico é selecionado a partir do gru- po que consiste em vírus da imunodeficiência humana (HIV), hepatite A, hepatite B, hepatite C, vírus do herpes, adenovírus, vírus influenza, flavivírus, echovírus, rinovírus, vírus coxsackie, coronavírus, vírus sin- cicial respiratório, vírus da caxumba, rotavírus, vírus do sarampo, vírus da rubéola, parvovírus, vírus da vacínia, vírus T-linfotrópico humano (HTL), vírus da dengue, papilomavírus, vírus do molusco, poliovírus, vírus da raiva, vírus de John Cunningham (JC) e vírus da encefalite arboviral.
104. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que a doença infecciosa é causada por bactérias pa- togênicas.
105. Método, de acordo com a reivindicação 104, caracteri- zado pelo fato de que a bactéria patogênica é selecionada a partir do grupo que consiste em clamídia, bactérias rickettsiais, micobactérias, estafilococos, estreptococos, pneumonococos, meningococos e gono- cocos, Kklebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionela, diftéria, salmonela, bacilos, cólera, tétano, botulismo, antraz, peste, leptospiro- se e bactérias da doença de Lymes.
106. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que a doença infecciosa é causada por fungos pato- gênicos.
107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que a bactéria patogênica é selecionada a partir do grupo que consiste em Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Gênero Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
108. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que a doença infecciosa é causada por um parasita patogênico.
109. Método, de acordo com a reivindicação 108, caracteri- zado pelo fato de que o parasita patogênico é selecionado a partir do grupo que consiste em Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Nae- gleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanoso- ma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii e Nippostrongylus brasiliensis.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 96 a 109, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ad- ministrar ao indivíduo um segundo agente.
111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente é um antagonista de PD-1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de TIM3, um antagonista de GITR, um antagonista de KIR, um antagonista de LAG3 ou qual- quer combinação dos mesmos.
112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o segundo agente é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti- TIM3, um anticorpo anti-KIR, um anticorpo anti-GITR, um anticorpo anti-LAG3 ou qualquer combinação dos mesmos.
113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 110 a 112, caracterizado pelo fato de que o segundo agente é um inibidor de citocina.
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor de citocina é direcionado a um ou mais dentre IL-6, IL-10, TGF-B, VEGF, IFN-y ou qualquer combinação dos mesmos.
115. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 96 a 114, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão é administrada por via tópica, mucosal epidérmica, intranasal, oral, vagi- nal, retal, sublingual, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intra- orbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuti- cular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural ou intraesternal.
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