TW202327642A - 一種含融合蛋白的醫藥組成物 - Google Patents

一種含融合蛋白的醫藥組成物 Download PDF

Info

Publication number
TW202327642A
TW202327642A TW111132118A TW111132118A TW202327642A TW 202327642 A TW202327642 A TW 202327642A TW 111132118 A TW111132118 A TW 111132118A TW 111132118 A TW111132118 A TW 111132118A TW 202327642 A TW202327642 A TW 202327642A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
pharmaceutical composition
buffer
seq
histidine
concentration
Prior art date
Application number
TW111132118A
Other languages
English (en)
Inventor
馬夏珍
田晨敏
李小菲
Original Assignee
大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
大陸商上海盛迪醫藥有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司, 大陸商上海盛迪醫藥有限公司 filed Critical 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Publication of TW202327642A publication Critical patent/TW202327642A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/246—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

本揭露關於一種含融合蛋白的醫藥組成物；具體地，本揭露關於包含含有共價結合的IL-2與抗IL-2抗體的融合蛋白的醫藥組成物及其用途。

Description

一種含融合蛋白的醫藥組成物
本揭露屬於藥物製劑領域，具體地，本揭露關於一種包含含有共價結合的IL-2與抗IL-2抗體的融合蛋白的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。
這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
人白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)，也稱為T細胞生長因子(TCGF)，基因位於4號染色體(4q27)，包括共7kb的序列，由133個胺基酸組成，分子量約15kD。1976年和1977年，Doris Morgan，Francis Ruscetti，Robert Gallo和Steven Gillis，Kendal Smith等分別發現活化後的T細胞培養液可以促進T細胞增殖。之後培養液中的刺激因子被純化並被鑑定為單一的蛋白質即IL-2。
IL-2藉由細胞表面的IL-2R發生作用。IL-2R包括三個亞基，IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。三個亞基可以形成三種受體形式：高結合力受體包含所有三個亞基IL-2Rα/β/γ，中結合力受體包含IL-2Rβ/γ，低結合力受體為IL-2Rα。其中，IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下 游信號通路所必需的，當IL-2同時結合IL-2Rβ和IL-2Rγ時，兩個受體亞基形成異源二聚體，磷酸化細胞內的STAT5，進入細胞核導致相應的基因轉錄和表達；IL-2Rα並非信號傳導所必需，但可以增強IL-2與IL-2Rβ和IL-2Rγ的結合。Treg持續表達高結和力受體IL-2Rα/β/γ，而未被激活的CD8+ T細胞和NK細胞等只表達中結合力受體IL-2Rβ/γ。因此，低劑量IL-2優先結合並激活Treg，而高劑量IL-2則也可以激活CD8+ T細胞和NK細胞等免疫效應細胞。
由於Treg具有免疫抑制作用，而低劑量IL-2具有優先激活Treg的性質，因此低劑量IL-2被報導可以用於一系列免疫相關，如自身免疫疾病和炎性疾病的治療、例如系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、I型糖尿病(type I diabetes，T1D)、慢性移植物對抗宿主疾病(chronic Graft versus Host Disease，cGvHD)、骨髓移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)、斑禿(alopecia areata)、C型肝炎病毒誘導的血管炎(hepatitis C virus-induced vasculitis)、慢性GvHD、哮喘、皮炎、斑禿、急性肺損傷、慢性鈹塵病、敗血症等。在很多接受低劑量IL-2處理的患者中，Treg與效應T細胞的比例均有上升，症狀也有所緩解。然而一方面，IL-2半衰期較短，需要頻繁給藥；另一方面，IL-2的給藥窗口較小，如果劑量略高，則可能激活免疫效應細胞，加重自身免疫疾病。這些IL-2本身的性質或缺點使得IL-2難以在患者體內保持持續的低劑量，限制了其進一步應用。
本揭露提供一種含融合蛋白的醫藥組成物。該組成物具有治療活性。此外，該組成物還可具有穩定性好，適於凍乾等優勢。
在一些實施方案中，本揭露提供一種醫藥組成物，包含融合蛋白和緩衝劑，其中該融合蛋白包含共價結合的IL-2與抗IL-2抗體，該緩衝劑為組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸緩衝劑或醋酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或醋酸-醋酸鈉緩衝劑。在一些實施方案中，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的pH為5.0-6.5。在一些實施方案中，該緩衝劑的pH為5.0-6.0。在一些實施方案中，該緩衝劑的pH為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。在一些實施方案中，該緩衝劑的pH為5.5-6.0。在一些實施方案中，該緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH相比其含有的緩衝劑的pH具有不超過±0.3的差異。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物的pH為5.0-6.5。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為6.0-6.5。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為6.0-6.3。在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該融合蛋白的濃度為5mg/mL至50mg/mL。在一些實施方案中，該融合蛋白的濃度為5mg/mL至30mg/mL。在一些實施方案中，該融合蛋白的濃度為10mg/mL至30mg/mL。在一些實施方案中，該融合蛋白的濃度為5mg/mL、10mg/mL、15 mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL。在一些實施方案中，該融合蛋白的濃度為30mg/mL。在一些實施方案中，該融合蛋白的濃度為10mg/mL。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含表面活性劑。在一些實施方案中，該表面活性劑是非離子表面活性劑。在一些實施方案中，該表面活性劑選自聚山梨酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等。在一些實施方案中，該表面活性劑為聚山梨酯或泊洛沙姆。在一些實施方案中，該表面活性劑為聚山梨酯80(PS80)、聚山梨酯20(PS20)或泊洛沙姆188(PF68)。在一些實施方案中，該表面活性劑為聚山梨酯80或泊洛沙姆188。在一些實施方案中，該表面活性劑為泊洛沙姆188。在一些實施方案中，該表面活性劑為聚山梨酯80。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該表面活性劑濃度為0.05mg/mL至2mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.05mg/mL至1.0mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.1mg/mL至0.8mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.1mg/mL至0.6mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.2mg/mL至0.6mg/mL。在一些實施 方案中，該表面活性劑濃度為0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL或2.0mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為1.6mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為1.5mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.8mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.6mg/mL。在一些實施方案中，該表面活性劑濃度為0.4mg/mL。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含糖。在一些實施方案中，所述糖選自常規組成物(CH2O)n及其衍生物，包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原性糖、非還原性糖等等。該的糖可選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇、甘露醇、密裡二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等。在一些實施方案中，該糖選自蔗糖、甘露醇和海藻糖中的一種或多種。在一些實施方案中，該糖為蔗糖。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，在一些實施方案中，該糖的濃度為20mg/mL至100mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為30mg/mL至80mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為40mg/mL至80mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為30mg/mL至50mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為20mg/mL、30mg/mL、36mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、87mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。 在一些實施方案中，該糖的濃度為87mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為80mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為50mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為45mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為40mg/mL。在一些實施方案中，該糖的濃度為36mg/mL。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含輔料。在一些實施方案中，該輔料為甘胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、鹽酸精胺酸、谷胺酸、天冬胺酸或乙二胺四乙酸二鈉。在一些實施方案中，該輔料為甘胺酸。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為1mg/mL至30mg/mL；較佳地，輔料的濃度為5mg/mL至15mg/mL。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為12mg/mL。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為10mg/mL。在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為9mg/mL。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該緩衝劑的濃度為5mM至100mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為5mM至30mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為10mM至30mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為5mM至10mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為10mM。在一些實施方案中，該緩衝劑的濃度為5mM。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體與IL-2的親和力的KD值
Figure 111132118-A0202-12-0007-94
5nM。在另一些實施方案中，該抗IL-2抗體與IL-2的親和力的KD值>5nM或
Figure 111132118-A0202-12-0007-95
10nM，且
Figure 111132118-A0202-12-0007-96
200nM或
Figure 111132118-A0202-12-0007-97
150nM或
Figure 111132118-A0202-12-0007-98
100nM或
Figure 111132118-A0202-12-0007-99
80nM或
Figure 111132118-A0202-12-0007-100
60nM。在一些實施方案中，該KD值>5nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-101
60nM，>5nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-102
50nM，
Figure 111132118-A0202-12-0007-103
10nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-104
50nM，
Figure 111132118-A0202-12-0007-105
10nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-106
60nM，>5nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-107
80nM，
Figure 111132118-A0202-12-0007-108
10nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-109
80nM，>5nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-111
100nM，
Figure 111132118-A0202-12-0007-112
10nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-114
100nM，>5nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-115
150nM，或
Figure 111132118-A0202-12-0007-116
10nM且
Figure 111132118-A0202-12-0007-117
150nM。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
SEQ ID NO：13、19、25、31、37或43所示的HCDR1，和/或
SEQ ID NO：14、20、26、32、38或44所示的HCDR2，和/或
SEQ ID NO：15、21、27、33、39或45所示的HCDR3，和/或
SEQ ID NO：16、22、28、34、40或46所示的LCDR1，和/或
SEQ ID NO：17、23、29、35、41或47所示的LCDR2，和/或
SEQ ID NO：18、24、30、36、42或48所示的LCDR3。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
SEQ ID NO：13、25或37所示的HCDR1，和/或
SEQ ID NO：14、26或38所示的HCDR2，和/或
SEQ ID NO：15、27或39所示的HCDR3，和/或
SEQ ID NO：16、28或40所示的LCDR1，和/或
SEQ ID NO：17、29或41所示的LCDR2，和/或
SEQ ID NO：18、30或42所示的LCDR3。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
SEQ ID NO：19、31或43所示的HCDR1，和/或
SEQ ID NO：20、32或44所示的HCDR2，和/或
SEQ ID NO：21、33或45所示的HCDR3，和/或
SEQ ID NO：22、34或46所示的LCDR1，和/或
SEQ ID NO：23、35或47所示的LCDR2，和/或
SEQ ID NO：24、36或48所示的LCDR3。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
SEQ ID NO：13-15所示的HCDR1-3，和/或SEQ ID NO：16-18所示的LCDR1-3；
SEQ ID NO：19-21所示的HCDR1-3，和/或SEQ ID NO：22-24所示的LCDR1-3；
SEQ ID NO：25-27所示的HCDR1-3，和/或SEQ ID NO：28-30所示的LCDR1-3；
SEQ ID NO：31-33所示的HCDR1-3，和/或SEQ ID NO：34-36所示的LCDR1-3；
SEQ ID NO：37-39所示的HCDR1-3，和/或SEQ ID NO：40-42所示的LCDR1-3；
SEQ ID NO：43-45所示的HCDR1-3，和/或SEQ ID NO：46-48所示的LCDR1-3。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11之一所示或與之具有至少90%、95%、98%、99%同一性的VH；和/或
如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12之一所示或與之具有至少90%、95%、98%、99%同一性的VH。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少90%同一性的VH，如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少90%同一性的VL；
如SEQ ID NO：3所示或與之具有至少90%同一性的VH，如SEQ ID NO：4所示或與之具有至少90%同一性的VL；
如SEQ ID NO：5所示或與之具有至少90%同一性的VH，如SEQ ID NO：6所示或與之具有至少90%同一性的VL；
如SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%同一性的VH，如SEQ ID NO：8所示或與之具有至少90%同一性的VL；
如SEQ ID NO：9所示或與之具有至少90%同一性的VH，如SEQ ID NO：10所示或與之具有至少90%同一性的VL；或
如SEQ ID NO：11所示或與之具有至少90%同一性的VH，如SEQ ID NO：12所示或與之具有至少90%同一性的VL。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體的可變區與CDR採用Kabat編號系統。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體的重鏈可變區(VH)與人IgG1重鏈恆定區連接，輕鏈可變區(VL)與kappa或lamda鏈恆定區連接。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
如SEQ ID NO：157、159、161、163、165、167之一所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的HC；和/或
如SEQ ID NO：158、160、162、164、166、168之一所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的LC。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含
如SEQ ID NO：157所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的全長重鏈(HC)，如SEQ ID NO：158所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的全長輕鏈(LC)；
如SEQ ID NO：159所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的HC，如SEQ ID NO：160所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的LC；
如SEQ ID NO：161所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的HC，如SEQ ID NO：162所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的LC；
如SEQ ID NO：163所示或與之具有至少90%同一性的HC，如SEQ ID NO：164所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的LC；
如SEQ ID NO：165所示或與之具有至少90%同一性的HC，如SEQ ID NO：166所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的LC；或
如SEQ ID NO：167所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的HC，如SEQ ID NO：168所示或與之具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的LC。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體為Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)，例如具體為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白中的IL-2與抗IL-2抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區連接，例如，IL-2與抗IL-2抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區的N端連接。在一些實施方案中，IL-2與抗IL-2抗體的輕鏈可變區的N端連接。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白中的IL-2與抗IL-2抗體藉由連接子連接。在一些實施方案中，該連接子是柔性肽連接子。在一些實施方案中，該連接子的胺基酸長度為5-50、10-40、20-30或25。在一些實施方案中，該連接子選自：如(GmSn)x或(GGNGT)x或(YGNGT)x所示的胺基酸序列，其中m、n各自獨立地選自1-8的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x獨立地選自1-20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在一些具體實施方案中，該連接子具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，x獨立地選自1-6的整數(例 如，x為4或5)。該連接子還可以為與上述(GmSn)x或(GGNGT)x或(YGNGT)x所示的胺基酸序列具有類似柔性和長度的其他連接子。在一些實施方案中，該連接子的胺基酸序列如SEQ ID No：190所示。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白選擇性增強高表達IL-2Ra的細胞的活性或促進其增殖，該高表達IL-2Ra的細胞例如為調節性T(Treg)細胞。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白中的IL-2存在第三位胺基酸(作為一個示例，T3)的胺基酸取代或N端缺失。一些具體實施方案中，IL-2的第三位胺基酸取代為Ala、Gln或Glu(作為一個示例，T3A、T3Q、T3E)，N端缺失為N端前3個或前7個胺基酸缺失。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白包含選自以下組的HC和LC：
SEQ ID No：169所示的HC，SEQ ID No：158所示的LC；
SEQ ID No：171所示的HC，SEQ ID No：160所示的LC；
SEQ ID No：159所示的HC，SEQ ID No：172所示的LC；
SEQ ID No：173所示的HC，SEQ ID No：162所示的LC；
SEQ ID No：175所示的HC，SEQ ID No：164所示的LC；
SEQ ID No：163所示的HC，SEQ ID No：176所示的LC；
SEQ ID No：177所示的HC，SEQ ID No：166所示的LC；
SEQ ID No：179所示的HC，SEQ ID No：168所示的LC；
SEQ ID No：167所示的HC，SEQ ID No：180所示的LC；
SEQ ID No：161所示的HC，SEQ ID No：174、181-186任一所示的LC；
SEQ ID No：157所示的HC，SEQ ID No：170、187所示的LC；
SEQ ID No：165所示的HC，SEQ ID No：178、188、189任一所示的LC；
或與上述HC、LC具有至少80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白選擇性的增強了IL-2對Treg活性的作用(例如促增殖活性、促STAT5磷酸化活性)，和/或選擇性地提高IL-2促Treg細胞中FOXP3、CD25和Icos中的一種或多種表達的能力。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該融合蛋白還具有(i)-(iii)中的一項或多項：
(i)對Treg的活性激活程度高於對CD8+T細胞的活性激活程度；
(ii)相較於在CD8+T細胞中，在Treg細胞中對STAT5磷酸化的促進程度更高；
(iii)相較於CD8+T細胞、CD4+T細胞或NK細胞的增殖，對Treg細胞的增殖促進程度更高。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該抗IL-2抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區具有：包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變區具有：包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列的LCDR3。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：10的胺基 酸序列。在一些實施方案中，該抗IL-2抗體包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的重鏈和SEQ ID NO：166的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該IL-2直接或藉由連接子融合至抗IL-2抗體的輕鏈的N端。在一些實施方案中，該IL-2的第3位胺基酸残基為E。在一些實施方案中，該融合蛋白包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的重鏈和SEQ ID NO：189的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.05mg/mL至2mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)20mg/mL至100mg/mL的糖，和(d)10mM至30mM的組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑，該緩衝劑的pH為5.5至6.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)30mg/mL至80mg/mL的糖，和(d)10mM至30mM的組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑，該緩衝劑的pH為5.5至6.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)40mg/mL至80mg/mL的糖，和(d)10mM至30mM的組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑，該緩衝劑的pH為5.5至6.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)40mg/mL至80mg/mL的糖，和(d)10mM至30mM的組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑，該緩衝劑的pH為5.5至6.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)40mg/mL至80mg/mL的糖，和(d)10mM至30mM的組胺酸緩衝劑，該組胺酸緩衝劑的pH為5.5至6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.6mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)40mg/mL至80mg/mL的糖，和(d)10mM至30mM的組胺酸緩衝劑，該組胺酸緩衝劑的pH為5.5至6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的醋酸鹽緩衝劑，該醋酸鹽緩衝劑的pH為5.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑，該緩衝劑的pH為5.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸緩衝劑，該組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸緩衝劑，該組胺酸緩衝劑的pH為6.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的醋酸鹽緩衝劑，該醋酸鹽緩衝劑的pH為5.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的海藻糖，和(d)10mM的醋酸鹽緩衝劑，該醋酸鹽緩衝劑的pH為5.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.6mg/mL的泊洛沙姆188，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的醋酸鹽緩衝劑，該醋酸鹽緩衝劑的pH為5.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.6mg/mL的泊洛沙姆188，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸緩衝劑，該組胺酸緩衝劑的pH為5.5。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.6mg/mL的泊洛沙姆188，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為5.5至6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.6mg/mL的泊洛沙姆188，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.6mg/mL的泊洛沙姆188，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.6mg/mL的聚山梨酯80，(c)80mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.4mg/mL的聚山梨酯80，(c)87mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)87mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)30mg/mL的該融合蛋白，(b)1.5mg/mL的聚山梨酯80，(c)87mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，(c)30mg/mL至80mg/mL的蔗糖，(d)1mg/mL至30mg/mL的甘胺酸，和(e)5mM至10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)30mg/mL至50mg/mL的蔗糖，(d)5mg/mL至15mg/mL的甘胺酸，和(e)5mM至10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)1.6mg/mL的聚山梨酯80，(c)36mg/mL的蔗糖，(d)12mg/mL甘胺酸，和(e)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)36mg/mL的蔗糖，和(d)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)36mg/mL的蔗糖，(d)12mg/mL甘胺酸，和(e)5mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)36mg/mL的蔗糖，(d)12mg/mL甘胺酸，和(e)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)1.6mg/mL的聚山梨酯80，(c)36mg/mL的蔗糖，(d)12mg/mL甘胺酸，和(e)5mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)50mg/mL的蔗糖，(d)9mg/mL甘胺酸，和(e)5mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)50mg/mL的蔗糖，(d)9mg/mL甘胺酸，和(e)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)45mg/mL的蔗糖，(d)10mg/mL甘胺酸，和(e)5mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)45mg/mL的蔗糖，(d)10mg/mL甘胺酸，和(e)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)40mg/mL的蔗糖，(d)10mg/mL甘胺酸，和(e)5mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
(a)10mg/mL的該融合蛋白，(b)0.8mg/mL的聚山梨酯80，(c)40mg/mL的蔗糖，(d)10mg/mL甘胺酸，和(e)10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
本揭露的數值範圍旨在包括該範圍內的每個數字和數字子集，無論是否被明確地公開。
在一些實施方案中，如上任一項所述的醫藥組成物，該醫藥組成物是液體製劑。在一些實施方案中，該液體製劑的溶劑是水。在一些實施方案中，該組成物的施用途徑為皮下注射、皮內注射、靜脈注射或肌內注射。在一些實施方案中，該組成物的施用途徑為皮下注射。
本揭露還提供一種的凍乾製劑，其特徵在於該凍乾製劑復溶後可形成如上任一項所述的醫藥組成物。本揭露還提供一種的凍乾製劑，其為如上任一項所述的醫藥組成物的凍乾形式。
本揭露還提供一種製備凍乾製劑的方法，其中包括將如上任一項所述的醫藥組成物進行冷凍乾燥的步驟。
本揭露還提供一種凍乾製劑，該製劑藉由將如上任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
本揭露還提供一種復溶溶液，其特徵在於該復溶溶液是藉由將如上任一項所述的凍乾製劑復溶製備的。本揭露還提供一種的凍乾製劑，其為如上任一項所述的凍乾製劑的復溶形式。
本揭露還提供一種製品，其包括容器，該容器中装有如上任一項所述的醫藥組成物、如上任一項所述的凍乾製劑或如上任一項所述的復溶溶液。
在一些實施方案中，本揭露還提供如上任一項所述的醫藥組成物、如上任一項的凍乾製劑、如上任一項的復溶溶液或如上任一項所述的製品在製備治療自身免疫疾病或延緩自身免疫疾病進展的藥物中的用途。
本揭露還提供一種治療自身免疫疾病或延緩自身免疫疾病進展的方法，包括給予患者有效量的如上任一項所述的醫藥組成物、如上任一項的凍乾製劑、如上任一項的復溶溶液或如上任一項所述的製品。
在一些實施方案中，本揭露還提供如上任一項所述的醫藥組成物、如上任一項的凍乾製劑、如上任一項的復溶溶液或如上任一項所述的製品，其用於治療自身免疫疾病或延緩自身免疫疾病進展。
在一些實施方案中，該自身免疫疾病選自以下的任一項或組合：狼瘡、移植物抗宿主病、C型肝炎誘導的脈管炎、I型糖尿病、多發性硬化、炎性腸病、慢性GvHD、哮喘、皮炎、斑秃、急性肺損傷、敗血症、反應性關節炎、類風濕性關節炎。
圖1A和圖1B分別為抗IL-2抗體阻斷IL-2與IL-2Rα和IL-2Rβ結合的ELISA實驗結果；其中圖1A為抗IL-2抗體阻斷IL-2與IL-2Rα結合的ELISA結果；圖1B為抗IL-2抗體阻斷IL-2與IL-2Rβ結合的ELISA結果。
圖2為藉由ELISA實驗檢測抗IL-2抗體與IL-2的結合能力的結果。
圖3A至圖3H為抗IL-2抗體與IL-2的非共價複合體刺激人外周血Treg和CD8+T細胞STAT5磷酸化的實驗結果。
圖4A至圖4D為融合蛋白刺激人外周血調節性T細胞Treg和CD8+ T細胞中STAT5磷酸化活性的實驗結果。
圖5A至圖5F為融合蛋白對Balb/c小鼠體內外周血中淋巴細胞增殖影響的實驗結果。
圖6為融合蛋白對經過OVA免疫的小鼠脾臟中淋巴細胞增殖影響的實驗結果。
圖7為融合蛋白在小鼠延遲性過敏反應模型中的藥效結果。
圖8A至圖8B為融合蛋白在小鼠關節炎模型中的藥效結果。
圖9A至圖9F為抗IL-2抗體與不同IL-2變體形成的融合蛋白刺激人外周血調節性T細胞Treg和CD8+ T細胞中STAT5磷酸化活性的實驗結果。
圖10為D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠尿中蛋白含量影響的實驗結果(n=7至10)。
圖11A和圖11B分別為D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠血清中dsDNA IgG、IgM含量影響的實驗結果(**P<0.01 vs.模型對照組)。
圖12A和圖12B分別為D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠腎功能影響的實驗結果。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001 vs.模型對照組，n=9至10。
圖13A和圖13B分別為D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠血清IL-6、INF-γ含量影響的實驗結果。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001 vs.模型對照組，n=9至10。
圖14為D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠血清IL-10含量影響的實驗結果。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001 vs.模型對照組，n=9至10。
圖15為D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠病理評分的影響。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001 vs.模型對照組，n=9至10。
術語
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“介白素-2”或“IL-2”旨在被廣義地解釋，包括任意IL-2相關的產品。包括但不限於人和非人的IL-2同系物、片段或截短體、融合蛋白(如與信號肽融合或其他活性、非活性成份融合，活性成份例如抗體)、修飾形式(如PEG化、糖基化、白蛋白綴合/融合、Fc綴和/融合、羥乙基化等)、和保守修飾的蛋白等。該術語涵蓋來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然的IL-2。該術語還涵蓋未加工的IL-2 以及源自細胞中的加工的任何形式的IL-2，還涵蓋天然存在的IL-2變體，例如剪接變體或等位變體，還涵蓋IL-2的保守修飾變體。
“IL-2Rα”、“CD25”或“IL-2受體的α亞基”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物如靈長類(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD25，包括“全長”的未加工的CD25以及源自細胞中的加工的任何形式的CD25，還包括天然存在的CD25變體，例如剪接變體或等位變體。在某些實施方案中，CD25是人CD25，例示性序列如SEQ ID NO.37所示。
“高親和力IL-2受體”指IL-2受體的異型三聚體形式，其由受體γ亞基(也稱為通用細胞因子受體γ亞基、γc或CD132)、受體β亞基(也稱為CD122、p70或IL-2Rβ)和受體α亞基(也稱為CD25、p55、IL-2Rα)組成。比較而言，“中等親和力IL-2受體”指僅包含γ亞基和β亞基而無α亞基的IL-2受體(參見例如Olejniczak和Kasprzak,MedSci Monit14,RA179-189(2008))。
“保守修飾”適用於胺基酸和核苷酸序列。對於特定的核苷酸序列，保守改性是指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸，或在核苷酸不編碼胺基酸序列的情況下，是指基本上相同的核苷酸序列。對於胺基酸序列，“保守修飾”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。所屬技術領域具有通常知識者知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。
“胺基酸突變”包括胺基酸取代、缺失、插入、修飾及其任意組合，以實現最終構建體，使得最終構建體擁有期望的特性，例如增強的穩定性、提高的活性。胺基酸序列缺失和插入包括胺基和/或羧基端缺失和胺基酸插入。較佳的胺基酸突變是胺基酸取代。為了改變例如抗IL-2抗體的結合特性，可以將非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。較佳的胺基酸取代包括用親水性胺基酸替換疏水性胺基酸。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種標準胺基酸的天然存在的胺基酸衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變，包括定點誘變、PCR、基因合成、化學修飾等方法。
“抗體”以最廣義使用，涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。抗體可以指免疫球蛋白，是由兩條重鏈和兩條輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原-特異性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變 區(CDR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
對於CDR的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構來完成CDR的確定性描繪，並鑑定參與抗原結合位點的殘基。這可藉由所屬技術領域具有通常知識者已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。
Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。
Chothia編號系統與Kabat編號系統類似，但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。
AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和de-novo方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198 中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。
接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。
構象定義中，CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。
其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊，儘管根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，它們可縮短或延長。如本文使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。本文使用的方法可利用根據這些方法中的任一種定義的CDR。對於包含超過一個CDR的任何給定實施例，可根據Kabat、Chothia、延伸的、AbM、IMGT、接觸和/或構象定義中的任一個來定義CDR。
“單株抗體”或“單抗”指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即除了可能以少量存在的可能天然存在的突變之外，群體包含的各個抗體是相同的。單株抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與多株抗體不同，每種單株抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單株”指示如從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本揭露使用的單株抗體可藉由首先由Kohler和Milstein，1975，Nature256：495描述的融合瘤方法來製備，或者可藉由例如美國專利號4,816,567中所述的重組DNA方法來製備。例如，單株抗體也可從使用McCafferty等，1990，Nature 348：552-554中描述的技術，從所生成的噬菌體文庫中分離。
“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本揭露的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
“人抗體”或“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
(1)從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；
(2)從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
(4)藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
“抗原(Ag)”指用於免疫接種免疫活性的脊椎動物的分子，以產生識別Ag的抗體(Ab)；或在表達文庫(例如尤其是噬菌體、酵母或核糖體展示文庫)中進行篩選所使用的分子或模擬物。在本文中，Ag被更廣義地定義，並且一般預期包括被Ab識別的靶分子。因此，Ag包括用於產生Ab的免疫接種過程或用於選擇Ab的文庫篩選中使用的分子、或其部分或模擬物。因此，對於本揭露的與IL-2結合的抗體，來自哺乳動物物種的全長IL-2(例如人、猴、小 鼠和大鼠IL-2)，包括其單體和多聚體，例如二聚體、三聚體等，以及IL-2的截短變體和其它變體均被稱為抗原。
“表位”是指抗原上與免疫球蛋白(或抗體)特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括例如3至15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
“抗體片段”包括單鏈抗體；Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價或三價或四價抗體、Bis-scFv、雙鏈抗體(diabody)、三功能抗體(tribody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)和上述任意一種的表位結合片段。產生和製備這些抗體片段的方法在本領域是公知的(參見例如Verma等人，1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先公開於WO2009/040562，其二硫鍵穩定化形式Fab-dsFv首先公開於WO2010/035012。本揭露的抗原結合片段還包括描述於WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中的Fab和Fab’片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的(參見例如WO92/22583和WO05/113605)，後者的一個實例是描述於WO 92/22583中的Tri-Fab(或TFM)。
“與IL-2結合”，指能與IL-2或其表位相互作用，該IL-2或其表位可以是人源的。
“抗原結合位點”指抗原上連續或不連續的，由本揭露抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
“調節性T細胞”或“Treg”意指一種能抑制其它T細胞的應答的特殊化CD4+T細胞類型。Treg的特徵在於表達IL-2受體的α亞基(CD25)和轉錄因子叉頭框P3(FOXP3)，並在誘導和維持對抗原(包括那些由腫瘤表達的抗原)的外周自體耐受性中起著關鍵作用。Treg需要IL-2來實現其功能和發育以及其抑制性特徵的誘導。
“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。“ADCC”是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A、P329G；IgG2/4chimera，IgG4的F234A/L235A突變。“CDC”是指藉由使補體成分C1q與抗體Fc結合來激活補體級聯的細胞毒性形式。檢測抗體的ADCC、CDC活性的方法是本領域已知的，例如可藉由測定待測抗體與Fc受體(例如C1q)之間的結合活性來評價CDC。
“Fc受體”或“FcR”描述結合抗體Fc區的受體。較佳的FcR是人FcR。此外，較佳的FcR是結合IgG抗體的FcR(γ受體)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有主要在 其胞質結構域中不同的相似胺基酸序列。激活受體FcγRIIA在其胞質結構域中包含基於免疫受體酪胺酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中包含基於免疫受體酪胺酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR綜述於Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文的術語“FcR”涵蓋了其他FcR，包括有待在將來鑑定的那些。該術語還包括負責將母體IgG轉移至胎兒的新生兒受體FcRn(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人IL-2或其表位作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面電漿共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原或其表位結合，並且其與預定抗原或其表位結合的親和力是其與預定抗原(或其表位)或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
“親和力”在本文中用作兩個分子(例如抗體或其抗原結合片段與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度。術語“親和力”用於描述單價相互作用(固有活性)。兩個分子之間的結合親和力可藉由確定解離常數(KD)來量化。可藉由使用例如表面電漿共振(SPR)方法(Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定KD。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或koff)。KD藉由方程KD=kd/ka 與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定，並且可藉由方法例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中所述的那些甚至對於複雜混合物進行計算。例如，可使用雙重過濾硝化纖維素濾器結合測定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中公開的那種來確定KD。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析、以及本文其它地方例舉的其它測定。抗體的結合動力學和結合親和力也可藉由本領域已知的標準測定，例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用BiacoreTM系統或KinExA來評價。可藉由比較各個抗體/融合蛋白的KD值來比較與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如，不同抗體對於給定抗原的結合親和力的比較。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的KD值與非目的相互作用(例如已知不結合IL-2的對照抗體)的KD值進行評價。在一些實施方案中，本揭露的抗IL-2抗體能夠與其靶結合的親和力比它與另一種非IL-2分子結合的親和力大至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍，這裡不屬於限制性定義。
“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。抑制和阻斷也旨在包括與抗IL-2抗體接觸時，與未與抗IL-2抗體接觸的IL-2相比，任何可測量的IL-2結合親和力、促細胞增殖(例如T細胞)活性降低。
“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位 置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述融合蛋白，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本揭露中，“醫藥組成物”和“製劑”並不互相排斥。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“藥學可接受的載體”或“藥學可接受的賦形劑”包括當與活性成分組合時，允許該成分保留生物學活性並且不與受試者的免疫系統反應的任何材料。例子包括但不限於任何標準藥物載體，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。在一些實施例中，用於氣霧劑或腸胃外施用的稀釋劑是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含此類載體的組成物藉由眾所周知的常規方法配製。
“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。
“組胺酸緩衝劑”是包含組胺酸的緩衝劑。組胺酸緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸組胺酸，組胺酸-醋酸組胺酸，組胺酸-磷酸組胺酸，組胺酸-硫酸組胺酸等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑可由組胺酸與鹽酸配製而成，或者由組胺酸與鹽酸組胺酸配製而成。
“枸櫞酸鹽緩衝劑”是包括枸櫞酸根離子的緩衝劑。枸櫞酸鹽緩衝劑的實例包括枸櫞酸-枸櫞酸鈉、枸櫞酸-枸機酸鉀、枸櫞酸-枸櫞酸鈣、枸櫞酸-枸櫞酸鎂等。較佳的枸櫞酸鹽緩衝劑是枸櫞酸-枸櫞酸鈉。
“琥珀酸鹽緩衝劑”是包括琥珀酸根離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉鹽、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。較佳的琥珀酸鹽緩衝劑是琥珀酸-琥珀酸鈉鹽。示例性的，該琥珀酸-琥珀酸鈉可由琥鉑酸與氫氧化鈉配製而成，或由琥鉑酸與琥珀酸鈉鹽配製而成。
“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸根離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-枸櫞酸等。較佳的磷酸鹽緩衝劑是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉。
“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、組胺酸-醋酸組胺酸、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝劑是醋酸-醋酸鈉。
“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。
本揭露所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的融合蛋白在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的醫藥組成物，較佳地，醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其 生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。
穩定的製劑是在下述情況下没有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、較佳6個月、更佳1年，且甚至更佳地多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃的溫度保存包括1個月、3個月或6個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的例子：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、較佳不超過約5%的融合蛋白發生聚集或降解。藉由視覺分析，製劑是淡黄色近無色澄明液體或者無色澄明液體，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化，較佳不超過±5%的變化。該製劑通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。
如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，融合蛋白沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該融合蛋白在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。
如果融合蛋白沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該融合蛋白在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和CE-SDS等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交 換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。
如果融合蛋白在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該融合蛋白在藥物製劑中“保留它的生物活性”。
“施用”、“給予”和“處理”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當其應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種的醫藥組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和 Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
在以上說明書中提出了本揭露一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文該類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本揭露，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍，本揭露的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本揭露的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本揭露的範圍，本揭露的範圍由申請專利範圍限定。
實施例-融合蛋白
以下結合實施例用於進一步描述，但這些實施例並非限制的範圍。PCT/CN2021/076806(優先權：CN202010107662.4)藉由援引完整收入本揭露。
實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 抗IL-2抗體的篩選
人源天然噬菌體Fab庫的篩選
將保存的天然庫噬菌體懸液用BSA稀釋封閉，與磁珠Dynabeads(M-280，invitrogen)共孵育，收集負篩孵育後的噬菌體。按照Kingfisher磁珠篩選系統方 法(Thermo Scientific)對磁珠進行結合和清洗，將5% BSA與磁珠孵育。用生物素標記的帶有人Fc標簽的IL-2(Sanyou Biopharmaceutical，GenBank Accession No：P60568-1)包被封閉Dynabeads，將負篩後收集的噬菌體懸液與該Dynabeads孵育，並按照Kingfisher磁珠篩選系統方法進行結合和清洗。用胰酶沖提噬菌體。沖提後噬菌體溶液與生長對數期的大腸桿菌SS320細胞(Sanyou Biopharmaceutical)充分混合後，37℃靜置孵育30min。將大腸桿菌SS320塗布在2YT-Car+-Tet+平板上，37℃培養箱過夜培養。計算噬菌體輸入、輸出等，刮板製備輸入的噬菌體並進行3輪篩選。
B)ELISA初篩能結合IL-2的表達了抗IL-2的Fab的單純株噬菌體
挑選第3輪篩選獲得的2000個純株在96孔深孔板中培養過夜。離心取上清。將抗人IgG(STAR161，Bio-rad)用PBS稀釋到2μg/mL，包被ELISA板，每孔加入30μL，4℃過夜。PBST(PBS，pH 7.4+0.1% Tween 20)洗板3次。1% BSA室溫封閉1小時，PBST洗板3次。加入離心後的上清30μL，室溫2小時，PBST洗板3次。將用生物素標記的帶有人Fc標簽的IL-2用PBS稀釋到2μg/mL每孔加入30μL，室溫1小時，PBST洗板3次。加入1：8000稀釋的二抗NeutrAvidin-HRP 30μL，室溫1小時，PBST洗板9次加入30μL TMB室溫顯色5-10分鐘，之後加入30μL 2M HCl或者H2SO4終止反應，酶標儀OD 450讀取數據。最終獲得364株具有特異序列的純株。
C)ELISA初篩能夠阻斷IL-2與IL-2Rβ結合的抗IL-2的Fab
將上述364株純株按照1：1000的比例接種到50mL體積的2YT-Car+-Tet+培養基中，37℃培養過夜。將菌液轉移至50mL離心管。常溫條件下離心處理，棄掉上清，向其中加入4℃預冷的蛋白裂解液(10mM Tris-HCl pH 9.0，1mM EDTA，5mM MgCl2，25U/mL Bezonase核酸酶(Merck))0.5mL，冰上靜置孵育1小時。4℃條件下離心處理收集上清備用。
將IL-2Rβ-Fc(CJ82，Novoprotein)(GenBank登錄No：NP_000869.1)用PBS稀釋到8μg/mL，包被ELISA板，每孔加入30μL，4℃過夜。PBST洗板3次。1% BSA室溫封閉1小時，PBST洗板3次。將獲得的Fab裂解液與用生物素標記的帶有人Fc標簽的IL-2(2.5μg/mL)室溫溫育1小時後，每孔加入30μL，室溫1小時，PBST洗板3次。加入1：8000稀釋的二抗NeutrAvidin-HRP 30μL，室溫1小時，PBST洗板9次加入30μL TMB室溫顯色5-10分鐘，之後加入30μL 2M HCl或者H2SO4終止反應，酶標儀OD 450讀取數據。
獲得具有較強的阻斷IL-2與IL-2Rβ結合能力的6個Fab。這6個全人源抗體的重鏈和輕鏈可變區序列如表1所示，不同編號系統的互補決定區(CDR)如表2所示。
表1. 全人源抗IL-2抗體重鏈(HCVR)和輕鏈(LCVR)可變區序列
Figure 111132118-A0202-12-0042-1
表2. 全人源抗IL-2抗體的重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)序列
Figure 111132118-A0202-12-0043-3
Figure 111132118-A0202-12-0044-4
Figure 111132118-A0202-12-0045-5
實施例2：全長全人源抗IL-2抗體的製備
將實施例1中6個抗體的重鏈和輕鏈可變區與人IgG1重鏈恆定區和kappa或lamda鏈恆定區連接，構造形成全長全人源抗IL-2抗體。其中重鏈恆定區帶有L234A和L235A突變(LALA突變)，用以去除抗體可能的ADCC功能。6個抗體的全長序列如表3所示。
表3. 全人源抗IL-2抗體的重輕鏈全長序列
Figure 111132118-A0202-12-0046-6
Figure 111132118-A0202-12-0047-7
Figure 111132118-A0202-12-0048-9
合成上述序列，用BamHI和XhoI消化後，藉由BamHI/XhoI酶切位點插入到pcDNA3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染 HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。表達的抗體藉由離心回收後，按常規方法進行抗體純化，經鑑定，得到本揭露的全長全人源抗體。
實施例3：抗IL-2抗體能阻斷或降低IL-2與IL-2Rα結合，能阻斷IL-2和IL-2Rβ結合的ELISA實驗
A)抗體阻斷或降低IL-2與IL-2Rα結合的ELISA實驗
將IL-2Rα-Fc(CJ78，Novoprotein)(Accession#NP_000408)用PBS稀釋到0.5μg/mL，包被ELISA板，每孔加入30μL，4℃過夜。PBST洗板3次。1% BSA室溫封閉1小時，PBST洗板3次。將抗IL-2抗體用PBS，pH7.4做濃度梯度稀釋至10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.63μg/mL，0.31μg/mL，0.16μg/mL，0.08μg/mL，分別與用生物素標記的帶有人Fc標簽的IL-2(終濃度1μg/mL)室溫溫育15分鐘後，每孔加入30μL，室溫1小時，PBST洗板3次。加入1：6000稀釋的二抗NeutrAvidin-HRP 30μL，室溫1小時，PBST洗板9次。加入30μL TMB室溫顯色5-10分鐘，之後加入30μL 2M HCl或者H2SO4終止反應，酶標儀OD 450讀取數據。
結果如圖1A所示。結果顯示，C2-53、D3-68和A3-21可以完全阻斷IL-2與IL-2Rα的結合，其餘純株在10μg/mL高濃度下可能僅有微弱的阻斷(即降低)IL-2與IL-2Rα結合的能力。各個抗體的IC50如表4。
表4. 抗IL-2抗體阻斷IL-2與IL-2Rα的結合的IC50
Figure 111132118-A0202-12-0050-10
B)抗體阻斷IL-2與IL-2Rβ結合的ELISA實驗
將IL-2Rβ-Fc(CJ82，Novoprotein)用PBS稀釋到8μg/mL，包被ELISA板，每孔加入30μL，4℃過夜。PBST洗板3次。1% BSA室溫封閉1小時，PBST洗板3次。將抗IL-2抗體用PBS，pH7.4做濃度梯度稀釋至10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.63μg/mL，0.31μg/mL，0.16μg/mL，0.08μg/mL，分別與用生物素標記的帶有人Fc標簽的IL-2(終濃度5μg/mL)室溫溫育15分鐘後，每孔加入30μL，室溫1小時，PBST洗板3次。加入1：6000稀釋的二抗NeutrAvidin-HRP 30μL，室溫1小時，PBST洗板9次。加入30μL TMB室溫顯色5-10分鐘，之後加入30μL 2M HCl或者H2SO4終止反應，酶標儀OD 450讀取數據。
結果如圖1B所示。其中，所有抗體都可以完全阻斷IL-2與IL-2Rβ的結合。各個抗體的IC50如表5。
表5. 抗IL-2抗體阻斷IL-2與IL-2Rβ的結合的IC50
Figure 111132118-A0202-12-0051-11
實施例4：抗IL-2抗體阻斷或降低IL-2與IL-2Rα的結合，阻斷IL-2和IL-2Rβ結合的Octet實驗
A)抗體阻斷或降低IL-2與IL-2Rα結合的Octet實驗
將Streptavidin生物傳感器(Fortebio，#18-5020)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.05% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將生物素化的IL-2Rα-Fc(CJ78，Novoprotein)稀釋到10μg/mL，將傳感器置於200μL該溶液中150秒。將傳感器浸泡於KB緩衝液中60秒，以沖提多餘的IL-2Rα。將IL-2-His(CX66，Novoprotein)與抗IL-2抗體混合，並以KB緩衝液稀釋至終濃度分別為100nM和500nM，室溫溫育30分鐘。將傳感器置於該混合溶液中結合300秒。抗IL-2抗體阻斷或降低IL-2與IL-2Rα結合的能力越強，則讀數越低。讀取開始結合230秒時的數值，如表6所示。
表6. 抗IL-2抗體在Octet實驗中阻斷或降低IL-2與IL-2Rα的結合
Figure 111132118-A0202-12-0051-12
B)抗體阻斷IL-2與IL-2Rβ結合的Octet實驗
將Streptavidin生物傳感器(Fortebio，#18-5020)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.05% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將生物素化的IL-2-Fc(Sanyou Biopharmaceutical)稀釋到10μg/mL，將傳感器置於200μL該溶液中300秒。將傳感器浸泡於KB緩衝液中60秒，以沖提多餘的IL-2。將抗IL-2抗體以KB緩衝液稀釋至終濃度500nM，將傳感器置於抗體溶液中結合300秒。將傳感器浸泡於KB緩衝液中60秒，以沖提多餘的抗IL-2抗體。將IL-2Rβ-Fc(CJ82，Novoprotein)以KB緩衝液稀釋至終濃度8000nM，將傳感器置於抗體溶液中結合300秒。抗IL-2抗體阻斷IL-2與IL-2Rβ結合的能力越強，則讀數越低。讀取在IL-2Rβ-Fc開始結合230秒時的數值，如表7所示。
表7.抗IL-2抗體在Octet實驗中阻斷IL-2與IL-2Rβ的結合
Figure 111132118-A0202-12-0052-13
實施例5：抗IL-2抗體與IL-2的結合ELISA實驗
將抗人-IgG(STAR161，Bio-rad)用PBS稀釋到2μg/mL，包被ELISA板，每孔加入30μL，4℃過夜。PBST洗板3次。1% BSA室溫封閉1小時，PBST洗板3次。將抗IL-2抗體用PBS梯度稀釋到20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.3125μg/mL，0.15625μg/mL， 加30μL抗體到ELISA板中，室溫1小時，PBST洗板3次。將用生物素標記的帶有人Fc標簽的IL-2(Sanyou Biopharmaceutical)用PBS稀釋到2μg/mL每孔加入30μL，室溫1小時，PBST洗板3次。加入1：6000稀釋的二抗NeutrAvidin-HRP 30μL，室溫1小時，PBST洗板9次加入30μL TMB室溫顯色5-10分鐘，之後加入30μL 2M HCl或者H2SO4終止反應，酶標儀OD 450讀取數據。結果如圖2和表8所示。結果顯示，在該實驗方法下，所有抗體均與IL-2有結合，其中C2-53結合較強。
表8. 抗IL-2抗體與IL-2結合的EC50
Figure 111132118-A0202-12-0053-14
實施例6：抗IL-2抗體與IL-2的親和力和動力學Biacore實驗
用Biacore儀器(Biacore T200，GE)的Protein A傳感芯片(GE，Cat# 29127556)捕獲抗體，其中抗IL-2抗體用1×HBS-EP稀釋至1μg/mL，以10μL/min的流速持續30秒。然後，在芯片表面以30μL/min的流速流經一系列濃度梯度的IL-2(C013，Novoprotein)，結合持續120秒。解離流速30μL/min，持續300秒，實時檢測反應信號，獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用10mM Gly-HCl pH 2.0將芯片洗淨再生。實驗得到的數據以1：1結合模型進行擬合，得出抗IL-2抗體與IL-2的結合力數值，見表9。結果顯示，所有抗體均與IL-2有結合，親和力跨度從C2-53的0.267nM到A2-22的39.8nM不等。
表9. 抗IL-2抗體與IL-2的親和力
Figure 111132118-A0202-12-0054-15
實施例7：抗IL-2抗體與IL-2的非共價複合體對人外周血PBMC中STAT5磷酸化活性的測定
依據在不同濃度的抗IL-2抗體與IL-2非共價複合體處理下，人外周血中各細胞群體(包括Treg，CD4+ T細胞，CD8+T細胞)中STAT5磷酸化水平，檢測抗體對IL-2活性的調節能力。
基礎培養基：RPMI 1640+10%胎牛血清。
抗體混合物：CD3 APC-Cy7(BD 557832)，CD4 BB515(BD 564419)，CD8 BB700(BD 566452)，CD25 BV421(BD 564033)，pSTAT5 AF647(BD 562076)。
人PBMC STAT5磷酸化實驗：將新鮮分離的人PBMC細胞用基礎培養基調整至6.5×106個細胞/mL的密度，取80μL置於96孔板中。將不同濃度的抗IL-2抗體與不同濃度的IL-2室溫預混30分鐘，取20μL加入90μL PBMC中，37℃刺激20分鐘。之後立即用預熱的BD Cytofix緩衝液(BD，Cat No.554655)在37℃固定細胞15分鐘，然後在冰上繼續固定15分鐘。400g 4℃離心7分鐘。去除上清液，用150μL PBS洗滌一次。加入150μL在-20℃預冷的BD Phosflow Perm Buffer III(BD，Cat No.558050)-20℃破膜過夜。500g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入150μL PBS，pH 7.4洗滌兩次。加入100μL按 1：200稀釋的FcR封閉劑，在4℃下溫育20分鐘。500g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入50μL抗體混合物，對細胞在4℃染色1小時。500g 4℃離心7分鐘。去除上清液，加入200μL PBS，pH 7.4洗滌一次，用150μL PBS，pH 7.4重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACSCelesta)檢測。CD8+ T細胞定義為CD3+CD4-CD8+的細胞，Treg定義為CD3+CD4+CD8+CD25+的細胞。
對上述兩個細胞群的pSTAT5螢光數值(MFI)進行統計，計算每個濃度下的數值與完全激活狀態下的最大pSTAT5 MFI數值的百分比，採用計算機程序或四參數回歸計算法進行擬合。結果如圖3A至圖3H所示。
結果表明，隨著抗體濃度增加，IgG1同種型並不會對IL-2激活Treg和CD8+ T細胞的pSTAT5產生任何影響。相反，A3-21，C2-53在很大的濃度範圍內，基本不影響IL-2對Treg的活性，卻在很大程度上降低了IL-2對CD8+ T細胞的活性。只有在高濃度下，比如100nM A3-21和33.3nM C2-53，IL-2對Treg的活性有一定下降，而在該條件下，IL-2對CD8+ T細胞完全沒有活性。也即，A3-21和C2-53可以在不影響或較少的降低IL-2對Treg的活性的同時，抑制或更多的降低IL-2對CD8+ T細胞等免疫效應細胞的活性。類似的，D3-68也可以相對於Treg更多的降低IL-2對CD8+ T細胞的活性，雖然這種能力可能不如A3-21和C2-53顯著。
實施例8：融合蛋白的製備
抗IL-2抗體與IL-2的非共價複合體體內可能容易解離，生成游離的IL-2，造成毒性。我們藉由(G4S)5連接臂(即，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID No：190)將人IL-2偶聯至抗IL-2抗體重鏈或輕鏈的N端，得到12個抗IL-2抗體與IL-2的融合蛋白。
對於抗體編號，若IL-2在抗體重鏈的N端，則該融合蛋白帶有後綴a；若IL-2在抗體輕鏈的N端，則該融合蛋白帶有後綴b。
對於所融合的IL-2，其帶有T3A(即第3位胺基酸由Thr突變為Ala)的突變，以去除可能的糖基化。人IL-2成熟蛋白不含有第1位的胺基酸M，因此編號從第2位的胺基酸A開始計數。12個融合蛋白胺基酸序列如下：
表10. 融合蛋白的全長序列
Figure 111132118-A0202-12-0056-16
Figure 111132118-A0202-12-0057-17
Figure 111132118-A0202-12-0058-18
Figure 111132118-A0202-12-0059-19
Figure 111132118-A0202-12-0060-20
依照實施例2中的方法對上述12個融合蛋白進行表達和純化，表達量和在SEC-HPLC中的純度如下表11。
表11. 融合蛋白的表達量和純度
Figure 111132118-A0202-12-0060-21
結果顯示，對於不同抗IL-2抗體，IL-2偶聯在重鏈或輕鏈的N端，會極大的影響融合蛋白的表達量和純度。表達量或純度低，提示在融合蛋白中IL-2與抗體可能無法形成正常的分子內結合，而是形成分子間結合，從而引起蛋白質的聚集。挑選表達量(至少20mg/L)和純度(至少90%)較高的融合蛋白進行後續鑑定。
實施例9：融合蛋白與IL-2Rα和IL-2Rβ結合的Octet實驗
將Protein A生物傳感器(Fortebio，#18-5010)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將融合蛋白稀釋到10μg/mL，將傳感器置於200μL該溶液中，待讀數為1.2nm時停止。將傳感器浸泡於KB緩衝液中100秒，以沖提多餘的抗體-IL-2融合蛋白。將IL-2Rα(ILA-H52H9，Acrobiosystem)用KB緩衝液以2倍梯度稀釋至100nM-3.125nM之間。將傳感器置於該溶液中結合60秒。將傳感器置於KB緩衝液中解離60秒。採用動態1：1結合方式擬合，則融合蛋白與IL-2Rα的親和力如表12所示。結果顯示，與IL-2相比，偶聯了抗IL-2抗體的IL-2與IL-2Rα的結合均有減弱，其中A3-21-a，D3-68-b完全不結合IL-2Rα。
表12. 融合蛋白與IL-2Rα的親和力
Figure 111132118-A0202-12-0061-22
與上述方法類似，用Octet採用穩態模式擬合數據，測得抗體-IL-2融合蛋白與IL-2Rβ(CD2-H5221，Acrobiosystem)的親和力如表13所示。其中，抗體融合蛋白作為固定相，IL-2Rβ作為流動相。結果顯示，與IL-2相比， 偶聯了抗IL-2抗體的IL-2絕大多數完全不結合，個別抗體-IL2融合蛋白，如D3-68-b與IL-2Rβ的結合減弱，但仍然有一定程度的結合。其中IL-2與IL-2Rβ的親和力實驗，IL-2Rβ作為固定相，IL-2作為流動相。
表13.抗IL-2抗體與IL-2融合蛋白與IL-2Rβ的親和力
Figure 111132118-A0202-12-0062-24
實施例10：融合蛋白對人外周血(PBMC)STAT5磷酸化活性的測定
依照實施例7中的方法，測定融合蛋白對人外周血(PBMC)中Treg和CD8+ T細胞中的STAT5磷酸化活性。如圖4A至圖4D所示，實驗結果顯示，相比IL-2，所有融合蛋白對Treg和CD8+ T細胞的活性均有所降低。但是對於A2-22-a，A2-22-b，B2-15-b，D2-60-b，A3-21-b，這些融合蛋白對CD8+ T細胞的活性降低相比對Treg的活性降低更多，提示了這些融合蛋白中的IL-2可以更偏向於激活Treg。
而對於D3-68-b，其對Treg的活性降低相比對CD8+ T細胞的活性降低更多(圖4C和圖4D所示)。融合蛋白激活Treg和CD8+ T細胞中pSTAT5的EC50如表14和表15所示。
表14. 融合蛋白激活Treg細胞中pSTAT5的EC50
Figure 111132118-A0202-12-0063-25
表15. 融合蛋白激活CD8+ T細胞中pSTAT5的EC50
Figure 111132118-A0202-12-0063-26
實施例11：融合蛋白對Balb/c小鼠外周血免疫細胞影響的測定
BALB/c小鼠(購自北京Charles River實驗動物技術有限公司)，雌性，6-8週齡，體重18-20g，在正式實驗前，適應性飼養5天。所有的BALB/c小鼠飼養於SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統中，其中溫度20至26℃，濕度40至70%，光照週期12小時明/12小時暗。每個籠盒內飼養不多於6隻BALB/c小鼠。小鼠按照體重進行分組，分組後開始給藥，給藥種類、給藥劑量和給藥途徑見表16。模型分組當天為第0天。
表16.小鼠給藥方案
Figure 111132118-A0202-12-0064-27
每個時間點新鮮採集的抗凝血用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗一次。用含有1% FBS的PBS配製混合染色液。混合染色液包括CD3 APC-Cy7(Biolegend 100329)、CD8 PE(Biolegend 100708)、CD4 PE-Cy7(eBioscience 25-0042-82)、CD25 PerCP-Cy5.5(BD 561112)。每個樣本加入100μL混合染色液，4度溫育30分鐘。用含有1% FBS的PBS洗兩次。用True-NuclearTM Transcription Factor Buffer Set(Biolegend 424401)進行固定破膜60分鐘，100μL抗小鼠Foxp3抗體(Biolegend 126405)和抗小鼠Ki67抗體(eBioscience，25-5698-82)室溫孵育60分鐘。用PBS(pH 7.4)洗兩次，最後用500μLPBS，pH 7.4洗液重新懸浮，上機分析。其中，CD8+ T細胞定義為CD3+CD4-CD8+的細胞，Treg定義為CD3+CD4+CD25+Foxp3+的細胞。
實驗結果如圖5A至圖5F所示。對於A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b，與第0天相比，小鼠全血中Treg占CD4+ T細胞的百分比從第2天開始上升，Treg中Ki67+的百分比也從第2天開始顯著上升，表明A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b可以強烈刺激Treg的增殖。相反，對於CD4+CD25- T細胞和CD8+ T細胞，Ki67+的百分比則幾乎沒有變化或變化較小，CD8+ T細胞占CD3+ T細胞的百分比也幾乎未變，說明A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b幾乎不活化CD8+ T細胞。
實施例12：融合蛋白對接受雞卵清蛋白OVA免疫的Balb/c小鼠的脾臟免疫細胞的影響的測定
雞卵清蛋白(OVA)，Sigma A5503，使用PBS溶解，配製成0.5mg/mL。弗氏完全佐劑(CFA，含滅活結核分枝桿菌1mg/mL)，Sigma，F5881。雄性C57B16/J小鼠(購自上海實驗動物中心)，6-8週齡，體重18-20g。小鼠按照體重進行分組，實驗第1天，取OVA溶液8mL，與8mL CFA混勻、乳化呈油包水狀態。每隻動物腹腔注射200μL進行免疫。分別於第3天和第8天，各組小鼠皮下注射(sc)待測融合蛋白和PBS對照10mL/kg。給藥種類、給藥劑量和給藥途徑見表17。
表17.小鼠免疫方案
Figure 111132118-A0202-12-0065-28
第10天時，小鼠安樂死，取脾臟處理後流式細胞儀檢測相關免疫細胞。方法包括：75%乙醇浸泡5分鐘後在無菌條件下取出小鼠脾臟，PBS漂洗1-2次後，將小鼠脾臟剪碎。將過濾網置於50mL離心管中，將脾臟組織碎片轉移到篩網上，研磨，過程中不斷加入新鮮的PBS。1800轉/分鐘離心3分鐘，棄上清。加入10mL紅細胞裂解液冰上靜置5分鐘後加入PBS終止裂解，1800轉/分鐘離心3分鐘兩次。根據BioLegend流式抗體染色步驟進行染色後，將細胞用PBS重新懸浮離心兩次，過篩，進行流式細胞檢測。
檢測細胞及其標記物如下：
脾臟生殖中心B細胞(GCB，Germinal Center B cells)(Fas+GL-7+B220+)；
卵泡輔助性T細胞(Tfh，follicular T helper cells)(PD1高，CXCR5高，FOXP3-CD4+)；
卵泡調節性T細胞(Tfr，follicular regulatory T cells)(PD1高，CXCR5高，FOXP3+CD4+)；
調節性T細胞Treg細胞(FOXP3+CD25+CD4+CXCR5低)；
實驗結果如圖6所示。A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b均可以刺激脾臟中的Treg和Tfr增殖，抑制脾臟中的Tfh和GCB數量，表明A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b具有藉由激活Treg抑制免疫系統的作用。
實施例13：融合蛋白在小鼠延遲性過敏反應模型中的藥效實驗
實驗方法：取2,4-二硝基氟苯(DNFB，Sigma，42085-50G)，用丙酮：橄欖油=4：1溶解，配製成1%(1g/100mL)溶液備用，另稀釋成0.5%(0.5g/100mL)溶液備用。雄性ICR小鼠(購自上海實驗動物中心)，6週週齡，體重18-20g。小鼠按照體重進行分組。實驗第0天，小鼠腹部塗抹1%的DNFB溶液50μL免疫，實驗第5天時，小鼠右耳內外側分別塗抹0.5%的DNFB溶液10μL(共20μL)進行激發，分別於實驗第6天使用8mm直徑打孔器取下左側和右側耳朵組織稱重，並計算左、右兩側耳朵組織重量的差值。待測藥從實驗開始前2天(第-2天)開始，每5天皮下給藥1次。
給藥種類、給藥劑量和給藥途徑見表18。
表18.小鼠免疫方案
Figure 111132118-A0202-12-0067-29
實驗結果如圖7所示。A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b均可以降低耳朵腫脹程度，並呈現劑量效應，表明A2-22-b、B2-15-b、D2-60-b具有抑制免疫系統的作用。
實施例14：融合蛋白在小鼠關節炎模型中的藥效實驗
雄性DBA/1純系小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。關節炎模型由牛II型膠原(Biolead，20022)免疫誘發。實驗第0天，取2.5mL牛II膠原/冰乙酸(2mg/mL)中，再與2.5mL完全弗氏佐劑充分混懸，成油包水乳狀，取0.1毫升在乙醚輕麻醉下於每個小鼠的尾根部皮內注射，3周後加強注射一次。造模動物隨機分為6組，分別為：正常對照組，造模型組，IL-2(C013，novoprotein)組、A2-22-b組、B2-15-b組，每組各8隻。同時選用正常對照動物作為正常對照組，分組見表19。
表19.小鼠免疫方案
Figure 111132118-A0202-12-0068-31
關節炎症評價：小鼠從二次免疫開始，每3天進行稱重和關節炎病情嚴重程度半定量計分(clinical scores)：
0分：無紅腫；
1分：在爪上有一處紅腫炎症；
2分：整爪上有輕微炎症或者有兩處及以上紅腫；
3分：整爪上有中度紅腫；
4分：整個爪上有嚴重紅腫甚至關節僵硬、畸形及活動障礙。
每隻爪最高得分4分，每隻鼠最高得分16分。關節炎病情觀察一直持續到實驗結束。
血清抗牛II型膠原抗體濃度檢測：實驗結束時，收集血，分離血清，-80℃保存。採用ELISA檢測試劑盒(Chondrex，20322T)檢測血清中抗牛II型膠原抗體的水平。具體步驟按說明書進行。
實驗結果如圖8A和圖8B所示。和正常對照組相比，模型對照組小鼠體重明顯下降，關節炎評分顯著升高(p<0.001)；和模型對照組相比，B2-15-b可顯著抑制關節炎造模小鼠體重減輕，可顯著降低關節炎評分(p<0.05)。和正常對照組相比，模型對照組血清抗牛II型膠原IgG2a抗體的濃度顯著增加(p<0.001)；和模型對照組相比，B2-15-b給藥可顯著下調關節炎小鼠血清抗牛II型膠原IgG2a抗體的分泌(p<0.01)。
實施例15：不同連接臂長度對融合蛋白表達量和純度的影響
將B2-15-b中IL-2與抗IL-2抗體B2-15輕鏈之間的(G4S)5連接臂縮短G4S的重複次數至4次，而重鏈保持不變，獲得B2-15-b的變體B2-15-b-(G4S)4，其輕鏈序列如表20。
表20. 融合蛋白中抗體的全長輕鏈序列
Figure 111132118-A0202-12-0069-33
按照實施例2中的方法對上述B2-15-b的變體進行表達和純化，仍可以達到表達量47mg/L，SEC-HPLC純度為99%。證明不同連接臂長度能實現融合蛋白的表達。
實施例16：抗IL-2抗體與不同IL-2變體之間的融合蛋白對人外周血(PBMC)STAT5磷酸化活性的測定
將IL-2進行突變，引入T3E，或T3Q，或去除IL-2N端前3個胺基酸(B2-15-b-Del3)，或去除IL-2N端前7個胺基酸(B2-15-b-Del7)，或直接使用野生型IL-2，分別與抗IL-2抗體進行偶聯。產生如下融合蛋白(每一個抗體的重鏈序列保持不變)，見表21。
表21. 融合蛋白中抗體的輕鏈全長序列
Figure 111132118-A0202-12-0070-34
Figure 111132118-A0202-12-0071-35
Figure 111132118-A0202-12-0072-36
依照實施例7中的方法，測定上述抗IL-2抗體與IL-2變體的融合蛋白對人外周血(PBMC)中Treg和CD8+ T細胞中的STAT5磷酸化活性。如圖9A至圖9F、表22所示，實驗結果顯示，這些IL-2變體基本不影響抗體融合蛋白對Treg和CD8+ T細胞的活性。這些融合蛋白依然更偏向於激活Treg，而不是CD8+ T細胞。
表22. 抗IL-2抗體與不同IL-2變體的融合蛋白激活Treg細胞中pSTAT5的EC50
Figure 111132118-A0202-12-0072-37
實施例17：融合蛋白在MRL/lpr自發性紅斑狼瘡小鼠模型中的藥效實驗
雌性BALB/c小鼠和雌性MRL/lpr小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd)。以雌性BALB/c小鼠為正常對照，雌性MRL/lpr小鼠按蛋白尿水平及體重隨機分為3組，分別為：MRL/lpr對照組(模型對照組)，1和3mg/kg給藥組。D2-60-b-T3E經皮下注射給藥，每3天給藥一次，劑量為1、3mg/kg；8週齡時開始給藥，連續給藥8週。
表23. 實驗設計與分組
Figure 111132118-A0202-12-0073-39
給藥期間，每兩週測定各組小鼠尿蛋白含量；連續8週給藥結束後進行如下檢測：
Figure 111132118-A0202-12-0073-118
測定各組小鼠血清中抗雙鏈DNA的IgM和IgG的含量；
Figure 111132118-A0202-12-0073-121
測定各組小鼠血清中血肌酐(CRE)和血尿素氮(BUN)含量；
Figure 111132118-A0202-12-0073-122
測定各組小鼠血清中IL-6、IL-10和IFN-γ的含量；
Figure 111132118-A0202-12-0073-123
對各組小鼠的腎臟組織進行病理分析和評分。
1)小鼠尿蛋白含量的檢測
本實驗使用提尾反射法收集小鼠尿液，採用尿蛋白檢測試劑盒(CBB法，南京建成生物工程研究所，#C035-2-1)檢測小鼠尿蛋白濃度。MRL/lpr小鼠紅斑狼瘡發病的過程中，腎臟會因dsDNA抗體沉積而發生損傷，進而導致腎小球濾過功能和重吸收能力下降，尿蛋白濃度升高。隨著MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎的發展，小鼠尿蛋白水平會逐漸升高。每兩週進行的小鼠尿蛋白水平檢測顯示，最初每組小鼠尿蛋白含量無明顯差異，隨著實驗的進行，MRL/lpr對照組(模型對照組)小鼠尿蛋白水平逐漸升高並明顯高於正常組，說明由於自身抗體的沉積，MRL/lpr小鼠出現嚴重的自發性腎損傷。1和3mg/kg D2-60-b-T3E給藥組小鼠平均尿蛋白含量低於模型對照組並呈現劑量依賴性，但由於數據個體差異較大，和模型對照組相比無統計學差異。數據見圖10。
2)血清中抗雙鏈DNA的IgM和IgG的含量檢測
採用ELISA法檢測血清中抗雙鏈DNA(抗-dsDNA)IgG、IgM的含量。具體方法參見ELISA試劑盒(Alpha Diagnostic，#5120和#5130)說明書。3mg/kg的D2-60-b-T3E給藥組小鼠血清中抗-dsDNA IgG和IgM含量的平均值顯著低於模型對照組(P<0.01)，1mg/kg組雖然有IgG和IgM含量低於模型對照組的趨勢，但和模型對照組的差異無統計學意義。實驗結果見圖11A和圖11B。
3)D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠腎功能的影響
本實驗使用肌酐(CRE)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，#C011-2-1)和尿素氮(BUN)測試盒(南京建成生物工程研究所，#C013-2-1)檢測實驗結束時小鼠血清中血肌酐和尿素氮的含量。
尿素氮和肌酐分別是人體蛋白質和肌肉的代謝產物，腎臟是其終排泄器官，腎功能受損後，血中尿素氮和肌酐無法有效排出，血尿素氮(BUN)和血肌酐(CRE)的濃度因瀦留而逐漸升高。因此血清中BUN和CRE水平是臨床上反映腎功能的主要指標。與正常小鼠相比，MRL/lpr對照組(模型對照組)小鼠血清中肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)含量均顯著升高(P<0.0001)，提示MRL/lpr模型組小鼠出現功能性腎受損。
1和3mg/kg給藥組小鼠血清中肌酐的含量顯著低於模型對照組(P<0.01，P<0.0001)，可以一定程度上改善MRL/lpr小鼠的腎功能，並且3mg/kg給藥組小鼠血清中肌酐的含量顯著低於1mg/kg給藥組。3mg/kg給藥組小鼠血清中尿素氮的含量同樣顯著低於模型對照組(P<0.05)，說明3mg/kg的D2-60-b-T3E可以逆轉MRL/lpr小鼠的自發性腎損傷。結果見圖12A和圖12B。
4)D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠血清IL-6，IL10和INF-γ含量的影響
採用ELISA方法檢測血清中細胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10的含量。
與正常小鼠相比，MRL/lpr對照組(模型組)小鼠血清中IL-6和IFN-γ的含量顯著升高(P<0.0001)。3mg/kg給藥組小鼠血清中IL-6的含量顯著低於模型對照組與1mg/kg給藥組(P<0.0001)，呈現出劑量依賴關係。3mg/kg給藥組小鼠血清中IFN-γ的含量顯著低於模型對照組(P<0.01)。結果見圖13A和圖13B。
與正常小鼠相比，MRL/lpr對照組(模型對照組)小鼠血清中IL-10的含量顯著下降(P<0.0001)。3mg/kg D2-60-b-T3E給藥組小鼠血清中IL-10的含量顯著高於模型對照組(P<0.001)。結果見圖14。
5)D2-60-b-T3E對MRL/lpr小鼠腎臟病變的影響
實驗結束時，取小鼠左腎用4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片後H&E染色，在顯微鏡下觀察切片，並進行病理評分，對腎小球、腎間質以及血管等病理損傷進行分級評分，評分標準見表24。
表24. 腎臟病理評分標準
Figure 111132118-A0202-12-0075-40
MRL/lpr對照組(模型對照組)小鼠腎臟出現嚴重的腎小球、腎間質及血管病理損傷，腎小球硬化，部分向內凹陷，大量細胞浸潤在血管周及間質 區域，腎小球出現嚴重的腫脹與增生。與正常小鼠相比，MRL/lpr對照組(模型對照組)小鼠腎臟病理評分顯著升高(P<0.001)，提示模型對照組小鼠的腎臟出現明顯的病變。
給藥組小鼠的腎小球、腎間質及血管病理損傷有一定程度的減輕。1和3mg/kg給藥組小鼠腎臟病理評分顯著低於模型對照組(P<0.05，P<0.0001)，表明D2-60-b-T3E能顯著減輕MRL/lpr自發性腎臟病變。結果見圖15。
實施例-製劑
SEC分子排阻色譜法：
根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關係而對溶質進行分離的分析的方法。
SEC%(SEC單體含量百分比)=A單體/A總×100%(A單體為樣品中主峰單體的峰面積，A總為所有峰面積之和)。△SEC%=強制降解實驗前製劑的SEC%-強制降解實驗後製劑的SEC%。
SEC測定用儀器：安捷倫1260；管柱：waters，XBrige BEH200Å SEC(300×7.8mm 3.5μm)
NR-CE毛細管凝膠電泳：
將凝膠移到毛細管中作為支持介質進行的一種電泳，並在一定的電壓下根據樣品分子量的大小進行分離的方法。
NR-CE%=A主峰/A總×100%(A主峰為樣品中輕鏈主峰+重鏈主峰的峰面積，A總為所有峰面積之和。△NR-CE%=強制降解實驗前製劑的NR-CE%-強制降解實驗後製劑的NR-CE%。
CE測定用儀器：Beckman型號plus800
iCIEF成像毛細管等點聚焦電泳：
根據蛋白質等電點pI不同進行分離的技術。
iCIEF%=中性峰面積/總面積×100%(總面積為酸性峰、中性峰和鹼性峰面積之和)。△iCIEF%=強制降解實驗前製劑的iCIEF%-強制降解實驗後製劑的iCIEF%。
iCIEF測定所用儀器廠家simple protein，型號muarice。
滲透壓測定：
冰點法測定滲透壓，以冰點下降值與溶液的莫耳濃度成正比例關係為基礎，採用高靈敏度感溫元件，測定溶液結冰點，藉由電量轉化為滲透壓。儀器廠家羅澤Loser，型號OM815。
融合蛋白
以下實施例所採用的融合蛋白為D2-60-b-T3E。融合蛋白的濃度採用蛋白濃度計。蛋白濃度測定儀器：紫外可見分光光度計，型號：Nano Drop oneC，光程為1mm。
製劑實施例1. pH和緩衝體系篩選
製備含表25所示的緩衝體系、30mg/mL融合蛋白、80mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酯80(PS80)的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置1個月、25℃，300rpm振搖6天)，以SEC和iCIEF為評價指標，考察不同緩衝體系對融合蛋白穩定性的影響。
結果見表25。SEC數據顯示，振搖6天後含His-HCl的製劑的單體純度優於含AA或SA的製劑。iCIEF數據顯示，振搖後組間無顯著差異。40℃ 放置一個月後，含AA(pH 5.5)的製劑與含His-HCl(pH 6.0-6.5)的製劑優於其他組。綜上所述，緩衝體系較佳AA和His-HCl，pH範圍較佳5.5-6.5。
表25. pH和緩衝體系篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0078-41
AA代表醋酸-醋酸鈉；SA代表琥珀酸-琥珀酸鈉；His-HCl代表組胺酸-鹽酸組胺酸；
振搖D6：25℃ 300rpm振搖6天；40℃ M1：40℃放置1個月，下同。
製劑實施例2. 蛋白濃度篩選
製備含10mM AA緩衝液(pH 5.5)、表26所示的蛋白濃度的融合蛋白、80mg/mL蔗糖、0.2mg/mL PS80的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置1個月)，以SEC、NR-CE和iCIEF為評價指標，考察不同蛋白濃度對融合蛋白穩定性的影響。
結果見表26。蛋白濃度10-30mg/mL時，高溫放置過程中外觀及純度項無明顯差異，純度項變化值均在可接受範圍內，說明在該濃度範圍內，融合蛋白樣品具有良好的穩定性。
表26. 蛋白濃度篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0079-42
製劑實施例3. 含不同糖的製劑
在10mM AA pH5.5緩衝液中，製備蛋白濃度為10mg/mL，含0.2mg/mL PS80，含不同糖種類的抗IL-2蛋白製劑。具體糖種類和濃度如下：
1)80mg/mL蔗糖
2)80mg/mL海藻糖
將每種製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將樣品進行25℃ 300rpm振搖穩定性考察，以SEC為評價指標，結果見表27，蔗糖穩定性優於海藻糖。
表27. 糖的篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0079-43
製劑實施例4. 表面活性劑濃度篩選
製備含30mg/mL的融合蛋白、80mg/mL蔗糖、表28所示的表面活性劑、和10mM AA緩衝液(pH 5.5)的製劑。對樣品進行強制降解實驗(40℃恆溫條件下放置1個月)，以SEC和iCIEF為評價指標，考察樣品穩定性。結果見表28。結果顯示，含泊洛沙姆188(PF68)的製劑的蛋白單體純度未有明顯變化。
表28. 融合蛋白表面活性劑種類及濃度篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0080-44
製劑實施例5. 表面活性劑篩選
以10mM pH6.0 His-HCl為緩衝體系，製備含80mg/mL蔗糖，含有不同種類的表面活性劑，蛋白濃度為30mg/mL的抗IL-2蛋白製劑。將每種製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。取樣品進行4℃長期研究，以外觀和SEC為評價指標，考察樣品穩定性，試驗結果見表29。具體表面活性劑設定如下：
1)0.6mg/mL PS80
2)0.6mg/mL PF68
實驗結果顯示，4℃ M13後相同表面活性劑濃度下PF68組SEC單體純度與PS80組無明顯差異。外觀上，相同表面活性劑濃度下PS80組外觀較優於PF68組。綜合以上數據較佳PS80作為抗IL-2蛋白製劑的表面活性劑。
表29. 抗IL-2蛋白表面活性劑種類篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0080-45
製劑實施例6. 表面活性劑濃度篩選
以10mM pH6.0 His為緩衝體系，製備含87mg/mL蔗糖，含有不同濃度PS80，蛋白濃度為30mg/mL的抗IL-2蛋白製劑。具體PS80濃度設定如下：
1)0.4mg/mL PS80
2)0.8mg/mL PS80
3)1.5mg/mL PS80
將每種製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。進行凍融考察，以外觀、SEC為評價指標，考察樣品穩定性，試驗結果見表30。凍融MFI結果顯示，隨著PS80濃度增大，
Figure 111132118-A0202-12-0081-125
2μm顆粒數減少。
表30. 表面活性劑濃度篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0081-46
FT5C：凍融5個循環，以此類推。
製劑實施例7. 輔料篩選
在10mM pH6.0 His-HCl緩衝液中，製備蛋白濃度為10mg/mL，含0.8mg/mL PS80，含不同輔料的抗IL-2蛋白製劑。具體如下：
1)36mg/mL蔗糖
2)36mg/mL蔗糖，12mg/mL甘胺酸
將每種製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將樣品進行凍融考察，以外觀、DLS和MFI為評價指標，結果見表31。外觀DLS和MFI數據顯示組間無顯著差異。 考慮到皮下製劑，減少注射刺激性，滲透壓控制為等滲最佳，因此對輔料濃度進行篩選，確定等滲濃度。只有36mg/mL蔗糖滲透壓偏低，36mg/mL蔗糖加12mg/mL甘胺酸或40mg/mL蔗糖加10mg/mL甘胺酸或45mg/mL蔗糖加10mg/mL甘胺酸或50mg/mL蔗糖加9mg/mL甘胺酸可控制在等滲範圍內。
表31. 輔料篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0082-47
製劑實施例8. 不同離子強度篩選
以pH6.0 His-HCl為緩衝體系，製備含36mg/mL蔗糖、12mg/mL甘胺酸，含0.8mg/mLPS80蛋白濃度為10mg/mL的抗IL-2蛋白製劑。具體不同離子強度設定如下：
1)10mM
2)5mM
將每種製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。進行凍融考察，以外觀和SEC為評價指標，考察樣品穩定性，試驗結果見表32。結果顯示組間外觀、SEC無顯著差異。
表32. 不同離子強度篩選結果
Figure 111132118-A0202-12-0083-48
製劑實施例9. 凍乾製劑
以10mM pH6.0 His-HCl為緩衝體系，製備含50mg/mL蔗糖加9mg/mL甘胺酸(組別1)或40mg/mL蔗糖加10mg/mL甘胺酸(組別2)，含0.8mg/mL PS80蛋白濃度為10mg/mL的抗IL-2蛋白製劑。
將製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將製劑樣品進行凍乾，凍乾程序為預凍、一次乾燥和二次乾燥(參數見表33)。凍乾程序結束後，真空加塞。然後，用注射用水復溶凍乾製劑，獲得蛋白濃度10mg/mL的抗IL-2抗體復溶溶液，考察凍乾前製劑及凍乾後復溶溶液的外觀、NR-CE和SEC純度等指標的變化。實驗結果見表34，結果表明，抗IL-2抗體製劑凍乾前後均保持良好的穩定性。
表33. 抗IL-2抗體製劑凍乾程序
Figure 111132118-A0202-12-0083-49
表34. 抗IL-2抗體製劑凍乾前後製劑對比實驗結果
Figure 111132118-A0202-12-0084-50
製劑實施例10. 凍乾製劑
分別以10mM pH6.0 His-HCl或5mM pH6.0 His-HCl為緩衝體系，製備含45mg/mL蔗糖、10mg/mL甘胺酸，含0.8mg/mL PS80蛋白濃度為10mg/mL的抗IL-2蛋白製劑。
將製劑過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將製劑樣品進行凍乾，凍乾程序為預凍、一次乾燥和二次乾燥(參數見表35)。凍乾程序結束後，真空加塞。然後，用注射用水復溶凍乾製劑，獲得蛋白濃度10mg/mL的抗IL-2抗體復溶溶液，考察凍乾前製劑及凍乾後復溶溶液的外觀和SEC純度等指標的變化。實驗結果見表36，結果表明，抗IL-2抗體製劑凍乾前後均保持良好的穩定性。
表35. 抗IL-2抗體製劑凍乾程序
Figure 111132118-A0202-12-0084-51
表36. 抗IL-2抗體製劑凍乾前後製劑對比實驗結果
Figure 111132118-A0202-12-0085-52
TW202327642A_111132118_SEQL.xml

Claims (20)

  1. 一種醫藥組成物，包含融合蛋白和緩衝劑，其中該融合蛋白包含共價結合的IL-2與抗IL-2抗體，該緩衝劑為組胺酸緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑或琥珀酸鹽緩衝劑；
    較佳地，該緩衝劑為組胺酸緩衝劑或醋酸鹽緩衝劑；
    更佳地，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑或醋酸-醋酸鈉緩衝劑。
  2. 如請求項1所述的醫藥組成物，其中該融合蛋白的濃度為5mg/mL至50mg/mL；
    較佳地，該融合蛋白的濃度為10mg/mL至30mg/mL。
  3. 如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含表面活性劑；
    較佳地，該表面活性劑為聚山梨酯或泊洛沙姆；
    更佳地，該表面活性劑為聚山梨酯80、聚山梨酯20或泊洛沙姆188。
  4. 如請求項3所述的醫藥組成物，其中該表面活性劑的濃度為0.05mg/mL至2mg/mL；
    較佳地，該表面活性劑的濃度為0.1mg/mL至0.8mg/mL。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含糖；
    較佳地，該糖為蔗糖、甘露醇和海藻糖中的一種或多種；
    更佳地，該糖為蔗糖。
  6. 如請求項5所述的醫藥組成物，其中該糖的濃度為20mg/mL至100mg/mL；
    較佳地，該糖的濃度為30mg/mL至80mg/mL；
    更佳地，該糖的濃度為30mg/mL至50mg/mL。
  7. 如請求項6所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含輔料；較佳地，該輔料為甘胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、鹽酸精胺酸、谷胺酸、天冬胺酸或乙二胺四乙酸二鈉；更佳地，該輔料為甘胺酸。
  8. 如請求項7所述的醫藥組成物，其中該輔料的濃度為1mg/mL至30mg/mL；較佳地，輔料的濃度為5mg/mL至15mg/mL。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的濃度為5mM至100mM；
    較佳地，該緩衝劑的濃度為5mM至30mM；
    更佳地，該緩衝劑的濃度為5mM至10mM。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的pH為5.0至6.5；
    較佳地，該緩衝劑的pH為5.5至6.0；
    更佳地，該緩衝劑的pH為6.0。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物，其中該抗IL-2抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區具有：包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變區具有：包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO：42的胺基酸序列的LCDR3；
    較佳地，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列；
    更佳地，該抗IL-2抗體包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的重鏈和SEQ ID NO：166的胺基酸序列的輕鏈。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的醫藥組成物，其中該IL-2直接或藉由連接子融合至抗IL-2抗體的輕鏈的N端；
    較佳地，該IL-2的第3位胺基酸殘基為E；
    更佳地，該融合蛋白包含SEQ ID NO：165的胺基酸序列的重鏈和SEQ ID NO：189的胺基酸序列的輕鏈。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
    a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，
    b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯或泊洛沙姆，
    c)30mg/mL至80mg/mL的蔗糖，
    d)1mg/mL至30mg/mL的甘胺酸，和
    e)5mM至10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0；
    較佳地，該醫藥組成物包含如下組分：
    a)10mg/mL至30mg/mL的該融合蛋白，
    b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的聚山梨酯80，
    c)30mg/mL至50mg/mL的蔗糖，
    d)5mg/mL至15mg/mL的甘胺酸，和
    e)5mM至10mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑的pH為6.0。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物，其中該組成物是液體製劑；
    較佳地，該組成物的施用途徑為皮下注射、皮內注射、靜脈注射或肌內注射；
    更佳地，該組成物的施用途徑為皮下注射。
  15. 一種凍乾製劑，該凍乾製劑復溶後可形成如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物。
  16. 一種製備凍乾製劑的方法，其中包括將如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物進行冷凍乾燥的步驟。
  17. 一種凍乾製劑，該製劑藉由將如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
  18. 一種復溶溶液，該復溶溶液是藉由將如請求項15或17所述的凍乾製劑復溶製備的。
  19. 一種製品，其包括容器，該容器中裝有如如請求項1至14任一項所述的醫藥組成物、如請求項15或17所述的凍乾製劑或如請求項18所述的復溶溶液。
  20. 一種治療自身免疫疾病或延緩自身免疫疾病進展的方法，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項1至14任一項所述的醫藥組成物、如請求項15或17所述的凍乾製劑、如請求項18所述的復溶溶液或如請求項19所述製品；
    較佳地，該自身免疫疾病選自以下的任一項或組合：狼瘡、移植物抗宿主病、C型肝炎誘導的脈管炎、I型糖尿病、多發性硬化、炎性腸病、慢性GvHD、哮喘、皮炎、斑秃、急性肺損傷、敗血症、反應性關節炎和類風濕性關節炎。
TW111132118A 2021-08-25 2022-08-25 一種含融合蛋白的醫藥組成物 TW202327642A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110985497.7 2021-08-25
CN202110985497 2021-08-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202327642A true TW202327642A (zh) 2023-07-16

Family

ID=85322447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111132118A TW202327642A (zh) 2021-08-25 2022-08-25 一種含融合蛋白的醫藥組成物

Country Status (6)

Country Link
KR (1) KR20240049304A (zh)
CN (1) CN117642424A (zh)
AU (1) AU2022332510A1 (zh)
CA (1) CA3229503A1 (zh)
TW (1) TW202327642A (zh)
WO (1) WO2023025249A1 (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
PL1644412T5 (pl) 2003-07-01 2019-01-31 Ucb Biopharma Sprl Modyfikowane fragmenty Fab przeciwciała
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
WO2010035012A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
WO2014028748A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Irm Llc Interleukin 2 antibodies and antibody complexes
TW201722989A (zh) * 2015-10-23 2017-07-01 輝瑞大藥廠 抗il-2抗體及其組合物及用途
MX2020009975A (es) * 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
BR112022016216A2 (pt) * 2020-02-16 2023-02-28 Aulos Bioscience Inc Anticorpos anti-il-2 modificados

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022332510A1 (en) 2024-02-15
KR20240049304A (ko) 2024-04-16
CA3229503A1 (en) 2023-03-02
CN117642424A (zh) 2024-03-01
WO2023025249A1 (zh) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112512550A (zh) 一种TGF-β受体融合蛋白药物组合物及其用途
JP6865826B2 (ja) インターロイキン１７ａを標的とする抗体、その製造方法及び応用
RU2771384C2 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к lag-3, и ее применение
TWI745670B (zh) 抗cd27抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
TWI797400B (zh) 抗IL17a抗體的水性藥物組合物及其用途
CN115867316A (zh) 抗pd-1抗体药物组合物及其用途
JP2022513553A (ja) 抗ｔｉｍ３抗体医薬組成物およびその使用
WO2021190582A1 (zh) 一种抗ox40抗体药物组合物及其用途
CN112839961B (zh) 一种cd40抗体药物组合物及其用途
WO2023025249A1 (zh) 一种含融合蛋白的药物组合物
US20220111047A1 (en) Formulations of antibodies that bind human cd137 and uses thereof
EP4146700A1 (en) Aqueous pharmaceutical composition of levilimab
TW202102204A (zh) 包含抗ｉｌ－５抗體的醫藥組成物及其用途
RU2778572C1 (ru) Фармацевтическая композиция на основе антител к cd40 и ее применение
WO2023040935A1 (zh) 一种含抗pvrig/tigit双特异性抗体的药物组合物
JP7315259B2 (ja) 百日咳毒素結合タンパク質
EP4104858A1 (en) Pharmaceutical composition containing anti-il-4r antibody and use thereof
WO2022116858A1 (zh) 一种抗tslp抗体药物组合物及其用途
TW202108623A (zh) 抗ｔｒｏｐ－２抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
TW202115118A (zh) 抗ｂｃｍａ抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途