CN112292137A - 通用抗原呈递细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了通用抗原呈递细胞。本文还提供了使用UAPC扩增免疫细胞的方法和使用所扩增的免疫细胞治疗疾病(如癌症)的方法。

Description

通用抗原呈递细胞及其用途

本申请要求2018年2月21日提交的第62/633587号美国临时专利申请的权益，通过引用将其整体并入本文中。

背景

序列表是以电子方式提交的并通过引用并入本文中，该序列表包含在名为“UTFCP1355WO_ST25.txt”的文件中，该文件为KB(如在Microsoft Windows中所测量的)并于2019年2月21日创建。

1.技术领域

本发明一般地涉及医学和免疫学领域。更具体地说，它涉及抗原呈递细胞及其用途，例如扩增性自然杀伤(NK)细胞。

2.相关现有技术说明

与T细胞相比，自然杀伤细胞(NK)不需要预先暴露于抗原进行活化，这使得它们在抗肿瘤免疫监视方面非常有效。尽管不需要事先活化，但NK细胞的巨大杀伤能力需要严格控制，以防止意外的细胞毒性和自身免疫性。在临床上产生足够数量和最佳功能的NK细胞是另一障碍。因此，需要集中研究控制NK细胞生物学区分“耐受性”和“敏感性”靶细胞的分子机制，以设计辅助细胞来增强NK细胞介导的癌症免疫治疗。

发明内容

因此，本公开的某些实施方案提供了有关旨在用于细胞和免疫治疗的临床级NK细胞的制备、扩增、质量控制和功能表征的方法和组合物。

在第一实施方案中，提供了通用抗原呈递细胞(UAPC)，其经改造以表达(1)CD48和/或CS1(CD319)，(2)膜结合白细胞介素-21(mbIL-21)和(3)41BB配体(41BBL)。在一些方面，UAPC表达CD48。在其他方面，UAPC表达CS1。在特定方面，UAPC表达CD48和CS1。

在一些方面，UAPC基本上不表达内源性HLA I类、II类或CD1d分子。在某些方面，UAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。

在某些方面，UAPC被进一步限定为源自白血病细胞的aAPC。在一些方面，源自白血病细胞的UAPC被进一步限定为K562细胞。

在某些方面，改造被进一步限定为逆转录病毒转导。在一些方面，逆转录病毒转导被进一步限定为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的病毒构建体的转导。在某些方面，UAPC被辐照。

在进一步的实施方案中，提供了扩增免疫细胞的方法，所述方法包括在有效量的所述实施方案的UAPC(例如经改造以表达(1)CD48和/或CS1(CD319)、(2)膜结合白细胞介素-21(mbIL-21)和(3)41BB配体(41BBL)的通用抗原呈递细胞(UAPC))存在下培养免疫细胞。在一些方面，免疫细胞和UAPC以3:1至1:3的比例培养，例如3:1、3:2、1:1、1:2或1:3。在特定方面，免疫细胞和UAPC以1:2的比例培养。

在一些方面，扩增是在IL-2存在下进行的。在具体方面，IL-2以10-500U/mL的浓度存在，例如10-25、25-50、50-75、75-10、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400或400-500U/mL。在某些方面，IL-2以100-300U/mL的浓度存在。在特定方面，IL-2以200U/mL的浓度存在。在一些方面，IL-2是重组人IL-2。在具体方面，每2-3天补充IL-2，例如每2天或每3天补充一次。

在某些方面，至少第二次添加UAPC。在一些方面，免疫细胞是NK细胞或T细胞。在特定方面，免疫细胞是NK细胞。

在特定方面，免疫细胞来自脐带血(CB)、外周血(PB)、干细胞或骨髓。在具体方面，干细胞是诱导性多能干细胞。在一些方面，免疫细胞获自CB。在特定方面，CB由2个或更多个个体脐带血单元汇集而成。在具体方面，CB是由3个、4个、5个、6个、7个或8个个体脐带血单元汇集而成的。

在一些方面，NK细胞是CB单核细胞(CBMC)。在某些方面，NK细胞被进一步限定为CD56⁺NK细胞。

在某些方面，方法是在无血清培养基中进行的。

在更多方面，免疫细胞被改造以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，CAR包含CD19、CD123、间皮素、CD5、CD47、CLL-1、CD33、CD99、U5snRNP200、CD200、CS1、BAFF-R、ROR-1或BCMA抗原结合结构域。在一些方面，CAR是人源化CAR。在一些方面，CAR包含IL-15。在某些方面，CAR包含自杀基因。在一些方面，自杀基因是CD20、CD52、EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。

本文还提供了根据所述实施方案所产生的扩增免疫细胞群(例如，在有效量的本实施方案UAPC(例如，经改造以表达(1)CD48和/或CS1(CD319)、(2)膜结合白细胞介素21(mbIL-21)和(3)41BB配体(41BBL)的通用抗原呈递细胞(UAPC))存在下培养免疫细胞)。

在另一实施方案中，提供了药物组合物，其包含所述实施方案的扩增免疫细胞群和药学上可接受的载体。本文还提供了组合物，其包含有效量的所述实施方案的扩增免疫细胞，用于治疗受试者的疾病或病症。

进一步的实施方案提供了治疗受试者疾病或病症的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的所述实施方案的扩增免疫细胞。

在一些方面，疾病或病症是癌症、炎症、移植物抗宿主病、移植排斥、自身免疫性病症、免疫缺陷疾病、B细胞恶性病或感染。在特定方面，癌症是白血病。在一些方面，白血病是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)。在特定方面，病症是移植物抗宿主病(GVHD)。在一些方面，病症是多发性硬化症、炎症性肠病、类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、接触性超敏反应、哮喘或舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)。在一些方面，受试者是人。

在某些方面，免疫细胞是同种异体的。在一些方面，免疫细胞是自体的。在一些方面，免疫细胞是NK细胞或T细胞。

在更多方面，方法还包括施用至少第二治疗剂。在一些方面，所述至少第二治疗剂是治疗有效量的抗癌剂、免疫调节剂或免疫抑制剂。在某些方面，抗癌剂是化疗、放疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或免疫治疗。

在一些方面，免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗体、化疗剂辐照、趋化因子、白细胞介素、或者趋化因子或白细胞介素的抑制剂。

在更多方面，免疫细胞和/或至少第二治疗剂是经静脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌肉内、内窥镜、病灶内、经皮、皮下、局部施用的或者通过直接注射或灌注施用。在一些方面，第二治疗剂是抗体。在某些方面，抗体是单克隆、双特异性或三特异性抗体。在一些方面，抗体是利妥昔单抗。

本发明的其他目的、特征和优点将通过以下详细描述而变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实施例尽管表明本发明的优选实施方案，但是其仅是通过举例说明的方式给出的，因为对于本领域技术人员来说，本发明的精神和范围内的各种改变和修改将通过该详细描述而变得显而易见。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并被包括来进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅，结合本文所介绍的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。

图1：人自然杀伤细胞受体和靶细胞配体相互作用的拉链模型。人NK细胞通过多种受体与靶细胞相互作用，包括杀伤免疫球蛋白受体(KIR)、自然细胞毒性受体(NCR)、NKG2受体家族、柄蛋白(nectin)结合受体、SLAM家族受体等。NK细胞上的受体是活化型的(KIR2DL4、KIR3DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、CD94-NKG2C、DAP10、NKG2D、DAP10、CRTAM、DNAM、2B4、NTB-A、CD3ζ、CD100、CD160)或抑制型的(KIR2DL1/2/3/5A/5B、KIR3DL1/2/3、CD94-NKG2A、TIGIT、CD96、CEACAM-1、ILT2/LILRB1、KLRG1、LAIR1、CD161、Siglec-3/7/9)。

图2A-2E：(图2A-2B)具有IL-2或APC的新鲜或冷冻NK细胞的成倍扩增。(图2C)第0天、第7天或第14天的流式细胞术检测NK细胞中CD3和CD56的表达。(图2D)用APC刺激的NT-NK或SG4-NK细胞的细胞数。(图2E)用克隆9APC或UAPC刺激的NK细胞的生长动力学。

图3A-3D：(图3A)用于所示标志物的亲代K562细胞流式细胞术。未观察到mb-IL21、41BBL、CD48和SLAMF7(CS1)的表达。(图3B)转导克隆46(mbIL-21、41BBL)后APC流式细胞术分析。(图3C)转导表达CD48的uAPC构建体(nmIL-21、41BBL和CD48)后APC流式细胞术分析。(图3D)转导表达CS1的uAPC2构建体(mbIL-21、41BBL和CS1)后APC流式细胞术分析。

图4A-4D：MMLV逆转录病毒转移构建体图谱和注释。(图4A)mb-IL21的逆转录病毒转移载体。(图4B)41BBL的逆转录病毒转移载体。(图4C)CD48-Katushka的逆转录病毒转移载体。(图4D)CS1-EGFP的逆转录病毒转移载体。

具体实施方案

在本研究中，NK细胞最初的特征在于其抗肿瘤和抗同种异体细胞溶解功能，不同于先天免疫隔室的其他组分。控制NK细胞行为的无数免疫受体如图1所示为“拉链”图。信号传感器阵列可大致分为两大类，即活化型与抑制型。结构和信号传导方式进一步将这些类别分为相关的免疫受体家族。尽管尚未完全阐明NK细胞的膜蛋白质组，但利用NK细胞“拉链”内的功能冗余来调节细胞溶解功能，同时保持互补和拮抗途径之间的复杂和动态平衡。

因此，本公开的某些实施方案提供了关于旨在用于细胞和免疫治疗的临床级NK细胞的制备、扩增、质量控制和功能表征的方法和组合物。即使在最佳情况下，在满足时间限制的同时培养和成型临床相关数量的NK细胞用于输注给患者也是具有挑战性的。在某些方面，所公开的方法和组合物详述了NK细胞制备的技术过程、可实现的NK细胞扩增的细节和动力学以及验证成功细胞成型的分子表征。

在进一步的实施方案中，本文提供了体现为通用抗原呈递细胞(UAPC)的稳健平台技术来调节、成型和武装人自然杀伤(NK)细胞对抗肿瘤。本文的“UAPC”是指设计用于免疫细胞(例如NK细胞)优化扩增的抗原呈递细胞。本发明的UAPC由共刺激分子的独特组合产生，以克服抑制信号并诱导最佳的且特异性的NK细胞杀伤功能。广泛的测试表明UAPC微调了NK细胞机制并改善了肿瘤清除。本发明的UAPC可用于NK细胞介导的癌症免疫治疗。

通过在NK细胞敏感性K562抗原呈递细胞系(APC)中强制表达膜结合的白细胞介素21(mbIL-21)和4-1BB配体而产生了示例性APC(称为克隆46)。在另一实施方案中，通过在K562细胞中强制表达mbIL-21、4-1BB配体和CD48而产生了UAPC(称为通用APC(UAPC))。在另一实施方案中，通过在K562细胞中强制表达mbIL-21、4-1BB配体和CS1而产生了UAPC(称为UAPC2)。可以产生表达mbIL-21、41BBL和NK细胞特异性抗原(例如SLAM家族抗原(表1))的UAPC。

UAPC平台也可用于扩增其他免疫效应物，包括T细胞(例如α-β和γ-δT细胞)。免疫细胞(如NK细胞和T细胞)可以源自外周血、脐带血、骨髓或干细胞(包括诱导性多能干细胞)。这些免疫细胞可以使用本发明的UAPC进行离体扩增和活化，这是达到临床相关应用(例如癌症免疫治疗)的有意义量的培养所需的。

因此，本公开提供了一系列辅助细胞系，其被设计和制备来调节、调控、引发和扩增用于癌症免疫治疗的人免疫细胞(例如NK细胞)。

I.定义

就具体组分而言，如本文所使用的“基本上没有”在本文中用于表示没有该具体组分被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染而导致的具体组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是用标准分析方法不能检测到该具体组分的量的组合物。

如本说明书中所使用的“一个”或“一种”可以表示一个或多个/一种或多种。当与“包含”一词结合使用时，如权利要求中所使用的词语“一个”或“一种”可以表示一个/一种或多于一个/多于一种。

权利要求中术语“或”的使用是用来表示“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是相互排斥的，尽管公开内容支持仅指备选方案和“和/或”的定义。如本文所使用的“另一”可以表示至少第二个或更多个。术语“约”、“基本上”和“大约”通常表示所述值加或减5％。

“免疫病症”、“免疫相关病症”或“免疫介导的病症”是指免疫应答在疾病的发展或进展中起关键作用的病症。免疫介导的病症包括自身免疫病症、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病以及炎性和过敏性病况。

“免疫应答”是免疫系统细胞(例如B细胞或T细胞)或先天免疫细胞对刺激的应答。在一个实施方案中，该应答对特定抗原具有特异性(“抗原特异性应答”)。

“自身免疫性疾病”是指免疫系统产生针对作为正常宿主一部分的抗原(即自身抗原)的免疫应答(例如B细胞或T细胞应答)、随后对组织造成伤害的疾病。自身抗原可以来源于宿主细胞，或者可以来源于通常定殖于粘膜表面的共生生物，例如微生物(称为共生生物)。

“治疗”或者疾病或病况的治疗是指执行方案，其可以包括向患者施用一种或多种药物，以努力减轻疾病的病征或症状。治疗的理想效果包括降低疾病发展速度，改善或缓解疾病状态，缓和或改善预后。缓解能够在疾病或病况的病征或症状出现之前以及它们出现之后发生。因此，“治疗”可包括疾病或不良病况的“预防”。另外，“治疗”不需要完全缓解病征或症状，不需要治愈，并具体地包括对患者仅具有边际效应的方案。

在本申请全文中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指在该病况的医学治疗方面促进或增强受试者健康的任何事物。这包括但不限于降低疾病病征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可包括例如肿瘤尺寸的减小、肿瘤侵袭性的降低、癌症生长速率的降低或转移的预防。癌症的治疗也可以指延长患有癌症的受试者的生存期。

“受试者”和“患者”是指人或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在具体实施方案中，受试者是人。

短语“药学或药理学上可接受的”是指当适当地向动物(例如人)施用时不会产生不良、过敏或其他不需要反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员已知包含抗体或额外活性成分的药物组合物的制备。此外，对于动物(例如人)施用而言，将会理解制剂应符合FDA Office of Biological Standards所要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如水，醇/水溶液，盐溶液，肠胃外媒介物，例如氯化钠、林格氏葡萄糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，例如本领域普通技术人员已知的类似材料及其组合。根据公知的参数调节药物组合物中各种组分的pH和精确浓度。

术语“单倍型分型或组织分型”是指用于鉴定受试者的单倍型或组织类型的方法，例如通过确定在特定受试者的淋巴细胞上表达哪个HLA基因座(或哪些HLA基因座)。HLA基因位于主要组织相容性复合体(MHC)上，位于6号染色体短臂上的区域，参与细胞-细胞相互作用、免疫应答、器官移植、癌症发展和疾病易感性。在移植中有六个重要的遗传基因座，分别称为HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ。在每个基因座处，能够存在几个不同等位基因中的任一个。

广泛使用的单倍型分型方法使用聚合酶链反应(PCR)将受试者的DNA与编码MHC抗原基因的已知区段进行比较。这些基因区域的变异性决定了受试者的组织类型或单倍型。血清学方法也用于检测细胞表面上血清学定义的抗原。HLA-A、-B和-C决定簇能够通过已知的血清学技术来测量。简而言之，将来自受试者的淋巴细胞(从新鲜外周血中分离)与识别所有已知HLA抗原的抗血清一起孵育。将细胞铺在具有包含各种抗血清的显微孔的托盘中。将细胞孵育30分钟，然后再进行60分钟的补体孵育。如果淋巴细胞在其表面上具有被抗血清中的抗体识别的抗原，则淋巴细胞被裂解。能够添加染料来显示细胞膜通透性的变化和细胞死亡。裂解破坏的细胞模式表明组织学不相容的程度。例如，如果来自测试HLA-A3的人的淋巴细胞在含有HLA-A3抗血清的孔中被破坏，则该抗原组的测试就是阳性的。

术语“抗原呈递细胞(APC)”是指能够以可被免疫系统的具体效应细胞识别的肽-MHC复合物的形式呈递一种或多种抗原、从而诱导针对所呈递的一种或多种抗原的有效细胞免疫应答的一类细胞。术语“APC”包括完整的全细胞，例如巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、活化的T细胞和树突状细胞，或者天然存在或合成的能够呈递抗原的分子，例如与

-微球蛋白复合的纯化MHC I类分子。

II.通用抗原呈递细胞

本公开的一些实施方案涉及通用抗原呈递细胞(UAPC)的产生和用途。UAPC可用于扩增免疫细胞，例如NK细胞和T细胞。可以将UAPC改造以表达膜结合的IL-21(mbIL-21)和41BBL(CD137配体)。

可以将UAPC改造以表达CD137配体和/或膜结合细胞因子。膜结合的细胞因子可以是mIL-21或mIL-15。在特定实施方案中，UAPC被改造以表达CD137配体和mIL-21。APC可以源自癌细胞，例如白血病细胞。APC可以不具有内源性HLA I类、II类或CD1d分子的任何表达。APC可以表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。特别地，APC可以是K562细胞，例如被改造以表达CD137配体和mIL-21的K562细胞。APC可被照射。改造可以通过现有技术已知的任何方法进行，例如逆转录病毒转导。

细胞因子对整类免疫细胞(包括NK细胞)发挥非常有效的控制作用，影响细胞命运、细胞应答的活性和功效。细胞因子刺激而活化NK细胞的能力证实了它们的“天然”效应功能极易受到环境干预，这种引发可调节体内NK细胞的行为。

为了解决获得临床相关量NK细胞的问题，本方法可以使用白细胞介素(IL-21)作为本发明UAPC平台技术中NK细胞扩增的驱动因素。在人中，用IL-10和IL-21刺激NK细胞以STAT3依赖性方式诱导NKG2D表达。尽管细胞因子受体在许多免疫细胞中具有相似的细胞信号传导成分，但NK细胞特异性信号传导依赖于IL-21受体-STAT3关系进行增殖。

细胞因子信号传导对维持淋巴细胞存活和增殖很重要。在体内，IL-2施用是FDA批准的扩增NK细胞的唯一方法。另一种有效的NK细胞活化剂IL-15正在进行I期临床试验，作为IL-2的可能备选，但在全身给药后可能具有明显的毒性。除了明显的毒性外，这些细胞因子还诱导T细胞增殖，同时限制NK细胞的持久性。尽管具有相同的信号转导受体，但IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体对不同细胞具有不同且特异性的作用。

A.膜结合的IL-21

在某些实施方案中，为了特异性地激发NK细胞，可使用IL-21来产生本发明的UAPC。IL-21受体(IL21R)与能够通过其与常见细胞因子受体γ链(γ(c))的二聚化转导信号的IL-2受体β链密切相关，在活化的人NK细胞(准备好被触发的细胞)中被上调。尽管IL-21(I型细胞因子)能够调节T、B和NK细胞功能，但本研究发现只有人NK细胞通过活化IL21受体信号传导通路而发生显著扩增(即21天内1000倍)。相反，IL21在CD8⁺T细胞的缩减中起重要作用。

IL21R信号传导主要由STAT3(强力的细胞增殖活化剂)提供能量。IL21R-STAT3联系由IL-21诱导的STAT3 DNA与GAS和顺式诱导元件的结合所驱动，如通过免疫沉淀和用抗磷酸酪氨酸抗体进行的蛋白质印迹所证实的。IL21介导的增殖的分子基础能够特异性地追溯到IL21R上的酪氨酸510(Y510)，其介导IL-21诱导的STAT1和STAT33的磷酸化。Stat1/Stat3双敲除小鼠中通过抑制IL-21应答而进一步印证了这一机制。

IL21R信号传导对NK细胞毒性很重要。人IL21R缺乏与51Cr标记的K562靶细胞的细胞溶解受损有关，而抗体依赖性细胞毒性不受影响。单基因非胚胎致死缺陷(IL21R中的功能丧失突变)提供了很好的机会来阐明，因此可用于模拟、增强和成型先天性NK细胞溶解反应。

尽管CD56^dim和CD56^bright细胞群都具有相似数量的表面IL21R，但IL-21信号传导选择性地塑造NK细胞亚群。CD56^bright与CD56^dim NK细胞相比，IL-21诱导STAT1和STAT3磷酸化更高。相反，IL-21对STAT5活化没有影响，STAT5活化是IL-2活化途径，其也驱动T细胞扩增。除STAT3活化外，IL-21信号传导还参与MAPK和PI3K途径，并诱导NK细胞中先天免疫应答基因的表达，包括IFN-γ、T-bet、IL-12Rβ2和IL-18R，引发它们杀死肿瘤细胞。

为了有效利用IL-21，可以使用mbIL-21的表达(图4A)来集中和定位NK细胞上与IL21R的反式相互作用。mbIL21的膜临近确保在需要时随时可用，因此它能够维持最佳的细胞增殖，而无需大量和高浓度的外源提供的IL-21。与经辐照的K562-mb15-41BBL共培养诱导了来自外周血的CD56+CD3-NK细胞的中值21.6倍的扩增。与仅使用来自共有γc家族的可溶性细胞因子(包括单独或组合的IL-2、IL-12、IL-15、IL-21)进行刺激相比，这种扩增更高。相比之下，本发明的UAPC能够在14-21天内将NK细胞扩增至少1000倍(3-log)。mbIL21在UAPC上的表达也能够免去对外源临床级细胞因子的需要。

B.4-1BBL(4-1BB配体，CD137配体，CD137L，TNFSF9)

除了引发NK细胞功能的细胞因子的概念之外，与NK细胞中的活化分子的直接物理相互作用导致了增强的细胞增殖反应。CD137(4-1BB)是肿瘤坏死受体(TNF-R)基因家族的成员，其介导细胞增殖、分化和程序性细胞死亡(细胞凋亡)。首先表征了鼠受体，然后是人同源物，其在氨基酸水平上具有60％的同一性，在细胞质/信号传导结构域中具有显著保守性。CD137主要在活化的T细胞和NK细胞中表达，在胸腺细胞、骨髓细胞和炎症部位的内皮细胞中可检测到不同水平。生理上的CD137信号传导是通过以下方式介导的：1)NF-κB，其通过Bcl-XL活化促进存活，和2)PI3K/ERK1/2途径，其特异性驱动细胞周期进程。

在活化的NK细胞中，CD137是细胞因子诱导的共刺激分子，其反过来通过增加细胞增殖和IFN-γ分泌来驱动NK细胞中的抗肿瘤应答。使用CD137L-/-敲除小鼠的研究阐明了CD137/CD137L信号传导在开发抗肿瘤免疫细胞中的重要性。与对照小鼠相比，CD137-/-敲除小鼠具有高出4倍的肿瘤转移发生率。

CD137配体(CD137L，4-1BB配体)是TNF超家族的34kDa糖蛋白成员，主要在活化的抗原呈递细胞(APC)中检测到，包括B细胞、巨噬细胞和树突状细胞以及在活化T细胞中以低水平瞬时表达。与鼠对应物相比，人CD137L仅36％同源。与激动性CD137抗体的抗肿瘤功效一致，已显示CD137L结合引发了CTL和抗肿瘤活性。

因此，本发明的UAPC可以被改造来表达4-1BB配体(CD137的生理反受体)以用于刺激。

C.SLAM/CD48

除了细胞因子调节和4-1BBL共刺激之外，NK和靶细胞之间的直接物理相互作用也影响细胞应答，即杀死靶细胞。在细胞间相互作用方面，广泛表达并在免疫系统中起关键作用的同源免疫球蛋白受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM，以前也称为CD2超家族)家族尤其重要。

因此，本公开的UAPC可以表达一种或多种SLAM家族抗原。SLAM家族成员包括CD2、CD48、CD58(LFA-3)、CD244(2B4)、CD229(Ly9)、CD319(CS1(CD2亚群1)；CRACC(CD2样受体活化细胞毒性细胞))和CD352(NTB-A(NK-T-B抗原))。在特定方面，UAPC表达CD48和/或CS1。NK细胞表达SLAM家族(SLAMF)的至少三个成员。它们是2B4、NK、T细胞和B细胞抗原(NTB-A)和CD2样受体活化细胞毒性细胞(CRACC)，它们识别靶细胞上和可能的其他NK细胞上的其相应配体CD48、NTB-A和CRACC。尽管SLAMF1、3、5、6、7、8和9是亲同种(自身配体)受体，但SLAMF2和SLAMF4是彼此的反受体(嗜异性)。已知的亲同种亲和力(解离常数Kd<1μM至200μM)的宽范围(三个数量级)表明SLAM糖蛋白的重叠但不同的信号传导机制的机制基础。

表1：SLAM家族成员结合亲和力。

在特定实施方案中，本发明的UAPC被改造以表达CD48以增强细胞间相互作用以增强NK细胞应答。CD48是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-AP)，存在于NK细胞、T细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞表面，参与这些细胞的粘附和活化途径。尽管CD48缺少胞内结构域，但刺激CD48可诱导脂筏中信号传导因子的重排、Lck激酶活性和酪氨酸磷酸化。作为粘附和共刺激分子，CD48诱导B和T淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的多种效应。在人NK细胞中，CD48是NK细胞重要活化剂2B426的反受体。这种嗜异性相互作用被认为是为了与CD244竞争同MHC-I的相互作用。2B4/CD48相互作用因此而在人NK细胞中诱导活化信号，而在鼠NK细胞中则发出抑制信号。

尽管相同群体细胞之间的2B4-CD48相互作用(即NK细胞-NK细胞相互作用或T细胞-T细胞相互作用)通过在APC上(例如通常不含CD48的K562骨髓细胞系)表达CD48而导致增强的活化，但UAPC能够在NK细胞上反式开启强力的2B4信号传导通路。

D.SLAM/CS1

在一些实施方案中，本发明的UAPC被改造以将SLAM家族的另一成员CS1表达为共同刺激分子，以开启NK细胞的杀伤能力。与CD48反结合到2B4不同，CS1相互作用是亲同种的，能够在顺式和反式相互作用的背景下被表征。通常不含CS1的K562细胞可以被改造以表达CS1。

E.核酸的递送

mbIL-21、41BBL和共刺激抗原可通过本领域已知的任何方法进行改造。核酸通常以表达载体的形式给药，例如病毒表达载体。在一些方面，表达载体是逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、DNA质粒表达载体或AAV表达载体。在一些方面，递送是通过递送一种或多种载体、其一种或多种转录体和/或将由其转录的一种或多种蛋白质递送到细胞。

用于将多核苷酸构建体引入动物细胞的方法是已知的，作为非限制性例子，包括其中的多核苷酸构建体整合到细胞基因组中的稳定转化方法，其中的多核苷酸结构未整合到细胞基因组中的瞬时转化方法，以及病毒介导的方法。在一些实施方案中，可通过例如重组病毒载体(如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将多核苷酸引入细胞中。例如，在一些方面，瞬时转化方法包括显微注射、电穿孔或粒子轰击。在一些实施方案中，考虑到在细胞中进行表达，可将多核苷酸包括在载体中，更具体地说是质粒或病毒中。

核酸的非病毒递送方法包括脂转染(lipofection)、细胞核转染(nucleofection)、显微注射、生物弹道技术(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和试剂增强的DNA摄取。脂转染描述于例如美国专利号5049386、4946787和4897355，脂转染试剂是商业化出售的(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Feigner，WO 91117424；WO 91116024中的那些。能够递送至细胞(如体外或离体施用)或靶组织(如体内施用)。

在一些实施方案中，递送是通过使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸。在一些方面，病毒载体可直接向患者施用(体内)，或者它们能够被用于在体外或离体处理细胞，然后向患者施用。在一些实施方案中，基于病毒的系统包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。

III.免疫细胞

本公开的一些实施方案涉及免疫细胞的分离和扩增，例如用于癌症免疫治疗的NK细胞或T细胞。

在某些实施方案中，免疫细胞通过本领域公知的方法来源于人外周血单核细胞(PBMC)、非刺激性白细胞分离产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、骨髓或脐带血。具体来说，免疫细胞可以从脐带血(CB)、外周血(PB)、骨髓或干细胞中分离出来。在特定实施方案中，免疫细胞是从汇集的CB中分离的。CB可由2、3、4、5、6、7、8、10个或更多个单元汇集。免疫细胞可以是自体或同种异体的。分离出的免疫细胞可以与要实施细胞治疗的受试者是单体型匹配的。在人中NK细胞能够通过特定的表面标志物检测到，所述表面标志物比如CD16、CD56和CD8。

在某些方面，通过先前描述的NK细胞离体扩增方法分离NK细胞(Spanholtz等人，2011；Shah等人，2013)。在该方法中，通过ficoll密度梯度离心分离CB单核细胞。可去除细胞培养物中任何表达CD3的细胞，并进行表征来确定CD56⁺/CD3^-细胞或NK细胞的百分比。在其他方法中，使用脐带血(CB)通过分离CD34⁺细胞来获得NK细胞。该方法可包括去除CD3、CD14和/或CD19阳性细胞。

分离的免疫细胞可在本发明的UAPC存在下扩增。扩增可持续约2-30天，例如3-20天，特别是12-16天，例如12、13、14、15、16、17、18或19天，具体而言约14天。免疫细胞与UAPC可以以约3:1-1:3的比例存在，如2:1、1:1、1:2，特别是约1:2。扩增培养物还可包含促进扩增的细胞因子，例如IL-2。IL-2可以以约10-500U/mL的浓度存在，例如100-300U/mL，特别是约200U/mL。IL-2可在扩增培养物中进行补充，例如每2-3天补充一次。UAPC至少可以被第二次添加到培养物中，例如在大约7天的扩增期。

扩增后，免疫细胞可立即灌注或者可以储存，例如通过冷冻保存。在某些方面，细胞可在约1、2、3、4、5天内作为大量群体而被离体增殖数天、数周或数月。

扩增的NK细胞能够分泌I型细胞因子，如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，它们能活化先天免疫细胞和适应性免疫细胞两者以及其他细胞因子和趋化因子。这些细胞因子的测定能够用来确定NK细胞的活化状态。此外，本领域已知的用于确定NK细胞活化的其他方法可用于表征本公开的NK细胞。

IV.嵌合抗原受体

在某些实施方案中，本发明的免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR包含：a)胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，以及c)包含抗原结合区的胞外结构域。

CAR识别独立于人白细胞抗原(HLA)的细胞表面肿瘤相关抗原，并利用一种或多种信号传导分子活化基因修饰的NK细胞，进行杀伤、增殖和细胞因子产生。在某些实施方案中，可通过以下方法对现有NK细胞进行基因修饰，包括(i)使用电穿孔装置(例如nucleofector)进行非病毒基因转移；(ii)通过内结构域(例如CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)信号传导的CAR，(iii)具有可变长度的胞外结构域的CAR，该胞外结构域将抗原识别结构域连接到细胞表面，以及在某些情况下，(iv)源自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其能够强力地和大量地扩增CAR⁺NK细胞(Singh等人，2011)。

本公开的实施方案涉及核酸的用途，包括编码抗原特异性CAR多肽的核酸，包括经人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域以及包含一个或多个信号传导基序的胞外结构域。在某些实施方案中，CAR可识别包含一种或多种抗原之间的共有间隔的表位。在某些实施方案中，结合区能够包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一实施方案中，该特异性源自与受体结合的肽(例如细胞因子)。

可预期人CAR核酸可以是用于增强人患者细胞免疫治疗的人基因。在具体实施方案中，本发明方法使用全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域能够包含源于特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的V_H和V_L链片段，例如通过引用并入本文的美国专利7109304中所述的。片段也能够是人抗原特异性抗体的任意数量的不同抗原结合结构域。在更具体的实施方案中，片段是抗原特异性scFv，由经人细胞表达所用的人密码子优化的序列所编码。

这种排列可以是多体的，比如双抗体(diabody)或多体(multimers)。多体最可能是由轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体而形成的。构建体的铰链部分能够有多种选择，从完全缺失到保留第一个半胱氨酸，到脯氨酸而不是丝氨酸取代，到被截短到第一个半胱氨酸。Fc部分能够缺失。任何稳定的和/或二聚化的蛋白质都能够达到这个目的。可使用Fc结构域之一，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。可以使用已被修饰的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区以改善二聚化。在其他方面，可仅使用免疫球蛋白的铰链部分或CD8α的部分。

在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其他共刺激受体的序列，例如跨膜结构域和修饰的CD28胞内信号传导结构域。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10和4-1BB(CD137)中的一种或多种。除了由CD3ζ起始的一级信号外，插入人体CAR中的人共刺激受体所提供的额外信号对于NK细胞的充分活化是重要的，并可能有助于提高过继免疫治疗的体内持久性和治疗成功率。

嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域负责活化嵌合抗原受体所在的免疫细胞的至少一种正常效应功能。效应功能是分化细胞(如NK细胞)的专门功能。在具体实施方案中，CAR中的胞内受体信号传导结构域包括T细胞抗原受体复合物的那些结构域，例如CD3的ζ链，还有单独或者与例如CD3ζ一起的FcγRIII共刺激信号传导结构域：CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2。在具体实施方案中，胞内结构域(可被称为胞质结构域)包含TCRζ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12和CD40中的一种或多种。内源性T细胞受体复合物的任何部分都可以用于胞内结构域。可以采用一个或多个胞质结构域，例如所谓的第三代CAR具有至少两个或三个信号传导结构域融合在一起以实现累加或协同效应。

在CAR的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(可被称为包含抗原结合区的胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域。抗原包括模式识别受体(如Dectin-1)所识别的碳水化合物抗原。肿瘤相关抗原可以是任何类型的，只要它表达在肿瘤细胞的细胞表面。肿瘤抗原结合结构域可以是但不限于CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30，CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。CAR可包含人源化scFv，例如人源化CD19或CD123。

在某些实施方案中，当存在少量肿瘤相关抗原时，CAR可与细胞因子共同表达以改善持久性。例如，CAR可与IL-15共表达。

编码嵌合受体的开放读码框序列能够从基因组DNA源、cDNA源获得或能够被合成(例如通过PCR)或其组合。根据基因组DNA的大小和内含子的数量，可希望使用cDNA或其组合，因为发现内含子稳定了mRNA。此外，使用内源性或外源性非编码区来稳定mRNA还可以更为有利。

可预期嵌合构建体能够作为裸DNA或在合适载体中被引入NK细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是现有技术已知的。参见例如美国专利号6410319。裸DNA通常是指以适当表达定向的方式包含在质粒表达载体中的编码嵌合受体的DNA。

备选地，能够使用病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入NK细胞。用于根据本发明方法的合适载体是在NK细胞中不复制的。已知大量基于病毒的载体，其中在细胞中维持的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。

CAR可以表达自杀基因，例如CD20、CD52、EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。

CAR可以包含肿瘤抗原结合结构域。肿瘤抗原结合结构域可以是但不限于CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变p53、突变ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。CAR可以包含人源化scFv，例如人源化CD19、CD123、间皮素、CD5、CD47、CLL-1、CD33、CD99、U5snRNP200、CD200、CS1、BAFF-R、ROR-1或BCMA。

V.使用方法

本公开的实施方案涉及用于本文所提供的免疫(例如NK或T)细胞(例如由本发明的UAPC所扩增的)用途的方法，用于通过转移引发免疫应答的免疫细胞群来治疗或预防医学疾病或病症。该方法包括向受试者施用治疗有效量的所扩增的免疫细胞，从而治疗或预防受试者的病症。在本公开的某些实施方案中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群来治疗癌症或感染。由于它们释放促炎性细胞因子，免疫细胞可以通过促进辅助免疫细胞的分化、活化和/或向恶性病部位的募集来逆转抗炎性肿瘤微环境并增加适应性免疫应答。

适用于本治疗方法的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中所发现的那些。示例性实体瘤可包括但不限于选自胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房的器官的肿瘤。示例性血液肿瘤包括骨髓种瘤、T或B细胞恶性病、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文所提供的方法治疗的癌症的更多例子包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)，腹膜癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)，胰腺癌，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，各种类型的头颈部癌和黑素瘤。

癌症可以具体是以下组织学类型，尽管它不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡性腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜氧腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非囊性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；顶浆腺癌(apocrineadenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌(ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(paget's disease)；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性睾丸母细胞瘤(androblastoma)；sertoli细胞癌；恶性leydig细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑素瘤；无色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；lentigo恶性黑素瘤；肢端雀斑样痣性黑素瘤；结节性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合性肿瘤；米勒管混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性brenner肿瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏(ewing's)肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金疾病；霍奇金病；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他具体非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)性NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小非分裂细胞性NHL；巨大肿块(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞性白血病；骨髓肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；以及慢性成髓细胞性白血病。

特定实施方案涉及治疗白血病的方法。白血病是血液或骨髓的癌症，其特征在于血细胞(通常是白细胞)的异常增殖(通过倍增产生)。它是称为血液肿瘤的广泛疾病组的一部分。白血病是涵盖多种疾病的广义术语。白血病在临床和病理学上分为其急性和慢性形式。

急性白血病的特征是未成熟血细胞的快速增殖。这种堵塞使得骨髓无法产生健康的血细胞。儿童和年轻人可能发生急性形式的白血病。急性白血病需要立即治疗，因为恶性细胞迅速发展和积聚，然后溢出到血流中并扩散到身体的其他器官中。中枢神经系统(CNS)病变并不常见，尽管该疾病偶尔会引起颅神经麻痹。慢性白血病的区别在于相对成熟但仍然异常的血细胞的过度积聚。通常需要数月至数年的时间来发展，细胞以比正常细胞高得多的速度产生，导致血液中许多异常的白细胞。慢性白血病主要发生在老年人身上，但理论上可能发生在任何年龄组。急性白血病必须立即治疗，而慢性形式有时候则要在治疗前监测一段时间以确保治疗的最大有效性。

此外，将疾病分为淋巴细胞性或成淋巴细胞性(这表明癌性变化发生在通常继续形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中)以及骨髓性的或髓性的(这表明癌性变化发生在通常继续形成红细胞、一些类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中)。

急性淋巴细胞性白血病(也称为急性成淋巴细胞性白血病或ALL)是幼儿中最常见的白血病类型。这种疾病也影响成年人，特别是65岁及以上的成年人。慢性淋巴细胞性白血病(CLL)最常影响55岁以上的成年人。它有时发生在更年轻的成人身上，但几乎从不影响儿童。急性骨髓性白血病(也称为急性髓性白血病或AML)在成人中比在儿童中更常见。这种类型的白血病以前称为急性非淋巴细胞性白血病。慢性骨髓性白血病(CML)主要发生在成人中。

淋巴瘤是起源于淋巴细胞(脊椎动物免疫系统中的一类白细胞)的一类癌症。有许多类型的淋巴瘤。根据美国国立卫生研究院的数据，淋巴瘤占美国所有癌症病例的约5％，特别是霍奇金淋巴瘤占美国所有癌症病例的不到1％。由于淋巴系统是人体免疫系统的一部分，免疫系统弱化的患者(如HIV感染或由于某些药物或药物处理)也具有更高的淋巴瘤发病率。

在本公开的某些实施方案中，将免疫细胞递送至有需要的个体，例如患有癌症或感染的个体。然后细胞会增强个体的免疫系统以攻击相应的癌症或病原体细胞。在一些情况下，向个体提供一剂或多剂免疫细胞。在向个体提供两剂或更多剂的免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以允许在个体中繁殖的时间，在具体实施方案中，施用之间的持续时间是1、2、3、4、5、6、7天或更多天。

预活化和扩增的免疫细胞的来源可以是任何类型的，但在具体实施方案中，细胞获自例如脐带血、外周血、人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的库。对于治疗效果的合适剂量为例如每剂量至少10⁵个或者约10⁵至约10¹⁰个细胞，优选为一系列给药周期。示例性给药方案由下述组成：递增剂量的四个一周给药周期，例如在第0天开始至少约10⁵个细胞，在起始同一患者剂量(intra-patient dose)增量方案的几周内逐步增加至约10¹⁰个细胞的目标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过储库进入设备(reservoir-accessdevice))、腹膜内和直接注射到肿瘤块中。

在一种示例性方法中，NK细胞可源自生物样本，例如一个或多个脐带血单元。脐带血单元可以是冷冻脐带血单元。可将脐带血单元解冻并进行ficoll梯度以获得单核细胞。可以除去单核细胞中的CD3、CD14和CD19阳性细胞，例如通过CliniMAS进行。然后可以在APC和IL-2(例如200U/mL)存在下培养阴性选择的NK细胞。然后可以用表达CAR的逆转录病毒上清液转导NK细胞，并用γ-辐照的APC和IL-2培养。最后，可以对细胞进行CAR(例如CD56、CD16、CD3、CD19、CD14或CD45)的阳性表达分选。

根据本方法产生的免疫细胞具有许多潜在用途，包括实验和治疗用途。特别地，预期这样的细胞群在抑制不希望的或不适当的免疫应答方面非常有用。在这样的方法中，从患者中取出少量免疫细胞，然后在将它们回输到患者体内之前进行离体操作和扩增。可以以这种方式治疗的疾病的例子是自身免疫疾病和需要抑制免疫活性的病况，例如对于同种异体移植耐受性。治疗方法可包括提供哺乳动物，从哺乳动物获得免疫细胞；根据如上所述的本发明方法的方法离体扩增免疫细胞；以及将扩增的免疫细胞施用给待治疗的哺乳动物。

本公开的药物组合物能够单独使用或与用于治疗癌症的其他公认的药剂组合使用。无论是单独递送还是与其他药剂组合递送，本公开的药物组合物都能通过各种途径递送至哺乳动物(特别是人)体内的各种部位以实现特定效果。本领域技术人员将认识到，尽管能够使用多于一种途径进行施用，但是特定途径能够提供比另一途径更直接和更有效的应答。例如，皮内递送可以比吸入有利地用于治疗黑素瘤。局部或全身递送能够通过包括将制剂应用或滴入体腔、吸入或吹入气溶胶或者或通过肠胃外引入(包括肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或皮内施用)的施用来实现。

本公开的某些实施方案提供了治疗或预防免疫介导的病症的方法。在一个实施方案中，受试者患有自身免疫疾病。自身免疫疾病的非限制性例子包括：斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合征，自身免疫性艾迪生病(autoimmune Addison's disease)，肾上腺自身免疫性疾病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性卵巢炎和睾丸炎，自身免疫性血小板减少症，Behcet病，大疱性类天疱疮，心肌病，乳糜泻性皮炎(celiac spate-dermatitis)，慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，CREST综合征，冷凝集素病，克罗恩病，盘状狼疮，特发性混合型冷球蛋白血症，纤维肌痛-纤维肌炎，肾小球肾炎，格雷夫斯病(Graves'disease)，Guillain-Barre，桥本氏甲状腺炎，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA神经病，幼年关节炎，扁平苔藓，红斑狼疮，美尼尔病(Meniere's disease)，混合性结缔组织病，多发性硬化症，1型或免疫介导的糖尿病，重症肌无力，肾病综合征(例如微变化疾病，局灶性肾小球硬化或膜性肾病)，寻常型天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多软骨炎，多腺体综合征，风湿性多肌痛，多发性肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，牛皮癣，牛皮癣关节炎，雷诺现象(Raynaud's phenomenon)，赖特综合征(Reiter's syndrome)，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病，舍格伦综合征(Sjogren'ssyndrome)，僵人综合征，系统性红斑狼疮，红斑狼疮，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎(如结节性多动脉炎、大动脉炎(takayasu arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎或者疱疹样皮炎血管炎)，白癜风以及韦格纳肉芽肿病。因此，能够使用本文公开的方法进行治疗的自身免疫疾病的一些例子包括但不限于多发性硬化症，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，I型糖尿病，克罗恩病；溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球肾炎，强直性脊柱炎，血管炎或者牛皮癣。受试者还可患有过敏性病症，例如哮喘。

在又一个实施方案中，受试者是移植器官或干细胞的受体，使用免疫细胞来预防和/或治疗排斥反应。在特定实施方案中，受试者患有移植物抗宿主病或者处于发生该疾病的风险中。GVHD是使用或包含来自相关或不相关供体的干细胞的任何移植物的可能并发症。有两种GVHD，急性的和慢性的。急性GVHD出现在移植后的前三个月内。急性GVHD的病征包括手和脚上的红色皮疹，可能会扩散并变得更严重，皮肤脱皮或起泡。急性GVHD还能够影响胃和肠，在这种情况下会出现痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛变黄(黄疸)表明急性GVHD已经影响了肝脏。慢性GVHD根据其严重程度进行排序：1期/1级为轻度；4期/4级为严重。慢性GVHD在移植后三个月或更晚发生。慢性GVHD的症状与急性GVHD的相似，但除此之外，慢性GVHD还可能影响眼睛的粘膜腺、口腔中的唾液腺以及润滑胃壁和肠道的腺体。能够使用本文所公开的任何免疫细胞群。移植器官的例子包括实体器官移植，例如肾、肝、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或者细胞移植，例如胰岛细胞、肝细胞、成肌细胞、骨髓或造血或其他干细胞。移植物可以是复合移植物，例如面部组织。免疫细胞能够在移植前、移植同时或移植后施用。在一些实施方案中，免疫细胞在移植前施用，例如移植前至少1小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周或至少1个月。在一个具体的非限制性例子中，治疗有效量的免疫细胞的施用在移植前3-5天进行。

在某些实施方案中，免疫细胞与第二治疗剂联合给药。例如，第二治疗剂可以包含T细胞、免疫调节剂、单克隆抗体或化疗剂。在非限制性例子中，免疫调节剂是来那多胺(lenolidomide)，单克隆抗体是利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumab)或鲁昔单抗(lumiliximab)，化疗剂是氟达拉滨或环磷酰胺。

本公开的组合物能够以单位剂型提供，其中每个剂量单位(例如注射剂)含有预定量的组合物(单独或与其它活性剂适当组合)。本文所使用的术语单位剂型是指适合作为单位剂量用于人和动物受试者的物理上分开的单位，每个单位含有预定量的本发明组合物(单独或与其他活性剂组合)，其计算量足以产生所需的效果，适当时与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合。本发明的新型单位剂型的规格取决于与特定受试者中的药物组合物相关的特定药效学。

理想地，组合物中存在有效量或足够数量的分离的转导免疫细胞并将其引入受试者中，使得能够建立长期、特异性的抗肿瘤反应，从而与缺少这种治疗相比，减小肿瘤的大小或消除肿瘤生长或再生。理想地，与不存在免疫细胞而其他相同的条件相比，重新引入受试者中的免疫细胞的量导致10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的肿瘤尺寸减小。

因此，施用的免疫细胞的量应考虑施用途径，并且应使得引入足够数量的免疫细胞以实现期望的治疗反应。此外，本文所述组合物中包含的每种活性剂的量(例如，每个细胞要接触的量或每一定体重的量)能够在不同的应用中变化。通常，理想的免疫细胞浓度应足以在待治疗受试者中提供至少约1×10⁶至约1×10⁹个免疫细胞，甚至更理想地约1×10⁷至约5×10⁸个免疫细胞，尽管能够使用高(例如大于5×10⁸个细胞)或低(例如小于1×10⁷个细胞)的合适量。给药方案能够基于公认的基于细胞的治疗(参见例如Topalian和Rosenberg，1987；美国专利号4690915)，或者能够采用备选的连续输注策略。

这些值提供了在优化本发明方法进行发明实施时由执业医师要使用的免疫细胞范围的一般性指南。如在特定应用中可能要保证的，本文中对这些范围的列举绝不排除使用更高或更低量的组分。例如，实际剂量和方案能够根据组合物是否与其他药物组合物联合施用，或者取决于药代动力学、药物处置和代谢的个体间差异而不同。本领域技术人员能够根据特定状况的紧急情况容易地进行任何必要的调整。

VI.试剂盒

在一些实施方案中，提供了能够包括例如一种或多种用于产生UAPC和/或免疫细胞的培养基和组分的试剂盒。此类制剂可以包含以适于与APC和/或免疫细胞组合的形式存在的因子混合物。合适的话，试剂体系可以以水性介质或冻干形式进行包装。试剂盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，其中可以放置组分，并且优选地适当等分。如果试剂盒中有多于一种组分，试剂盒通常还会包含第二个、第三个或其他附加容器，附加组分可以单独放置在其中。然而，组分的各种组合都可以包含在小瓶中。试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，能够通过加入合适的溶剂来重建粉末。设想溶剂也可以提供在另一容器装置中。试剂盒通常还包括用于将试剂盒组分严格封闭形式包含后用于商业销售的装置。这样的容器可以包括注射或吹塑的塑料容器，其中保留所需的小瓶。试剂盒还能够包括使用说明书，例如打印或电子形式(如数字形式)的使用说明书。

VII.实施例

包括以下实施例来证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，下面实施例中所公开的技术代表了发明人所发现的在本发明实施中起良好作用的技术，因此能够被认为构成了实施它的优选模式。然而，本领域技术人员应理解，根据本公开，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中能够进行许多改变且仍获得相似或类似的结果。

实施例1——mbIL21、4-1BBL和SLAM(CD48/CS1)的组合

通过用CD48-Katushka或CS1-EGFP关于膜结合IL-21和41BBL(CD137配体)的逆转录病毒构建体转导K562细胞，产生了通用抗原呈递细胞(UAPC)。MMLV逆转录病毒构建体图谱和注释示于图4A-4D中。克隆46(图3B)通过在NK细胞敏感性K562(HLA-A^-,HLA-B^-)APC中强制表达mbIL-21和41BBL而产生(图3A)。UAPC是通过在K562细胞中强制表达mbIL-1、41BBL和CD48而产生的(图3C)。UAPC2是通过在K562细胞中强制表达mbIL-21、41BBL和CS1而产生的(图3D)。

NK细胞的数量扩增是通过克隆46、UAPC或UAPC2的活化进行的。通过APC共培养的NK细胞增殖和扩增表明，与先前公布的克隆9相比，克隆46在扩增未转导的NK细胞(NT-NK)和CAR转导的细胞(SG4-NK)的能力方面更为优越(图2B)。

与先前公布的克隆9(33小时的倍增时间)相比，通过与UAPC共培养的NK细胞扩增被证明在将NK细胞倍增时间减少至31.38小时的能力方面更为优越，产生了2周内44％的增殖优势(UAPC扩增1671倍，克隆9扩增1161倍)(图2E)。倍增时间、倍数扩增和起始细胞群之间的关系通过下式概括：

其中N_f是最终细胞数，N_b是起始细胞数，e＝2.71828(数学常数，也称为欧拉数)，T是以小时为单位的培养时间跨度，T_D是以小时为单位的倍增时间。倍增时间以指数方式影响最终细胞数，从而复合了指定细胞培养期内的增殖优势，使得能够在很紧的时间范围内收获临床相关数量的细胞。因此，本方法允许通过与UAPC共培养来有效产生NK细胞。

本平台技术利用具体的组合治疗途径来提供用于制备旨在用于癌症免疫治疗的大量临床级高度功能性和细胞毒性NK细胞的实用方法。扩增的细胞是100％的NK细胞，没有可检测到的T细胞，避免了许多免疫细胞制剂中常见的意外的移植物抗宿主副作用。

* * *

根据本公开，无需过度实验就能够进行和实施本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法以及方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，化学和生理学上相关的某些试剂可以替换本文所述的试剂而得到相同或类似的结果，这将是显而易见的。对于本领域技术人员而言显而易见的所有这些类似替换和修饰都被认为在本发明的精神、范围和概念内，本发明的精神、范围和概念如所附权利要求所限定的。

参考文献

以下参考文献通过引用而被专门并入本文，程度为由它们提供对本文所述进行补充的示例性程序或其他细节。

Czerkinsky等人,J.Immunol.Methods 1988；110:29-36.

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Olsson等人.J.Clin.Invest.1990；86:981-985.

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美国专利号5,939,281

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美国专利号6,264,951

美国专利号7,488,490

美国专利申请号2007/0078113

序列表

<110> 得克萨斯大学体系董事会

REZVANI, KATY

ANG, SONNY O.T.

LIU, ENLI

SHPALL, ELIZABETH

<120> 通用抗原呈递细胞及其用途

<130> UTFC.P1355WO

<150> 62633587

<151> 2018-02-21

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8202

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CS1构建体

<400> 1

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60

atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120

agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180

aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420

ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480

ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540

cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600

ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660

tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatgcgact gattttatgc 720

gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg gcggacccgt gggctggaac 780

tgacgagttc ggaacacccg gccgcaaccc tgggagacgt cccagggact tcgggggccg 840

gctttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc 900

ccccttaggc aggagggata tgtggttctg gtaggagacg agaacctaaa acagttcccg 960

cctccgtctg aatttttgct ttcggtttgg gaccgaagcc gcgccgcgcg tcttgtctgc 1020

tgcagcatcg ttctgtgttg tcgctctgtc tgactgtgtt tctgtatttg tctgaaaata 1080

tgggcccggg ctagcctgtt accactccct gctaagtttg accttaggtc actggaaaga 1140

tgtcgagcgg atcgctcaca accagtcggt agatgtcagc agaagagacg ttgggttacc 1200

ttctgctctg cagaatggcc aacctttaac gtcggatggc cgcgaggcac ggcaccttta 1260

accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc 1320

cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg 1380

tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc 1440

cccttggcaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag ccctcactcc 1500

ttctctaggc gcccccatat ggccatatga gatcttatat ggggcacccc cgccccttgt 1560

aaacttccct gaccctgaca tgacaagagt tactaacagc ccctctctcc aagctcactt 1620

acaggctctc tacttagtcc agcacggcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa 1680

gaacaactgg accgaccggt ggtacctcac ccttgcaccg agtcggcgac acagtgtggg 1740

tccgccgaca ccagactaag aacctagaac ctcgctggaa aggcgacctt acacagtcct 1800

gctgaccacc cccaccgccc tcaaagtaga cggcatcgca gcttggatac acgccgccca 1860

cgtgaaggct gccgaccccg ggggtggacc atcctctaga ctgccatgct cgaggccggc 1920

agccccacct gcctgaccct gatctacatc ctgtggcagc tgaccggcag cgccgccagc 1980

ggccccgtga aggagctggt gggcagcgtg ggcggcgccg tgaccttccc cctgaagagc 2040

aaggtgaagc aggtggacag catcgtgtgg accttcaaca ccacccccct ggtgaccatc 2100

cagcccgagg gcggcaccat catcgtgacc cagaacagaa acagagagag agtggacttc 2160

cccgacggcg gctacagcct gaagctgagc aagctgaaga agaacgacag cggcatctac 2220

tacgtgggca tctacagcag cagcctgcag cagcccagca cccaggagta cgtgctgcac 2280

gtgtacgagc acctgagcaa gcccaaggtg accatgggcc tgcagagcaa caagaacggc 2340

acctgcgtga ccaacctgac ctgctgcatg gagcacggcg aggaggacgt gatctacacc 2400

tggaaggccc tgggccaggc cgccaacgag agccacaacg gcagcatcct gcccatcagc 2460

tggagatggg gcgagagcga catgaccttc atctgcgtgg ccagaaaccc cgtgagcaga 2520

aacttcagca gccccatcct ggccagaaag ctgtgcgagg gcgccgccga cgaccccgac 2580

agcagcatgg tgctgctgtg cctgctgctg gtgcccctgc tgctgagcct gttcgtgctg 2640

ggcctgttcc tgtggttcct gaagagagag agacaggagg agtacatcga ggagaagaag 2700

agagtggaca tctgcagaga gacccccaac atctgccccc acagcggcga gaacaccgag 2760

tacgacacca tcccccacac caacagaacc atcctgaagg aggaccccgc caacaccgtg 2820

tacagcaccg tggagatccc caagaagatg gagaaccccc acagcctgct gaccatgccc 2880

gacaccccca gactgttcgc ctacgagaac gtgatcggca gcacctccgg cagcggcgcg 2940

cctggcagcg gcgagggcag caccaagggc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc 3000

ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 3060

tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 3120

accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag 3180

tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 3240

gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 3300

gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 3360

ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 3420

gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac 3480

aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 3540

gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 3600

gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 3660

actctcggca tggacgagct gtacaagtga cgcgtcatca tcgatccgga ttagtccaat 3720

ttgttaaaga caggatatca gtggtccagg ctctagtttt gactcaacaa tatcaccagc 3780

tgaagcctat agagtacgag ccatagataa aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa 3840

aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttt 3900

gcaaggcatg gaaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg tcaggaacag 3960

atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 4020

cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 4080

gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc agccctcagc 4140

agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 4200

ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 4260

gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc cagtcctccg attgactgag 4320

tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc 4380

gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcac 4440

acatgcagca tgtatcaaaa ttaatttggt tttttttctt aagtatttac attaaatggc 4500

catagtactt aaagttacat tggcttcctt gaaataaaca tggagtattc agaatgtgtc 4560

ataaatattt ctaattttaa gatagtatct ccattggctt tctacttttt cttttatttt 4620

tttttgtcct ctgtcttcca tttgttgttg ttgttgtttg tttgtttgtt tgttggttgg 4680

ttggttaagc ttttttttta aagatcctac actatagttc aagctagact attagctact 4740

ctgtaaccca gggtgagccc ttgaagtcat gggtagcctg ctgttttagc cttcccacat 4800

ctaagattac aggtatgagc tatcgcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg 4860

tgtgtgtgtg tgattgtgtt tgtgtgtgtg acgctgtgaa aatgtgtgta tgggtgtgtg 4920

tgaatgtgtg tatgtatgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg tgtgtgtgca tgtgtgtgtg 4980

tgtgactgtg tctatgtgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtggctg tgtgtgtgtg 5040

tgtgtgtgtg tgttgtgaaa aaatattcta tggtagtgag agccaacgct ccgggcctca 5100

ggtgtcaggt tggtttttga gacagagtct ttcacttagc ttggaattca ctggccgtcg 5160

ttgcttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 5220

acatccccct gcttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 5280

caacagttgc gcagcctggc aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 5340

atctgtgcgg tatttcacac cgcatagctg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 5400

cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacagccccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5460

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tcgctccggg agctgcatgt 5520

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gcgtgatacg 5580

cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 5640

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 5700

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 5760

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 5820

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5880

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 5940

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 6000

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 6060

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 6120

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 6180

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 6240

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 6300

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 6360

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 6420

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 6480

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 6540

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 6600

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 6660

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 6720

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 6780

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6840

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6900

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 6960

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 7020

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 7080

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 7140

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 7200

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 7260

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 7320

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 7380

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 7440

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 7500

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 7560

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 7620

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 7680

cactgccatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 7740

attgtgagcg gagctaacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 7800

tttgctctta ggagtttcct gcaatacatc ccaaactcaa atatataaag catttgactt 7860

gttctatgcc ctagggggcg gggggaaggc ctaagccagc tttttttaac atttaaaatg 7920

ttaattccat tttaaatgca cagatgtttt tatttcgcat aagggtttca atgtgcatga 7980

atgctgcaat attcctgtta ccaaagctag tataaataaa aatagataaa cgtggaaatt 8040

acttagagtt tctgtcatta acgtttcctt cctcagttga caacataaat gcgcgctgct 8100

gagcaagcca gtttgcatct gtcaggatca atttcccatt atgccagtca tattaattgc 8160

actagtcaat tagttgattt ttatttttga catatacatg tg 8202

<210> 2

<211> 7935

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD48构建体

<400> 2

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60

atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120

agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180

aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttatgctc cccgagctca 420

ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480

ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540

cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 600

ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 660

tggccagcaa cttatctgtg tctgtccgat tgtctagtgt ctatcgactg attttatgcg 720

cctgcgtcgg tactagttag ctaactagct ctgtatctgg cggacccgtg gctggaactg 780

acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc cagggacttc gggggccgct 840

ttttgtggcc cgacctgagt cctaaaatcc cgatcgttta ggactctttg gtgcaccccc 900

cttagcagga gggatatgtg gttctggtag gagacgagaa cctaaaacag ttcccgcctc 960

cgtctgaatt tttgctttcg gtttgggacc gaagccgcgc cgcgcgtctt gtctgctgca 1020

gcatcgttct gtgttgtcct ctgtctgact gtgtttctgt atttgtctga aaatatgggc 1080

ccgggctagc ctgttaccac tccctctaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga 1140

gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt cacagaagag acgttgggtt accttctgct 1200

ctgcagaatg gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgagc acggcacctt taaccgagac 1260

ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc cgcatggaca cccagaccag 1320

gtggggtaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc cccctccctg ggtcaagccc 1380

tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg ccccgtctct cccccttgca 1440

acctcctcgt tcgaccccgc ctcgatcctc cctttatcca gccctcactc cttctctagg 1500

cgcccccata tggccatatg agatcttata tggggcaccc ccgccccttg taaacttccc 1560

tgaccctgac atgacaagag ttactaacag cccctctctc caagctcact tacaggctct 1620

ctacttagtc cagcacgcaa gtctggagac ctctggcggc agcctaccaa gaacaactgg 1680

accgaccggt ggtacctcac ccttcaccga gtcggcgaca cagtgtgggt ccgccgacac 1740

cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa gcgaccttac acagtcctgc tgaccacccc 1800

caccgccctc aaagtagacg gcatcgcagc ttggatacac gccgcccacg tgaaggctgc 1860

cgaccccggg ggtggaccat cctctagact gccatgctcg aggtgggtga ggatagcgtg 1920

ctgatcaccg agaacatgca catgaaactg tacatggagg gcaccgtgaa cgaccaccac 1980

ttcaagtgca catccgaggg cgaaggcaag ccctacgagg gcacccagac catgaagatc 2040

aaggtggtcg agggcggccc tctccccttc gccttcgaca tcctggctac cagcttcatg 2100

tacggcagca aaacctttat caaccacacc cagggcatcc ccgacttctt taagcagtcc 2160

ttccctgagg gcttcacatg ggagaggatc accacatacg aagacggggg cgtgctgacc 2220

gctacccagg acaccagcct ccagaacggc tgcctcatct acaacgtcaa gatcaacggg 2280

gtgaacttcc catccaacgg ccctgtgatg cagaagaaaa cactcggctg ggaggccagc 2340

accgagatgc tgtaccccgc tgacagcggc ctgagaggcc atgcccagat ggccctgaag 2400

ctcgtgggcg ggggctacct gcactgctcc ctcaagacca catacagatc caagaaaccc 2460

gctaagaacc tcaagatgcc cggcttctac ttcgtggacc ggagactgga aagaatcaag 2520

gaggccgaca aagagaccta cgtcgagcag cacgagatgg ctgtggccag atactgcgac 2580

ctgcctagca aactggggca cagcggcagc acctccggca gcggcgcgcc tggcagcggc 2640

gagggcagca ccaagggcga gggcagggga agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa 2700

aatcccgggc ccatgtgcag cagaggctgg gacagctgcc tggccctgga gctgctgctg 2760

ctgcccctga gcctgctggt gaccagcatc cagggccacc tggtgcacat gaccgtggtg 2820

agcggcagca acgtgaccct gaacatcagc gagagcctgc ccgagaacta caagcagctg 2880

acctggttct acaccttcga ccagaagatc gtggagtggg acagcagaaa gagcaagtac 2940

ttcgagagca agttcaaggg cagagtgaga ctggaccccc agagcggcgc cctgtacatc 3000

agcaaggtgc agaaggagga caacagcacc tacatcatga gagtgctgaa gaagaccggc 3060

aacgagcagg agtggaagat caagctgcag gtgctggacc ccgtgcccaa gcccgtgatc 3120

aagatcgaga agatcgagga catggacgac aactgctacc tgaagctgag ctgcgtgatc 3180

cccggcgaga gcgtgaacta cacctggtac ggcgacaaga gacccttccc caaggagctg 3240

cagaacagcg tgctggagac caccctgatg ccccacaact acagcagatg ctacacctgc 3300

caggtgagca acagcgtgag cagcaagaac ggcaccgtgt gcctgagccc cccctgcacc 3360

ctggccagaa gcttcggcgt ggagtggatc gccagctggc tggtggtgac cgtgcccacc 3420

atcctgggcc tgctgctgac ctgacgcgtc atcatcgatc cggattagtc caatttgtta 3480

aagacaggat atcagtggtc caggctctag ttttgactca acaatatcac cagctgaagc 3540

ctatagagta cgagccatag ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg 3600

gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg 3660

catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa 3720

cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 3780

caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 3840

gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc 3900

tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat 3960

ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc 4020

aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc 4080

gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt 4140

ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcacacatgc 4200

agcatgtatc aaaattaatt tggttttttt tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt 4260

acttaaagtt acattggctt ccttgaaata aacatggagt attcagaatg tgtcataaat 4320

atttctaatt ttaagatagt atctccattg gctttctact ttttctttta tttttttttg 4380

tcctctgtct tccatttgtt gttgttgttg ttctgtttgt ttgtttgttg gttggttggt 4440

taattttttt ttaaagatcc tacactatag ttcaagctag actattagct actctgtaac 4500

ccagggtgac cttgaagtca tgggtagcct gctgttttag ccttccccac atctaagatt 4560

acaggtatga gctatcattt ttggtatatt gattgattga ttgattgatg tgtgtgtgtg 4620

tgattgtgtt tgtgtgtgtg actgtgaaaa tgtgtgtatg ggtgtgtgtg aatgtgtgct 4680

atgtatgtgt gtgtgtgagt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtgtgtgt gtgactgtgt 4740

ctatgctgta tgactgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 4800

ttgtgaaaaa atcattctat ggtagtgaga gccaacgctc cggctcaggt gtcaggttgg 4860

tttttgagac agagtctttc cacttagctt ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 4920

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 4980

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca cccgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 5040

ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctccttc acgcatctgt gcggtatttc 5100

acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 5160

ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cgcgcatccg 5220

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 5280

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 5340

tgatacataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 5400

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 5460

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 5520

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 5580

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 5640

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 5700

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 5760

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 5820

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 5880

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 5940

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 6000

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 6060

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 6120

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 6180

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 6240

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 6300

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 6360

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 6420

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 6480

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 6540

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 6600

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 6660

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 6720

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 6780

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 6840

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 6900

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 6960

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 7020

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 7080

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 7140

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atccccctga 7200

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7260

gcaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 7320

ctctcccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7380

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7440

gctttacact ttatgcttcc gcgctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 7500

tcacacagga aacagctatg accatgatct acgccaagct ttgctcttag gagtttccta 7560

atacatccca aactcaaata tataaagcat ttgacttgtt ctatgcccta gggggcgggg 7620

ggaagctaag ccagcttttt ttaacattta aaatgttaat tcccatttta aatgcacaga 7680

tgtttttatt tcataagggt ttcaatgtgc atgaatgctg caatattccc tgttaccaaa 7740

gctagtataa ataaaaatag ataaacgtgg aaattactta gagtttctgt cattacacgt 7800

ttccttcctc agttgacaac ataaatgcgc tgctgagcaa gccagtttgc atctgtcagg 7860

atccaatttc ccattatgcc agtcatatta attactagtc aattagttga tttttatttt 7920

tgacatatac atgtg 7935

Claims (61)

1.通用抗原呈递细胞(UAPC)，所述通用抗原呈递细胞(UAPC)经改造以表达(1)CD48和/或CS1(CD319)、(2)膜结合白细胞介素-21(mbIL-21)和(3)41BB配体(41BBL)。

2.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC表达CD48。

3.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC表达CS1。

4.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC表达CD48和CS1。

5.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC基本上不表达内源性HLA I类、II类或CD1d分子。

6.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。

7.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC是源自白血病细胞的UAPC。

8.权利要求7所述的UAPC，其中所述源自白血病细胞的UAPC被进一步限定为K562细胞。

9.权利要求1所述的UAPC，其中所述UAPC已通过逆转录病毒转导而被改造。

10.权利要求9所述的UAPC，其中所述逆转录病毒转导被进一步限定为使用SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的病毒构建体进行的转导。

11.权利要求1-10中任一项所述的UAPC，其中所述UAPC被辐照。

12.扩增免疫细胞的方法，所述方法包括在有效量的权利要求1-11中任一项所述的UAPC存在下培养免疫细胞。

13.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞和UAPC以3:1至1:3的比例培养。

14.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞和UAPC以1:2的比例培养。

15.权利要求12所述的方法，其中所述扩增在IL-2存在下进行。

16.权利要求15所述的方法，其中所述IL-2以10-500U/mL的浓度存在。

17.权利要求15所述的方法，其中所述IL-2以100-300U/mL的浓度存在。

18.权利要求15所述的方法，其中所述IL-2以200U/mL的浓度存在。

19.权利要求15所述的方法，其中所述IL-2是重组人IL-2。

20.权利要求15所述的方法，其中所述IL-2每2-3天补充一次。

21.权利要求12所述的方法，其中至少第二次添加所述UAPC。

22.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞或T细胞。

23.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。

24.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。

25.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞源自脐带血(CB)、外周血(PB)、干细胞或骨髓。

26.权利要求12所述的方法，其中所述干细胞是诱导性多能干细胞。

27.权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞获自CB。

28.权利要求27所述的方法，其中所述CB由2个或更多个个体脐带血单元汇集而成。

29.权利要求27所述的方法，其中所述CB由3、4、5、6、7或8个个体脐带血单元汇集而成。

30.权利要求23所述的方法，其中所述NK细胞是CB单核细胞(CBMC)。

31.权利要求23所述的方法，其中所述NK细胞被进一步限定为CD56⁺NK细胞。

32.权利要求12所述的方法，其中所述方法在无血清培养基中进行。

33.权利要求12-32中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞被改造以表达嵌合抗原受体(CAR)。

34.权利要求33所述的方法，其中所述CAR包含人源化抗原结合结构域。

35.权利要求33所述的方法，其中所述CAR包含CD19、CD123、间皮素、CD5、CD47、CLL-1、CD33、CD99、U5snRNP200、CD200、CS1、BAFF-R、ROR-1或BCMA抗原结合结构域。

36.权利要求33所述的方法，其中所述CAR包含CD19或CD123抗原结合结构域。

37.权利要求33所述的方法，其中所述CAR包含IL-15。

38.权利要求33所述的方法，其中所述CAR包含自杀基因。

39.权利要求38所述的方法，其中所述自杀基因是CD20、CD52、EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。

40.根据权利要求12-39中任一项所述的方法所产生的经扩增的免疫细胞群。

41.药物组合物，其包含权利要求40所述的经扩增的免疫细胞群和药学上可接受的载体。

42.组合物，其包含有效量的权利要求40所述的经扩增的免疫细胞，所述组合物用于治疗受试者的疾病或病症。

43.治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求40所述的经扩增的免疫细胞。

44.权利要求43所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、炎症、移植物抗宿主病、移植排斥、自身免疫病症、免疫缺陷病、B细胞恶性病或感染。

45.权利要求44所述的方法，其中所述癌症是白血病。

46.权利要求45所述的方法，其中所述白血病是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)。

47.权利要求43所述的方法，其中所述免疫细胞是同种异体的。

48.权利要求43所述的方法，其中所述免疫细胞是自体的。

49.权利要求43所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞或T细胞。

50.权利要求43所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。

51.权利要求43所述的方法，其中所述病症是移植物抗宿主病(GVHD)。

52.权利要求43所述的方法，其中所述病症是多发性硬化症、炎性肠病、类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、接触性超敏反应、哮喘或舍格伦综合征。

53.权利要求43所述的方法，其中所述受试者是人。

54.权利要求43所述的方法，所述方法还包括施用至少第二治疗剂。

55.权利要求54所述的方法，其中所述至少第二治疗剂是治疗有效量的抗癌剂、免疫调节剂或免疫抑制剂。

56.权利要求55所述的方法，其中所述抗癌剂是化疗、放疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或免疫治疗。

57.权利要求55所述的方法，其中所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗体、化疗剂辐照、趋化因子、白细胞介素、或者趋化因子或白细胞介素的抑制剂。

58.权利要求54所述的方法，其中免疫细胞和/或所述至少第二治疗剂是经静脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌肉内、内窥镜、病灶内、经皮、皮下、局部施用的或者通过直接注射或灌注施用的。

59.权利要求54所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗体。

60.权利要求59所述的方法，其中所述抗体是单克隆、双特异性或三特异性抗体。

61.权利要求60所述的方法，其中所述抗体是利妥昔单抗。

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