JP2023033462A - メラノーマ優先発現抗原に対して向けられたt細胞レセプターおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】メラノーマ優先発現抗原に対して向けられたT細胞レセプターおよびその使用の提供。【解決手段】本技術は、部分的に、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。PRAME抗原に対する免疫応答を誘導することによって過剰増殖性疾患を処置するための方法が提供され;上記免疫応答は、PRAMEに対して向けられたT細胞レセプターを使用して、PRAME発現細胞を特異的に標的とすることによって誘導され得る。T細胞レセプター、T細胞レセプターをコードする核酸、ならびにPRAME抗原を認識するT細胞レセプターを発現する細胞を含む組成物および方法が、本明細書で提供される。上記細胞はまた、誘導性カスパーゼ-9ポリペプチドを発現し得る。【選択図】なし
Description
(関連出願)
2015年3月10日に出願された「T Cell Receptors Directed Against the Preferentially Expressed Antigen of Melanoma and Uses Thereof」との表題の米国仮特許出願第62/130,884号に対して優先権が主張され、当該出願は参照され、かつその参照によってその全体が参考として援用される。
2015年3月10日に出願された「T Cell Receptors Directed Against the Preferentially Expressed Antigen of Melanoma and Uses Thereof」との表題の米国仮特許出願第62/130,884号に対して優先権が主張され、当該出願は参照され、かつその参照によってその全体が参考として援用される。
(分野)
本技術は、部分的に、メラノーマ優先発現抗原(the Preferentially Expressed Antigen of Melanoma)(PRAME)に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。PRAME抗原に対する免疫応答を誘導することによって過剰増殖性疾患を処置するための方法が提供され;上記免疫応答は、PRAMEに対して向けられたT細胞レセプターを使用して、PRAME発現細胞を特異的に標的とすることによって誘導され得る。
本技術は、部分的に、メラノーマ優先発現抗原(the Preferentially Expressed Antigen of Melanoma)(PRAME)に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。PRAME抗原に対する免疫応答を誘導することによって過剰増殖性疾患を処置するための方法が提供され;上記免疫応答は、PRAMEに対して向けられたT細胞レセプターを使用して、PRAME発現細胞を特異的に標的とすることによって誘導され得る。
(背景)
T細胞の活性化は、病原微生物(例えば、ウイルス、細菌および寄生生物)、外来タンパク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要なステップである。T細胞は、その表面上に、細胞表面上に提示された抗原を認識するレセプター(すなわち、T細胞レセプター)を発現する。正常な免疫応答の間、MHC抗原提示の状況において、これらの抗原がT細胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、T細胞の活性化に至る。
T細胞の活性化は、病原微生物(例えば、ウイルス、細菌および寄生生物)、外来タンパク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要なステップである。T細胞は、その表面上に、細胞表面上に提示された抗原を認識するレセプター(すなわち、T細胞レセプター)を発現する。正常な免疫応答の間、MHC抗原提示の状況において、これらの抗原がT細胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、T細胞の活性化に至る。
養子T細胞療法は、抗原特異的免疫応答を提供することによって過剰増殖性疾患(腫瘍が挙げられる)を処置するために使用されてきた。1つの方法は、抗原に結合する細胞外ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝子改変されたT細胞の使用を要する。
(要旨)
PRAME遺伝子は、大部分の腫瘍(メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫が挙げられる)、ならびにいくつかのタイプの白血病において高レベルで発現される。PRAME特異的T細胞クローンが同定された。これらT細胞クローンは、これらの異なる腫瘍タイプ(ユーイング肉腫、滑膜肉腫、および神経芽細胞腫の細胞株が挙げられる)を認識する。PRAME特異的TCRを使用するTCR遺伝子移入アプローチは、過剰増殖性疾患(例えば、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫のような)を有する患者にとっての新規な処置モダリティーをもたらし得る。
PRAME遺伝子は、大部分の腫瘍(メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫が挙げられる)、ならびにいくつかのタイプの白血病において高レベルで発現される。PRAME特異的T細胞クローンが同定された。これらT細胞クローンは、これらの異なる腫瘍タイプ(ユーイング肉腫、滑膜肉腫、および神経芽細胞腫の細胞株が挙げられる)を認識する。PRAME特異的TCRを使用するTCR遺伝子移入アプローチは、過剰増殖性疾患(例えば、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫のような)を有する患者にとっての新規な処置モダリティーをもたらし得る。
T細胞レセプター、T細胞レセプターをコードする核酸、ならびにPRAME抗原を認識するT細胞レセプターを発現する細胞を含む組成物および方法が、本明細書で提供される。上記細胞はまた、誘導性カスパーゼ-9ポリペプチドを発現し得る。
ある種の実施形態は、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面の中でさらに記載される。
図面は、本技術のある種の実施形態を例証するのであって、限定ではない。例証の明瞭性および容易さのために、図面は、縮尺どおりには作成されておらず、場合によっては、種々の局面が、特定の実施形態の理解を促進するために誇張または拡大されて示され得る。
(詳細な説明)
特定の抗原に対して特異的な組換えT細胞レセプターは、T細胞に特異性を提供するために、および患者において抗原特異的免疫応答を提供するために使用されてきた。ある種の方法は、抗原に結合する細胞外ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝子改変されたT細胞の使用を要する。
特定の抗原に対して特異的な組換えT細胞レセプターは、T細胞に特異性を提供するために、および患者において抗原特異的免疫応答を提供するために使用されてきた。ある種の方法は、抗原に結合する細胞外ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝子改変されたT細胞の使用を要する。
異種T細胞レセプター(TCR)を発現する遺伝子改変されたT細胞を使用する養子T細胞療法は、患者のT細胞レパートリーの一部として高アビディティー標的細胞特異的TCRを提供し得る。養子T細胞療法は、抗原特異的免疫応答を提供することによって、過剰増殖性疾患(腫瘍が挙げられる)を処置するために使用されてきた。T細胞は、規定された特異性(例えば、腫瘍細胞に対する特異性のような)を有するT細胞を生成するように遺伝子改変される。養子T細胞療法の方法は、図1において模式図として提供される。本明細書で論じられるとき、アロHLAレパートリーから単離されたT細胞は、標的へのより高いアビディティーを提供し得、これは、腫瘍を効率的に根絶するために望ましい。アロHLA拘束T細胞は、以下の表1において自己拘束T細胞と比較される:
従って、いくつかの実施形態において、CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供され、ここで:上記CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(the preferentially expressed antigen in melanoma)(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードし;上記CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み;上記CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含み;そして上記TCRαポリペプチドおよびTCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする。いくつかの実施形態において、上記第1のもしくは第2のポリペプチドまたは上記第1のおよび第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されており;いくつかの実施形態において、上記第1のまたは第2のポリペプチド。いくつかの実施形態において、上記第1のおよび第2のポリペプチド、または上記第1のもしくは第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、組換えTCRの発現を増大させるためにシステイン改変されている。システイン改変されるとは、ヌクレオチド配列がさらなるシステイン残基を含むポリペプチドをコードすることを意味する。コドン最適化されるとは、ヌクレオチド配列がそのコードされるポリペプチドの発現を増強するコドンを含むことを意味する。コドン最適化されたヌクレオチド配列の例は本明細書で示されるが、本明細書で提供されるCDR3領域を同様にコードする他のヌクレオチド配列が使用され得、用語コドン最適化されるが、CDR3ポリペプチド(本明細書中のTCRα鎖およびTCRβ鎖のCDR3領域、または本明細書で提供されるポリペプチド配列と90%もしくは90%超(90% of more)同一であるその誘導体を含む)をコードするようなヌクレオチド配列を含むことは、理解される。アミノ酸配列およびアミノ酸配列誘導体の同一性を計算するにあたって、組換えTCRαまたはβポリペプチド、またはそのCDR3領域もしくは他のフラグメントの発現を増強するために使用されるシステインは、配列番号として本明細書で提供される配列がシステイン改変を有しない場合のパーセンテージ計算の一部として考慮されない。
いくつかの実施形態において、上記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、上記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか;または上記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、上記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列、または配列番号1、配列番号4、配列番号23、もしくは配列番号26の配列と90%もしくは90%超(90% or more)同一のアミノ酸配列を有するその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含み、上記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含むか;または上記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列、または配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含み、上記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列、または配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、上記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列を含み、上記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列、配列番号45もしくは配列番号48の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列、または配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含み、上記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列、または配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、上記T細胞レセプターのCDR3領域は、ヒトPRAMEに結合する。いくつかの実施形態において、上記T細胞レセプターのCDR3領域は、MHCクラスI HLA提示の状況においてPRAMEに結合する。いくつかの実施形態において、上記T細胞レセプターのCDR3領域は、ペプチド-MHC複合体に特異的に結合し、ここで上記MHC分子は、MHCクラスI HLA分子であり、上記ペプチドは、PRAMEエピトープである。いくつかの実施形態において、上記MHC分子は、MHCクラス1 HLA A2.01分子である。いくつかの実施形態において、上記PRAMEエピトープは、SLLQHLIGLであるか、または上記PRAMEエピトープは、QLLALLPSLである。
いくつかの実施形態において、上記核酸は、上記CDR3コードポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記CDR3領域および上記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする本出願の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞が、提供される。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、T細胞である。
いくつかの実施形態において、本出願の核酸分子を含むプラスミドベクターまたはウイルスベクターがまた、提供される。いくつかの実施形態において、本出願の核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞が提供される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、T細胞である。
いくつかの実施形態において、本出願の改変された細胞、本出願の核酸、または本出願のプラスミドベクターもしくはウイルスベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物がまた、提供される。
いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するための方法が提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞の治療有効量を上記被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有し、ここで上記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、上記改変された細胞の投与後に減少している。いくつかの実施形態において、上記被験体は、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患を有すると診断されている、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、乳がん、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患と診断されている。
いくつかの実施形態において、被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法が提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞を上記被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している。ここで、いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする核酸を含み、上記方法は、上記被験体への上記改変された細胞の投与後に、上記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを上記被験体に投与する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドを投与すると、上記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、上記多量体リガンドを投与する前に上記被験体から得られるサンプル中の上記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、上記多量体リガンドを投与後に上記被験体から得られるサンプル中で減少している。
いくつかの実施形態において、細胞においてPRAMEに特異的に結合するT細胞レセプターを発現するための方法もまた提供され、上記方法は、本出願の核酸分子と細胞とを、上記核酸が上記細胞へと組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、上記細胞が上記T細胞レセプターを上記組み込まれた核酸から発現する。
本明細書中で使用されるとき、請求項および/または明細書において用語「含む(comprising)」とともに使用されるときの単語「a」または「an」の使用は、「1つの」を意味し得るが、「1つ以上の」、「少なくとも1つの」および「1つもしくは1つより多くの」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む(including)」、「含む(containing)」および「含む(comprising)」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな(open ended)用語であると認識している。
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に異なるHLA遺伝子座またはMHC遺伝子座のことを指す。
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、1つ以上の遺伝子座が異なり得(コンジェニック)、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。
本明細書で使用される用語「自家の」とは、宿主とドナー細胞との間で抗原性において別個でない(例えば、ドナー細胞が宿主から得られる場合)HLA遺伝子座またはMHC遺伝子座に言及する。
本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含み得る。抗原は、生物、タンパク質/抗原のサブユニット、殺滅されたまたは不活性化されたホールセルまたは溶解産物に由来し得る。例示的な生物としては、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリジウム、Corynebacterium diphtheriae、Bordetella pertussis、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Borrelia burgdorfei、プラスモディウム、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、Vibrio cholera、大腸菌、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢菌、Salmonella typhi、Neisseria gonorrheaが挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働き得る。さらに、抗原は、組換えDNAまたはゲノムDNAに由来し得る。病原性ゲノム、または免疫応答を誘発するタンパク質に対する遺伝子もしくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAは、抗原の合成をもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの核酸配列全体の使用に限定されない。本組成物および方法は、1つより多くの遺伝子またはゲノムの部分的核酸配列の使用、およびこれら核酸配列が所望の免疫応答を誘起する種々の組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されない。
用語「抗原提示細胞」は、少なくとも1つの抗原または抗原性フラグメントをその細胞表面上に(または細胞表面に)ディスプレイするか、獲得するかまたは提示することができる種々の細胞のいずれかである。一般に、用語「細胞」は、抗原または抗原性組成物に対する免疫応答(すなわち、免疫系のT細胞またはB細胞のアームからの免疫応答)の強化を助けるという目標を達成する任意の細胞であり得る。例えば、Kuby,2000,Immunology,supp.4th edition,W.H.Freeman and company(参照により本明細書中に援用される)において論じられ、ある特定の実施形態において本明細書中で使用されるように、正常にまたはクラスII主要組織適合分子もしくは主要組織適合複合体とともに免疫細胞に抗原をディスプレイするかまたは提示する細胞が、「抗原提示細胞」である。ある特定の態様において、細胞(例えば、APC細胞)は、別の細胞、例えば、組換え細胞または所望の抗原を発現している腫瘍細胞と融合され得る。2つまたはそれを超える細胞の融合物を調製するための方法は、例えば、Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.65-66,71-74(Academic Press,1986);Campbell,Monoclonal Antibody Technology,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.13,Burden & Von Knippenberg,Amsterdam,Elseview,pp.75-83,1984; Kohler & Milstein,Nature,256:495-497,1975;Kohler & Milstein,Eur.J.Immunol.,6:511-519,1976,Gefterら、Somatic Cell Genet.,3:231-236,1977(これらの各々は参照により本明細書中に援用される)において論じられている。場合によっては、細胞が抗原をディスプレイするかまたは提示する免疫細胞は、CD4+TH細胞である。APC上または他の免疫細胞上に発現されるさらなる分子は、免疫応答の強化を助け得るか、または改善し得る。分泌分子または可溶性分子、例えば、サイトカインおよびアジュバントもまた、抗原に対する免疫応答を助け得るかまたは高め得る。様々な例が、本明細書中で論じられる。
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインであり得る。抗原認識部分の例としては、抗体由来のポリペプチド(例えば、一本鎖可変フラグメント(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメントのような);T細胞レセプター由来のポリペプチド(例えば、TCR可変ドメインのような);シグナル伝達ドメインに人工的に融合され得る分泌因子(例えば、サイトカイン、成長因子)(例えば、「ザイトカイン」)、および細胞外の同種(cognate)タンパク質に結合する任意のリガンドまたはレセプターフラグメント(例えば、CD27、NKG2D)が挙げられるが、これらに限定されない。コンビナトリアルライブラリーはまた、腫瘍関連標的に高親和性で結合するペプチドを同定するために使用され得る。
用語「自己の」は、細胞、核酸、タンパク質、ポリペプチドなどであって、これが後に個体に投与されるその同じ個体に由来するものを意味する。本方法の改変された細胞は、例えば、自己細胞(例えば、自己T細胞のような)であり得る。
本明細書中で使用される用語「がん」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉がん、舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頚部がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、眼のがん、腎がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、脳がん、結腸がん、肉腫または膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。
本明細書中で使用されるとき、用語「cDNA」は、鋳型としてメッセンジャーRNA(mRNA)を使用して調製されたDNAのことを指すと意図されている。ゲノムDNA、またはゲノムRNA鋳型、プロセシングされていないRNA鋳型もしくは部分的にプロセシングされたRNA鋳型から重合されたDNAに対立するものとしてcDNAを使用することの利点は、cDNAが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とmRNAから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害(例えば、がん)を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、RNA分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作用的に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
T細胞レセプター(TCR)は、抗原性分子に特異的に結合する免疫タンパク質である。TCRは、T細胞の表面上に存在する2つの異なるポリペプチドから構成される。それらは、主要組織適合性遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識またはこれに特異的に結合する;その抗原に結合すると、T細胞は活性化される。「認識する」とは、例えば、上記T細胞レセプターまたはそのフラグメント(単数または複数)(例えば、TCRαポリペプチドおよびTCRβポリペプチド)が、一緒に、抗原と接触し、これを標的として同定することができることを意味する。TCRは、αポリペプチドおよびβポリペプチド、または鎖を含み得る。このαポリペプチドおよびβポリペプチドは、2つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメインを含む。このαポリペプチドおよびβポリペプチドの可変ドメインは、3個の相補性決定領域(CDR)を有する;CDR3は、エピトープの認識を担う主なCDRであると考えられる。上記αポリペプチドは、VJ再構成によって生成されるVおよびJ領域を含み、上記βポリペプチドは、VDJ再構成によって生成されるV、D、およびJ領域を含む。上記VJ領域とVDJ領域との交差(intersection)は、CDR3領域に相当する。TCRはしばしば、国際免疫遺伝学(IMGT)TCR命名法(IMGT Database、www. IMGT.org; Giudicelli, V.ら,IMGT/LIGM-DB、IMGT(登録商標) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979;T Cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12-441352-8)を使用して命名される。
「特異的に結合する」とは、T細胞レセプターに関するとき、あるいは本明細書中の組換えT細胞レセプター、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、バリアント、もしくはアナログ、または改変された細胞(例えば、PRAME T細胞レセプター、T細胞レセプターCDR3領域、およびPRAME TCRを発現する改変された細胞など)を指すとき、T細胞レセプターもしくはそのフラグメントが、PRAME抗原を認識するかまたはこれに選択的に結合することを意味する。ある種の条件下では(例えば、イムノアッセイ、例えば、本明細書で論じられるイムノアッセイでは)、上記T細胞レセプターはPRAMEに結合し、他のポリペプチドには有意な量で結合しない。従って、上記T細胞レセプターは、コントロール抗原性ポリペプチドに対するより少なくとも5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または100倍高い親和性でPRAMEに結合する。この結合はまた、PRAME TCRを発現する改変されたT細胞の状況において間接的に決定され得る。例えば、本明細書で論じられるアッセイのようなアッセイにおいて、上記改変されたT細胞は、PRAME発現細胞株、細胞、または組織(例えば、骨髄腫、AML、またはALLの細胞のような)に対して特異的に反応性である。従って、上記改変されたPRAME TCR発現T細胞は、PRAME発現細胞株ではないコントロール細胞株に対するその反応性と比較した場合、少なくとも5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または100倍高い反応性でPRAME発現細胞株に結合する。上記PRAME T細胞レセプター、T細胞レセプターCDR3領域、およびPRAME TCR発現細胞株は、例えば、細胞表面上に発現されるPRAMEに結合し得、そして代表的には、主要組織適合マーカー(major histocompatibility marker)(MHC)提示(例えば、MHCクラスI HLA提示)の状況において、例えば、MHCクラス1 HLA A2.01提示の状況において、PRAMEに結合し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「機能的に等価な」とは、例えば、T細胞レセプターに関するとき、またはT細胞レセプター核酸フラグメント、バリアント、もしくはアナログを指すとき、抗原もしくは細胞に対する免疫応答を刺激するT細胞レセプターもしくはT細胞レセプターポリペプチドをコードする核酸を指す。TCR認識または抗原への結合の状況において、上記TCRは、ペプチド-MHC複合体の一部としてエピトープとして抗原を認識し得る。T細胞レセプターポリペプチドの「機能的に等価な」または「機能的フラグメント」とは、例えば、T細胞レセプタードメイン(例えば、定常領域)を欠いているが、T細胞に代表的な免疫応答を刺激し得るT細胞レセプターを指す。機能的に等価なT細胞レセプターフラグメントは、例えば、単独でまたはMHC複合体において、抗原に特異的に結合し得るかまたは抗原を認識し得、そして結合または認識すると、Tリンパ球を活性化し得る。例えば、TCRの、またはTCRαポリペプチドもしくはTCRβポリペプチドのCDR3領域をコードする核酸分子またはヌクレオチド配列の誘導体は、TCRの、またはTCRαポリペプチドもしくはβポリペプチドの機能的CDR3領域をコードする、そして例えば、単独でまたはMHC複合体において、抗原に特異的に結合するかまたは抗原を認識するポリペプチドをコードする核酸分子またはヌクレオチド配列である。TCRαポリペプチドまたはTCRβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のこれら誘導体は、例えば、TCRαポリペプチドまたはTCRβポリペプチドをコードする相当するヌクレオチド配列と80%、85%、90%、95%もしくは95%超同一の連続ヌクレオチドを有し得る。T細胞レセプターポリペプチドのCDR3領域の「機能的に等価な」または「その機能的フラグメント」は、例えば、改変されたアミノ酸配列を有し得、そして例えば、上記αポリペプチドもしくはβポリペプチドのアミノ酸配列、またはその相当するαポリペプチドおよびβポリペプチドと80%、85%、90%、95%もしくは95%超同一であるが、T細胞レセプター(例えば、組換えT細胞レセプター)の一部として含まれる場合に、T細胞に代表的な免疫応答を刺激し得るαポリペプチドおよびβポリペプチドを有し得るT細胞レセプターのことを指す。アミノ酸配列およびアミノ酸配列誘導体、またはヌクレオチド配列の同一性を計算するにあたって、組換えTCRαポリペプチドもしくはβポリペプチド、またはそのCDR3領域もしくは他のフラグメントの発現を増強するために使用されるシステイン、あるいはシステイン残基をコードするコドンは、配列番号として本明細書で提供される配列がシステイン改変を有しない場合のパーセンテージ計算の一部として考慮されない。用語「機能的に等価な」または「機能的フラグメント」が、他の核酸またはポリペプチド(例えば、カスパーゼ-9もしくは切断型カスパーゼ-9のような)に適用される場合、その用語は、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント、バリアントなどのことを指す。例えば、腫瘍抗原ポリペプチド(例えば、PSMAのような)の機能的フラグメントは、抗原性であり得、特定の腫瘍抗原を認識する抗体を産生させ得る。リガンド結合領域の機能的フラグメント、例えば、Fvlsは、適切なリガンドに結合するのに十分なリガンド結合領域ポリペプチドの部分を含む。「機能的に等価な」とは、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、T細胞において発現されたとき、T細胞媒介性の腫瘍殺滅応答を増幅することができる、共刺激ポリペプチドのことを指す。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、cDNA配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、およびがん細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および/もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における2つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、HIVによって引き起こされる特定のTリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン(indwelling central lines)もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか;または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体(例えば、結核)もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害(adverse)反応、アレルギー反応または他の有害(untoward)反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびPCRTMなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、1つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、タンパク質という用語と相互交換可能であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列として定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答を制御する」、「免疫応答を調節する」または「免疫応答をコントロールする」とは、免疫応答を改変できることを指す。例えば、組成物は、免疫応答を増強することおよび/または活性化することができる。なおもさらに、組成物は、免疫応答を阻害することもできる。制御の形態は、組成物とともに使用されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログが、共刺激性ポリペプチドの二量体化をもたらし、T細胞活性化をもたらすが、しかしながら、その化学物質のモノマーアナログは、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、T細胞を活性化しない。
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性DNA配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション(または形質導入)は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション(superfection)などを含むいくつかの手段のうちのいずれか1つによって達成され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物;哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル)、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む);非哺乳動物(例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類(例えば、ニワトリまたはアヒル)または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む)を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインおよび/または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作用的に連結された」は、プロモーターが、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する(treat)」、「処置される」または「処置する(treating)」とは、予防法および/または治療のことを指す。その用語は、例えば、がん性の固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用されるとき、固形腫瘍またはがんに対する被験体の抵抗性を高める予防的処置による予防のことを指す。いくつかの例において、被験体は、がんを予防するために処置され得、ここで、そのがんは、家族性であるか、または遺伝的に関連する。その用語は、例えば、感染症に関して使用されるとき、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置、すなわち換言すれば、その被験体が病原体に感染する可能性もしくはその感染症に起因し得る疾病の徴候を示す可能性を低下させる予防的処置、ならびに感染症と闘うための、例えば、感染症を弱めるためもしくは排除するための、または悪化するのを防ぐための、その被験体が感染した後の処置のことを指す。
本明細書で提供される方法は、例えば、腫瘍抗原の上昇した発現が存在する疾患、障害、または状態を処置するために使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体の産生、サイトカインの産生および/または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
血液疾患:本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および/または「血液の疾患」は、血液およびその成分(血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない)の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症(albuminemias)、血友病などが挙げられる。
骨髄疾患:本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症(例えば、結核)または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症(例えば、結核)、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症(apnocytopenia)、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
T細胞および活性化T細胞(CD3+):T細胞(Tリンパ球とも称される)は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「T細胞」における「T」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。T細胞は、T細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ(例えば、B細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞)と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化T細胞」は、クラスII主要組織適合性(MHC)マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答(例えば、活性化T細胞のクローン性増殖)をもたらすように刺激されたT細胞のことを指す。T細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび/またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8などおよびそれらの組み合わせ)の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、T細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる(例えば、CD3またはCD4の発現について陽性の細胞は、CD3+またはCD4+と称される)。CD3およびCD4タンパク質は、T細胞におけるシグナル伝達に直接的および/または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
末梢血:本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分(例えば、赤血球、白血球および血小板)のことを指す。
臍帯血:臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血(umbilical blood)」、「臍帯血(umbilical blood)」または「臍帯血(cord blood)」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
あるパーセントの細胞が殺滅される場合におけるような「殺滅する(kill)」または「殺滅する(killing)」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。その用語は、細胞剥離のことも指し得る。
ドナーT細胞:ここで使用される用語「ドナーT細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および/または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるT細胞のことを指す。ドナーT細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着(alloengraftment)の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーT細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応(alloaggressive response)を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病(GvHD)をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーT細胞は、他の活性化T細胞よりも高いまたは低いGvHD反応を引き起こし得る。ドナーT細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。
機能保存的バリアントは、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の2つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、例えば、少なくとも95%であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。2つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および/または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性(およびアミノ酸配列の場合、保存)レベルを達成するように2つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性/同一性を評価するための数多くの方法(例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくCluster法ならびにBLASTN、BLASTPおよびFASTAなど)が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、用いられる設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
間葉系ストローマ細胞:本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、CD73、CD90およびCD105が陽性である。
胚性幹細胞:本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、50~150個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに3つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞(例えば、成体幹細胞)は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性(pluripotent)は、多分化能(multipotent)と区別される。
誘導性多能性幹細胞:本明細書中で使用される用語「誘導性多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞などの、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作(例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現)、生物学的操作(例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理)および/または化学的操作(例えば、小分子、ペプチドなど)によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導性多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは最終分化した状況(例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など)を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
CD34+細胞:本明細書中で使用される用語「CD34+細胞」は、その細胞表面上にCD34タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「CD34」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にT細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質(例えば、シアロムチンタンパク質)のことを指す。CD34は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。CD34+細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆体細胞、リンパ管(胸膜のリンパ管を除く)ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団(XIIIa因子が陰性である)、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍(例えば、胞状軟部肉腫、プレB急性リンパ芽球性白血病(Pre-B-ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、AML-M7、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜(mengingeal)血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌)における細胞に見られることが多い。
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、標的化された様式(manor)で、腫瘍に浸潤し、腫瘍細胞を殺滅する、様々なレセプターを有するT細胞のことを指す。本願の方法を使用してTILの活性を制御することは、腫瘍細胞の排除のより直接的なコントロールを可能にし得る。
遺伝子発現ベクター:本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子(例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列(ARS)、人工染色体、酵母人工染色体(例えば、YAC))のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子(例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子)または異種遺伝子(例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子)であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および/またはターミネーター配列として時折、機能し得る、5’および3’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および/または発現の機能性(例えば、転写および翻訳)について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。
発生的に制御されるプロモーター:本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するRNAポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
発生的に分化した細胞:本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化(例えば、遺伝子発現のパターンの変化)、遺伝子の再編成(例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン)を含み、時々、DNA配列の変化(例えば、免疫多様性の分化)を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット(例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質)を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点(node)である(例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する)。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対してもたらされる。時折、免疫応答は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答である。時折、免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。
いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時折、その細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入される。時折、その細胞は、インビボにおいて核酸を形質導入される。
いくつかの実施形態における細胞は、時折、エキソビボにおいて抗原と接触される。ある特定の実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答、例えば、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答が、その抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、免疫応答が、腫瘍抗原(例えば、PSMA)に対してもたらされる。いくつかの実施形態において、核酸は、エキソビボにおいて調製され、例えば、皮内投与または皮下投与によって、被験体に投与される。時折、細胞は、エキソビボまたはインビボにおいて核酸を形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。あるいは、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域を含む、エキソビボにおいて転写されるRNAを含む。
固形腫瘍の「腫瘍サイズを減少させる」または「腫瘍の成長を阻害する」とは、標準的なガイドライン、例えば、例えば、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST)基準に従う、処置に対する応答または疾患の安定化のことを意味する。例えば、これは、固形腫瘍の直径の約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の減少、または腫瘍、循環腫瘍細胞もしくは腫瘍マーカーの数の約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の減少を含み得る。腫瘍のサイズは、例えば、CTスキャン、MRI、例えば、CT-MRI、胸部X線(肺の腫瘍の場合)または分子イメージング、例えば、PETスキャン、例えば、阻害剤がTROFEXTM/MIP-1072/1095である場合など、例えば、ヨウ素123で標識されたPSA、例えば、PSMAリガンドを投与した後のPETスキャン、または分子イメージング、例えば、SPECT、またはPSA、例えば、PSMA抗体、例えば、111-イリジウムで標識されたPSMA抗体であるカプロマブ(capromad)ペンデチド(pendetide)(Prostascint)などを用いるPETスキャンをはじめとした任意の方法によって解析され得る。
「腫瘍の血管新生を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍の血管新生の量と比べたときの、腫瘍の血管新生の約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の減少または新しい血管構造の出現の約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の減少のことを意味する。その減少は、1つの腫瘍について言及していることもあるし、1つより多い腫瘍における血管新生の合計または平均でもあり得る。腫瘍の血管新生を測定する方法としては、例えば、CATスキャン、MRI、例えば、CT-MRI、または分子イメージング、例えば、SPECTもしくはPETスキャン、例えば、阻害剤がTROFEXTM/MIP-1072/1095である場合など、例えば、ヨウ素123で標識されたPSA、例えば、PSMAリガンドの投与後のPETスキャンなど、またはPSA、例えば、PSMA抗体、例えば、111-イリジウムで標識されたPSMA抗体であるカプロマブペンデチド(Prostascint)などを用いるPETスキャンが挙げられる。
例えば、腫瘍が、前立腺に存在するものであるか、または前立腺における腫瘍に由来するかもしくは前立腺における腫瘍から転移したものであるか、またはPSAを産生するものであるとき、その腫瘍は、前立腺がんの腫瘍などと分類されるかまたは器官の一部として命名される。例えば、腫瘍が、被験体の前立腺における腫瘍と同じまたは同様の染色体切断点を有すると決定されるとき、その腫瘍は、前立腺における腫瘍から転移したものである。
血液悪性腫瘍に関して、「血液悪性腫瘍を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の悪性細胞の量または濃度と比較したとき、例えば被験体から得られるサンプル中で測定される場合に、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の悪性細胞の量または濃度の減少、遅延または阻害のことを意味する。悪性細胞もしくは腫瘍負荷の量または濃度を測定するための方法としては、例えば、qRT-PCRおよびゲノムワイドシーケンシングが挙げられる。
血液腫瘍に関して、「腫瘍負荷を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍細胞の量または濃度と比較したとき、例えば被験体から得られるサンプル中で測定される場合に、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の腫瘍細胞の量または濃度の減少、遅延または阻害のことを意味する。腫瘍細胞の量または濃度を測定するための方法としては、例えば、qRT-PCRおよびゲノムワイドシーケンシングが挙げられる。
(発現構築物の操作)
本発明のTCRまたはキメラポリペプチドを発現する発現構築物は、TCRまたはポリペプチドコード領域およびプロモーター配列(全て作用的に連結される)を含む。一般に、用語「作動可能に連結される(operably linked)」とは、プロモーター配列が第2の配列に機能的に連結されており、ここで上記プロモーター配列が、上記第2の配列に相当するDNAの転写を開始および媒介することを示すことを意味する。
本発明のTCRまたはキメラポリペプチドを発現する発現構築物は、TCRまたはポリペプチドコード領域およびプロモーター配列(全て作用的に連結される)を含む。一般に、用語「作動可能に連結される(operably linked)」とは、プロモーター配列が第2の配列に機能的に連結されており、ここで上記プロモーター配列が、上記第2の配列に相当するDNAの転写を開始および媒介することを示すことを意味する。
ある種の例において、TCRまたは他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター(例えば、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターなどの)の中に含まれる。この第2のポリペプチドは、例えば、カスパーゼポリペプチド(本明細書で論じられるとおり)またはマーカーポリペプチドであり得る。これらの例において、上記構築物は、切断可能な2Aポリペプチドによって、または内部リボソーム侵入配列(IRES)によって連結された、2個のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された1個のプロモーターとともにデザインされ得る。これらの例において、上記第1のおよび第2のポリペプチドは、翻訳の間に分断され、TCRおよびさらなるポリペプチドを生じる。他の例において、この2個のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで上記ポリペプチドのうちの一方をコードするポリヌクレオチドを含む各核酸は、別個のプロモーターに作動可能に連結される。さらに他の例において、1個のプロモーターは、2個のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、2個の別個のRNA転写物、および従って2個のポリペプチドの生成を指向する;一例において、上記プロモーターは、2方向性であり得、そのコード領域は、5’-3’の反対方向にあり得る。従って、本明細書で論じる発現構築物は、少なくとも1個、または少なくとも2個のプロモーターを含み得る。
さらに他の例において、2個のポリペプチド(例えば、TCRおよびカスパーゼポリペプチドなど)は、2個の別個のベクターを使用して細胞によって発現され得る。上記細胞は、ベクターで共トランスフェクトもしくは共形質転換され得るか、または上記ベクターは、異なる時点で上記細胞に導入され得る。
上記ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端までそれらの順序において変動し得る。種々のドメインの順序は、最適な発現および活性を得るために、例えば、本明細書で論じる方法などの方法を使用してアッセイされ得る。
選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(tk)などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質(例えば、CD34、CD19、低親和性神経成長因子レセプター(LNGFR))もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター(例えば、GFP、EGFP、ベータ-galまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT))が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、CD19などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように、CD19マーカーは、抗CD19抗体、すなわち、例えば、CD19に結合するscFv、TCRまたは他の抗原認識部分と区別される。
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(tk)などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質(例えば、CD34、CD19、低親和性神経成長因子レセプター(LNGFR))もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター(例えば、GFP、EGFP、ベータ-galまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT))が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、CD19などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように、CD19マーカーは、抗CD19抗体、すなわち、例えば、CD19に結合するscFv、TCRまたは他の抗原認識部分と区別される。
ある種の実施形態において、上記マーカーポリペプチドは、誘導性キメラシグナル伝達分子に連結される。例えば、上記マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列(例えば、切断可能な2A様配列など)を介して、誘導性キメラシグナル伝達分子に連結され得る。上記マーカーポリペプチドは、例えば、CD19、ΔCD19であり得るか、または例えば、上記誘導性キメラシグナル伝達分子の活性に影響を与えないように選択された異種タンパク質であり得る。
2A様配列または「ペプチド結合スキッピング」2A配列は、例えば、Thosea asigna由来のものを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分断されるように意図された2つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Thosea asignaの配列の場合、カルボキシ末端「P-G-P」におけるGlyアミノ酸とProアミノ酸との間の結合が省略される。これは、共刺激ポリペプチド細胞質領域およびマーカーポリペプチドの場合に、2個~3個のポリペプチドを残す。この配列が使用されるとき、2A配列の5’側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Gly残基および2A配列内の任意の上流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。2A配列の3’側でコードされるペプチドは、アミノ末端において、Pro残基および2A配列の後ろの任意の下流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞をソーティングする一助とするために、発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、CD34最小エピトープは、ベクターの中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるTCRを発現させるために使用される発現ベクターは、16アミノ酸のCD34最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中の例において提供されるある特定の実施形態などのいくつかの実施形態において、CD34最小エピトープは、CD8ストークのアミノ末端位置において組み込まれる。
リガンド結合領域
リガンド結合領域は、本明細書で論じられるキメラポリペプチド中に、例えば、誘導性カスパーゼポリペプチドの一部として含まれ得る。発現構築物のリガンド結合(「二量体化」)ドメインは、天然もしくは非天然のリガンド(例えば、非天然の合成リガンド)を使用して誘導を可能にする任意の都合の良いドメインであり得る。多量体化領域またはリガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に依存して、細胞膜に対して内部または外部にあり得る。多種多様なリガンド結合タンパク質(レセプターを含む)は、上記で示される細胞質領域と会合するリガンド結合タンパク質を含め、公知である。本明細書で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、用語「レセプター」と互換性であり得る。リガンド(例えば、小さい有機リガンド)が公知であるか、または容易に産生され得るリガンド結合タンパク質は、特に重要である。これらリガンド結合ドメインまたはレセプターは、FKBPおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上記で示される他のレセプターなど、ならびに抗体、特に重鎖もしくは軽鎖サブユニットから得られ得る「非天然の」レセプター、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、上記リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、上記リガンド結合領域は、FvFvls配列を含む。ときおり、上記Fv’Fvls配列は、さらなるFv’配列をさらに含む。上記FKBP12領域は、例えば、36位でのアミノ酸置換、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有し得る。例としては、例えば、Kopytek, S.J.ら, Chemistry & Biology 7:313-321 (2000)およびGestwicki, J.E.ら, Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10:667-675 (2007);Clackson, T. (2006) Chem Biol Drug Des 67:440-2; Clackson, T., in Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s.ら編, Wiley, 2007))において論じられるものが挙げられる。例えば、配列番号77のアミノ酸配列は、36位においてバリンのアミノ酸置換が存在する(本明細書中の配列において35番目のアミノ酸として提供される)配列の一例を表す。配列番号84のアミノ酸配列は、36位において野生型フェニルアラニンを有する(本明細書中の配列において35番目のアミノ酸として提供される)FKBP12のアミノ酸配列を表す。
リガンド結合領域は、本明細書で論じられるキメラポリペプチド中に、例えば、誘導性カスパーゼポリペプチドの一部として含まれ得る。発現構築物のリガンド結合(「二量体化」)ドメインは、天然もしくは非天然のリガンド(例えば、非天然の合成リガンド)を使用して誘導を可能にする任意の都合の良いドメインであり得る。多量体化領域またはリガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に依存して、細胞膜に対して内部または外部にあり得る。多種多様なリガンド結合タンパク質(レセプターを含む)は、上記で示される細胞質領域と会合するリガンド結合タンパク質を含め、公知である。本明細書で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、用語「レセプター」と互換性であり得る。リガンド(例えば、小さい有機リガンド)が公知であるか、または容易に産生され得るリガンド結合タンパク質は、特に重要である。これらリガンド結合ドメインまたはレセプターは、FKBPおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上記で示される他のレセプターなど、ならびに抗体、特に重鎖もしくは軽鎖サブユニットから得られ得る「非天然の」レセプター、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、上記リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、上記リガンド結合領域は、FvFvls配列を含む。ときおり、上記Fv’Fvls配列は、さらなるFv’配列をさらに含む。上記FKBP12領域は、例えば、36位でのアミノ酸置換、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有し得る。例としては、例えば、Kopytek, S.J.ら, Chemistry & Biology 7:313-321 (2000)およびGestwicki, J.E.ら, Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10:667-675 (2007);Clackson, T. (2006) Chem Biol Drug Des 67:440-2; Clackson, T., in Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s.ら編, Wiley, 2007))において論じられるものが挙げられる。例えば、配列番号77のアミノ酸配列は、36位においてバリンのアミノ酸置換が存在する(本明細書中の配列において35番目のアミノ酸として提供される)配列の一例を表す。配列番号84のアミノ酸配列は、36位において野生型フェニルアラニンを有する(本明細書中の配列において35番目のアミノ酸として提供される)FKBP12のアミノ酸配列を表す。
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約50アミノ酸、および約350アミノ酸未満、通常、200アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子(ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする<25kDa)であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の5’または3’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の5’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター-リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン(複数可)を公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され得る。
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢(すなわち、CNS/脳領域の外側)では発現されない細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター(LNGFR)および胚表面タンパク質(すなわち、癌胎児抗原)が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするcDNAは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
カスパーゼ-9ポリペプチドを多量体化する場合、キメラ誘導性カスパーゼ-9ポリペプチドのリガンド結合ドメイン/レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも2つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる2つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約150Daおよび約5kDa未満、通常、約3kDa未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のFK506は、FKBP12レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンAは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンDは、ビタミンDレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性/親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化(CID)の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
CIDシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質(Spencer,D.M.ら、Science,1993.262:p.1019-1024;Spencer D.M.ら、Curr Biol 1996,6:839-847;Blau,C.A.ら、Proc Natl Acad.Sci.USA 1997,94:3076-3081)またはサイトゾルタンパク質(Luo,Z.ら、Nature 1996,383:181-185;MacCorkle,R.A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 1998,95:3655-3660)のオリゴマー化および活性化、転写を調節するDNAエレメントへの転写因子のリクルートメント(Ho,S.N.ら、Nature 1996,382:822-826;Rivera,V.M.ら、Nat.Med.1996,2:1028-1032)またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント(Spencer D.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995,92:9805-9809;Holsinger,L.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995,95:9810-9814)を引き起こすために使用されている。
CIDシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、CIDシステムは、脂質透過性免疫抑制薬FK506の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、FK506結合タンパク質であるFKBP12に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。1つ以上のFKBPおよびミリストイル化配列を、標的レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二量体化剤薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でシグナル伝達を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第3世代のAP20187/AP1903 CIDの、それらの結合ドメインであるFKBP12に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のFKBP12による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化剤薬物に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するFKBP12バリアント(例えば、FKBP12v36)もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの2つ以上に結合することができる。キメラタンパク質は、2つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、2つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、二量体のFK506(例えば、FK1012)が挙げられるが、これに限定されない。
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、FKBP12(V36)などであり得る:F36がVに置換されたヒト12kDa FK506結合タンパク質、完全に成熟したコード配列(アミノ酸1~107)は、合成二量体化剤薬物AP1903に対する結合部位を提供する(Jemal,A.ら、CA Cancer J.Clinic.58,71-96(2008);Scher,H.I.and Kelly,W.K.,Journal of Clinical Oncology 11,1566-72(1993))。上記タンパク質の2つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、AP1903による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
F36V’-FKBP:F36V’-FKBPは、F36V-FKBPのコドンゆらぎバージョンである。それは、 F36V-FKPBと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは62%の相同性しか有しない。F36V’-FKBPは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた(Schellhammer,P.F.ら、J.Urol.157,1731-5(1997))。F36V’-FKBPは、PCRアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、1コピーのF36V-FKBPに直接連結された1コピーのF36V’-FKBPを含む。
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のFK506または二量体のFK506アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、AP1903(INN:リミズシド、CAS索引名:2-ピペリジンカルボン酸、1-[(2S)-1-オキソ-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ブチル]-、1,2-エタンジイルビス[イミノ(2-オキソ-2,1-エタンジイル)オキシ-3,1-フェニレン[(1R)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)プロピリデン]]エステル、[2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl)CAS登録番号:195514-63-7;分子式:C78H98N4O20 分子量:1411.65)である。ある特定の実施形態において、リガンドは、AP20187である。ある特定の実施形態において、リガンドは、AP20187アナログ、例えば、AP1510などである。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、FKBP12に対して適切であり得、ある特定のアナログは、FKBP12の変異体(V36)バージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、1つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、2つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、FKBP12である場合、これらの領域の2つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン/DNAジャイレースBシステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたRafタンパク質を活性化し、MAPキナーゼカスケードを刺激する。Farrarら、1996を参照のこと。
AP1903 APIは、Alphora Research Inc.によって製造されており、AP1903 Drug Product for Injectionは、AAI Pharma Services Corpによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Solutol HS 15(250mg/mL,BASF)の25%溶液中のAP1903の5mg/mL溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、長期の貯蔵において可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る。1本分は、10mLのガラスバイアルにおける8mLである(バイアル1本あたり合計約40mgのAP1903 for Injection)。
使用のために、AP1903は、室温へと加温され、投与前に希釈される。50kgを超える被験体に関しては、AP1903は、100mL 生理食塩水中で希釈した40mgの用量で、DEHP非含有食塩水バッグおよび溶液セットを使用して、50mL/時間の速度で2時間かけてi.v.注入を介して投与される。50kg未満の被験体は、0.4mg/kg AP1903を受ける。
すべての試験薬が、2℃~8℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
AP1903を投与する必要性、ならびに改変されたTCR発現T細胞のアポトーシスを誘導するためにカスパーゼ-9を活性化する必要性を決定する際、患者には、例えば、非DEHPで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、2時間にわたるIV注入によって、単一の固定された用量のAP1903 for Injection(0.4mg/kg)が投与され得る。AP1903の用量は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧10%変動しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に0.9%生理食塩水において100mLに希釈される。
AP1903の以前の第I相研究では、24人の健常志願者を、2時間にわたって、IV注入される0.01、0.05、0.1、0.5および1.0mg/kgという用量レベルにおいて、単一用量のAP1903 for Injectionで処置した。AP1903血漿レベルは、用量に正比例し、平均Cmax値は、0.01~1.0mg/kgの用量の範囲にわたって、およそ10~1275ng/mLの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の0.5、2および10時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ18、7および1%に減少した。AP1903 for Injectionは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Iuliucci JDら、J Clin Pharmacol.41:870-9,2001。
使用されるAP1903 for injectionの固定された用量は、例えば、2時間にわたって静脈内に注入される0.4mg/kgであり得る。細胞の効率的なシグナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるAP1903の量は、約10~100nM(MW:1412Da)である。これは、14~140μg/Lまたは約0.014~0.14mg/kg(1.4~140μg/kg)に等しい。投与量は、用途に応じて変動することがあり、ある特定の例では、0.1~10nMの範囲内、または50~150nM、10~200nM、75~125nM、100~500nM、100~600nM、100~700nM、100~800nMもしくは100~900nMの範囲内であり得る。1mg/kgまでの用量が、上記のAP1903の第I相研究において耐容性がよかった。
膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をN末端またはC末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分(その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基(例えば、ヒトc-Src:M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R)が続くことが多い)によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼSrcのN末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ(例えば、Srcファミリーメンバーのサブセット(例えば、Yes、Fyn、Lck)およびGタンパク質アルファサブユニット)のN末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の18アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフMet-Gly-Cys-Xaa-Cysに一致し、ここで、Metは、切断され、Glyは、N-アシル化され、Cys残基のうちの1つは、S-アシル化される。Glyは、ミリストイル化されることが多く、Cysは、パルミトイル化され得る。配列モチーフCys-Ala-Ala-Xaa(いわゆる「CAAXボックス」)に一致するアシル化領域は、Gタンパク質ガンマサブユニットのC末端由来のC15またはC10イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質(例えば、ワールドワイドウェブアドレスebi.ac.uk/interpro/DisplayIproEntry?ac=IPR001230)もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Gauthier-Campbellら、Molecular Biology of the Cell 15:2205-2217(2004);Glabatiら、Biochem.J.303:697-700(1994)およびZlakineら、J.Cell Science 110:673-679(1997)において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Lck、FynもしくはYesまたはGタンパク質アルファサブユニットのN末端部分(例えば、そのようなタンパク質由来の最初の25個のN末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸(例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約5~約20アミノ酸、約10~約19アミノ酸または約15~約19アミノ酸))が、キメラタンパク質のN末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、CAAXボックスモチーフ配列を含むGタンパク質ガンマサブユニット由来の約25アミノ酸以下のC末端配列(例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約5~約20アミノ酸、約10~約18アミノ酸または約15~約18アミノ酸)が、キメラタンパク質のC末端に連結され得る。
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をN末端またはC末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分(その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基(例えば、ヒトc-Src:M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R)が続くことが多い)によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼSrcのN末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ(例えば、Srcファミリーメンバーのサブセット(例えば、Yes、Fyn、Lck)およびGタンパク質アルファサブユニット)のN末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の18アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフMet-Gly-Cys-Xaa-Cysに一致し、ここで、Metは、切断され、Glyは、N-アシル化され、Cys残基のうちの1つは、S-アシル化される。Glyは、ミリストイル化されることが多く、Cysは、パルミトイル化され得る。配列モチーフCys-Ala-Ala-Xaa(いわゆる「CAAXボックス」)に一致するアシル化領域は、Gタンパク質ガンマサブユニットのC末端由来のC15またはC10イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質(例えば、ワールドワイドウェブアドレスebi.ac.uk/interpro/DisplayIproEntry?ac=IPR001230)もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Gauthier-Campbellら、Molecular Biology of the Cell 15:2205-2217(2004);Glabatiら、Biochem.J.303:697-700(1994)およびZlakineら、J.Cell Science 110:673-679(1997)において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Lck、FynもしくはYesまたはGタンパク質アルファサブユニットのN末端部分(例えば、そのようなタンパク質由来の最初の25個のN末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸(例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約5~約20アミノ酸、約10~約19アミノ酸または約15~約19アミノ酸))が、キメラタンパク質のN末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、CAAXボックスモチーフ配列を含むGタンパク質ガンマサブユニット由来の約25アミノ酸以下のC末端配列(例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約5~約20アミノ酸、約10~約18アミノ酸または約15~約18アミノ酸)が、キメラタンパク質のC末端に連結され得る。
いくつかの実施形態において、アシル部分は、+1から+6というlog p値を有し、時折、+3から+4.5というlog p値を有する。Log p値は、疎水性の尺度であり、オクタノール/水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いlog p値を有すると特徴付けられる。Log p値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、log p値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る(例えば、Chemical Reviews,Vol.71,Issue 6,page 599、エントリー4493は、4.2というlog p値を有するラウリン酸を示している)。任意のアシル部分が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、C1-C20アルキル、C2-C20アルケニル、C2-C20アルキニル、C3-C6シクロアルキル、C1-C4ハロアルキル、C4-C12シクロアルキルアルキル(cyclalkylalkyl)、アリール、置換アリールまたはアリール(C1-C4)アルキルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル(C3)、ブチル(C4)、ペンチル(C5)、ヘキシル(C6)、ヘプチル(C7)、オクチル(C8)、ノニル(C9)、デシル(C10)、ウンデシル(C11)、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)、アラキジル(C20)、ベヘニル(C22)およびリグノセリル部分(C24)であり、各部分は、0、1、2、3、4、5、6、7または8つの不飽和(すなわち、二重結合)を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子(例えば、ホスファチジル脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン)、スフィンゴ脂質(例えば、スフィンゴミエリン(shingomyelin)、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド))またはそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、1、2、3、4もしくは5個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの1つと会合されていることもあるし会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列(すなわち、ファルネシル化、ゲラニル-ゲラニル化、CAAXボックス)、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列(シグナルペプチドを利用する)が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば、ten Klooster JPら、Biology of the Cell(2007)99,1-12,Vincent,S.ら、Nature Biotechnology 21:936-40,1098(2003)において論じられているものが挙げられる。
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約120アミノ酸のプレクストリン相同(PH)ドメインが、代表的には細胞内のシグナル伝達に関与する200個を超えるヒトタンパク質において見られる。PHドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール(PI)脂質(例えば、PI(3,4,5)-P3、PI(3,4)-P2、PI(4,5)-P2)に結合し得るので、種々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際に鍵となる役割を果たし得る。しばしば、PI脂質のリン酸化状態は、例えば、PI-3キナーゼまたはPTENによって制御されるので、膜とPHドメインとの相互作用は、アシル脂質による相互作用ほど安定でない。
調節領域
1.プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
1.プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β-アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。例えば、1つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの1つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である(より誘導性のプロモーターを付加する)。
エクジソンシステム(Invitrogen,Carlsbad,CA)は、1つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく200倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンAなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのmRNA転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、1つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンAによって活性化され得る。
有用であり得る別の誘導性システムは、もともとはGossenおよびBujardによって開発された(Gossen and Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551,1992;Gossenら、Science,268:1766-1769,1995)、Tet-OffTMまたはTet-OnTMシステム(Clontech,Palo Alto,CA)である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体(例えば、ドキシサイクリン)に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Tet-OnTMシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Tet-OffTMシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する2つの制御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第2のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Tet-OffTMシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のVP16ドメインおよび野生型テトラサイクリンリプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Tet-OnTMシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Tet-OffTMシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、CMV前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。CMVプロモーターは、Donnelly,J.J.ら、1997.Annu.Rev.Immunol.15:617-48において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないCMVプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、MLVまたはMMTV由来のLTRなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、SV40、RSV LTR、HIV-1およびHIV-2 LTR、アデノウイルスプロモーター(例えば、E1A、E2AまたはMLP領域由来のもの)、AAV LTR、HSV-TKおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、CMVプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る(Bojak,A.ら、2002.Vaccine 20:1975-79;Cazeaux.,N.ら、2002.Vaccine 20:3322-31)。例えば、組織特異的プロモーター(例えば、PSA関連プロモーター)または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:B29/CD79b(B細胞);CD14(単球性細胞);CD43(白血球および血小板);CD45(造血細胞);CD68(マクロファージ);デスミン(筋肉);エラスターゼ-1(膵腺房細胞);エンドグリン(内皮細胞);フィブロネクチン(分化中の細胞、治癒中の組織);およびFlt-1(内皮細胞);GFAP(アストロサイト)。
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、KキニノーゲンおよびTキニノーゲン(Kageyamaら(1987)J.Biol.Chem.,262,2345-2351)、c-fos、TNF-α、C反応性タンパク質(Arconeら(1988)Nucl.Acids Res.,16(8),3195-3207)、ハプトグロビン(Olivieroら(1987)EMBO J.,6,1905-1912)、血清アミロイドA2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli and Cortese,(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,86,8202-8206)、補体C3(Wilsonら(1990)Mol.Cell.Biol.,6181-6191)、IL-8、α-1酸性糖タンパク質(Prowse and Baumann,(1988)Mol Cell Biol,8,42-51)、α-1抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ(Zechnerら、Mol.Cell.Biol.,2394-2401,1988)、アンジオテンシノーゲン(Ronら(1991)Mol.Cell.Biol.,2887-2895)、フィブリノゲン、c-jun(ホルボールエステル、TNF-α、UV照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能)、コラゲナーゼ(ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される)、メタロチオネイン(重金属および糖質コルチコイド誘導性)、ストロメライシン(ホルボールエステル、インターロイキン-1およびEGFによって誘導可能)、α-2マクログロブリンおよびα-1抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、SV40、MMTV、ヒト免疫不全ウイルス(MV)、モロニーウイルス、ALV、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく;他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
2.エンハンサー
エンハンサーは、同じDNA分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびT細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター(例えば、CMV、SV40およびレトロウイルスLTR)は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、1つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する;これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでRNA合成の開始を指示する1つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを(インスレーターエレメントとともに)隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域(LCR)が含まれる。
エンハンサーは、同じDNA分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびT細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター(例えば、CMV、SV40およびレトロウイルスLTR)は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、1つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する;これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでRNA合成の開始を指示する1つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを(インスレーターエレメントとともに)隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域(LCR)が含まれる。
任意のプロモーター/エンハンサーの組み合わせ(Eukaryotic Promoter Data Base EPDBのように)が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る(例えば、Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Reviews Genetics 9:776-88に概説されている)。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスCMV、RSVおよびEBV由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
3.ポリアデニル化シグナル
cDNAインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列(例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびSV40のポリアデニル化シグナルならびにLTRポリアデニル化シグナル)が、使用される。1つの非限定的な例は、pCEP3プラスミド(Invitrogen,Carlsbad,California)に存在するSV40ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ(A)シグナル配列は、例えば、mRNAの3’末端における保存配列(AAUAAA)から約11~30ヌクレオチド下流に位置し得る(Montgomery,D.L.ら、1993.DNA Cell Biol.12:777-83;Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88)。
cDNAインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列(例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびSV40のポリアデニル化シグナルならびにLTRポリアデニル化シグナル)が、使用される。1つの非限定的な例は、pCEP3プラスミド(Invitrogen,Carlsbad,California)に存在するSV40ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ(A)シグナル配列は、例えば、mRNAの3’末端における保存配列(AAUAAA)から約11~30ヌクレオチド下流に位置し得る(Montgomery,D.L.ら、1993.DNA Cell Biol.12:777-83;Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88)。
4.開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接する配列を含む。ATG開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接する配列を含む。ATG開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。IRESエレメントは、5’メチル化cap依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる(Pelletier and Sonenberg,Nature,334:320-325,1988)。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー(ポリオおよび脳心筋炎)由来のIRESエレメントが、論じられており(Pelletier and Sonenberg,1988)、ならびに哺乳動物メッセージ由来のIRESも論じられている(Macejak and Sarnow,Nature,353:90-94,1991)。IRESエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がIRESによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。IRESエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター/エンハンサーを使用して効率的に発現され得る(米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号(各々が参照により本明細書中に援用される)を参照のこと)。
配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたRNAが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。RNAに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るmRNA二次構造、またはmRNAの核外輸送を阻害し得るクリプティック(cryptic)配列などのエレメントが、除去され得る(Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88;Yan.,J.ら、2007.Mol.Ther.15:411-21;Cheung,Y.K.ら、2004.Vaccine 23:629-38;Narum.,D.L.ら、2001.69:7250-55;Yadava,A.,and Ockenhouse,C.F.,2003.Infect.Immun.71:4962-69;Smith.,J.M.ら、2004.AIDS Res.Hum.Retroviruses 20:1335-47;Zhou,W.ら、2002.Vet.Microbiol.88:127-51;Wu,X.ら、2004.Biochem.Biophys.Res.Commun.313:89-96;Zhang,W.ら、2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.349:69-78;Deml,L.A.ら、2001.J.Virol.75:1099-11001;Schneider,R.M.ら、1997.J.Virol.71:4892-4903;Wang,S.D.ら、2006.Vaccine 24:4531-40;zur Megede,J.ら、2000.J.Virol.74:2628-2635)。例えば、FKBP12または他の多量体化領域ポリペプチド、カスパーゼ-9ポリペプチド、およびTCRポリペプチドコードポリヌクレオチド配列は、コドンの変化によって最適化され得る。
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたRNAが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。RNAに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るmRNA二次構造、またはmRNAの核外輸送を阻害し得るクリプティック(cryptic)配列などのエレメントが、除去され得る(Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88;Yan.,J.ら、2007.Mol.Ther.15:411-21;Cheung,Y.K.ら、2004.Vaccine 23:629-38;Narum.,D.L.ら、2001.69:7250-55;Yadava,A.,and Ockenhouse,C.F.,2003.Infect.Immun.71:4962-69;Smith.,J.M.ら、2004.AIDS Res.Hum.Retroviruses 20:1335-47;Zhou,W.ら、2002.Vet.Microbiol.88:127-51;Wu,X.ら、2004.Biochem.Biophys.Res.Commun.313:89-96;Zhang,W.ら、2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.349:69-78;Deml,L.A.ら、2001.J.Virol.75:1099-11001;Schneider,R.M.ら、1997.J.Virol.71:4892-4903;Wang,S.D.ら、2006.Vaccine 24:4531-40;zur Megede,J.ら、2000.J.Virol.74:2628-2635)。例えば、FKBP12または他の多量体化領域ポリペプチド、カスパーゼ-9ポリペプチド、およびTCRポリペプチドコードポリヌクレオチド配列は、コドンの変化によって最適化され得る。
リーダー配列
リーダー配列は、mRNAの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、mRNAを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、HIV-1エンベロープ糖タンパク質(Env)に対するシグナル配列、およびIgE遺伝子リーダー配列が挙げられる(Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88;Li,V.ら、2000.Virology 272:417-28;Xu,Z.L.ら、2001.Gene 272:149-56;Malin,A.S.ら、2000.Microbes Infect.2:1677-85;Kutzler,M.A.ら、2005.J.Immunol.175:112-125;Yang.,J.S.ら、2002.Emerg.Infect.Dis.8:1379-84;Kumar.,S.ら、2006.DNA Cell Biol.25:383-92;Wang,S.ら、2006.Vaccine 24:4531-40)。IgEリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る(Tepler,Iら(1989)J.Biol.Chem.264:5912)。
リーダー配列は、mRNAの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、mRNAを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、HIV-1エンベロープ糖タンパク質(Env)に対するシグナル配列、およびIgE遺伝子リーダー配列が挙げられる(Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88;Li,V.ら、2000.Virology 272:417-28;Xu,Z.L.ら、2001.Gene 272:149-56;Malin,A.S.ら、2000.Microbes Infect.2:1677-85;Kutzler,M.A.ら、2005.J.Immunol.175:112-125;Yang.,J.S.ら、2002.Emerg.Infect.Dis.8:1379-84;Kumar.,S.ら、2006.DNA Cell Biol.25:383-92;Wang,S.ら、2006.Vaccine 24:4531-40)。IgEリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る(Tepler,Iら(1989)J.Biol.Chem.264:5912)。
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび/またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む(例えば、Laddy,D.J.ら、2008.PLoS.ONE 3 e2517;Kutzler,M.A.,and Weiner,D.B.,2008.Nature Rev.Gen.9:776-88に提示されているような)。
核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、DNA、RNAまたはその誘導体もしくはアナログの分子(1本、2本またはそれより多くの鎖)のことを指す。核酸塩基には、例えば、DNA(例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」またはシトシン「C」)またはRNA(例えば、A、G、ウラシル「U」またはC)に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990もしくは1000ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、DNA、RNAまたはその誘導体もしくはアナログの分子(1本、2本またはそれより多くの鎖)のことを指す。核酸塩基には、例えば、DNA(例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」またはシトシン「C」)またはRNA(例えば、A、G、ウラシル「U」またはC)に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990もしくは1000ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも5つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990または1000個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件(複数可)」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件(複数可)」を包含する。
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件(複数可)」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列(複数可)を含む1つ以上の核酸鎖の間のまたはその1つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸(例えば、遺伝子またはその核酸セグメント)の単離、または少なくとも1つの特異的なmRNA転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
ストリンジェントな条件は、約42℃~約70℃の温度における約0.02M~約0.5M NaClによって提供されるような、低塩および/または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸(複数可)の長さ、標的配列(複数可)の長さおよび核酸塩基含有量、核酸(複数可)の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒(複数可)の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、1つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および/または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約20℃~約50℃の温度範囲における約0.15M~約0.9M NaClで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存されていると示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、その結果、機能が類似した任意の2つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および例えば、少なくとも95%であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。2つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および/または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性(およびアミノ酸配列の場合、保存)レベルを達成するように2つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性/同一性を評価するための数多くの方法(例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくCluster法ならびにBLASTN、BLASTPおよびFASTAなど)が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、使用される設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、RNAもしくはDNAの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および/または塩基が、修飾され得る(例えば、独立して、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、最大100%)。修飾されていないヌクレオシドは、β-D-リボ-フラノースの1’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか1つである。
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、RNAもしくはDNAの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および/または塩基が、修飾され得る(例えば、独立して、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、最大100%)。修飾されていないヌクレオシドは、β-D-リボ-フラノースの1’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか1つである。
修飾塩基は、1’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、フェニル、シュードウラシル、2,4,6-トリメトキシベンゼン、3-メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5-アルキルシチジン(例えば、5-メチルシチジン)、5-アルキルウリジン(例えば、リボチミジン)、5-ハロウリジン(例えば、5-ブロモウリジン)または6-アザピリミジンまたは6-アルキルピリミジン(例えば、6-メチルウリジン)、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル(例えば、3-ニトロピロリル)、ニトロインドリル(例えば、4-、5-、6-ニトロインドリル)、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、4-フルオロ-6-メチルベンゾイミダゾール、4-メチルベンゾイミダゾール、3-メチルイソカルボスチリリル、5-メチルイソカルボスチリリル、3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリリル、7-アザインドリル、6-メチル-7-アザインドリル、イミジゾピリジニル、9-メチル-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル-7-アザインドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチルインドリル、4,6-ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル(napthalenyl)、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、例えば、核酸(nucleid acid)は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび/またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、D-ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に1つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、ビシクロ[3.2.1]オクタンまたはビシクロ[3.3.1]ノナンである。
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに4つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、3-ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、4-、5-および6-ニトロインドリルは、4つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。1-(2’-O-メチル-β-D-リボフラノシル)-5-ニトロインドールを調製するための手順は、Gaubert,G.;Wengel,J.Tetrahedron Letters 2004,45,5629に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、4-フルオロ-6-メチルベンゾイミダゾールおよび4-メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である3-メチルイソカルボスチリリル、5-メチルイソカルボスチリリルおよび3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、7-アザインドリル、6-メチル-7-アザインドリル、イミジゾピリジニル、9-メチル-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル-7-アザインドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチルインドリル、4,6-ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、4-フルオロ-6-メチルベンゾイミダゾール、4-メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Schweitzerら、J.Org.Chem.,59:7238-7242(1994)を参照のこと。
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル(ジスクシンイミジルエステル、例えば、3,3’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)を含む)、二官能性マレイミド(例えば、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン)およびメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、「ロックド(locked)」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および/またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る(すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る)か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
核酸分子は、RNAまたはDNAだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、1%~100%(例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95%)であり得る。
核酸の調製
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法(例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など)によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る(細胞のゲノムから産生され得る)。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法(例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など)によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る(細胞のゲノムから産生され得る)。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび/またはRNA分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および/または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のRNA集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック(例えば、グアニジニウムイソチオシアネート)および/または界面活性剤(例えば、N-ラウロイルサルコシン)で溶解する工程を含む。
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および/またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約55%~60%というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
核酸単離プロセスは、時折、a)サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解する工程(ここで、少なくとも約1Mグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される);b)その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する工程;c)その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物/アルコール混合物を形成する工程(ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約35%~約70%である);d)その溶解産物/アルコール混合物を固体支持体に適用する工程;e)イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程;およびf)その核酸分子を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。
遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド(例えば、DNA)を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるAmerican Type Culture Collection(ATCC)を通じて入手することができる。具体的な実施形態では、宿主細胞は、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーT細胞である。
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および/または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、DH5α、JM109およびKC8、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主(例えば、SURE(登録商標)Competent CellsおよびSOLOPACK Gold Cells(STRATAGENE(登録商標),La Jolla,CA))が挙げられる。あるいは、大腸菌LE392などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および/または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、CHO、SaosおよびPC12が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、YPH499、YPH500およびYPH501が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスDNAベクター、「裸の」DNAおよびRNA、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞、例えば、T細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、IN-VIVO-JET PEIなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
細胞、例えば、T細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、IN-VIVO-JET PEIなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
1.エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された(Wilsonら、Science,244:1344-1346,1989)。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した(Nabelら、Science,244(4910):1342-1344,1989)。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。例えば、T細胞は、動物から得られ得、上記細胞は、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換され得、次いで、その動物へと投与して戻され得る。
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された(Wilsonら、Science,244:1344-1346,1989)。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した(Nabelら、Science,244(4910):1342-1344,1989)。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。例えば、T細胞は、動物から得られ得、上記細胞は、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換され得、次いで、その動物へと投与して戻され得る。
2.注射
ある特定の実施形態において、細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、1つ以上の注射(すなわち、針による注射)、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内(intraprotatic)、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
ある特定の実施形態において、細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、1つ以上の注射(すなわち、針による注射)、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内(intraprotatic)、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、DC投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である(すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む)。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、DCの直接投与を可能にする。
3.エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびDNAの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素(例えば、ペクチン分解酵素)を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする(参照により本明細書中に援用される米国特許第5,384,253号)。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびDNAの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素(例えば、ペクチン分解酵素)を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする(参照により本明細書中に援用される米国特許第5,384,253号)。
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレBリンパ球がヒトκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ(Potterら(1984)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,81,7161-7165)、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた(Tur-Kaspaら(1986)Mol.Cell Biol.,6,716-718)。
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション(electroporation for vaccines)、すなわちeVacは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。腫瘍抗原をコードするDNAベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、DNAベクターを取り込み、コードされる腫瘍抗原を発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、腫瘍抗原を発現しているこれらの樹状細胞が、リンパ節に遊走し、腫瘍抗原を提示し、腫瘍抗原特異的T細胞をプライムし得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に(electroporetically)投与される。
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Sardesai,N.Y.,and Weiner,D.B.,Current Opinion in Immunotherapy 23:421-9(2011)およびFerraro,B.ら、Human Vaccines 7:120-127(2011)(これらの全体が本明細書中で参照により援用される)に論じられている。
4.リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトKB細胞が、アデノウイルス5DNAでトランスフェクトされた(Graham and van der Eb,(1973)Virology,52,456-467)。また、この様式において、マウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3およびHeLa細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ(Chen and Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987)、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた(Rippeら、Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990)。
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトKB細胞が、アデノウイルス5DNAでトランスフェクトされた(Graham and van der Eb,(1973)Virology,52,456-467)。また、この様式において、マウスL(A9)、マウスC127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3およびHeLa細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ(Chen and Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987)、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた(Rippeら、Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990)。
5.DEAE-デキストラン
別の実施形態では、DEAE-デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された(Gopal,T.V.,Mol Cell Biol.1985 May;5(5):1188-90)。
別の実施形態では、DEAE-デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された(Gopal,T.V.,Mol Cell Biol.1985 May;5(5):1188-90)。
6.音波処理負荷(Sonication Loading)
さらなる実施形態は、直接音波負荷(direct sonic loading)によるポリヌクレオチドの導入を含む。LTK線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた(Fechheimerら(1987)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,84,8463-8467)。
さらなる実施形態は、直接音波負荷(direct sonic loading)によるポリヌクレオチドの導入を含む。LTK線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた(Fechheimerら(1987)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,84,8463-8467)。
7.リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める(Ghosh and Bachhawat,(1991)In:Liver Diseases,Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands.pp.87-104)。Lipofectamine(Gibco BRL)またはSuperfect(Qiagen)と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める(Ghosh and Bachhawat,(1991)In:Liver Diseases,Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands.pp.87-104)。Lipofectamine(Gibco BRL)またはSuperfect(Qiagen)と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
8.レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され(Wu and Wu,(1987)J.Biol.Chem.,262,4429-4432;Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(9):3410-3414,1990;Peralesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994;Myers,EPO 0273085)、これにより、この手法の実施可能性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている(Wu and Wu,Adv.Drug Delivery Rev.,12:159-167,1993;参照により本明細書中に援用される)。ある特定の態様では、標的細胞の集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチド(複数可)は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプター(複数可)に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子(EGF)が、EGFレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する1つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル-セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された(Nicolauら(1987)Methods Enzymol.,149,157-176)。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
9.微粒子銃(microprojectile bombardment)
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る(米国特許第5,550,318号;米国特許第5,538,880号;米国特許第5,610,042号;およびPCT出願WO94/09699;これらの各々は、参照により本明細書中に援用される)。この方法は、DNAをコーティングした微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する(Kleinら(1987)Nature,327,70-73)。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る(米国特許第5,550,318号;米国特許第5,538,880号;米国特許第5,610,042号;およびPCT出願WO94/09699;これらの各々は、参照により本明細書中に援用される)。この方法は、DNAをコーティングした微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する(Kleinら(1987)Nature,327,70-73)。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
この微粒子銃では、1つ以上の粒子が、少なくとも1つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。1つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する(Yangら(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,87,9568-9572)。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質(例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ)からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成された粒子(例えば、ナノ粒子を含む)が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのDNA沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのDNA送達に必要としないことが企図される。しかしながら、粒子は、DNAでコーティングされるのではなく、DNAを含み得ることが企図される。DNAをコーティングした粒子は、粒子銃を介したDNA送達のレベルを上昇させ得るが、必要ない。
10.トランスポゾン媒介性移入
トランスポゾン媒介性移入法はまた、例えば、piggy/Bac遺伝子移入システムを使用して、用いられ得る。Sato, M.ら, Biotechnol J. 2014 Oct 24. doi: 10.1002/biot.201400283. [印刷物に先駆けた電子出版]。
トランスポゾン媒介性移入法はまた、例えば、piggy/Bac遺伝子移入システムを使用して、用いられ得る。Sato, M.ら, Biotechnol J. 2014 Oct 24. doi: 10.1002/biot.201400283. [印刷物に先駆けた電子出版]。
ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
1.アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのDNAゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ36kbのウイルスゲノムは、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む100~200塩基対(bp)の末端逆位配列(ITR)が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期(E)領域および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される。
アデノウイルスは、その中程度のサイズのDNAゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ36kbのウイルスゲノムは、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む100~200塩基対(bp)の末端逆位配列(ITR)が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期(E)領域および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される。
E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。E2領域(E2AおよびE2B)の発現により、ウイルスDNA複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、DNAの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する(Renan,M.J.(1990)Radiother Oncol.,19,197-218)。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子(L1、L2、L3、L4およびL5)の産物は、主要後期プロモーター(MLP)によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。MLP(16.8マップ単位に位置する)は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのmRNAは、それらを翻訳にとって有用にする5’トリパータイトリーダー(tripartite leader)(TL)配列を有する。
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなDNAセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの2つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
ウイルスDNAの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位反復配列(ITR)(100~200bp)に局在化するので、DNAの大きな置き換えが可能である。ITRを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る(Hay,R.T.ら、J Mol Biol.1984 Jun 5;175(4):493-510)。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の194~385bp(0.5~1.1マップ単位)に局在する(Hearingら、J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのDNAの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダDNAにおけるタンパク質認識部位を模倣している。AdのE1置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の450bp(0~1.25マップ単位)フラグメントが293細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した(Levreroら、Gene,101:195-202,1991)。
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および/またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている(Tibbettsら(1977)Cell,12,243-249)。後の研究から、ゲノムのE1A(194~358bp)領域に欠失を有する変異体が、初期(E1A)機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された(Hearing and Shenk,(1983)J.Mol.Biol.167,809-822)。代償的な(compensating)アデノウイルスDNA(0~353bp)が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ad5ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには1コピーで十分であるが、Ad5 DNA分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された(Hearingら、J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統(stock)が達成され得る。
特定の組織または種に対するADV構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス5において見出されたコクサッキー-アデノウイルスレセプター(CAR)リガンドは、アデノウイルス35由来のCD46結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるAd5f35は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、例えばT細胞などの標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体(一方の末端はCARリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する)の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド(例えば、抗CD205)をヘテロ二機能性リンカー(例えば、PEG含有)によってアデノウイルス粒子に付着することができる。
2.レトロウイルス
レトロウイルスは、そのRNAを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である(Coffin,(1990)In:Virology,ed.,New York:Raven Press,pp.1437-1500)。次いで、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、3つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするgag、polおよびenvを含む。psiと呼ばれる、gag遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。2つの長い末端反復(LTR)配列が、ウイルスゲノムの5’および3’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である(Coffin,1990)。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスは、そのRNAを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖DNAに変換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である(Coffin,(1990)In:Virology,ed.,New York:Raven Press,pp.1437-1500)。次いで、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、3つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするgag、polおよびenvを含む。psiと呼ばれる、gag遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。2つの長い末端反復(LTR)配列が、ウイルスゲノムの5’および3’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である(Coffin,1990)。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、gag、polおよびenv遺伝子を含むがLTRおよびpsi成分を含まないパッケージング細胞株を構築する(Mannら(1983)Cell,33,153-159)。レトロウイルスのLTR配列およびpsi配列とともにヒトcDNAを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき(例えば、リン酸カルシウム沈殿によって)、そのpsi配列は、その組換えプラスミドのRNA転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させる(Nicolas,J.F.,and Rubenstein,J.L.R.,(1988)In:Vectors:a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Rodriquez and Denhardt,Eds.).Nicolas and Rubenstein;Teminら(1986)In:Gene Transfer,Kucherlapati(ed.),New York:Plenum Press,pp.149-188;Mannら、1983)。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする(Paskindら(1975)Virology,67,242-248)。
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された(Rouxら(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,86,9079-9083)。主要組織適合遺伝子複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された(Rouxら、1989)。
(3.レンチウイルス)
本方法において使用されるレンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターは、霊長類および非霊長類両方の群を含むレトロウイルスベクターの1タイプである。レンチウイルスベクターの例は、例えば、Coffinら (1997) 「Retroviruses」 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763)において論じられる。霊長類レンチウイルスの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(ヒト自己免疫不全症候群(AIDS)の原因因子)およびサル免疫不全ウイルス(SIV)。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ/マエディーウイルス(VMV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ならびにネコ免疫不全ウイルス(FIV)およびウシ免疫不全ウイルス(BIV)が挙げられる。レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る(Lewisら (1992); Lewis and Emerman (1994))。
本方法において使用されるレンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターは、霊長類および非霊長類両方の群を含むレトロウイルスベクターの1タイプである。レンチウイルスベクターの例は、例えば、Coffinら (1997) 「Retroviruses」 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763)において論じられる。霊長類レンチウイルスの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(ヒト自己免疫不全症候群(AIDS)の原因因子)およびサル免疫不全ウイルス(SIV)。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ/マエディーウイルス(VMV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ならびにネコ免疫不全ウイルス(FIV)およびウシ免疫不全ウイルス(BIV)が挙げられる。レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る(Lewisら (1992); Lewis and Emerman (1994))。
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、少なくとも1個の構成要素部分を含むベクターであり、ここでこの構成要素部分は、このベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現するか、または複製され、レンチウイルスに由来し得ることによる生物学的機構に関与する。
レトロウイルスゲノムおよびレンチウイルスゲノムの基本的構造は、5’ LTRおよび3’ LTR(その間またはその内部に、ゲノムをパッケージし得るようにパッケージングシグナルを配置する)、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムならびにパッケージング構成要素をコードするgag、polおよびenv遺伝子への組み込みを可能にする組み込み部位などの多くの共通する特徴を共有する。レンチウイルスはまた、HIVにおけるrevおよびRRE配列などのさらなる特徴を含み、これらは、その組み込まれたプロウイルスのRNA転写物を、感染した標的細胞の核から細胞質へと効率的に輸送することを可能にする。
上記プロウイルスでは、ウイルス遺伝子は両方の末端で、長末端反復(LTR)といわれる領域に挟まれている。このLTRは、プロウイルス組み込みおよび転写を担う、LTRはまた、エンハンサー-プロモーター配列として働き、ウイルス遺伝子の発現をコントロールし得る。
上記LTR自体は、U3、RおよびU5といわれる3個のエレメントに分けられ得る同一の配列である。U3は、RNAの3’末端に特有の配列に由来する。Rは、RNAの両方の末端で反復される配列に由来し、U5は、RNAの5’末端に特有の配列に由来する。この3個のエレメントのサイズは、異なるウイルス間でかなり変動し得る。
本明細書で論じられるレンチウイルスベクターの例において、複製に必須の1またはこれより多くのタンパク質コード領域のうちの少なくとも一部は、上記ウイルスから除去され得る。このことは、ウイルスベクターを複製欠損にする。ウイルスゲノムの一部はまた、標的非分裂宿主細胞を形質導入し得るおよび/またはそのゲノムを宿主ゲノムへと組み込み得るNOIを含むベクターを生成するために、NOIによって置き換えられ得る。
一実施形態において、上記レトロウイルスベクターは、WO 2007/071994、WO 2007/072056、米国特許第9,169,491号、米国特許第8,084,249号、または米国特許第7,531,648号で論じられるとおりの非組み込みベクターである。いくつかの例において、上記レンチウイルスベクターは、自己不活性化レトロウイルスベクターであり、ここで転写エンハンサー、または3’ LTRのU3領域中のエンハンサーおよびプロモーターは、欠失されている(例えば、Yuら. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:3194-3198; Dougherty and Temin (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1197-1201; Hawleyら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:2406-2410; Yeeら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9564-9568を参照のこと)。
宿主細胞/パッケージング細胞内でウイルスゲノムを生成するために使用されるレンチウイルスプラスミドベクターはまた、宿主細胞/パッケージング細胞中のゲノムの転写を指向するためにレンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写制御コントロール配列を含む。これら制御配列は、その転写されたレンチウイルス配列、すなわち、5’ U3領域と会合した天然の配列であり得るか、またはそれらは、異種プロモーター(例えば、別のウイルスプロモーター、例えば、CMVプロモーター)であり得る。
4.アデノ随伴ウイルス
AAVは、約4700塩基対の直鎖状の一本鎖DNAを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。2つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第1に、cap遺伝子は、VP-1、VP-2およびVP-3と命名された3つの異なるビリオンタンパク質(VP)を生成する。第2に、rep遺伝子は、4つの非構造タンパク質(NS)をコードする。これらのrep遺伝子産物の1つ以上は、AAV転写のトランス活性化に関与する。
AAVは、約4700塩基対の直鎖状の一本鎖DNAを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。2つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第1に、cap遺伝子は、VP-1、VP-2およびVP-3と命名された3つの異なるビリオンタンパク質(VP)を生成する。第2に、rep遺伝子は、4つの非構造タンパク質(NS)をコードする。これらのrep遺伝子産物の1つ以上は、AAV転写のトランス活性化に関与する。
AAVにおける3つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、p5、p19およびp40である。転写によって、6つの転写産物が生じ、2つは、3つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位42~46に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。4つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、3つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
AAVは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、AAVは、単純ヘルペスウイルスIおよびII、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、AAVの複製を支援すると示された。AAV repタンパク質の低レベルの発現は、AAV構造発現を抑制すると考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
AAVベクターの末端反復配列は、AAVまたは改変されたAAVゲノムを含むp201などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって(Samulskiら、J.Virol.,61:3096-3101(1987))またはAAVの公開配列に基づく末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるAAV ITRの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することもできる。
AAVベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている(Carter and Flotte,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770;79-90;Chatteijeeら(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770,79-90;Ferrariら(1996)J.Virol.,70,3227-3234;Fisherら(1996)J.Virol.,70,520-532;Flotteら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993);Goodmanら(1994),Blood,84,1492-1500;Kaplittら(1994)Nat’l Genet.,8,148-153;Kaplitt,M.G.ら、Ann Thorac Surg.1996 Dec;62(6):1669-76;Kesslerら(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,93,14082-14087;Koeberlら(1997)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,94,1426-1431;Mizukamiら(1996)Virology,217,124-130)。
肺におけるAAV媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている(Carter and Flotte,1995;Flotteら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993))。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のAAV媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第IX因子遺伝子送達による血友病Bの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるAAV媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる(Fisherら(1996)J.Virol.,70,520-532;Flotteら、1993;Kaplittら、1994;1996;Koeberlら、1997;McCownら(1996)Brain Res.,713,99-107;Pingら(1996)Microcirculation,3,225-228;Xiaoら(1996)J.Virol.,70,8098-8108)。
5.他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス(Ridgeway,(1988)In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,pp.467-492;Baichwal and Sugden,(1986)In,Gene Transfer,pp.117-148;Couparら、Gene,68:1-10,1988)カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス(Ridgeway,(1988)In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,pp.467-492;Baichwal and Sugden,(1986)In,Gene Transfer,pp.117-148;Couparら、Gene,68:1-10,1988)カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の(cognate)位置および向きである(遺伝子置換)かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる(遺伝子増強)。なおもさらなる実施形態において、核酸は、DNAの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
(T細胞を操作するための方法、および改変されたT細胞の評価)
T細胞を操作するための方法および改変されたT細胞の評価の例は、本明細書で提供される。
T細胞を操作するための方法および改変されたT細胞の評価の例は、本明細書で提供される。
(レトロウイルス形質導入)
レトロウイルスの一過性の生成のために、293T細胞を、キメラポリペプチド構築物で、gag-polおよびRD 114エンベロープをコードするプラスミドとともに、GeneJuiceトランスフェクション試薬(Novagen, Madison, WI)を使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの48~72時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで-80℃で貯蔵する。レンチウイルスの一過性の生成のために、293T細胞を、上記構築物で、プラスミドpLP1(gag/pol)、pLP2(rev)およびpLP/VSVG(VSVG env)とともにGeneJuiceを使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの48~72時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで-80℃で貯蔵する。大規模なレトロウイルス生成のために、一過性VSV-G偽型レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なFLYRD18由来レトロウイルス産生株を生成する。導入遺伝子発現が最も高いFLYRD18細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらすクローンを増やし、リンパ球形質導入のためのウイルスを生成するために使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価は、8週間超にわたる連続培養中、維持される。組織培養用の処理が行われていない24ウェルプレートを、37℃において1時間または4℃において一晩、7μg/ml Retronectin(TakaraBio,Otsu,Shiga,Japan)でコーティングする。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、次いで、37℃において30分間、プレートを1.5mlの上清とともにインキュベートすることによって、レトロウイルス上清でコーティングする。続いて、T細胞芽球を、100U/ml IL-2が補充されたウイルス上清中、1ウェルあたり5×105細胞をプレーティングする。60時間の期間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってCD19またはGFPの発現について表現型分析を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってCD19またはGFPの発現について表現型分析を行う。
レトロウイルスの一過性の生成のために、293T細胞を、キメラポリペプチド構築物で、gag-polおよびRD 114エンベロープをコードするプラスミドとともに、GeneJuiceトランスフェクション試薬(Novagen, Madison, WI)を使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの48~72時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで-80℃で貯蔵する。レンチウイルスの一過性の生成のために、293T細胞を、上記構築物で、プラスミドpLP1(gag/pol)、pLP2(rev)およびpLP/VSVG(VSVG env)とともにGeneJuiceを使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの48~72時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで-80℃で貯蔵する。大規模なレトロウイルス生成のために、一過性VSV-G偽型レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なFLYRD18由来レトロウイルス産生株を生成する。導入遺伝子発現が最も高いFLYRD18細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらすクローンを増やし、リンパ球形質導入のためのウイルスを生成するために使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価は、8週間超にわたる連続培養中、維持される。組織培養用の処理が行われていない24ウェルプレートを、37℃において1時間または4℃において一晩、7μg/ml Retronectin(TakaraBio,Otsu,Shiga,Japan)でコーティングする。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、次いで、37℃において30分間、プレートを1.5mlの上清とともにインキュベートすることによって、レトロウイルス上清でコーティングする。続いて、T細胞芽球を、100U/ml IL-2が補充されたウイルス上清中、1ウェルあたり5×105細胞をプレーティングする。60時間の期間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってCD19またはGFPの発現について表現型分析を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリーによってCD19またはGFPの発現について表現型分析を行う。
(形質導入されたT細胞の細胞傷害性)
形質導入された各T細胞株の細胞傷害活性は、以前に提示されたような標準的な4時間の51Cr放出アッセイにおいて評価される。T細胞に上記レトロウイルスまたはレンチウイルスを形質導入し、それを、フィトヘマグルチニン(PHA)によって刺激された自家リンパ球(PHA芽球)、LNCaP、PC3またはDU145およびA549がん細胞株、ならびにヒトPSMAを発現するトランスジェニックA549(A549-PSMA)を含む、Cr51で標識された標的細胞と比較する。完全培地または1%Triton X-100(Sigma,St Louis,MO)中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の51Cr放出を決定するために使用する。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、100×(実験による放出-自発的な放出)/(最大放出-自発的な放出)として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実験を行う。ここでは、細胞株LNCaP、PC3、DU145、A549およびA549-PSMAを、蛍光性mOrangeを発現するように形質導入し、標的細胞として使用する。mOrangeを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、IL-2(50U/ml)の存在下において、形質導入されていないT細胞または改変されたT細胞とともに、腫瘍細胞とT細胞とが1:10という比で共培養する。24時間後、T細胞を100nM AP1903で刺激する。72時間後、細胞を捕集し、カウントし、T細胞を検出するためにCD3で標識し、mOrange腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー(LSRII;BD)によって解析する。
形質導入された各T細胞株の細胞傷害活性は、以前に提示されたような標準的な4時間の51Cr放出アッセイにおいて評価される。T細胞に上記レトロウイルスまたはレンチウイルスを形質導入し、それを、フィトヘマグルチニン(PHA)によって刺激された自家リンパ球(PHA芽球)、LNCaP、PC3またはDU145およびA549がん細胞株、ならびにヒトPSMAを発現するトランスジェニックA549(A549-PSMA)を含む、Cr51で標識された標的細胞と比較する。完全培地または1%Triton X-100(Sigma,St Louis,MO)中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の51Cr放出を決定するために使用する。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、100×(実験による放出-自発的な放出)/(最大放出-自発的な放出)として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実験を行う。ここでは、細胞株LNCaP、PC3、DU145、A549およびA549-PSMAを、蛍光性mOrangeを発現するように形質導入し、標的細胞として使用する。mOrangeを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、IL-2(50U/ml)の存在下において、形質導入されていないT細胞または改変されたT細胞とともに、腫瘍細胞とT細胞とが1:10という比で共培養する。24時間後、T細胞を100nM AP1903で刺激する。72時間後、細胞を捕集し、カウントし、T細胞を検出するためにCD3で標識し、mOrange腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー(LSRII;BD)によって解析する。
(形質導入されたT細胞の表現型分析および活性化状態)
形質導入されたT細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べる:CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD80、CD83、CD86、CD95、CD127、CD134、CD137、HLA-ABCおよびHLA-DR。100nM AP1903を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチコントロールを各実験において使用し、LSRIIフローサイトメーター(BD)を用いて細胞を解析する。抗F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)を使用して、キメラポリペプチドの発現を評価する。
形質導入されたT細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べる:CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD28、CD44、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD80、CD83、CD86、CD95、CD127、CD134、CD137、HLA-ABCおよびHLA-DR。100nM AP1903を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチコントロールを各実験において使用し、LSRIIフローサイトメーター(BD)を用いて細胞を解析する。抗F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)を使用して、キメラポリペプチドの発現を評価する。
(形質導入されたT細胞のサイトカイン産生の解析)
100nM AP1903による刺激の前および後(24時間)のT細胞培養上清中のインターフェロン-γ(IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10および腫瘍壊死因子-α(TNFα)の濃度を、ヒトTh1/Th2サイトカインサイトメトリビーズアレイ(BD Pharmingen)を使用して測定する。培養上清中の誘導されたサイトカイン産生を、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法(ELISA;R&D Systems,Minneapolis,MN)によって検証する。
100nM AP1903による刺激の前および後(24時間)のT細胞培養上清中のインターフェロン-γ(IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10および腫瘍壊死因子-α(TNFα)の濃度を、ヒトTh1/Th2サイトカインサイトメトリビーズアレイ(BD Pharmingen)を使用して測定する。培養上清中の誘導されたサイトカイン産生を、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法(ELISA;R&D Systems,Minneapolis,MN)によって検証する。
(形質導入されたT細胞の増殖)
AP1903によって誘導される活性化の増殖効果を、AP1903に曝露した後の、形質導入されたT細胞および形質導入されていないT細胞の細胞成長を測定することによって評価する。T細胞を、37℃において10分間、10μMカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル(CFSE)で標識する。インキュベーション後、細胞をPBS中で洗浄し、次いで、Cellgenix DC培地に再懸濁する。その後、1×106個のCFSEで標識された改変T細胞または形質導入されていないT細胞を、Cellgenix DC培地のみにおいて培養するか、または100nM AP1903で刺激する。5日後、細胞を収集し、CD3-PerCP.Cy5.5およびCD19-PEで標識し、CFSE希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。
AP1903によって誘導される活性化の増殖効果を、AP1903に曝露した後の、形質導入されたT細胞および形質導入されていないT細胞の細胞成長を測定することによって評価する。T細胞を、37℃において10分間、10μMカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル(CFSE)で標識する。インキュベーション後、細胞をPBS中で洗浄し、次いで、Cellgenix DC培地に再懸濁する。その後、1×106個のCFSEで標識された改変T細胞または形質導入されていないT細胞を、Cellgenix DC培地のみにおいて培養するか、または100nM AP1903で刺激する。5日後、細胞を収集し、CD3-PerCP.Cy5.5およびCD19-PEで標識し、CFSE希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。
可溶性免疫グロブリンが、形質導入されたTリンパ球の増殖および拡大に影響するかを評価するために、いかなる外来性サイトカインも加えずに、健常ドナーから得られるヒト血漿の段階希釈物または精製されたヒト免疫グロブリン(Jackson ImmunoResearch)の段階希釈物とともに細胞を1×105細胞/ウェルで培養する。72時間後、それらの細胞を、1μCi(0.037MBq)メチル-3[H]チミジン(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)でパルスし、さらに15時間培養する。次いで、それらの細胞を、フィルター上に収集し、乾燥させ、1分当たりのカウント数を、β-シンチレーションカウンター(TriCarb 2500 TR;Packard BioScience,Meridien,CT)において測定する。これらの実験は、三連で行う。他の実験では、コントロールおよび改変されたTリンパ球を、培地のみ、または血漿もしくは精製された免疫グロブリンの段階希釈物を1日おきに加えた培地を用いて培養する。次いで、トリパンブルー排除を用いて細胞を2日おきにカウントする。
(エキソビボでのT細胞の活性化およびヒト被験体への投与)
ヒト治療のためにさらなるキメラポリペプチド(例えば、本明細書で論じるキメラカスパーゼ-9ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい改変されたT細胞(例えば、PRAME特異的組換えTCR改変T細胞)を使用する方法が、本実施例で呈示される。
ヒト治療のためにさらなるキメラポリペプチド(例えば、本明細書で論じるキメラカスパーゼ-9ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい改変されたT細胞(例えば、PRAME特異的組換えTCR改変T細胞)を使用する方法が、本実施例で呈示される。
材料および方法
遺伝子改変されたT細胞の大規模産生
T細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から生成される。簡潔には、健常ドナーまたはがん患者由来の末梢血単核球(PBMC)を、可溶性αCD3およびαCD28(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)を使用して、増殖および形質導入のために活性化する。PBMCを、100U/ml IL-2(Cellgenix)が補充されたCellgenix DC培地に、1×106細胞/mlで再懸濁し、0.2μg/ml αCD3および0.5μg/ml αCD28可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を37℃、5%CO2において4日間培養する。4日目に、IL-2を含む1mlの新鮮培地を加える。7日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Cellgenix DC培地に再懸濁する。
遺伝子改変されたT細胞の大規模産生
T細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から生成される。簡潔には、健常ドナーまたはがん患者由来の末梢血単核球(PBMC)を、可溶性αCD3およびαCD28(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)を使用して、増殖および形質導入のために活性化する。PBMCを、100U/ml IL-2(Cellgenix)が補充されたCellgenix DC培地に、1×106細胞/mlで再懸濁し、0.2μg/ml αCD3および0.5μg/ml αCD28可溶性抗体で刺激する。次いで、細胞を37℃、5%CO2において4日間培養する。4日目に、IL-2を含む1mlの新鮮培地を加える。7日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Cellgenix DC培地に再懸濁する。
(プラスミドおよびレトロウイルス)
本実施例の組成物および方法は、本明細書で論じるとおりのPRAME特異的組換えTCRをコードするレンチウイルスベクターを含むように改変され得る。SFGプラスミドは、切断可能な2A様配列を介して短縮型ヒトCD19に連結された誘導性キメラポリペプチドからなる。この誘導性キメラポリペプチドは、Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを介してヒトキメラポリペプチドに接続された、F36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12; GenBank AH002 818)からなる。上記F36V変異は、合成ホモ二量体化剤(homodimerizer)、AP20187またはAP1903へのFKBP12の結合親和性を増大させる。上記2A様配列、「T2A」は、Thosea asigna昆虫ウイルス由来の20アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での>99%の切断を媒介して、誘導性キメラポリペプチドのC末端に19個の追加のアミノ酸およびCD19のN末端に1つの追加のプロリン残基をもたらす。CD19は、細胞質内ドメインを242アミノ酸から19アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸333(TDPTRRF)で短縮される、完全長CD19(GenBank NM001770)からなる。
本実施例の組成物および方法は、本明細書で論じるとおりのPRAME特異的組換えTCRをコードするレンチウイルスベクターを含むように改変され得る。SFGプラスミドは、切断可能な2A様配列を介して短縮型ヒトCD19に連結された誘導性キメラポリペプチドからなる。この誘導性キメラポリペプチドは、Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを介してヒトキメラポリペプチドに接続された、F36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12; GenBank AH002 818)からなる。上記F36V変異は、合成ホモ二量体化剤(homodimerizer)、AP20187またはAP1903へのFKBP12の結合親和性を増大させる。上記2A様配列、「T2A」は、Thosea asigna昆虫ウイルス由来の20アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での>99%の切断を媒介して、誘導性キメラポリペプチドのC末端に19個の追加のアミノ酸およびCD19のN末端に1つの追加のプロリン残基をもたらす。CD19は、細胞質内ドメインを242アミノ酸から19アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸333(TDPTRRF)で短縮される、完全長CD19(GenBank NM001770)からなる。
テナガザル白血病ウイルス(Gal-V)偽型レトロウイルスを産生する安定したPG13クローンを、Phoenix Eco細胞株(ATCC product #SD3444;ATCC,Manassas,VA)をSFGプラスミドで一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Eco偽型レトロウイルスを産生する。そのPG13パッケージング細胞株(ATCC)を、Eco偽型レトロウイルスで3回形質導入することにより、細胞1つあたり複数のSFGプラスミドプロウイルス組み込み体を含む産生株(producer line)を生成する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価をもたらしたPG13クローンを、増やし、ベクター生成のために使用する。
レトロウイルス形質導入
T細胞の活性化および増殖のための培養培地は、100U/ml IL-2(Cellgenix)が補充された無血清Cellgenix DC培地(Cellgenix)である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の7日間にわたって、T細胞を可溶性抗CD3および抗CD28(Miltenyi Biotec)によって活性化する。必要であれば、ΔCD19の免疫磁気選択を形質導入後の4日目に行い;陽性画分をさらに2日間にわたって増殖させ、凍結保存する。
T細胞の活性化および増殖のための培養培地は、100U/ml IL-2(Cellgenix)が補充された無血清Cellgenix DC培地(Cellgenix)である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の7日間にわたって、T細胞を可溶性抗CD3および抗CD28(Miltenyi Biotec)によって活性化する。必要であれば、ΔCD19の免疫磁気選択を形質導入後の4日目に行い;陽性画分をさらに2日間にわたって増殖させ、凍結保存する。
(遺伝子改変され、同種枯渇された細胞(allodepleted cell)のスケールアップ産生)
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、10mlの抗CD3 0.5μg/mlおよび抗CD28 0.2μg/mlまたは10mlのフィブロネクチン7μg/mlで4℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないT75フラスコ(Nunc,Rochester,NY)を使用する。細胞付着性を増大させるためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ(2PF-0072AC,American Fluoroseal Corporation,Gaithersburg,MD)も使用する。PBMCを、抗CD3、抗CD28をコーティングしたフラスコに、100U/ml IL-2が補充された培地中、1×106細胞/ml播種する。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンをコーティングしたフラスコまたはバッグを、10mlのレトロウイルス含有上清で2~3時間、一度負荷する。活性化T細胞を、3:1の比の、レトロウイルスベクター含有新鮮培地および100U/ml IL-2が補充されたT細胞培養培地中、1×106細胞/ml播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたT75またはT175フラスコ内、100U/ml IL-2が補充された培養培地中で、約5×105細胞/ml~8×105細胞/mlの播種密度で増やす。
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、10mlの抗CD3 0.5μg/mlおよび抗CD28 0.2μg/mlまたは10mlのフィブロネクチン7μg/mlで4℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないT75フラスコ(Nunc,Rochester,NY)を使用する。細胞付着性を増大させるためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ(2PF-0072AC,American Fluoroseal Corporation,Gaithersburg,MD)も使用する。PBMCを、抗CD3、抗CD28をコーティングしたフラスコに、100U/ml IL-2が補充された培地中、1×106細胞/ml播種する。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンをコーティングしたフラスコまたはバッグを、10mlのレトロウイルス含有上清で2~3時間、一度負荷する。活性化T細胞を、3:1の比の、レトロウイルスベクター含有新鮮培地および100U/ml IL-2が補充されたT細胞培養培地中、1×106細胞/ml播種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたT75またはT175フラスコ内、100U/ml IL-2が補充された培養培地中で、約5×105細胞/ml~8×105細胞/mlの播種密度で増やす。
(CD19免疫磁気選択)
本実施例では、改変された細胞は、CD19マーカータンパク質を発現する;改変された細胞を、CD19以外のマーカーを使用して、または他の方法によって選択し得ることは、理解される。CD19に対する免疫磁気選択は、一例では、形質導入の4日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体に結合体化された常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)で標識し、小規模実験ではMSまたはLSカラムにおいて、および大規模実験ではCliniMacs Plus自動選択デバイスにおいて、選択する。CD19によって選択された細胞を、さらに4日間増やし、形質導入後の8日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。
本実施例では、改変された細胞は、CD19マーカータンパク質を発現する;改変された細胞を、CD19以外のマーカーを使用して、または他の方法によって選択し得ることは、理解される。CD19に対する免疫磁気選択は、一例では、形質導入の4日後に行われ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体に結合体化された常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)で標識し、小規模実験ではMSまたはLSカラムにおいて、および大規模実験ではCliniMacs Plus自動選択デバイスにおいて、選択する。CD19によって選択された細胞を、さらに4日間増やし、形質導入後の8日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称される。
免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析(FACSCaliburおよびCellQuestソフトウェア;Becton Dickinson)を、以下の抗体を使用して行う:CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD56およびCD62L。CD19-PE(クローン4G7;Becton Dickinson)は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、CD19に対するネガティブゲートを設定するために使用する。
フローサイトメトリー解析(FACSCaliburおよびCellQuestソフトウェア;Becton Dickinson)を、以下の抗体を使用して行う:CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD56およびCD62L。CD19-PE(クローン4G7;Becton Dickinson)は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、CD19に対するネガティブゲートを設定するために使用する。
統計解析
対応のある両側スチューデントt検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を決定する。すべてのデータを平均±1標準偏差として表す。
対応のある両側スチューデントt検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を決定する。すべてのデータを平均±1標準偏差として表す。
疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
細胞、例えば、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、または前駆体細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物(metastatic deposit)などに送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加されるか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、T細胞レセプター(例えば、PRAME標的化TCR)を発現するT細胞が患者に提供される場合、場合によっては、またはオフターゲット毒性などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用T細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する(return)かまたは腫瘍サイズが増加する場合、TCRを発現しているT細胞をさらに活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量(unitary dosages)として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。
本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、60%、70%、80%、85%、90%、95%もしくは97%超または80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%もしくは10%未満の治療用細胞が殺滅されるような、カスパーゼ-9を発現する細胞T細胞においてアポトーシスを誘導するこの選択された結果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。薬学的組成物が改変T細胞である場合の有効量は、所望の治療的応答(例えば、リガンド誘導物質が投与される前の時点と比べて、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞のレベルの低下、または白血病細胞のレベルの低下)を達成する量でもあり得る。
任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の組成物、被験体のサイズ、および/または上記疾患もしくは状態の重症度などの要因に依存して変動し得る。本明細書で示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を要することなしに経験的に決定され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および/もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および/またはさらなる作用物質(複数可)が、細胞(複数可)を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で1つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質(複数可)より先に行われ得る、他の作用物質(複数可)と同時であり得る、および/または他の作用物質(複数可)の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質(複数可)が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質(複数可)がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、2、3、4つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に(すなわち、約1分未満以内に)薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、1つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および/または投与した後に、実質的に同時、約1分以内から、約24時間、約7日間、約1~約8週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と1つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
最適化されたおよび個別化された治療的処置
改変された細胞の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベルを決定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している、腫瘍細胞または白血病細胞などのレベルが、決定され得る。
改変された細胞の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベルを決定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している、腫瘍細胞または白血病細胞などのレベルが、決定され得る。
例えば、患者が臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞を有するか、または最初の治療の後に固形腫瘍を有するという決定は、改変されたT細胞を投与する必要があり得るという指示を臨床医に提供する。別の例では、改変された細胞で処置した後に、患者が、低下したレベルの腫瘍細胞または減少した腫瘍サイズを有するという決定は、追加の用量の改変された細胞が必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、改変された細胞で処置した後、患者が、疾患もしくは状態の症状を示し続けているかまたは症状の再発に苦しんでいるという決定は、少なくとも1つのさらなる用量の改変された細胞を投与する必要があり得ると臨床医に指示し得る。
用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度(例えば、次の投与のタイミングなど)の両方を含むことが意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投与される改変された細胞の量のことを指す。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類における細胞である。被験体は、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類であり得る。上記被験体は、例えば、ヒト、例えば、感染症に罹患している患者、および/または免疫無防備状態であるかもしくは過剰増殖性疾患に罹患している被験体であり得る。
従って、例えば、ある種の実施形態において、上記方法は、改変された細胞もしくは核酸の投与後の腫瘍サイズおよび/または腫瘍細胞数と比較して、被験体における腫瘍サイズ増大および/または腫瘍細胞数の増大の有無を決定すること、ならびに腫瘍サイズの増大および/または腫瘍細胞数の増大の存在が決定されるという事象において、上記被験体に上記改変された細胞もしくは核酸のさらなる用量を投与することを包含する。上記方法はまた、改変された細胞または核酸の投与後の白血病細胞のレベルと比較して、例えば、被験体における白血病細胞の増大の有無を決定すること、ならびに上記被験体における白血病細胞の増大の存在が決定されるという事象において、上記被験体に上記改変された細胞または核酸のさらなる用量を投与することを包含する。これらの実施形態において、例えば、上記患者は、本明細書で提供される方法に従って、治療用細胞または核酸で最初に処置される。最初の処置後に、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞数、または白血病細胞の数は、その最初の処置前のときと比較して減少し得る。この最初の処置後のある時間では、上記患者は再び試験されるか、または上記患者は、疾患症候に関して継続してモニターされ得る。例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞数、または白血病細胞数が、その最初の処置直後のときと比較して増大していることが決定される場合、上記改変された細胞または核酸は、さらなる用量のために投与され得る。PRAME標的化T細胞レセプターを発現する治療用細胞が患者の中に残っていることに注意しながら、このモニタリングおよび処置スケジュールは、継続され得る。
他の実施形態において、改変された細胞または核酸(ここで上記改変された細胞または核酸は、誘導性カスパーゼ-9ポリペプチドを発現する)の投与後に、改変された細胞またはインビボで改変された細胞の数を減少させる必要がある事象において、多量体リガンドは、上記患者に投与され得る。これらの実施形態において、上記方法は、負の症候または状態(例えば、移植片対宿主病、またはオフターゲット毒性)の有無を決定すること、およびある用量の上記多量体リガンドを投与することを包含する。上記方法は、上記症候または状態をモニターすることおよび上記症候または状態が持続する事象において、上記多量体リガンドのさらなる用量を投与することをさらに包含し得る。PRAME標的化TCRを発現する治療用細胞が上記患者に残っている間は、このモニタリングおよび処置スケジュールは継続され得る。
その後の薬物の用量、例えば、その後の、改変された細胞または核酸の用量、および/またはその後の薬物投与量などを調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で(例えば、物理的媒体または電子媒体において)提供され得る。例えば、腫瘍細胞のサイズ、またはサンプル中の腫瘍細胞の数もしくはレベルが、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量(drug dose)に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状がコンピュータに提供された後(例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後)、コンピュータによって提示され得る(例えば、表示され得る)。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得(例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得)、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持するための指示を生成し得、および/またはその後の薬物用量の量(subsequent drug dose amount)を提供し得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示(instruction)を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る(例えば、その後の用量を被験体に注入し得る)か、または遠隔的に投与し得る(例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る)。
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。活性化された細胞、核酸または発現構築物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカー、または腫瘍サイズもしくは腫瘍抗原発現などの他の疾患症状をモニターすることが存在し得る。
さらなる実施形態において、発現構築物および/または発現ベクターは、細胞を活性化する組成物または物質として利用され得る。「細胞を活性化する」または「細胞の活性を増強する」そのような組成物とは、細胞に関連する1つまたはそれを超える活性を刺激する能力のことを指す。例えば、本方法の発現構築物またはベクターなどの組成物は、細胞上の共刺激分子のアップレギュレーションを刺激し得るか、細胞におけるNF-κBの核移行を誘導し得るか、細胞におけるtoll様レセプター、またはサイトカインもしくはケモカインを含む他の活性を活性化し得る。
発現構築物、発現ベクターおよび/または形質導入された細胞は、例えば、より弱い抗原(例えば、高度に精製された抗原または組換え抗原)の免疫原性を高めること、免疫応答に必要な抗原の量を減少させること、防御免疫をもたらすのに必要な免疫化の頻度を減少させること、免疫応答が低下しているかまたは弱まっている被験体(例えば、新生児、高齢および免疫無防備状態の個体)におけるワクチンの効力を改善すること、および粘膜免疫などの標的組織における免疫を増強することによって、ワクチンの有効性を高め得るかもしくはワクチンの有効性に寄与し得るか、または特定のサイトカインプロファイルを誘発することによって細胞媒介性免疫もしくは体液性免疫を促進し得る。
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対してもたらされる。時折、その免疫応答は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答である。時折、その免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、その細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。
ある種の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、静脈内投与によって上記被験体へと投与される。他の実施形態において、上記細胞は、皮内投与を使用して投与される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体に投与される。ときおり、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入される。ときおり、上記細胞は、インビボで、上記核酸で形質導入される。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮内投与によって上記被験体へと投与され、ときおり上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体へと投与される。抗原は、腫瘍抗原であり得、流入領域リンパ節への細胞の遊走によってCTL免疫応答が誘導され得る。腫瘍抗原は、宿主において免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプチドなどである。腫瘍抗原は、新生物腫瘍細胞に関連する腫瘍関連抗原であり得る。
いくつかの実施形態において、免疫無防備状態の個体または被験体は、免疫応答が低下したまたは弱まった被験体である。そのような個体には、化学療法または免疫系を弱める他の任意の治療を受けた被験体、移植レシピエント、現在、免疫抑制剤を摂取している被験体、高齢化している個体、またはCD4Tヘルパー細胞が減少しているおよび/もしくは損なわれている任意の個体も含まれ得る。本方法は、免疫無防備状態の被験体におけるCD4Tヘルパー細胞の量および/または活性を高めるために利用され得ることが企図される。
抗原
インビトロまたはエキソビボでT細胞活性化をアッセイする場合、標的抗原は、種々の供給源から得られ得るかまたは単離され得る。標的抗原は、本明細書中で使用されるとき、抗原または抗原上の免疫学的エピトープであり、それは、哺乳動物における、免疫認識および疾患を引き起こす作用因子(agent)または疾患状態の最終的な排除またはコントロールにおいてきわめて重大である。その免疫認識は、細胞性および/または体液性であり得る。細胞内の病原体およびがんの場合、免疫認識は、例えば、Tリンパ球応答であり得る。本明細書中の標的抗原は、例えば、PRAMEを含み得る。T細胞レセプターは、単独で、エピトープ、すなわちPRAMEに由来するポリペプチドに結合し得るか、またはペプチド-MHC複合体との関連において、例えば、HLAクラスI分子とのMHC複合体の一部として提示されるペプチド分子に結合し得る。主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子は、TCRおよびTリンパ球上のCD4/CD8共レセプターに結合する;上記MHC分子はまた、TCRと相互作用するポリペプチドフラグメント、またはエピトープを提示する。一般に、MHCクラスI分子は、CD8レセプターと相互作用し、クラスII分子は、CD4レセプターと相互作用する。従って、本出願において、例えば、TCRのCDR3領域、またはTCRがPRAMEまたは標的抗原に特異的に結合する場合などの、PRAMEに特異的に結合する」とは、CDR3領域が単独で、TCRの一部として、異種ポリペプチド配列を含む組換えTCRの一部として、または異種ポリペプチドの一部として、PRAME、PRAMEに由来するエピトープもしくはポリペプチド、またはペプチド-MHC複合体(例えば、HLAクラスI複合体)の一部として(または例えば、HLAクラスI A2.01分子を含むペプチド-MHC複合体の一部として)PRAMEに由来するエピトープもしくはポリペプチドに特異的に結合し得ることと、理解される。αポリペプチドおよびβポリペプチドのCDR3領域は、一緒に、ペプチド-MHC複合体を認識し、これに結合し、他のTCR領域、または他のポリペプチドがこの結合に寄与し得ることは、理解される。従って、本明細書で論じられる、PRAMEに「特異的に結合する」TCR CDR3領域は、PRAMEペプチド-MHC複合体に対して特異的結合親和性を有し、ここで例えば、上記MHCは、HLAクラスI分子、例えば、HLAクラスI A2.01分子である。
インビトロまたはエキソビボでT細胞活性化をアッセイする場合、標的抗原は、種々の供給源から得られ得るかまたは単離され得る。標的抗原は、本明細書中で使用されるとき、抗原または抗原上の免疫学的エピトープであり、それは、哺乳動物における、免疫認識および疾患を引き起こす作用因子(agent)または疾患状態の最終的な排除またはコントロールにおいてきわめて重大である。その免疫認識は、細胞性および/または体液性であり得る。細胞内の病原体およびがんの場合、免疫認識は、例えば、Tリンパ球応答であり得る。本明細書中の標的抗原は、例えば、PRAMEを含み得る。T細胞レセプターは、単独で、エピトープ、すなわちPRAMEに由来するポリペプチドに結合し得るか、またはペプチド-MHC複合体との関連において、例えば、HLAクラスI分子とのMHC複合体の一部として提示されるペプチド分子に結合し得る。主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子は、TCRおよびTリンパ球上のCD4/CD8共レセプターに結合する;上記MHC分子はまた、TCRと相互作用するポリペプチドフラグメント、またはエピトープを提示する。一般に、MHCクラスI分子は、CD8レセプターと相互作用し、クラスII分子は、CD4レセプターと相互作用する。従って、本出願において、例えば、TCRのCDR3領域、またはTCRがPRAMEまたは標的抗原に特異的に結合する場合などの、PRAMEに特異的に結合する」とは、CDR3領域が単独で、TCRの一部として、異種ポリペプチド配列を含む組換えTCRの一部として、または異種ポリペプチドの一部として、PRAME、PRAMEに由来するエピトープもしくはポリペプチド、またはペプチド-MHC複合体(例えば、HLAクラスI複合体)の一部として(または例えば、HLAクラスI A2.01分子を含むペプチド-MHC複合体の一部として)PRAMEに由来するエピトープもしくはポリペプチドに特異的に結合し得ることと、理解される。αポリペプチドおよびβポリペプチドのCDR3領域は、一緒に、ペプチド-MHC複合体を認識し、これに結合し、他のTCR領域、または他のポリペプチドがこの結合に寄与し得ることは、理解される。従って、本明細書で論じられる、PRAMEに「特異的に結合する」TCR CDR3領域は、PRAMEペプチド-MHC複合体に対して特異的結合親和性を有し、ここで例えば、上記MHCは、HLAクラスI分子、例えば、HLAクラスI A2.01分子である。
標的抗原は、例えば、病原性の微生物、例えば、HIV(Korberら編 HIV Molecular Immunology Database,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,N.Mex.1977)、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス(米国特許第5,719,054号)、B型肝炎(米国特許第5,780,036号)、C型肝炎(米国特許第5,709,995号)、EBV、サイトメガロウイルス(CMV)などを含むウイルスに由来し得るかまたはそれらから単離され得る。標的抗原は、病原菌、例えば、クラミジア(米国特許第5,869,608号)、マイコバクテリア、レジオネラ、髄膜炎菌(Meningiococcus)、A群連鎖球菌、サルモネラ、リステリア、Hemophilus influenzae(米国特許第5,955,596号)など)に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原は、例えば、アスペルギルス、侵襲性カンジダ(米国特許第5,645,992)、ノカルジア、ヒストプラスマ(Histoplasmosis)、クリプトスポリジウムなどを含む病原性の酵母に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原は、例えば、Pneumocystis carinii、トリパノソーマ、リーシュマニア(米国特許第5,965,242号)、マラリア原虫(米国特許第5,589,343号)およびToxoplasma gondiiを含むがこれらに限定されない、病原性の原生動物および病原性の寄生生物に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原には、新生物発生前または過形成の状態に関連する抗原が含まれる。標的抗原はまた、がんに関連し得るか、またはがんの原因となり得る。ある特定の実施形態において、標的抗原は、PRAMEである。そのような標的抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原(TAA)または組織特異的抗原、それらのエピトープおよびそれらのエピトープアゴニストであり得る。そのような標的抗原としては、癌胎児抗原(CEA)およびそのエピトープ、例えば、CAP-1、CAP-1-6Dなど(GenBankアクセッション番号M29540)、MART-1(Kawakarniら、J.Exp.Med.180:347-352,1994)、MAGE-1(米国特許第5,750,395号)、MAGE-3、GAGE(米国特許第5,648,226号)、GP-100(Kawakamiら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91:6458-6462,1992)、MUC-1、MUC-2、点変異したrasがん遺伝子、正常なおよび点変異したp53がん遺伝子(Hollsteinら、Nucleic Acids Res.22:3551-3555,1994)、PSMA(Israeliら、Cancer Res.53:227-230,1993)、チロシナーゼ(Kwonら、PNAS 84:7473-7477,1987)TRP-1(gp75)(Cohenら、Nucleic Acid Res.18:2807-2808,1990;米国特許第5,840,839号)、NY-ESO-1(Chenら、PNAS 94:1914-1918,1997)、TRP-2(Jacksonら、EMBOJ,11:527-535,1992)、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2(米国特許第5,550,214号)、BRC-I、BRC-II、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、TAAおよび組織特異的抗原の改変物、TAAのスプライスバリアント、エピトープアゴニストなどが挙げられるがこれらに限定されない。他のTAAは、当該分野で公知の方法、例えば、米国特許第4,514,506号に開示されている方法によって同定され、単離され、クローニングされ得る。標的抗原は、1つまたはそれを超える成長因子および各々のスプライスバリアントも含み得る。
ある抗原は、非がん細胞よりもがん細胞において、頻繁に発現され得る。その抗原は、改変された細胞を、前立腺特異的膜抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原(PSMA)またはそのフラグメントと接触させた結果、生じ得る。
前立腺抗原(PA001)は、PSMA抗原の細胞外の一部からなる組換えタンパク質である。PSMAは、ニューロペプチダーゼ活性および葉酸加水分解酵素活性を有する約100kDa(グリコシル化前は84kDaであり、二量体としては約180kDa)のタイプII膜タンパク質であるが、PSMAの真の機能は、現在のところ不明である。Carter REら、Proc Natl Acad Sci USA.93:749-53,1996;Israeli RSら、Cancer Res.53:227-30,1993;Pinto JTら、Clin Cancer Res.2:1445-51,1996。
上記細胞は、例えば、未分画の腫瘍溶解産物、MHCから溶出したペプチド、腫瘍由来の熱ショックタンパク質(HSP)、腫瘍関連抗原(TAA(ペプチドまたはタンパク質))を未熟なDCにパルスすること、またはバルク腫瘍mRNA、すなわちTAAをコードするmRNAでDCをトランスフェクトすること(Gilboa,E.& Vieweg,J.,Immunol Rev 199,251-63(2004);Gilboa,E,Nat Rev Cancer 4,401-11(2004)に概説)をはじめとした様々な方法によって、腫瘍抗原、例えば、PSA、例えば、PSMAポリペプチドと接触され得る。
DNAゲノムを含む生物の場合、標的抗原またはその目的の免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、そのゲノムDNAから単離される。RNAゲノムを有する生物の場合、所望の遺伝子は、そのゲノムのcDNAコピーから単離され得る。そのゲノムの制限酵素地図が入手可能である場合、目的の遺伝子を含むDNAフラグメントは、日常的な方法による制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断される。所望の遺伝子が以前にクローニングされていた場合、それらの遺伝子は、入手可能なクローンから容易に得られることがある。あるいは、その遺伝子のDNA配列が既知である場合、その遺伝子は、デオキシリボ核酸を合成するための任意の従来の手法によって合成することができる。
目的の抗原をコードする遺伝子は、例えば、その遺伝子を細菌宿主にクローニングすることによって、増幅され得る。この目的のために、様々な原核生物のクローニングベクターが使用され得る。例は、プラスミドpBR322、pUCおよびpEMBLである。
少なくとも1つの標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、標準的な手法によるウイルスを用いた組換えのためにデザインされたプラスミドベクターに挿入するために調製され得る。一般に、クローニングされた遺伝子は、制限酵素消化によって原核生物クローニングベクターから切り取られ得る。ほとんどの場合、切り取られたフラグメントは、その遺伝子のコード領域全体を含む。クローニングされた遺伝子を有するDNAフラグメントは、例えば、ウイルスを用いた組換えのために使用されるDNAベクターの挿入部位と適合するフラグメントの末端を作製するために、必要に応じて改変され得、次いで、精製された後、そのベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断部位(クローニング部位)に挿入される。
細胞、例えば、例えば、樹状細胞の、抗原(例えば、PRAMEエピトープポリペプチドのような)による抗原負荷は、例えば、例えば、細胞、例えば、樹状細胞または前駆体細胞を抗原と接触させることによって、例えば、細胞を抗原とともにインキュベートすることによって、達成され得る。負荷は、例えば、抗原をコードするDNA(裸のものまたはプラスミドベクター内のもの)またはRNAをインキュベートする;または抗原を発現している組換え細菌またはウイルス(例えば、ワクシニア、水痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター)とともにインキュベートすることによっても達成され得る。負荷の前に、抗原は、T細胞を助ける免疫学的パートナー(例えば、キャリア分子)に共有結合的に結合体化されてもよい。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下において、結合体化されていない免疫学的パートナーでパルスされ得る。細胞またはMHC分子由来の抗原は、酸溶出または他の方法によって得ることができる(Zitvogel Lら、J Exp Med 1996.183:87-97を参照のこと)。それらの細胞は、それらの細胞が抗原で負荷される前、負荷された後、または負荷されるのと同時に、本方法に従って、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形質導入され得るかまたはトランスフェクトされ得る。特定の実施形態において、抗原負荷は、形質導入またはトランスフェクションの後に行われる。
さらなる実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞mRNAでトランスフェクトされる。形質導入され、トランスフェクトされた細胞は、動物に投与されて、細胞傷害性Tリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞は、二量体のFK506および二量体のFK506アナログによって制御される。腫瘍細胞mRNAは、例えば、前立腺腫瘍細胞由来のmRNAであり得る。
いくつかの実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞溶解産物でパルスすることによって負荷され得る。パルスされ、形質導入された細胞は、動物に投与されて、細胞傷害性Tリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞は、二量体のFK506および二量体のFK506アナログを用いて制御される。その腫瘍細胞溶解産物は、例えば、前立腺腫瘍細胞溶解産物であり得る。
免疫細胞および細胞傷害性Tリンパ球応答
Tリンパ球は、本明細書中で論じられる発現ベクターを含む細胞との接触によって活性化され得、ここで、その細胞は、抗原でチャレンジされているか、トランスフェクトされているか、パルスされているか、または電気融合されている。
Tリンパ球は、本明細書中で論じられる発現ベクターを含む細胞との接触によって活性化され得、ここで、その細胞は、抗原でチャレンジされているか、トランスフェクトされているか、パルスされているか、または電気融合されている。
T細胞は、その膜上にユニークな抗原結合レセプター(T細胞レセプター)を発現し、そのレセプターは、他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と会合しているか、または他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の状況における抗原のみを認識することができる。T細胞にはいくつかの集団、例えば、ヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞がある。ヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞は、第一に、それぞれ、膜結合糖タンパク質CD4およびCD8のディスプレイによって区別される。ヘルパーT細胞は、B細胞、細胞傷害性T細胞、マクロファージおよび他の免疫系細胞の活性化にとってきわめて重大な様々なリンフォカインを分泌する。対照的に、抗原-MHC複合体を認識するナイーブCD8T細胞は、増殖し、細胞傷害性CD8Tリンパ球(CTL)と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。CTLは、細胞溶解をもたらす物質を産生することによって、抗原をディスプレイしている体内の細胞(例えば、ウイルスに感染した細胞および腫瘍細胞)を排除する。
本明細書中の核酸、ベクター、または組成物で形質導入またはトランスフェクトされた改変された細胞は、例えば、Tヘルパー細胞、T細胞傷害性細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、NK T細胞、およびNK細胞を含む。本明細書で提供されるとおりの改変された細胞は、代表的には、改変された細胞の集まりである。
CTLの活性は、例えば、本明細書中で論じられる方法によって評価され得る。例えば、CTLは、単離されたばかりの末梢血単核球(PBMC)において評価され得るか、PBMCから確立された、フィトヘマグルチニン(phytohaemaglutinin)によって刺激され、IL-2によって増殖した細胞株において評価され得るか(Bernardら、AIDS,12(16):2125-2139,1998)、または予め免疫された被験体から単離され、抗原を含むアデノウイルスベクターに感染したDCで6日間にわたって再刺激されたT細胞によって、標準的な4時間の51Cr放出マイクロ毒性アッセイを用いて評価され得る。1つのタイプのアッセイは、クローン化T細胞を用いる。クローン化T細胞は、再指向化(redirected)細胞傷害性アッセイにおいてパーフォリン依存性の殺滅とFasリガンド依存性の殺滅の両方を媒介する能力について試験された(Simpsonら、Gastroenterology,115(4):849-855,1998)。クローン化細胞傷害性Tリンパ球は、Fas依存性殺滅とパーフォリン依存性殺滅の両方を示した。最近になって、新しい蛍光増幅システムを利用するインビトロデヒドロゲナーゼ放出アッセイが開発された(Page,B.ら、Anticancer Res.1998 Jul-Aug;18(4A):2313-6)。このアプローチは、高感度であり、迅速であり、再現性があり、混合リンパ球反応(MLR)に対して有益に使用され得る。このアプローチは、細胞膜の完全性を用いる、大規模な細胞傷害性試験のためにさらに容易に自動化され得るので、考慮に入れられる。細胞媒介性の細胞傷害性を検出するために開発された別の蛍光測定アッセイでは、使用されるフルオロフォアは、無毒性分子のAlamarBlueである(Nociariら、J.Immunol.Methods,213(2):157-167,1998)。AlamarBlueは、ミトコンドリアの還元が生じ、それによってAlamarBlueの蛍光強度の劇的な増加(すなわち、量子収量の増加)がもたらされるまで、蛍光消光される(すなわち、低量子収量)。このアッセイは、極めて高感度であり、特異的であると報告されており、標準的な51Cr放出アッセイよりも有意に少ない数のエフェクター細胞しか必要としない。
本方法によって誘導され得る他の免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞(NK)が挙げられる。NKは、抗原特異的レセプターを欠き、自然免疫系の一部である、リンパ系細胞である。代表的には、感染した細胞は、通常、細胞表面MHCに結合した外来粒子によって警告されたT細胞によって破壊される。しかしながら、ウイルスに感染した細胞は、抗体によって認識されるウイルスタンパク質を発現することによって感染をシグナル伝達する。これらの細胞は、NKによって殺滅され得る。腫瘍細胞では、その腫瘍細胞が、MHC I分子の発現を失っている場合、それは、NKに感受性であり得る。
患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物(発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化T細胞、形質導入されたT細胞、および負荷されたT細胞)を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物(発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、活性化T細胞、形質導入されたT細胞、および負荷されたT細胞)を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
多量体リガンド、例えば、AP1903などは、例えば、約0.01~1mg/kg被験体体重、約0.05~0.5mg/kg被験体体重、0.1~2mg/kg被験体体重、約0.05~1.0mg/kg被験体体重、約0.1~5mg/kg被験体体重、約0.2~4mg/kg被験体体重、約0.3~3mg/kg被験体体重、約0.3~2mg/kg被験体体重または約0.3~1mg/kg被験体体重、例えば、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9もしくは10mg/kg被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、1用量あたり0.4mg/kg、例えば、5mg/mLの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル1本あたり約0.25ml~約10ml、例えば、約0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5または10ml、例えば、約2mlの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」とは、動物またはヒトに投与されたとき、有害(adverse)反応、アレルギー反応または他の有害(untoward)反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液(ドーベル液)などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される)が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
製剤化されると、溶液は、投与製剤(dosage formulation)に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。例えば、本明細書で論じるPRAME TCRを発現する改変された細胞の治療有効量は、例えば、インビボで、被験体において、またはマウスもしくは他の動物モデルにおいて、本明細書で論じるアッセイによって測定されるとき、被験体においてPRAME発現細胞の量または濃度を減少させる量であり得る。従って、治療有効量は、PRAME発現細胞のパーセントまたは量を、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは95%減少させるために十分な量であり得る;治療有効量はまた、例えば、安定な疾患をもたらすために十分であり得る、すなわち、PRAME発現細胞の数または濃度が有意に増大しない。それらの製剤は、種々の剤形(例えば、注射可能な液剤、薬物放出カプセル剤など)で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、1投与量が、1mlの等張性NaCl溶液に溶解され得、1000mlの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る(例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th Edition,1035-1038および1570-1580頁を参照のこと)。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、FDA Office of Biologicsの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
投与スケジュールは、患者にとって適切であるように決定され得、例えば、PRAME TCR改変された細胞が0週目に投与され、続いて、有効な治療結果を得ることが必要な場合に、あるいは例えば、その後、合計で例えば、2週間、4週間、6週間、8週間、10週間、12週間、14週間、16週間、18週間、20週間、22週間、24週間、26週間、28週間、または30週間、40週間、50週間、60週間、70週間、80週間、90週間、または100週間にわたって、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20回間隔をあけて、さらなる細胞の投与が行われる投薬スケジュールを含み得る。
必要であれば、上記方法は、処置において使用される予定のより多くの細胞を得るために、さらなる白血球搬出をさらに含み得る。
本出願の改変された細胞は、例えば、0.25×106(±20%)細胞/kg、0.5×105(±20%)細胞/kg、0.75×105(±20%)細胞/kg、1×105(±20%)細胞/kg、0.3×106(±20%)細胞/kg、0.625×106(±20%)細胞/kg、1.25×106(±20%)細胞/kg、2.5×106(±20%)細胞/kg、5×106(±20%)細胞/kg、7.5×106(±20%)細胞/kg、1×107(±20%)細胞/kg、2.5×107(±20%)細胞/kg、5×107(±20%)細胞/kg、7.5×107(±20%)細胞/kg、または1×108(±20%)細胞/kgの被験体体重、という細胞の総数の1回の投与または複数回の投与において送達され得る。
カスパーゼ-9スイッチの活性化または誘導が必要とされる場合、AP1903または他の化学的誘導因子の投与は、患者にとって適切であるように決定され得、例えば、最初の用量がCID治療の開始の0週目に投与され、続いて、有効な治療結果を得ることが必要とされる場合に、または例えば、その後、合計で例えば、2週間、4週間、6週間、8週間、10週間、12週間、14週間、16週間、18週間、20週間、22週間、24週間、26週間、28週間、もしくは30週間、40週間、50週間、60週間、70週間、80週間、90週間、もしくは100週間にわたって、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20回間隔をあけて、さらなる化学的誘導因子の投与が行われる投薬スケジュールを含み得る。
(疾患を処置するための方法)
本方法はまた、過剰増殖性疾患によって引き起こされる疾患の処置または防止の方法を包含する。
本方法はまた、過剰増殖性疾患によって引き起こされる疾患の処置または防止の方法を包含する。
薬学的組成物(形質導入されたT細胞、発現ベクター、発現構築物など)を使用して処置され得るかまたは予防され得る新生物発生前または過形成の状態としては、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などのような新生物発生前または過形成の状態が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物を使用して処置され得る、固形腫瘍を含むがんとしては、原発性または転移性メラノーマ、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、ぶどう膜黒色腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、結腸がん、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、NPC、膀胱がん、子宮頸がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提示されるT細胞活性化システムおよび他の治療的細胞活性化システムを使用して処置され得る、固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患としては、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、新生物発生前の病変(例えば、腺腫様過形成および前立腺上皮内新形成)、上皮内癌、口腔毛状白斑症または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
処置方法において、薬学的組成物(発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質導入された細胞、および活性化T細胞、形質導入されたT細胞および負荷されたT細胞)の投与は、「予防的」または「治療的」な目的であり得る。薬学的組成物は、予防的に提供されるとき、任意の症候よりも先に提供される。薬学的組成物の予防的投与は、その後の任意の感染または疾患を予防するためまたは回復させるために役立つ。薬学的組成物は、治療的に提供されるとき、感染または疾患の症候の発生時または発生後に提供される。したがって、本明細書中に提示される組成物は、疾患を引き起こす作用因子もしくは疾患状態への予想される曝露の前または感染もしくは疾患の開始後に提供され得る。したがって、本明細書中で論じられる核酸および細胞を用いる、固形腫瘍(例えば、がんに見出される固形腫瘍、または例えば前立腺がんであるがこれに限定されない)の予防的処置のための方法が、本明細書中に提供される。例えば、被験体において腫瘍を予防的に防止するかまたはそのサイズを減少するための方法が提供され、上記方法は、本明細書で論じられる核酸または細胞を投与し、それによって上記核酸または細胞が、被験体において腫瘍を防止するかまたはそのサイズを減少するために有効な量で投与される工程を包含する。
任意の組織または器官由来の固形腫瘍が、本方法を用いて処置され得るが、例えば、その固形腫瘍としては、血管構造において、例えば、PSA、例えばPSMAを発現している任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺または脳、ならびにまた、例えば、乳房、卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨性腫瘤(boney mass)およびリンパ系に存在する固形腫瘍が挙げられる。処置され得る他の固形腫瘍としては、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が挙げられる。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤と共同して、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量についての規格(specification)は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
薬学的組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり、そのような量は、決定され得る。例えば、免疫系不全を処置するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるために必要な量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。
任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の組成物、被験体のサイズ、および/または上記疾患もしくは状態の重症度などの要因に依存して変動し得る。本明細書で示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を要することなしに経験的に決定され得る。従って、例えば、一実施形態において、上記形質導入されたT細胞または他の細胞は、例えば、免疫応答を誘導するのに有効な量で、または例えば、腫瘍サイズを減少させるかもしくは腫瘍血管構造の量を減少させるのに有効な量で、被験体に投与される。
A.遺伝子に基づく治療
ある種の実施形態において、細胞には、T細胞において組換えTCRポリペプチド(例えば、PRAME特異的組換えTCRポリペプチドなど)を提供し得る発現構築物が提供される。その中で使用される発現ベクターおよび遺伝的エレメントの考察は、この節へと参考として援用される。ある種の例において、発現ベクターは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルス)であり得る。別の例において、上記ベクターは、リソソームによって被包された発現ベクターであり得る。
ある種の実施形態において、細胞には、T細胞において組換えTCRポリペプチド(例えば、PRAME特異的組換えTCRポリペプチドなど)を提供し得る発現構築物が提供される。その中で使用される発現ベクターおよび遺伝的エレメントの考察は、この節へと参考として援用される。ある種の例において、発現ベクターは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルス)であり得る。別の例において、上記ベクターは、リソソームによって被包された発現ベクターであり得る。
遺伝子送達は、インビボとエキソビボの両方の状況において行われ得る。ウイルスベクターの場合、一般に、ウイルスベクターストックが調製され得る。エキソビボおよびインビボにおけるウイルスベクター媒介性の遺伝子送達の例は、本願において提示される。インビボで送達する場合、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×104、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×105、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×106、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×107、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×108、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×109、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×1010、1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×1011または1、2、3、4、5、6、7、8もしくは9×1012個の感染性粒子が患者に送達され得る。類似の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製剤または他の非ウイルス製剤に対して外挿され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、下記で論じられる。多量体リガンド、例えば、AP1903などは、例えば、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9または10mg/kg被験体体重の用量で送達され得る。
B.細胞ベースの治療
企図される別の治療は、例えば、形質導入されたT細胞の投与などの操作されたT細胞の投与である。上記T細胞は、インビトロにおいて操作され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、本明細書中で論じられる。
企図される別の治療は、例えば、形質導入されたT細胞の投与などの操作されたT細胞の投与である。上記T細胞は、インビトロにおいて操作され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、本明細書中で論じられる。
細胞に基づく治療では、操作された細胞は、例えば、標的抗原核酸をコードするレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターで形質導入され得るか;標的抗原核酸(例えば、mRNAまたはDNA)もしくはタンパク質でトランスフェクトされ得るか;細胞溶解産物、タンパク質もしくは核酸でパルスされ得るか;または細胞と電気的に融合され得る。それらの細胞、タンパク質、細胞溶解産物または核酸は、腫瘍細胞などの細胞、または他の病原微生物、例えば、ウイルス、細菌、原生動物などに由来し得る。
C.併用療法
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合がある。
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合がある。
ある特定の実施形態において、抗がん剤が、本方法と組み合わせて使用され得る。「抗がん」剤は、例えば、1つ以上のがん細胞を殺滅すること、1つ以上のがん細胞においてアポトーシスを誘導すること、1つ以上のがん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率もしくは数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の成長を阻害すること、腫瘍もしくは1つ以上のがん細胞への血液の供給を減少させること、1つ以上のがん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防するかもしくは阻害すること、またはがんを有する被験体の寿命を延長することによって、被験体におけるがんに悪影響を与えることができる。抗がん剤としては、例えば、化学療法剤(化学療法)、放射線治療剤(放射線治療)、外科手技(手術)、免疫治療剤(免疫療法)、遺伝的治療剤(遺伝子治療)、ホルモン治療、他の生物学的薬剤(生物療法)および/または代替療法が挙げられる。
さらなる実施形態では、感染症を処置するためおよび/または予防するために、抗生物質が薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。そのような抗生物質としては、アミカシン、アミノグリコシド類(例えば、ゲンタマイシン)、アモキシシリン、アンホテリシンB、アンピシリン、アンチモン類(antimonials)、アトバコン、スチボグルコン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン類、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン)、パラ-アミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、ディフェンシン類(definsins)、プロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン類(例えば、シプロフロキサシン)、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類、チアセタゾン、トリメトプリム(trimethaprim)-スルファメトキサゾール、バイオマイシンまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
より一般的には、そのような薬剤は、がん細胞および/もしくは微生物を殺滅するためまたはがん細胞および/もしくは微生物の増殖を阻害するために有効な発現ベクターとともに、合計量で提供され得る。このプロセスは、細胞(複数可)を薬剤(複数可)および薬学的組成物と同時にまたはある時間内に接触させる工程を含み得、ここで、細胞、組織または生物への薬学的組成物と薬剤との別個の投与によって、所望の治療的な利益がもたらされる。これは、薬学的組成物と1つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞、組織もしくは生物を接触させることによって、または2つ以上の別々の組成物もしくは製剤(ここで、一方の組成物は薬学的組成物を含み、他方は1つ以上の薬剤を含む)と細胞を接触させることによって達成され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および/もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを記述するために本明細書中で使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および/またはさらなる作用物質(複数可)が、細胞(複数可)を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で1つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質(複数可)より先に行われ得る、他の作用物質(複数可)と同時であり得る、および/または他の作用物質(複数可)の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質(複数可)が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質(複数可)がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、2、3、4つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に(すなわち、約1分未満以内に)薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、1つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および/または投与した後に、実質的に同時、約1分以内から、約24時間、約7日間、約1~約8週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と1つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記化学療法剤は、リンパ球枯渇化学療法剤であり得る。他の実施形態において、化学療法剤は、タキソテール(ドセタキセル)または別のタキサン、例えば、カバジタキセル(cabazitaxel)などであり得る。化学療法剤は、細胞および誘導物質による処置の前、処置中または処置の後に投与され得る。例えば、化学療法剤は、第1の用量の活性化された核酸を投与する約1年前、11、10、9、8、7、6、5もしくは4ヶ月前、または18、17、16、15、14、13、12,11、10、9、8、7、6、5、4、3、2週間前もしくは1週間前に、投与され得る。または、例えば、化学療法剤は、第1の用量の細胞または誘導物質を投与した約1週間後、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18週間後、または4、5、6、7、8、9、10もしくは11ヶ月後、または1年後に投与され得る。
化学療法剤の投与は、2つ以上の化学療法剤の投与を含み得る。例えば、シスプラチンは、タキソテールまたは他のタキサン、例えば、カバジタキセルなどに加えて投与され得る。
本明細書で示されるとおりの方法は、限定なしに、活性化された細胞、核酸、またはこれをコードする発現構築物の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、検出可能にかつ反復して、述べられる所望の結果を達成するために、例えば、上記疾患またはその症候を回復するか、減少するか、最小にするか、またはその程度を制限するために、十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターすることが存在してもよい。
改変された細胞の有効量は、個々の患者を考慮して、医師によって決定され得る。考慮されるべき因子としては、例えば、疾患もしくは状態の程度、腫瘍サイズ、感染症の程度、転移、年齢、および体重が挙げられ得る。投与量および投与回数は、医師、または他の臨床医によって、疾患もしくは状態の症候について患者をモニターすることによって、および以前の投与量への応答に関しては、例えば、腫瘍サイズ、または腫瘍抗原のレベルもしくは濃度をモニターすることによって、決定され得る。ある特定の例では、改変された細胞は、104~109個の改変された細胞/kg 体重、105~106個、109~1011個、または1010~1011個の改変された細胞/kg 体重の投与量で、投与され得る。
D.再発性または難治性骨髄性新生物を有する患者におけるPRAME TCR発現T細胞の安全性および実施可能性(feasiblity)を評価する用量漸増研究
キメラカスパーゼ-9コード核酸を含むPRAME TCR発現T細胞(Cell A)は、PRAME抗原の発現と関連する状態または疾患を有する被験体に、例えば、骨髄性新生物を有する被験体に投与され得る。カスパーゼ-9安全スイッチ(iCasp9)は、Cell Aのデザインの中に含まれ、PRAME TCR発現T細胞による処置のレベルをコントロールするか、または処置を停止するための方法を提供する。
キメラカスパーゼ-9コード核酸を含むPRAME TCR発現T細胞(Cell A)は、PRAME抗原の発現と関連する状態または疾患を有する被験体に、例えば、骨髄性新生物を有する被験体に投与され得る。カスパーゼ-9安全スイッチ(iCasp9)は、Cell Aのデザインの中に含まれ、PRAME TCR発現T細胞による処置のレベルをコントロールするか、または処置を停止するための方法を提供する。
フェーズIのオープンラベル非無作為化実施可能性、安全性および用量設定試験。 フェーズI MTDステージの間に、被験体は、0日目にCell Aの1用量を受ける。そのデザインは、3+3用量漸増(escalation)/漸減(de-escalation)スキーマに従って、Cell Aで処置される、1コホートあたり3~6名の被験体からなるCell Aの5つのコホートからなる。フェーズIb拡大ステージ(expansion stage)の間に、被験体は、0日目にCell Aの最大耐量を受ける。制御されない毒性は、CaspaCIDe自殺スイッチを活性化する二量体化剤薬物(dimerizer drug)、リミズシドの使用を誘発し、従って、Cell A PRAME反応性T細胞を排除する。
投薬デザイン
・1/3が出発用量(コホート3)においてDLTを経験する場合;別の3名の被験体が登録され、コホート3において処置される。最初の3名の患者は、各患者の後に3週間追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時に登録され得る。
・1/3が出発用量(コホート3)においてDLTを経験する場合;別の3名の被験体が登録され、コホート3において処置される。最初の3名の患者は、各患者の後に3週間追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート3(出発用量)においてDLTを経験する場合、次にその後の被験体は、コホート4に登録される。≧2/6の被験体がコホート3においてDLTを経験する場合;次にその後の被験体は、コホート2に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にその後の被験体は、コホート5に登録される。≧2/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にコホート3はMTDと示され(declared)、3名の被験体のみがコホート3において処置されている場合、次に追加の3名の被験体がMTDを確認するために登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、コホート5は、MTDと示され、3名の被験体のみがコホート5において処置されている場合、次に追加の3名の被験体がMTDを確認するために登録される。≧2/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、コホート4がMTDと示され、3名の被験体のみがコホート4において処置されている場合、次に追加の3名の被験体がMTDを確認するために登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合、次にコホート2は、MTDと示され;3名の被験体のみがコホート2において処置されている場合、次に追加の3名の被験体がMTDを確認するために登録される。≧2/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合;その後の被験体は、コホート1に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合、次にコホート1は、MTDと示される。≧2/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合;次にこの研究は中断され、そのデータは、治験依頼者および研究者を含む臨床研究チームによって評価される。
Cell A処置のDLTは、以下のとおりに定義される:
最初の21日間で起こる新たな有害事象は、Cell A注入に関連した
・≧グレード5の血液毒性は、Cell Aに関連した;
・≧グレード3の非血液毒性は、過敏性反応および自己免疫反応を含め、Cell A注入に関連した
処置効果は、国際作業グループ判定基準を使用してベースラインと比較して計算する。
最初の21日間で起こる新たな有害事象は、Cell A注入に関連した
・≧グレード5の血液毒性は、Cell Aに関連した;
・≧グレード3の非血液毒性は、過敏性反応および自己免疫反応を含め、Cell A注入に関連した
処置効果は、国際作業グループ判定基準を使用してベースラインと比較して計算する。
投薬研究の組み入れ基準の例
1.急性白血病:急性前骨髄球性白血病(APL)以外の難治性または再発性のAMLを有する患者、
2.モノソーム核型または複雑核型を有する患者は、残存病変が同定される場合、導入化学療法後の14日目の生検の時点で登録され得る。
3.患者は、HLA-A2.01を発現しなければならず、骨髄性芽球(myeloid blast)は、PRAMEを発現しなければならない。
4.絶対リンパ球数(ALC)>300/mm3またはCD3+>150細胞/mm3。
5.再発してしまい、かつ幹細胞移植後100日間を超えている患者は、彼らが全身性免疫抑制療法を要する活動性GVHDを有しなければ、適格である。
6.再発性もしくは難治性のAMLまたはMDS
・AML患者は、代わりの因果律(例えば、骨髄再生)なしに、研究登録時に>5% 骨髄芽球を有しなければならない。
-AMLの改正国際作業グループ判定基準に従う再発性もしくは難治性のAML
・10~19% 芽球を有し、低メチル化療法もしくはIPSS INT-1に応答しないIPSS INT-2または高グレードMDS(RAEB-2)、最初の応答後の再発を有するInt-2もしくは高グレードMDS
7.年齢>18歳。
8.平均余命が少なくとも2ヶ月。
9.ECOGパフォーマンスステータス(performance status): ≦2
10.白血球増加症のコントロールが必要とされる場合にのみ与えられるヒドロキシ尿素を除いて、第1の被験薬投与の前に、以前投与された薬物のうちの以前の細胞傷害性薬剤に関して少なくとも14日間、以前のがん治療を休む。以前の化学療法に由来する持続性の臨床的に重大な毒性は、登録の時点でグレード1を超えていてはならない。化学療法剤は、急速に成長する疾患をコントロールすることが必要な場合、T細胞再注入の前に最大5日間与えてもよい。
11.T細胞アフェレーシス収集のための施設判定基準を満たすことができる
12.腎機能:
1.全患者は、Cockraft-Gaultに従って、計算されたクレアチニンクリアランス>40mL/分を有しなければならない。
2.慣用的な尿検査は、臨床的に重大な異常を示してはならない。
13.適切なLFT:総ビリルビン≦3.0×施設内正常値上限(ULN)とともに直接ビリルビン<1.6×ULN。
14.ALT/ASTおよびアルカリホスファターゼ≦5×ULN
15.許容可能な凝固状態:
-INR/PT≦1.5×正常値上限(ULN)
-PTT<1.5×ULN
1.急性白血病:急性前骨髄球性白血病(APL)以外の難治性または再発性のAMLを有する患者、
2.モノソーム核型または複雑核型を有する患者は、残存病変が同定される場合、導入化学療法後の14日目の生検の時点で登録され得る。
3.患者は、HLA-A2.01を発現しなければならず、骨髄性芽球(myeloid blast)は、PRAMEを発現しなければならない。
4.絶対リンパ球数(ALC)>300/mm3またはCD3+>150細胞/mm3。
5.再発してしまい、かつ幹細胞移植後100日間を超えている患者は、彼らが全身性免疫抑制療法を要する活動性GVHDを有しなければ、適格である。
6.再発性もしくは難治性のAMLまたはMDS
・AML患者は、代わりの因果律(例えば、骨髄再生)なしに、研究登録時に>5% 骨髄芽球を有しなければならない。
-AMLの改正国際作業グループ判定基準に従う再発性もしくは難治性のAML
・10~19% 芽球を有し、低メチル化療法もしくはIPSS INT-1に応答しないIPSS INT-2または高グレードMDS(RAEB-2)、最初の応答後の再発を有するInt-2もしくは高グレードMDS
7.年齢>18歳。
8.平均余命が少なくとも2ヶ月。
9.ECOGパフォーマンスステータス(performance status): ≦2
10.白血球増加症のコントロールが必要とされる場合にのみ与えられるヒドロキシ尿素を除いて、第1の被験薬投与の前に、以前投与された薬物のうちの以前の細胞傷害性薬剤に関して少なくとも14日間、以前のがん治療を休む。以前の化学療法に由来する持続性の臨床的に重大な毒性は、登録の時点でグレード1を超えていてはならない。化学療法剤は、急速に成長する疾患をコントロールすることが必要な場合、T細胞再注入の前に最大5日間与えてもよい。
11.T細胞アフェレーシス収集のための施設判定基準を満たすことができる
12.腎機能:
1.全患者は、Cockraft-Gaultに従って、計算されたクレアチニンクリアランス>40mL/分を有しなければならない。
2.慣用的な尿検査は、臨床的に重大な異常を示してはならない。
13.適切なLFT:総ビリルビン≦3.0×施設内正常値上限(ULN)とともに直接ビリルビン<1.6×ULN。
14.ALT/ASTおよびアルカリホスファターゼ≦5×ULN
15.許容可能な凝固状態:
-INR/PT≦1.5×正常値上限(ULN)
-PTT<1.5×ULN
要旨
再発性または難治性の急性骨髄性白血病は、最適管理の決定への明確な道筋がないことから、患者生存にとって困難な臨床状況である。集中的管理をもってしても、4年間の難治性AMLの全生存率は、一貫して不良である:SWOG-60歳を超える患者に関しては4年間で3%、HOVON-SAKK 60歳未満の患者に関しては5年間で7%の全生存率および60歳を超える患者において2年間で4%。幹細胞移植を含む標準治療とともに第2のサルベージ療法を受けているAMLを有する594名の患者の後ろ向き分析研究から、メジアン生存期間1.5ヶ月とともに1年生存率8%が報告された。標準的アルゴリズムは、進行性疾患を有するMDS患者においてHSCTまたは「新規薬剤での治験」を推奨する(Sekeres, 2014)。明らかに、潜在的に治癒力のある移植の資格を得るために、骨髄性新生物を有する患者がそれらの疾患をコントロール下に置く臨床的必要性は、満たされていない。
再発性または難治性の急性骨髄性白血病は、最適管理の決定への明確な道筋がないことから、患者生存にとって困難な臨床状況である。集中的管理をもってしても、4年間の難治性AMLの全生存率は、一貫して不良である:SWOG-60歳を超える患者に関しては4年間で3%、HOVON-SAKK 60歳未満の患者に関しては5年間で7%の全生存率および60歳を超える患者において2年間で4%。幹細胞移植を含む標準治療とともに第2のサルベージ療法を受けているAMLを有する594名の患者の後ろ向き分析研究から、メジアン生存期間1.5ヶ月とともに1年生存率8%が報告された。標準的アルゴリズムは、進行性疾患を有するMDS患者においてHSCTまたは「新規薬剤での治験」を推奨する(Sekeres, 2014)。明らかに、潜在的に治癒力のある移植の資格を得るために、骨髄性新生物を有する患者がそれらの疾患をコントロール下に置く臨床的必要性は、満たされていない。
PRAMEは、正常組織において検出されるより高い頻度でかつ遙かに高いレベルでAMLにおいて発現される。任意のオフ腫瘍/オンターゲット副作用は、CaspaCIDe自殺スイッチの活性化およびCell A T細胞の排除によって対処されるはずであるので、TCR免疫療法は、再発性または難治性の骨髄性新生物を有する「選択肢のない」患者において評価されるべきである潜在的治療ストラテジーである。
この用量設定プロトコルにおいて、再発性もしくは難治性のAMLまたは進行した低メチル化剤抵抗性MDSを有する患者は、アフェレーシスを介して集められかつ既知のクラスI HLA拘束要素HLA A2.01の状況においてPRAMEを標的とするトランスジェニックT細胞レセプター(TCR)を発現するようにレトロウイルスを使用して改変された自家T細胞を有する。上記細胞は、養子移入された、操作された治療用T細胞生成物の恒常的拡大(homeostatic expansion)を提供するのに適したリンパ球減少を有すると上記患者が同定された後に、用量設定スケジュールに従って再注入され得る。
(原発性難治性AML)
集中的導入化学療法(1サイクルまたは2サイクル)で最初に処置された患者に関して、20~40%が、寛解を得られず、原発性難治性疾患を有すると考えられる(Cheson 2004)。原発性難治性疾患は、複雑核型もしくはモノソーム核型、または続発性処置関連AMLもしくは先立つ血液障害から生じるがAML疾患リスク層別の全てにわたって認められ得るAML、を有する患者においてより一般に同定される。60歳未満のAMLを有する患者のうちのおよそ10%は、彼らの白血病クローン内でモノソーム核型と同定される一方で、この分子サブタイプは、年齢と共にますます同定されており、60歳を超える患者のうちの約20%は、この抵抗性疾患表現型を発現している。集中的導入化学療法を行うと、60歳未満の患者では、寛解率は、およそ14~50%である一方で、60歳を超える患者では、寛解率は、13~34%へと低下する(Breems, 2008; Lowenberg, 2009; Medeiros 2010)。
集中的導入化学療法(1サイクルまたは2サイクル)で最初に処置された患者に関して、20~40%が、寛解を得られず、原発性難治性疾患を有すると考えられる(Cheson 2004)。原発性難治性疾患は、複雑核型もしくはモノソーム核型、または続発性処置関連AMLもしくは先立つ血液障害から生じるがAML疾患リスク層別の全てにわたって認められ得るAML、を有する患者においてより一般に同定される。60歳未満のAMLを有する患者のうちのおよそ10%は、彼らの白血病クローン内でモノソーム核型と同定される一方で、この分子サブタイプは、年齢と共にますます同定されており、60歳を超える患者のうちの約20%は、この抵抗性疾患表現型を発現している。集中的導入化学療法を行うと、60歳未満の患者では、寛解率は、およそ14~50%である一方で、60歳を超える患者では、寛解率は、13~34%へと低下する(Breems, 2008; Lowenberg, 2009; Medeiros 2010)。
再発性AML
再発性AMLを有する患者にとっての転帰は、同様に失望するものである。細胞遺伝学リスク群および生物学的リスク群では変動するものの、再発性AMLを有する患者のうちの30~60%は、サルベージ化学療法で第2の寛解を得ることができ(Mangan, 2011)、MD Anderson Cancer Centerのデータは、幹細胞移植へと進んだそれら患者ではメジアン生存期間11.7ヶ月に対して、化学療法単独に関しては5.6ヶ月のメジアン生存期間を示す(Armistead, 2009)。患者が二次サルベージ療法を要する場合、転帰は、極めて不良である。幹細胞移植を含む標準治療とともに二次サルベージ療法を受けているAMLを有する594名の患者の後ろ向き分析研究から、メジアン生存期間1.5ヶ月とともに1年生存率8%が報告された。完全寛解(CR)を達成する患者の下位群(13%)を分析した場合、メジアンCR持続期間は、7ヶ月であった。多変量解析に際して、多くの予後不良特徴が同定された(年齢>60、初期CR持続期間<12ヶ月、および第2のCR持続期間<6ヶ月が挙げられる)(Giles, 2005)。重要なことには、標準治療は、<12ヶ月で再発する患者に都合良く影響を与えないようである(Kumar, 2011)。
再発性AMLを有する患者にとっての転帰は、同様に失望するものである。細胞遺伝学リスク群および生物学的リスク群では変動するものの、再発性AMLを有する患者のうちの30~60%は、サルベージ化学療法で第2の寛解を得ることができ(Mangan, 2011)、MD Anderson Cancer Centerのデータは、幹細胞移植へと進んだそれら患者ではメジアン生存期間11.7ヶ月に対して、化学療法単独に関しては5.6ヶ月のメジアン生存期間を示す(Armistead, 2009)。患者が二次サルベージ療法を要する場合、転帰は、極めて不良である。幹細胞移植を含む標準治療とともに二次サルベージ療法を受けているAMLを有する594名の患者の後ろ向き分析研究から、メジアン生存期間1.5ヶ月とともに1年生存率8%が報告された。完全寛解(CR)を達成する患者の下位群(13%)を分析した場合、メジアンCR持続期間は、7ヶ月であった。多変量解析に際して、多くの予後不良特徴が同定された(年齢>60、初期CR持続期間<12ヶ月、および第2のCR持続期間<6ヶ月が挙げられる)(Giles, 2005)。重要なことには、標準治療は、<12ヶ月で再発する患者に都合良く影響を与えないようである(Kumar, 2011)。
MDS
低メチル化剤で処置されておりかつ疾患が進行してしまったか、または疾患が応答できなかった骨髄異形成症候群(MDS)を有する患者は、非常に予後不良であり、いかなる治療の利益も支持医療を超えるという証拠はない。標準的アルゴリズムは、この状況では「新規薬剤での治験」を推奨する(Sekeres, 2014)。PRAME発現および過剰発現は、いくつかのグループによってMDSにおいて同定されている。MDSにおけるPRAME発現は、より高いリスク疾患のマーカーとして研究されてきており、より悪い転帰が示されているが、これは、より大きな患者コホートにおいて検証されていない(Andrews, 2014)。
低メチル化剤で処置されておりかつ疾患が進行してしまったか、または疾患が応答できなかった骨髄異形成症候群(MDS)を有する患者は、非常に予後不良であり、いかなる治療の利益も支持医療を超えるという証拠はない。標準的アルゴリズムは、この状況では「新規薬剤での治験」を推奨する(Sekeres, 2014)。PRAME発現および過剰発現は、いくつかのグループによってMDSにおいて同定されている。MDSにおけるPRAME発現は、より高いリスク疾患のマーカーとして研究されてきており、より悪い転帰が示されているが、これは、より大きな患者コホートにおいて検証されていない(Andrews, 2014)。
再発性もしくは難治性の骨髄性新生物における処置選択肢
移植
AML持続もしくは再発を有する患者では、白血病は、化学療法感受性ではないと考えられ、代替の管理ストラテジーが要求される。現在では、これら患者のための普遍的目標は、彼らが虚弱でなくかつ手順の厳しさに耐え得ると想定して、同種異系造血幹細胞移植(HSCT)を追求することである。患者が難治性、再発性のAMLを有し、かつ臨床的寛解を得られない場合、およびその患者が適切なHLAマッチドナー、良好なパフォーマンスステータス(>90% KPS)を有し、循環する芽球がない場合、移植後の長期の全生存率は、20~30%である(Craddock 2011, Duvall 2010)。移植がなければ、意味のある長期の生存はない。
移植
AML持続もしくは再発を有する患者では、白血病は、化学療法感受性ではないと考えられ、代替の管理ストラテジーが要求される。現在では、これら患者のための普遍的目標は、彼らが虚弱でなくかつ手順の厳しさに耐え得ると想定して、同種異系造血幹細胞移植(HSCT)を追求することである。患者が難治性、再発性のAMLを有し、かつ臨床的寛解を得られない場合、およびその患者が適切なHLAマッチドナー、良好なパフォーマンスステータス(>90% KPS)を有し、循環する芽球がない場合、移植後の長期の全生存率は、20~30%である(Craddock 2011, Duvall 2010)。移植がなければ、意味のある長期の生存はない。
急性白血病を有し、同種異系HSCTに適格でない高齢患者は、一般に転帰不良であり、従って、依然としてかなり治療が困難なままである。AMLを有する高齢患者のうちの30~40%が、標準導入でCRを達成するが、この集団におけるメジアン生存期間は、10ヶ月に近い(Oran 2012)。この集団における転帰がより不良であることは、高リスク細胞遺伝学的特徴(cytogenetics)、より高い二次性白血病率、多剤耐性の増大、パフォーマンスステータスの低下、重大な共存症、ならびに寛解後強化(post remission consolidation)の定義のはっきりしない利益および高い処置関連死亡率に帰因している(Oran 2012)。従って、過去10年間にわたる臨床ストラテジーにおける変化は、高齢患者を含めるよう試みて、HSCT適格性を拡大してきた(Hegenbart, 2006)。
Cell A: PRAME TCR免疫療法
治療様式として、養子T細胞療法は、同種異系移植後の再発を管理するにあたって有効なツールであることが示されてきた(Collins, 1997; Kolb, 1995; Porter, 2005)。
治療様式として、養子T細胞療法は、同種異系移植後の再発を管理するにあたって有効なツールであることが示されてきた(Collins, 1997; Kolb, 1995; Porter, 2005)。
免疫抑制の非存在下で養子移入された、刺激されていない(unprimed)ドナー由来のT細胞は、特に化学療法と併用された場合に有効であり得、持続し得る臨床的寛解を取り戻し得る。HLA抗原および特定の腫瘍ペプチドに対して拘束された、エキソビボで拡大されたT細胞は、WT1またはPR1のような標的を使用して、小施設症例集積にて(in small institutional series)利益を有することが示された。近年、キメラ抗原レセプター改変T細胞(レンチウイルスベクターによって自家T細胞生成物へと導入される)の出現は、種々の疾患状態における既知の系統特異的抗原を標的化するにあたって非常に有効であることが示されており、現在B細胞悪性腫瘍において最高の経験がなされている(Porter, 2011; Grupp, 2013)。これらの最も最近の進歩は、それらを標準的な製造に結び付けることができ、かつ共通の抗原を発現する悪性腫瘍を有する種々の患者に一般化することができてきたことから、急速に商業化されてきた。しかし、AMLおよびMDSの治療は、理解しにくい。なぜならCAR-T細胞は、有効であるとしても、長期の血球減少症と関連するようであるからである。
目的の別のペプチド抗原は、いくつかの腫瘍タイプ(AMLおよびMDSが挙げられる)の悪性細胞上で発現される腫瘍抗原であるメラノーマ優先発現抗原(PRAME)に由来する。PRAMEは、レチノイン酸シグナル伝達(混乱させられ得かつ白血病発生において重要であることが公知である経路)の調節において役割を有する。
PRAMEは、がん-精巣抗原ファミリーのメンバーであり、胚組織およびいくつかの悪性腫瘍において高レベルで発現される。それは、メラノーマ組織において最初に同定されたが、その後、複数のがんにおいて検出されている(リンパ系悪性腫瘍および骨髄系悪性腫瘍の両方を含む)。PRAMEは、複数のグループによって、急性骨髄性白血病細胞上で同定されており、白血病関連抗原(LAA)と考えられている。PRAMEは、天然には免疫原性であり、エキソビボで拡大されるT細胞は、HLA拘束要素の状況において、T細胞レセプターを通じてPRAMEペプチドを標的とし得、これが養子細胞療法の利用され得る標的であり得ることを示唆する。
PRAME過剰発現は、研究されてきており、新たに診断されたAML患者のうちのおよそ32%(Goswami, 2014)、van Barenらによる研究では35%(van Baren, 1998)およびQinらによる研究では55.4%(Qin, 2009)に存在する。高発現は、Dingらによる研究(Ding, 2012)ではt(8;21)およびt(15;17)白血病(40.7%)と関連した。Qinらは、74.4%および56.6%発現、ならびにMDSを有する患者において骨髄サンプルでの過剰発現を同定した(Qin 2009)。
HLA拘束PRAME抗原決定基の標的化は、難治性のAMLおよびMDSを有する患者にとっての代替の細胞療法として、養子T細胞療法のために同様に標的とされ得る。
PRAME標的化TCR免疫療法
健康な正常組織に対してオンターゲットおよびオフターゲット両方の反応性に関連した、TCR免疫療法と関連する安全性リスクが存在する。例えば、免疫療法のために生成される高親和性TCRは、MART-1に対して特異的なTCR T細胞の臨床試験において報告されるように、いくらかの患者に関しては処置を要するオンターゲット/オフ腫瘍毒性のリスクを課し得る。従って、がんおよび正常組織における発現が十分に理解されている標的抗原を選択することは、重要である。PRAME抗原は、低レベルでの腎臓上皮細胞における発現により同定されているので、画像化および実験室での検査による腎機能の注意深いモニタリングが行われる。
健康な正常組織に対してオンターゲットおよびオフターゲット両方の反応性に関連した、TCR免疫療法と関連する安全性リスクが存在する。例えば、免疫療法のために生成される高親和性TCRは、MART-1に対して特異的なTCR T細胞の臨床試験において報告されるように、いくらかの患者に関しては処置を要するオンターゲット/オフ腫瘍毒性のリスクを課し得る。従って、がんおよび正常組織における発現が十分に理解されている標的抗原を選択することは、重要である。PRAME抗原は、低レベルでの腎臓上皮細胞における発現により同定されているので、画像化および実験室での検査による腎機能の注意深いモニタリングが行われる。
コントロール不能なオフ腫瘍/オンターゲットT細胞毒性の事象において遺伝子改変されたT細胞を除去するために「安全スイッチ」を含めることは、臨床上の安全性を改善する。Cell A、PRAME抗原を標的とするTCRベースの治療は、AMLの処置のためにCaspaCIDe自殺スイッチ技術を組み込むようにデザインされる。Cell A T細胞生成物において発現されるTCRは、がん細胞表面上のHLA-A2に結合したPRAMEペプチドを認識しかつこれに結合し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす。
開発されてきたTCRは、天然の高親和性を有するが、さらに親和性は増強されていない。さらに、リミズシドの投与に応じたCaspaCIDe安全スイッチの活性化は、iカスパーゼ-9カスケードの活性化およびCell A T細胞のインビボでの排除をもたらす。この安全スイッチは、患者が養子T細胞療法の利益を受けることを可能にしながら、関連する健康上のリスクを軽減する。
CELL Aによって発現されるTCRを発現するT細胞は、PRAME陽性腫瘍細胞株のパネルに対しておよび原発性AML細胞に対して高い反応性を示し、近位尿細管上皮細胞に対する低い反応性および成熟樹状細胞に対する中程度の反応性を除いて正常細胞タイプに対して反応性を示さなかった。TCR αおよびβ鎖の遺伝子を配列決定し、iCasp9自殺遺伝子とともに、患者T細胞を形質導入して、Cell A TCR T細胞免疫療法生成物を生成するために使用されるレトロウイルスベクターに挿入した。
高親和性PRAME特異的T細胞を、同種異系幹細胞移植後にAML患者から単離した(Amirら CCR 2011)。このT細胞は、Kesslerら(Kessler, 2001)によって以前に記載されるPRAME由来ペプチドSLLQHLIGL(SLL)を認識することが見出された。これら高親和性PRAME特異的T細胞クローンのさらなる分析は、PRAME陽性腫瘍細胞株のパネルに対して、ならびに転移性メラノーマ、肉腫、および原発性AML細胞に対して高反応性を示し、近位尿細管上皮細胞に対する低い反応性および成熟樹状細胞に対する中程度の反応性を除いて、正常細胞タイプに対して反応性(reaactivity)を示さなかった。PRAME特異的T細胞クローンHSS1のTCR αおよびβ鎖の遺伝子(AAV54といわれる)を配列決定し、iCasp9自殺遺伝子とともに、T細胞を形質導入して、Cell A TCR T細胞免疫療法生成物を生成するために使用されるレトロウイルスベクターに挿入した。
インビボ前臨床研究
免疫不全マウスモデルは、予測外のオンターゲット/オフ腫瘍毒性と関連する毒性を推測するにあたって歴史的に有用ではなかったが、インビボマウスモデルとCell A PRAME TCRとの使用は、PRAME指向性TCRによる殺滅の効力、およびCaspaCIDeスイッチのリミズシド活性化によるCell A T細胞の機能的排除の両方を示すにあたって有用である。2つのインビボ研究を、ともに、iCasp9およびPRAME αβTCRをコードするγ-レトロウイルスで形質導入したCell A、HLA-A2.01拘束ヒトT細胞を使用して、免疫不全NSG(NOD.CgPrkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; NSG)マウスモデルにおいて行った。このCell A構築物は、誤った対合を最小限にするようにデザインされたシステイン改変TCR HSS1と同じシステイン改変アミノ酸配列を含む(Amir, 2011)。
免疫不全マウスモデルは、予測外のオンターゲット/オフ腫瘍毒性と関連する毒性を推測するにあたって歴史的に有用ではなかったが、インビボマウスモデルとCell A PRAME TCRとの使用は、PRAME指向性TCRによる殺滅の効力、およびCaspaCIDeスイッチのリミズシド活性化によるCell A T細胞の機能的排除の両方を示すにあたって有用である。2つのインビボ研究を、ともに、iCasp9およびPRAME αβTCRをコードするγ-レトロウイルスで形質導入したCell A、HLA-A2.01拘束ヒトT細胞を使用して、免疫不全NSG(NOD.CgPrkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; NSG)マウスモデルにおいて行った。このCell A構築物は、誤った対合を最小限にするようにデザインされたシステイン改変TCR HSS1と同じシステイン改変アミノ酸配列を含む(Amir, 2011)。
PRAME発現腫瘍に対するCell A効力
正常ドナーHLA-A2.01拘束ヒトT細胞を活性化し、pSFG-iC9.2A.PRAME由来Cell Aベクターで形質導入した。Cell A T細胞および非形質導入(NT)コントロールT細胞を、Cell A TCRのβ鎖の可変ドメインセグメントであるVβ1の発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。U266骨髄腫腫瘍を、2×106 U266-EGFP-ルシフェラーゼ(U266-luc)腫瘍細胞/動物の尾静脈注射によって、10匹のNSGマウスにおいて確立した。腫瘍生着後24日目に、5匹のマウスに、1×107 非形質導入(NT)T細胞またはCell Aで形質導入した1×107 T細胞のいずれかを、i.v.注射を介して与えた。腫瘍サイズを測定するために1週間に1回を基本にしてIVIS画像化を行った。
正常ドナーHLA-A2.01拘束ヒトT細胞を活性化し、pSFG-iC9.2A.PRAME由来Cell Aベクターで形質導入した。Cell A T細胞および非形質導入(NT)コントロールT細胞を、Cell A TCRのβ鎖の可変ドメインセグメントであるVβ1の発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。U266骨髄腫腫瘍を、2×106 U266-EGFP-ルシフェラーゼ(U266-luc)腫瘍細胞/動物の尾静脈注射によって、10匹のNSGマウスにおいて確立した。腫瘍生着後24日目に、5匹のマウスに、1×107 非形質導入(NT)T細胞またはCell Aで形質導入した1×107 T細胞のいずれかを、i.v.注射を介して与えた。腫瘍サイズを測定するために1週間に1回を基本にしてIVIS画像化を行った。
Cell Aは、Cell Aの単回のi.v.注射後に、処置後のバックグラウンドレベルへの腫瘍排除を2週間未満で示したのに対して、NT T細胞の注射は、腫瘍成長をコントロールしなかった(図21)。腫瘍負荷の尺度としての平均放射輝度を使用すると、NT T細胞で処置したマウスの腫瘍は、Cell A T細胞で処置したマウスより約800倍多い細胞を有した。これらデータは、Cell Aが、i.v.注射を介して投与した1×107 T細胞の用量で、U266骨髄腫腫瘍に対してインビボで有効であることを示す。
リミズシドに対するインビボでのCell A応答
16匹のマウスに、上記で概説されるように、0日目に1×107 Cell A T細胞のi.v.注射を与えた。48時間後、上記マウスのうちの8匹に、5mg/kgのリミズシドをi.p.注射して、iCasp9の活性化およびCell A T細胞のアポトーシスを評価した;他の8匹のマウスは、未処置のままにした。リミズシド投与の24時間後の脾臓のフローサイトメトリー分析は、非形質導入ヒトT細胞が8匹の各群中の5匹の動物において検出されるが、リミズシドは、処置された動物において形質導入されたCell A T細胞の大部分を効率的に排除したことを示した:ヒトT細胞のうちの42±1.1%は、リミズシド処置動物における7.3±0.2%と比較して、処置されていないマウスにおいてVβ1+であった(p<0.0001)(図22、上段:未処置動物;下段:リミズシド処置マウス)。従って、Cell A内でコードされるiCasp9は、インビボで誘発されてCell A細胞を排除し得る機能的安全スイッチを表す。
16匹のマウスに、上記で概説されるように、0日目に1×107 Cell A T細胞のi.v.注射を与えた。48時間後、上記マウスのうちの8匹に、5mg/kgのリミズシドをi.p.注射して、iCasp9の活性化およびCell A T細胞のアポトーシスを評価した;他の8匹のマウスは、未処置のままにした。リミズシド投与の24時間後の脾臓のフローサイトメトリー分析は、非形質導入ヒトT細胞が8匹の各群中の5匹の動物において検出されるが、リミズシドは、処置された動物において形質導入されたCell A T細胞の大部分を効率的に排除したことを示した:ヒトT細胞のうちの42±1.1%は、リミズシド処置動物における7.3±0.2%と比較して、処置されていないマウスにおいてVβ1+であった(p<0.0001)(図22、上段:未処置動物;下段:リミズシド処置マウス)。従って、Cell A内でコードされるiCasp9は、インビボで誘発されてCell A細胞を排除し得る機能的安全スイッチを表す。
CaspaCIDe(iCasp9)スイッチは、インビボで51日後にCell A
T細胞において感受性のままである
脾臓細胞および骨髄細胞を、NT T細胞またはCell A改変T細胞のいずれかで処置したマウスから、T細胞注射後51日目(腫瘍移植後74日目)に採取し、計数し、CD4+ およびCD8+ T細胞上でのVβ1発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。有効な腫瘍排除を示した動物においてすら、Cell A T細胞は、脾臓および骨髄中に存続した(図3)。非形質導入T細胞を受けたマウスにおけるより、Cell A T細胞を受けたマウスの脾臓において、約600倍多い総CD8+ T細胞、約130倍多いVβ1+CD8+ T細胞が存在した。
T細胞において感受性のままである
脾臓細胞および骨髄細胞を、NT T細胞またはCell A改変T細胞のいずれかで処置したマウスから、T細胞注射後51日目(腫瘍移植後74日目)に採取し、計数し、CD4+ およびCD8+ T細胞上でのVβ1発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。有効な腫瘍排除を示した動物においてすら、Cell A T細胞は、脾臓および骨髄中に存続した(図3)。非形質導入T細胞を受けたマウスにおけるより、Cell A T細胞を受けたマウスの脾臓において、約600倍多い総CD8+ T細胞、約130倍多いVβ1+CD8+ T細胞が存在した。
脾臓細胞および骨髄細胞の画分を、上記で分析されるように、Cell A処置動物から単離し、自殺スイッチの感受性を決定するために、10nM リミズシドありまたはなしで一晩培養した。リミズシドは、脾臓および骨髄の両方から回収されたVβ1+ T細胞の画分を有意に減少させた(p<0.05)。このことから、存続するCell A細胞が機能的iCasp9自殺遺伝子を保持することが確認された(図24)。
前臨床試験の結論
NSGマウスへの尾静脈注射の後、Cell A T細胞は、24時間後程度の早さで脾臓において検出され得、注射後48時間で数の増大が検出され得る。Cell A T細胞は、NSGマウスにおいてi.v.投与した場合に、測定可能な存続およびU266骨髄腫細胞に対して抗腫瘍効力を示す。Cell A改変T細胞は、1×107 T細胞の用量で、投与後2週間未満でU266骨髄腫腫瘍を排除し、50日間より長く、腫瘍成長をコントロールした。Cell A内でコードされるiCasp9は、リミズシド投与によって誘発されて、アポトーシスを誘導することによってCell A細胞を排除し得る安全スイッチとしてインビボで機能する。ルシフェラーゼ生物発光(IVISによって測定される)による検出可能な腫瘍はないにも関わらず、Cell A T細胞は、51日間で脾臓および骨髄の両方から回収され得る;これら細胞は、その後のリミズシド処置に対して感受性のままであった。
NSGマウスへの尾静脈注射の後、Cell A T細胞は、24時間後程度の早さで脾臓において検出され得、注射後48時間で数の増大が検出され得る。Cell A T細胞は、NSGマウスにおいてi.v.投与した場合に、測定可能な存続およびU266骨髄腫細胞に対して抗腫瘍効力を示す。Cell A改変T細胞は、1×107 T細胞の用量で、投与後2週間未満でU266骨髄腫腫瘍を排除し、50日間より長く、腫瘍成長をコントロールした。Cell A内でコードされるiCasp9は、リミズシド投与によって誘発されて、アポトーシスを誘導することによってCell A細胞を排除し得る安全スイッチとしてインビボで機能する。ルシフェラーゼ生物発光(IVISによって測定される)による検出可能な腫瘍はないにも関わらず、Cell A T細胞は、51日間で脾臓および骨髄の両方から回収され得る;これら細胞は、その後のリミズシド処置に対して感受性のままであった。
これらデータは、Cell AがPRAME/HLA-A2抗原を発現する腫瘍細胞に対して有効であること、およびiCasp9スイッチがリミズシド処置後に、形質導入されたT細胞を排除するにあたって有効であることを示唆する。
リミズシド安全性および機能性の臨床評価
ヒトにおけるTCR細胞療法の安全性
一般に、TCR細胞療法に関する1つの安全性の懸念は、腫瘍抗原発現正常組織でのT細胞活性化に起因するオンターゲットオフ腫瘍毒性のリスクである。短期間の毒性は、潜在的には、急性輸液反応、アナフィラキシーおよび心停止、オンターゲット毒性(例えば、腫瘍溶解症候群およびサイトカイン放出症候群(CRS))からなる。
ヒトにおけるTCR細胞療法の安全性
一般に、TCR細胞療法に関する1つの安全性の懸念は、腫瘍抗原発現正常組織でのT細胞活性化に起因するオンターゲットオフ腫瘍毒性のリスクである。短期間の毒性は、潜在的には、急性輸液反応、アナフィラキシーおよび心停止、オンターゲット毒性(例えば、腫瘍溶解症候群およびサイトカイン放出症候群(CRS))からなる。
リミズシド/AP1903二量体化剤薬物
AP1903は、細胞内部の操作されたタンパク質のクラスター化を誘導することによって作用する活性化薬物、または二量体化剤薬物といわれる脂質透過性化合物の新たなクラスのメンバーである。カスパーゼ9自殺遺伝子のAP1903誘導性活性化は、ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)に由来する薬物結合ドメインに融合されたキメラタンパク質(iCasp9)を発現することによって達成される。このキメラタンパク質は、AP1903(これは、FKBPドメインを架橋し、iCasp9シグナル伝達を開始する)の投与まで細胞内部で静止している。このシグナル伝達は、遺伝子改変された細胞のアポトーシスを誘導する。AP1903は、25% Solutol HS 15(非イオン性可溶化剤)中5mg/mlの濃度で製剤化される。
AP1903は、細胞内部の操作されたタンパク質のクラスター化を誘導することによって作用する活性化薬物、または二量体化剤薬物といわれる脂質透過性化合物の新たなクラスのメンバーである。カスパーゼ9自殺遺伝子のAP1903誘導性活性化は、ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)に由来する薬物結合ドメインに融合されたキメラタンパク質(iCasp9)を発現することによって達成される。このキメラタンパク質は、AP1903(これは、FKBPドメインを架橋し、iCasp9シグナル伝達を開始する)の投与まで細胞内部で静止している。このシグナル伝達は、遺伝子改変された細胞のアポトーシスを誘導する。AP1903は、25% Solutol HS 15(非イオン性可溶化剤)中5mg/mlの濃度で製剤化される。
ヒト志願者におけるリミズシド
フェーズIのプラセボコントロール単盲検の静脈内単一漸増用量研究を、成人の健康な被験体において行って、リミズシド/(AP1903)(Iuliucci, 2001)の安全性、耐容性および薬物動態を決定した。28名の被験体を、5処置群に登録し、これら群においてAP1903の5種の用量レベル(すなわち、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kgおよび1.0mg/kg)を調査した。各群内で、4名の被験体にAP1903を与え、1名の被験体にプラセボを与え、1名の被験体にノーマルセーラインを与えた。唯一の例外は、0.5mg/kg処置群においてであり、3名の被験体にAP1903を与え、1名の被験体にノーマルセーラインを与えたことであった。各処置群内で、AP1903、プラセボ、およびノーマルセーラインの用量体積は、体重ベースで同等であった。全ての処置を、2時間の期間をかけて、静脈内注入として投与した。臨床アセスメントは、投与前ならびに注入開始後10分、20分、40分、1時間、1時間20分、1時間40分、2時間、4時間、8時間、12時間および24時間で、ならびに7日目に再度測定した生命徴候(仰臥位での血圧、仰臥位での脈拍数および口腔体温)を含んだ。12誘導安静時ECGを、投与前、注入開始後3時間および24時間、ならびに7日目に行った。連続心臓モニタリングを、注入開始前のおよそ1時間から行って、注入開始後3時間まで継続した。注射用AP1903は、全ての用量レベルで安全かつ十分に寛容されることが示され、都合の良い薬物動態プロフィールを示した。
フェーズIのプラセボコントロール単盲検の静脈内単一漸増用量研究を、成人の健康な被験体において行って、リミズシド/(AP1903)(Iuliucci, 2001)の安全性、耐容性および薬物動態を決定した。28名の被験体を、5処置群に登録し、これら群においてAP1903の5種の用量レベル(すなわち、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kgおよび1.0mg/kg)を調査した。各群内で、4名の被験体にAP1903を与え、1名の被験体にプラセボを与え、1名の被験体にノーマルセーラインを与えた。唯一の例外は、0.5mg/kg処置群においてであり、3名の被験体にAP1903を与え、1名の被験体にノーマルセーラインを与えたことであった。各処置群内で、AP1903、プラセボ、およびノーマルセーラインの用量体積は、体重ベースで同等であった。全ての処置を、2時間の期間をかけて、静脈内注入として投与した。臨床アセスメントは、投与前ならびに注入開始後10分、20分、40分、1時間、1時間20分、1時間40分、2時間、4時間、8時間、12時間および24時間で、ならびに7日目に再度測定した生命徴候(仰臥位での血圧、仰臥位での脈拍数および口腔体温)を含んだ。12誘導安静時ECGを、投与前、注入開始後3時間および24時間、ならびに7日目に行った。連続心臓モニタリングを、注入開始前のおよそ1時間から行って、注入開始後3時間まで継続した。注射用AP1903は、全ての用量レベルで安全かつ十分に寛容されることが示され、都合の良い薬物動態プロフィールを示した。
AP1903(リミズシド)の臨床的機能性
CASPALLO治験の10名の被験体を、iカスパーゼ-9自殺スイッチを含むT細胞で処置したところ、4名の被験体に急性GVHDが発生した。これは、AP1903の投与後に、アポトーシスを介する同種反応性T細胞の選択的排除を伴って、急速に抑止された。AP1903は、2時間の静脈内注入の終了から30分で誘導性カスパーゼ-9発現T細胞のうちの≧90%の排除をもたらした。AP1903注入と関連した有害事象は報告されなかった。
CASPALLO治験の10名の被験体を、iカスパーゼ-9自殺スイッチを含むT細胞で処置したところ、4名の被験体に急性GVHDが発生した。これは、AP1903の投与後に、アポトーシスを介する同種反応性T細胞の選択的排除を伴って、急速に抑止された。AP1903は、2時間の静脈内注入の終了から30分で誘導性カスパーゼ-9発現T細胞のうちの≧90%の排除をもたらした。AP1903注入と関連した有害事象は報告されなかった。
DOTTI治験は、CASPALLO治験に対する追跡研究である。3名の被験体は、グレードIおよびIIの急性GVHDをその後発生させたので、二量体化薬物(dimerizing drug)AP1903の単一用量で処置した。4名の被験体は、移植後476日というメジアンで生存しており(範囲は、278~674日)、そして彼らは、AP1903を受けていた。AP1903と関連した即時型または遅延型の有害事象は存在しなかった。
研究デザイン
これは、拘束要素HLA A2.01の状況においてPRAMEペプチドと反応するa/b T細胞レセプターからなるレトロウイルス構築物で遺伝子改変した自家T細胞の安全性および有効性を決定する、シングルアーム用量漸増/漸減、単一US施設のフェーズ1研究である。漸増漸減デザインの使用は、再発性もしくは難治性のAMLまたはMDSを有する患者にとって有効な治療が存在しないこと、ならびに治療量以下の投与で開始することが、急速な白血病進行および何らかの有効性シグナルが存在するかを決定することができないことの原因となる可能性があることを認識するによって支持される。この研究は、およそ36名までの患者(patients patients)を登録し、これにより、24名の患者が処置されかつ有効性について評価されることを可能にする。適格性の評価後に、この研究に適格である患者を登録し、T細胞アフェレーシスを遂行する予定を立てる。ベストプラクティス労力(Best practice effort)は、患者の再発性および難治性の白血病またはMDSを処置するために使用されるが、一般に、製造されたT細胞注入の時点の被験薬の活性化(activation of study treatment)前にリンパ球枯渇という課題も順当に達成する、標準的AMLまたはMDSサルベージレジメン内で組み込まれたプリンアナログを含む。
これは、拘束要素HLA A2.01の状況においてPRAMEペプチドと反応するa/b T細胞レセプターからなるレトロウイルス構築物で遺伝子改変した自家T細胞の安全性および有効性を決定する、シングルアーム用量漸増/漸減、単一US施設のフェーズ1研究である。漸増漸減デザインの使用は、再発性もしくは難治性のAMLまたはMDSを有する患者にとって有効な治療が存在しないこと、ならびに治療量以下の投与で開始することが、急速な白血病進行および何らかの有効性シグナルが存在するかを決定することができないことの原因となる可能性があることを認識するによって支持される。この研究は、およそ36名までの患者(patients patients)を登録し、これにより、24名の患者が処置されかつ有効性について評価されることを可能にする。適格性の評価後に、この研究に適格である患者を登録し、T細胞アフェレーシスを遂行する予定を立てる。ベストプラクティス労力(Best practice effort)は、患者の再発性および難治性の白血病またはMDSを処置するために使用されるが、一般に、製造されたT細胞注入の時点の被験薬の活性化(activation of study treatment)前にリンパ球枯渇という課題も順当に達成する、標準的AMLまたはMDSサルベージレジメン内で組み込まれたプリンアナログを含む。
安全性は、治験の間全体を通してモニターされる。組み込みベクター(例えば、レトロウイルス構築物)を利用する先端治療生成物のための遺伝子治療生成物に関する確立されたガイドライン(FDA)に基づいて、Cell Aで処置される全ての患者は、彼らが処置薬剤に応答したか否かに関わらず、合計で15年間まで特異的毒性についてモニターされなければならない。全ての患者は、この治験において5年間にわたってモニターされ、続いて、別個の長期安全性追跡プロトコルにおいて1年に1回の安全性評価が行われる。その目的は、細胞療法と関連する急性および遅延型の有害事象のリスクを評価すること、ならびにRCR(複製能のあるレトロウイルス)をモニターすることである。
処置薬剤の有効性は、分子的、細胞遺伝学的および血液学的な完全奏効および部分奏効の評価を含め、疾患コントロールの二次エンドポイントを通じて評価され得る。臨床応答の尺度は別の方法では適格でなかった、HSCTへと進んだ患者のパーセントを決定することである。
投薬デザイン:
・1/3が出発用量(コホート3)においてDLTを経験する場合;別の3名の被験体が登録され、コホート3において処置される。最初の3名の患者は、各患者の後に3週間追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート3(出発用量)においてDLTを経験する場合、次にその後の被験体は、コホート4に登録される。≧2/6の被験体がコホート3においてDLTを経験する場合;次にその後の被験体は、コホート2に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にその後の被験体は、コホート5に登録される。≧2/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にコホート3は、MTDと示され得、そしてわずか3名の被験体がコホート3において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、コホート5は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート5において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。≧2/6の被験体がコホート5にいてDLTを経験する場合、コホート4は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート4において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合、コホート2はMTDと示され得;わずか3名の被験体がコホート2において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。≧2/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合;次にその後の被験体は、コホート1に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合、コホート1は、MTDと示され得る。≧2/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合;その研究は中断され、そのデータは、治験依頼者および研究者を含め、臨床研究チームによって評価される。
・1/3が出発用量(コホート3)においてDLTを経験する場合;別の3名の被験体が登録され、コホート3において処置される。最初の3名の患者は、各患者の後に3週間追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート3(出発用量)においてDLTを経験する場合、次にその後の被験体は、コホート4に登録される。≧2/6の被験体がコホート3においてDLTを経験する場合;次にその後の被験体は、コホート2に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にその後の被験体は、コホート5に登録される。≧2/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にコホート3は、MTDと示され得、そしてわずか3名の被験体がコホート3において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、コホート5は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート5において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。≧2/6の被験体がコホート5にいてDLTを経験する場合、コホート4は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート4において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合、コホート2はMTDと示され得;わずか3名の被験体がコホート2において処置されている場合、MTDを確認するために、さらに3名の被験体が登録される。≧2/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合;次にその後の被験体は、コホート1に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合、コホート1は、MTDと示され得る。≧2/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合;その研究は中断され、そのデータは、治験依頼者および研究者を含め、臨床研究チームによって評価される。
投薬の安全性は、臨床研究チームによって評価され得、このチームは、治験依頼者(医学責任者)、研究医療モニター(Study Medical Monitor)、および研究者から構成される。この臨床研究チームは、各コホートから明らかになる安全性データを精査して、用量漸増または漸減が想到するかを決定する。あるいは、非耐用量レベルと先の耐用量レベルとの間の中間の用量レベルが調査され得、6名の被験体のうちの<2名がその用量においてDLTを経験する場合に、MTDと示され得る。
所定の患者のための目標用量を満たすには不適切な細胞が存在する場合、その被験体は、利用可能な細胞を与えられ得るが、MTDの決定のために評価可能とは見做されなくてもよい。
研究中の集団において頻繁な共存症および併用薬物療法(concurrent medication)に起因して、AEの原因が特定の薬物にあるとすることは、困難である。従って、Cell A T細胞に関連しないと明確には決定できない全てのAEは、DLTの決定に関連していると見做され得、臨床研究チームによって精査され得る。
動員されていないT細胞白血球搬出の前に、被験体の血球数および白血球百分率数(blood count and differential)が収集されかつ記録され得る。確立された規制ガイドラインに従う感染症モニタリングが行われ得る。被験体は、白血球搬出を開始する前に、CBCおよび血小板に関して施設内基準を満たさなければならない。白血球画分を、標準化された連続フロー遠心分離を使用して集め得る。この被験体は、アフェレーシスの間にモニターされ得る。およそ3~4血液容積までの標準アフェレーシス手順は、白血病患者に関する予防措置を含め、施設内標準手順に従って処理され得る。処理される容積および白血球搬出の継続時間は、文書化されかつ記録され得る。5×109未満の単核細胞が集められる場合、医療モニターに助言を求めなければならない。
PRAME-TCR細胞(Cell A)製造プロセス
Cell A生成物の出発材料は、集中GMP製造施設へと一晩で新鮮なまま輸送される患者由来PBMC収集物であるか、または上記収集物からその単核細胞が以前に選択されかつ凍結保存されている患者由来PBMC収集物である。Ficollで分離された(ficolled)収集物は、複数のアリコートに分けて凍結保存され、それらは、集中GMP製造施設へと輸送される。受け取った際およびその出発物質の受容性の確認の後、アリコートを製造クリーン・ルームに移し、急速解凍する。その細胞を洗浄し、T細胞が形質導入のための目標細胞数に達するまで増殖するように、培養培地に入れる。その拡大したT細胞は、Cell Aレトロウイルス構築物で形質導入される。上記細胞を、凍結保存培地(CryoStor CS10)を用いて製剤化し、凍結保存する。最終Cell A生成物は、発売試験が完了するまで、液体窒素(LN2)の気相中で凍結保存して貯蔵される。上記Cell A生成物を、検証された凍結輸送容器(cryoshipper)中のLN2の気相中で輸送し得る。処置用のCell Aを製造および発売するためにおよそ2~4週間かかると予測される。
Cell A生成物の出発材料は、集中GMP製造施設へと一晩で新鮮なまま輸送される患者由来PBMC収集物であるか、または上記収集物からその単核細胞が以前に選択されかつ凍結保存されている患者由来PBMC収集物である。Ficollで分離された(ficolled)収集物は、複数のアリコートに分けて凍結保存され、それらは、集中GMP製造施設へと輸送される。受け取った際およびその出発物質の受容性の確認の後、アリコートを製造クリーン・ルームに移し、急速解凍する。その細胞を洗浄し、T細胞が形質導入のための目標細胞数に達するまで増殖するように、培養培地に入れる。その拡大したT細胞は、Cell Aレトロウイルス構築物で形質導入される。上記細胞を、凍結保存培地(CryoStor CS10)を用いて製剤化し、凍結保存する。最終Cell A生成物は、発売試験が完了するまで、液体窒素(LN2)の気相中で凍結保存して貯蔵される。上記Cell A生成物を、検証された凍結輸送容器(cryoshipper)中のLN2の気相中で輸送し得る。処置用のCell Aを製造および発売するためにおよそ2~4週間かかると予測される。
パッケージングおよび製剤化: Cell A T細胞を、10~15mL 凍結培地(Cryostor, BioLife)中に凍結保存し、液体窒素の気相中で、凍結貯蔵バッグの中に入れて凍結して貯蔵する。
輸送および貯蔵: 凍結保存したCell Aは、検証された輸送容器(shipping container)中で臨床場所までLN2の気相中で輸送され得る。受け取る細胞処理実験室は、注入するときまでLN2の気相中にその生成物を貯蔵する。その時点で、上記生成物は、レシピエントへの注入のための指示に従って、37℃±2℃で解凍され得る。輸送の日付に依存して、輸送のタイミングは1日より長くてもよい。
Cell A T細胞注入の前の化学療法およびリンパ球枯渇
Cell A T細胞注入前の化学療法
改変されたT細胞での処置の前に、患者は、彼らの疾患生物学および共存症の臨床家の評価に基づいて、および一時的な疾患コントロールを提供するために、以下のレジメンのうちの1つとともに、つなぎ化学療法および同時にリンパ球枯渇化学療法を受ける。
-FLAG-Ida(フルダラビン、シタラビン、GCSF、イダルビシン)
-FLAG(フルダラビン、シタラビン、GCSF)
-単一薬剤 クラドリビン
-単一薬剤 シクロホスファミド(以下のとおり)。
Cell A T細胞注入前の化学療法
改変されたT細胞での処置の前に、患者は、彼らの疾患生物学および共存症の臨床家の評価に基づいて、および一時的な疾患コントロールを提供するために、以下のレジメンのうちの1つとともに、つなぎ化学療法および同時にリンパ球枯渇化学療法を受ける。
-FLAG-Ida(フルダラビン、シタラビン、GCSF、イダルビシン)
-FLAG(フルダラビン、シタラビン、GCSF)
-単一薬剤 クラドリビン
-単一薬剤 シクロホスファミド(以下のとおり)。
Cell A T細胞注入前のリンパ球枯渇
被験体の絶対リンパ球数が1000/μl未満である場合、Cell A注入前にリンパ球枯渇は必要ない。被験体のALCが1000細胞/μlを上回る場合、3日間にわたるベンダムスチン 90mg/m2またはフルダラビン(fludaribine) 90mg/m2のいずれかとシクロホスファミド 750mg/M2でのリンパ球枯渇化学療法が、注入前の3日間までに(no later than 3 days)投与され得る。
被験体の絶対リンパ球数が1000/μl未満である場合、Cell A注入前にリンパ球枯渇は必要ない。被験体のALCが1000細胞/μlを上回る場合、3日間にわたるベンダムスチン 90mg/m2またはフルダラビン(fludaribine) 90mg/m2のいずれかとシクロホスファミド 750mg/M2でのリンパ球枯渇化学療法が、注入前の3日間までに(no later than 3 days)投与され得る。
さらなるリンパ球枯渇薬剤(例えば、フルダラビン)は、研究者の裁量でその後の被験体についても考慮され得る。
Cell A T細胞注入
Cell A細胞は、37℃のウォーターバスの中で解凍され得、研究手順マニュアルに指示されるように、50mL Plasmalyte(最初に35mL、次いで15mLでバッグを「すすぐ」)で希釈され得、15~30分間かけて投与され得る。
Cell A細胞は、37℃のウォーターバスの中で解凍され得、研究手順マニュアルに指示されるように、50mL Plasmalyte(最初に35mL、次いで15mLでバッグを「すすぐ」)で希釈され得、15~30分間かけて投与され得る。
被験体を、0日目にCell Aの投与のために病院に一晩入院させ得る。最大予測入院日数は、予測外のAEが起こらなければ、一晩である。上記被験体は、T細胞生成物に関する施設内標準に従ってアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンで予備処置され得る。
施設内標準に従って、モニタリングが行われ得る。注入の前、および注入の4時間後に、生体マーカーモニタリングのために、血液サンプルを収集し得る。生体マーカーモニタリングは、まとめられて評価され得る。このAEモニタリングは、最低でも注入後4時間、継続する。
腫瘍評価および生体マーカー
腫瘍評価
AML(Cheson, 2003)およびMDS(Cheson, 2006)における改正国際作業グループ(IWG)応答基準に基づいて処置に対する腫瘍応答を決定する血液および骨髄の連続サンプリング。
骨髄生検を、以下の時点で完了し得る:
-登録前の7日以内
-T細胞注入前の7日以内
-T細胞注入後4日目
-T細胞注入後28日(±1日)
-臨床的に示されるとおり。
腫瘍評価
AML(Cheson, 2003)およびMDS(Cheson, 2006)における改正国際作業グループ(IWG)応答基準に基づいて処置に対する腫瘍応答を決定する血液および骨髄の連続サンプリング。
骨髄生検を、以下の時点で完了し得る:
-登録前の7日以内
-T細胞注入前の7日以内
-T細胞注入後4日目
-T細胞注入後28日(±1日)
-臨床的に示されるとおり。
生体マーカー 連続の血液サンプリングが収集され得、選択的サイトカインおよび生体マーカーのさらなる分析のために凍結保存される。
リミズシド(AP1903)二量体化剤薬物パッケージング、ラベリングおよび貯蔵
パッケージングおよび製剤化: 注入用AP1903を、10mLまたは2mLいずれかのタイプ1 透明ガラス製セラムバイアル中にパッケージする。各バイアルの内容物は、AP1903濃度5mg/mLおよびpH5.0~7.5の注射溶液として滅菌のエンドトキシン非含有25% Solutol HS 15に溶解されたAP1903薬物物質の表示された内容物(それぞれ、40mgまたは10mg)から構成される。各バイアルは、テフロン(登録商標)コーティングしたセラムストッパーおよびフリップオフシールで栓をされる。
パッケージングおよび製剤化: 注入用AP1903を、10mLまたは2mLいずれかのタイプ1 透明ガラス製セラムバイアル中にパッケージする。各バイアルの内容物は、AP1903濃度5mg/mLおよびpH5.0~7.5の注射溶液として滅菌のエンドトキシン非含有25% Solutol HS 15に溶解されたAP1903薬物物質の表示された内容物(それぞれ、40mgまたは10mg)から構成される。各バイアルは、テフロン(登録商標)コーティングしたセラムストッパーおよびフリップオフシールで栓をされる。
表示: 注射用AP1903の一次生成物ラベル(バイアルに直接つけられる)は、以下の情報を含み得る:製品名、注射用AP1903;製造業者のロット番号;製品濃度、5mg/mL;バイアル中で利用可能な溶液の体積;バイアルの総AP1903含有量(40mgまたは10mg);提示「IV投与に関しては、保存剤は含まない」およびIND表記「警告:連邦法によって研究用途に限定された新薬」。上記生成物は、各監督官庁の要求に従って表示され得る。
貯蔵: 注射用AP1903バイアルは、アクセスが限定され、適格な冷蔵庫の中で5℃±3℃(41°F±5°F)で貯蔵されなければならず、遮光して貯蔵され得る。
処置のための調製: 使用に関して、AP1903は、投与前に希釈され得る。AP1903は、DEHP非含有食塩水バッグおよび溶液セットを使用して2時間かけて投与される容積を有し、ノーマルセーライン中に希釈した0.4mg/kgの目標用量で、IV注入を介して投与される。詳細は、薬学マニュアルの中に含まれる。
リミズシドでのPRAME-TCRの自殺誘導
0.4mg/kgのリミズシド(AP1903)の用量を注入し得る。アセトアミノフェン、H1およびH2ブロッカーならびに任意の他の標準的施設内予備処置/予防措置は、潜在的なアナフィラキシー様の輸液反応(SolutolのようなKolliphor製品で潜在的に認められる)の予防措置として、リミズシドの注入の前に必要とされる。リミズシドの注入は、非DEHP食塩水バッグを使用して行われるものとし、詳細は、リミズシド薬学マニュアルの中に見出され得る。血液サンプルは、注入前に、および注入後4時間で生体マーカーモニタリングのために集められ得る。生体マーカーモニタリングは、まとめられて評価され得る。このAEモニタリングを、注入後最低4時間継続する。予測外のAEが起こらなければ、最大予測入院日数は一晩である。
0.4mg/kgのリミズシド(AP1903)の用量を注入し得る。アセトアミノフェン、H1およびH2ブロッカーならびに任意の他の標準的施設内予備処置/予防措置は、潜在的なアナフィラキシー様の輸液反応(SolutolのようなKolliphor製品で潜在的に認められる)の予防措置として、リミズシドの注入の前に必要とされる。リミズシドの注入は、非DEHP食塩水バッグを使用して行われるものとし、詳細は、リミズシド薬学マニュアルの中に見出され得る。血液サンプルは、注入前に、および注入後4時間で生体マーカーモニタリングのために集められ得る。生体マーカーモニタリングは、まとめられて評価され得る。このAEモニタリングを、注入後最低4時間継続する。予測外のAEが起こらなければ、最大予測入院日数は一晩である。
オンターゲット-オフ腫瘍
Cell A PRAME-TCR T細胞が非腫瘍標的と反応する状況では、患者は、支持医療、および研究者によって決定されるように、リミズシドの投与を受けるべきである。
Cell A PRAME-TCR T細胞が非腫瘍標的と反応する状況では、患者は、支持医療、および研究者によって決定されるように、リミズシドの投与を受けるべきである。
他の治験薬
他の治験薬または治験生物製剤は、患者の疾患状態が悪化していないかまたは非応答性なければ、Cell A後3ヶ月間投与されなくてもよい。被験体は、HSCTへと進み得る(may proceed to HSCT)。
他の治験薬または治験生物製剤は、患者の疾患状態が悪化していないかまたは非応答性なければ、Cell A後3ヶ月間投与されなくてもよい。被験体は、HSCTへと進み得る(may proceed to HSCT)。
臨床評価
臨床アセスメント
・被験体の臨床アセスメントが行われ得る。
・腎臓の状態は、連続クレアチニン検査の評価、および臨床的に示される場合にはさらなるアセスメントによって評定され得る。
・AML(Cheson, 2003)およびMDS(Cheson, 2006)における改正国際作業グループ(IWG)応答基準に基づく処置に対する応答を決定するための連続血液サンプリングおよび骨髄サンプリング。
・骨髄生検を、以下の時点で完了し得る:
・-登録前の7日間以内
・-T細胞注入前の7日間以内
・-T細胞注入後4日目
・-T細胞注入後28日(±1日)
・-臨床的に示される場合
・微小残存病変に関する検査を、4日目に2つの方法を使用して開始して、各骨髄吸引物を用いて行い得る。なぜなら患者は、1つの方法論のみによって検出可能であるMRDを有し得るからである。
○以前に同定された分子異常についての分子検査(Klco, 2015)
○8色フローサイトメトリーを使用するフローサイトメトリー(Grimwade, 2014)
臨床アセスメント
・被験体の臨床アセスメントが行われ得る。
・腎臓の状態は、連続クレアチニン検査の評価、および臨床的に示される場合にはさらなるアセスメントによって評定され得る。
・AML(Cheson, 2003)およびMDS(Cheson, 2006)における改正国際作業グループ(IWG)応答基準に基づく処置に対する応答を決定するための連続血液サンプリングおよび骨髄サンプリング。
・骨髄生検を、以下の時点で完了し得る:
・-登録前の7日間以内
・-T細胞注入前の7日間以内
・-T細胞注入後4日目
・-T細胞注入後28日(±1日)
・-臨床的に示される場合
・微小残存病変に関する検査を、4日目に2つの方法を使用して開始して、各骨髄吸引物を用いて行い得る。なぜなら患者は、1つの方法論のみによって検出可能であるMRDを有し得るからである。
○以前に同定された分子異常についての分子検査(Klco, 2015)
○8色フローサイトメトリーを使用するフローサイトメトリー(Grimwade, 2014)
Cell A T細胞機能アッセイ
利用可能なものとしての末梢血、腫瘍組織および任意の他の細胞標本中の遺伝子改変されたT細胞の残留性は、表2中のスケジュールに従ってqPCRおよび/またはフローサイトメトリーアッセイによって行われ得る。さらに、Cell A注入の前後に、PBMCサンプルは、PRAME特異的細胞傷害性活性によって分析され得る。
利用可能なものとしての末梢血、腫瘍組織および任意の他の細胞標本中の遺伝子改変されたT細胞の残留性は、表2中のスケジュールに従ってqPCRおよび/またはフローサイトメトリーアッセイによって行われ得る。さらに、Cell A注入の前後に、PBMCサンプルは、PRAME特異的細胞傷害性活性によって分析され得る。
一般的統計アプローチ
記述統計を利用して、個体群統計特徴およびベースライン特徴をまとめ得る。定量的パラメーターに関する全ての要約表は、関連する場合、平均、標準偏差、メジアン、範囲(最小および最大)、ならびに欠陥データの数を示す。定性的パラメーターに関する全ての要約表は、関連する場合、数、パーセンテージ、および欠陥データの数を示す。
記述統計を利用して、個体群統計特徴およびベースライン特徴をまとめ得る。定量的パラメーターに関する全ての要約表は、関連する場合、平均、標準偏差、メジアン、範囲(最小および最大)、ならびに欠陥データの数を示す。定性的パラメーターに関する全ての要約表は、関連する場合、数、パーセンテージ、および欠陥データの数を示す。
用量漸増アルゴリズム
MTDステージにおいて、そのデザインは、5つのコホート(表1)からなる。1コホートあたり3~6名の被験体からなるコホートは、3+3用量漸増/漸減スキーマに従って、Cell A T細胞で処置され得る。被験体は、0日目にCell Aの1用量を受ける。
MTDステージにおいて、そのデザインは、5つのコホート(表1)からなる。1コホートあたり3~6名の被験体からなるコホートは、3+3用量漸増/漸減スキーマに従って、Cell A T細胞で処置され得る。被験体は、0日目にCell Aの1用量を受ける。
登録は、コホート3から開始する。被験体は、Cell Aの注入後に用量制限毒性(DLT)に関して評価され得る。観察されるDLTは、さらなる被験体が、以下に概説される規則を使用して、同じ用量レベル、より高い用量レベルまたはより低い用量レベルに登録されるべきかを決定するために使用され得る:
・1/3が出発用量(コホート3)においてDLTを経験する場合;別の3名の被験体は、コホート3に登録され得る。最初の3名の患者は、各患者の後に3週間追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート3(出発用量)においてDLTを経験する場合、次に続く被験体は、コホート4に登録され得る。≧2/6の被験体がコホート3においてDLTを経験する場合;次に続く被験体は、コホート2に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次に続く被験体は、コホート5に登録される。≧2/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にコホート3は、MTDと示され得、そしてわずか3名の被験体がコホート3に登録されている場合、次にMTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、次にコホート5は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート5に登録されている場合、MTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。≧2/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、次にコホート4は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート4に登録されている場合、次にMTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合、次にコホート2はMTDと示され得る;わずか3名の被験体がコホート2に登録されている場合、次にMTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。≧2/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合;続く被験体は、コホート1に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合、次にコホート1はMTDと示され得る。≧2/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合;次にその研究は中断され得、そのデータは、臨床研究チームによって評価され得る。
・1/3が出発用量(コホート3)においてDLTを経験する場合;別の3名の被験体は、コホート3に登録され得る。最初の3名の患者は、各患者の後に3週間追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート3(出発用量)においてDLTを経験する場合、次に続く被験体は、コホート4に登録され得る。≧2/6の被験体がコホート3においてDLTを経験する場合;次に続く被験体は、コホート2に登録される。
・0/3または1/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次に続く被験体は、コホート5に登録される。≧2/6の被験体がコホート4においてDLTを経験する場合、次にコホート3は、MTDと示され得、そしてわずか3名の被験体がコホート3に登録されている場合、次にMTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、次にコホート5は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート5に登録されている場合、MTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。≧2/6の被験体がコホート5においてDLTを経験する場合、次にコホート4は、MTDと示され得、わずか3名の被験体がコホート4に登録されている場合、次にMTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合、次にコホート2はMTDと示され得る;わずか3名の被験体がコホート2に登録されている場合、次にMTDを確認するためにさらに3名の被験体が登録され得る。≧2/6の被験体がコホート2においてDLTを経験する場合;続く被験体は、コホート1に登録され得る。
・0/3または1/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合、次にコホート1はMTDと示され得る。≧2/6の被験体がコホート1においてDLTを経験する場合;次にその研究は中断され得、そのデータは、臨床研究チームによって評価され得る。
DLTは、以下のとおり定義される:
Cell A: DLTは、治療の最初の28日間で起こる新たな有害事象に基づき得、有害事象が薬物関連でなければならない(すなわち、明らかに関連あり、関連がある可能性が高い、またはおそらく関連あり):
・≧グレード3 CRS関連毒性または他のグレード3器官毒性
Cell A: DLTは、治療の最初の28日間で起こる新たな有害事象に基づき得、有害事象が薬物関連でなければならない(すなわち、明らかに関連あり、関連がある可能性が高い、またはおそらく関連あり):
・≧グレード3 CRS関連毒性または他のグレード3器官毒性
AMLにおける完全寛解は、国際作業グループによって確立された以下の基準を使用して定義されている(Dohnerら, 2010; Chesonら, 2001; de Greefら, 2005):
・絶対好中球数の正常値(>1000/μL)および血小板数の正常値(>100,000/μL)、ならびに赤血球輸血からの独立性。
・芽細胞のクラスターまたはコレクションがないことを明らかにする骨髄生検。髄外白血病(例えば、中枢神経系または軟組織の関与)は、非存在でなければならない。
・骨髄吸引は、全ての細胞構成要素(すなわち、赤血球、顆粒球、および巨核球のシリーズ)の正常な成熟を明らかにする。骨髄細胞性に関する要件はない。
・5%未満の芽細胞が骨髄に存在し、白血病表現型(例えば、アウエル小体)は全く有し得ない。異形成の残留は、残存AMLのインジケーターとして気にかかるが、寛解状態の基準としては検証されていない。
・以前検出されたクローン性細胞遺伝学的異常の非存在(すなわち、完全な細胞遺伝学的寛解、CRc)は、CRの形態診断を確認するが、現在では、必要とされる基準ではない。しかし、第1のCRの時点での異常な核型から正常な核型への変換は、重要な予後指標であり、これは、AMLにおけるCRの基準としてCRcの使用を裏付ける(Cheson, 2003; Marcucci et al, 2004; Chen et al, 2011)。
・不完全血小板回収を伴うCR(CRp):残存血小板減少症(血小板数<100× 109/L[100,000/μL])を除く全てのCR基準
・不完全な回収を伴うCR(CRi):残存好中球減少症(絶対好中球数<1.0×109/L[1000/μL])を除く全てのCR基準
・絶対好中球数の正常値(>1000/μL)および血小板数の正常値(>100,000/μL)、ならびに赤血球輸血からの独立性。
・芽細胞のクラスターまたはコレクションがないことを明らかにする骨髄生検。髄外白血病(例えば、中枢神経系または軟組織の関与)は、非存在でなければならない。
・骨髄吸引は、全ての細胞構成要素(すなわち、赤血球、顆粒球、および巨核球のシリーズ)の正常な成熟を明らかにする。骨髄細胞性に関する要件はない。
・5%未満の芽細胞が骨髄に存在し、白血病表現型(例えば、アウエル小体)は全く有し得ない。異形成の残留は、残存AMLのインジケーターとして気にかかるが、寛解状態の基準としては検証されていない。
・以前検出されたクローン性細胞遺伝学的異常の非存在(すなわち、完全な細胞遺伝学的寛解、CRc)は、CRの形態診断を確認するが、現在では、必要とされる基準ではない。しかし、第1のCRの時点での異常な核型から正常な核型への変換は、重要な予後指標であり、これは、AMLにおけるCRの基準としてCRcの使用を裏付ける(Cheson, 2003; Marcucci et al, 2004; Chen et al, 2011)。
・不完全血小板回収を伴うCR(CRp):残存血小板減少症(血小板数<100× 109/L[100,000/μL])を除く全てのCR基準
・不完全な回収を伴うCR(CRi):残存好中球減少症(絶対好中球数<1.0×109/L[1000/μL])を除く全てのCR基準
より低い基底活性およびリガンドIC50の最小喪失を伴う改変カスパーゼ-9ポリペプチド
基底シグナル伝達(アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達)は、多くの生体分子に一般的である。例えば、それは、複数のサブファミリーに由来する60を超える野生型Gプロテイン共役レセプター(GPCR)[1]、キナーゼ(例えば、ERKおよびabl)[2]、表面免疫グロブリン[3]、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、B細胞発生および分化[4~6]、T細胞分化[2、7]、胸腺細胞発生[8]、エンドサイトーシスおよび薬物耐性[9]、自己免疫[10]から、植物成長および発生[11]まで、非常に種々の生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な結果をもたらし得る。欠陥のある基底Gsプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性ACTH不応(familial ACTH resistance)、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症[12、13])などの疾患をもたらした。
基底シグナル伝達(アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達)は、多くの生体分子に一般的である。例えば、それは、複数のサブファミリーに由来する60を超える野生型Gプロテイン共役レセプター(GPCR)[1]、キナーゼ(例えば、ERKおよびabl)[2]、表面免疫グロブリン[3]、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、B細胞発生および分化[4~6]、T細胞分化[2、7]、胸腺細胞発生[8]、エンドサイトーシスおよび薬物耐性[9]、自己免疫[10]から、植物成長および発生[11]まで、非常に種々の生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な結果をもたらし得る。欠陥のある基底Gsプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性ACTH不応(familial ACTH resistance)、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症[12、13])などの疾患をもたらした。
たとえ野生型イニシエーターカスパーゼ-9のホモ二量体化がエネルギー的に不利であり、野生型イニシエーターカスパーゼ-9を溶液中で大部分をモノマーにしても[14~16]、プロセシングされていないカスパーゼ-9の低レベルの固有の基底活性[15,17]は、Apaf-1ベースの「アポプトソーム」(その天然のアロステリック調節因子[6])の存在下で増強される。さらに、超生理学的発現レベルおよび/または共局在は、近位にあることで駆動される二量体化(proximity-driven dimerization)をもたらし得、さらには、基底活性化を増強し得る。本出願の改変された細胞は、より低い基底シグナル伝達活性を有するキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ-9変異体の例は、以下の表中に提供される。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ-9変異体を含むポリヌクレオチドは、本明細書中での細胞療法に使用される改変された細胞において発現され得る。これらの例では、その改変された細胞は、より低い基底シグナル伝達キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む安全スイッチを含み得る。本明細書中のキメラ刺激分子またはキメラ抗原レセプターを含む改変された細胞の投与後の有害事象の事象では、カスパーゼ-9活性は、患者に二量体化剤を投与し、従って、改変された細胞のうちのいくらかまたは全てのアポトーシスおよびクリアランスを誘導することによって誘導され得る。いくつかの例では、投与される二量体化剤の量は、改変された細胞のうちの最高量、少なくとも80%または90%を除去するようにデザインされた量として決定され得る。他の例では、投与される二量体化剤の量は、負の症候または状態を緩和するその一方で患者において治療用の改変された細胞の十分な量を残しておくために、治療を継続するために、改変された細胞の一部のみを除去するようにデザインされた量として決定され得る。キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを使用してアポトーシスを誘導するための方法は、Malcolm K. BrennerらによるPCT出願番号PCT/US2011/037381(標題、Methods for Inducing Selective Apoptosis、2011年5月20日出願)およびMalcolm K. Brennerらによる米国特許出願第13/112,739号(標題、Methods for Inducing Selective Apoptosis、2011年5月20日出願、米国特許第9,089,520号として2015年7月28日発行)において論じられる。改変された基底活性を有するキメラカスパーゼポリペプチドは、David SpencerらによるPCT出願番号PCT/US2014/022004(標題、Modified Caspase Polypeptides and Uses Thereof」、2014年3月7日出願、WO2014/164348として2014年10月9日公開)、およびDavid Spencerらによる米国特許出願第13/792,135号(標題、Modified Caspase Polypeptides and Uses Thereof、2014年3月7日出願);およびSpencerらによる米国特許出願第14/640,553号(2015年3月6日出願)において論じられる。治療用の改変された細胞の部分的アポトーシスを誘導するための方法は、Kevin SlawinらによるPCT出願番号PCT/US14/040964(標題、Methods for Inducing Partial Apoptosis Using Caspase Polypeptides、2014年6月4日出願、WO2014/197638として2014年12月11日公開)、およびKevin Slawinらによる米国特許出願第14/296,404号(標題、Methods for Inducing Partial Apoptosis Using Caspase Polypeptides、2014年6月4日出願)において論じられる。これらの特許出願および刊行物は、それらの全体において本明細書に全て参考として援用される。
レトロウイルスベクター構築物の生成
本出願において論じられるPRAME由来ペプチドSLLQLIGL(PRAME)に特異的なヒトTCRを、SLLQLIGLポリペプチドを認識するT細胞クローンの単離および同定後に、T2A配列によって連結された、コドン最適化しかつシステイン改変したTCR-AV1S1およびTCR-BV1S1を使用してデザインした(Heemskerk 2001; Heemskerk, 2004; van Loenen, 2011)。TCRαおよびTCRβ鎖をコードするヌクレオチド配列を、コドン最適化およびシステイン改変して、混合TCR二量体形成を防止し、かつTCR発現を最適化した。
本出願において論じられるPRAME由来ペプチドSLLQLIGL(PRAME)に特異的なヒトTCRを、SLLQLIGLポリペプチドを認識するT細胞クローンの単離および同定後に、T2A配列によって連結された、コドン最適化しかつシステイン改変したTCR-AV1S1およびTCR-BV1S1を使用してデザインした(Heemskerk 2001; Heemskerk, 2004; van Loenen, 2011)。TCRαおよびTCRβ鎖をコードするヌクレオチド配列を、コドン最適化およびシステイン改変して、混合TCR二量体形成を防止し、かつTCR発現を最適化した。
レトロウイルス構築物SFG.iCasp9.2A.SLL-TCR(SFG.iCasp9.2A.PRAMEともいわれる)は、PRAME由来ペプチドSLLQLIGL(PRAME 425~433)に特異的なヒトTCRのα鎖およびβ鎖に連結された、合成リガンド-誘導性ヒトカスパーゼ-9cDNA(iCasp9)をコードする。
活性に重要な機能的構成要素は、以下である:
・ベクターの5’末端にある5’ LTR-レトロウイルス長末端反復(プロモーター配列として機能する)
・ψ- レトロウイルスキャプシド化シグナル(プサイ;ビリオン粒子の中にRNAをパッケージングするために必要)
・SA- スプライスアクセプター部位
・iCasp9- 誘導性カスパーゼ-9発現カセット。iCasp9は、6アミノ酸Gly-Serリンカーを介して改変されたCARDドメイン欠失ヒトカスパーゼ-9に接続された、F36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12)からなる
・FKBP12- F36V-AP1903に対する結合親和性を最適化するためにF36V変異を含む操作されたFK506結合タンパク質。このFKBP12-F36Vタンパク質ドメインは、連結された治療用タンパク質の薬物結合/オリゴマー化ドメインとして働く。FKBP12-F36Vは、カスパーゼ-9の調節因子として機能する:AP1903の非存在下では、iCasp9は、最小の活性を有する;FKBP12-F36VへのAP1903結合は、二量体化を促進し、2個のカスパーゼ-9分子を並置した状態にして、アポトーシスを開始する。従って、このFKBP12-F36V部分は、Apaf-1関連オリゴマー化を媒介するカスパーゼ-9の内因性二量体化/活性化モジュール(カスパーゼ活性化および補充ドメイン;CARD)を機能的に置き換える。
・リンカー- スイッチ-調節因子配列をカスパーゼ-9に融合するために使用される合成のSer-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyペプチドリンカー
・カスパーゼ-9- ヒトカスパーゼ-9 cDNA配列(重要なアポトーシス促進性調節因子)および構築物の治療構成要素(調節された自殺遺伝子)。内因性二量体化/活性化モジュール(カスパーゼ活性化および補充ドメイン;CARD)を欠失させて、自発的Apaf1結合および従ってバックグラウンド殺滅を減少させた。
・2A- Thosea Asigna昆虫ウイルスに由来し、カスパーゼ-9タンパク質とTCRタンパク質との間で切断可能なリンカーとして機能する合成の20アミノ酸ペプチドをコードする。
・TCR- PRAME由来SLLQLIGLペプチドに特異的なヒトTCR。それは、αおよびβ鎖からなる。
・TCRβ- Vβ1ファミリーに属する、PRAME-TCRのβ鎖の配列。それは、S57C改変がTCR鎖対合を増大させるために挿入された、可変領域および定常領域からなる。
・2A- Thosea Asigna昆虫ウイルスに由来し、カスパーゼ-9タンパク質とTCRタンパク質との間で切断可能なリンカーとして機能する合成の20アミノ酸ペプチドをコードする。その天然の配列は、第1の2A配列との組換え事象を減少させるためにコドン最適化されている。
・TCRα- Vα8ファミリーに属するPRAME-TCRのβ鎖の配列。それは、T48C改変がTCR鎖対合を増大させるために挿入された、可変領域および定常領域からなる。
・3’ LTR- ベクターの3’末端にあるレトロウイルス長末端反復(ターミネーター/ポリアデニル化配列として機能する)。
活性に重要な機能的構成要素は、以下である:
・ベクターの5’末端にある5’ LTR-レトロウイルス長末端反復(プロモーター配列として機能する)
・ψ- レトロウイルスキャプシド化シグナル(プサイ;ビリオン粒子の中にRNAをパッケージングするために必要)
・SA- スプライスアクセプター部位
・iCasp9- 誘導性カスパーゼ-9発現カセット。iCasp9は、6アミノ酸Gly-Serリンカーを介して改変されたCARDドメイン欠失ヒトカスパーゼ-9に接続された、F36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12)からなる
・FKBP12- F36V-AP1903に対する結合親和性を最適化するためにF36V変異を含む操作されたFK506結合タンパク質。このFKBP12-F36Vタンパク質ドメインは、連結された治療用タンパク質の薬物結合/オリゴマー化ドメインとして働く。FKBP12-F36Vは、カスパーゼ-9の調節因子として機能する:AP1903の非存在下では、iCasp9は、最小の活性を有する;FKBP12-F36VへのAP1903結合は、二量体化を促進し、2個のカスパーゼ-9分子を並置した状態にして、アポトーシスを開始する。従って、このFKBP12-F36V部分は、Apaf-1関連オリゴマー化を媒介するカスパーゼ-9の内因性二量体化/活性化モジュール(カスパーゼ活性化および補充ドメイン;CARD)を機能的に置き換える。
・リンカー- スイッチ-調節因子配列をカスパーゼ-9に融合するために使用される合成のSer-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyペプチドリンカー
・カスパーゼ-9- ヒトカスパーゼ-9 cDNA配列(重要なアポトーシス促進性調節因子)および構築物の治療構成要素(調節された自殺遺伝子)。内因性二量体化/活性化モジュール(カスパーゼ活性化および補充ドメイン;CARD)を欠失させて、自発的Apaf1結合および従ってバックグラウンド殺滅を減少させた。
・2A- Thosea Asigna昆虫ウイルスに由来し、カスパーゼ-9タンパク質とTCRタンパク質との間で切断可能なリンカーとして機能する合成の20アミノ酸ペプチドをコードする。
・TCR- PRAME由来SLLQLIGLペプチドに特異的なヒトTCR。それは、αおよびβ鎖からなる。
・TCRβ- Vβ1ファミリーに属する、PRAME-TCRのβ鎖の配列。それは、S57C改変がTCR鎖対合を増大させるために挿入された、可変領域および定常領域からなる。
・2A- Thosea Asigna昆虫ウイルスに由来し、カスパーゼ-9タンパク質とTCRタンパク質との間で切断可能なリンカーとして機能する合成の20アミノ酸ペプチドをコードする。その天然の配列は、第1の2A配列との組換え事象を減少させるためにコドン最適化されている。
・TCRα- Vα8ファミリーに属するPRAME-TCRのβ鎖の配列。それは、T48C改変がTCR鎖対合を増大させるために挿入された、可変領域および定常領域からなる。
・3’ LTR- ベクターの3’末端にあるレトロウイルス長末端反復(ターミネーター/ポリアデニル化配列として機能する)。
ベクター模式図
生成物製造において使用されるレトロウイルスシャトルベクター(SFG.iCasp9.2A.SLL-TCR)のプラスミドマップは、図25に示される。特有の制限部位および導入遺伝子特徴が図示される。
生成物製造において使用されるレトロウイルスシャトルベクター(SFG.iCasp9.2A.SLL-TCR)のプラスミドマップは、図25に示される。特有の制限部位および導入遺伝子特徴が図示される。
参照電子ベクター配列(reference electronic vector sequence)を、ベクター構築物の各構成要素についてDNA配列ファイルを組み合わせることによってアセンブリした。レトロウイルスゲノムはRNAベースであるので、配列分析は、293VEC細胞株へのトランスフェクション(レトロウイルス生成物調製における最初の工程)に使用されるプラスミドDNAに対して行った。Ospedale Pediatrico Bambino Gesu(OPBG)(Rome, Italy)においてベクター全体に対して2方向性配列決定を行った。配列決定実行を、SnapGeneソフトウェアを使用してアセンブリした。理論的参照電子配列と比較してミスマッチの塩基は、同定されなかった。TCRβ S57CおよびTCRα-T48Cを導入して、α-TCR鎖とβ-TCR鎖との間の対合を増大させた。従って、これらの差異は、変異ではなく、親構築物の中へ実際に操作された。
参照配列からのヌクレオチドのずれは、カスパーゼ-9コードドメイン内で起こった(nt 2493)。これは、アルギニンの代わりにグルタミンを使用する。これは、ヒトカスパーゼ-9において天然に存在する一般的な多型を表し、iカスパーゼ-9のテンプレートとして作用する最初のカスパーゼ-9 cDNAに存在した。従って、これもまた、変異ではなかった。
SFG.iCasp9.2A SLL-TCRレトロウイルスベクターは、親のSFG.iCasp9.2A.CARに由来した。SFG.iCasp9.2A.CARは、MCSV骨格からSFGレトロウイルス骨格へと発現挿入物(F-Casp9といわれ、iCasp9と再命名)をクローニングすることによる、MSCV.IRES.GFPベースの構築物に由来した。このiCasp9部分を、MCSV骨格からSFG骨格へと移して、(i)MCSV構築物中の共発現されるIRES-GFPを排除した、および(ii)SFG骨格を利用した。さらに、SFGレトロウイルス構築物は、9年間までの安定性を示した。SFG骨格において、iCasp9カセットを、2A様の切断可能なリンカーを介してTCR配列に接続した。この2A様の配列は、Thosea asigna昆虫ウイルス由来の20アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での>99%の切断を媒介して、iCasp9のC末端において19個の追加のアミノ酸およびTCRβ鎖のN末端において1つの追加のプロリン残基をもたらす。このTCRエレメントは、第2のコトン最適化されたT2Aによって連結される、全長ヒトTCRβ(可変領域および定常領域)および全長ヒトTCRα(可変領域および定常領域)からなる。
関連しないCAR配列を含むベクターカセットを、PSI-1(iCasp9の配列に存在)およびMLU-1(関連しないCAR配列の終止コドン(codon stop)の後に存在)での酵素消化を通じて除去した。構築物はSIGMA Aldrich Companyによって合成され(このiCasp9配列は、PSI-1部位の後ろの、2Aペプチド、TCRβ、第2の2AペプチドおよびTCRαとともにインフレームで存在する)、発現ベクターPUC中でOPBGセンターに輸送された。PUCベクター中に存在する関連遺伝子カセットは、PSI-1およびMLU-1での酵素消化後に得られ、ベクター骨格(上記で記載されるように調製)におけるライゲーションのために使用した。
このSFG.iCasp9.2A.SLL-TCRレトロウイルスベクターを、Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Cell and Gene Therapy for Pediatric Tumor Laboratoryにおいて製造した。レトロウイルスを生成するためのパッケージング細胞株を、専用のLaminar Flow HoodsおよびCO2インキュベーターを使用して、研究環境において生成した。このSFG.iCasp9.2A.SLL-TCRレトロウイルスベクターを、cGMPで保存された(cGMP-banked)293VEC RD114プロデューサークローンから生成する。
BioVec 293Vec-RD114パッケージング細胞株は、ヒト胚性腎臓HEK293ベースのパッケージング細胞株である。この293Vec-RD114細胞株を、モロニーマウス白血病(MLV)gag-polおよびRD114エンベロープ(env)ウイルスタンパク質を安定して発現するように、ゼオシンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を使用して開発した。293Vec-RD114細胞によって生成されるベクターは、広い範囲の哺乳動物細胞に感染し得る。
SFG.iCasp9.2A.SLL-TCRレトロウイルスベクターの生成の第1段階のために、293VEC GALVプロデューサー細胞株を使用して、一過性レトロウイルス上清を生成した。その後、それを使用して、293VEC RD114プロデューサー細胞株を安定して形質導入した。OPBGのCell and Gene Therapy for Pediatric Tumor Laboratoryは、293VEC GALVおよび293VEC RD114のバイアルを受け取り、これをその後、製薬グレードのウシ胎仔血清を使用して、ワーキングセルバンク(WCB)を生成するために研究実験室の中で拡大および使用した。
WCB 293VEC GALV細胞株のバイアルを、全て専用の材料および機器を使用して、Translational Research Laboratoriesにおいて拡大した。この293VEC GALVを、リポフェクタミン2000試薬および5μgのBPZ-701レトロウイルスベクターを使用して一過性にトランスフェクトした。
トランスフェクションに由来する上清のうちの2mlを、ポリブレンの存在下で293VEC RD114細胞に適用した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生じた293VEC RD114クローン(上清中でのベクターの存在に関してはPCR分析を使用する)を拡大し、OPBGのcGMP施設において保存し、無菌性およびマイコプラズマに関して試験した後、cGMP条件下でレトロウイルス生成のために使用した。
プロデューサー株を、10%の製薬グレードのγ線照射したウシ胎仔血清を有する、DMEM-ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で成長させる。293VECプロデューサー細胞株に由来する上清を、0.20μmフィルターを通して濾過して、夾雑する293VEC細胞を除去する。
初代T細胞を、無血清のゼノフリー(xeno-free)限定培地(Cellgenix)中で培養する。患者由来PBMCを培養し、活性化する。組換えインターロイキン2(IL-2; Cellgenix)を添加し、T細胞を選択的に拡大する。ヒトフィブロネクチンフラグメントのキメラペプチドであるRetroNectin(Takara Bio incorporated, Japan)を使用して、T細胞のレトロウイルス形質導入を促進する。形質導入された細胞を、IL-2を補充した培地中で再び培養し、速度制御フリーザー(controlled-rate freezer)を使用して、限定凍結培地(Cryostor CS10, Biolife Solutions)中で凍結保存する。
自家T細胞は、Cell A遺伝子改変の標的である。末梢血単核細胞を、T細胞特異的条件下での拡大後に形質導入する。上記細胞は、適切なTCR機能のためにCD3シグナルを提供しなければならないので、そのT細胞のみが、最終生成物において機能的である。
PRAME TCR-iCasp9ベクターヌクレオチド配列
以下の配列、配列番号85は、LTR、リンカー、T2A、および他の非iCasp9またはPRAME TCRコード配列を含む。この配列に対するバリアントおよび改変は、ベクターの機能を変化させることなく使用され得ることは、理解される。ある種のコード配列は、順番に、以下である: 5’LTR; FKBP12v; GSリンカー; dカスパーゼ9; T2A; TCRβ; 2A; TCRα; 3’LTR。
配列番号85: SFG.iC9-2A-SLL.TCR iCasp9-PRAME
TCRコード配列
配列番号86: 上記配列番号85においてカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
配列番号87: 上記の配列番号85においてTCRβをコードするヌクレオチド配列
配列番号88: 上記の配列番号85においてTCRαをコードするヌクレオチド配列
(引用されるかまたは本実施例に対するさらなる裏付けを提供する参考文献)
以下の配列、配列番号85は、LTR、リンカー、T2A、および他の非iCasp9またはPRAME TCRコード配列を含む。この配列に対するバリアントおよび改変は、ベクターの機能を変化させることなく使用され得ることは、理解される。ある種のコード配列は、順番に、以下である: 5’LTR; FKBP12v; GSリンカー; dカスパーゼ9; T2A; TCRβ; 2A; TCRα; 3’LTR。
配列番号85: SFG.iC9-2A-SLL.TCR iCasp9-PRAME
TCRコード配列
配列番号86: 上記配列番号85においてカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
配列番号87: 上記の配列番号85においてTCRβをコードするヌクレオチド配列
配列番号88: 上記の配列番号85においてTCRαをコードするヌクレオチド配列
(引用されるかまたは本実施例に対するさらなる裏付けを提供する参考文献)
代表的実施形態
これ以降提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
これ以降提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
A1.
a.TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド;および
b.TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、
を含む、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)を認識するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする核酸分子であって、ここで:
該TCRαポリペプチドおよびTCRβポリペプチドのCDR3領域は一緒に、PRAMEを認識する、核酸分子。
a.TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド;および
b.TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、
を含む、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)を認識するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする核酸分子であって、ここで:
該TCRαポリペプチドおよびTCRβポリペプチドのCDR3領域は一緒に、PRAMEを認識する、核酸分子。
A2.
a.前記第1のポリヌクレオチドは、前記TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする;および
b.前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
実施形態A1に記載の核酸分子。
a.前記第1のポリヌクレオチドは、前記TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする;および
b.前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
実施形態A1に記載の核酸分子。
A3.前記第1のポリペプチドは、前記TCRαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第2のポリペプチドは、前記TCRβポリペプチドの定常領域をさらに含む、実施形態A1またはA2のいずれかに記載の核酸分子。
A4.前記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする、実施形態A1~A3のいずれか1項に記載の核酸分子。
A5.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、実施形態A1~A4のいずれか1項に記載の核酸分子。
A6.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、実施形態A1~A4,のいずれか1項に記載の核酸分子。
A7.前記第1のまたは第2のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、実施形態A3~A6のいずれか1項に記載の核酸分子。
A8.前記第1のおよび第2のポリペプチドの定常領域は、マウスTCR定常領域に由来する、実施形態A3~A7のいずれか1項に記載の核酸分子。
A9.前記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A10.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A9に記載の核酸分子。
A11.前記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A10のいずれか1項に記の載核酸分子。
A12.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A11に記載の核酸分子。
A13.前記第1のポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A14.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A13に記載の核酸分子。
A15.前記第2のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA13~A14のいずれか1項に記載の核酸分子。
A16.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A15に記載の核酸分子。
A17.前記第1のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号14のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A18.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16もしくは配列番号17のヌクレオチド配列を含む、実施形態A17に記載の核酸分子。
A19.前記第2のポリペプチドは、配列番号18もしくは配列番号19のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA17~A18のいずれか1項に記載の核酸分子。
A20.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列を含む、実施形態A19に記載の核酸分子。
A21.前記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A22.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A21に記載の核酸分子。
A23.前記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA21~A22のいずれか1項に記載の核酸分子。
A24.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A23に記載の核酸分子。
A25.前記第1のポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A26.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A25に記載の核酸分子。
A27.前記第2のポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA25~A26のいずれか1項に記載の核酸分子。
A28.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A27に記載の核酸分子。
A29.前記第1のポリペプチドは、配列番号35もしくは配列番号36のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A30.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列を含む、実施形態A29に記載の核酸分子。
A31.前記第2のポリペプチドは、配列番号40もしくは配列番号41のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA29~A30のいずれか1項に記載の核酸分子。
A32.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列を含む、実施形態A31に記載の核酸分子。
A33.前記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A34.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A33に記載の核酸分子。
A35.前記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA33~A34のいずれか1項に記載の核酸分子。
A36.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A35に記載の核酸分子。
A37.前記第1のポリペプチドは、配列番号51のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A38.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A37に記載の核酸分子。
A39.前記第2のポリペプチドは、配列番号54のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA37~A38のいずれか1項に記載の核酸分子。
A40.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、実施形態A39に記載の核酸分子。
A41.前記第1のポリペプチドは、配列番号57もしくは配列番号58のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8のいずれか1項に記載の核酸分子。
A42.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60もしくは配列番号61のヌクレオチド配列を含む、実施形態A41に記載の核酸分子。
A43.前記第2のポリペプチドは、配列番号62もしくは配列番号63のアミノ酸配列を含む、実施形態A1~A8またはA41~A42のいずれか1項に記載の核酸分子。
A44.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を含む、実施形態A43に記載の核酸分子。
B1.多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子。
B2.前記TCRαもしくはTCRβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態B1に記載の核酸分子。
B3.前記多量体化領域は、FKBP12領域を含む、実施形態B1またはB2のいずれか1項に記載の核酸分子。
B4.前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態B3に記載の方法。
B5.前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、実施形態B4に記載の方法。
B6.前記多量体化領域は、Fv’Fvlsを含む、実施形態B1~B2のいずれか1項に記載の方法。
B7.前記多量体化領域は、配列番号77もしくは配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態B1~B2のいずれか1項に記載の方法。
B8.前記多量体化領域は、配列番号76もしくは配列番号78のヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントによってコードされる、実施形態B7に記載の方法。
B9.前記多量体化領域は、残基36がバリンであるFvポリペプチドバリアントをさらに含む、実施形態B7に記載の方法。
B10.前記リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドである、実施形態B2~B9のいずれか1項に記載の核酸分子。
B11.前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、実施形態B1~B10のいずれか1項に記載の核酸分子。
B12.組成物であって、該組成物は、
a)実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子
を含む組成物。
a)実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子
を含む組成物。
C1.実施形態A1~B12のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
C2.実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子または実施形態C1に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
C2.1.前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、実施形態C2に記載の細胞。
C2.2.前記多量体リガンド結合領域は、FKBP領域である、実施形態C2.1に記載の細胞。
C2.3.前記多量体リガンド結合領域は、FKB12v36領域である、実施形態C2.1またはC2.2のいずれか1項に記載の細胞。
C2.4.前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、実施形態C2.1~C2.3のいずれか1項に記載の細胞。
C3.実施形態B1~B6のいずれか1項に記載の核酸分子または実施形態B7に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
C4~C10.保留。
C11.前記細胞は、自家T細胞である、実施形態C2~C3のいずれか1項に記載の細胞。
C12.前記細胞は、同種異系T細胞である、実施形態C2~C3のいずれか1項に記載の細胞。
C13.実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配列番号1、配列番号4、配列番号21、もしくは配列番号23のアミノ酸配列を含む、T細胞レセプター。
C14.実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配列番号45もしくは配列番号48のアミノ酸配列を含む、T細胞レセプター。
C15.実施形態C2~C3のいずれか1項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
C16.実施形態C2~C3のいずれか1項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
C17.実施形態A1~A44のいずれか1項に記載の核酸分子または実施形態C1に記載のベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
C18.過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態C15に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
C19.過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態C16に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
C20.過剰増殖性疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態C17に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
C21.前記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有する、実施形態C18~C20のいずれか1項に記載の方法。
C22.前記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態C21に記載の方法。
C23.前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、または乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、実施形態C18~C20のいずれか1項に記載の方法。
C24.前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、実施形態C18~C23のいずれか1項に記載の方法。
C25.被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態C15~C16のいずれか1項に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで前記細胞は、該標的細胞上の抗原に結合するT細胞レセプターまたはその機能的フラグメントを含む、方法。
C26.被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態C17に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで前記核酸またはベクターは、該標的細胞上の抗原に結合するT細胞レセプターまたはその機能的フラグメントをコードする方法。
C27.前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態C25またはC26のいずれか1項に記載の方法。
C28.前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態C25~C27のいずれか1項に記載の方法。
C29.前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態C25~C28のいずれか1項に記載の方法。
C30.前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態C29に記載の方法。
C31.前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態C29に記載の方法。
C32.前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態C25~C31のいずれか1項に記載の方法。
C33.被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態C15~C17のいずれか1項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する方法。
C34.標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態C15~C17のいずれか1項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する方法。
C35.前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態C34に記載の方法。
C36.外因性T細胞レセプターをコードする単離されたT細胞であって、ここで該T細胞レセプターは、PRAMEを認識する、単離されたT細胞。
C37.前記T細胞レセプターは、配列番号1、配列番号4、配列番号21、もしくは配列番号23のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、実施形態C25に記載の単離されたT細胞。
C38.前記T細胞レセプターは、配列番号45もしくは配列番号48のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、実施形態C25に記載の単離されたT細胞。
C39.前記T細胞レセプターは、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、実施形態C25~C27のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
C40.前記T細胞レセプターは、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、実施形態C25~C27のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
D1.CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む;および
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む;および
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
D2.
前記第1のポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする;および
前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
実施形態D1に記載の核酸分子。
前記第1のポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする;および
前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
実施形態D1に記載の核酸分子。
D3.前記第1のポリペプチドは、前記TCRαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第2のポリペプチドは、前記TCRβポリペプチドの定常領域をさらに含む、実施形態D1に記載の核酸分子。
D4.前記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする、実施形態D1~D3のいずれか1項に記載の核酸分子。
D5.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する、実施形態D1~D4のいずれか1項に記載の核酸分子。
D6.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する、実施形態D1~D4のいずれか1項に記載の核酸分子。
D7.前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、実施形態D3~D6のいずれか1項に記載の核酸分子。
D8.前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの定常領域は、マウスTCR定常領域に由来する、実施形態D3~D7のいずれか1項に記載の核酸分子。
D9.前記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D10.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D9に記載の核酸分子。
D11.前記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列、または配列番号4の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D10のいずれか1項に記載の核酸分子。
D12.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D11に記載の核酸分子。
D13.前記第1のポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列、または配列番号7の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D14.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D13に記載の核酸分子。
D15.前記第2のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列、または配列番号10の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD13~D14のいずれか1項に記載の核酸分子。
D16.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D15に記載の核酸分子。
D17.前記第1のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号14のアミノ酸配列、または配列番号13もしくは配列番号14の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D18.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16,もしくは配列番号17のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D17に記載の核酸分子。
D19.前記第2のポリペプチドは、配列番号18もしくは配列番号19のアミノ酸配列、または配列番号18もしくは配列番号19の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD17~D18のいずれか1項に記載の核酸分子。
D20.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21,もしくは配列番号22のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D19に記載の核酸分子。
D21.前記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列、または配列番号23の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D22.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D21に記載の核酸分子。
D23.前記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列、または配列番号26の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD21~D22のいずれか1項に記載の核酸分子。
D24.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D23に記載の核酸分子。
D25.前記第1のポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列、または配列番号29の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D26.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D25に記載の核酸分子。
D27.前記第2のポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸配列、または配列番号32の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD25~D26のいずれか1項に記載の核酸分子。
D28.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D27に記載の核酸分子。
D29.前記第1のポリペプチドは、配列番号35もしくは配列番号36のアミノ酸配列、または配列番号35もしくは配列番号36の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D30.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D29に記載の核酸分子。
D31.前記第2のポリペプチドは、配列番号40もしくは配列番号41のアミノ酸配列、または配列番号40もしくは配列番号41の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD29~D30のいずれか1項に記載の核酸分子。
D32.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D31に記載の核酸分子。
D33.前記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列、または配列番号45の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D34.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D33に記載の核酸分子。
D35.前記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列、または配列番号48の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD33~D34のいずれか1項に記載の核酸分子。
D36.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D35に記載の核酸分子。
D37.前記第1のポリペプチドは、配列番号51のアミノ酸配列、あるいは配列番号51の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D38.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D37に記載の核酸分子。
D39.前記第2のポリペプチドは、配列番号54のアミノ酸配列、または配列番号54の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD37~D38のいずれか1項に記載の核酸分子。
D40.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D39に記載の核酸分子。
D41.前記第1のポリペプチドは、配列番号57もしくは配列番号58のアミノ酸配列、または配列番号57もしくは配列番号58の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8のいずれか1項に記載の核酸分子。
D42.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D41に記載の核酸分子。
D43.前記第2のポリペプチドは、配列番号62もしくは配列番号63のアミノ酸配列、または配列番号62もしくは配列番号63の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D1~D8またはD41~D42のいずれか1項に記載の核酸分子。
D44.前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態D43に記載の核酸分子。
D45.CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、ここで該第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含み、ここで該第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む;ならびに
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、ここで該第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含み、ここで該第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む;ならびに
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
D46.前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド配列を含み、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号6のヌクレオチド配列を含む、実施形態D45に記載の核酸分子。
D47.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、ヒトPRAMEに結合する、実施形態D1~D46のいずれか1項に記載の核酸分子。
D48.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、細胞表面上に発現されるPRAMEに結合する、実施形態D1~D47のいずれか1項に記載の核酸分子。
D49.前記T細胞レセプターのCDR3領域は、ペプチド-MHC複合体に特異的に結合し、ここで該MHC分子は、MHCクラスI HLA分子であり、該ペプチドは、PRAMEエピトープである、実施形態D1~48のいずれか1項に記載の核酸分子。
D50.前記MHC分子は、MHCクラスI HLA A2.01分子である。実施形態D49に記載の核酸分子。
D51.前記PRAMEエピトープはSLLQHLIGLであるか、または前記PRAMEエピトープは、QLLALLPSLである、実施形態D49またはD50のいずれか1項に記載の核酸分子。
D52.前記CDR3コードポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターをさらに含む、実施形態D1~D51のいずれか1項に記載の核酸分子。
D53.前記第1のポリヌクレオチドに作用的に連結された第1のプロモーターおよび前記第2のポリヌクレオチドに作用的に連結された第2のプロモーターをさらに含む、実施形態D1~D51のいずれか1項に記載の核酸分子。
D54.多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態D1~D53のいずれか1項に記載の核酸分子。
D55.前記TCRαもしくはTCRβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態D54に記載の核酸分子。
D56.前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、実施形態D54またはD55のいずれか1項に記載の核酸分子。
D57.前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、実施形態D55~D56のいずれか1項に記載の核酸分子。
D58.前記FKBP12領域は、36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D57に記載の核酸分子。
D59.前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D57に記載の核酸分子。
D60.前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D59に記載の核酸分子。
D61.前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、実施形態D59に記載の核酸分子。
D62.前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、実施形態D54~D57のいずれか1項に記載の核酸分子。
D63.前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態D54~D61のいずれか1項に記載の核酸分子。
D64.前記リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドである、実施形態D55~D63のいずれか1項に記載の核酸分子。
D65.前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、実施形態D55~D64のいずれか1項に記載の核酸分子。
D66.前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態D55~D65のいずれか1項に記載の核酸分子。
D67.前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、実施形態D54~D66のいずれか1項に記載の核酸分子。
D68.
a)実施形態D1~D55のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
a)実施形態D1~D55のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
D69.前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、実施形態D68に記載の組成物。
D70.前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、実施形態D68~D69のいずれか1項に記載の組成物。
D71.前記FKBP12領域は、36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D70に記載の組成物。
D72.前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D70に記載の組成物。
D73.前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D70に記載の組成物。
D74.前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、実施形態D71に記載の組成物。
D75.前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、実施形態D68~D74のいずれか1項に記載の組成物。
D76.前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態D68~D72のいずれか1項に記載の組成物。
D77 前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態D68~D76のいずれか1項に記載の組成物。
D78.前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、実施形態D68~D76のいずれか1項に記載の組成物。
D79.実施形態D1~D53のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
D80.前記ベクターは、プラスミドベクターである、実施形態D79に記載のベクター。
D81.前記ベクターは、ウイルスベクターである、実施形態D79に記載のベクター。
D82.前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態D81に記載のベクター。
D83.前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態D81に記載のベクター。
D84.実施形態D1~D53のいずれか1項に記載の核酸分子または実施形態D79~D83のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞。
D85.前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、実施形態D84に記載の改変された細胞。
D86.実施形態D54~D67のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
D87.前記ベクターは、プラスミドベクターである、実施形態D86に記載のベクター。
D88.前記ベクターは、ウイルスベクターである、実施形態D86に記載のベクター。
D89.前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態D88に記載のベクター。
D90.前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態D88に記載のベクター。
D91.実施形態D54~D67のいずれか1項に記載の核酸分子または実施形態D86~D90のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
D92.前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、実施形態D85またはD91のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D93.前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、実施形態D85またはD91のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D94.前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D93に記載の改変された細胞。
D95.前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、実施形態D93に記載の改変された細胞。
D96.前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、実施形態D94に記載の改変された細胞。
D97.前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、実施形態D93に記載の改変された細胞。
D98.前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態D94に記載の改変された細胞。
D99 前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態D85またはD91~D98のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D100.前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、実施形態D84またはD91~D98のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D101.実施形態D1~D67のいずれか1項に記載の核酸分子、実施形態D79~D83もしくはD86~D90のいずれか1項に記載のベクター、または実施形態D68~D78のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
D102.実施形態D84、D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
D103.実施形態D1~D67のいずれか1項に記載の核酸、実施形態D79~D83もしくはD86~D90のいずれか1項に記載のベクター、または実施形態D65~D74のいずれか1項に記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
D104.過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するための方法であって、該方法は、実施形態D84~D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
D105.前記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有する、実施形態D104に記載の方法。
D106.前記腫瘍中の細胞は、PRAMEを発現する、実施形態D105に記載の方法。
D107.前記腫瘍のPRAME発現を決定する工程をさらに包含する、実施形態D104~D106のいずれか1項に記載の方法。
D108.前記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、実施形態D104~D106のいずれか1項に記載の方法。
D109.前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、および乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、実施形態D104~D108のいずれか1項に記載の方法。
D110.前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、急性リンパ芽球性白血病、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患と診断されている、実施形態D104~D108のいずれか1項に記載の方法。
D111.被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、実施形態D84~D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
D112.前記標的細胞集団の細胞は、PRAMEを発現する、実施形態D111に記載の方法。
D113.前記標的細胞のPRAME発現を決定する工程をさらに包含する、実施形態D111またはD112のいずれか1項に記載の方法。
D114.前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態D111~D113のいずれか1項に記載の方法。
D115.前記標的細胞は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫の細胞からなる群より選択される、実施形態D111~D114のいずれか1項に記載の方法。
D116.前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、実施形態D111~D115のいずれか1項に記載の方法。
D117.前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態D111~D116のいずれか1項に記載の方法。
D118.前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態D117に記載の方法。
D119.前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、実施形態D117に記載の方法。
D120.前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態D111~D119のいずれか1項に記載方法。
D121.前記標的細胞は、PRAMEを発現する、実施形態D111~D120のいずれか1項に記載の方法。
D122.被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態D84~D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
D123.標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態D84~D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
D124.前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態D123に記載の方法。
D125.前記標的抗原は、PRAMEである、実施形態D123またはD124のいずれか1項に記載の方法。
D126.前記改変された細胞のさらなる用量を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、ここで前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、実施形態D123~D125のいずれか1項に記載の方法。
D127.
a)被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程;または該被験体から得られる細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルを決定する工程;および
b)(i)実施形態D84~D85もしくはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞を投与するか、または投与する指示を伝える工程、(ii)該改変された細胞のその後の投与量を維持するか、もしくは維持する指示を伝える工程、または該改変された細胞のその後の投与量を調節する工程、あるいは(iii)該被験体において特定された状態もしくは疾患の有無またはステージ、または該細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルに基づいて、該被験体に投与される該改変された細胞のその後の投与量を調節するか、または調節する指示を伝える工程、
をさらに包含する、実施形態D104~D126のいずれか1項に記載の方法。
a)被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程;または該被験体から得られる細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルを決定する工程;および
b)(i)実施形態D84~D85もしくはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞を投与するか、または投与する指示を伝える工程、(ii)該改変された細胞のその後の投与量を維持するか、もしくは維持する指示を伝える工程、または該改変された細胞のその後の投与量を調節する工程、あるいは(iii)該被験体において特定された状態もしくは疾患の有無またはステージ、または該細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルに基づいて、該被験体に投与される該改変された細胞のその後の投与量を調節するか、または調節する指示を伝える工程、
をさらに包含する、実施形態D104~D126のいずれか1項に記載の方法。
D128 前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ぶどう膜黒色腫、滑膜肉腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、実施形態D104~D128のいずれか1項に記載の方法。
D129.前記被験体は、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、実施形態D104~D128のいずれか1項に記載の方法。
D130.前記被験体は、急性骨髄性白血病と診断されている、実施形態D129に記載の方法。
D131.前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む、実施形態D104~D130のいずれか1項に記載の方法。
D132.前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、実施形態D131に記載の方法。
D133.前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドを投与する前に該被験体から得られるサンプル中の該キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、該多量体リガンドの投与後に該被験体から得られるサンプル中で減少している、実施形態D131またはD132のいずれか1項に記載の方法。
D134.改変された細胞の数または濃度は、前記多量体リガンドの投与後24時間以内に減少している、実施形態133に記載の方法。
D135.前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、50%減少している、実施形態D133またはD134のいずれか1項に記載の方法。
D136.前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、75%減少している、実施形態D133またはD134のいずれか1項に記載の方法。
D137.前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、90%減少している、実施形態D133またはD134のいずれか1項に記載の方法。
D138.前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に、負の症候を経験していることを決定する工程、および該負の症候を減少または改善するために前記リガンドを投与する工程を包含する、実施形態D132~D137のいずれか1項に記載の方法。
D139.前記リガンドは、AP1903またはAP20187である、実施形態D132~D137のいずれか1項に記載の方法。
D140.前記改変された細胞は、自家T細胞である、実施形態D104~D139のいずれか1項に記載の方法。
D141.前記改変された細胞は、同種異系T細胞である、実施形態D104~D139のいずれか1項に記載の方法。
D142.前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態D104~D139のいずれか1項に記載の方法。
D143.前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態D104~D139のいずれか1項に記載の方法。
D144.前記改変された細胞は、T細胞である、実施形態D84、D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D145.前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態D84、D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D146.前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態D84、D85またはD91~D101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
D147.細胞においてPRAMEに特異的に結合するT細胞レセプターを発現するための方法であって、該方法は、実施形態D1~D64のいずれか1項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該細胞が該T細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
D148.前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態D147に記載の方法。
D149.前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態D147に記載の方法。
以下に示される実施例は、ある種の実施形態を例証するのであって、本技術を限定しない。
実施例1: PRAME特異的T細胞
PRAME特異的T細胞の単離および分析
全ての研究を、Leiden University Medical Center(LUMC)の施設内審査委員会の承認を得て行った。インフォームドコンセントの後、末梢血単核細胞(PBMC)を、単一HLA-A2ミスマッチのSCTおよびその後のDLIの後に、急性GVHDを経験したAMLに罹患している患者から集めた。クロスオーバーに基づいて、患者は、HLA-A*0201陽性であり、その同胞ドナーは、HLA-A*0201陰性であったのに対して、全ての他のHLAクラスIおよびクラスII分子は、完全にマッチした。GVHDの間に集めた患者PBMCを、抗HLA-A2-FITC(Pharmingen)、抗HLA-DR-APC(Pharmingen)および抗CD8-PE(BD)で30分間4℃において染色し、活性化した(HLA-DRpos)ドナー由来(HLA-A2neg)CD8+ T細胞を、セルソーティング(FACSAria)によって単離した。PBMCは限られていたので、そのソートしたT細胞を、T細胞培地中、まず抗CD3/CD28および照射した自家PBMC(0.5×106/ml)で拡大した。T細胞培地は、10% ヒト血清(HS)、IL-2(120 IU/ml; Proleukin)およびIL-15(20ng/ml; Peprotech)を有するイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM; Lonza)からなる。T細胞を、照射した同種異系PBMC(0.5×106 /ml)、IL-2(120 IU/ml)、およびフィトヘマグルチニン(PHA, 0.8μg/ml; Murex Biotec Limited)を使用して、非特異的に刺激した。14日間の培養後、T細胞を、抗CD8-APC(BD)および異なるTAAペプチドに対して特異的なPE結合体化HLA-A2四量体で標識した(1-4):PRAMEに関しては: VLDGLDVLL(VLD)、SLYSFPEPEA(SLY)、ALYVDSLFFL(ALY)、およびSLLQHLIGL(SLL)を、WT-1に関しては:RMFPNAPYLを、Pr-1に関しては:VLQELNVTVを試験した。単一細胞ソーティングのために、T細胞を、APC結合体化四量体で、4℃において1時間、TCR VBレパートリー染色キット(Beckman Coulter)と組み合わせて染色し、SLL四量体+VB1+およびSLL四量体+ VB3+ CD8+ T細胞をソートし、照射した同種異系PBMC(0.5×106 /ml)、IL-2(120 IU/ml)、およびフィトヘマグルチニン(PHA、0.8μg/ml; Murex Biotec Limited)を使用して非特異的に刺激した。自己拘束PRAME特異的T細胞クローンを、完全にHLA同一ドナー移植片を移植したHLA-A*0201患者から単離した。SCT後の患者に由来するPBMCを、PE結合体化SLL四量体で1時間、4℃において標識した。四量体陽性T細胞を、抗PEコーティング磁性ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してMACSによって単離し、上記で提供されるように、10日間、抗CD3/CD28ビーズを用いて拡大した。その後のソーティングのために、T細胞を、PE結合体化SLL四量体および抗CD8 APCで1時間、4℃において染色し、四量体陽性CD8+ T細胞を、1ウェルあたり単一細胞にソートし、拡大した。3種のPRAME-SLL四量体陽性T細胞クローン、AAV54(クローン54またはHSS1ともいわれる)、AAV46(HSS3ともいわれる)、およびDMG16を選択し、さらなる分析のために使用した。さらに、PRAME特異的クローンDSK3を選択し、このT細胞クローンの特異性を、ペプチド溶離研究によって決定した。
PRAME特異的T細胞の単離および分析
全ての研究を、Leiden University Medical Center(LUMC)の施設内審査委員会の承認を得て行った。インフォームドコンセントの後、末梢血単核細胞(PBMC)を、単一HLA-A2ミスマッチのSCTおよびその後のDLIの後に、急性GVHDを経験したAMLに罹患している患者から集めた。クロスオーバーに基づいて、患者は、HLA-A*0201陽性であり、その同胞ドナーは、HLA-A*0201陰性であったのに対して、全ての他のHLAクラスIおよびクラスII分子は、完全にマッチした。GVHDの間に集めた患者PBMCを、抗HLA-A2-FITC(Pharmingen)、抗HLA-DR-APC(Pharmingen)および抗CD8-PE(BD)で30分間4℃において染色し、活性化した(HLA-DRpos)ドナー由来(HLA-A2neg)CD8+ T細胞を、セルソーティング(FACSAria)によって単離した。PBMCは限られていたので、そのソートしたT細胞を、T細胞培地中、まず抗CD3/CD28および照射した自家PBMC(0.5×106/ml)で拡大した。T細胞培地は、10% ヒト血清(HS)、IL-2(120 IU/ml; Proleukin)およびIL-15(20ng/ml; Peprotech)を有するイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM; Lonza)からなる。T細胞を、照射した同種異系PBMC(0.5×106 /ml)、IL-2(120 IU/ml)、およびフィトヘマグルチニン(PHA, 0.8μg/ml; Murex Biotec Limited)を使用して、非特異的に刺激した。14日間の培養後、T細胞を、抗CD8-APC(BD)および異なるTAAペプチドに対して特異的なPE結合体化HLA-A2四量体で標識した(1-4):PRAMEに関しては: VLDGLDVLL(VLD)、SLYSFPEPEA(SLY)、ALYVDSLFFL(ALY)、およびSLLQHLIGL(SLL)を、WT-1に関しては:RMFPNAPYLを、Pr-1に関しては:VLQELNVTVを試験した。単一細胞ソーティングのために、T細胞を、APC結合体化四量体で、4℃において1時間、TCR VBレパートリー染色キット(Beckman Coulter)と組み合わせて染色し、SLL四量体+VB1+およびSLL四量体+ VB3+ CD8+ T細胞をソートし、照射した同種異系PBMC(0.5×106 /ml)、IL-2(120 IU/ml)、およびフィトヘマグルチニン(PHA、0.8μg/ml; Murex Biotec Limited)を使用して非特異的に刺激した。自己拘束PRAME特異的T細胞クローンを、完全にHLA同一ドナー移植片を移植したHLA-A*0201患者から単離した。SCT後の患者に由来するPBMCを、PE結合体化SLL四量体で1時間、4℃において標識した。四量体陽性T細胞を、抗PEコーティング磁性ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してMACSによって単離し、上記で提供されるように、10日間、抗CD3/CD28ビーズを用いて拡大した。その後のソーティングのために、T細胞を、PE結合体化SLL四量体および抗CD8 APCで1時間、4℃において染色し、四量体陽性CD8+ T細胞を、1ウェルあたり単一細胞にソートし、拡大した。3種のPRAME-SLL四量体陽性T細胞クローン、AAV54(クローン54またはHSS1ともいわれる)、AAV46(HSS3ともいわれる)、およびDMG16を選択し、さらなる分析のために使用した。さらに、PRAME特異的クローンDSK3を選択し、このT細胞クローンの特異性を、ペプチド溶離研究によって決定した。
PRAME特異的T細胞クローンの機能的反応性
刺激アッセイを、96ウェルプレート中のイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)(10% ヒト血清(HS)および100 IU/ml インターロイキン2(IL-2)を補充)中、5,000個のT細胞および20,000個の標的で行った。種々の悪性細胞および非悪性細胞を集め、調製した。安定なエプスタインバーウイルス(EBV)形質転換B細胞株(EBV-LCL)を、標準的手順を使用して生成し、IMDMおよび10% FBS中で培養した。K562、COS、T2、腎細胞癌細胞株(RCC 1257、RCC 1774、RCC 1851)、肺癌細胞株(A549、NCI-H292)、メラノーマ細胞株(518A2、FM3、FM6、SK2.3、MI-3046、BML、1.14)、子宮頸癌細胞株(SIHA、HELA、CASKI)、乳癌細胞株(MCF7、BT549、MDA231)および結腸癌細胞株(SW480、HCT116、LS411、LS180)を、IMDMおよび10% FBS中で培養した。HLA-A2を発現しないK562、COS、H292、A549、SIHAおよびHELAを、以前に論じられたように5、HLA-A2をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。
刺激アッセイを、96ウェルプレート中のイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)(10% ヒト血清(HS)および100 IU/ml インターロイキン2(IL-2)を補充)中、5,000個のT細胞および20,000個の標的で行った。種々の悪性細胞および非悪性細胞を集め、調製した。安定なエプスタインバーウイルス(EBV)形質転換B細胞株(EBV-LCL)を、標準的手順を使用して生成し、IMDMおよび10% FBS中で培養した。K562、COS、T2、腎細胞癌細胞株(RCC 1257、RCC 1774、RCC 1851)、肺癌細胞株(A549、NCI-H292)、メラノーマ細胞株(518A2、FM3、FM6、SK2.3、MI-3046、BML、1.14)、子宮頸癌細胞株(SIHA、HELA、CASKI)、乳癌細胞株(MCF7、BT549、MDA231)および結腸癌細胞株(SW480、HCT116、LS411、LS180)を、IMDMおよび10% FBS中で培養した。HLA-A2を発現しないK562、COS、H292、A549、SIHAおよびHELAを、以前に論じられたように5、HLA-A2をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。
さらに、メラノーマ細胞を、切り刻んだ腫瘍細胞のフィコール(ficol)単離およびCD45、CD3、CD19、CD14、CD56陰性細胞のその後のFACSソートによって、リンパ節転移メラノーマを有するHLA-A2陽性患者から新たに単離した。選択された実験のために、COS-A2細胞を、野生型ヒトPRAMEをコードするpcDNA3.1発現ベクターでトランスフェクトした。原発性AML細胞(>80% 芽細胞)を有するHLA-A2陽性患者の末梢血を、IMDMおよび10% FCS中で1日培養し、刺激細胞(stimulator cell)として使用した。原発性AML細胞を、GM-CSF(100ng/ml; Novartis)、TNFα(10ng/ml; R&D Systems)、IL-1b(10ng/ml; Immunex)、IL-6(10ng/ml; Cellgenix)、PGE-2(1μg/ml; Sigma-Aldrich)、およびIFNγ(500 IU/ml; Immukine, Boehringer Ingelheim)で1日間活性化した。HLA-A2陽性ALL細胞株を、以前に論じられたとおり6に生成した。B細胞を、抗CD19コーティング磁性ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してMACSによって、PBMCから単離した。ALL細胞株および新たに単離したB細胞を、上記細胞をIL-4(500 U/ml; Schering-Plough)、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(10μg/ml; Eurogentec)およびヒトCD40リガンド7でトランスフェクトした1×105/ml マウス線維芽細胞の存在下で48時間、106 細胞/mlの濃度で24ウェルプレートの中で培養することによって活性化した7)。インビボで活性化したB細胞は、炎症した扁桃に由来した。T細胞の芽細胞を、PHAおよびIL-2(120 IU/ml)を用い7日間、PBMCの刺激によって生成した。
単球を、抗CD14コーティング磁性ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してMACSによってPBMCから単離した。マクロファージ(MO)を、CD14+細胞を6日間、0.5×106 細胞/mlの濃度で24ウェルプレートにおいてIMDMおよび10% HS中で培養することによって生成した。炎症促進性マクロファージ(MO1)細胞を、GM-CSF(5ng/ml)の存在下での培養によって得、抗炎症マクロファージ(MO2)細胞を、M-CSF(5ng/ml, Cetus Corporation)とともに培養した。単球由来DCを、CD14+ 細胞を48時間、IMDMおよび10% HS中、0.5×106 細胞/mlの濃度で24ウェルプレートにおいてIL-4(500 U/ml)およびGM-CSF(100ng/ml)の存在下で培養することによって生成した。CD14 DCの成熟のために、細胞を、さらに48時間、IMDMおよび10% HS(GM-CSF(100ng /ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-1b(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、PGE-2(1μg/ml)、およびIFNγ(500 IU/ml)を補充)中で培養した。
CD34+細胞を、抗CD34コーティング磁性ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用するMACSによって、末梢血幹細胞移植片から単離した。CD34 DCを、GM-CSF(100ng/ml)、SCF(20ng/ml;Amgenによって贈呈)、およびTNFα(2ng/ml)の存在下で4日間、IMDMおよび10% HS中、0.25×106 細胞/mlの濃度で24ウェルプレートにおいて、その後3日間、さらにIL-4(500 IU/ml)とともにCD34細胞を培養することによって生成した。CD34 DCを成熟させるために、上記細胞を、さらに48時間、IMDMおよび10% HS(GM-CSF(100ng/ml)、SCF(20ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-1b(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、PGE-2(1μg/ml)、およびIFNγ(500 IU/ml)を補充)中で培養した。血液由来骨髄様DC(MDC)および形質細胞様DC(PDC)を単離するために、PBMCを、それぞれ、抗BDCA1-PE mAb(Biolegend)または抗BDCA2-PE mAb(Miltenyi Biotec)で染色し、BDCA1-PEまたはBDCA2-PE陽性細胞を、抗PEコーティング磁性ビーズを使用してMACSによって単離した。MACS単離した細胞を、FITC結合体化抗CD3、抗CD14、抗CD19および抗CD56 mAb(BD)で染色し、MDCおよびPDCを、BDCA1またはBDCA2陽性および系統マーカー陰性細胞に基づいて(on bases of)、細胞ソーティングによって選択した。MDCおよびPDCを成熟させるために、細胞を、24時間、IMDMおよび10% HS(それぞれ、ポリ-IC(Amersham)またはCpG(10μg/ml)のいずれかおよびIL-3(50ng/ml;Novartisによって贈呈)を補充)中で培養した。線維芽細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Lonza)(1g/l グルコース(BioWhittaker)および10% FBSを有する)中で皮膚生検から培養した。
ケラチノサイトを、ケラチノサイト無血清培地(30μg/ml ウシ脳下垂体抽出物および2ng/ml 上皮成長因子(EGF)を補充(全ての構成要素をInvitrogenから購入した))中で皮膚生検から培養した。線維芽細胞およびケラチノサイトを、3日間、IFNγ(200 IU/ml)の存在下または非存在下で培養した。初代気管支上皮細胞(PBEC)を、以前に論じられたとおりに4得て、培養した。
間葉系ストローマ細胞(MSC)は、以前に論じられたとおり5、健康なドナーの骨髄に由来し、DMEMおよび10% FBS中で培養した。結腸上皮細胞を、DMEM F12(Lonza)および10% FCS中(EGF(10ng/ml; Promega)、T3ホルモン(2nmol/l; Sigma)、ヒドロコルチゾン(0,4ug/ml; Pharmacy LUMC)、およびインスリン(5ng/ml; Sigma)を補充)で培養した。肝細胞および肝内胆管上皮細胞(IHBEC)(ともにScienCellから購入)を、RPMI(Lonza)および10% FBS中で培養した。近位尿細管上皮細胞(PTEC)を、以前に論じられたとおり6に単離および培養した。
ペプチド力価のために、T2細胞を、種々の濃度のペプチドとともに1時間予備インキュベートし、洗浄した。刺激の18時間後、上清を採取し、IFNγ生成を、標準的ELISAによって測定した。細胞傷害性アッセイにおいて、T細胞を標準的な4時間の51Cr放出アッセイにおいて96ウェルプレート中で1,000個の51Cr標識した標的に対して種々のエフェクター-標的比で試験した。これら実験において、USP11遺伝子に対して特異的なコントロールHLA-A2拘束T細胞クローンHSS12を含めた。
ペプチド溶離、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)および質量分析(MS)
ペプチド溶離、RP-HPLCおよびMSを、以前に論じられたとおり8に行った。簡潔には、3×1010 エプスタインバーウイルス形質転換B細胞(EBV-LCL)を溶解し、ペプチド-HLA-A2複合体を、HLA-A2特異的BB7.2モノクローナル抗体(mAb)を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。その後、ペプチドを、HLA-A2分子から溶離し、サイズ濾過によってHLA単量体およびs2-ミクログロブリンから分離した。凍結乾燥後、ペプチド混合物を、水/アセトニトリル/TFAを使用して第1回のRP-C18-HPLCに供し、画分を集めた。各画分の小さなサンプルをT2細胞に負荷し、T細胞クローンによる認識に関して試験した。その認識された画分を、第2回および第3回のRP-C18-HPLC分画に供した。第2分画において、水/イソプロパノール/TFA勾配を使用し、第3分画において、水/メタノール/ギ酸勾配を使用した。第3分画の後、その認識された画分中および隣接する認識されていない画分中に存在するペプチド質量を、MSによって決定した。その量がT細胞クローンの認識パターンと相関するペプチドを、タンデム質量分析のために選択し、それらの配列を決定した。
ペプチド溶離、RP-HPLCおよびMSを、以前に論じられたとおり8に行った。簡潔には、3×1010 エプスタインバーウイルス形質転換B細胞(EBV-LCL)を溶解し、ペプチド-HLA-A2複合体を、HLA-A2特異的BB7.2モノクローナル抗体(mAb)を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。その後、ペプチドを、HLA-A2分子から溶離し、サイズ濾過によってHLA単量体およびs2-ミクログロブリンから分離した。凍結乾燥後、ペプチド混合物を、水/アセトニトリル/TFAを使用して第1回のRP-C18-HPLCに供し、画分を集めた。各画分の小さなサンプルをT2細胞に負荷し、T細胞クローンによる認識に関して試験した。その認識された画分を、第2回および第3回のRP-C18-HPLC分画に供した。第2分画において、水/イソプロパノール/TFA勾配を使用し、第3分画において、水/メタノール/ギ酸勾配を使用した。第3分画の後、その認識された画分中および隣接する認識されていない画分中に存在するペプチド質量を、MSによって決定した。その量がT細胞クローンの認識パターンと相関するペプチドを、タンデム質量分析のために選択し、それらの配列を決定した。
定量的リアルタイムPCRによるPRAME発現、およびサイレンシングRNAによるPRAME発現の阻害
PRAME発現を、リアルタイムPCR(TaqMan)によって定量した。PRAMEの阻害を、R.Bernards博士(NKI, Amsterdam, The Netherlands)9によって贈呈されたピューロマイシン耐性遺伝子と組み合わせて、PRAMEに特異的な短いヘアピン(sh)RNA配列をコードするレトロウイルスベクターを使用して行った。レトロウイルスにより形質導入した細胞を、試験前に、種々の濃度のピューロマイシンとともに少なくとも1週間培養した。近位尿細管上皮細胞(PTEC)を3μg/mlで、腎細胞癌細胞株RCC1257を4μg/mlで、およびCD34+由来樹状細胞(CD34DC)を0.4μg/mlで培養した。CD34DCを、本明細書で提供されるように生成し、培養の1日目に形質導入した。
PRAME発現を、リアルタイムPCR(TaqMan)によって定量した。PRAMEの阻害を、R.Bernards博士(NKI, Amsterdam, The Netherlands)9によって贈呈されたピューロマイシン耐性遺伝子と組み合わせて、PRAMEに特異的な短いヘアピン(sh)RNA配列をコードするレトロウイルスベクターを使用して行った。レトロウイルスにより形質導入した細胞を、試験前に、種々の濃度のピューロマイシンとともに少なくとも1週間培養した。近位尿細管上皮細胞(PTEC)を3μg/mlで、腎細胞癌細胞株RCC1257を4μg/mlで、およびCD34+由来樹状細胞(CD34DC)を0.4μg/mlで培養した。CD34DCを、本明細書で提供されるように生成し、培養の1日目に形質導入した。
TCR遺伝子移入
クローンAAV54(クローン54またはHSS1とも称される)のTCRAVおよびTCRBV遺伝子使用を、逆転写酵素(RT)-PCRおよび配列決定を使用して決定した5。HSS1は、TCR-AV1S1(IMGT: TRAV8-4*04)およびTCR-BV1S1(IMGT: TRBV9*01)を発現した。レトロウイルスベクターを、切断型神経成長因子レセプター(ΔNGF-R)と組み合わせて、T2A配列によって連結された、コドン最適化しかつシステイン改変したTCRαおよびTCRβ鎖で構築した10,11。サイトメガロウイルス(CMV)-IE1特異的HLA-B8拘束T細胞を、CMV-IE1四量体を使用してソートし、PHAおよび照射した同種異系PBMCで2日間刺激し、PRAME-TCRまたはモックで形質導入した。形質導入したT細胞を、ΔNGF-Rに関する陽性に基づいてソートし、機能的反応性に関して試験した。
クローンAAV54(クローン54またはHSS1とも称される)のTCRAVおよびTCRBV遺伝子使用を、逆転写酵素(RT)-PCRおよび配列決定を使用して決定した5。HSS1は、TCR-AV1S1(IMGT: TRAV8-4*04)およびTCR-BV1S1(IMGT: TRBV9*01)を発現した。レトロウイルスベクターを、切断型神経成長因子レセプター(ΔNGF-R)と組み合わせて、T2A配列によって連結された、コドン最適化しかつシステイン改変したTCRαおよびTCRβ鎖で構築した10,11。サイトメガロウイルス(CMV)-IE1特異的HLA-B8拘束T細胞を、CMV-IE1四量体を使用してソートし、PHAおよび照射した同種異系PBMCで2日間刺激し、PRAME-TCRまたはモックで形質導入した。形質導入したT細胞を、ΔNGF-Rに関する陽性に基づいてソートし、機能的反応性に関して試験した。
定量的リアルタイム(RT)PCRによるPRAME発現
PRAME発現を、RT-PCR(TaqMan)によって定量した。総RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen)またはマイクロRNaqueousキット(Ambion)を使用して、細胞から単離した。第1鎖cDNA合成を、オリゴdTプライマーを用いM-MLV逆転写酵素(Invitrogen)を使用して、またはTranscriptor逆転写酵素(Roche)を用いて行った。サンプルを、Applied Biosystemsの7900HT RT-PCR Systemで行った。以下のPRAMEプライマーを使用した:センス 5’ CGTTTGTGGGGTTCCATTC 3’、アンチセンス 5’ GCTCCCTGGGCAGCAAC 3’およびアンチセンスプローブとして 5’ CCTGCCAGCTCCACAAGTCTCCGTG 3’。プローブは、色素としてVICおよびクエンチャーとしてTAMRAを使用した;両方のプライマーを、イントロン/エキソン境界にわたって選択した。各サンプルを、50ng 総RNAからのcDNAで、二連で行った。ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(PBGD)遺伝子をハウスキーピング遺伝子として測定して、cDNAの良好な品質を担保した。
PRAME発現を、RT-PCR(TaqMan)によって定量した。総RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen)またはマイクロRNaqueousキット(Ambion)を使用して、細胞から単離した。第1鎖cDNA合成を、オリゴdTプライマーを用いM-MLV逆転写酵素(Invitrogen)を使用して、またはTranscriptor逆転写酵素(Roche)を用いて行った。サンプルを、Applied Biosystemsの7900HT RT-PCR Systemで行った。以下のPRAMEプライマーを使用した:センス 5’ CGTTTGTGGGGTTCCATTC 3’、アンチセンス 5’ GCTCCCTGGGCAGCAAC 3’およびアンチセンスプローブとして 5’ CCTGCCAGCTCCACAAGTCTCCGTG 3’。プローブは、色素としてVICおよびクエンチャーとしてTAMRAを使用した;両方のプライマーを、イントロン/エキソン境界にわたって選択した。各サンプルを、50ng 総RNAからのcDNAで、二連で行った。ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(PBGD)遺伝子をハウスキーピング遺伝子として測定して、cDNAの良好な品質を担保した。
CD34細胞増殖アッセイ
CD34細胞増殖阻害アッセイにおいて、CD34細胞を、以前に論じられたようにカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識し、前駆細胞培養培地中に再懸濁した12。
参考文献リスト
CD34細胞増殖阻害アッセイにおいて、CD34細胞を、以前に論じられたようにカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識し、前駆細胞培養培地中に再懸濁した12。
参考文献リスト
アロHLAレパートリーに由来する高親和性PRAME特異的TCRの単離
臨床的に関連する抗原であるメラノーマ優先発現抗原(PRAME)に対して特異的であるアロHLAレパートリー由来のT細胞を単離し、基本的にはAmirら Clin Cancer Res 2011において論じられるようにアッセイした。アロHLA拘束TAA特異的T細胞を、単一HLA-A2ミスマッチ幹細胞移植を受けたことがある患者において分析した。HLA-A2+患者を化学療法および放射線療法で処置したところ、悪性細胞のレベルおよびその患者の正常造血系が減少した。次に、この患者は、HLAミスマッチ(HLA-A2-)幹細胞移植(SCT)を受けた;SCTの後、正常な免疫システムの存在と同様に、この患者の悪性細胞レベルは増大した。次いで、上記患者は、HLA-A2-ドナー細胞リンパ球注入を受けたところ、有益な移植片対腫瘍(GVT)応答が提供され、悪性細胞レベルは減少したが、移植片対宿主病(GVHD)ももたらされた。活性化した腫瘍反応性CD8+ T細胞を、上記患者から得た(図3)。50個の抗HLA-A2反応性T細胞クローンを同定した。その全ては、異なるT細胞レセプター(TCR)を発現した。TCR特異性を、HLA結合ペプチドの単離、多次元HPLC分画、および質量分析によって分析した。高度に単一ペプチド特異的反応性を発揮する、PRAMEに対して特異的なT細胞を同定した。
臨床的に関連する抗原であるメラノーマ優先発現抗原(PRAME)に対して特異的であるアロHLAレパートリー由来のT細胞を単離し、基本的にはAmirら Clin Cancer Res 2011において論じられるようにアッセイした。アロHLA拘束TAA特異的T細胞を、単一HLA-A2ミスマッチ幹細胞移植を受けたことがある患者において分析した。HLA-A2+患者を化学療法および放射線療法で処置したところ、悪性細胞のレベルおよびその患者の正常造血系が減少した。次に、この患者は、HLAミスマッチ(HLA-A2-)幹細胞移植(SCT)を受けた;SCTの後、正常な免疫システムの存在と同様に、この患者の悪性細胞レベルは増大した。次いで、上記患者は、HLA-A2-ドナー細胞リンパ球注入を受けたところ、有益な移植片対腫瘍(GVT)応答が提供され、悪性細胞レベルは減少したが、移植片対宿主病(GVHD)ももたらされた。活性化した腫瘍反応性CD8+ T細胞を、上記患者から得た(図3)。50個の抗HLA-A2反応性T細胞クローンを同定した。その全ては、異なるT細胞レセプター(TCR)を発現した。TCR特異性を、HLA結合ペプチドの単離、多次元HPLC分画、および質量分析によって分析した。高度に単一ペプチド特異的反応性を発揮する、PRAMEに対して特異的なT細胞を同定した。
この同定したPRAME特異的アロHLA拘束T細胞クローンは、PRAME陽性腫瘍細胞株、および新たに単離した(PRAME陽性)転移性メラノーマおよび原発性白血病細胞の一団に対して高度に反応性であった(図4)。例えば、T細胞クローン54を、PRAME特異的であると決定した(図5)。興味深いことには、アロHLAレパートリーに由来するPRAME特異的T細胞の抗原感受性とHLA-A2発現個体から得たPRAME特異的T細胞とを比較すると、アロHLAレパートリー由来のPRAME特異的T細胞がT細胞活性化のために200倍低いペプチド濃度を必要とすることが明らかになった。さらに、アロHLA拘束T細胞のみが、腫瘍細胞株および白血病細胞を認識できた(図6)。これらデータは、T細胞トレランスが患者レパートリーから得られ得る腫瘍特異的T細胞の親和性を凌ぎ得ることを示唆する。
アロHLAレパートリーに由来するPRAME特異的T細胞の高親和性を決定した後に、PRAME特異的T細胞の安全サイン(signature)を特徴付けた。上記T細胞を、非悪性細胞の大きな一団に対して徹底的に試験した。非悪性細胞のこの一団は、異なる組織(例えば、皮膚、肺、結腸、胆道、腎臓、肝臓)に由来する上皮細胞、ならびに線維芽細胞、間葉系ストローマ細胞および全ての異なる造血系統(造血幹細胞を含む)からなった(図7および図8)。上記T細胞は、健康な細胞に対して低い反応性を有した。近位尿細管上皮細胞(PTEC)に対する低い反応性および成熟樹状細胞(CD34-mDC)に対する中程度の反応性を除いて、非悪性細胞タイプのうちのいずれも認識されなかった。反応性は、定量的RT-PCRによって、ならびにPRAME特異的shRNA形質導入によって分析されるとおり、PRAME発現と厳密に相関した(図9)。(Amirら Clin Can Res 2011)。アロHLA拘束PRAME特異的T細胞クローンのシグナルペプチド特異性を、サイレンシングshRNAを使用する認識された抗原の発現のダウンレギュレーションによって示した(図10)。
PRAME特異的TCRのクローニング
クローンAAV54 SLL(アロ54もしくはHSS1ともいわれる)、AAV46 SLL(HSS3ともいわれる)、およびDSK3 QLLクローンによって発現されるT細胞レセプターを、配列決定した。PRAMEのSLLQHLIGLペプチドに対して特異的な2種の異なる高親和性TCR(AAV54およびAAV46)の配列は、図17および図18において示される。さらに、PRAMEのQLLALLPSLエピトープに対して向けられた高親和性TCR、クローンDSK3のこのTCR配列は、図19に示される。PRAME特異的HLA-A2拘束TCRをコードするレトロウイルスベクターを構築し、末梢血T細胞を形質導入するために使用した。末梢血に由来するPRAME特異的なTCR形質導入したCD8+ T細胞は、PRAME特異的認識パターンを有する。
クローンAAV54 SLL(アロ54もしくはHSS1ともいわれる)、AAV46 SLL(HSS3ともいわれる)、およびDSK3 QLLクローンによって発現されるT細胞レセプターを、配列決定した。PRAMEのSLLQHLIGLペプチドに対して特異的な2種の異なる高親和性TCR(AAV54およびAAV46)の配列は、図17および図18において示される。さらに、PRAMEのQLLALLPSLエピトープに対して向けられた高親和性TCR、クローンDSK3のこのTCR配列は、図19に示される。PRAME特異的HLA-A2拘束TCRをコードするレトロウイルスベクターを構築し、末梢血T細胞を形質導入するために使用した。末梢血に由来するPRAME特異的なTCR形質導入したCD8+ T細胞は、PRAME特異的認識パターンを有する。
PRAME特異的TCR発現細胞の特徴付け
PRAME特異的四量体で染色した、TCR形質導入したCD8+ T細胞は、その相当する元のT細胞クローンと比較して類似の認識パターンを示した(図11;またAmirら Clin Can Res 2011)。PRAME-TCRがiCasp9自殺スイッチに連結されているレトロウイルス構築物を生成した。MP71-PRAME-TCR-iCasp9およびMP71-PRAME-TCR-iCasp9-NGFRで形質導入したT細胞の機能性は、MP71-PRAME-TCR-CD20およびMP71-PRAME-TCR-NGFRで形質導入したT細胞に類似であり、そしてAP1903と一晩インキュベートした後、T細胞のPRAME特異的機能的活性は抑止された。これは、iCasp9の機能的発現を示す(図12および図15)。
PRAME特異的四量体で染色した、TCR形質導入したCD8+ T細胞は、その相当する元のT細胞クローンと比較して類似の認識パターンを示した(図11;またAmirら Clin Can Res 2011)。PRAME-TCRがiCasp9自殺スイッチに連結されているレトロウイルス構築物を生成した。MP71-PRAME-TCR-iCasp9およびMP71-PRAME-TCR-iCasp9-NGFRで形質導入したT細胞の機能性は、MP71-PRAME-TCR-CD20およびMP71-PRAME-TCR-NGFRで形質導入したT細胞に類似であり、そしてAP1903と一晩インキュベートした後、T細胞のPRAME特異的機能的活性は抑止された。これは、iCasp9の機能的発現を示す(図12および図15)。
図12。 PRAME-TCRをコードする異なるレトロウイルスベクターを、ウイルス特異的T細胞へと形質導入し、その反応性を、種々の濃度のPRAMEペプチドを負荷した標的細胞に対して、および2種のメラノーマ細胞株に対して測定する:HLA-A2およびPRAMEに関して陽性のFM6、ならびにHLA-A2に関して陽性であるがPRAMEに関して陰性のMI3046/2。HLA-A*0201に関して陽性でありかつPRAMEの中程度の発現を有するJY、EBV-LCLに対するこの形質導入されたT細胞の反応性もまたアッセイした。100nMのAP1903で18時間処理した後に、PRAME反応性は、iCasp9と組み合わせてPRAME-TCRで形質導入したT細胞において抑止された(図の右側部分)。
図13。 4種の異なるPRAME特異的T細胞クローンを、ユーイング肉腫細胞株に対して向けられた反応性に関して試験した。DSK3は、QLL特異的T細胞クローンであり、DMG16およびAAV54は、2種の同一のT細胞クローンであり(同一のTCRαおよびβ配列)、AAV46はまた、SLLエピトープに対して向けられるが、このクローンは、異なるTCRを発現する。AAV12は、USP11遺伝子のペプチドを認識する陽性コントロールT細胞クローンとして使用される。クローンHA1k4は、陰性コントロールクローンである。上記ユーイング肉腫細胞株を、300 IU/mlのIFN-αまたは100 IU/ml IFN-γのいずれかで48時間処理し、洗浄し、異なるT細胞クローンに添加した。共培養の18時間後、その上清を採取し、T細胞クローンのIFN-γ生成を測定した。結果は、12種のーイング肉腫細胞株のうちの8種がPRAMEを発現することを示す。IFN-αおよびIFN-γでの処理は、細胞表面上のHLAクラスI発現を増大させ、異なるT細胞クローンによるユーイング細胞株のより良好な認識をもたらした。
図14。 4種の異なるPRAME特異的T細胞クローンを、神経芽細胞腫(NB)細胞株に対して向けられた反応性に関して試験した。DSK3(QLL特異的)、DMG16およびAAV54(SLL特異的、同じTCR使用)、ならびにAAV46(SLL)。AAV12を、USP11のペプチドを認識する陽性コントロールとして使用した。クローンHA1k4は、陰性コントロールであった。NB細胞株を、300 IU/mlのIFN-αまたは100 IU/ml IFN-γのいずれかで48時間処理したHLA-A2(+A2)で形質導入し、洗浄し、異なるT細胞クローンに添加した。共培養の18時間後、その上清を採取し、T細胞クローンのIFN-γ生成を測定した。結果は、7種のNB細胞株のうちの5種が、PRAMEを発現することを示す(1種のNB細胞株(SK-N-F1)に関しては、PRAME発現は、IFN-αおよびIFN-γでの処理後ですら、低いクラスI発現に起因して未知である)。IFN-αおよびIFN-γでの処理は、細胞表面上のHLAクラスI発現を増大させ、異なるT細胞クローンによるNB細胞株のよりよい認識をもたらした。
定量的RT-PCRによって、PRAME発現を、ユーイング肉腫細胞株および神経芽細胞腫細胞株の両方において決定したところ、T細胞クローンによる認識と相関した。
図15 PRAME-TCRをコードする異なるレトロウイルスベクターを、ウイルス特異的T細胞へと形質導入し、その反応性を、PRAMEペプチドを負荷した標的細胞(T2細胞)ならびに2種のPRAME陽性およびHLA-A2陽性メラノーマ細胞株:518.A2およびFM6、ならびに1種のPRAME陰性であるがHLA-A2陽性メラノーマ細胞株MI3046/2に対して測定した。100nMのAP1903で18時間処理した後に、iCasp9と組み合わせてPRAME-TCRで形質導入したT細胞においてPRAME反応性が抑止された。
図16は、PRAME特異的T細胞クローンによるユーイング肉腫細胞の認識を示す棒グラフである。ユーイング肉腫細胞株を、IFN-γ/IFN-αありまたはなしで48時間処理した。ユーイング肉腫細胞株のIFN-γ/IFN-αありまたはなしでのHLA発現を、図の右側部分に示す。
図20において、本発明者らは、診断時にAMLに罹患している患者に由来する種々の原発性AMLサンプルに対するPRAME特異的T細胞の反応性を示す。分析した上記AMLサンプルは、HLA-A*0201であり(41個のサンプル)、1個のAMLサンプルは、HLA-A2陰性であった(AML 54)。図20において、T細胞クローンの反応性(B)およびqPCRによって測定されるPRAMEの発現(A)の両方を示す。
原発性AMLサンプルを、PRAME特異的T細胞による認識に関して分析した。42個のAMLサンプルのうち、41個は、HLA-A*02:01陽性であり、1個は、HLA-A*02:01陰性であった(AML 54)。41個のHLA-A*02:01+ AMLサンプルのうち、9個のAMLサンプルは、PRAME特異的T細胞によって効率的に認識された。メラノーマ細胞株Mel1.14(100%に設定)において測定されたPRAME発現のレベルに対してPRAME発現>2.5%を有するAMLサンプルは、PRAME特異的T細胞によって効率的に認識された。
結果は、AMLサンプルにおいてPRAME発現がメラノーマ細胞株Mel1.14(100%に設定)において測定されたPRAME発現のレベルに対して>2.5%である場合、このPRAME特異的T細胞は上記AMLサンプルに対して効率的に反応し得ることを示す。これらの結果は、HLA-A*0201陽性AML患者のうちのおよそ20~25%が、PRAME-TCR遺伝子移入で処置され得ることを示す。さらに、結果は、qPCRによるAMLサンプルのPRAME発現の測定が、患者をPRAME-TCR改変T細胞で処置することが潜在的に有益であるかを決定するために使用され得ることを示す。
実施例2:自殺遺伝子の付加--改変された細胞の選択的アポトーシス
PRAME標的化TCRを発現する改変された細胞は、患者が負の効果を経験し、処置を減らすかまたは停止する必要がある場合には、上記細胞のうちのいくらかまたは全てを除去する機構により、提供され得る。これらの細胞は、全てのTCRを発現する改変されたT細胞に関して使用され得るか、または上記細胞は、致死的なオンターゲットオフ臓器毒性を以前に引き起こしたことがあるかまたは引き起こすリスクがある抗原に対してTCRが向けられた場合に、迅速に治療を終える選択肢が必要である場合に、この能力が提供され得る。
PRAME標的化TCRを発現する改変された細胞は、患者が負の効果を経験し、処置を減らすかまたは停止する必要がある場合には、上記細胞のうちのいくらかまたは全てを除去する機構により、提供され得る。これらの細胞は、全てのTCRを発現する改変されたT細胞に関して使用され得るか、または上記細胞は、致死的なオンターゲットオフ臓器毒性を以前に引き起こしたことがあるかまたは引き起こすリスクがある抗原に対してTCRが向けられた場合に、迅速に治療を終える選択肢が必要である場合に、この能力が提供され得る。
上記改変された細胞において発現され得るキメラポリペプチドの一例は、本実施例において提供される。これらの例において、単一のポリペプチドは、核酸ベクターによってコードされる。誘導性カスパーゼ-9ポリペプチドは、ペプチド結合のスキッピングに起因して、翻訳中にCARポリペプチドから分離される(Donnelly, ML 2001, J. Gen. Virol. 82:1013-25)。
(ベクター構築および発現の確認)
ヒトT細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示される。ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)(例えば、FKBP12v36などの)に融合された改変されたヒトカスパーゼ-9活性を含む、治療剤としての使用に適した発現ベクターを、構築した。このカスパーゼ-9/FK506ハイブリッド活性は、小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ-9活性の全長、短縮型および改変バージョンを、リガンド結合ドメインまたは多量体化領域に融合し、蛍光マーカーGFPの発現をも可能にするレトロウイルスベクターMSCV.IRES.GRPへと挿入した。
ヒトT細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示される。ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)(例えば、FKBP12v36などの)に融合された改変されたヒトカスパーゼ-9活性を含む、治療剤としての使用に適した発現ベクターを、構築した。このカスパーゼ-9/FK506ハイブリッド活性は、小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ-9活性の全長、短縮型および改変バージョンを、リガンド結合ドメインまたは多量体化領域に融合し、蛍光マーカーGFPの発現をも可能にするレトロウイルスベクターMSCV.IRES.GRPへと挿入した。
全長の誘導性カスパーゼ-9分子(F’-F-C-Casp9)は、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Serリンカーで、カスパーゼ分子の小サブユニットおよび大サブユニットに連結された、2個、3個、またはこれより多くのFK506結合タンパク質(FKBP-例えば、FKBP12v36バリアント)を含む。全長の誘導性カスパーゼ-9(F’F-C-Casp9.I.GFP)は、全長カスパーゼ-9を有し、F36V変異を含む2個の12kDa ヒトFK506結合タンパク質(FKBP12; GenBank AH002 818)に連結されたカスパーゼ補充ドメイン(caspase recruitment domain)(CARD; GenBank NM001 229)をも含む。上記FKBP(F’)のうちの1個もしくはこれより多くのアミノ酸配列は、レトロウイルスにおいて発現される場合に相同組換えを防止するために、コドン揺らぎがあった(例えば、各アミノ酸コドンの3番目のヌクレオチドが、本来コードされるアミノ酸を維持するサイレント変異によって変化されていた)。F’F-C-Casp9C3Sは、その活性化部位を破壊する287位でのシステインからセリンへの変異を含む。構築物F’F-Casp9、F-C-Casp9、およびF’-Casp9において、カスパーゼ活性化ドメイン(CARD)、1個のFKBP、または両方のいずれかを、それぞれ、欠失さた。全ての構築物を、EcoRI-XhoIフラグメントとしてMSCV.IRES.GFPへとクローニングした。
トランスフェクトされた293T細胞での予測されるサイズの誘導性カスパーゼ-9構築物とマーカー遺伝子GFPとの共発現は、全長および短縮型のカスパーゼ分子の両方に存在するアミノ酸残基299~318に特異的なカスパーゼ-9抗体、ならびにGFP特異的抗体を使用するウェスタンブロットによって示された。
最初のスクリーニングは、形質導入された細胞が導入遺伝子の基底活性によって排除されることに恐らく起因して、全長iCasp9がT細胞において高レベルで安定して維持できないことを示した。上記CARDドメインは、アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子1(Apaf-1)とのシトクロムCおよびアデノシン三リン酸(ATP)駆動性相互作用によって、カスパーゼ-9分子の生理学的二量体化に関与する。CIDを使用して、自殺スイッチの二量体化および活性化を誘導することから、CARDドメインの機能は、この状況では不要であり、CARDドメインの除去を、基底活性を減少させるための方法として調査した。
(iCasp9自殺遺伝子を使用して、半合致(haploidentical)幹細胞移植後に同種枯渇されたT細胞の安全性を改善する)
半合致幹細胞移植後に同種枯渇されたT細胞の安全性を改善するための発現構築物および発現構築物を使用するための方法が、本実施例において示される。類似の方法が、同種枯渇されていない細胞においてカスパーゼ-9発現構築物を発現させるために使用され得る。iCasp9および選択マーカー(短縮型CD19)をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーT細胞のための安全スイッチとして作製した。(抗CD25免疫毒素を使用する)同種枯渇後ですら、ドナーT細胞は、効率的に形質導入、拡大、およびその後、CD19免疫磁性選択によって>90%純度へと富化できた。その操作された細胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、制御性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。小分子二量体化剤でのiCasp9の活性化は、>90%のアポトーシスを迅速に生じた。導入遺伝子発現は静止期T細胞においてダウンレギュレートされたが、iCasp9は、発現が活性化(同種反応性)T細胞において迅速にアップレギュレートされたので、効率的自殺遺伝子を保持した。
半合致幹細胞移植後に同種枯渇されたT細胞の安全性を改善するための発現構築物および発現構築物を使用するための方法が、本実施例において示される。類似の方法が、同種枯渇されていない細胞においてカスパーゼ-9発現構築物を発現させるために使用され得る。iCasp9および選択マーカー(短縮型CD19)をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーT細胞のための安全スイッチとして作製した。(抗CD25免疫毒素を使用する)同種枯渇後ですら、ドナーT細胞は、効率的に形質導入、拡大、およびその後、CD19免疫磁性選択によって>90%純度へと富化できた。その操作された細胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、制御性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。小分子二量体化剤でのiCasp9の活性化は、>90%のアポトーシスを迅速に生じた。導入遺伝子発現は静止期T細胞においてダウンレギュレートされたが、iCasp9は、発現が活性化(同種反応性)T細胞において迅速にアップレギュレートされたので、効率的自殺遺伝子を保持した。
(材料および方法)
(同種枯渇されたT細胞の生成)
同種枯渇された細胞を、以前に示されたように健常志願者から生成した。簡潔には、健常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、無血清培地(AIM V; Invitrogen, Carlsbad, CA)中で40:1のレスポンダー 対 スティミュレーター比において、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換リンパ芽球細胞株(LCL)とともに共培養した。72時間後、CD25を発現する活性化T細胞は、RFT5-SMPT-dgA免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているCD3+CD25+集団が<1%であり、3H-チミジン組み込みによる残りの増殖が<10%である場合に適切であるとみなした。
(同種枯渇されたT細胞の生成)
同種枯渇された細胞を、以前に示されたように健常志願者から生成した。簡潔には、健常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、無血清培地(AIM V; Invitrogen, Carlsbad, CA)中で40:1のレスポンダー 対 スティミュレーター比において、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換リンパ芽球細胞株(LCL)とともに共培養した。72時間後、CD25を発現する活性化T細胞は、RFT5-SMPT-dgA免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているCD3+CD25+集団が<1%であり、3H-チミジン組み込みによる残りの増殖が<10%である場合に適切であるとみなした。
(プラスミドおよびレトロウイルス)
SFG.iCasp9.2A.CD19は、切断可能な2A様配列を介して短縮型ヒトCD19へと連結された誘導性カスパーゼ-9(iCasp9)からなる。iCasp9は、Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを介してヒトカスパーゼ-9(CASP9; GenBank NM 001229)へと接続された、F36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12; GenBank AH002 818)からなる。このF36V変異は、合成ホモ二量体化剤AP20187またはAP1903へのFKBP12の結合親和性を増大させる。カスパーゼ補充ドメイン(CARD)を、ヒトカスパーゼ-9配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、FKBP12によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この2A様配列は、Thosea asigna昆虫ウイルス由来の20アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での>99%の切断を媒介して、iCasp9のC末端に19個の追加のアミノ酸およびCD19のN末端に1つの追加のプロリン残基をもたらす。CD19は、アミノ酸333(TDPTRRF)で短縮された全長CD19(GenBank NM 001770)からなり、これは、242から19個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸化の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
SFG.iCasp9.2A.CD19は、切断可能な2A様配列を介して短縮型ヒトCD19へと連結された誘導性カスパーゼ-9(iCasp9)からなる。iCasp9は、Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを介してヒトカスパーゼ-9(CASP9; GenBank NM 001229)へと接続された、F36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12; GenBank AH002 818)からなる。このF36V変異は、合成ホモ二量体化剤AP20187またはAP1903へのFKBP12の結合親和性を増大させる。カスパーゼ補充ドメイン(CARD)を、ヒトカスパーゼ-9配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、FKBP12によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この2A様配列は、Thosea asigna昆虫ウイルス由来の20アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での>99%の切断を媒介して、iCasp9のC末端に19個の追加のアミノ酸およびCD19のN末端に1つの追加のプロリン残基をもたらす。CD19は、アミノ酸333(TDPTRRF)で短縮された全長CD19(GenBank NM 001770)からなり、これは、242から19個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸化の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
テナガザル白血病ウイルス(Gal-V)偽型レトロウイルスを生成する安定なPG13クローンを、Phoenix Eco細胞株(ATCC製品#SD3444; ATCC, Manassas, VA)をSFG.iCasp9.2A.CD19で一過性にトランスフェクトすることによって作製した。これは、Eco偽型レトロウイルスを生成した。PG13パッケージング細胞株(ATCC)を、Eco偽型化もしくはレトロウイルスで3回形質導入して、1細胞あたり複数のSFG.iCasp9.2A.CD19プロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生じたPG13クローンを増やし、ベクター生成のために使用した。
(レトロウイルス形質導入)
T細胞活性化および拡大のための培養培地は、45% RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT)、45% クリック(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)および10% ウシ胎仔血清(FBS; Hyclone)からなった。同種枯渇された細胞を、レトロウイルスベクターでの形質導入前に、48時間にわたって固定化抗CD3(OKT3; Ortho Biotech, Bridgewater, NJ)によって活性化した。選択的同種枯渇を、ドナーPBMCとレシピエントEBV-LCLとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性化した:活性化した細胞は、CD25を発現し、その後、抗CD25免疫毒素によって排除した。この同種枯渇された細胞を、OKT3によって活性化し、レトロウイルスベクターで48時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の4日目に行った;陽性画分を、さらに4日間増やし、凍結保存した。
T細胞活性化および拡大のための培養培地は、45% RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT)、45% クリック(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)および10% ウシ胎仔血清(FBS; Hyclone)からなった。同種枯渇された細胞を、レトロウイルスベクターでの形質導入前に、48時間にわたって固定化抗CD3(OKT3; Ortho Biotech, Bridgewater, NJ)によって活性化した。選択的同種枯渇を、ドナーPBMCとレシピエントEBV-LCLとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性化した:活性化した細胞は、CD25を発現し、その後、抗CD25免疫毒素によって排除した。この同種枯渇された細胞を、OKT3によって活性化し、レトロウイルスベクターで48時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の4日目に行った;陽性画分を、さらに4日間増やし、凍結保存した。
小規模実験では、組織培養用の処理が行われていない24ウェルプレート(Becton Dickinson, San Jose, CA)を、OKT3 1g/mlで2~4時間、37℃においてコーティングした。同種枯渇された細胞を、1×106 細胞/ウェルで添加した。24時間で、100U/mlの組換えヒトインターロイキン-2(IL-2)(Proleukin; Chiron, Emeryville, CA)を添加した。レトロウイルス形質導入を、活性化の48時間後に行った。組織培養用の処理が行われていない24ウェルプレートを、3.5ug/cm2 組換えフィブロネクチンフラグメント(CH-296; Retronectin; Takara Mirus Bio, Madison, WI)でコーティングし、そのウェルに、0.5ml/ウェルにおいてレトロウイルスベクター含有上清を、30分間、37℃において2回負荷した。その後、OKT3活性化細胞を、3:1の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有上清およびT細胞培養培地(100U/ml IL-2を補充)中で、5×105 細胞/ウェルにおいてプレーティングした。細胞を2~3日後に採取し、50U/ml IL-2の存在下で増やした。
(遺伝子改変同種枯渇細胞のスケールアップ生成)
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、組織培養用の処理が行われていないT75フラスコ(Nunc, Rochester, NY)を使用し、これを、一晩4℃において、10mlのOKT3 1μg/mlまたは10mlのフィブロネクチン 7μg/mlでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ(2PF-0072AC, American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD)も使用した。同種枯渇された細胞を、1×106 細胞/mlでOKT3コーティングフラスコの中に播種した。100U/ml IL-2を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンコーティングフラスコまたはバッグに、10mlのレトロウイルス含有上清を2~3時間にわたって1回負荷した。OKT3活性化T細胞を、3:1の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびT細胞培養培地(100 U/ml IL-2を補充)中、1×106 細胞/mlで播種した。翌朝に細胞を採取し、約50~100U/mlの間のIL-2で補充した培養培地中、約5×105 細胞/ml~8×105 細胞/mlの間の播種密度で組織培養用に処理したT75またはT175フラスコの中で増やした。
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、組織培養用の処理が行われていないT75フラスコ(Nunc, Rochester, NY)を使用し、これを、一晩4℃において、10mlのOKT3 1μg/mlまたは10mlのフィブロネクチン 7μg/mlでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ(2PF-0072AC, American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD)も使用した。同種枯渇された細胞を、1×106 細胞/mlでOKT3コーティングフラスコの中に播種した。100U/ml IL-2を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンコーティングフラスコまたはバッグに、10mlのレトロウイルス含有上清を2~3時間にわたって1回負荷した。OKT3活性化T細胞を、3:1の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびT細胞培養培地(100 U/ml IL-2を補充)中、1×106 細胞/mlで播種した。翌朝に細胞を採取し、約50~100U/mlの間のIL-2で補充した培養培地中、約5×105 細胞/ml~8×105 細胞/mlの間の播種密度で組織培養用に処理したT75またはT175フラスコの中で増やした。
(CD19免疫磁性選択)
CD19に関する免疫磁性選択を、形質導入の4日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)で標識し、小規模実験ではMSもしくはLSカラム上で、および大規模実験ではCliniMacs Plus自動化選択デバイスで選択した。CD19選択した細胞を、さらに4日間増やし、形質導入後の8日目に凍結保存した。これらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」とよんだ。
CD19に関する免疫磁性選択を、形質導入の4日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)で標識し、小規模実験ではMSもしくはLSカラム上で、および大規模実験ではCliniMacs Plus自動化選択デバイスで選択した。CD19選択した細胞を、さらに4日間増やし、形質導入後の8日目に凍結保存した。これらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」とよんだ。
(免疫表現型決定およびペンタマー分析)
フローサイトメトリー分析(FACSCaliburおよびCellQuestソフトウェア; Becton Dickinson)を、以下の抗体を使用して行った:CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD56およびCD62L。CD19-PE(Clone 4G7; Becton Dickinson)は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、CD19に関する陰性ゲートを設定した。HLA-ペンタマー、HLA-B8-RAKFKQLL(Proimmune, Springfield, VA)を使用して、EBV溶解抗原(BZLF1)のエピトープを認識するT細胞を検出した。HLA-A2-NLVPMVATVペンタマーを使用して、CMV-pp65抗原のエピトープを認識するT細胞を検出した。
フローサイトメトリー分析(FACSCaliburおよびCellQuestソフトウェア; Becton Dickinson)を、以下の抗体を使用して行った:CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD56およびCD62L。CD19-PE(Clone 4G7; Becton Dickinson)は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、CD19に関する陰性ゲートを設定した。HLA-ペンタマー、HLA-B8-RAKFKQLL(Proimmune, Springfield, VA)を使用して、EBV溶解抗原(BZLF1)のエピトープを認識するT細胞を検出した。HLA-A2-NLVPMVATVペンタマーを使用して、CMV-pp65抗原のエピトープを認識するT細胞を検出した。
(二量体化の化学的誘導物質、AP20187でのアポトーシスの誘導)
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、AP20187(Ariad Pharmaceuticals; Cambridge, MA)をCD19免疫磁性選択の翌日に10nM 終濃度で添加することによって評価した。AP1903も使用され得る。細胞を、24時間でアネキシンVおよび7-アミノアクチノマイシン(7-AAD)(BD Pharmingen)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンVおよび7-AADの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネキシンV陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンVおよび7-AADの両方に陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導されるパーセンテージ殺滅を、以下のとおり、ベースラインの生存率に関して較正した:パーセンテージ殺滅=100%-(AP20187処理細胞の%生存率÷非処理細胞の%生存率)。
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、AP20187(Ariad Pharmaceuticals; Cambridge, MA)をCD19免疫磁性選択の翌日に10nM 終濃度で添加することによって評価した。AP1903も使用され得る。細胞を、24時間でアネキシンVおよび7-アミノアクチノマイシン(7-AAD)(BD Pharmingen)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンVおよび7-AADの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネキシンV陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンVおよび7-AADの両方に陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導されるパーセンテージ殺滅を、以下のとおり、ベースラインの生存率に関して較正した:パーセンテージ殺滅=100%-(AP20187処理細胞の%生存率÷非処理細胞の%生存率)。
(長期培養および再活性化後の導入遺伝子発現の評価)
細胞を、形質導入の22日後まで、50U/ml IL-2を含むT細胞培地中で維持した。細胞の一部を、1g/ml OKT3および1μg/ml 抗CD28(Clone CD28.2, BD Pharmingen, San Jose, CA)で48~72時間コーティングした24ウェルプレートにおいて再活性化した。再活性化細胞および非再活性化細胞の両方でのCD19発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の24日目または25日目に測定した。
細胞を、形質導入の22日後まで、50U/ml IL-2を含むT細胞培地中で維持した。細胞の一部を、1g/ml OKT3および1μg/ml 抗CD28(Clone CD28.2, BD Pharmingen, San Jose, CA)で48~72時間コーティングした24ウェルプレートにおいて再活性化した。再活性化細胞および非再活性化細胞の両方でのCD19発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の24日目または25日目に測定した。
いくつかの実験では、細胞をまた、形質導入後3週間培養し、1:1レスポンダー:スティミュレーター比において、30Gガンマ線照射同種異系PBMCで刺激した。共培養の4日後、細胞の一部を、10nM AP20187で処理した。殺滅を、24時間でのアネキシンV/7-AAD染色によって測定し、傍観者(bystander)ウイルス特異的T細胞に対する二量体化剤の効果を、AP20187処理細胞および未処理細胞においてペンタマー分析によって評価した。
自殺遺伝子改変T細胞の免疫学的応答能を維持するための最適な培養条件を、安全スイッチ、選択マーカーおよび細胞タイプの各組み合わせに関して決定して定義しなければならない。なぜなら表現型、レパートリーおよび機能性は、全て、ポリクローナルT細胞活性化のために使用される刺激、形質導入細胞の選択のための方法、および培養の継続時間によって影響を受け得るからである。
(半合致幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ-9自殺遺伝子で形質導入した同種枯渇T細胞のフェーズI臨床試験)
この例は、代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ1臨床試験の結果を示す。簡潔には、ドナー末梢血単核細胞を、レシピエントの照射EBV形質転換リンパ芽球細胞とともに(40:1)72時間共培養し、CD25免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、iCasp9自殺遺伝子および選択マーカー(ΔCD19)を有するレトロウイルス上清で形質導入した;ΔCD19は、免疫磁性選択を介して>90%純度への富化を可能にした。
この例は、代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ1臨床試験の結果を示す。簡潔には、ドナー末梢血単核細胞を、レシピエントの照射EBV形質転換リンパ芽球細胞とともに(40:1)72時間共培養し、CD25免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、iCasp9自殺遺伝子および選択マーカー(ΔCD19)を有するレトロウイルス上清で形質導入した;ΔCD19は、免疫磁性選択を介して>90%純度への富化を可能にした。
細胞療法生成物の生成のためのプロトコルの一例は、本明細書で提供される。
(原材料)
末梢血の240mlまで(2回の収集にて)を、確立されたプロトコルに従って移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球フェレーシス(leukopheresis)を行って、十分なT細胞を単離した。10~30ccの血液をまた、レシピエントから採血し、刺激細胞として使用されるエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換リンパ芽球細胞株を生成するために使用した。場合によっては、医療履歴および/または低いB細胞数の徴候に依存して、LCLを、適切な第1度近親者(例えば、親、きょうだい、もしくは子孫)の末梢血単核細胞を使用して生成した。
末梢血の240mlまで(2回の収集にて)を、確立されたプロトコルに従って移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球フェレーシス(leukopheresis)を行って、十分なT細胞を単離した。10~30ccの血液をまた、レシピエントから採血し、刺激細胞として使用されるエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換リンパ芽球細胞株を生成するために使用した。場合によっては、医療履歴および/または低いB細胞数の徴候に依存して、LCLを、適切な第1度近親者(例えば、親、きょうだい、もしくは子孫)の末梢血単核細胞を使用して生成した。
(同種枯渇された細胞の生成)
同種枯渇された細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)を、無血清培地(AIM V; Invitrogen, Carlsbad, CA)中40:1のレスポンダー対スティミュレーター比において、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換リンパ芽球細胞株(LCL)とともに共培養した。72時間後、CD25を発現する活性化T細胞を、RFT5-SMPT-dgA免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのCD3+CD25+集団が<1%であり、3H-チミジン組み込みによる残りの増殖が<10%であった場合に、適切であるとみなす。
同種枯渇された細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)を、無血清培地(AIM V; Invitrogen, Carlsbad, CA)中40:1のレスポンダー対スティミュレーター比において、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換リンパ芽球細胞株(LCL)とともに共培養した。72時間後、CD25を発現する活性化T細胞を、RFT5-SMPT-dgA免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのCD3+CD25+集団が<1%であり、3H-チミジン組み込みによる残りの増殖が<10%であった場合に、適切であるとみなす。
(レトロウイルス生成)
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、iCasp9-ΔCD19構築物のために生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびマイコプラズマ、HIV、HBV、HCVなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、-80℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス(Replication Competent Retrovirus)(RCR)を除外し、分析証明書を発行した。
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、iCasp9-ΔCD19構築物のために生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびマイコプラズマ、HIV、HBV、HCVなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、-80℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス(Replication Competent Retrovirus)(RCR)を除外し、分析証明書を発行した。
(同種枯渇された細胞の形質導入)
同種枯渇されたTリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントCH-296(RetronectinTM, Takara Shuzo, Otsu, Japan)でコーティングした。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグの中でプロデューサー上清をインキュベートすることによってレトロネクチンに付着させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、プロトコルに従って、同種枯渇されたT細胞を、これらにIL-2を1週間に2回供給して増やして、十分な細胞数に到達させた。
同種枯渇されたTリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントCH-296(RetronectinTM, Takara Shuzo, Otsu, Japan)でコーティングした。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグの中でプロデューサー上清をインキュベートすることによってレトロネクチンに付着させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、プロトコルに従って、同種枯渇されたT細胞を、これらにIL-2を1週間に2回供給して増やして、十分な細胞数に到達させた。
(CD19免疫磁性選択)
CD19に関する免疫磁性選択を、形質導入の4日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)で標識し、CliniMacs Plus自動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、CliniMacs選択後に凍結保存するか、またはIL-2でさらに増やして形質導入後の6日目または8日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
CD19に関する免疫磁性選択を、形質導入の4日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)で標識し、CliniMacs Plus自動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、CliniMacs選択後に凍結保存するか、またはIL-2でさらに増やして形質導入後の6日目または8日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
(凍結)
細胞のアリコートを、FDAによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
細胞のアリコートを、FDAによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
(研究薬物)
(RFT5-SMPT-dgA)
RFT5-SMPT-dgAは、ヘテロ--二官能性架橋剤[N-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-d-(2-ピリジルチオ)トルエン](SMPT)を介して化学的に脱グリコシル化したリシンA鎖(dgA)に結合体化されたマウスIgG1 抗CD25(IL-2レセプターα鎖)である。RFT5-SMPT-dgAを、0.5mg/mlで滅菌溶液として製剤化する。
(RFT5-SMPT-dgA)
RFT5-SMPT-dgAは、ヘテロ--二官能性架橋剤[N-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-d-(2-ピリジルチオ)トルエン](SMPT)を介して化学的に脱グリコシル化したリシンA鎖(dgA)に結合体化されたマウスIgG1 抗CD25(IL-2レセプターα鎖)である。RFT5-SMPT-dgAを、0.5mg/mlで滅菌溶液として製剤化する。
(合成ホモ二量体化剤AP1903)
作用機構:AP1903誘導可能細胞死は、ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト(カスパーゼ-9プロテイン)レセプター(これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する)の細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、FKBPドメインを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するAP1903の投与まで細胞内で静止したままである。
作用機構:AP1903誘導可能細胞死は、ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト(カスパーゼ-9プロテイン)レセプター(これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する)の細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、FKBPドメインを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するAP1903の投与まで細胞内で静止したままである。
毒物学:AP1903は、FDAによって治験薬(IND)として評価されており、フェーズI臨床安全性研究を成功裡に終えた。API903を0.01mg/kg~1.0mg/kg 用量範囲にわたって投与した場合に、重大な有害作用は注記されなかった。
薬理学/薬物動態:患者に、0.4mg/kgのAP1903を、2時間注入として(0.01mg/kg~1.0mg/kg用量範囲にわたって10ng/mL~I275ng/mLの血漿濃度を示し、投与後0.5時間および2時間において最大の18%および7%へと低下する血漿レベルを伴う公開されたPKデータに基づいて)与えた。
ヒトにおける副作用プロファイル:志願者でのフェーズ1研究の間には、重篤な有害事象は起こらなかった。有害事象の発生率は、各処置後に非常に低く、全ての有害事象は、重症度が軽度であった。唯一の有害事象は、おそらくAPI903に関連していると考えられた。これは、1.0mg/kg API903投与量で1名の志願者について「顔面紅潮」として示された血管拡張というエピソードであった。この事象は、注入の開始後3分で起こり、32分の継続後に解決した。この研究の間に報告された全ての他の有害事象は、研究者によって研究薬物には関連しないかまたは関連性がありそうもないと考えられた。これらの事象は、胸痛、インフルエンザ様症状(flu syndrome)、口臭、頭痛、注射部位疼痛、血管拡張、増大した咳嗽、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出血を含んだ。
グレード1 GvHDを発症している患者を、2時間注入として、0.4mg/kg AP1903で処置した。グレード1 GvHD患者へのAP1903の投与プロトコルを、以下のとおり確立した。同種枯渇されたT細胞の注入後にGvHDを発症している患者を生検して診断を確定し、0.4mg/kgのAP1903を2時間の注入として与える。グレードI GvHDを有する患者は、他の治療を最初に何も受けなかったが、彼らがGvHDの進行を示した場合、従来のGvHD治療を、規制ガイドラインに従って施した。グレード2~4 GvHDを発症している患者に、規制ガイドラインに従って、AP1903二量体化剤薬物に加えて、標準的な全身免疫抑制治療を施した。
調製および注入の指示:注射用AP1903を、3ml バイアル中、5mg/mlの濃度の2.33mlの濃縮溶液(すなわち、10.66mg/バイアル)として得る。投与前に、その計算した用量を、注入用0.9% ノーマルセーライン中で100mLへと希釈した。100ml容積中の注射用AP1903(0.4mg/kg)を、非DEHP、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、2時間かけてIV注入を介して投与した。
iCasp9自殺遺伝子発現構築物(例えば、SFG.iCasp9.2A.ΔCD19)は、切断可能な2A様配列を介して短縮型ヒトCD19(ΔCD19)へと連結した誘導性カスパーゼ-9(iCasp9)からなる。iCasp9は、Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyリンカーを介してヒトカスパーゼ-9(CASP9; GenBank NM 001229)へと接続されたF36V変異を有するヒトFK506結合タンパク質(FKBP12; GenBank AH002 818)を含む。このF36V変異は、合成ホモ二量体化剤AP20187またはAPI903に対するFKBP12の結合親和性を増大させ得る。このカスパーゼ補充ドメイン(CARD)は、ヒトカスパーゼ-9配列から欠失されており、その生理学的機能は、FKBP12によって置き換えられている。CARDをFKBP12で置き換えると、導入遺伝子発現および機能が増大する。上記2A様配列は、Thosea Asigna昆虫ウイルス由来の18アミノ酸のペプチドをコードし、それはグリシンと末端プロリン残基との間で>99%切断を媒介し、iCasp9のC末端において17個の追加のアミノ酸およびCD19のN末端において1個の追加のプロリン残基をもたらす。ΔCD19は、アミノ酸333(TDPTRRF)で短縮された全長CD19(GenBank NM 001770)からなり、これは、242から19個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸化の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
(インビボ研究)
3名の患者に、ハプロ-CD34+幹細胞移植(SCT)後に、約1×106~約3×106 細胞/kgの間の用量レベルでiCasp9+ T細胞を与えた。
3名の患者に、ハプロ-CD34+幹細胞移植(SCT)後に、約1×106~約3×106 細胞/kgの間の用量レベルでiCasp9+ T細胞を与えた。
注入したT細胞を、170±5の最大倍数拡大(maximum fold expansion)(注入後29±9日目)とともに、注入後7日目ほどの早さで、フローサイトメトリー(CD3+ ΔCD19+)またはqPCRによってインビボで検出した。2名の患者は、グレードI/II aGvHDを発症し、AP1903投与は、注入の30分以内に、CD3+ ΔCD19+細胞の>90%除去(24時間以内にさらなる対数減少を伴う)、および24時間以内の皮膚および肝臓のaGvHDの消散を引き起こし、iCasp9導入遺伝子がインビボで機能することを示した。
エキソビボ実験は、このデータを確認した。さらに、残っている同種枯渇されたT細胞は、拡大でき、ウイルス(CMV)および真菌(Aspergillus fumigatus)に対して反応性であった(IFN-γ生成)。これらのインビボ研究は、二量体化剤薬物の単一用量が、GvHDを引き起こすT細胞の部分集団を減少または排除し得るが、ウイルス特異的CTL(これは、次いで、再拡大し得る)を残し得ることを見出した。
(免疫再構築)
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再構築研究(免疫表現型決定、T細胞およびB細胞機能)は、移植後一連の間隔で得られ得る。iカスパーゼ形質導入同種枯渇T細胞から生じる免疫再構築を測定するいくつかのパラメーターを分析する。この分析は、全リンパ球数、T細胞およびCD19 B細胞の数の反復測定、ならびにT細胞サブセット(CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD27、CD28、CD44、CD62L、CCR7、CD56、CD45RA、CD45RO、α/βおよびγ/δT細胞レセプター)のFACS分析を含む。患者T細胞の利用可能性に依存して、T調節性細胞マーカー(例えば、CD41CD251FoxP3)もまた分析する。可能な場合には、注入の4時間後、1ヶ月間毎週、毎月×9ヶ月間、および次に1年でおよび2年で、およそ10~60mlの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの1回の血液採取時にも(臨床上のケアおよび研究評価のために血液が採取されることを考慮して)全体で1~2cc/kgを超えない。
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再構築研究(免疫表現型決定、T細胞およびB細胞機能)は、移植後一連の間隔で得られ得る。iカスパーゼ形質導入同種枯渇T細胞から生じる免疫再構築を測定するいくつかのパラメーターを分析する。この分析は、全リンパ球数、T細胞およびCD19 B細胞の数の反復測定、ならびにT細胞サブセット(CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD27、CD28、CD44、CD62L、CCR7、CD56、CD45RA、CD45RO、α/βおよびγ/δT細胞レセプター)のFACS分析を含む。患者T細胞の利用可能性に依存して、T調節性細胞マーカー(例えば、CD41CD251FoxP3)もまた分析する。可能な場合には、注入の4時間後、1ヶ月間毎週、毎月×9ヶ月間、および次に1年でおよび2年で、およそ10~60mlの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの1回の血液採取時にも(臨床上のケアおよび研究評価のために血液が採取されることを考慮して)全体で1~2cc/kgを超えない。
同種枯渇されていないトランスフェクトまたは形質転換されたT細胞の投与
PRAME特異的TCRおよび誘導性カスパーゼポリペプチドを発現するT細胞の生成および投与のための本明細書で提供されるプロトコルはまた、インビボでのT細胞同種枯渇(allodepletion)を、必要であれば、患者が毒性の症候を示した後に提供するように改変され得る。このアプローチを、急性GvHDなしで免疫再構築から利益を受け得る被験体のより大きな群へと拡大するために、上記プロトコルは、インビボでのT細胞枯渇方法を提供することによって簡略化され得る。予備処置の同種枯渇法において、本明細書で論じられるように、EBV形質転換リンパ芽球様細胞株を、レシピエントからまず調製し、次いで、それは、同種抗原提示細胞として働く。この手順には、8週間までかかり得、悪性腫瘍を有する広範囲に予備処置した被験体において、特に彼らが最初の治療の構成要素としてリツキシマブを受けたことがある場合、失敗し得る。その後、ドナーT細胞を、レシピエントEBV-LCLとともに共培養し、同種反応性T細胞(これは、活性化抗原CD25を発現する)を、次に、CD25-リシン結合体化モノクローナル抗体で処理する。この手順は、各被験体に関しさらに多くの日数の実験作業がかかり得る。
PRAME特異的TCRおよび誘導性カスパーゼポリペプチドを発現するT細胞の生成および投与のための本明細書で提供されるプロトコルはまた、インビボでのT細胞同種枯渇(allodepletion)を、必要であれば、患者が毒性の症候を示した後に提供するように改変され得る。このアプローチを、急性GvHDなしで免疫再構築から利益を受け得る被験体のより大きな群へと拡大するために、上記プロトコルは、インビボでのT細胞枯渇方法を提供することによって簡略化され得る。予備処置の同種枯渇法において、本明細書で論じられるように、EBV形質転換リンパ芽球様細胞株を、レシピエントからまず調製し、次いで、それは、同種抗原提示細胞として働く。この手順には、8週間までかかり得、悪性腫瘍を有する広範囲に予備処置した被験体において、特に彼らが最初の治療の構成要素としてリツキシマブを受けたことがある場合、失敗し得る。その後、ドナーT細胞を、レシピエントEBV-LCLとともに共培養し、同種反応性T細胞(これは、活性化抗原CD25を発現する)を、次に、CD25-リシン結合体化モノクローナル抗体で処理する。この手順は、各被験体に関しさらに多くの日数の実験作業がかかり得る。
上記プロセスは、二量体化剤薬物による同種反応性T細胞の観察されたインビボでの迅速な枯渇および刺激されていないがウイルス/真菌反応性T細胞の節約に基づいて、インビボでの同種枯渇方法を使用することによって簡略化され得る。
グレードIもしくはこれより高い急性GvHDまたは他の毒性事象の発生が存在する場合、二量体化剤薬物の単一用量を、例えば、2時間の静脈内注入として、0.4mg/kgのAP1903の用量で投与する。二量体化剤薬物のさらなる最大3用量を、急性GvHDが持続する場合に48時間間隔で投与し得る。グレードIIもしくはこれより高い急性GvHDを有する被験体において、二量体化剤薬物のこれらのさらなる用量は、ステロイドと併用され得る。上記二量体化剤に対するグレードIIIもしくはIVの反応に起因して、上記二量体化剤のさらなる用量を受けられない、持続するGVHDを有する患者に関して、上記患者は、上記二量体化剤の0または1用量のいずれかの後に、ステロイドのみで処置され得る。
治療用T細胞の生成
240mlまで(2回の収集で)の末梢血を、調達の同意(procurement consent)に従って移植ドナーから得る。必要であれば、白血球搬出を使用して、十分なT細胞を得る;(幹細胞動員の前またはG-CSFの最後の用量の7日後のいずれか)。余分な10~30mlの血液をまた、感染症(例えば、肝炎およびHIV)について検査するために収集してよい。
240mlまで(2回の収集で)の末梢血を、調達の同意(procurement consent)に従って移植ドナーから得る。必要であれば、白血球搬出を使用して、十分なT細胞を得る;(幹細胞動員の前またはG-CSFの最後の用量の7日後のいずれか)。余分な10~30mlの血液をまた、感染症(例えば、肝炎およびHIV)について検査するために収集してよい。
末梢血単核細胞を、0日目に抗ヒトCD3抗体(例えば、OrthotechまたはMiltenyi製)を使用して活性化し、2日目に組換えヒトインターロイキン-2(rhIL-2)の存在下で拡大する。CD3抗体活性化T細胞を、組換えフィブロネクチンフラグメントCH-296(RetronectinTM, Takara Shuzo, Otsu, Japan)でコーティングしたフラスコまたはプレート上で、iカスパーゼ-9レトロウイルスベクターによって形質導入する。ウイルスを、レトロネクチンコーティングしたプレートまたはフラスコ中でプロデューサー上清をインキュベートすることによって、レトロネクチンに付着させる。次いで、細胞を、ウイルスをコーティングした組織培養デバイスに移す。形質導入後、T細胞を、プロトコルに従って、十分な細胞数に達するように、それらにrhIL-2を1週間に2回供給することによって拡大する。
注入されるT細胞のうちの大部分が自殺遺伝子を有することを担保するために、選択マーカー、切断型ヒトCD19(ΔCD19)および市販の選択デバイスを使用して、形質導入された細胞を>90%純度になるように選択し得る。CD19の免疫磁性選択を、形質導入後4日間行い得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトCD19抗体(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)に結合体化した常磁性マイクロビーズで標識し、CliniMacs Plus自動化選択デバイスで選択する。臨床注入に必要とされる細胞の数に依存して、細胞を、CliniMacs選択後に凍結保存し得るか、またはIL-2でさらに拡大し得、そして十分な細胞が拡大されたら直ぐに凍結保存し得る(生成開始から14日目まで)かのいずれかである。
細胞のアリコートを、FDAにより最終発売試験のために要求されるとおりの形質導入効率、同一性、表現型、自律的成長および微生物学的検査を試験するために除去し得る。この細胞を、投与する前に凍結保存する。
治療用T細胞の代替の生成
動員されていないT細胞の白血球搬出の前に、被験体の血球数および白血球百分率数を収集し、記録する。確立された規制ガイドラインに従う感染症モニタリングを行う。被験体は、白血球搬出を開始する前に、CBCおよび血小板に関する施設内基準を満たさなければならない。白血球画分を、標準化連続フロー遠心分離を使用して集める。被験体を、アフェレーシスの間にモニターする。およそ3~4血液容積までの標準的アフェレーシス手順を、白血病患者に対する基本的注意(precaution)を含め、施設内標準手順に従って処理する。処理される容積および白血球搬出の継続時間は、文書化して記録される。5×109 未満の単核細胞が集められる場合、医療モニターに助言を求める。
動員されていないT細胞の白血球搬出の前に、被験体の血球数および白血球百分率数を収集し、記録する。確立された規制ガイドラインに従う感染症モニタリングを行う。被験体は、白血球搬出を開始する前に、CBCおよび血小板に関する施設内基準を満たさなければならない。白血球画分を、標準化連続フロー遠心分離を使用して集める。被験体を、アフェレーシスの間にモニターする。およそ3~4血液容積までの標準的アフェレーシス手順を、白血病患者に対する基本的注意(precaution)を含め、施設内標準手順に従って処理する。処理される容積および白血球搬出の継続時間は、文書化して記録される。5×109 未満の単核細胞が集められる場合、医療モニターに助言を求める。
T細胞の投与
形質導入したT細胞を、幹細胞移植後から、例えば、30~120日間患者に投与する。凍結保存したT細胞を解凍し、ノーマルセーラインとともにカテーテルラインを通じて注入する。小児に関しては、前投薬の薬剤(premedication)が体重によって投与される。細胞の用量は、例えば、約1×104 細胞/Kg~1×108 細胞/kg、例えば、約1×105 細胞/Kg~1×107 細胞/kg、約1×106 細胞/Kg~5×106 細胞/kg、約1×104 細胞/Kg~5×106 細胞/kg、例えば、約1×104、約1×105、約2×105、約3×105、約5×105、6×105、約7×105、約8×105、約9×105、約1×106、約2×106、約3×106、約4×106、または約5×106 細胞/Kgの範囲であり得る
形質導入したT細胞を、幹細胞移植後から、例えば、30~120日間患者に投与する。凍結保存したT細胞を解凍し、ノーマルセーラインとともにカテーテルラインを通じて注入する。小児に関しては、前投薬の薬剤(premedication)が体重によって投与される。細胞の用量は、例えば、約1×104 細胞/Kg~1×108 細胞/kg、例えば、約1×105 細胞/Kg~1×107 細胞/kg、約1×106 細胞/Kg~5×106 細胞/kg、約1×104 細胞/Kg~5×106 細胞/kg、例えば、約1×104、約1×105、約2×105、約3×105、約5×105、6×105、約7×105、約8×105、約9×105、約1×106、約2×106、約3×106、約4×106、または約5×106 細胞/Kgの範囲であり得る
GvHDの処置
グレード≧1の急性GVHDを発症する患者は、2時間の注入として0.4mg/kg AP1903で処置する。注射用のAP1903は、例えば、3mlバイアル中、5mg/mlの濃度の2.33mlの濃縮溶液(すなわち、10.66mg/バイアル)として提供され得る。投与前に、計算した用量を、注入用の0.9% ノーマルセーライン中で100mLへと希釈する。100mlの容積中の注射用AP1903(0.4mg/kg)を、非DEHP、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、2時間にわたってIV注入を介して投与し得る。
サンプル処理スケジュール
グレード≧1の急性GVHDを発症する患者は、2時間の注入として0.4mg/kg AP1903で処置する。注射用のAP1903は、例えば、3mlバイアル中、5mg/mlの濃度の2.33mlの濃縮溶液(すなわち、10.66mg/バイアル)として提供され得る。投与前に、計算した用量を、注入用の0.9% ノーマルセーライン中で100mLへと希釈する。100mlの容積中の注射用AP1903(0.4mg/kg)を、非DEHP、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、2時間にわたってIV注入を介して投与し得る。
サンプル処理スケジュール
キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを使用して、アポトーシスを導入するための方法は、Malcolm K. BrennerらによるPCT出願番号PCT/US2011/037381(標題、Methods for Inducing Selective Apoptosis、2011年5月20日出願)およびMalcolm K. Brennerらによる米国特許出願第13/112,739号(標題、Methods for Inducing Selective Apoptosis、2011年5月20日出願)において論じられる。これら特許出願および刊行物は、全てそれらの全体において本明細書に参考として援用される。
本明細書で言及される各特許、特許出願、刊行物および文書の全体は、これによって本明細書に参考として援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であるということを許容するものでもなく、これら刊行物または文書の内容または日付に関するいかなる許容をも構成しない。それらの引用は、関連する開示の検索を示すものではない。文書の日付(複数可)または内容に関する全ての陳述は、入手可能な情報に基づき、それらの精度または正確さに関する許容ではない。
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、1つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント(複数可)の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「~を含む」、「~から本質的になる」および「~からなる」のいずれかは、他の2つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの1つまたはエレメントのうちの2つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「a」または「an」は、それが修飾するエレメントのうちの1つまたは複数のことを指し得る(例えば、「試薬(a reagent)」は、1つ以上の試薬を意味し得る)。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの10%以内の値(すなわち、プラスまたはマイナス10%)のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される(すなわち、「約1、2および3」は、約1、約2および約3のことを指す)。例えば、「約100グラム」という重量は、90グラム~110グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき(例えば、約50%、60%、70%、80%、85%または86%)、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値(例えば、54%、85.4%)が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
本技術のある種の実施形態は、以下の特許請求の範囲に示される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む;ならびに
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
(項目2)
前記第1のポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする;および
前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
項目1に記載の核酸分子。
(項目3)
前記第1のポリペプチドは、前記TCRαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第2のポリペプチドは、前記TCRβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目1に記載の核酸分子。
(項目4)
前記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする、項目1~3のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目5)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する、項目1~4のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目6)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する、項目1~4のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目7)
前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、項目3~6のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目8)
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの定常領域は、マウスTCR定常領域に由来する、項目3~7のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目9)
前記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目10)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列を含むか、または前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目9に記載の核酸分子。
(項目11)
前記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列、あるいは配列番号4の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~10のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目12)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目11に記載の核酸分子。
(項目13)
前記第1のポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列、あるいは配列番号7の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目14)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目13に記載の核酸分子。
(項目15)
前記第2のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列、あるいは配列番号10の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または13~14のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目16)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目15に記載の核酸分子。
(項目17)
前記第1のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号14のアミノ酸配列、あるいは配列番号13もしくは配列番号14の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目18)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目17に記載の核酸分子。
(項目19)
前記第2のポリペプチドは、配列番号18もしくは配列番号19のアミノ酸配列、あるいは配列番号18もしくは配列番号19の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または17~18のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目20)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目19に記載の核酸分子。
(項目21)
前記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列、あるいは配列番号23の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目22)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目21に記載の核酸分子。
(項目23)
前記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列、あるいは配列番号26の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または21~22のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目24)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目23に記載の核酸分子。
(項目25)
前記第1のポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列、あるいは配列番号29の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目26)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目25に記載の核酸分子。
(項目27)
前記第2のポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸配列、あるいは配列番号32の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または25~26のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目28)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目27に記載の核酸分子。
(項目29)
前記第1のポリペプチドは、配列番号35もしくは配列番号36のアミノ酸配列、あるいは配列番号35もしくは配列番号36の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目30)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目29に記載の核酸分子。
(項目31)
前記第2のポリペプチドは、配列番号40もしくは配列番号41のアミノ酸配列、あるいは配列番号40もしくは配列番号41の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または29~30のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目32)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目31に記載の核酸分子。
(項目33)
前記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列、あるいは配列番号45の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目34)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目33に記載の核酸分子。
(項目35)
前記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列、あるいは配列番号48の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または33~34のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目36)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目35に記載の核酸分子。
(項目37)
前記第1のポリペプチドは、配列番号51のアミノ酸配列、あるいは配列番号51の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目38)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目37に記載の核酸分子。
(項目39)
前記第2のポリペプチドは、配列番号54のアミノ酸配列、あるいは配列番号54の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または37~38のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目40)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目39に記載の核酸分子。
(項目41)
前記第1のポリペプチドは、配列番号57もしくは配列番号58のアミノ酸配列、あるいは配列番号57もしくは配列番号58の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目42)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目41に記載の核酸分子。
(項目43)
前記第2のポリペプチドは、配列番号62もしくは配列番号63のアミノ酸配列、あるいは配列番号62もしくは配列番号63の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または41~42のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目44)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目43に記載の核酸分子。
(項目45)
CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、ここで該第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含み、ここで該第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む;ならびに
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
(項目46)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド配列を含み、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号6のヌクレオチド配列を含む、項目45に記載の核酸分子。
(項目47)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、ヒトPRAMEに結合する、項目1~46のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目48)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、細胞表面上に発現されるPRAMEに結合する、項目1~47のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目49)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、ペプチド-MHC複合体に特異的に結合し、ここで該MHC分子は、MHCクラスI HLA分子であり、該ペプチドは、PRAMEエピトープである、項目1~48のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目50)
前記MHC分子は、MHCクラスI HLA A2.01分子である、項目49に記載の核酸分子。
(項目51)
前記PRAMEエピトープは、SLLQHLIGLであるか、または前記PRAMEエピトープは、QLLALLPSLである、項目49または50のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目52)
前記CDR3コードポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターをさらに含む、項目1~51のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目53)
前記第1のポリヌクレオチドに作用的に連結された第1のプロモーターおよび前記第2のポリヌクレオチドに作用的に連結された第2のプロモーターをさらに含む、項目1~51のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目54)
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目1~53のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目55)
前記TCRαもしくはTCRβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目54に記載の核酸分子。
(項目56)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、項目54または55のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目57)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、項目55~56のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目58)
前記FKBP12領域は、36位でのアミノ酸置換を有する、項目57に記載の核酸分子。
(項目59)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目57に記載の核酸分子。
(項目60)
前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目59に記載の核酸分子。
(項目61)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目59に記載の核酸分子。
(項目62)
前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、項目54~57のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目63)
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目54~61のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目64)
前記リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドである、項目55~63のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目65)
前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目55~64のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目66)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、項目55~65のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目67)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、項目54~66のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目68)
a)項目1~55のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
(項目69)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、項目68に記載の組成物。
(項目70)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、項目68~69のいずれか1項に記載の組成物。
(項目71)
前記FKBP12領域は、36位でのアミノ酸置換を有する、項目70に記載の組成物。
(項目72)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目70に記載の組成物。
(項目73)
前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目70に記載の組成物。
(項目74)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目71に記載の組成物。
(項目75)
前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、項目68~74のいずれか1項に記載の組成物。
(項目76)
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目68~72のいずれか1項に記載の組成物。
(項目77)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、項目68~76のいずれか1項に記載の組成物。
(項目78)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、項目68~76のいずれか1項に記載の組成物。
(項目79)
項目1~53のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目80)
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目79に記載のベクター。
(項目81)
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目79に記載のベクター。
(項目82)
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目81に記載のベクター。
(項目83)
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目81に記載のベクター。
(項目84)
項目1~53のいずれか1項に記載の核酸分子または項目79~83のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目85)
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、項目84に記載の改変された細胞。
(項目86)
項目54~67のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目87)
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目86に記載のベクター。
(項目88)
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目86に記載のベクター。
(項目89)
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目88に記載のベクター。
(項目90)
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目88に記載のベクター。
(項目91)
項目54~67のいずれか1項に記載の核酸分子または項目86~90のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目92)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、項目85または91のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目93)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、項目85または91のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目94)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目93に記載の改変された細胞。
(項目95)
前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目93に記載の改変された細胞。
(項目96)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目94に記載の改変された細胞。
(項目97)
前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、項目93に記載の改変された細胞。
(項目98)
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目94に記載の改変された細胞。
(項目99)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、項目85または91~98のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目100)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、項目84または91~98のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目101)
項目1~67のいずれか1項に記載の核酸分子、項目79~83もしくは86~90のいずれか1項に記載のベクター、または項目68~78のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目102)
項目84、85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目103)
項目1~67のいずれか1項に記載の核酸、項目79~83もしくは86~90のいずれか1項に記載のベクター、または項目65~74のいずれか1項に記載の組成物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目104)
過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するための方法であって、該方法は、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目105)
前記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有する、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記腫瘍の中の細胞は、PRAMEを発現する、項目105に記載の方法。
(項目107)
前記腫瘍のPRAME発現を決定する工程をさらに包含する、項目104~106のいずれか1項に記載の方法。
(項目108)
前記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目104~106のいずれか1項に記載の方法。
(項目109)
前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、および乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、項目104~108のいずれか1項に記載の方法。
(項目110)
前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、急性リンパ芽球性白血病、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患と診断されている、項目104~108のいずれか1項に記載の方法。
(項目111)
被験体において標的細胞集団または組織への細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する方法。
(項目112)
前記標的細胞集団の細胞は、PRAMEを発現する、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記標的細胞のPRAME発現を決定する工程をさらに包含する、項目111または112のいずれか1項に記載の方法。
(項目114)
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目111~113のいずれか1項に記載の方法。
(項目115)
前記標的細胞は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫の細胞からなる群より選択される、項目111~114のいずれか1項に記載の方法。
(項目116)
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、項目111~115のいずれか1項に記載の方法。
(項目117)
前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、項目111~116のいずれか1項に記載の方法。
(項目118)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目117に記載の方法。
(項目119)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、項目117に記載の方法。
(項目120)
前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目111~119のいずれか1項に記載の方法。
(項目121)
前記標的細胞は、PRAMEを発現する、項目111~120のいずれか1項に記載の方法。
(項目122)
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目123)
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目124)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記標的抗原は、PRAMEである、項目123または124のいずれか1項に記載の方法。
(項目126)
前記改変された細胞のさらなる用量を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、ここで前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目123~125のいずれか1項に記載の方法。
(項目127)
a)被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程;あるいは該被験体から得られる細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルを決定する工程;および
b)(i)項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞を投与する工程もしくは投与する指示を伝える工程、(ii)該改変された細胞のその後の投与量を維持する工程、もしくは維持する指示を伝える工程、もしくは該改変された細胞のその後の投与量を調節する指示を伝える工程、または(iii)該被験体において特定された状態もしくは疾患の有無またはステージ、または該細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルに基づいて、該被験体に投与される該改変された細胞のその後の投与量を調節する工程もしくは調節する指示を伝える工程、
をさらに包含する、項目104~126のいずれか1項に記載の方法。
(項目128)
前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ぶどう膜黒色腫、滑膜肉腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、項目104~128のいずれか1項に記載の方法。
(項目129)
前記被験体は、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、項目104~128のいずれか1項に記載の方法。
(項目130)
前記被験体は、急性骨髄性白血病と診断されている、項目129に記載の方法。
(項目131)
前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む、項目104~130のいずれか1項に記載の方法。
(項目132)
前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドの投与前に前記被験体から得られるサンプル中の該キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、該多量体リガンドの投与後に該被験体から得られるサンプル中で減少している、項目131または132のいずれか1項に記載の方法。
(項目134)
改変された細胞の数または濃度は、前記多量体リガンドの投与後24時間以内に減少している、項目133に記載の方法。
(項目135)
前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、50%減少している、項目133または134のいずれか1項に記載の方法。
(項目136)
前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、75%減少している、項目133または134のいずれか1項に記載の方法。
(項目137)
前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、90%減少している、項目133または134のいずれか1項に記載の方法。
(項目138)
前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に、負の症候を経験していることを決定する工程、および該負の症候を減少または改善するために前記リガンドを投与する工程を包含する、項目132~137のいずれか1項に記載の方法。
(項目139)
前記リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目132~137のいずれか1項に記載の方法。
(項目140)
前記改変された細胞は、自家T細胞である、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目141)
前記改変された細胞は、同種異系T細胞である、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目142)
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目143)
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目144)
前記改変された細胞は、T細胞である、項目84、85、または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目145)
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目84、85、または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目146)
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目84、85、または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目147)
細胞においてPRAMEに特異的に結合するT細胞レセプターを発現するための方法であって、該方法は、項目1~64のいずれか1項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該細胞が該T細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
(項目148)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目147に記載の方法。
(項目149)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目147に記載の方法。
(項目150)
メラノーマ優先発現抗原(PRAME)を認識するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする核酸分子であって、該核酸分子は、
a.TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド;および
b.TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、
を含み、ここで該TCRαポリペプチドおよびTCRβポリペプチドのCDR3領域は一緒に、PRAMEを認識する、核酸分子。
(項目151)
a.前記第1のポリヌクレオチドは、前記TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードし;そして
b.前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
項目150に記載の核酸分子。
(項目152)
前記第1のポリペプチドは、前記TCRαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第2のポリペプチドは、前記TCRβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目150または151のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目153)
前記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする、項目150~152のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目154)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目150~153のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目155)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目150~153のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目156)
前記第1のまたは第2のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、項目152~155のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目157)
前記第1のまたは第2のポリペプチドの定常領域は、マウスTCR定常領域に由来する、項目152~156のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目158)
前記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目159)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目A9に記載の核酸分子。
(項目160)
前記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、項目150~159のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目161)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目160に記載の核酸分子。
(項目162)
前記第1のポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目163)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目162に記載の核酸分子。
(項目164)
前記第2のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列を含む、項目150~157または162~163のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目165)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目164に記載の核酸分子。
(項目166)
前記第1のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号14のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目167)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列を含む、項目166に記載の核酸分子。
(項目168)
前記第2のポリペプチドは、配列番号18もしくは配列番号19のアミノ酸配列を含む、項目150~157または166~167のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目169)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列を含む、項目168に記載の核酸分子。
(項目170)
前記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目171)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目170に記載の核酸分子。
(項目172)
前記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列を含む、項目150~157または170~171のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目173)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目172に記載の核酸分子。
(項目174)
前記第1のポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目175)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目174に記載の核酸分子。
(項目176)
前記第2のポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸配列を含む、項目150~157または174~175のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目177)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目176に記載の核酸分子。
(項目178)
前記第1のポリペプチドは、配列番号35もしくは配列番号36のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目179)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列を含む、項目178に記載の核酸分子。
(項目180)
前記第2のポリペプチドは、配列番号40もしくは配列番号41のアミノ酸配列を含む、項目150~157または178~179のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目181)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列を含む、項目180に記載の核酸分子。
(項目182)
前記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目183)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目182に記載の核酸分子。
(項目184)
前記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列を含む、項目150~157または182~183のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目185)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目184に記載の核酸分子。
(項目186)
前記第1のポリペプチドは、配列番号51のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目187)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目186に記載の核酸分子。
(項目188)
前記第2のポリペプチドは、配列番号54のアミノ酸配列を含む、項目150~157または186~187のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目189)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目188に記載の核酸分子。
(項目190)
前記第1のポリペプチドは、配列番号57もしくは配列番号58のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目191)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列を含む、項目190に記載の核酸分子。
(項目192)
前記第2のポリペプチドは、配列番号62もしくは配列番号63のアミノ酸配列を含む、項目150~157または190~191のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目193)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を含む、項目192に記載の核酸分子。
(項目194)
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目195)
前記TCRαもしくはTCRβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目194に記載の核酸分子。
(項目196)
多量体化領域は、FKBP12領域を含む、項目194または195のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目197)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目196に記載の方法。
(項目198)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目197に記載の方法。
(項目199)
前記多量体化領域は、Fv’Fvlsを含む、項目194~195のいずれか1項に記載の方法。
(項目200)
前記多量体化領域は、配列番号77もしくは配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的フラグメントを含む、項目194~195のいずれか1項に記載の方法。
(項目201)
前記多量体化領域は、配列番号76もしくは配列番号78のヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントによってコードされる、項目200に記載の方法。
(項目202)
前記多量体化領域は、残基36がバリンであるFvポリペプチドバリアントをさらに含む、項目200に記載の方法。
(項目203)
前記リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドである、項目195~202のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目204)
前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目194~203のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目205)
a)項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
(項目206)
項目150~205のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目207)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子または項目206に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
(項目208)
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、項目207に記載の細胞。
(項目209)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP領域である、項目208に記載の細胞。
(項目210)
前記多量体リガンド結合領域は、FK205v36領域である、項目208または209のいずれか1項に記載の細胞。
(項目211)
前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目208~210のいずれか1項に記載の細胞。
(項目212)
項目194~B6のいずれか1項に記載の核酸分子または項目200に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
(項目213)
前記細胞は、自家T細胞である、項目207~212のいずれか1項に記載の細胞。
(項目214)
前記細胞は、同種異系T細胞である、項目207~212のいずれか1項に記載の細胞。
(項目215)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配列番号1、配列番号4、配列番号21、もしくは配列番号23のアミノ酸配列を含む、T細胞レセプター。
(項目216)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配列番号45もしくは配列番号48のアミノ酸配列を含む、T細胞レセプター。
(項目217)
項目207~212のいずれか1項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目218)
項目207~212のいずれか1項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目219)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子または項目206に記載のベクターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目220)
過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目217に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目221)
過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目218に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目222)
過剰増殖性疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目219に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目223)
前記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有する、項目220~222のいずれか1項に記載の方法。
(項目224)
前記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目223に記載の方法。
(項目225)
前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、または乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、項目220~222のいずれか1項に記載の方法。
(項目226)
前記被験体に、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに包含する、項目220~225のいずれか1項に記載の方法。
(項目227)
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目217~218のいずれか1項に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで該細胞は、該標的細胞上の抗原に結合するT細胞レセプター、またはその機能的フラグメントを含む、方法。
(項目228)
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目219に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで前記核酸またはベクターは、該標的細胞上の抗原に結合するT細胞レセプター、またはその機能的フラグメントをコードする、方法。
(項目229)
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目227または228のいずれか1項に記載の方法。
(項目230)
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目227~229のいずれか1項に記載の方法。
(項目231)
前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、項目227~230のいずれか1項に記載の方法。
(項目232)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目231に記載の方法。
(項目233)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、項目231に記載の方法。
(項目234)
前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目227~233のいずれか1項に記載の方法。
(項目235)
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目217~219のいずれか1項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目236)
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目217~219のいずれか1項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目237)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目236に記載の方法。
(項目238)
外因性T細胞レセプターをコードする単離されたT細胞であって、ここで該T細胞レセプターは、PRAMEを認識する、単離されたT細胞。
(項目239)
前記T細胞レセプターは、配列番号1、配列番号4、配列番号21、もしくは配列番号23のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、項目227に記載の単離されたT細胞。
(項目240)
前記T細胞レセプターは、配列番号45もしくは配列番号48のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、項目227に記載の単離されたT細胞。
(項目241)
前記T細胞レセプターは、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目227~229のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
(項目242)
前記T細胞レセプターは、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目227~229のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む;ならびに
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
(項目2)
前記第1のポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする;および
前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
項目1に記載の核酸分子。
(項目3)
前記第1のポリペプチドは、前記TCRαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第2のポリペプチドは、前記TCRβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目1に記載の核酸分子。
(項目4)
前記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする、項目1~3のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目5)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する、項目1~4のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目6)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドに特異的に結合する、項目1~4のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目7)
前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、項目3~6のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目8)
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドの定常領域は、マウスTCR定常領域に由来する、項目3~7のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目9)
前記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目10)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列を含むか、または前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目9に記載の核酸分子。
(項目11)
前記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列、あるいは配列番号4の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~10のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目12)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目11に記載の核酸分子。
(項目13)
前記第1のポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列、あるいは配列番号7の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目14)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目13に記載の核酸分子。
(項目15)
前記第2のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列、あるいは配列番号10の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または13~14のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目16)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目15に記載の核酸分子。
(項目17)
前記第1のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号14のアミノ酸配列、あるいは配列番号13もしくは配列番号14の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目18)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目17に記載の核酸分子。
(項目19)
前記第2のポリペプチドは、配列番号18もしくは配列番号19のアミノ酸配列、あるいは配列番号18もしくは配列番号19の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または17~18のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目20)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目19に記載の核酸分子。
(項目21)
前記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列、あるいは配列番号23の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目22)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目21に記載の核酸分子。
(項目23)
前記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列、あるいは配列番号26の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または21~22のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目24)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目23に記載の核酸分子。
(項目25)
前記第1のポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列、あるいは配列番号29の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目26)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目25に記載の核酸分子。
(項目27)
前記第2のポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸配列、あるいは配列番号32の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または25~26のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目28)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目27に記載の核酸分子。
(項目29)
前記第1のポリペプチドは、配列番号35もしくは配列番号36のアミノ酸配列、あるいは配列番号35もしくは配列番号36の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目30)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目29に記載の核酸分子。
(項目31)
前記第2のポリペプチドは、配列番号40もしくは配列番号41のアミノ酸配列、あるいは配列番号40もしくは配列番号41の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または29~30のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目32)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目31に記載の核酸分子。
(項目33)
前記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列、あるいは配列番号45の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目34)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目33に記載の核酸分子。
(項目35)
前記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列、あるいは配列番号48の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または33~34のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目36)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目35に記載の核酸分子。
(項目37)
前記第1のポリペプチドは、配列番号51のアミノ酸配列、あるいは配列番号51の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目38)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目37に記載の核酸分子。
(項目39)
前記第2のポリペプチドは、配列番号54のアミノ酸配列、あるいは配列番号54の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または37~38のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目40)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目39に記載の核酸分子。
(項目41)
前記第1のポリペプチドは、配列番号57もしくは配列番号58のアミノ酸配列、あるいは配列番号57もしくは配列番号58の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目42)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目41に記載の核酸分子。
(項目43)
前記第2のポリペプチドは、配列番号62もしくは配列番号63のアミノ酸配列、あるいは配列番号62もしくは配列番号63の配列と90%もしくは90%超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目1~8または41~42のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目44)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列と90%もしくは90%超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目43に記載の核酸分子。
(項目45)
CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、ここで該第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む;
該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含み、ここで該第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む;ならびに
該TCRαポリペプチドのCDR3領域および該TCRβポリペプチドのCDR3領域は、一緒にPRAMEに特異的に結合する、
核酸分子。
(項目46)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド配列を含み、前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号6のヌクレオチド配列を含む、項目45に記載の核酸分子。
(項目47)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、ヒトPRAMEに結合する、項目1~46のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目48)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、細胞表面上に発現されるPRAMEに結合する、項目1~47のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目49)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、ペプチド-MHC複合体に特異的に結合し、ここで該MHC分子は、MHCクラスI HLA分子であり、該ペプチドは、PRAMEエピトープである、項目1~48のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目50)
前記MHC分子は、MHCクラスI HLA A2.01分子である、項目49に記載の核酸分子。
(項目51)
前記PRAMEエピトープは、SLLQHLIGLであるか、または前記PRAMEエピトープは、QLLALLPSLである、項目49または50のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目52)
前記CDR3コードポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターをさらに含む、項目1~51のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目53)
前記第1のポリヌクレオチドに作用的に連結された第1のプロモーターおよび前記第2のポリヌクレオチドに作用的に連結された第2のプロモーターをさらに含む、項目1~51のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目54)
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目1~53のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目55)
前記TCRαもしくはTCRβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目54に記載の核酸分子。
(項目56)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、項目54または55のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目57)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、項目55~56のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目58)
前記FKBP12領域は、36位でのアミノ酸置換を有する、項目57に記載の核酸分子。
(項目59)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目57に記載の核酸分子。
(項目60)
前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目59に記載の核酸分子。
(項目61)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目59に記載の核酸分子。
(項目62)
前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、項目54~57のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目63)
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目54~61のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目64)
前記リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドである、項目55~63のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目65)
前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目55~64のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目66)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、項目55~65のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目67)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、項目54~66のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目68)
a)項目1~55のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
(項目69)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、項目68に記載の組成物。
(項目70)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、項目68~69のいずれか1項に記載の組成物。
(項目71)
前記FKBP12領域は、36位でのアミノ酸置換を有する、項目70に記載の組成物。
(項目72)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目70に記載の組成物。
(項目73)
前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目70に記載の組成物。
(項目74)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目71に記載の組成物。
(項目75)
前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、項目68~74のいずれか1項に記載の組成物。
(項目76)
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目68~72のいずれか1項に記載の組成物。
(項目77)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、項目68~76のいずれか1項に記載の組成物。
(項目78)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、項目68~76のいずれか1項に記載の組成物。
(項目79)
項目1~53のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目80)
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目79に記載のベクター。
(項目81)
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目79に記載のベクター。
(項目82)
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目81に記載のベクター。
(項目83)
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目81に記載のベクター。
(項目84)
項目1~53のいずれか1項に記載の核酸分子または項目79~83のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目85)
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、項目84に記載の改変された細胞。
(項目86)
項目54~67のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目87)
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目86に記載のベクター。
(項目88)
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目86に記載のベクター。
(項目89)
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目88に記載のベクター。
(項目90)
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目88に記載のベクター。
(項目91)
項目54~67のいずれか1項に記載の核酸分子または項目86~90のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目92)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域である、項目85または91のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目93)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP12領域を含む、項目85または91のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目94)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目93に記載の改変された細胞。
(項目95)
前記FKBP12領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目93に記載の改変された細胞。
(項目96)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目94に記載の改変された細胞。
(項目97)
前記多量体リガンド結合領域は、Fv’Fvlsを含む、項目93に記載の改変された細胞。
(項目98)
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号77のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目94に記載の改変された細胞。
(項目99)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、配列番号75のアミノ酸配列を有するか、または配列番号74のヌクレオチド配列によってコードされる、項目85または91~98のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目100)
前記カスパーゼ-9ポリペプチドは、表3中のカスパーゼバリアントにおける置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ-9ポリペプチドである、項目84または91~98のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目101)
項目1~67のいずれか1項に記載の核酸分子、項目79~83もしくは86~90のいずれか1項に記載のベクター、または項目68~78のいずれか1項に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目102)
項目84、85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目103)
項目1~67のいずれか1項に記載の核酸、項目79~83もしくは86~90のいずれか1項に記載のベクター、または項目65~74のいずれか1項に記載の組成物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目104)
過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するための方法であって、該方法は、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目105)
前記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有する、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記腫瘍の中の細胞は、PRAMEを発現する、項目105に記載の方法。
(項目107)
前記腫瘍のPRAME発現を決定する工程をさらに包含する、項目104~106のいずれか1項に記載の方法。
(項目108)
前記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目104~106のいずれか1項に記載の方法。
(項目109)
前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、および乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、項目104~108のいずれか1項に記載の方法。
(項目110)
前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、急性リンパ芽球性白血病、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患と診断されている、項目104~108のいずれか1項に記載の方法。
(項目111)
被験体において標的細胞集団または組織への細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する方法。
(項目112)
前記標的細胞集団の細胞は、PRAMEを発現する、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記標的細胞のPRAME発現を決定する工程をさらに包含する、項目111または112のいずれか1項に記載の方法。
(項目114)
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目111~113のいずれか1項に記載の方法。
(項目115)
前記標的細胞は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫の細胞からなる群より選択される、項目111~114のいずれか1項に記載の方法。
(項目116)
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している、項目111~115のいずれか1項に記載の方法。
(項目117)
前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、項目111~116のいずれか1項に記載の方法。
(項目118)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目117に記載の方法。
(項目119)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、項目117に記載の方法。
(項目120)
前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目111~119のいずれか1項に記載の方法。
(項目121)
前記標的細胞は、PRAMEを発現する、項目111~120のいずれか1項に記載の方法。
(項目122)
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目123)
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目124)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記標的抗原は、PRAMEである、項目123または124のいずれか1項に記載の方法。
(項目126)
前記改変された細胞のさらなる用量を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、ここで前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目123~125のいずれか1項に記載の方法。
(項目127)
a)被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程;あるいは該被験体から得られる細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルを決定する工程;および
b)(i)項目84~85または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞を投与する工程もしくは投与する指示を伝える工程、(ii)該改変された細胞のその後の投与量を維持する工程、もしくは維持する指示を伝える工程、もしくは該改変された細胞のその後の投与量を調節する指示を伝える工程、または(iii)該被験体において特定された状態もしくは疾患の有無またはステージ、または該細胞または組織サンプル中のPRAME発現のレベルに基づいて、該被験体に投与される該改変された細胞のその後の投与量を調節する工程もしくは調節する指示を伝える工程、
をさらに包含する、項目104~126のいずれか1項に記載の方法。
(項目128)
前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ぶどう膜黒色腫、滑膜肉腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、項目104~128のいずれか1項に記載の方法。
(項目129)
前記被験体は、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、項目104~128のいずれか1項に記載の方法。
(項目130)
前記被験体は、急性骨髄性白血病と診断されている、項目129に記載の方法。
(項目131)
前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む、項目104~130のいずれか1項に記載の方法。
(項目132)
前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドの投与前に前記被験体から得られるサンプル中の該キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、該多量体リガンドの投与後に該被験体から得られるサンプル中で減少している、項目131または132のいずれか1項に記載の方法。
(項目134)
改変された細胞の数または濃度は、前記多量体リガンドの投与後24時間以内に減少している、項目133に記載の方法。
(項目135)
前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、50%減少している、項目133または134のいずれか1項に記載の方法。
(項目136)
前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、75%減少している、項目133または134のいずれか1項に記載の方法。
(項目137)
前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、90%減少している、項目133または134のいずれか1項に記載の方法。
(項目138)
前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に、負の症候を経験していることを決定する工程、および該負の症候を減少または改善するために前記リガンドを投与する工程を包含する、項目132~137のいずれか1項に記載の方法。
(項目139)
前記リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目132~137のいずれか1項に記載の方法。
(項目140)
前記改変された細胞は、自家T細胞である、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目141)
前記改変された細胞は、同種異系T細胞である、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目142)
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目143)
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目104~139のいずれか1項に記載の方法。
(項目144)
前記改変された細胞は、T細胞である、項目84、85、または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目145)
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目84、85、または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目146)
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目84、85、または91~101のいずれか1項に記載の改変された細胞。
(項目147)
細胞においてPRAMEに特異的に結合するT細胞レセプターを発現するための方法であって、該方法は、項目1~64のいずれか1項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該細胞が該T細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
(項目148)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目147に記載の方法。
(項目149)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目147に記載の方法。
(項目150)
メラノーマ優先発現抗原(PRAME)を認識するT細胞レセプターのCDR3領域をコードする核酸分子であって、該核酸分子は、
a.TCRαポリペプチドのCDR3領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド;および
b.TCRβポリペプチドのCDR3領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、
を含み、ここで該TCRαポリペプチドおよびTCRβポリペプチドのCDR3領域は一緒に、PRAMEを認識する、核酸分子。
(項目151)
a.前記第1のポリヌクレオチドは、前記TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードし;そして
b.前記第2のポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする、
項目150に記載の核酸分子。
(項目152)
前記第1のポリペプチドは、前記TCRαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第2のポリペプチドは、前記TCRβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目150または151のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目153)
前記核酸分子は、T細胞レセプターをコードする、項目150~152のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目154)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目150~153のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目155)
前記T細胞レセプターのCDR3領域は、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目150~153のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目156)
前記第1のまたは第2のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、項目152~155のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目157)
前記第1のまたは第2のポリペプチドの定常領域は、マウスTCR定常領域に由来する、項目152~156のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目158)
前記第1のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目159)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目A9に記載の核酸分子。
(項目160)
前記第2のポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む、項目150~159のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目161)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目160に記載の核酸分子。
(項目162)
前記第1のポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目163)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号8もしくは配列番号9のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目162に記載の核酸分子。
(項目164)
前記第2のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列を含む、項目150~157または162~163のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目165)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号11もしくは配列番号12のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目164に記載の核酸分子。
(項目166)
前記第1のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号14のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目167)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号16、もしくは配列番号17のヌクレオチド配列を含む、項目166に記載の核酸分子。
(項目168)
前記第2のポリペプチドは、配列番号18もしくは配列番号19のアミノ酸配列を含む、項目150~157または166~167のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目169)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号20、配列番号21、もしくは配列番号22のヌクレオチド配列を含む、項目168に記載の核酸分子。
(項目170)
前記第1のポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目171)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号24もしくは配列番号25のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目170に記載の核酸分子。
(項目172)
前記第2のポリペプチドは、配列番号26のアミノ酸配列を含む、項目150~157または170~171のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目173)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号27もしくは配列番号28のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目172に記載の核酸分子。
(項目174)
前記第1のポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目175)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号30もしくは配列番号31のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目174に記載の核酸分子。
(項目176)
前記第2のポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸配列を含む、項目150~157または174~175のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目177)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号33もしくは配列番号34のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目176に記載の核酸分子。
(項目178)
前記第1のポリペプチドは、配列番号35もしくは配列番号36のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目179)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号37、配列番号38、もしくは配列番号39のヌクレオチド配列を含む、項目178に記載の核酸分子。
(項目180)
前記第2のポリペプチドは、配列番号40もしくは配列番号41のアミノ酸配列を含む、項目150~157または178~179のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目181)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号42、配列番号43、もしくは配列番号44のヌクレオチド配列を含む、項目180に記載の核酸分子。
(項目182)
前記第1のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目183)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号46もしくは配列番号47のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目182に記載の核酸分子。
(項目184)
前記第2のポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸配列を含む、項目150~157または182~183のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目185)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号49もしくは配列番号50のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目184に記載の核酸分子。
(項目186)
前記第1のポリペプチドは、配列番号51のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目187)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号52もしくは配列番号53のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目186に記載の核酸分子。
(項目188)
前記第2のポリペプチドは、配列番号54のアミノ酸配列を含む、項目150~157または186~187のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目189)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号55もしくは配列番号56のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含む、項目188に記載の核酸分子。
(項目190)
前記第1のポリペプチドは、配列番号57もしくは配列番号58のアミノ酸配列を含む、項目150~157のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目191)
前記第1のポリヌクレオチドは、配列番号59、配列番号60、もしくは配列番号61のヌクレオチド配列を含む、項目190に記載の核酸分子。
(項目192)
前記第2のポリペプチドは、配列番号62もしくは配列番号63のアミノ酸配列を含む、項目150~157または190~191のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目193)
前記第2のポリヌクレオチドは、配列番号64、配列番号65、もしくは配列番号66のヌクレオチド配列を含む、項目192に記載の核酸分子。
(項目194)
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目195)
前記TCRαもしくはTCRβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目194に記載の核酸分子。
(項目196)
多量体化領域は、FKBP12領域を含む、項目194または195のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目197)
前記FKBP12領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される36位でのアミノ酸置換を有する、項目196に記載の方法。
(項目198)
前記FKBP12領域は、FKBP12v36領域である、項目197に記載の方法。
(項目199)
前記多量体化領域は、Fv’Fvlsを含む、項目194~195のいずれか1項に記載の方法。
(項目200)
前記多量体化領域は、配列番号77もしくは配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその機能的フラグメントを含む、項目194~195のいずれか1項に記載の方法。
(項目201)
前記多量体化領域は、配列番号76もしくは配列番号78のヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントによってコードされる、項目200に記載の方法。
(項目202)
前記多量体化領域は、残基36がバリンであるFvポリペプチドバリアントをさらに含む、項目200に記載の方法。
(項目203)
前記リンカーポリペプチドは、2Aポリペプチドである、項目195~202のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目204)
前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目194~203のいずれか1項に記載の核酸分子。
(項目205)
a)項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子;および
b)多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
(項目206)
項目150~205のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目207)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子または項目206に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
(項目208)
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ-9ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ-9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、項目207に記載の細胞。
(項目209)
前記多量体リガンド結合領域は、FKBP領域である、項目208に記載の細胞。
(項目210)
前記多量体リガンド結合領域は、FK205v36領域である、項目208または209のいずれか1項に記載の細胞。
(項目211)
前記多量体リガンドは、AP1903またはAP20187である、項目208~210のいずれか1項に記載の細胞。
(項目212)
項目194~B6のいずれか1項に記載の核酸分子または項目200に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
(項目213)
前記細胞は、自家T細胞である、項目207~212のいずれか1項に記載の細胞。
(項目214)
前記細胞は、同種異系T細胞である、項目207~212のいずれか1項に記載の細胞。
(項目215)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配列番号1、配列番号4、配列番号21、もしくは配列番号23のアミノ酸配列を含む、T細胞レセプター。
(項目216)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配列番号45もしくは配列番号48のアミノ酸配列を含む、T細胞レセプター。
(項目217)
項目207~212のいずれか1項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目218)
項目207~212のいずれか1項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目219)
項目150~193のいずれか1項に記載の核酸分子または項目206に記載のベクターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
(項目220)
過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目217に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目221)
過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目218に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目222)
過剰増殖性疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目219に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
(項目223)
前記被験体は、少なくとも1個の腫瘍を有する、項目220~222のいずれか1項に記載の方法。
(項目224)
前記少なくとも1個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目223に記載の方法。
(項目225)
前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、または乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、項目220~222のいずれか1項に記載の方法。
(項目226)
前記被験体に、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに包含する、項目220~225のいずれか1項に記載の方法。
(項目227)
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目217~218のいずれか1項に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで該細胞は、該標的細胞上の抗原に結合するT細胞レセプター、またはその機能的フラグメントを含む、方法。
(項目228)
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目219に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで前記核酸またはベクターは、該標的細胞上の抗原に結合するT細胞レセプター、またはその機能的フラグメントをコードする、方法。
(項目229)
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目227または228のいずれか1項に記載の方法。
(項目230)
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目227~229のいずれか1項に記載の方法。
(項目231)
前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第1のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第2のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、項目227~230のいずれか1項に記載の方法。
(項目232)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目231に記載の方法。
(項目233)
前記第2のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第1のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増大している、項目231に記載の方法。
(項目234)
前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目227~233のいずれか1項に記載の方法。
(項目235)
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目217~219のいずれか1項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目236)
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目217~219のいずれか1項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目237)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目236に記載の方法。
(項目238)
外因性T細胞レセプターをコードする単離されたT細胞であって、ここで該T細胞レセプターは、PRAMEを認識する、単離されたT細胞。
(項目239)
前記T細胞レセプターは、配列番号1、配列番号4、配列番号21、もしくは配列番号23のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、項目227に記載の単離されたT細胞。
(項目240)
前記T細胞レセプターは、配列番号45もしくは配列番号48のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、項目227に記載の単離されたT細胞。
(項目241)
前記T細胞レセプターは、アミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目227~229のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
(項目242)
前記T細胞レセプターは、アミノ酸配列QLLALLPSLを含むPRAMEポリペプチドを認識する、項目227~229のいずれか1項に記載の単離されたT細胞。
Claims (15)
- CDR3コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで:
該CDR3コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)に特異的に結合するT細胞レセプターのCDR3領域をコードし;
a)該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRαポリペプチドのVJ領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含み、該第1のポリペプチドは、該TCRαポリペプチドのCDR3領域、該TCRαポリペプチドのCDR1領域および該TCRαポリペプチドのCDR2領域を含み、該CDR3領域は、配列番号1のアミノ酸配列を含み;
b)該CDR3コードポリヌクレオチドは、TCRβポリペプチドのVDJ領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含み、該第2のポリペプチドは、該TCRβポリペプチドのCDR3領域、該TCRβポリペプチドのCDR1領域および該TCRβポリペプチドのCDR2領域を含み、該CDR3領域が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、
該TCRαポリペプチドおよび該TCRβポリペプチドは、一緒にペプチド-MHC複合体に特異的に結合し、該MHC分子がMHCクラスI HLA A2.01分子であり、該ペプチドがアミノ酸配列SLLQHLIGLを含むPRAMEポリペプチドであり、
該核酸分子はT細胞レセプターをコードする、
核酸分子。 - 請求項1に記載の核酸分子であって、
前記第1のポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列、または配列番号7の配列と90%以上同一なアミノ酸配列を含み;かつ、前記第2のポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列、または配列番号10の配列と90%以上同一なアミノ酸配列を含む、核酸分子。 - 請求項1~2のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
a)前記第1のポリヌクレオチドが、配列番号8または配列番号9のヌクレオチド配列を含み;かつ
b)前記第2のポリヌクレオチドが、配列番号11または配列番号12のヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸分子であって、前記CDR3コードポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、核酸分子。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、プラスミドベクターまたはウイルスベクター。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子、または、請求項5に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸、請求項5に記載のベクター、または請求項6に記載の改変された細胞、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体における免疫応答の増強における使用のための、請求項7に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物の治療有効量が該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
- 前記被験体が、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、乳がん、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄性新生物、子宮頚癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、神経芽細胞腫、および卵巣がんからなる群より選択される疾患と診断されている、請求項8に記載の使用のための組成物。
- 被験体における標的細胞集団または組織への細胞媒介性免疫応答の刺激における使用のための、請求項7に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物の治療有効量が該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
- 前記標的細胞が、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌(RCC)、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、急性リンパ芽球性白血病、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、および卵巣がんの細胞からなる群より選択される、請求項10に記載の使用のための組成物。
- 被験体への抗腫瘍免疫の提供における使用のための、請求項7に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物の治療有効量が該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
- 細胞においてPRAMEに特異的に結合するT細胞レセプターを発現するインビトロの方法であって、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該細胞が該T細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、T細胞レセプター。
- 過剰増殖性疾患または状態を有する被験体の処置における使用のための、請求項7に記載の薬学的組成物であって、該薬学的組成物の治療有効量が該被験体に投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
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