JP2021090466A - メラノーマ優先発現抗原に対して向けられたｔ細胞レセプターおよびその使用 - Google Patents

メラノーマ優先発現抗原に対して向けられたｔ細胞レセプターおよびその使用 Download PDF

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H M Heemskerk Mirjam
ハー．エム． ヘームスケルク ミリアム
フレデリック ファルケンベルク イェー．ハー．
H Frederik Falkenburg J
フレデリック ファルケンベルク イェー．ハー．
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Abstract

【課題】メラノーマ優先発現抗原に対して向けられたＴ細胞レセプターおよびその使用の提供。【解決手段】本技術は、部分的に、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に対する免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。ＰＲＡＭＥ抗原に対する免疫応答を誘導することによって過剰増殖性疾患を処置するための方法が提供され；上記免疫応答は、ＰＲＡＭＥに対して向けられたＴ細胞レセプターを使用して、ＰＲＡＭＥ発現細胞を特異的に標的とすることによって誘導され得る。Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターをコードする核酸、ならびにＰＲＡＭＥ抗原を認識するＴ細胞レセプターを発現する細胞を含む組成物および方法が、本明細書で提供される。上記細胞はまた、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを発現し得る。【選択図】なし

Description

（関連出願）
２０１５年３月１０日に出願された「T Cell Receptors Directed Against the
Preferentially Expressed Antigen of Melanoma and Uses Thereof」との表題の
米国仮特許出願第６２／１３０，８８４号に対して優先権が主張され、当該出願は参照さ
れ、かつその参照によってその全体が参考として援用される。
（分野）
本技術は、部分的に、メラノーマ優先発現抗原（the Preferentially Expressed An
tigen of Melanoma）（ＰＲＡＭＥ）に対する免疫応答を誘導するための組成物および
方法に関する。ＰＲＡＭＥ抗原に対する免疫応答を誘導することによって過剰増殖性疾患
を処置するための方法が提供され；上記免疫応答は、ＰＲＡＭＥに対して向けられたＴ細
胞レセプターを使用して、ＰＲＡＭＥ発現細胞を特異的に標的とすることによって誘導さ
れ得る。
（背景）
Ｔ細胞の活性化は、病原微生物（例えば、ウイルス、細菌および寄生生物）、外来タン
パク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他
の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要なステップである。Ｔ細胞は、その表面上
に、細胞表面上に提示された抗原を認識するレセプター（すなわち、Ｔ細胞レセプター）
を発現する。正常な免疫応答の間、ＭＨＣ抗原提示の状況において、これらの抗原がＴ細
胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、Ｔ細胞の活性化に至る。
養子Ｔ細胞療法は、抗原特異的免疫応答を提供することによって過剰増殖性疾患（腫瘍
が挙げられる）を処置するために使用されてきた。１つの方法は、抗原に結合する細胞外
ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝子改変されたＴ細胞の使用を要す
る。
（要旨）
ＰＲＡＭＥ遺伝子は、大部分の腫瘍（メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）
、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫が挙げられる）、ならびにいくつかのタ
イプの白血病において高レベルで発現される。ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンが同定さ
れた。これらＴ細胞クローンは、これらの異なる腫瘍タイプ（ユーイング肉腫、滑膜肉腫
、および神経芽細胞腫の細胞株が挙げられる）を認識する。ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲを使
用するＴＣＲ遺伝子移入アプローチは、過剰増殖性疾患（例えば、肉腫、急性リンパ芽球
性白血病、急性骨髄性白血病、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫のような）を有する
患者にとっての新規な処置モダリティーをもたらし得る。
Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターをコードする核酸、ならびにＰＲＡＭＥ抗原を認
識するＴ細胞レセプターを発現する細胞を含む組成物および方法が、本明細書で提供され
る。上記細胞はまた、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを発現し得る。
ある種の実施形態は、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面の中でさらに記
載される。
図面は、本技術のある種の実施形態を例証するのであって、限定ではない。例証の明瞭
性および容易さのために、図面は、縮尺どおりには作成されておらず、場合によっては、
種々の局面が、特定の実施形態の理解を促進するために誇張または拡大されて示され得る
。
図１Ａは、養子Ｔ細胞療法の構成要素の模式図を提供する；図１Ｂは、種々の組織における抗原発現の棒グラフを提供する。
図２Ａは、Ｔ細胞クローンライブラリーを生成するために使用される方法の例を図示する模式図を提供する；図２Ｂは、サイトカイン生成の棒グラフを提供する。 図２Ａは、Ｔ細胞クローンライブラリーを生成するために使用される方法の例を図示する模式図を提供する；図２Ｂは、サイトカイン生成の棒グラフを提供する。
図３は、ＨＬＡミスマッチ幹細胞療法後の活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離を示すＦＡＣｓ分析の結果を提供する。患者レシピエントは、ＨＬＡ−Ａ２＋であり、ドナーは、ＨＬＡ−Ａ２−であった。
図４Ａ〜４Ｃは、３種の異なるＴ細胞クローンの腫瘍特異性を測定する棒グラフを提供する。図４Ａは、クローン１２の棒グラフを提供する；図４Ｂは、クローン３５の棒グラフを提供する；図４Ｃは、クローン５４の棒グラフを提供する。
図５Ａ〜５Ｃは、Ｔ細胞クローンがＰＲＡＭＥ特異的であることを示すＩＦＮγのグラフを提供する。図５Ａは、第１ｄｉｍ：水／ＡＣＮ／ＴＦＡ ＨＰＬＣ画分のグラフを提供する；図５Ｂは、第２ｄｉｍ：水／ＩＰＡ／ＴＦＡ ＨＰＬＣ画分のグラフを提供する；図５Ｃは、第３ｄｉｍ：水／ＡＮＣ／ギ酸 ＨＰＬＣ画分のグラフを提供する。
図６Ａ〜６Ｃは、アロ拘束（ａｌｌｏ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）および非アロ拘束のＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞のアビディティーを比較する実験の結果を提供する。図６Ａは、ＦＡＣｓ結果を提供する；図６Ｂは、線グラフを提供する；図６Ｃは、棒グラフを提供する。
図７Ａおよび７Ｂは、ＰＲＡＭＥ特異的アロＨＬＡ拘束Ｔ細胞の高い特異性を示す棒グラフである。図７Ａは、メラノーマ細胞株を表す棒グラフを提供する；図７Ｂは、原発性ＡＭＬサンプルを表す棒グラフを提供する。
図８は、健康なＣＤ３４＋ 細胞に由来する成熟樹状細胞（ＤＣ）に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの制限された反応性を示す棒グラフである。
図９は、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンによる細胞の認識が標的化細胞のＰＲＡＭＥ発現レベルと相関することを示す散布図である。
図１０Ａ〜１０Ｃは、ｓｈＲＮＡによるＰＲＡＭＥ発現のサイレンシングが、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの減少した反応性と相関したことを示す棒グラフである。図１０Ａは、腎細胞癌ＲＣＣ １２５７を表す棒グラフを提供する；図１０Ｂは、ＣＤ３４＋細胞に由来する成熟樹状細胞（ＣＤ３４ ｍＤＣ）を表す棒グラフを提供する；図１０Ｃは、近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）を表す棒グラフを提供する。
図１１は、ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の高い腫瘍反応性を示す棒グラフである。
図１２は、ＡＰ１９０３処置ありまたはなしの標的細胞に対する、カスパーゼ−９コードポリペプチド（ｃａｓｐａｓｅ−９ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）ありまたはなしのＰＲＡＭＥ ＴＣＲ構築物で形質導入したＴ細胞の反応性を示す棒グラフである。
図１３は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、ユーイング肉腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１３は、本明細書では６ページの図面で提供される。 図１３は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、ユーイング肉腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１３は、本明細書では６ページの図面で提供される。 図１３は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、ユーイング肉腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１３は、本明細書では６ページの図面で提供される。 図１３は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、ユーイング肉腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１３は、本明細書では６ページの図面で提供される。 図１３は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、ユーイング肉腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１３は、本明細書では６ページの図面で提供される。 図１３は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、ユーイング肉腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１３は、本明細書では６ページの図面で提供される。
図１４は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、神経芽細胞腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。神経芽細胞腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１４は、本明細書では４ページの図面で提供される。 図１４は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、神経芽細胞腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。神経芽細胞腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１４は、本明細書では４ページの図面で提供される。 図１４は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、神経芽細胞腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。神経芽細胞腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１４は、本明細書では４ページの図面で提供される。 図１４は、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αで４８時間の処置ありまたはなしでの、神経芽細胞腫細胞に対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの反応性を示す棒グラフを提供する。神経芽細胞腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬＡ発現は、図の右側に示される。図１４は、本明細書では４ページの図面で提供される。
図１５Ａおよび１５Ｂは、メラノーマ細胞に対してＰＲＡＭＥ ＴＣＲおよびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ＋ｉｃａｓｐ９構築物で形質導入したＴ細胞の反応性を示す棒グラフである。１５Ａ）ＡＰ１９０３処置なし、１５Ｂ）ＡＰ１９０３処置あり。
図１６Ａ〜１６Ｄは、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンによるユーイング肉腫細胞の認識を示す棒グラフである。ユーイング肉腫細胞株を、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしで４８時間処理した。図１６Ａは、ＥＷ３細胞株の棒グラフを提供する；図１６Ｂは、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＥＷ３細胞株ＨＬＡ発現の棒グラフを提供する；図１６Ｃは、ＥＷ７細胞株の棒グラフを提供する；図１６Ｄは、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＥＷ３細胞株の棒グラフを提供する。
図１７Ａは、ＰＲＡＭＥ／ｉｃａｓｐ９構築物におけるＰＲＡＭＥクローン５４ＳＬＬ（ＴＲＡＶ８−４＊０４）のアミノ酸配列を提供する；図１７Ｂは、ＰＲＡＭＥ／ｉｃａｓｐ９構築物におけるＰＲＡＭＥクローン５４ＳＬＬ（ＴＲＢＶ９＊０１）のアミノ酸配列を提供する。 図１７Ａは、ＰＲＡＭＥ／ｉｃａｓｐ９構築物におけるＰＲＡＭＥクローン５４ＳＬＬ（ＴＲＡＶ８−４＊０４）のアミノ酸配列を提供する；図１７Ｂは、ＰＲＡＭＥ／ｉｃａｓｐ９構築物におけるＰＲＡＭＥクローン５４ＳＬＬ（ＴＲＢＶ９＊０１）のアミノ酸配列を提供する。
図１８Ａは、ＰＲＡＭＥクローン４６ＳＬＬ（ＴＲＡＶ３５＊０２）のアミノ酸配列を提供する。図１８Ｂは、ＰＲＡＭＥクローン４６ＳＬＬ（ＴＲＢＶ２８＊０１）のアミノ酸配列を提供する。 図１８Ａは、ＰＲＡＭＥクローン４６ＳＬＬ（ＴＲＡＶ３５＊０２）のアミノ酸配列を提供する。図１８Ｂは、ＰＲＡＭＥクローン４６ＳＬＬ（ＴＲＢＶ２８＊０１）のアミノ酸配列を提供する。
図１９Ａは、ＰＲＡＭＥクローンＤＳＫ３ ＱＬＬ（ＴＲＡＶ１２−２＊０１）のアミノ酸配列を提供し、図１９Ｂは、ＰＲＡＭＥクローンＤＳＫ３ Ｑｌｌ（ＴＲＢＶ９＊０１）のアミノ酸配列を提供する。 図１９Ａは、ＰＲＡＭＥクローンＤＳＫ３ ＱＬＬ（ＴＲＡＶ１２−２＊０１）のアミノ酸配列を提供し、図１９Ｂは、ＰＲＡＭＥクローンＤＳＫ３ Ｑｌｌ（ＴＲＢＶ９＊０１）のアミノ酸配列を提供する。
図２０Ａは、原発性ＡＭＬ細胞のサンプル中のＰＲＡＭＥ発現の棒グラフを提供する。図２０Ｂは、原発性ＡＭＬ細胞のサンプルに対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の反応性の棒グラフを提供する。 図２０Ａは、原発性ＡＭＬ細胞のサンプル中のＰＲＡＭＥ発現の棒グラフを提供する。図２０Ｂは、原発性ＡＭＬ細胞のサンプルに対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の反応性の棒グラフを提供する。
図２１Ａは、ＮＳＧ免疫不全マウス異種移植片モデルでの、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞での処置後のマウスにおける腫瘍応答のアッセイのタイムラインを提供する；図２１Ｂは、７〜３５日目での非形質導入（ＮＴ）およびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞（（Ｃｅｌｌ Ａ）で処置したマウスの写真を提供する；図２１Ｃは、４１〜７４日目での非形質導入（ＮＴ）およびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞で処置したマウスの写真を提供する；図２１Ｄは、蛍光カラースケールを提供する；図２１Ｅは、非形質導入細胞で処置されたマウスにおける腫瘍の平均放射輝度の線グラフを提供する；図２１Ｆは、コントロール（ＮＴ）細胞で処置したマウスおよびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞で処置したマウスにおける腫瘍の平均放射輝度の線グラフを提供する；図２１Ｇは、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞で処置したマウスにおける腫瘍の平均放射輝度の線グラフを提供する。 図２１Ａは、ＮＳＧ免疫不全マウス異種移植片モデルでの、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞での処置後のマウスにおける腫瘍応答のアッセイのタイムラインを提供する；図２１Ｂは、７〜３５日目での非形質導入（ＮＴ）およびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞（（Ｃｅｌｌ Ａ）で処置したマウスの写真を提供する；図２１Ｃは、４１〜７４日目での非形質導入（ＮＴ）およびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞で処置したマウスの写真を提供する；図２１Ｄは、蛍光カラースケールを提供する；図２１Ｅは、非形質導入細胞で処置されたマウスにおける腫瘍の平均放射輝度の線グラフを提供する；図２１Ｆは、コントロール（ＮＴ）細胞で処置したマウスおよびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞で処置したマウスにおける腫瘍の平均放射輝度の線グラフを提供する；図２１Ｇは、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現細胞で処置したマウスにおける腫瘍の平均放射輝度の線グラフを提供する。
図２２Ａは、リミズシドの投与後のＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ発現Ｔ細胞で処置したマウス由来の脾臓のＦＡＣｓ分析を提供する；図２２Ｂは、図２２ＡのＦＡＣｓ分析をまとめるグラフを提供する。
図２３Ａは、Ｔ細胞注射後の５１日目に（腫瘍移植後７４日目）にＮＴ−またはＣｅｌｌ Ａのいずれかで処置したマウスから採取し、ＣＤ８＋発現について計数および分析した脾臓細胞および骨髄細胞のフローサイトメトリー結果を提供する；図２３Ｂは、ＣＤ４＋発現について計数および分析した細胞のフローサイトメトリー分析を提供する；図２３Ｃは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上でのＶβ１発現について計数および分析した細胞のフローサイトメトリー分析を提供する；図２３Ｄは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのＶβ１発現について計数および分析した細胞のフローサイトメトリー分析を提供する。
図２４は、上記で分析し、１０ｎＭ リミズシドありまたはなしで一晩培養した場合の、Ｃｅｌｌ Ａ処置動物から単離した脾臓細胞および骨髄細胞のフローサイトメトリー結果を提供する。
図２５は、ＳＦＧ．ｉＣ９−２Ａ−ＳＬＬ．ＴＣＲのプラスミドマップを提供する。
（詳細な説明）
特定の抗原に対して特異的な組換えＴ細胞レセプターは、Ｔ細胞に特異性を提供するた
めに、および患者において抗原特異的免疫応答を提供するために使用されてきた。ある種
の方法は、抗原に結合する細胞外ドメインを有する抗原特異的タンパク質を発現する遺伝
子改変されたＴ細胞の使用を要する。
異種Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する遺伝子改変されたＴ細胞を使用する養子Ｔ
細胞療法は、患者のＴ細胞レパートリーの一部として高アビディティー標的細胞特異的Ｔ
ＣＲを提供し得る。養子Ｔ細胞療法は、抗原特異的免疫応答を提供することによって、過
剰増殖性疾患（腫瘍が挙げられる）を処置するために使用されてきた。Ｔ細胞は、規定さ
れた特異性（例えば、腫瘍細胞に対する特異性のような）を有するＴ細胞を生成するよう
に遺伝子改変される。養子Ｔ細胞療法の方法は、図１において模式図として提供される。
本明細書で論じられるとき、アロＨＬＡレパートリーから単離されたＴ細胞は、標的への
より高いアビディティーを提供し得、これは、腫瘍を効率的に根絶するために望ましい。
アロＨＬＡ拘束Ｔ細胞は、以下の表１において自己拘束Ｔ細胞と比較される：
Figure 2021090466
従って、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドを含む核酸分
子が提供され、ここで：上記ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗
原（the preferentially expressed antigen in melanoma）（ＰＲＡＭＥ）に特異
的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードし；上記ＣＤＲ３コードポリヌク
レオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードす
る第１のポリヌクレオチドを含み；上記ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポ
リペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチ
ドを含み；そして上記ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域
は、一緒にＰＲＡＭＥに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、上記核酸分子
は、Ｔ細胞レセプターをコードする。いくつかの実施形態において、上記第１のもしくは
第２のポリペプチドまたは上記第１のおよび第２のポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列は、コドン最適化されており；いくつかの実施形態において、上記第１のまたは第
２のポリペプチド。いくつかの実施形態において、上記第１のおよび第２のポリペプチド
、または上記第１のもしくは第２のポリペプチドのアミノ酸配列は、組換えＴＣＲの発現
を増大させるためにシステイン改変されている。システイン改変されるとは、ヌクレオチ
ド配列がさらなるシステイン残基を含むポリペプチドをコードすることを意味する。コド
ン最適化されるとは、ヌクレオチド配列がそのコードされるポリペプチドの発現を増強す
るコドンを含むことを意味する。コドン最適化されたヌクレオチド配列の例は本明細書で
示されるが、本明細書で提供されるＣＤＲ３領域を同様にコードする他のヌクレオチド配
列が使用され得、用語コドン最適化されるが、ＣＤＲ３ポリペプチド（本明細書中のＴＣ
Ｒα鎖およびＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域、または本明細書で提供されるポリペプチド配列
と９０％もしくは９０％超（90% of more）同一であるその誘導体を含む）をコードす
るようなヌクレオチド配列を含むことは、理解される。アミノ酸配列およびアミノ酸配列
誘導体の同一性を計算するにあたって、組換えＴＣＲαまたはβポリペプチド、またはそ
のＣＤＲ３領域もしくは他のフラグメントの発現を増強するために使用されるシステイン
は、配列番号として本明細書で提供される配列がシステイン改変を有しない場合のパーセ
ンテージ計算の一部として考慮されない。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列
ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むＰＲＡＭＥポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施
形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、上記第２
のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか；または上記第１のポリペプチド
は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、上記第２のポリペプチドは、配列番号２６のア
ミノ酸配列、または配列番号１、配列番号４、配列番号２３、もしくは配列番号２６の配
列と９０％もしくは９０％超（90% or more）同一のアミノ酸配列を有するその誘導体
を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もし
くは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含み、上記第２のポリヌクレオ
チドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその誘導体を含むか
；または上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５のヌクレオ
チド配列、または配列番号２４もしくは配列番号２５のヌクレオチド配列と９０％もしく
は９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含み、上記第２のポリヌクレオ
チドは、配列番号２７もしくは配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２７も
しくは配列番号２８のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチ
ドを有するその誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列
ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含むＰＲＡＭＥポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施
形態において、上記第１のポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、上記第
２のポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列、配列番号４５もしくは配列番号４８
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いく
つかの実施形態において、上記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列番
号４７のヌクレオチド配列、または配列番号４６もしくは配列番号４７のヌクレオチド配
列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含み、上記第
２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列番号５０のヌクレオチド配列、また
は配列番号４９もしくは配列番号５０のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一
の連続ヌクレオチドを有するその誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、ヒトＰＲＡＭ
Ｅに結合する。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、
ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ提示の状況においてＰＲＡＭＥに結合する。いくつかの実施形態
において、上記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的に
結合し、ここで上記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子であり、上記ペプチドは
、ＰＲＡＭＥエピトープである。いくつかの実施形態において、上記ＭＨＣ分子は、ＭＨ
Ｃクラス１ ＨＬＡ Ａ２．０１分子である。いくつかの実施形態において、上記ＰＲ
ＡＭＥエピトープは、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬであるか、または上記ＰＲＡＭＥエピトープは
、ＱＬＬＡＬＬＰＳＬである。
いくつかの実施形態において、上記核酸は、上記ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドに作
用的に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記核酸分
子は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態に
おいて、上記ＣＤＲ３領域および上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする本
出願の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された改変された細胞が、提供される。い
くつかの実施形態において、上記改変された細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、本出願の核酸分子を含むプラスミドベクターまたはウイ
ルスベクターがまた、提供される。いくつかの実施形態において、本出願の核酸分子でト
ランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞が提供される。いくつかの実施形
態において、上記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを
含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を
さらに含む。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、本出願の改変された細胞、本出願の核酸、または本出願
のプラスミドベクターもしくはウイルスベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを
含む薬学的組成物がまた、提供される。
いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において
免疫応答を増強するための方法が提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞の治療
有効量を上記被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記被験
体は、少なくとも１個の腫瘍を有し、ここで上記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、上記
改変された細胞の投与後に減少している。いくつかの実施形態において、上記被験体は、
肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫からなる群より
選択される状態または疾患を有すると診断されている、メラノーマ、白血病、肺がん、結
腸がん、腎細胞がん、乳がん、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、およ
び神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患と診断されている。
いくつかの実施形態において、被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒
介性免疫応答を刺激するための方法が提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞を
上記被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、前記被験体におけ
る標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少している。ここで、い
くつかの実施形態において、上記改変された細胞は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチド
をコードする核酸を含み、上記方法は、上記被験体への上記改変された細胞の投与後に、
上記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを上記被験体に投与する工程をさ
らに包含する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドを投与すると、上記キ
メラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度は、上記多量体リ
ガンドを投与する前に上記被験体から得られるサンプル中の上記キメラカスパーゼ−９ポ
リペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較して、上記多量体リガンドを投与
後に上記被験体から得られるサンプル中で減少している。
いくつかの実施形態において、細胞においてＰＲＡＭＥに特異的に結合するＴ細胞レセ
プターを発現するための方法もまた提供され、上記方法は、本出願の核酸分子と細胞とを
、上記核酸が上記細胞へと組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって
、上記細胞が上記Ｔ細胞レセプターを上記組み込まれた核酸から発現する。
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏ
ｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「
１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つもしくは
１つより多くの」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃ
ｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉ
ｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅ
ｎ ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に
異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウ
スは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバッ
クグラウンドを有し得る。
本明細書で使用される用語「自家の」とは、宿主とドナー細胞との間で抗原性において
別個でない（例えば、ドナー細胞が宿主から得られる場合）ＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ
遺伝子座に言及する。
本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される
。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含
み得る。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺滅されたまたは不活性化さ
れたホールセルまたは溶解産物に由来し得る。例示的な生物としては、ヘリコバクター、
カンピロバクター、クロストリジウム、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、インフルエンザウイルス、パ
ラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｉ、プラスモディウム、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマ
ウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、大腸菌、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢
菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａが挙
げられるが、これらに限定されない。ゆえに、実質的にすべてのタンパク質またはペプチ
ドを含む任意の高分子が、抗原として働き得る。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡに由来し得る。病原性ゲノム、または免疫応答を誘発するタンパク質に対する
遺伝子もしくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を
含む任意のＤＮＡは、抗原の合成をもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの
核酸配列全体の使用に限定されない。本組成物および方法は、１つより多くの遺伝子また
はゲノムの部分的核酸配列の使用、およびこれら核酸配列が所望の免疫応答を誘起する種
々の組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されない。
用語「抗原提示細胞」は、少なくとも１つの抗原または抗原性フラグメントをその細胞
表面上に（または細胞表面に）ディスプレイするか、獲得するかまたは提示することがで
きる種々の細胞のいずれかである。一般に、用語「細胞」は、抗原または抗原性組成物に
対する免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞またはＢ細胞のアームからの免疫応答）の強
化を助けるという目標を達成する任意の細胞であり得る。例えば、Ｋｕｂｙ，２０００，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｐ．４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ（参照により本明細書中に援用される）において論じられ、ある
特定の実施形態において本明細書中で使用されるように、正常にまたはクラスＩＩ主要組
織適合分子もしくは主要組織適合複合体とともに免疫細胞に抗原をディスプレイするかま
たは提示する細胞が、「抗原提示細胞」である。ある特定の態様において、細胞（例えば
、ＡＰＣ細胞）は、別の細胞、例えば、組換え細胞または所望の抗原を発現している腫瘍
細胞と融合され得る。２つまたはそれを超える細胞の融合物を調製するための方法は、例
えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．６５−６６，７１−７４（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉ
ｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
．１３，Ｂｕｒｄｅｎ ＆ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｗ，ｐｐ．７５−８３，１９８４； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６，Ｇｅｆｔｅｒら
、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−２３６，１９７７（これらの
各々は参照により本明細書中に援用される）において論じられている。場合によっては、
細胞が抗原をディスプレイするかまたは提示する免疫細胞は、ＣＤ４＋ＴＨ細胞である。
ＡＰＣ上または他の免疫細胞上に発現されるさらなる分子は、免疫応答の強化を助け得る
か、または改善し得る。分泌分子または可溶性分子、例えば、サイトカインおよびアジュ
バントもまた、抗原に対する免疫応答を助け得るかまたは高め得る。様々な例が、本明細
書中で論じられる。
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例
えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインであり得る。抗原認
識部分の例としては、抗体由来のポリペプチド（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃ
Ｆｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントのような）；Ｔ細
胞レセプター由来のポリペプチド（例えば、ＴＣＲ可変ドメインのような）；シグナル伝
達ドメインに人工的に融合され得る分泌因子（例えば、サイトカイン、成長因子）（例え
ば、「ザイトカイン」）、および細胞外の同種（ｃｏｇｎａｔｅ）タンパク質に結合する
任意のリガンドまたはレセプターフラグメント（例えば、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ）が挙げ
られるが、これらに限定されない。コンビナトリアルライブラリーはまた、腫瘍関連標的
に高親和性で結合するペプチドを同定するために使用され得る。
用語「自己の」は、細胞、核酸、タンパク質、ポリペプチドなどであって、これが後に
個体に投与されるその同じ個体に由来するものを意味する。本方法の改変された細胞は、
例えば、自己細胞（例えば、自己Ｔ細胞のような）であり得る。
本明細書中で使用される用語「がん」は、そのユニークな特質である正常なコントロー
ルの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、
細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺がん、小細胞肺
がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉がん、
舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頚部がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、眼のがん、
腎がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、脳
がん、結腸がん、肉腫または膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能
に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれら
の子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性
があることが理解される。
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ
、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロ
セシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用す
ることの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。
完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非
コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンススト
ラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産
物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コ
ード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入
され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。
ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳
の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だ
けを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すために
も使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増
殖性障害（例えば、がん）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物また
は導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝
子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっ
ては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。
他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻
訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿
主生物において、作用的に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳する
ために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を
支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で
論じられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。
用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、抗原性分子に特異的に結合する免疫タンパク質である
。ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面上に存在する２つの異なるポリペプチドから構成される。それ
らは、主要組織適合性遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識またはこれに特異的に結合
する；その抗原に結合すると、Ｔ細胞は活性化される。「認識する」とは、例えば、上記
Ｔ細胞レセプターまたはそのフラグメント（単数または複数）（例えば、ＴＣＲαポリペ
プチドおよびＴＣＲβポリペプチド）が、一緒に、抗原と接触し、これを標的として同定
することができることを意味する。ＴＣＲは、αポリペプチドおよびβポリペプチド、ま
たは鎖を含み得る。このαポリペプチドおよびβポリペプチドは、２つの細胞外ドメイン
、可変ドメインおよび定常ドメインを含む。このαポリペプチドおよびβポリペプチドの
可変ドメインは、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する；ＣＤＲ３は、エピトープの
認識を担う主なＣＤＲであると考えられる。上記αポリペプチドは、ＶＪ再構成によって
生成されるＶおよびＪ領域を含み、上記βポリペプチドは、ＶＤＪ再構成によって生成さ
れるＶ、Ｄ、およびＪ領域を含む。上記ＶＪ領域とＶＤＪ領域との交差（ｉｎｔｅｒｓｅ
ｃｔｉｏｎ）は、ＣＤＲ３領域に相当する。ＴＣＲはしばしば、国際免疫遺伝学（ＩＭＧ
Ｔ）ＴＣＲ命名法（ＩＭＧＴ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ． ＩＭＧＴ．ｏｒｇ； Ｇｉ
ｕｄｉｃｅｌｌｉ， Ｖ．ら，ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、ＩＭＧＴ（登録商標） ｃｏ
ｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａ
ｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３４， Ｄ７８１−Ｄ７８４ （２００６）．
ＰＭＩＤ： １６３８１９７９；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏ
ｋ， ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉ
ＳＢＮ ０−１２−４４１３５２−８）を使用して命名される。
「特異的に結合する」とは、Ｔ細胞レセプターに関するとき、あるいは本明細書中の組
換えＴ細胞レセプター、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、バリアント、もしく
はアナログ、または改変された細胞（例えば、ＰＲＡＭＥ Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レ
セプターＣＤＲ３領域、およびＰＲＡＭＥ ＴＣＲを発現する改変された細胞など）を指
すとき、Ｔ細胞レセプターもしくはそのフラグメントが、ＰＲＡＭＥ抗原を認識するかま
たはこれに選択的に結合することを意味する。ある種の条件下では（例えば、イムノアッ
セイ、例えば、本明細書で論じられるイムノアッセイでは）、上記Ｔ細胞レセプターはＰ
ＲＡＭＥに結合し、他のポリペプチドには有意な量で結合しない。従って、上記Ｔ細胞レ
セプターは、コントロール抗原性ポリペプチドに対するより少なくとも５倍、１０倍、２
０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍高い親和性でＰＲＡＭＥに結合する。こ
の結合はまた、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲを発現する改変されたＴ細胞の状況において間接的に
決定され得る。例えば、本明細書で論じられるアッセイのようなアッセイにおいて、上記
改変されたＴ細胞は、ＰＲＡＭＥ発現細胞株、細胞、または組織（例えば、骨髄腫、ＡＭ
Ｌ、またはＡＬＬの細胞のような）に対して特異的に反応性である。従って、上記改変さ
れたＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、ＰＲＡＭＥ発現細胞株ではないコントロール細胞
株に対するその反応性と比較した場合、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０
倍、５０倍、または１００倍高い反応性でＰＲＡＭＥ発現細胞株に結合する。上記ＰＲＡ
ＭＥ Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターＣＤＲ３領域、およびＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発
現細胞株は、例えば、細胞表面上に発現されるＰＲＡＭＥに結合し得、そして代表的には
、主要組織適合マーカー（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｍａｒ
ｋｅｒ）（ＭＨＣ）提示（例えば、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ提示）の状況において、例え
ば、ＭＨＣクラス１ ＨＬＡ Ａ２．０１提示の状況において、ＰＲＡＭＥに結合し得る
。
本明細書で使用されるとき、用語「機能的に等価な」とは、例えば、Ｔ細胞レセプターに
関するとき、またはＴ細胞レセプター核酸フラグメント、バリアント、もしくはアナログ
を指すとき、抗原もしくは細胞に対する免疫応答を刺激するＴ細胞レセプターもしくはＴ
細胞レセプターポリペプチドをコードする核酸を指す。ＴＣＲ認識または抗原への結合の
状況において、上記ＴＣＲは、ペプチド−ＭＨＣ複合体の一部としてエピトープとして抗
原を認識し得る。Ｔ細胞レセプターポリペプチドの「機能的に等価な」または「機能的フ
ラグメント」とは、例えば、Ｔ細胞レセプタードメイン（例えば、定常領域）を欠いてい
るが、Ｔ細胞に代表的な免疫応答を刺激し得るＴ細胞レセプターを指す。機能的に等価な
Ｔ細胞レセプターフラグメントは、例えば、単独でまたはＭＨＣ複合体において、抗原に
特異的に結合し得るかまたは抗原を認識し得、そして結合または認識すると、Ｔリンパ球
を活性化し得る。例えば、ＴＣＲの、またはＴＣＲαポリペプチドもしくはＴＣＲβポリ
ペプチドのＣＤＲ３領域をコードする核酸分子またはヌクレオチド配列の誘導体は、ＴＣ
Ｒの、またはＴＣＲαポリペプチドもしくはβポリペプチドの機能的ＣＤＲ３領域をコー
ドする、そして例えば、単独でまたはＭＨＣ複合体において、抗原に特異的に結合するか
または抗原を認識するポリペプチドをコードする核酸分子またはヌクレオチド配列である
。ＴＣＲαポリペプチドまたはＴＣＲβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のこ
れら誘導体は、例えば、ＴＣＲαポリペプチドまたはＴＣＲβポリペプチドをコードする
相当するヌクレオチド配列と８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９５％超同一の連
続ヌクレオチドを有し得る。Ｔ細胞レセプターポリペプチドのＣＤＲ３領域の「機能的に
等価な」または「その機能的フラグメント」は、例えば、改変されたアミノ酸配列を有し
得、そして例えば、上記αポリペプチドもしくはβポリペプチドのアミノ酸配列、または
その相当するαポリペプチドおよびβポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９５％も
しくは９５％超同一であるが、Ｔ細胞レセプター（例えば、組換えＴ細胞レセプター）の
一部として含まれる場合に、Ｔ細胞に代表的な免疫応答を刺激し得るαポリペプチドおよ
びβポリペプチドを有し得るＴ細胞レセプターのことを指す。アミノ酸配列およびアミノ
酸配列誘導体、またはヌクレオチド配列の同一性を計算するにあたって、組換えＴＣＲα
ポリペプチドもしくはβポリペプチド、またはそのＣＤＲ３領域もしくは他のフラグメン
トの発現を増強するために使用されるシステイン、あるいはシステイン残基をコードする
コドンは、配列番号として本明細書で提供される配列がシステイン改変を有しない場合の
パーセンテージ計算の一部として考慮されない。用語「機能的に等価な」または「機能的
フラグメント」が、他の核酸またはポリペプチド（例えば、カスパーゼ−９もしくは切断
型カスパーゼ−９のような）に適用される場合、その用語は、本明細書中の方法の参照ポ
リペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント、バリアントなどのことを指す
。例えば、腫瘍抗原ポリペプチド（例えば、ＰＳＭＡのような）の機能的フラグメントは
、抗原性であり得、特定の腫瘍抗原を認識する抗体を産生させ得る。リガンド結合領域の
機能的フラグメント、例えば、Ｆｖｌｓは、適切なリガンドに結合するのに十分なリガン
ド結合領域ポリペプチドの部分を含む。「機能的に等価な」とは、例えば、細胞外ドメイ
ンを欠いているが、Ｔ細胞において発現されたとき、Ｔ細胞媒介性の腫瘍殺滅応答を増幅
することができる、共刺激ポリペプチドのことを指す。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的
な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定され
ない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または
炎症性腸疾患が挙げられ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチド
またはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用
語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペ
プチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、よ
り小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質
のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を
果たす自己抗原、およびがん細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱く
なっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機
能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。その
ような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群
または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の
欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を
有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減
少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であ
り得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒ
ａｌ ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得
るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病
原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染している
ことに起因し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物
またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の
有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべ
ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤な
どを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分
野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクター
または細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図さ
れる。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態にお
いて、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである
。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として
定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中
で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの
「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチド
は、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチド
には、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含ま
れるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常の
クローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノム
からの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されな
い。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方
法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸
は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、
アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという
用語は、タンパク質という用語と相互交換可能であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始
するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識される
ＤＮＡ配列として定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答を制御する」、「免疫応答を調節する」
または「免疫応答をコントロールする」とは、免疫応答を改変できることを指す。例えば
、組成物は、免疫応答を増強することおよび／または活性化することができる。なおもさ
らに、組成物は、免疫応答を阻害することもできる。制御の形態は、組成物とともに使用
されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログが、共刺激性ポ
リペプチドの二量体化をもたらし、Ｔ細胞活性化をもたらすが、しかしながら、その化学
物質のモノマーアナログは、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、Ｔ細胞を活性
化しない。
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性Ｄ
ＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション
（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃
送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅ
ｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が
可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有
する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物
。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき
、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、
ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまた
は他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、
鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含
む）を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形
態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワ
クチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を
含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途
処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サ
イトカインおよび／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を
引き起こすことができる。
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作用的に連結された」は、
プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸
に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置さ
れる」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のこと
を指す。その用語は、例えば、がん性の固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用されるとき
、固形腫瘍またはがんに対する被験体の抵抗性を高める予防的処置による予防のことを指
す。いくつかの例において、被験体は、がんを予防するために処置され得、ここで、その
がんは、家族性であるか、または遺伝的に関連する。その用語は、例えば、感染症に関し
て使用されるとき、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置、すな
わち換言すれば、その被験体が病原体に感染する可能性もしくはその感染症に起因し得る
疾病の徴候を示す可能性を低下させる予防的処置、ならびに感染症と闘うための、例えば
、感染症を弱めるためもしくは排除するための、または悪化するのを防ぐための、その被
験体が感染した後の処置のことを指す。
本明細書で提供される方法は、例えば、腫瘍抗原の上昇した発現が存在する疾患、障害
、または状態を処置するために使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形
態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワ
クチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を
含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途
処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体の産
生、サイトカインの産生および／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されな
い免疫応答を引き起こすことができる。
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「
血液の疾患」は、血液およびその成分（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含む
が、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の
産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な
例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉ
ｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生
の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感
染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞およ
び血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染
症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐ
ｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（ＣＤ３＋）：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リン
パ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ
細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞
のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在に
よって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）
と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織
適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例え
ば、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。
Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラス
ター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わ
せ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、
しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例
えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称さ
れる）。ＣＤ３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および
／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるか
または調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分
（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血
液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ
）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌ
ｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。
臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細
胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製される
ことを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。
これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、およ
び子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
あるパーセントの細胞が殺滅される場合におけるような「殺滅する（ｋｉｌｌ）」また
は「殺滅する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法
を用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。その用語は、細胞
剥離のことも指し得る。
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後
に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投
与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよ
び同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用され
ることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反
応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後
、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の
活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レ
シピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす
。
機能保存的バリアントは、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化
させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、ある
アミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有す
るアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的
にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である
。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の
特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異
なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配
列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき
、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば、少なくと
も９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配
列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配
列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は
、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラ
インメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配
列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。
配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例
えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡ
ＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知である。これらのプロ
グラムのうちのいずれかを使用するとき、用いられる設定は、最も高い配列類似性をもた
らす設定である。
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または
「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて
脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチッ
ク培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のこ
とを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性で
ある。
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の
初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞
は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉およ
び中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型
を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み
出せないという点で、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）は、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏ
ｔｅｎｔ）と区別される。
誘導性多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導性多能性幹細胞」または「人
工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞などの、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化
できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発
現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／また
は化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または
誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導性多能性幹細胞は、それらが
、中間に分化したまたは最終分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など
）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能
性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上
にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ
３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、
「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば
、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、
またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、
臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆体細胞、
リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の
間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、
ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白
血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚
線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪
性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫
、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多
い。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、標的化された様式（ｍａｎｏｒ）で、腫瘍に浸潤し、
腫瘍細胞を殺滅する、様々なレセプターを有するＴ細胞のことを指す。本願の方法を使用
してＴＩＬの活性を制御することは、腫瘍細胞の排除のより直接的なコントロールを可能
にし得る。
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用
される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、
宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され
得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体
、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された
遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）また
は異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物
の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子
は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現
ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進
し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミ
ネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操
作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにお
ける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。
発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するため
の選択マーカーを含む。
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御される
プロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始さ
れるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメ
ラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御
されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し
得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロ
モーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプ
ロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発
生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、そ
の細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセス
を経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、
皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化
（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングさ
れるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチ
ン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細
胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシ
ス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現
されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす
、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝
子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的
な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定され
ない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または
炎症性腸疾患が挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定
の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベ
クターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、エ
キソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、細胞は、
インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキ
ソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。
いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対しても
たらされる。時折、免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。時折
、免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、細胞は、
アジュバントの添加なしに活性化される。
いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮内
投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボに
おいて核酸を形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時折、その細胞は、
エキソビボにおいて核酸を形質導入される。時折、その細胞は、インビボにおいて核酸を
形質導入される。
いくつかの実施形態における細胞は、時折、エキソビボにおいて抗原と接触される。あ
る特定の実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答、例えば、細胞傷害性
Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答が、その抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態
において、免疫応答が、腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に対してもたらされる。いくつか
の実施形態において、核酸は、エキソビボにおいて調製され、例えば、皮内投与または皮
下投与によって、被験体に投与される。時折、細胞は、エキソビボまたはインビボにおい
て核酸を形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された
プロモーター配列を含む。あるいは、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域
を含む、エキソビボにおいて転写されるＲＮＡを含む。
固形腫瘍の「腫瘍サイズを減少させる」または「腫瘍の成長を阻害する」とは、標準的
なガイドライン、例えば、例えば、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（Ｒｅ
ｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏ
ｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）基準に従う、処置に対する応答または疾患の安定化のことを意味
する。例えば、これは、固形腫瘍の直径の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５
０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少、または腫瘍、循環腫瘍
細胞もしくは腫瘍マーカーの数の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６
０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少を含み得る。腫瘍のサイズは、例
えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、胸部Ｘ線（肺の腫瘍の場合）また
は分子イメージング、例えば、ＰＥＴスキャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸＴＭ／Ｍ
ＩＰ−１０７２／１０９５である場合など、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、
例えば、ＰＳＭＡリガンドを投与した後のＰＥＴスキャン、または分子イメージング、例
えば、ＳＰＥＣＴ、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウム
で標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｄ）ペンデチド（ｐｅｎｄ
ｅｔｉｄｅ）（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）などを用いるＰＥＴスキャンをはじめとした任
意の方法によって解析され得る。
「腫瘍の血管新生を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍
の血管新生の量と比べたときの、腫瘍の血管新生の約５％、１０％、２０％、３０％、４
０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少または新しい血
管構造の出現の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８
０％、９０％もしくは１００％の減少のことを意味する。その減少は、１つの腫瘍につい
て言及していることもあるし、１つより多い腫瘍における血管新生の合計または平均でも
あり得る。腫瘍の血管新生を測定する方法としては、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、
例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴもしくはＰＥＴス
キャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸＴＭ／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である場合な
ど、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡリガンドの投与後のＰ
ＥＴスキャンなど、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウム
で標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブペンデチド（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）など
を用いるＰＥＴスキャンが挙げられる。
例えば、腫瘍が、前立腺に存在するものであるか、または前立腺における腫瘍に由来す
るかもしくは前立腺における腫瘍から転移したものであるか、またはＰＳＡを産生するも
のであるとき、その腫瘍は、前立腺がんの腫瘍などと分類されるかまたは器官の一部とし
て命名される。例えば、腫瘍が、被験体の前立腺における腫瘍と同じまたは同様の染色体
切断点を有すると決定されるとき、その腫瘍は、前立腺における腫瘍から転移したもので
ある。
血液悪性腫瘍に関して、「血液悪性腫瘍を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する
」とは、処置前の悪性細胞の量または濃度と比較したとき、例えば被験体から得られるサ
ンプル中で測定される場合に、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０
％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の悪性細胞の量または濃度の減少、遅延ま
たは阻害のことを意味する。悪性細胞もしくは腫瘍負荷の量または濃度を測定するための
方法としては、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムワイドシーケンシングが挙げられる
。
血液腫瘍に関して、「腫瘍負荷を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、
処置前の腫瘍細胞の量または濃度と比較したとき、例えば被験体から得られるサンプル中
で測定される場合に、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０
％、８０％、９０％もしくは１００％の腫瘍細胞の量または濃度の減少、遅延または阻害
のことを意味する。腫瘍細胞の量または濃度を測定するための方法としては、例えば、ｑ
ＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムワイドシーケンシングが挙げられる。
（発現構築物の操作）
本発明のＴＣＲまたはキメラポリペプチドを発現する発現構築物は、ＴＣＲまたはポリ
ペプチドコード領域およびプロモーター配列（全て作用的に連結される）を含む。一般に
、用語「作動可能に連結される（operably linked）」とは、プロモーター配列が第２の
配列に機能的に連結されており、ここで上記プロモーター配列が、上記第２の配列に相当
するＤＮＡの転写を開始および媒介することを示すことを意味する。
ある種の例において、ＴＣＲまたは他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
、上記第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイ
ルスベクターもしくはプラスミドベクターなどの）の中に含まれる。この第２のポリペプ
チドは、例えば、カスパーゼポリペプチド（本明細書で論じられるとおり）またはマーカ
ーポリペプチドであり得る。これらの例において、上記構築物は、切断可能な２Ａポリペ
プチドによって、または内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）によって連結された、２個
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１個の
プロモーターとともにデザインされ得る。これらの例において、上記第１のおよび第２の
ポリペプチドは、翻訳の間に分断され、ＴＣＲおよびさらなるポリペプチドを生じる。他
の例において、この２個のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで
上記ポリペプチドのうちの一方をコードするポリヌクレオチドを含む各核酸は、別個のプ
ロモーターに作動可能に連結される。さらに他の例において、１個のプロモーターは、２
個のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、２個の別個のＲＮＡ転写物、および従って
２個のポリペプチドの生成を指向する；一例において、上記プロモーターは、２方向性で
あり得、そのコード領域は、５’−３’の反対方向にあり得る。従って、本明細書で論じ
る発現構築物は、少なくとも１個、または少なくとも２個のプロモーターを含み得る。
さらに他の例において、２個のポリペプチド（例えば、ＴＣＲおよびカスパーゼポリペ
プチドなど）は、２個の別個のベクターを使用して細胞によって発現され得る。上記細胞
は、ベクターで共トランスフェクトもしくは共形質転換され得るか、または上記ベクター
は、異なる時点で上記細胞に導入され得る。
上記ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端までそれらの順序において変動し
得る。種々のドメインの順序は、最適な発現および活性を得るために、例えば、本明細書
で論じる方法などの方法を使用してアッセイされ得る。
選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めること
によってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そ
のようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変
化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび
形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシ
ン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子
は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（
ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ド
メインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、低親和性神経成長因子レ
セプター（ＬＮＧＦＲ））もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によ
って媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝
子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられな
い。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦ
Ｐ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
）が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９
などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用さ
れる。本明細書中で論じられるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち
、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。
ある種の実施形態において、上記マーカーポリペプチドは、誘導性キメラシグナル伝達
分子に連結される。例えば、上記マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列（例えば、
切断可能な２Ａ様配列など）を介して、誘導性キメラシグナル伝達分子に連結され得る。
上記マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９、ΔＣＤ１９であり得るか、または例え
ば、上記誘導性キメラシグナル伝達分子の活性に影響を与えないように選択された異種タ
ンパク質であり得る。
２Ａ様配列または「ペプチド結合スキッピング」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ
ａｓｉｇｎａ由来のものを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配
列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分
断されるように意図された２つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソ
ームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａの配列の場
合、カルボキシ末端「Ｐ−Ｇ−Ｐ」におけるＧｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結
合が省略される。これは、共刺激ポリペプチド細胞質領域およびマーカーポリペプチドの
場合に、２個〜３個のポリペプチドを残す。この配列が使用されるとき、２Ａ配列の５’
側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Ｇｌｙ残基および２Ａ配列内の
任意の上流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。２Ａ配列の３’側でコード
されるペプチドは、アミノ末端において、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列の後ろの任意の下流
残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞をソーティングする一助とするた
めに、発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、ＣＤ３４最小エピトープは、ベクターの
中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＴＣＲを発現
させるために使用される発現ベクターは、１６アミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコー
ドするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中の例において提供されるある特定の実
施形態などのいくつかの実施形態において、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８ストーク
のアミノ末端位置において組み込まれる。
リガンド結合領域
リガンド結合領域は、本明細書で論じられるキメラポリペプチド中に、例えば、誘導性
カスパーゼポリペプチドの一部として含まれ得る。発現構築物のリガンド結合（「二量体
化」）ドメインは、天然もしくは非天然のリガンド（例えば、非天然の合成リガンド）を
使用して誘導を可能にする任意の都合の良いドメインであり得る。多量体化領域またはリ
ガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に依存して、細胞膜に対して
内部または外部にあり得る。多種多様なリガンド結合タンパク質（レセプターを含む）は
、上記で示される細胞質領域と会合するリガンド結合タンパク質を含め、公知である。本
明細書で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、用語「レセプター」と互換
性であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるか、または容易に
産生され得るリガンド結合タンパク質は、特に重要である。これらリガンド結合ドメイン
またはレセプターは、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター
、テトラサイクリンレセプター、上記で示される他のレセプターなど、ならびに抗体、特
に重鎖もしくは軽鎖サブユニットから得られ得る「非天然の」レセプター、その変異され
た配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配
列を含む。ある種の実施形態において、上記リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合
領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合
領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、およびテトラサイクリンレセプター
リガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、上記リガンド結合領域は、Ｆｖ
Ｆｖｌｓ配列を含む。ときおり、上記Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさら
に含む。上記ＦＫＢＰ１２領域は、例えば、３６位でのアミノ酸置換、例えば、バリン、
ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有し得
る。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ， Ｓ．Ｊ．ら， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆
Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３−３２１ （２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ， Ｊ．
Ｅ．ら， Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ． ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐ
ｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７−６７５ （２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，
Ｔ． （２００６） Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７：４４０−２；
Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．， ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｆｒｏｍ
Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄ
ｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ （Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， ｓ．ら編， Ｗｉｌｅｙ， ２００７
））において論じられるものが挙げられる。例えば、配列番号７７のアミノ酸配列は、３
６位においてバリンのアミノ酸置換が存在する（本明細書中の配列において３５番目のア
ミノ酸として提供される）配列の一例を表す。配列番号８４のアミノ酸配列は、３６位に
おいて野生型フェニルアラニンを有する（本明細書中の配列において３５番目のアミノ酸
として提供される）ＦＫＢＰ１２のアミノ酸配列を表す。
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたは
その切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸
未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイル
スベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モ
ノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可
能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応
じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のい
ずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガン
ドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合
ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は
、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメ
インをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を
有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する
場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得
る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセ
プターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−
リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけ
るコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み
得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に
対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン（複数可）を公知の変化によってまたは
ランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、
得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され
得る。
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳
細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融
合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさ
ず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されない細胞外ドメインな
どの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親
和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児
抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性につい
てスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニッ
トをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変
異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合
タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る
任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピ
トープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であっ
て、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマ
ー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得る
が、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用
され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの
反復の数に関して、変動し得る。
カスパーゼ−９ポリペプチドを多量体化する場合、キメラ誘導性カスパーゼ−９ポリペ
プチドのリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なく
とも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結
合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域
」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リ
ガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプター
ドメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガン
ドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機
分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未
満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用
され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、
ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シク
ロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲ
ンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイ
ドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリ
ンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプター
とともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使
用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニ
ット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタ
ンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列など
を含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリ
ガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができ
る点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。
また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途
のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／
親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質また
はポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用
する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノ
マーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合された
シグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃ
ｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐ
ｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａ
ｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：３
０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９
９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化お
よび活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，
Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ
．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激
する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：９８０５−９８０９
；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
１９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的
に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂
質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その
正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的
に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰおよびミリストイ
ル化配列を、標的レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二
量体化剤薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でシグナル
伝達を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナロ
グを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ
２０１８７／ＡＰ１９０３ ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対す
る高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導
することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化剤薬物に結合
する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１
２ｖ３６）もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵
抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほ
とんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キ
メラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに
結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化
学物質である。例示的なリガンドとしては、二量体のＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２
）が挙げられるが、これに限定されない。
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変され
たリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）などであり得る：Ｆ３６がＶに置
換されたヒト１２ｋＤａ ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミ
ノ酸１〜１０７）は、合成二量体化剤薬物ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊ
ｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００
８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパ
ク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の
際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎ
バージョンである。それは、 Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードす
るが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、
レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌ
ｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ
３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、
１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含む
。
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領
域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時
折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６アナログである。ある特
定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＩＮＮ：リミズシド、ＣＡＳ索引名
：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメ
トキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１
−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフ
ェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（
Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子
式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０ 分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態に
おいて、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。ある特定の実施形態において、リガンドは
、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。いくつかの実施形態にお
いて、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログ
は、ＦＫＢＰ１２の変異体（Ｖ３６）バージョンに対して適切であり得る。ある特定の実
施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施
形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域
が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、
ゆらぎバージョンであり得る。
企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシ
ステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたＲａｆ
タンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒら、１９９
６を参照のこと。
ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造
されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは
、ＡＡＩ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐによって作製されている。それは
、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２
５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、
この製剤は、透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、長期の貯蔵において可逆的
な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る
。１本分は、１０ｍＬのガラスバイアルにおける８ｍＬである（バイアル１本あたり合計
約４０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
使用のために、ＡＰ１９０３は、室温へと加温され、投与前に希釈される。５０ｋｇを
超える被験体に関しては、ＡＰ１９０３は、１００ｍＬ 生理食塩水中で希釈した４０ｍ
ｇの用量で、ＤＥＨＰ非含有食塩水バッグおよび溶液セットを使用して、５０ｍＬ／時間
の速度で２時間かけてｉ．ｖ．注入を介して投与される。５０ｋｇ未満の被験体は、０．
４ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３を受ける。
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、ア
クセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
ＡＰ１９０３を投与する必要性、ならびに改変されたＴＣＲ発現Ｔ細胞のアポトーシス
を誘導するためにカスパーゼ−９を活性化する必要性を決定する際、患者には、例えば、
非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩ
Ｖ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（
０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別
に計算され、体重が≧１０％変動しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入
前に０．９％生理食塩水において１００ｍＬに希釈される。
ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、Ｉ
Ｖ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという用量レ
ベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ
１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋ
ｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入
期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１
０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３ ｆ
ｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいこ
とが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら、Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
使用されるＡＰ１９０３ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、
２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効率的なシグ
ナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるＡＰ１９０３の量は、約１０〜１００
ｎＭ（ＭＷ：１４１２Ｄａ）である。これは、１４〜１４０μｇ／Ｌまたは約０．０１４
〜０．１４ｍｇ／ｋｇ（１．４〜１４０μｇ／ｋｇ）に等しい。投与量は、用途に応じて
変動することがあり、ある特定の例では、０．１〜１０ｎＭの範囲内、または５０〜１５
０ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、７５〜１２５ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、１００〜６００ｎ
Ｍ、１００〜７００ｎＭ、１００〜８００ｎＭもしくは１００〜９００ｎＭの範囲内であ
り得る。１ｍｇ／ｋｇまでの用量が、上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において耐容性が
よかった。
膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列
または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会
合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタ
ンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつ
かのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部
分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識
され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一
のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電
した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ
−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複
数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼ
ＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある
特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、
Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に
配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８ア
ミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘ
ａａ−Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ−アシル化され、Ｃ
ｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが
多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａ
ａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサ
ブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他
のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒ
ｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用さ
れ得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １
５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３
：６９７−７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
１１０：６７３−６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモ
チーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態
において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に
組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓま
たはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分（例えば、そのようなタンパク質由
来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異
を有する、その天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１９アミノ酸または約１
５〜約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定
の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニ
ット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列
の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ酸または約１５〜約１８アミノ酸）が、
キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ ｐ値を有し
、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ ｐ値を有する。Ｌｏｇ ｐ値は、疎水性の尺度
であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を
有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ ｐ値を有すると
特徴付けられる。Ｌｏｇ ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏ
ｇ ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅ ５９９、エントリー４４９
３は、４．２というｌｏｇ ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分
が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論
じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ
１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シ
クロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃ
ｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ４）アル
キルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピ
ル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）
、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウ
リル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）
、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり
、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合
）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン
、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇ
ｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））また
はそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしく
は５個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。宿主において機能
性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし
会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形
態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的
化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸ
ボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグ
ナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば
、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２０
０７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げ
られる。
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する
。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞
内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨド
メインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，
４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合し得るので、種
々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際
に鍵となる役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ−３
キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、ア
シル脂質による相互作用ほど安定でない。
調節領域
１．プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモ
ーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができ
る限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌ
クレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモ
ーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そ
のようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモー
ター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β−アクチ
ン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目
的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にと
って十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他の
ウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーター
の使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、
トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパタ
ーンが、最適化され得る。
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選
択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、また
はマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベク
ターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の
発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺
伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導
性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製
に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそ
のようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御さ
れた発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベル
の発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構から
なる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき
、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そ
のレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レ
ベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの
両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発
現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、
このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入する
ことが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドと
レセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在
的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能にな
り得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡに
よって活性化され得る。
有用であり得る別の誘導性システムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄに
よって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ−
ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステ
ムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン
）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシス
テムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ
−ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンにな
る。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制
御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペ
レーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、プラ
スミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろで
プラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコ
ントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメ
ントは、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメイ
ンおよび野生型テトラサイクリンリプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイ
クリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムで
は、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下におい
て転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキ
シサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現
を妨げ得るように、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者
に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御するこ
とが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の
発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力
な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎ
ｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−
４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強
力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞におけ
る導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウ
イルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイル
スプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ Ｌ
ＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のも
の）、ＡＡＶ ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性ま
たは望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたら
すために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプ
ロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性もも
たらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９７５−７９；
Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２−３１）。例え
ば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺
性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：Ｂ２９／ＣＤ７９ｂ（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）
；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ
）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；
フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；Ｇ
ＦＡＰ（アストロサイト）。
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を
活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であ
るようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーター
および炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノー
ゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−
２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８
）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビ
ン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清
アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓ
ｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−
８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６
１８１−６１９１）、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａ
ｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、α−１抗ト
リプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホ
ルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導
可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、
メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボ
ールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、α−２マクログ
ロブリンおよびα−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例え
ば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、
エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロ
ビンおよびクレアチンが挙げられる。
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応
じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それ
らが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモ
ーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモータ
ーが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
２．エンハンサー
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写
を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かつい
くつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連する
エンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０お
よびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントの
ように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。
すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以
上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操
作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、
転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当て
はまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開
始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性
を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しば
しば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには
、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配
列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る
、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が含まれる。
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使
用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（
例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７７６−８８に概説されている）。
例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエ
ンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、
これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切
な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提
供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得
る。
３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもた
らすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナ
ルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のその
ような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シ
グナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は
、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現
カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高
めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち
得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端
における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍ
ｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７
７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。
４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。こ
れらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをは
じめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、イン
サート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置
される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現
の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使
用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される
。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデ
ルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔ
ｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８
８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩ
ＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒ
ｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃ
ｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。Ｉ
ＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲ
ＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、
ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープ
ンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の
遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用
して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８
１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得
る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、
コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より
効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって
、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し
得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙ
ｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ
Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８
８；Ｙａｎ．，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎ
ｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．
Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈ
ｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓ
ｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．
Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．
Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ
．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。例えば、ＦＫＢＰ１２
または他の多量体化領域ポリペプチド、カスパーゼ−９ポリペプチド、およびＴＣＲポリ
ペプチドコードポリヌクレオチド配列は、コドンの変化によって最適化され得る。
リーダー配列
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすた
めに付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与す
る。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎ
ｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌ
ｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．
Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１
７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ
，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕ
ｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙ
ａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−
８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３８３−
９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥ
リーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最
適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモー
ター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ
．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ ３ ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎ
ｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−
８８に提示されているような）。
核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは
その誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す
。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「
Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）
に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用
語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核
酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３
４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７
、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、
６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７
４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７
、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００
、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０
、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０
、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０
、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０
、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００
、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００
、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００
、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００
、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００
、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは
１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し
得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ること
が企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１
３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２
３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３
３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４
３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５
２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６
２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７
２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８
２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９
２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続
したヌクレオチドであることが特に企図される。
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」
または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または
部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解され
る。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義で
ある。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイ
ズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリ
ンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件
（複数可）」を包含する。
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高スト
リンジェンシー」は、相補的な配列（複数可）を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその
１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリ
ダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間の
ミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であ
り、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては
、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特
異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．
５Ｍ ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。
所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸（複数可）の長さ、標
的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハ
イブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他
の溶媒（複数可）の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な
例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望の
ストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロー
ルとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に
応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダ
イゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下におい
て核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／また
は高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件
は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリ
ンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１
５Ｍ〜約０．９Ｍ ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または
高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を
変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、
あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を
有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺
伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知で
ある。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ
酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存されていると示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において
異なり得、その結果、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列また
はアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決
定されるとき、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、およ
び例えば、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」
は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の
類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中
の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意
味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性
（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプ
ロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するため
の数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅ
ｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知で
ある。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、使用される設定は、最も高
い配列類似性をもたらす設定である。
核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡ
もしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が
挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾さ
れ得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、β−Ｄ−リボ−
フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウ
ラシルのうちのいずれか１つである。
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌク
レオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−
４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキ
シベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−
アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リ
ボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミ
ジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙
げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロ
ピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキ
サンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロ
イミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ア
ミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベ
ンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、
５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、
７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチ
ル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイ
ソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニ
ル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎ
ａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニ
ル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、例えば、核酸（nucleid acid）は、リン酸骨格修飾を
有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ
、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スル
ホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール
および／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシ
ドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシ
クロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロー
ス、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロ
ースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマ
ンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つ
の酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル
基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシク
ロ［３．３．１］ノナンである。
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として
公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重
鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置
き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作
用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタ
ッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水
素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さ
らに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特
異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロイ
ンドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユ
ニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、
７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダ
ゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構
造的誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフ
ルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異な
り、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニ
バーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミ
ダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカル
ボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチ
リリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含む
オリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引
き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインド
リル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピ
リジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリ
リル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチル
インドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、
フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれ
らの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイ
ミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成
手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさ
らに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビ
ス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミド
エステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−
１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミ
デートなどの作用物質が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の
組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」た
めに使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆ
えに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニング
も可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または
複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもし
くはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、ま
たはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾
されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾
ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５
、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０ま
たは９５％）であり得る。
核酸の調製
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質
として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公
知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製
され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、
組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（
細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高め
るような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび
界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌ
クレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホス
ホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシ
ヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異な
るオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子
を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロ
マトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するた
めに使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動
、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る
。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮ
Ａ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グア
ニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサ
ルコシン）で溶解する工程を含む。
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。
いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜
６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールが
うまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有す
る無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる
。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で
溶解する工程（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成
される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する
工程；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混
合物を形成する工程（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％
である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用する工程；ｅ）イオ
ン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程；およびｆ）その核酸分子
を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体
および体積で再懸濁され得る。
遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必
要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによら
ない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が
提供される。
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することに
よって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の
形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、Ｄ
ＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。
宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされ
るポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真
核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するため
に利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所として
の機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。具体的な実施形態では、宿主細胞
は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞
である。
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基
づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物
宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使
用される細菌細胞としては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商
業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌ
ｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標
），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌
細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用さ
れ得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定され
ない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例として
は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓおよび
ＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、
ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、
ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およ
びこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それ
らの方法も本明細書中で論じられる。
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞、例えば、Ｔ細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または
本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用さ
れ得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン
性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ Ｐ
ＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
１．エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフ
ェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロ
におけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、
ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし
、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織
が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおい
てトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞ま
たは組織は、生物の中に配置され得る。例えば、Ｔ細胞は、動物から得られ得、上記細胞
は、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換され得、次いで、その動物へと投与
して戻され得る。
２．注射
ある特定の実施形態において、細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、
１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静
脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小
器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液
を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクション
によるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、な
らびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方
法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅
速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより
、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る
。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留
置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な
送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
３．エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して
細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およ
びＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、あ
る特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細
胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性に
する（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功し
ている。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフ
ェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実
行されている。腫瘍抗原をコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次い
で、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化して
いる細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされる腫瘍
抗原を発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、腫瘍抗原を発現し
ているこれらの樹状細胞が、リンパ節に遊走し、腫瘍抗原を提示し、腫瘍抗原特異的Ｔ細
胞をプライムし得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合
、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、
エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｗ
ｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ
ａｐｙ ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照に
より援用される）に論じられている。
４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入さ
れる。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクト
された（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２
７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマー
カー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々
のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。
５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して
、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、
マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ）
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）に
よるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジ
ンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。
７．リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームな
どの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特
徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質
層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。
それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶
質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９
１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａ
ｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ
Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも
企図される。
８．レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞
に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイト
ーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布
に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンド
およびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに
作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レ
セプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａ
ｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０
，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能
性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ ａｎ
ｄ Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１
９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞の集団上
に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチ
ド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達される
べきポリヌクレオチド（複数可）は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンド
は、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細
胞のレセプター（複数可）に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのよう
なシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレ
ーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシ
ステムを使用して機能的であると示された。
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達
ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合
を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端の
アシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細
胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７
）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転
換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
９．微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生
物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５
３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６
９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡをコ
ーティングした微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せ
ずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎ
ａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、
それらの多くは、本方法に適用可能である。
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティ
ングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバ
イスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が
輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生
物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった
。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成さ
れた粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤ
ＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要としないことが
企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを
含み得ることが企図される。ＤＮＡをコーティングした粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送
達のレベルを上昇させ得るが、必要ない。
１０．トランスポゾン媒介性移入
トランスポゾン媒介性移入法はまた、例えば、ｐｉｇｇｙ／Ｂａｃ遺伝子移入システム
を使用して、用いられ得る。Ｓａｔｏ， Ｍ．ら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２０
１４ Ｏｃｔ ２４． ｄｏｉ： １０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１４００２８３．
［印刷物に先駆けた電子出版］。
ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発
現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細
胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使
用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介す
るウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞
に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方
法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される
。
１．アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範
囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するの
に特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパ
ッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端
逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域
および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転
写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現に
より、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、Ｄ
ＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．
Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイル
スキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５
）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物
の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する
）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべての
ｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａ
ｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを
含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物
に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの
目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり
合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする
能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノ
ムのいずれかの末端の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化する
ので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノ
ウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１
９８４ Ｊｕｎ ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントを
アデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１
９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（
１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが
付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク
質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を
模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１
．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ること
を実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込ま
れ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細
胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルス
ベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスま
たは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する
。
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され
得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで
、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が
可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージング
に特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイ
ルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左
端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２
４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有
する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しな
いことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイ
ルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイル
スは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短
い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に
存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分
子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら
、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッ
ケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、
点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細
胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとし
てもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、こ
れらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞
内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先
的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグ
ナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分
大きい場合、均質に近い系統（stock）が達成され得る。
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合フ
ァイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウ
イルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガン
ドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト
造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シ
ュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発された
ウイルス分離株の基礎となった。さらに、例えばＴ細胞などの標的細胞に対してウイルス
を再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。
方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配
列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの
会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば
、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイ
ルス粒子に付着することができる。
２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖Ｄ
ＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１
９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ
，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染
色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、
レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイ
ルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素および
エンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、
ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするための
シグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’
および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列
を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。した
がって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオ
チドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイル
スゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイ
ルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含
むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（
１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓ
ｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例え
ば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮ
Ａ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させ
る（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９
８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔ
ｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ
（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍ
ａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し
、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染
することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定
な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，６７，２４２−２４８）。
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチ
は、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化
学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞など
の細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、その
アプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特
異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプト
アビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８
９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それ
らの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感
染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
（３．レンチウイルス）
本方法において使用されるレンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスに
由来し得る。レンチウイルスベクターは、霊長類および非霊長類両方の群を含むレトロウ
イルスベクターの１タイプである。レンチウイルスベクターの例は、例えば、Ｃｏｆｆｉ
ｎら （１９９７） 「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ： Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ， Ｓ
Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ， Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３）において論じられ
る。霊長類レンチウイルスの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子）お
よびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイ
プ「スローウイルス」ビスナ／マエディーウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス
（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびにネコ免疫不全ウイルス（
ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスは、分裂
細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る（Ｌｅｗｉｓら （１９９２）； Ｌｅｗｉｓ
ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ （１９９４））。
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、少なくとも１個の構成要素部
分を含むベクターであり、ここでこの構成要素部分は、このベクターが細胞に感染し、遺
伝子を発現するか、または複製され、レンチウイルスに由来し得ることによる生物学的機
構に関与する。
レトロウイルスゲノムおよびレンチウイルスゲノムの基本的構造は、５’ ＬＴＲおよ
び３’ ＬＴＲ（その間またはその内部に、ゲノムをパッケージし得るようにパッケージ
ングシグナルを配置する）、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムならびにパッケージン
グ構成要素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子への組み込みを可能にする組
み込み部位などの多くの共通する特徴を共有する。レンチウイルスはまた、ＨＩＶにおけ
るｒｅｖおよびＲＲＥ配列などのさらなる特徴を含み、これらは、その組み込まれたプロ
ウイルスのＲＮＡ転写物を、感染した標的細胞の核から細胞質へと効率的に輸送すること
を可能にする。
上記プロウイルスでは、ウイルス遺伝子は両方の末端で、長末端反復（ＬＴＲ）といわ
れる領域に挟まれている。このＬＴＲは、プロウイルス組み込みおよび転写を担う、ＬＴ
Ｒはまた、エンハンサー−プロモーター配列として働き、ウイルス遺伝子の発現をコント
ロールし得る。
上記ＬＴＲ自体は、Ｕ３、ＲおよびＵ５といわれる３個のエレメントに分けられ得る同
一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両
方の末端で反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する
。この３個のエレメントのサイズは、異なるウイルス間でかなり変動し得る。
本明細書で論じられるレンチウイルスベクターの例において、複製に必須の１またはこ
れより多くのタンパク質コード領域のうちの少なくとも一部は、上記ウイルスから除去さ
れ得る。このことは、ウイルスベクターを複製欠損にする。ウイルスゲノムの一部はまた
、標的非分裂宿主細胞を形質導入し得るおよび／またはそのゲノムを宿主ゲノムへと組み
込み得るＮＯＩを含むベクターを生成するために、ＮＯＩによって置き換えられ得る。
一実施形態において、上記レトロウイルスベクターは、ＷＯ ２００７／０７１９９４
、ＷＯ ２００７／０７２０５６、米国特許第９，１６９，４９１号、米国特許第８，０
８４，２４９号、または米国特許第７，５３１，６４８号で論じられるとおりの非組み込
みベクターである。いくつかの例において、上記レンチウイルスベクターは、自己不活性
化レトロウイルスベクターであり、ここで転写エンハンサー、または３’ ＬＴＲのＵ３
領域中のエンハンサーおよびプロモーターは、欠失されている（例えば、Ｙｕら． （１
９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８３：３１９４−３１９８
； Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：１１９７−１２０１； Ｈａｗｌｅｙら （１９８７）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：２４０６−２４１０； Ｙｅ
ｅら （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：９５６４
−９５６８を参照のこと）。
宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを生成するために使用されるレンチ
ウイルスプラスミドベクターはまた、宿主細胞／パッケージング細胞中のゲノムの転写を
指向するためにレンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写制御コントロール配列
を含む。これら制御配列は、その転写されたレンチウイルス配列、すなわち、５’ Ｕ３
領域と会合した天然の配列であり得るか、またはそれらは、異種プロモーター（例えば、
別のウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター）であり得る。
４．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は
、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子
産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名され
た３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つ
の非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、Ａ
ＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位
で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によ
って、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の
一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転
写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来すると
みられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な
複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「
補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウ
イルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると
示された。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると
考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０
１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づ
く末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法
によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み
込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分
析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端
反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することも
できる。
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビ
ヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボ
とインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段
階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，（１
９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊ
ｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒ
ｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら
（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；
Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔ
ｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ
．Ｇ．ら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．１９９６ Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９
−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９
９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処
置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆ
ｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−
１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性
の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送
達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、
および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、こ
れらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示された
ので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５
２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋ
ｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１３
，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２
５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。
５．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いら
れる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ
ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄ
ｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕ
ｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘル
ペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様
々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部
位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、
細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の（ｃｏ
ｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に
組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個
のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメン
トまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複
製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、
その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
（Ｔ細胞を操作するための方法、および改変されたＴ細胞の評価）
Ｔ細胞を操作するための方法および改変されたＴ細胞の評価の例は、本明細書で提供さ
れる。
（レトロウイルス形質導入）
レトロウイルスの一過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、キメラポリペプチド構築物
で、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ １１４エンベロープをコードするプラスミドとともに、
ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）を使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの４８〜７
２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵する。レンチウイルスの一
過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、上記構築物で、プラスミドｐＬＰ１（ｇａｇ／ｐ
ｏｌ）、ｐＬＰ２（ｒｅｖ）およびｐＬＰ／ＶＳＶＧ（ＶＳＶＧ ｅｎｖ）とともにＧｅ
ｎｅＪｕｉｃｅを使用してトランスフェクトする。ウイルスを、トランスフェクションの
４８〜７２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵する。大規模なレ
トロウイルス生成のために、一過性ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルス上清を用いた複数回の
形質導入によって、安定なＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生株を生成する。導入遺
伝子発現が最も高いＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス
力価をもたらすクローンを増やし、リンパ球形質導入のためのウイルスを生成するために
使用する。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価は、８週間超
にわたる連続培養中、維持される。組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレー
トを、３７℃において１時間または４℃において一晩、７μｇ／ｍｌ Ｒｅｔｒｏｎｅｃ
ｔｉｎ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でコーティングする
。それらのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、３７℃において３
０分間、プレートを１．５ｍｌの上清とともにインキュベートすることによって、レトロ
ウイルス上清でコーティングする。続いて、Ｔ細胞芽球を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が
補充されたウイルス上清中、１ウェルあたり５×１０５細胞をプレーティングする。６０
時間の期間にわたって形質導入を行う。形質導入後、細胞を収集し、フローサイトメトリ
ーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析を行う。形質導入後、細胞を
収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ１９またはＧＦＰの発現について表現型分析
を行う。
（形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性）
形質導入された各Ｔ細胞株の細胞傷害活性は、以前に提示されたような標準的な４時間
の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価される。Ｔ細胞に上記レトロウイルスまたはレンチ
ウイルスを形質導入し、それを、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって刺激された自
家リンパ球（ＰＨＡ芽球）、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３またはＤＵ１４５およびＡ５４９がん細
胞株、ならびにヒトＰＳＭＡを発現するトランスジェニックＡ５４９（Ａ５４９−ＰＳＭ
Ａ）を含む、Ｃｒ５１で標識された標的細胞と比較する。完全培地または１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートされた標的
細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の５１Ｃｒ放出を決定するために使用する。三連のウ
ェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験による放出−自発的な放出）
／（最大放出−自発的な放出）として計算した。クロム放出アッセイに加えて、共培養実
験を行う。ここでは、細胞株ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、Ａ５４９およびＡ５４９
−ＰＳＭＡを、蛍光性ｍＯｒａｎｇｅを発現するように形質導入し、標的細胞として使用
する。ｍＯｒａｎｇｅを発現している腫瘍細胞を、完全培地中、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ
）の存在下において、形質導入されていないＴ細胞または改変されたＴ細胞とともに、腫
瘍細胞とＴ細胞とが１：１０という比で共培養する。２４時間後、Ｔ細胞を１００ｎＭ
ＡＰ１９０３で刺激する。７２時間後、細胞を捕集し、カウントし、Ｔ細胞を検出するた
めにＣＤ３で標識し、ｍＯｒａｎｇｅ腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー
（ＬＳＲＩＩ；ＢＤ）によって解析する。
（形質導入されたＴ細胞の表現型分析および活性化状態）
形質導入されたＴ細胞の細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調
べる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、
ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、
ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ。１００ｎＭ
ＡＰ１９０３を用いておよび用いずに、表現型分析を行う。適切なアイソタイプマッチ
コントロールを各実験において使用し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を用い
て細胞を解析する。抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して、キメラポリペ
プチドの発現を評価する。
（形質導入されたＴ細胞のサイトカイン産生の解析）
１００ｎＭ ＡＰ１９０３による刺激の前および後（２４時間）のＴ細胞培養上清中の
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およ
び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメト
リビーズアレイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定する。培養上清中の誘導
されたサイトカイン産生を、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ
；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって検証する。
（形質導入されたＴ細胞の増殖）
ＡＰ１９０３によって誘導される活性化の増殖効果を、ＡＰ１９０３に曝露した後の、
形質導入されたＴ細胞および形質導入されていないＴ細胞の細胞成長を測定することによ
って評価する。Ｔ細胞を、３７℃において１０分間、１０μＭカルボキシフルオレセイン
ジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。インキュベーション
後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に再懸濁する。そ
の後、１×１０６個のＣＦＳＥで標識された改変Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細
胞を、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地のみにおいて培養するか、または１００ｎＭ ＡＰ
１９０３で刺激する。５日後、細胞を収集し、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５およびＣ
Ｄ１９−ＰＥで標識し、ＣＦＳＥ希釈についてフローサイトメトリーによって解析する。
可溶性免疫グロブリンが、形質導入されたＴリンパ球の増殖および拡大に影響するかを
評価するために、いかなる外来性サイトカインも加えずに、健常ドナーから得られるヒト
血漿の段階希釈物または精製されたヒト免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の段階希釈物とともに細胞を１×１０５細胞／ウェルで培養する。７
２時間後、それらの細胞を、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）メチル−３［Ｈ］チミジン（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ
）でパルスし、さらに１５時間培養する。次いで、それらの細胞を、フィルター上に収集
し、乾燥させ、１分当たりのカウント数を、β−シンチレーションカウンター（ＴｒｉＣ
ａｒｂ ２５００ ＴＲ；Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，
ＣＴ）において測定する。これらの実験は、三連で行う。他の実験では、コントロールお
よび改変されたＴリンパ球を、培地のみ、または血漿もしくは精製された免疫グロブリン
の段階希釈物を１日おきに加えた培地を用いて培養する。次いで、トリパンブルー排除を
用いて細胞を２日おきにカウントする。
（エキソビボでのＴ細胞の活性化およびヒト被験体への投与）
ヒト治療のためにさらなるキメラポリペプチド（例えば、本明細書で論じるキメラカス
パーゼ−９ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよいし、含んで
いなくてもよい改変されたＴ細胞（例えば、ＰＲＡＭＥ特異的組換えＴＣＲ改変Ｔ細胞）
を使用する方法が、本実施例で呈示される。
材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から生成される。簡潔には、健常ドナーま
たはがん患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、増殖および形質導入
のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が
補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２
μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次い
で、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍ
ｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉ
ｘ ＤＣ培地に再懸濁する。
（プラスミドおよびレトロウイルス）
本実施例の組成物および方法は、本明細書で論じるとおりのＰＲＡＭＥ特異的組換えＴ
ＣＲをコードするレンチウイルスベクターを含むように改変され得る。ＳＦＧプラスミド
は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９に連結された誘導性キメラポリペ
プチドからなる。この誘導性キメラポリペプチドは、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトキメラポリペプチドに接続された、Ｆ３６Ｖ変異を
有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２
８１８）からなる。上記Ｆ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤（homodimerizer）、ＡＰ
２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。上記２Ａ様
配列、「Ｔ２Ａ」は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペ
プチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒
介して、誘導性キメラポリペプチドのＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９の
Ｎ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２
アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたす
べてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮される、完全
長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１７７０）からなる。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを産生する安定したＰＧ
１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３
４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミドで一過性にトランスフ
ェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを産生する。そ
のＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスで３回形質
導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧプラスミドプロウイルス組み込み体を
含む産生株（producer line）を生成する。単一細胞クローニングを行い、最も高い力価
をもたらしたＰＧ１３クローンを、増やし、ベクター生成のために使用する。
レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および増殖のための培養培地は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌ
ｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）
である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必
要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに
２日間にわたって増殖させ、凍結保存する。
（遺伝子改変され、同種枯渇された細胞（allodepleted cell）のスケールアップ産生
）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌの抗ＣＤ３ ０．
５μｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７
μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７
５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用する。細胞付着性を増大させ
るためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）も使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８をコーティングしたフラ
スコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０６細胞／ｍｌ播種する
。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンをコーティングしたフラスコまたは
バッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷する。活性化Ｔ細
胞を、３：１の比の、レトロウイルスベクター含有新鮮培地および１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ
−２が補充されたＴ細胞培養培地中、１×１０６細胞／ｍｌ播種する。細胞を、翌朝収集
し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−
２が補充された培養培地中で、約５×１０５細胞／ｍｌ〜８×１０５細胞／ｍｌの播種密
度で増やす。
（ＣＤ１９免疫磁気選択）
本実施例では、改変された細胞は、ＣＤ１９マーカータンパク質を発現する；改変され
た細胞を、ＣＤ１９以外のマーカーを使用して、または他の方法によって選択し得ること
は、理解される。ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、一例では、形質導入の４日後に行わ
れ得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化された常磁性マイ
クロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）で標識し、小規
模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ
Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さ
らに４日間増やし、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変
細胞」と称される。
免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフト
ウェア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行う：ＣＤ３、
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５Ｒ
Ｏ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析に
おいて使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブ
ゲートを設定するために使用する。
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を決
定する。すべてのデータを平均±１標準偏差として表す。
疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による
細胞の投与が、有益であり得る。
細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー
Ｔ細胞、または前駆体細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、
多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は
、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例
えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それ
らの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の
沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔ）などに送達され得るように、異種遺伝
子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を
提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使
用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加され
るか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチ
を含む。例えば、Ｔ細胞レセプター（例えば、ＰＲＡＭＥ標的化ＴＣＲ）を発現するＴ細
胞が患者に提供される場合、場合によっては、またはオフターゲット毒性などの有害事象
が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒
性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または
腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況
では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初
の治療後に腫瘍細胞が再発する（ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、Ｔ
ＣＲを発現しているＴ細胞をさらに活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再
度投与され得る。
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を
処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量（ｕｎ
ｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓ）として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位
は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の量
の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな
特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。
本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、６０％、７０
％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超または８０％、７０％、６０％、
５０％、４０％、３０％、２０％もしくは１０％未満の治療用細胞が殺滅されるような、
カスパーゼ−９を発現する細胞Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導するこの選択された結
果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。薬学的組成物が
改変Ｔ細胞である場合の有効量は、所望の治療的応答（例えば、リガンド誘導物質が投与
される前の時点と比べて、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞のレベルの低下、または白血病細
胞のレベルの低下）を達成する量でもあり得る。
任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されてい
る特定の組成物、被験体のサイズ、および／または上記疾患もしくは状態の重症度などの
要因に依存して変動し得る。本明細書で示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を
要することなしに経験的に決定され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき
、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬
などが、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もし
くは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細
胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（
複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計
量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）よ
り先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用
物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に
細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複
数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮
することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証
され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用い
て、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成
物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質が、発現ベクタ
ーを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時
間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き
出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ
以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
最適化されたおよび個別化された治療的処置
改変された細胞の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベ
ルを決定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイ
ズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している、腫瘍細胞または白血病
細胞などのレベルが、決定され得る。
例えば、患者が臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞を有するか、または最初の治療の後
に固形腫瘍を有するという決定は、改変されたＴ細胞を投与する必要があり得るという指
示を臨床医に提供する。別の例では、改変された細胞で処置した後に、患者が、低下した
レベルの腫瘍細胞または減少した腫瘍サイズを有するという決定は、追加の用量の改変さ
れた細胞が必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、改変された細胞で処置した後、患者
が、疾患もしくは状態の症状を示し続けているかまたは症状の再発に苦しんでいるという
決定は、少なくとも１つのさらなる用量の改変された細胞を投与する必要があり得ると臨
床医に指示し得る。
用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミングなど）の
両方を含むことが意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投
与される改変された細胞の量のことを指す。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ
、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類における細胞である。被験体は
、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、
ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類であり得る。上記被験体は、例えば、ヒト、例
えば、感染症に罹患している患者、および／または免疫無防備状態であるかもしくは過剰
増殖性疾患に罹患している被験体であり得る。
従って、例えば、ある種の実施形態において、上記方法は、改変された細胞もしくは核
酸の投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比較して、被験体における腫瘍サイ
ズ増大および／または腫瘍細胞数の増大の有無を決定すること、ならびに腫瘍サイズの増
大および／または腫瘍細胞数の増大の存在が決定されるという事象において、上記被験体
に上記改変された細胞もしくは核酸のさらなる用量を投与することを包含する。上記方法
はまた、改変された細胞または核酸の投与後の白血病細胞のレベルと比較して、例えば、
被験体における白血病細胞の増大の有無を決定すること、ならびに上記被験体における白
血病細胞の増大の存在が決定されるという事象において、上記被験体に上記改変された細
胞または核酸のさらなる用量を投与することを包含する。これらの実施形態において、例
えば、上記患者は、本明細書で提供される方法に従って、治療用細胞または核酸で最初に
処置される。最初の処置後に、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞数、または白血病細胞の
数は、その最初の処置前のときと比較して減少し得る。この最初の処置後のある時間では
、上記患者は再び試験されるか、または上記患者は、疾患症候に関して継続してモニター
され得る。例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞数、または白血病細胞数が、その最初の処置
直後のときと比較して増大していることが決定される場合、上記改変された細胞または核
酸は、さらなる用量のために投与され得る。ＰＲＡＭＥ標的化Ｔ細胞レセプターを発現す
る治療用細胞が患者の中に残っていることに注意しながら、このモニタリングおよび処置
スケジュールは、継続され得る。
他の実施形態において、改変された細胞または核酸（ここで上記改変された細胞または
核酸は、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する）の投与後に、改変された細胞ま
たはインビボで改変された細胞の数を減少させる必要がある事象において、多量体リガン
ドは、上記患者に投与され得る。これらの実施形態において、上記方法は、負の症候また
は状態（例えば、移植片対宿主病、またはオフターゲット毒性）の有無を決定すること、
およびある用量の上記多量体リガンドを投与することを包含する。上記方法は、上記症候
または状態をモニターすることおよび上記症候または状態が持続する事象において、上記
多量体リガンドのさらなる用量を投与することをさらに包含し得る。ＰＲＡＭＥ標的化Ｔ
ＣＲを発現する治療用細胞が上記患者に残っている間は、このモニタリングおよび処置ス
ケジュールは継続され得る。
その後の薬物の用量、例えば、その後の、改変された細胞または核酸の用量、および／
またはその後の薬物投与量などを調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で
提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体ま
たは電子媒体において）提供され得る。例えば、腫瘍細胞のサイズ、またはサンプル中の
腫瘍細胞の数もしくはレベルが、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストま
たは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量
（drug dose）に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それ
らの症状がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた
後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報
は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れら
れ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータ
に送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもし
くは維持するための指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量（subsequent
drug dose amount）を提供し得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を
投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示（instructio
n）を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し
、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつか
の実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプ
ットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づ
いて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る
（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば
、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれを
コードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。活性化された細胞、核酸
または発現構築物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰
り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させる
か、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排
除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態に
おいて、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカ
ー、または腫瘍サイズもしくは腫瘍抗原発現などの他の疾患症状をモニターすることが存
在し得る。
さらなる実施形態において、発現構築物および／または発現ベクターは、細胞を活性化
する組成物または物質として利用され得る。「細胞を活性化する」または「細胞の活性を
増強する」そのような組成物とは、細胞に関連する１つまたはそれを超える活性を刺激す
る能力のことを指す。例えば、本方法の発現構築物またはベクターなどの組成物は、細胞
上の共刺激分子のアップレギュレーションを刺激し得るか、細胞におけるＮＦ−κＢの核
移行を誘導し得るか、細胞におけるｔｏｌｌ様レセプター、またはサイトカインもしくは
ケモカインを含む他の活性を活性化し得る。
発現構築物、発現ベクターおよび／または形質導入された細胞は、例えば、より弱い抗
原（例えば、高度に精製された抗原または組換え抗原）の免疫原性を高めること、免疫応
答に必要な抗原の量を減少させること、防御免疫をもたらすのに必要な免疫化の頻度を減
少させること、免疫応答が低下しているかまたは弱まっている被験体（例えば、新生児、
高齢および免疫無防備状態の個体）におけるワクチンの効力を改善すること、および粘膜
免疫などの標的組織における免疫を増強することによって、ワクチンの有効性を高め得る
かもしくはワクチンの有効性に寄与し得るか、または特定のサイトカインプロファイルを
誘発することによって細胞媒介性免疫もしくは体液性免疫を促進し得る。
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキ
ソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。
いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対しても
たらされる。時折、その免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。
時折、その免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、
その細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。
ある種の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、静
脈内投与によって上記被験体へと投与される。他の実施形態において、上記細胞は、皮内
投与を使用して投与される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、
上記核酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体に投与される。ときおり、上記細
胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入される。ときおり、上記細胞は、インビボで、
上記核酸で形質導入される。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、
皮内投与によって上記被験体へと投与され、ときおり上記細胞は、エキソビボで、上記核
酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体へと投与される。抗原は、腫瘍抗原であ
り得、流入領域リンパ節への細胞の遊走によってＣＴＬ免疫応答が誘導され得る。腫瘍抗
原は、宿主において免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプ
チドなどである。腫瘍抗原は、新生物腫瘍細胞に関連する腫瘍関連抗原であり得る。
いくつかの実施形態において、免疫無防備状態の個体または被験体は、免疫応答が低下
したまたは弱まった被験体である。そのような個体には、化学療法または免疫系を弱める
他の任意の治療を受けた被験体、移植レシピエント、現在、免疫抑制剤を摂取している被
験体、高齢化している個体、またはＣＤ４Ｔヘルパー細胞が減少しているおよび／もしく
は損なわれている任意の個体も含まれ得る。本方法は、免疫無防備状態の被験体における
ＣＤ４Ｔヘルパー細胞の量および／または活性を高めるために利用され得ることが企図さ
れる。
抗原
インビトロまたはエキソビボでＴ細胞活性化をアッセイする場合、標的抗原は、種々の
供給源から得られ得るかまたは単離され得る。標的抗原は、本明細書中で使用されるとき
、抗原または抗原上の免疫学的エピトープであり、それは、哺乳動物における、免疫認識
および疾患を引き起こす作用因子（agent）または疾患状態の最終的な排除またはコント
ロールにおいてきわめて重大である。その免疫認識は、細胞性および／または体液性であ
り得る。細胞内の病原体およびがんの場合、免疫認識は、例えば、Ｔリンパ球応答であり
得る。本明細書中の標的抗原は、例えば、ＰＲＡＭＥを含み得る。Ｔ細胞レセプターは、
単独で、エピトープ、すなわちＰＲＡＭＥに由来するポリペプチドに結合し得るか、また
はペプチド−ＭＨＣ複合体との関連において、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子とのＭＨＣ複
合体の一部として提示されるペプチド分子に結合し得る。主要組織適合遺伝子複合体（Ｍ
ＨＣ）分子は、ＴＣＲおよびＴリンパ球上のＣＤ４／ＣＤ８共レセプターに結合する；上
記ＭＨＣ分子はまた、ＴＣＲと相互作用するポリペプチドフラグメント、またはエピトー
プを提示する。一般に、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８レセプターと相互作用し、クラス
ＩＩ分子は、ＣＤ４レセプターと相互作用する。従って、本出願において、例えば、ＴＣ
ＲのＣＤＲ３領域、またはＴＣＲがＰＲＡＭＥまたは標的抗原に特異的に結合する場合な
どの、ＰＲＡＭＥに特異的に結合する」とは、ＣＤＲ３領域が単独で、ＴＣＲの一部とし
て、異種ポリペプチド配列を含む組換えＴＣＲの一部として、または異種ポリペプチドの
一部として、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＡＭＥに由来するエピトープもしくはポリペプチド、また
はペプチド−ＭＨＣ複合体（例えば、ＨＬＡクラスＩ複合体）の一部として（または例え
ば、ＨＬＡクラスＩ Ａ２．０１分子を含むペプチド−ＭＨＣ複合体の一部として）ＰＲ
ＡＭＥに由来するエピトープもしくはポリペプチドに特異的に結合し得ることと、理解さ
れる。αポリペプチドおよびβポリペプチドのＣＤＲ３領域は、一緒に、ペプチド−ＭＨ
Ｃ複合体を認識し、これに結合し、他のＴＣＲ領域、または他のポリペプチドがこの結合
に寄与し得ることは、理解される。従って、本明細書で論じられる、ＰＲＡＭＥに「特異
的に結合する」ＴＣＲ ＣＤＲ３領域は、ＰＲＡＭＥペプチド−ＭＨＣ複合体に対して特
異的結合親和性を有し、ここで例えば、上記ＭＨＣは、ＨＬＡクラスＩ分子、例えば、Ｈ
ＬＡクラスＩ Ａ２．０１分子である。
標的抗原は、例えば、病原性の微生物、例えば、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒら編 ＨＩＶ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．１９
７７）、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス（米国特許第５，７１
９，０５４号）、Ｂ型肝炎（米国特許第５，７８０，０３６号）、Ｃ型肝炎（米国特許第
５，７０９，９９５号）、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などを含むウイルス
に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。標的抗原は、病原菌、例えば、クラミジ
ア（米国特許第５，８６９，６０８号）、マイコバクテリア、レジオネラ、髄膜炎菌（Ｍ
ｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、Ａ群連鎖球菌、サルモネラ、リステリア、Ｈｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（米国特許第５，９５５，５９６号）など）に由来し得
るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原は、例えば、アスペルギルス、侵襲性カンジダ（米国特許第５，６４５，９９
２）、ノカルジア、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、クリプトスポリ
ジウムなどを含む病原性の酵母に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原は、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノソーマ、
リーシュマニア（米国特許第５，９６５，２４２号）、マラリア原虫（米国特許第５，５
８９，３４３号）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉを含むがこれらに限定され
ない、病原性の原生動物および病原性の寄生生物に由来し得るかまたはそれらから単離さ
れ得る。
標的抗原には、新生物発生前または過形成の状態に関連する抗原が含まれる。標的抗原
はまた、がんに関連し得るか、またはがんの原因となり得る。ある特定の実施形態におい
て、標的抗原は、ＰＲＡＭＥである。そのような標的抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原、
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異的抗原、それらのエピトープおよびそれらのエピ
トープアゴニストであり得る。そのような標的抗原としては、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およ
びそのエピトープ、例えば、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなど（ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号Ｍ２９５４０）、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｒｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１８０：３４７−３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１（米国特許第５，７５０，３９
５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２６号）、ＧＰ−１００（
Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６４５
８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異したｒａｓがん遺伝子、正
常なおよび点変異したｐ５３がん遺伝子（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３５５１−３５５５，１９９４）、ＰＳＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０，１９９３）、チロシナーゼ（Ｋｗｏｎ
ら、ＰＮＡＳ ８４：７４７３−７４７７，１９８７）ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈ
ｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：２８０７−２８０８，１９９０；米
国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ ９４：１
９１４−１９１８，１９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ，１１：５
２７−５３５，１９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／
ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−
ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡおよび組織特
異的抗原の改変物、ＴＡＡのスプライスバリアント、エピトープアゴニストなどが挙げら
れるがこれらに限定されない。他のＴＡＡは、当該分野で公知の方法、例えば、米国特許
第４，５１４，５０６号に開示されている方法によって同定され、単離され、クローニン
グされ得る。標的抗原は、１つまたはそれを超える成長因子および各々のスプライスバリ
アントも含み得る。
ある抗原は、非がん細胞よりもがん細胞において、頻繁に発現され得る。その抗原は、
改変された細胞を、前立腺特異的膜抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）また
はそのフラグメントと接触させた結果、生じ得る。
前立腺抗原（ＰＡ００１）は、ＰＳＭＡ抗原の細胞外の一部からなる組換えタンパク質
である。ＰＳＭＡは、ニューロペプチダーゼ活性および葉酸加水分解酵素活性を有する約
１００ｋＤａ（グリコシル化前は８４ｋＤａであり、二量体としては約１８０ｋＤａ）の
タイプＩＩ膜タンパク質であるが、ＰＳＭＡの真の機能は、現在のところ不明である。Ｃ
ａｒｔｅｒ ＲＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３：７４９−
５３，１９９６；Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−３０
，１９９３；Ｐｉｎｔｏ ＪＴら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１４４５−５
１，１９９６。
上記細胞は、例えば、未分画の腫瘍溶解産物、ＭＨＣから溶出したペプチド、腫瘍由来
の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ（ペプチドまたはタンパク質
））を未熟なＤＣにパルスすること、またはバルク腫瘍ｍＲＮＡ、すなわちＴＡＡをコー
ドするｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトすること（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．＆ Ｖｉｅｗｅ
ｇ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９，２５１−６３（２００４）；Ｇｉｌｂｏａ
，Ｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４，４０１−１１（２００４）に概説）をはじめ
とした様々な方法によって、腫瘍抗原、例えば、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチド
と接触され得る。
ＤＮＡゲノムを含む生物の場合、標的抗原またはその目的の免疫学的エピトープをコー
ドする遺伝子は、そのゲノムＤＮＡから単離される。ＲＮＡゲノムを有する生物の場合、
所望の遺伝子は、そのゲノムのｃＤＮＡコピーから単離され得る。そのゲノムの制限酵素
地図が入手可能である場合、目的の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、日常的な方法に
よる制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断される。所望の遺伝子が以前にクローニン
グされていた場合、それらの遺伝子は、入手可能なクローンから容易に得られることがあ
る。あるいは、その遺伝子のＤＮＡ配列が既知である場合、その遺伝子は、デオキシリボ
核酸を合成するための任意の従来の手法によって合成することができる。
目的の抗原をコードする遺伝子は、例えば、その遺伝子を細菌宿主にクローニングする
ことによって、増幅され得る。この目的のために、様々な原核生物のクローニングベクタ
ーが使用され得る。例は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣおよびｐＥＭＢＬである。
少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、標準
的な手法によるウイルスを用いた組換えのためにデザインされたプラスミドベクターに挿
入するために調製され得る。一般に、クローニングされた遺伝子は、制限酵素消化によっ
て原核生物クローニングベクターから切り取られ得る。ほとんどの場合、切り取られたフ
ラグメントは、その遺伝子のコード領域全体を含む。クローニングされた遺伝子を有する
ＤＮＡフラグメントは、例えば、ウイルスを用いた組換えのために使用されるＤＮＡベク
ターの挿入部位と適合するフラグメントの末端を作製するために、必要に応じて改変され
得、次いで、精製された後、そのベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断部位（クローニ
ング部位）に挿入される。
細胞、例えば、例えば、樹状細胞の、抗原（例えば、ＰＲＡＭＥエピトープポリペプチ
ドのような）による抗原負荷は、例えば、例えば、細胞、例えば、樹状細胞または前駆体
細胞を抗原と接触させることによって、例えば、細胞を抗原とともにインキュベートする
ことによって、達成され得る。負荷は、例えば、抗原をコードするＤＮＡ（裸のものまた
はプラスミドベクター内のもの）またはＲＮＡをインキュベートする；または抗原を発現
している組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、水痘、アデノウイルスまたは
レンチウイルスベクター）とともにインキュベートすることによっても達成され得る。負
荷の前に、抗原は、Ｔ細胞を助ける免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有
結合的に結合体化されてもよい。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存
在下において、結合体化されていない免疫学的パートナーでパルスされ得る。細胞または
ＭＨＣ分子由来の抗原は、酸溶出または他の方法によって得ることができる（Ｚｉｔｖｏ
ｇｅｌ Ｌら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６．１８３：８７−９７を参照のこと）。そ
れらの細胞は、それらの細胞が抗原で負荷される前、負荷された後、または負荷されるの
と同時に、本方法に従って、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を形質導入
され得るかまたはトランスフェクトされ得る。特定の実施形態において、抗原負荷は、形
質導入またはトランスフェクションの後に行われる。
さらなる実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞ｍＲＮＡでトランスフェ
クトされる。形質導入され、トランスフェクトされた細胞は、動物に投与されて、細胞傷
害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞
は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログによって制御される。腫瘍細
胞ｍＲＮＡは、例えば、前立腺腫瘍細胞由来のｍＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞溶解産物でパルスする
ことによって負荷され得る。パルスされ、形質導入された細胞は、動物に投与されて、細
胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その
細胞は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログを用いて制御される。そ
の腫瘍細胞溶解産物は、例えば、前立腺腫瘍細胞溶解産物であり得る。
免疫細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球応答
Ｔリンパ球は、本明細書中で論じられる発現ベクターを含む細胞との接触によって活性
化され得、ここで、その細胞は、抗原でチャレンジされているか、トランスフェクトされ
ているか、パルスされているか、または電気融合されている。
Ｔ細胞は、その膜上にユニークな抗原結合レセプター（Ｔ細胞レセプター）を発現し、
そのレセプターは、他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と会合
しているか、または他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の状況
における抗原のみを認識することができる。Ｔ細胞にはいくつかの集団、例えば、ヘルパ
ーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞がある。ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は、第
一に、それぞれ、膜結合糖タンパク質ＣＤ４およびＣＤ８のディスプレイによって区別さ
れる。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび他の免疫系
細胞の活性化にとってきわめて重大な様々なリンフォカインを分泌する。対照的に、抗原
−ＭＨＣ複合体を認識するナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、増殖し、細胞傷害性ＣＤ８Ｔリンパ
球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。ＣＴＬは、細胞溶解をもたらす物
質を産生することによって、抗原をディスプレイしている体内の細胞（例えば、ウイルス
に感染した細胞および腫瘍細胞）を排除する。
本明細書中の核酸、ベクター、または組成物で形質導入またはトランスフェクトされた
改変された細胞は、例えば、Ｔヘルパー細胞、Ｔ細胞傷害性細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｃ
Ｄ４＋ Ｔ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む。本明細書で提供されるとおりの
改変された細胞は、代表的には、改変された細胞の集まりである。
ＣＴＬの活性は、例えば、本明細書中で論じられる方法によって評価され得る。例えば
、ＣＴＬは、単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において評価され得るか、Ｐ
ＢＭＣから確立された、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ
）によって刺激され、ＩＬ−２によって増殖した細胞株において評価され得るか（Ｂｅｒ
ｎａｒｄら、ＡＩＤＳ，１２（１６）：２１２５−２１３９，１９９８）、または予め免
疫された被験体から単離され、抗原を含むアデノウイルスベクターに感染したＤＣで６日
間にわたって再刺激されたＴ細胞によって、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出マイクロ毒性
アッセイを用いて評価され得る。１つのタイプのアッセイは、クローン化Ｔ細胞を用いる
。クローン化Ｔ細胞は、再指向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞傷害性アッセイにおいて
パーフォリン依存性の殺滅とＦａｓリガンド依存性の殺滅の両方を媒介する能力について
試験された（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１５（４）：８
４９−８５５，１９９８）。クローン化細胞傷害性Ｔリンパ球は、Ｆａｓ依存性殺滅とパ
ーフォリン依存性殺滅の両方を示した。最近になって、新しい蛍光増幅システムを利用す
るインビトロデヒドロゲナーゼ放出アッセイが開発された（Ｐａｇｅ，Ｂ．ら、Ａｎｔｉ
ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１８（４Ａ）：２３１３−６）。こ
のアプローチは、高感度であり、迅速であり、再現性があり、混合リンパ球反応（ＭＬＲ
）に対して有益に使用され得る。このアプローチは、細胞膜の完全性を用いる、大規模な
細胞傷害性試験のためにさらに容易に自動化され得るので、考慮に入れられる。細胞媒介
性の細胞傷害性を検出するために開発された別の蛍光測定アッセイでは、使用されるフル
オロフォアは、無毒性分子のＡｌａｍａｒＢｌｕｅである（Ｎｏｃｉａｒｉら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１３（２）：１５７−１６７，１９９８）。Ａｌａｍａ
ｒＢｌｕｅは、ミトコンドリアの還元が生じ、それによってＡｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光
強度の劇的な増加（すなわち、量子収量の増加）がもたらされるまで、蛍光消光される（
すなわち、低量子収量）。このアッセイは、極めて高感度であり、特異的であると報告さ
れており、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイよりも有意に少ない数のエフェクター細胞しか
必要としない。
本方法によって誘導され得る他の免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が
挙げられる。ＮＫは、抗原特異的レセプターを欠き、自然免疫系の一部である、リンパ系
細胞である。代表的には、感染した細胞は、通常、細胞表面ＭＨＣに結合した外来粒子に
よって警告されたＴ細胞によって破壊される。しかしながら、ウイルスに感染した細胞は
、抗体によって認識されるウイルスタンパク質を発現することによって感染をシグナル伝
達する。これらの細胞は、ＮＫによって殺滅され得る。腫瘍細胞では、その腫瘍細胞が、
ＭＨＣ Ｉ分子の発現を失っている場合、それは、ＮＫに感受性であり得る。
患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク
質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞、および負荷されたＴ細
胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは
、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まな
い組成物を調製することを伴い得る。
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ被
験体体重、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重
、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０
．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ
／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２
、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２
．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重
の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４
ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル
１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２
、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５
、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が
提供され得る。
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切
な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が
患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリア
または水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。
そのような組成物は、接種材料とも称される。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得
る」とは、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー
反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のこ
とを指す。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーテ
ィング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な
物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質ま
たは作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物
におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る
。
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその
経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経
口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、
皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通
常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、およ
び滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。
すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性で
ある。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚
染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グ
リセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの
好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例え
ば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維
持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用
の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノ
ール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張
剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸
収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチ
ンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬およ
び歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ド
ーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活
性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み
込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤
にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿
潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、
例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マ
ンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と
ともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩
基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウ
ムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン
、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合
した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。例えば、本明細書で
論じるＰＲＡＭＥ ＴＣＲを発現する改変された細胞の治療有効量は、例えば、インビボ
で、被験体において、またはマウスもしくは他の動物モデルにおいて、本明細書で論じる
アッセイによって測定されるとき、被験体においてＰＲＡＭＥ発現細胞の量または濃度を
減少させる量であり得る。従って、治療有効量は、ＰＲＡＭＥ発現細胞のパーセントまた
は量を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
もしくは９５％減少させるために十分な量であり得る；治療有効量はまた、例えば、安定
な疾患をもたらすために十分であり得る、すなわち、ＰＲＡＭＥ発現細胞の数または濃度
が有意に増大しない。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な液剤、薬物放出
カプセル剤など）で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液
剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグル
コースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹
腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば
、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に
加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ，１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。処置されている被
験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにし
ても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒ
トに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準
が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得
る。
投与スケジュールは、患者にとって適切であるように決定され得、例えば、ＰＲＡＭＥ
ＴＣＲ改変された細胞が０週目に投与され、続いて、有効な治療結果を得ることが必要
な場合に、あるいは例えば、その後、合計で例えば、２週間、４週間、６週間、８週間、
１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、
２６週間、２８週間、または３０週間、４０週間、５０週間、６０週間、７０週間、８０
週間、９０週間、または１００週間にわたって、２、４、６、８、１０、１２、１４、１
６、１８、２０回間隔をあけて、さらなる細胞の投与が行われる投薬スケジュールを含み
得る。
必要であれば、上記方法は、処置において使用される予定のより多くの細胞を得るため
に、さらなる白血球搬出をさらに含み得る。
本出願の改変された細胞は、例えば、０．２５×１０６（±２０％）細胞／ｋｇ、０．
５×１０５（±２０％）細胞／ｋｇ、０．７５×１０５（±２０％）細胞／ｋｇ、１×１
０５（±２０％）細胞／ｋｇ、０．３×１０６（±２０％）細胞／ｋｇ、０．６２５×１
０６（±２０％）細胞／ｋｇ、１．２５×１０６（±２０％）細胞／ｋｇ、２．５×１０
６（±２０％）細胞／ｋｇ、５×１０６（±２０％）細胞／ｋｇ、７．５×１０６（±２
０％）細胞／ｋｇ、１×１０７（±２０％）細胞／ｋｇ、２．５×１０７（±２０％）細
胞／ｋｇ、５×１０７（±２０％）細胞／ｋｇ、７．５×１０７（±２０％）細胞／ｋｇ
、または１×１０８（±２０％）細胞／ｋｇの被験体体重、という細胞の総数の１回の投
与または複数回の投与において送達され得る。
カスパーゼ−９スイッチの活性化または誘導が必要とされる場合、ＡＰ１９０３または
他の化学的誘導因子の投与は、患者にとって適切であるように決定され得、例えば、最初
の用量がＣＩＤ治療の開始の０週目に投与され、続いて、有効な治療結果を得ることが必
要とされる場合に、または例えば、その後、合計で例えば、２週間、４週間、６週間、８
週間、１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４
週間、２６週間、２８週間、もしくは３０週間、４０週間、５０週間、６０週間、７０週
間、８０週間、９０週間、もしくは１００週間にわたって、２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０回間隔をあけて、さらなる化学的誘導因子の投与が行われる投
薬スケジュールを含み得る。
（疾患を処置するための方法）
本方法はまた、過剰増殖性疾患によって引き起こされる疾患の処置または防止の方法を
包含する。
薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して処
置され得るかまたは予防され得る新生物発生前または過形成の状態としては、結腸ポリー
プ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などのような新生物発生前または過形成の状態
が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物を使用して処置され得る、固形腫瘍を含むがんとしては、原発性または転
移性メラノーマ、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、ぶどう膜黒色腫、リンパ腫
、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん
、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、結腸がん、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、Ｎ
ＰＣ、膀胱がん、子宮頸がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提示されるＴ細胞活性化システムおよび他の治療的細胞活性化システムを
使用して処置され得る、固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患としては、関節リウマチ、炎
症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞
、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、新生物発生前の病変（例えば、腺腫様過形成および
前立腺上皮内新形成）、上皮内癌、口腔毛状白斑症または乾癬が挙げられるが、これらに
限定されない。
処置方法において、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質
導入された細胞、および活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞および負荷されたＴ細胞）
の投与は、「予防的」または「治療的」な目的であり得る。薬学的組成物は、予防的に提
供されるとき、任意の症候よりも先に提供される。薬学的組成物の予防的投与は、その後
の任意の感染または疾患を予防するためまたは回復させるために役立つ。薬学的組成物は
、治療的に提供されるとき、感染または疾患の症候の発生時または発生後に提供される。
したがって、本明細書中に提示される組成物は、疾患を引き起こす作用因子もしくは疾患
状態への予想される曝露の前または感染もしくは疾患の開始後に提供され得る。したがっ
て、本明細書中で論じられる核酸および細胞を用いる、固形腫瘍（例えば、がんに見出さ
れる固形腫瘍、または例えば前立腺がんであるがこれに限定されない）の予防的処置のた
めの方法が、本明細書中に提供される。例えば、被験体において腫瘍を予防的に防止する
かまたはそのサイズを減少するための方法が提供され、上記方法は、本明細書で論じられ
る核酸または細胞を投与し、それによって上記核酸または細胞が、被験体において腫瘍を
防止するかまたはそのサイズを減少するために有効な量で投与される工程を包含する。
任意の組織または器官由来の固形腫瘍が、本方法を用いて処置され得るが、例えば、そ
の固形腫瘍としては、血管構造において、例えば、ＰＳＡ、例えばＰＳＭＡを発現してい
る任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺または脳、ならびにまた、例えば、乳房、
卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨性腫瘤（ｂｏｎ
ｅｙ ｍａｓｓ）およびリンパ系に存在する固形腫瘍が挙げられる。処置され得る他の固
形腫瘍としては、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が挙げられる。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量とし
て好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤と共同して
、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料
の単位用量についての規格（specification）は、薬学的組成物のユニークな特色および
達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
薬学的組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり
、そのような量は、決定され得る。例えば、免疫系不全を処置するための有効量は、免疫
系の活性化を引き起こし、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるた
めに必要な量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。
任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されてい
る特定の組成物、被験体のサイズ、および／または上記疾患もしくは状態の重症度などの
要因に依存して変動し得る。本明細書で示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を
要することなしに経験的に決定され得る。従って、例えば、一実施形態において、上記形
質導入されたＴ細胞または他の細胞は、例えば、免疫応答を誘導するのに有効な量で、ま
たは例えば、腫瘍サイズを減少させるかもしくは腫瘍血管構造の量を減少させるのに有効
な量で、被験体に投与される。
Ａ．遺伝子に基づく治療
ある種の実施形態において、細胞には、Ｔ細胞において組換えＴＣＲポリペプチド（例
えば、ＰＲＡＭＥ特異的組換えＴＣＲポリペプチドなど）を提供し得る発現構築物が提供
される。その中で使用される発現ベクターおよび遺伝的エレメントの考察は、この節へと
参考として援用される。ある種の例において、発現ベクターは、ウイルスベクター（例え
ば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レ
ンチウイルス、およびレトロウイルス）であり得る。別の例において、上記ベクターは、
リソソームによって被包された発現ベクターであり得る。
遺伝子送達は、インビボとエキソビボの両方の状況において行われ得る。ウイルスベク
ターの場合、一般に、ウイルスベクターストックが調製され得る。エキソビボおよびイン
ビボにおけるウイルスベクター媒介性の遺伝子送達の例は、本願において提示される。イ
ンビボで送達する場合、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約１、
２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０４、１、２、３、４、５、６、７、８もし
くは９×１０５、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０６、１、２、３、４
、５、６、７、８もしくは９×１０７、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１
０８、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０９、１、２、３、４、５、６、
７、８もしくは９×１０１０、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１１ま
たは１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１２個の感染性粒子が患者に送達
され得る。類似の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製
剤または他の非ウイルス製剤に対して外挿され得る。薬学的に許容され得る組成物として
の製剤は、下記で論じられる。多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、
約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０
、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／
ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。
Ｂ．細胞ベースの治療
企図される別の治療は、例えば、形質導入されたＴ細胞の投与などの操作されたＴ細胞
の投与である。上記Ｔ細胞は、インビトロにおいて操作され得る。薬学的に許容され得る
組成物としての製剤は、本明細書中で論じられる。
細胞に基づく治療では、操作された細胞は、例えば、標的抗原核酸をコードするレトロ
ウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターで形質導入され得るか；標的抗原核酸
（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）もしくはタンパク質でトランスフェクトされ得るか；
細胞溶解産物、タンパク質もしくは核酸でパルスされ得るか；または細胞と電気的に融合
され得る。それらの細胞、タンパク質、細胞溶解産物または核酸は、腫瘍細胞などの細胞
、または他の病原微生物、例えば、ウイルス、細菌、原生動物などに由来し得る。
Ｃ．併用療法
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および
方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合があ
る。
ある特定の実施形態において、抗がん剤が、本方法と組み合わせて使用され得る。「抗
がん」剤は、例えば、１つ以上のがん細胞を殺滅すること、１つ以上のがん細胞において
アポトーシスを誘導すること、１つ以上のがん細胞の成長速度を低下させること、転移の
発生率もしくは数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の成長を阻害
すること、腫瘍もしくは１つ以上のがん細胞への血液の供給を減少させること、１つ以上
のがん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防するかもし
くは阻害すること、またはがんを有する被験体の寿命を延長することによって、被験体に
おけるがんに悪影響を与えることができる。抗がん剤としては、例えば、化学療法剤（化
学療法）、放射線治療剤（放射線治療）、外科手技（手術）、免疫治療剤（免疫療法）、
遺伝的治療剤（遺伝子治療）、ホルモン治療、他の生物学的薬剤（生物療法）および／ま
たは代替療法が挙げられる。
さらなる実施形態では、感染症を処置するためおよび／または予防するために、抗生物
質が薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。そのような抗生物質としては、アミカシ
ン、アミノグリコシド類（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンホテリシン
Ｂ、アンピシリン、アンチモン類（ａｎｔｉｍｏｎｉａｌｓ）、アトバコン、スチボグル
コン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシ
チン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシ
ン、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、
エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン類、イソニアジド、イトラコナゾール
、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン）、パラ−アミノサ
リチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、ディフェンシン類（ｄｅｆｉｎｓｉｎｓ）、プ
ロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン類（例えば、
シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプト
マイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類、チアセタゾン、トリメトプリム（ｔ
ｒｉｍｅｔｈａｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール、バイオマイシンまたはそれらの組
み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
より一般的には、そのような薬剤は、がん細胞および／もしくは微生物を殺滅するため
またはがん細胞および／もしくは微生物の増殖を阻害するために有効な発現ベクターとと
もに、合計量で提供され得る。このプロセスは、細胞（複数可）を薬剤（複数可）および
薬学的組成物と同時にまたはある時間内に接触させる工程を含み得、ここで、細胞、組織
または生物への薬学的組成物と薬剤との別個の投与によって、所望の治療的な利益がもた
らされる。これは、薬学的組成物と１つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物または薬理
学的製剤と細胞、組織もしくは生物を接触させることによって、または２つ以上の別々の
組成物もしくは製剤（ここで、一方の組成物は薬学的組成物を含み、他方は１つ以上の薬
剤を含む）と細胞を接触させることによって達成され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき
、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬
などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを記述するために本明細書中で
使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記
述するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的
組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有
効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）よ
り先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用
物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に
細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複
数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮
することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証
され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用い
て、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成
物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベ
クターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２
４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の
導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と
１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記化学療法剤は、リンパ球枯渇化学療法剤であり得る
。他の実施形態において、化学療法剤は、タキソテール（ドセタキセル）または別のタキ
サン、例えば、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）などであり得る。化学療法剤
は、細胞および誘導物質による処置の前、処置中または処置の後に投与され得る。例えば
、化学療法剤は、第１の用量の活性化された核酸を投与する約１年前、１１、１０、９、
８、７、６、５もしくは４ヶ月前、または１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２，
１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間前もしくは１週間前に、投与され得る
。または、例えば、化学療法剤は、第１の用量の細胞または誘導物質を投与した約１週間
後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７もしくは１８週間後、または４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月後
、または１年後に投与され得る。
化学療法剤の投与は、２つ以上の化学療法剤の投与を含み得る。例えば、シスプラチン
は、タキソテールまたは他のタキサン、例えば、カバジタキセルなどに加えて投与され得
る。
本明細書で示されるとおりの方法は、限定なしに、活性化された細胞、核酸、またはこ
れをコードする発現構築物の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、一般に
、検出可能にかつ反復して、述べられる所望の結果を達成するために、例えば、上記疾患
またはその症候を回復するか、減少するか、最小にするか、またはその程度を制限するた
めに、十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定
義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するた
めおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターすることが存在しても
よい。
改変された細胞の有効量は、個々の患者を考慮して、医師によって決定され得る。考慮
されるべき因子としては、例えば、疾患もしくは状態の程度、腫瘍サイズ、感染症の程度
、転移、年齢、および体重が挙げられ得る。投与量および投与回数は、医師、または他の
臨床医によって、疾患もしくは状態の症候について患者をモニターすることによって、お
よび以前の投与量への応答に関しては、例えば、腫瘍サイズ、または腫瘍抗原のレベルも
しくは濃度をモニターすることによって、決定され得る。ある特定の例では、改変された
細胞は、１０４〜１０９個の改変された細胞／ｋｇ 体重、１０５〜１０６個、１０９〜
１０１１個、または１０１０〜１０１１個の改変された細胞／ｋｇ 体重の投与量で、投
与され得る。
Ｄ．再発性または難治性骨髄性新生物を有する患者におけるＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現Ｔ
細胞の安全性および実施可能性（feasiblity）を評価する用量漸増研究
キメラカスパーゼ−９コード核酸を含むＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現Ｔ細胞（Ｃｅｌｌ Ａ
）は、ＰＲＡＭＥ抗原の発現と関連する状態または疾患を有する被験体に、例えば、骨髄
性新生物を有する被験体に投与され得る。カスパーゼ−９安全スイッチ（ｉＣａｓｐ９）
は、Ｃｅｌｌ Ａのデザインの中に含まれ、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ発現Ｔ細胞による処置の
レベルをコントロールするか、または処置を停止するための方法を提供する。
フェーズＩのオープンラベル非無作為化実施可能性、安全性および用量設定試験。 フ
ェーズＩ ＭＴＤステージの間に、被験体は、０日目にＣｅｌｌ Ａの１用量を受ける。
そのデザインは、３＋３用量漸増（ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）／漸減（ｄｅ−ｅｓｃａｌａ
ｔｉｏｎ）スキーマに従って、Ｃｅｌｌ Ａで処置される、１コホートあたり３〜６名の
被験体からなるＣｅｌｌ Ａの５つのコホートからなる。フェーズＩｂ拡大ステージ（ｅ
ｘｐａｎｓｉｏｎ ｓｔａｇｅ）の間に、被験体は、０日目にＣｅｌｌ Ａの最大耐量を
受ける。制御されない毒性は、ＣａｓｐａＣＩＤｅ自殺スイッチを活性化する二量体化剤
薬物（dimerizer drug）、リミズシドの使用を誘発し、従って、Ｃｅｌｌ Ａ ＰＲＡ
ＭＥ反応性Ｔ細胞を排除する。
投薬デザイン
・１／３が出発用量（コホート３）においてＤＬＴを経験する場合；別の３名の被験体
が登録され、コホート３において処置される。最初の３名の患者は、各患者の後に３週間
追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホ
ートは、同時に登録され得る。
・０／３または１／６の被験体がコホート３（出発用量）においてＤＬＴを経験する場
合、次にその後の被験体は、コホート４に登録される。≧２／６の被験体がコホート３に
おいてＤＬＴを経験する場合；次にその後の被験体は、コホート２に登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート４においてＤＬＴを経験する場合、次にその
後の被験体は、コホート５に登録される。≧２／６の被験体がコホート４においてＤＬＴ
を経験する場合、次にコホート３はＭＴＤと示され（declared）、３名の被験体のみがコ
ホート３において処置されている場合、次に追加の３名の被験体がＭＴＤを確認するため
に登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート５においてＤＬＴを経験する場合、コホート
５は、ＭＴＤと示され、３名の被験体のみがコホート５において処置されている場合、次
に追加の３名の被験体がＭＴＤを確認するために登録される。≧２／６の被験体がコホー
ト５においてＤＬＴを経験する場合、コホート４がＭＴＤと示され、３名の被験体のみが
コホート４において処置されている場合、次に追加の３名の被験体がＭＴＤを確認するた
めに登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート２においてＤＬＴを経験する場合、次にコホ
ート２は、ＭＴＤと示され；３名の被験体のみがコホート２において処置されている場合
、次に追加の３名の被験体がＭＴＤを確認するために登録される。≧２／６の被験体がコ
ホート２においてＤＬＴを経験する場合；その後の被験体は、コホート１に登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート１においてＤＬＴを経験する場合、次にコホ
ート１は、ＭＴＤと示される。≧２／６の被験体がコホート１においてＤＬＴを経験する
場合；次にこの研究は中断され、そのデータは、治験依頼者および研究者を含む臨床研究
チームによって評価される。
Ｃｅｌｌ Ａ処置のＤＬＴは、以下のとおりに定義される：
最初の２１日間で起こる新たな有害事象は、Ｃｅｌｌ Ａ注入に関連した
・≧グレード５の血液毒性は、Ｃｅｌｌ Ａに関連した；
・≧グレード３の非血液毒性は、過敏性反応および自己免疫反応を含め、Ｃｅｌｌ Ａ注
入に関連した
処置効果は、国際作業グループ判定基準を使用してベースラインと比較して計算する。
投薬研究の組み入れ基準の例
１．急性白血病：急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）以外の難治性または再発性のＡＭＬを
有する患者、
２．モノソーム核型または複雑核型を有する患者は、残存病変が同定される場合、導入化
学療法後の１４日目の生検の時点で登録され得る。
３．患者は、ＨＬＡ−Ａ２．０１を発現しなければならず、骨髄性芽球（myeloid blast
）は、ＰＲＡＭＥを発現しなければならない。
４．絶対リンパ球数（ＡＬＣ）＞３００／ｍｍ３またはＣＤ３＋＞１５０細胞／ｍｍ３。
５．再発してしまい、かつ幹細胞移植後１００日間を超えている患者は、彼らが全身性免
疫抑制療法を要する活動性ＧＶＨＤを有しなければ、適格である。
６．再発性もしくは難治性のＡＭＬまたはＭＤＳ
・ＡＭＬ患者は、代わりの因果律（例えば、骨髄再生）なしに、研究登録時に＞５％
骨髄芽球を有しなければならない。
−ＡＭＬの改正国際作業グループ判定基準に従う再発性もしくは難治性のＡＭＬ
・１０〜１９％ 芽球を有し、低メチル化療法もしくはＩＰＳＳ ＩＮＴ−１に応答し
ないＩＰＳＳ ＩＮＴ−２または高グレードＭＤＳ（ＲＡＥＢ−２）、最初の応答後の再
発を有するＩｎｔ−２もしくは高グレードＭＤＳ
７．年齢＞１８歳。
８．平均余命が少なくとも２ヶ月。
９．ＥＣＯＧパフォーマンスステータス（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｔｕｓ）：
≦２
１０．白血球増加症のコントロールが必要とされる場合にのみ与えられるヒドロキシ尿素
を除いて、第１の被験薬投与の前に、以前投与された薬物のうちの以前の細胞傷害性薬剤
に関して少なくとも１４日間、以前のがん治療を休む。以前の化学療法に由来する持続性
の臨床的に重大な毒性は、登録の時点でグレード１を超えていてはならない。化学療法剤
は、急速に成長する疾患をコントロールすることが必要な場合、Ｔ細胞再注入の前に最大
５日間与えてもよい。
１１．Ｔ細胞アフェレーシス収集のための施設判定基準を満たすことができる
１２．腎機能：
１．全患者は、Ｃｏｃｋｒａｆｔ−Ｇａｕｌｔに従って、計算されたクレアチニンクリ
アランス＞４０ｍＬ／分を有しなければならない。
２．慣用的な尿検査は、臨床的に重大な異常を示してはならない。
１３．適切なＬＦＴ：総ビリルビン≦３．０×施設内正常値上限（ＵＬＮ）とともに直接
ビリルビン＜１．６×ＵＬＮ。
１４．ＡＬＴ／ＡＳＴおよびアルカリホスファターゼ≦５×ＵＬＮ
１５．許容可能な凝固状態：
−ＩＮＲ／ＰＴ≦１．５×正常値上限（ＵＬＮ）
−ＰＴＴ＜１．５×ＵＬＮ
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
要旨
再発性または難治性の急性骨髄性白血病は、最適管理の決定への明確な道筋がないこと
から、患者生存にとって困難な臨床状況である。集中的管理をもってしても、４年間の難
治性ＡＭＬの全生存率は、一貫して不良である：ＳＷＯＧ−６０歳を超える患者に関して
は４年間で３％、ＨＯＶＯＮ−ＳＡＫＫ ６０歳未満の患者に関しては５年間で７％の全
生存率および６０歳を超える患者において２年間で４％。幹細胞移植を含む標準治療とと
もに第２のサルベージ療法を受けているＡＭＬを有する５９４名の患者の後ろ向き分析研
究から、メジアン生存期間１．５ヶ月とともに１年生存率８％が報告された。標準的アル
ゴリズムは、進行性疾患を有するＭＤＳ患者においてＨＳＣＴまたは「新規薬剤での治験
」を推奨する（Ｓｅｋｅｒｅｓ， ２０１４）。明らかに、潜在的に治癒力のある移植の
資格を得るために、骨髄性新生物を有する患者がそれらの疾患をコントロール下に置く臨
床的必要性は、満たされていない。
ＰＲＡＭＥは、正常組織において検出されるより高い頻度でかつ遙かに高いレベルでＡ
ＭＬにおいて発現される。任意のオフ腫瘍／オンターゲット副作用は、ＣａｓｐａＣＩＤ
ｅ自殺スイッチの活性化およびＣｅｌｌ Ａ Ｔ細胞の排除によって対処されるはずであ
るので、ＴＣＲ免疫療法は、再発性または難治性の骨髄性新生物を有する「選択肢のない
」患者において評価されるべきである潜在的治療ストラテジーである。
この用量設定プロトコルにおいて、再発性もしくは難治性のＡＭＬまたは進行した低メ
チル化剤抵抗性ＭＤＳを有する患者は、アフェレーシスを介して集められかつ既知のクラ
スＩ ＨＬＡ拘束要素ＨＬＡ Ａ２．０１の状況においてＰＲＡＭＥを標的とするトラン
スジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するようにレトロウイルスを使用して改
変された自家Ｔ細胞を有する。上記細胞は、養子移入された、操作された治療用Ｔ細胞生
成物の恒常的拡大（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を提供するのに適し
たリンパ球減少を有すると上記患者が同定された後に、用量設定スケジュールに従って再
注入され得る。
（原発性難治性ＡＭＬ）
集中的導入化学療法（１サイクルまたは２サイクル）で最初に処置された患者に関して
、２０〜４０％が、寛解を得られず、原発性難治性疾患を有すると考えられる（Ｃｈｅｓ
ｏｎ ２００４）。原発性難治性疾患は、複雑核型もしくはモノソーム核型、または続発
性処置関連ＡＭＬもしくは先立つ血液障害から生じるがＡＭＬ疾患リスク層別の全てにわ
たって認められ得るＡＭＬ、を有する患者においてより一般に同定される。６０歳未満の
ＡＭＬを有する患者のうちのおよそ１０％は、彼らの白血病クローン内でモノソーム核型
と同定される一方で、この分子サブタイプは、年齢と共にますます同定されており、６０
歳を超える患者のうちの約２０％は、この抵抗性疾患表現型を発現している。集中的導入
化学療法を行うと、６０歳未満の患者では、寛解率は、およそ１４〜５０％である一方で
、６０歳を超える患者では、寛解率は、１３〜３４％へと低下する（Ｂｒｅｅｍｓ， ２
００８； Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ， ２００９； Ｍｅｄｅｉｒｏｓ ２０１０）。
再発性ＡＭＬ
再発性ＡＭＬを有する患者にとっての転帰は、同様に失望するものである。細胞遺伝学
リスク群および生物学的リスク群では変動するものの、再発性ＡＭＬを有する患者のうち
の３０〜６０％は、サルベージ化学療法で第２の寛解を得ることができ（Ｍａｎｇａｎ，
２０１１）、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒのデータは、幹細
胞移植へと進んだそれら患者ではメジアン生存期間１１．７ヶ月に対して、化学療法単独
に関しては５．６ヶ月のメジアン生存期間を示す（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ， ２００９）。
患者が二次サルベージ療法を要する場合、転帰は、極めて不良である。幹細胞移植を含む
標準治療とともに二次サルベージ療法を受けているＡＭＬを有する５９４名の患者の後ろ
向き分析研究から、メジアン生存期間１．５ヶ月とともに１年生存率８％が報告された。
完全寛解（ＣＲ）を達成する患者の下位群（１３％）を分析した場合、メジアンＣＲ持続
期間は、７ヶ月であった。多変量解析に際して、多くの予後不良特徴が同定された（年齢
＞６０、初期ＣＲ持続期間＜１２ヶ月、および第２のＣＲ持続期間＜６ヶ月が挙げられる
）（Ｇｉｌｅｓ， ２００５）。重要なことには、標準治療は、＜１２ヶ月で再発する患
者に都合良く影響を与えないようである（Ｋｕｍａｒ， ２０１１）。
ＭＤＳ
低メチル化剤で処置されておりかつ疾患が進行してしまったか、または疾患が応答でき
なかった骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する患者は、非常に予後不良であり、いかなる
治療の利益も支持医療を超えるという証拠はない。標準的アルゴリズムは、この状況では
「新規薬剤での治験」を推奨する（Ｓｅｋｅｒｅｓ， ２０１４）。ＰＲＡＭＥ発現およ
び過剰発現は、いくつかのグループによってＭＤＳにおいて同定されている。ＭＤＳにお
けるＰＲＡＭＥ発現は、より高いリスク疾患のマーカーとして研究されてきており、より
悪い転帰が示されているが、これは、より大きな患者コホートにおいて検証されていない
（Ａｎｄｒｅｗｓ， ２０１４）。
再発性もしくは難治性の骨髄性新生物における処置選択肢
移植
ＡＭＬ持続もしくは再発を有する患者では、白血病は、化学療法感受性ではないと考え
られ、代替の管理ストラテジーが要求される。現在では、これら患者のための普遍的目標
は、彼らが虚弱でなくかつ手順の厳しさに耐え得ると想定して、同種異系造血幹細胞移植
（ＨＳＣＴ）を追求することである。患者が難治性、再発性のＡＭＬを有し、かつ臨床的
寛解を得られない場合、およびその患者が適切なＨＬＡマッチドナー、良好なパフォーマ
ンスステータス（＞９０％ ＫＰＳ）を有し、循環する芽球がない場合、移植後の長期の
全生存率は、２０〜３０％である（Ｃｒａｄｄｏｃｋ ２０１１， Ｄｕｖａｌｌ ２０
１０）。移植がなければ、意味のある長期の生存はない。
急性白血病を有し、同種異系ＨＳＣＴに適格でない高齢患者は、一般に転帰不良であり
、従って、依然としてかなり治療が困難なままである。ＡＭＬを有する高齢患者のうちの
３０〜４０％が、標準導入でＣＲを達成するが、この集団におけるメジアン生存期間は、
１０ヶ月に近い（Ｏｒａｎ ２０１２）。この集団における転帰がより不良であることは
、高リスク細胞遺伝学的特徴（cytogenetics）、より高い二次性白血病率、多剤耐性の増
大、パフォーマンスステータスの低下、重大な共存症、ならびに寛解後強化（ｐｏｓｔ
ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）の定義のはっきりしない利益および
高い処置関連死亡率に帰因している（Ｏｒａｎ ２０１２）。従って、過去１０年間にわ
たる臨床ストラテジーにおける変化は、高齢患者を含めるよう試みて、ＨＳＣＴ適格性を
拡大してきた（Ｈｅｇｅｎｂａｒｔ， ２００６）。
Ｃｅｌｌ Ａ： ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ免疫療法
治療様式として、養子Ｔ細胞療法は、同種異系移植後の再発を管理するにあたって有効
なツールであることが示されてきた（Ｃｏｌｌｉｎｓ， １９９７； Ｋｏｌｂ， １９
９５； Ｐｏｒｔｅｒ， ２００５）。
免疫抑制の非存在下で養子移入された、刺激されていない（unprimed）ドナー由来のＴ
細胞は、特に化学療法と併用された場合に有効であり得、持続し得る臨床的寛解を取り戻
し得る。ＨＬＡ抗原および特定の腫瘍ペプチドに対して拘束された、エキソビボで拡大さ
れたＴ細胞は、ＷＴ１またはＰＲ１のような標的を使用して、小施設症例集積にて（in
small institutional series）利益を有することが示された。近年、キメラ抗原レセプ
ター改変Ｔ細胞（レンチウイルスベクターによって自家Ｔ細胞生成物へと導入される）の
出現は、種々の疾患状態における既知の系統特異的抗原を標的化するにあたって非常に有
効であることが示されており、現在Ｂ細胞悪性腫瘍において最高の経験がなされている（
Ｐｏｒｔｅｒ， ２０１１； Ｇｒｕｐｐ， ２０１３）。これらの最も最近の進歩は、
それらを標準的な製造に結び付けることができ、かつ共通の抗原を発現する悪性腫瘍を有
する種々の患者に一般化することができてきたことから、急速に商業化されてきた。しか
し、ＡＭＬおよびＭＤＳの治療は、理解しにくい。なぜならＣＡＲ−Ｔ細胞は、有効であ
るとしても、長期の血球減少症と関連するようであるからである。
目的の別のペプチド抗原は、いくつかの腫瘍タイプ（ＡＭＬおよびＭＤＳが挙げられる
）の悪性細胞上で発現される腫瘍抗原であるメラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に由
来する。ＰＲＡＭＥは、レチノイン酸シグナル伝達（混乱させられ得かつ白血病発生にお
いて重要であることが公知である経路）の調節において役割を有する。
ＰＲＡＭＥは、がん−精巣抗原ファミリーのメンバーであり、胚組織およびいくつかの
悪性腫瘍において高レベルで発現される。それは、メラノーマ組織において最初に同定さ
れたが、その後、複数のがんにおいて検出されている（リンパ系悪性腫瘍および骨髄系悪
性腫瘍の両方を含む）。ＰＲＡＭＥは、複数のグループによって、急性骨髄性白血病細胞
上で同定されており、白血病関連抗原（ＬＡＡ）と考えられている。ＰＲＡＭＥは、天然
には免疫原性であり、エキソビボで拡大されるＴ細胞は、ＨＬＡ拘束要素の状況において
、Ｔ細胞レセプターを通じてＰＲＡＭＥペプチドを標的とし得、これが養子細胞療法の利
用され得る標的であり得ることを示唆する。
ＰＲＡＭＥ過剰発現は、研究されてきており、新たに診断されたＡＭＬ患者のうちのお
よそ３２％（Ｇｏｓｗａｍｉ， ２０１４）、ｖａｎ Ｂａｒｅｎらによる研究では３５
％（ｖａｎ Ｂａｒｅｎ， １９９８）およびＱｉｎらによる研究では５５．４％（Ｑｉ
ｎ， ２００９）に存在する。高発現は、Ｄｉｎｇらによる研究（Ｄｉｎｇ， ２０１２
）ではｔ（８；２１）およびｔ（１５；１７）白血病（４０．７％）と関連した。Ｑｉｎ
らは、７４．４％および５６．６％発現、ならびにＭＤＳを有する患者において骨髄サン
プルでの過剰発現を同定した（Ｑｉｎ ２００９）。
ＨＬＡ拘束ＰＲＡＭＥ抗原決定基の標的化は、難治性のＡＭＬおよびＭＤＳを有する患
者にとっての代替の細胞療法として、養子Ｔ細胞療法のために同様に標的とされ得る。
ＰＲＡＭＥ標的化ＴＣＲ免疫療法
健康な正常組織に対してオンターゲットおよびオフターゲット両方の反応性に関連した
、ＴＣＲ免疫療法と関連する安全性リスクが存在する。例えば、免疫療法のために生成さ
れる高親和性ＴＣＲは、ＭＡＲＴ−１に対して特異的なＴＣＲ Ｔ細胞の臨床試験におい
て報告されるように、いくらかの患者に関しては処置を要するオンターゲット／オフ腫瘍
毒性のリスクを課し得る。従って、がんおよび正常組織における発現が十分に理解されて
いる標的抗原を選択することは、重要である。ＰＲＡＭＥ抗原は、低レベルでの腎臓上皮
細胞における発現により同定されているので、画像化および実験室での検査による腎機能
の注意深いモニタリングが行われる。
コントロール不能なオフ腫瘍／オンターゲットＴ細胞毒性の事象において遺伝子改変さ
れたＴ細胞を除去するために「安全スイッチ」を含めることは、臨床上の安全性を改善す
る。Ｃｅｌｌ Ａ、ＰＲＡＭＥ抗原を標的とするＴＣＲベースの治療は、ＡＭＬの処置の
ためにＣａｓｐａＣＩＤｅ自殺スイッチ技術を組み込むようにデザインされる。Ｃｅｌｌ
Ａ Ｔ細胞生成物において発現されるＴＣＲは、がん細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２に結合
したＰＲＡＭＥペプチドを認識しかつこれに結合し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす
。
開発されてきたＴＣＲは、天然の高親和性を有するが、さらに親和性は増強されていな
い。さらに、リミズシドの投与に応じたＣａｓｐａＣＩＤｅ安全スイッチの活性化は、ｉ
カスパーゼ−９カスケードの活性化およびＣｅｌｌ Ａ Ｔ細胞のインビボでの排除をも
たらす。この安全スイッチは、患者が養子Ｔ細胞療法の利益を受けることを可能にしなが
ら、関連する健康上のリスクを軽減する。
ＣＥＬＬ Ａによって発現されるＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞
株のパネルに対しておよび原発性ＡＭＬ細胞に対して高い反応性を示し、近位尿細管上皮
細胞に対する低い反応性および成熟樹状細胞に対する中程度の反応性を除いて正常細胞タ
イプに対して反応性を示さなかった。ＴＣＲ αおよびβ鎖の遺伝子を配列決定し、ｉＣ
ａｓｐ９自殺遺伝子とともに、患者Ｔ細胞を形質導入して、Ｃｅｌｌ Ａ ＴＣＲ Ｔ細
胞免疫療法生成物を生成するために使用されるレトロウイルスベクターに挿入した。
高親和性ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞を、同種異系幹細胞移植後にＡＭＬ患者から単離した
（Ａｍｉｒら ＣＣＲ ２０１１）。このＴ細胞は、Ｋｅｓｓｌｅｒら（Ｋｅｓｓｌｅｒ
， ２００１）によって以前に記載されるＰＲＡＭＥ由来ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（
ＳＬＬ）を認識することが見出された。これら高親和性ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローン
のさらなる分析は、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍細胞株のパネルに対して、ならびに転移性メラノ
ーマ、肉腫、および原発性ＡＭＬ細胞に対して高反応性を示し、近位尿細管上皮細胞に対
する低い反応性および成熟樹状細胞に対する中程度の反応性を除いて、正常細胞タイプに
対して反応性（reaactivity）を示さなかった。ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンＨＳＳ
１のＴＣＲ αおよびβ鎖の遺伝子（ＡＡＶ５４といわれる）を配列決定し、ｉＣａｓｐ
９自殺遺伝子とともに、Ｔ細胞を形質導入して、Ｃｅｌｌ Ａ ＴＣＲ Ｔ細胞免疫療法
生成物を生成するために使用されるレトロウイルスベクターに挿入した。
インビボ前臨床研究
免疫不全マウスモデルは、予測外のオンターゲット／オフ腫瘍毒性と関連する毒性を推
測するにあたって歴史的に有用ではなかったが、インビボマウスモデルとＣｅｌｌ Ａ
ＰＲＡＭＥ ＴＣＲとの使用は、ＰＲＡＭＥ指向性ＴＣＲによる殺滅の効力、およびＣａ
ｓｐａＣＩＤｅスイッチのリミズシド活性化によるＣｅｌｌ Ａ Ｔ細胞の機能的排除の
両方を示すにあたって有用である。２つのインビボ研究を、ともに、ｉＣａｓｐ９および
ＰＲＡＭＥ αβＴＣＲをコードするγ−レトロウイルスで形質導入したＣｅｌｌ Ａ、
ＨＬＡ−Ａ２．０１拘束ヒトＴ細胞を使用して、免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ．ＣｇＰｒｋｄ
ｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ； ＮＳＧ）マウスモデルにおいて行った
。このＣｅｌｌ Ａ構築物は、誤った対合を最小限にするようにデザインされたシステイ
ン改変ＴＣＲ ＨＳＳ１と同じシステイン改変アミノ酸配列を含む（Ａｍｉｒ， ２０１
１）。
ＰＲＡＭＥ発現腫瘍に対するＣｅｌｌ Ａ効力
正常ドナーＨＬＡ−Ａ２．０１拘束ヒトＴ細胞を活性化し、ｐＳＦＧ−ｉＣ９．２Ａ．
ＰＲＡＭＥ由来Ｃｅｌｌ Ａベクターで形質導入した。Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞および非形
質導入（ＮＴ）コントロールＴ細胞を、Ｃｅｌｌ Ａ ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインセグ
メントであるＶβ１の発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。Ｕ２６６骨
髄腫腫瘍を、２×１０６ Ｕ２６６−ＥＧＦＰ−ルシフェラーゼ（Ｕ２６６−ｌｕｃ）腫
瘍細胞／動物の尾静脈注射によって、１０匹のＮＳＧマウスにおいて確立した。腫瘍生着
後２４日目に、５匹のマウスに、１×１０７ 非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞またはＣｅｌｌ
Ａで形質導入した１×１０７ Ｔ細胞のいずれかを、ｉ．ｖ．注射を介して与えた。腫
瘍サイズを測定するために１週間に１回を基本にしてＩＶＩＳ画像化を行った。
Ｃｅｌｌ Ａは、Ｃｅｌｌ Ａの単回のｉ．ｖ．注射後に、処置後のバックグラウンド
レベルへの腫瘍排除を２週間未満で示したのに対して、ＮＴ Ｔ細胞の注射は、腫瘍成長
をコントロールしなかった（図２１）。腫瘍負荷の尺度としての平均放射輝度を使用する
と、ＮＴ Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍は、Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞で処置したマウスよ
り約８００倍多い細胞を有した。これらデータは、Ｃｅｌｌ Ａが、ｉ．ｖ．注射を介し
て投与した１×１０７ Ｔ細胞の用量で、Ｕ２６６骨髄腫腫瘍に対してインビボで有効で
あることを示す。
リミズシドに対するインビボでのＣｅｌｌ Ａ応答
１６匹のマウスに、上記で概説されるように、０日目に１×１０７ Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ
細胞のｉ．ｖ．注射を与えた。４８時間後、上記マウスのうちの８匹に、５ｍｇ／ｋｇの
リミズシドをｉ．ｐ．注射して、ｉＣａｓｐ９の活性化およびＣｅｌｌ Ａ Ｔ細胞のア
ポトーシスを評価した；他の８匹のマウスは、未処置のままにした。リミズシド投与の２
４時間後の脾臓のフローサイトメトリー分析は、非形質導入ヒトＴ細胞が８匹の各群中の
５匹の動物において検出されるが、リミズシドは、処置された動物において形質導入され
たＣｅｌｌ Ａ Ｔ細胞の大部分を効率的に排除したことを示した：ヒトＴ細胞のうちの
４２±１．１％は、リミズシド処置動物における７．３±０．２％と比較して、処置され
ていないマウスにおいてＶβ１＋であった（ｐ＜０．０００１）（図２２、上段：未処置
動物；下段：リミズシド処置マウス）。従って、Ｃｅｌｌ Ａ内でコードされるｉＣａｓ
ｐ９は、インビボで誘発されてＣｅｌｌ Ａ細胞を排除し得る機能的安全スイッチを表す
。
ＣａｓｐａＣＩＤｅ（ｉＣａｓｐ９）スイッチは、インビボで５１日後にＣｅｌｌ Ａ
Ｔ細胞において感受性のままである
脾臓細胞および骨髄細胞を、ＮＴ Ｔ細胞またはＣｅｌｌ Ａ改変Ｔ細胞のいずれかで
処置したマウスから、Ｔ細胞注射後５１日目（腫瘍移植後７４日目）に採取し、計数し、
ＣＤ４＋ およびＣＤ８＋ Ｔ細胞上でのＶβ１発現に関してフローサイトメトリーによ
って分析した。有効な腫瘍排除を示した動物においてすら、Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞は、脾
臓および骨髄中に存続した（図３）。非形質導入Ｔ細胞を受けたマウスにおけるより、Ｃ
ｅｌｌ Ａ Ｔ細胞を受けたマウスの脾臓において、約６００倍多い総ＣＤ８＋ Ｔ細胞
、約１３０倍多いＶβ１＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞が存在した。
脾臓細胞および骨髄細胞の画分を、上記で分析されるように、Ｃｅｌｌ Ａ処置動物か
ら単離し、自殺スイッチの感受性を決定するために、１０ｎＭ リミズシドありまたはな
しで一晩培養した。リミズシドは、脾臓および骨髄の両方から回収されたＶβ１＋ Ｔ細
胞の画分を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。このことから、存続するＣｅｌｌ Ａ細
胞が機能的ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子を保持することが確認された（図２４）。
前臨床試験の結論
ＮＳＧマウスへの尾静脈注射の後、Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞は、２４時間後程度の早さで
脾臓において検出され得、注射後４８時間で数の増大が検出され得る。Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ
細胞は、ＮＳＧマウスにおいてｉ．ｖ．投与した場合に、測定可能な存続およびＵ２６６
骨髄腫細胞に対して抗腫瘍効力を示す。Ｃｅｌｌ Ａ改変Ｔ細胞は、１×１０７ Ｔ細胞
の用量で、投与後２週間未満でＵ２６６骨髄腫腫瘍を排除し、５０日間より長く、腫瘍成
長をコントロールした。Ｃｅｌｌ Ａ内でコードされるｉＣａｓｐ９は、リミズシド投与
によって誘発されて、アポトーシスを誘導することによってＣｅｌｌ Ａ細胞を排除し得
る安全スイッチとしてインビボで機能する。ルシフェラーゼ生物発光（ＩＶＩＳによって
測定される）による検出可能な腫瘍はないにも関わらず、Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞は、５１
日間で脾臓および骨髄の両方から回収され得る；これら細胞は、その後のリミズシド処置
に対して感受性のままであった。
これらデータは、Ｃｅｌｌ ＡがＰＲＡＭＥ／ＨＬＡ−Ａ２抗原を発現する腫瘍細胞に
対して有効であること、およびｉＣａｓｐ９スイッチがリミズシド処置後に、形質導入さ
れたＴ細胞を排除するにあたって有効であることを示唆する。
リミズシド安全性および機能性の臨床評価
ヒトにおけるＴＣＲ細胞療法の安全性
一般に、ＴＣＲ細胞療法に関する１つの安全性の懸念は、腫瘍抗原発現正常組織でのＴ
細胞活性化に起因するオンターゲットオフ腫瘍毒性のリスクである。短期間の毒性は、潜
在的には、急性輸液反応、アナフィラキシーおよび心停止、オンターゲット毒性（例えば
、腫瘍溶解症候群およびサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ））からなる。
リミズシド／ＡＰ１９０３二量体化剤薬物
ＡＰ１９０３は、細胞内部の操作されたタンパク質のクラスター化を誘導することによ
って作用する活性化薬物、または二量体化剤薬物といわれる脂質透過性化合物の新たなク
ラスのメンバーである。カスパーゼ９自殺遺伝子のＡＰ１９０３誘導性活性化は、ヒトＦ
Ｋ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する薬物結合ドメインに融合されたキメラタ
ンパク質（ｉＣａｓｐ９）を発現することによって達成される。このキメラタンパク質は
、ＡＰ１９０３（これは、ＦＫＢＰドメインを架橋し、ｉＣａｓｐ９シグナル伝達を開始
する）の投与まで細胞内部で静止している。このシグナル伝達は、遺伝子改変された細胞
のアポトーシスを誘導する。ＡＰ１９０３は、２５％ Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（非
イオン性可溶化剤）中５ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
ヒト志願者におけるリミズシド
フェーズＩのプラセボコントロール単盲検の静脈内単一漸増用量研究を、成人の健康な
被験体において行って、リミズシド／（ＡＰ１９０３）（Ｉｕｌｉｕｃｃｉ， ２００１
）の安全性、耐容性および薬物動態を決定した。２８名の被験体を、５処置群に登録し、
これら群においてＡＰ１９０３の５種の用量レベル（すなわち、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０
．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇ）を調
査した。各群内で、４名の被験体にＡＰ１９０３を与え、１名の被験体にプラセボを与え
、１名の被験体にノーマルセーラインを与えた。唯一の例外は、０．５ｍｇ／ｋｇ処置群
においてであり、３名の被験体にＡＰ１９０３を与え、１名の被験体にノーマルセーライ
ンを与えたことであった。各処置群内で、ＡＰ１９０３、プラセボ、およびノーマルセー
ラインの用量体積は、体重ベースで同等であった。全ての処置を、２時間の期間をかけて
、静脈内注入として投与した。臨床アセスメントは、投与前ならびに注入開始後１０分、
２０分、４０分、１時間、１時間２０分、１時間４０分、２時間、４時間、８時間、１２
時間および２４時間で、ならびに７日目に再度測定した生命徴候（仰臥位での血圧、仰臥
位での脈拍数および口腔体温）を含んだ。１２誘導安静時ＥＣＧを、投与前、注入開始後
３時間および２４時間、ならびに７日目に行った。連続心臓モニタリングを、注入開始前
のおよそ１時間から行って、注入開始後３時間まで継続した。注射用ＡＰ１９０３は、全
ての用量レベルで安全かつ十分に寛容されることが示され、都合の良い薬物動態プロフィ
ールを示した。
ＡＰ１９０３（リミズシド）の臨床的機能性
ＣＡＳＰＡＬＬＯ治験の１０名の被験体を、ｉカスパーゼ−９自殺スイッチを含むＴ細
胞で処置したところ、４名の被験体に急性ＧＶＨＤが発生した。これは、ＡＰ１９０３の
投与後に、アポトーシスを介する同種反応性Ｔ細胞の選択的排除を伴って、急速に抑止さ
れた。ＡＰ１９０３は、２時間の静脈内注入の終了から３０分で誘導性カスパーゼ−９発
現Ｔ細胞のうちの≧９０％の排除をもたらした。ＡＰ１９０３注入と関連した有害事象は
報告されなかった。
ＤＯＴＴＩ治験は、ＣＡＳＰＡＬＬＯ治験に対する追跡研究である。３名の被験体は、
グレードＩおよびＩＩの急性ＧＶＨＤをその後発生させたので、二量体化薬物（dimerizi
ng drug）ＡＰ１９０３の単一用量で処置した。４名の被験体は、移植後４７６日という
メジアンで生存しており（範囲は、２７８〜６７４日）、そして彼らは、ＡＰ１９０３を
受けていた。ＡＰ１９０３と関連した即時型または遅延型の有害事象は存在しなかった。
研究デザイン
これは、拘束要素ＨＬＡ Ａ２．０１の状況においてＰＲＡＭＥペプチドと反応するａ
／ｂ Ｔ細胞レセプターからなるレトロウイルス構築物で遺伝子改変した自家Ｔ細胞の安
全性および有効性を決定する、シングルアーム用量漸増／漸減、単一ＵＳ施設のフェーズ
１研究である。漸増漸減デザインの使用は、再発性もしくは難治性のＡＭＬまたはＭＤＳ
を有する患者にとって有効な治療が存在しないこと、ならびに治療量以下の投与で開始す
ることが、急速な白血病進行および何らかの有効性シグナルが存在するかを決定すること
ができないことの原因となる可能性があることを認識するによって支持される。この研究
は、およそ３６名までの患者（patients patients）を登録し、これにより、２４名の患
者が処置されかつ有効性について評価されることを可能にする。適格性の評価後に、この
研究に適格である患者を登録し、Ｔ細胞アフェレーシスを遂行する予定を立てる。ベスト
プラクティス労力（Ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｅｆｆｏｒｔ）は、患者の再発性およ
び難治性の白血病またはＭＤＳを処置するために使用されるが、一般に、製造されたＴ細
胞注入の時点の被験薬の活性化（activation of study treatment）前にリンパ球枯渇
という課題も順当に達成する、標準的ＡＭＬまたはＭＤＳサルベージレジメン内で組み込
まれたプリンアナログを含む。
安全性は、治験の間全体を通してモニターされる。組み込みベクター（例えば、レトロ
ウイルス構築物）を利用する先端治療生成物のための遺伝子治療生成物に関する確立され
たガイドライン（ＦＤＡ）に基づいて、Ｃｅｌｌ Ａで処置される全ての患者は、彼らが
処置薬剤に応答したか否かに関わらず、合計で１５年間まで特異的毒性についてモニター
されなければならない。全ての患者は、この治験において５年間にわたってモニターされ
、続いて、別個の長期安全性追跡プロトコルにおいて１年に１回の安全性評価が行われる
。その目的は、細胞療法と関連する急性および遅延型の有害事象のリスクを評価すること
、ならびにＲＣＲ（複製能のあるレトロウイルス）をモニターすることである。
処置薬剤の有効性は、分子的、細胞遺伝学的および血液学的な完全奏効および部分奏効
の評価を含め、疾患コントロールの二次エンドポイントを通じて評価され得る。臨床応答
の尺度は別の方法では適格でなかった、ＨＳＣＴへと進んだ患者のパーセントを決定する
ことである。
投薬デザイン：
・１／３が出発用量（コホート３）においてＤＬＴを経験する場合；別の３名の被験体
が登録され、コホート３において処置される。最初の３名の患者は、各患者の後に３週間
追跡調査して順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホ
ートは、同時に登録され得る。
・０／３または１／６の被験体がコホート３（出発用量）においてＤＬＴを経験する場
合、次にその後の被験体は、コホート４に登録される。≧２／６の被験体がコホート３に
おいてＤＬＴを経験する場合；次にその後の被験体は、コホート２に登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート４においてＤＬＴを経験する場合、次にその
後の被験体は、コホート５に登録される。≧２／６の被験体がコホート４においてＤＬＴ
を経験する場合、次にコホート３は、ＭＴＤと示され得、そしてわずか３名の被験体がコ
ホート３において処置されている場合、ＭＴＤを確認するために、さらに３名の被験体が
登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート５においてＤＬＴを経験する場合、コホート
５は、ＭＴＤと示され得、わずか３名の被験体がコホート５において処置されている場合
、ＭＴＤを確認するために、さらに３名の被験体が登録される。≧２／６の被験体がコホ
ート５にいてＤＬＴを経験する場合、コホート４は、ＭＴＤと示され得、わずか３名の被
験体がコホート４において処置されている場合、ＭＴＤを確認するために、さらに３名の
被験体が登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート２においてＤＬＴを経験する場合、コホート
２はＭＴＤと示され得；わずか３名の被験体がコホート２において処置されている場合、
ＭＴＤを確認するために、さらに３名の被験体が登録される。≧２／６の被験体がコホー
ト２においてＤＬＴを経験する場合；次にその後の被験体は、コホート１に登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート１においてＤＬＴを経験する場合、コホート
１は、ＭＴＤと示され得る。≧２／６の被験体がコホート１においてＤＬＴを経験する場
合；その研究は中断され、そのデータは、治験依頼者および研究者を含め、臨床研究チー
ムによって評価される。
Figure 2021090466
投薬の安全性は、臨床研究チームによって評価され得、このチームは、治験依頼者（医
学責任者）、研究医療モニター（Study Medical Monitor）、および研究者から構成さ
れる。この臨床研究チームは、各コホートから明らかになる安全性データを精査して、用
量漸増または漸減が想到するかを決定する。あるいは、非耐用量レベルと先の耐用量レベ
ルとの間の中間の用量レベルが調査され得、６名の被験体のうちの＜２名がその用量にお
いてＤＬＴを経験する場合に、ＭＴＤと示され得る。
所定の患者のための目標用量を満たすには不適切な細胞が存在する場合、その被験体は
、利用可能な細胞を与えられ得るが、ＭＴＤの決定のために評価可能とは見做されなくて
もよい。
研究中の集団において頻繁な共存症および併用薬物療法（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅ
ｄｉｃａｔｉｏｎ）に起因して、ＡＥの原因が特定の薬物にあるとすることは、困難であ
る。従って、Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞に関連しないと明確には決定できない全てのＡＥは、
ＤＬＴの決定に関連していると見做され得、臨床研究チームによって精査され得る。
動員されていないＴ細胞白血球搬出の前に、被験体の血球数および白血球百分率数（bl
ood count and differential）が収集されかつ記録され得る。確立された規制ガイド
ラインに従う感染症モニタリングが行われ得る。被験体は、白血球搬出を開始する前に、
ＣＢＣおよび血小板に関して施設内基準を満たさなければならない。白血球画分を、標準
化された連続フロー遠心分離を使用して集め得る。この被験体は、アフェレーシスの間に
モニターされ得る。およそ３〜４血液容積までの標準アフェレーシス手順は、白血病患者
に関する予防措置を含め、施設内標準手順に従って処理され得る。処理される容積および
白血球搬出の継続時間は、文書化されかつ記録され得る。５×１０９未満の単核細胞が集
められる場合、医療モニターに助言を求めなければならない。
ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ細胞（Ｃｅｌｌ Ａ）製造プロセス
Ｃｅｌｌ Ａ生成物の出発材料は、集中ＧＭＰ製造施設へと一晩で新鮮なまま輸送され
る患者由来ＰＢＭＣ収集物であるか、または上記収集物からその単核細胞が以前に選択さ
れかつ凍結保存されている患者由来ＰＢＭＣ収集物である。Ｆｉｃｏｌｌで分離された（
ｆｉｃｏｌｌｅｄ）収集物は、複数のアリコートに分けて凍結保存され、それらは、集中
ＧＭＰ製造施設へと輸送される。受け取った際およびその出発物質の受容性の確認の後、
アリコートを製造クリーン・ルームに移し、急速解凍する。その細胞を洗浄し、Ｔ細胞が
形質導入のための目標細胞数に達するまで増殖するように、培養培地に入れる。その拡大
したＴ細胞は、Ｃｅｌｌ Ａレトロウイルス構築物で形質導入される。上記細胞を、凍結
保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０）を用いて製剤化し、凍結保存する。最終Ｃｅｌ
ｌ Ａ生成物は、発売試験が完了するまで、液体窒素（ＬＮ２）の気相中で凍結保存して
貯蔵される。上記Ｃｅｌｌ Ａ生成物を、検証された凍結輸送容器（cryoshipper）中の
ＬＮ２の気相中で輸送し得る。処置用のＣｅｌｌ Ａを製造および発売するためにおよそ
２〜４週間かかると予測される。
パッケージングおよび製剤化： Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞を、１０〜１５ｍＬ 凍結培地
（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ， ＢｉｏＬｉｆｅ）中に凍結保存し、液体窒素の気相中で、凍結貯
蔵バッグの中に入れて凍結して貯蔵する。
輸送および貯蔵： 凍結保存したＣｅｌｌ Ａは、検証された輸送容器（shipping co
ntainer）中で臨床場所までＬＮ２の気相中で輸送され得る。受け取る細胞処理実験室は
、注入するときまでＬＮ２の気相中にその生成物を貯蔵する。その時点で、上記生成物は
、レシピエントへの注入のための指示に従って、３７℃±２℃で解凍され得る。輸送の日
付に依存して、輸送のタイミングは１日より長くてもよい。
Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞注入の前の化学療法およびリンパ球枯渇
Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞注入前の化学療法
改変されたＴ細胞での処置の前に、患者は、彼らの疾患生物学および共存症の臨床家の
評価に基づいて、および一時的な疾患コントロールを提供するために、以下のレジメンの
うちの１つとともに、つなぎ化学療法および同時にリンパ球枯渇化学療法を受ける。
−ＦＬＡＧ−Ｉｄａ（フルダラビン、シタラビン、ＧＣＳＦ、イダルビシン）
−ＦＬＡＧ（フルダラビン、シタラビン、ＧＣＳＦ）
−単一薬剤 クラドリビン
−単一薬剤 シクロホスファミド（以下のとおり）。
Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞注入前のリンパ球枯渇
被験体の絶対リンパ球数が１０００／μｌ未満である場合、Ｃｅｌｌ Ａ注入前にリン
パ球枯渇は必要ない。被験体のＡＬＣが１０００細胞／μｌを上回る場合、３日間にわた
るベンダムスチン ９０ｍｇ／ｍ２またはフルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ） ９
０ｍｇ／ｍ２のいずれかとシクロホスファミド ７５０ｍｇ／Ｍ２でのリンパ球枯渇化学
療法が、注入前の３日間までに（no later than 3 days）投与され得る。
さらなるリンパ球枯渇薬剤（例えば、フルダラビン）は、研究者の裁量でその後の被験
体についても考慮され得る。
Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞注入
Ｃｅｌｌ Ａ細胞は、３７℃のウォーターバスの中で解凍され得、研究手順マニュアル
に指示されるように、５０ｍＬ Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（最初に３５ｍＬ、次いで１５ｍ
Ｌでバッグを「すすぐ」）で希釈され得、１５〜３０分間かけて投与され得る。
被験体を、０日目にＣｅｌｌ Ａの投与のために病院に一晩入院させ得る。最大予測入
院日数は、予測外のＡＥが起こらなければ、一晩である。上記被験体は、Ｔ細胞生成物に
関する施設内標準に従ってアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンで予備処置され
得る。
施設内標準に従って、モニタリングが行われ得る。注入の前、および注入の４時間後に
、生体マーカーモニタリングのために、血液サンプルを収集し得る。生体マーカーモニタ
リングは、まとめられて評価され得る。このＡＥモニタリングは、最低でも注入後４時間
、継続する。
腫瘍評価および生体マーカー
腫瘍評価
ＡＭＬ（Ｃｈｅｓｏｎ， ２００３）およびＭＤＳ（Ｃｈｅｓｏｎ， ２００６）にお
ける改正国際作業グループ（ＩＷＧ）応答基準に基づいて処置に対する腫瘍応答を決定す
る血液および骨髄の連続サンプリング。
骨髄生検を、以下の時点で完了し得る：
−登録前の７日以内
−Ｔ細胞注入前の７日以内
−Ｔ細胞注入後４日目
−Ｔ細胞注入後２８日（±１日）
−臨床的に示されるとおり。
生体マーカー 連続の血液サンプリングが収集され得、選択的サイトカインおよび生体マ
ーカーのさらなる分析のために凍結保存される。
リミズシド（ＡＰ１９０３）二量体化剤薬物パッケージング、ラベリングおよび貯蔵
パッケージングおよび製剤化： 注入用ＡＰ１９０３を、１０ｍＬまたは２ｍＬいずれ
かのタイプ１ 透明ガラス製セラムバイアル中にパッケージする。各バイアルの内容物は
、ＡＰ１９０３濃度５ｍｇ／ｍＬおよびｐＨ５．０〜７．５の注射溶液として滅菌のエン
ドトキシン非含有２５％ Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５に溶解されたＡＰ１９０３薬物物
質の表示された内容物（それぞれ、４０ｍｇまたは１０ｍｇ）から構成される。各バイア
ルは、テフロン（登録商標）コーティングしたセラムストッパーおよびフリップオフシー
ルで栓をされる。
表示： 注射用ＡＰ１９０３の一次生成物ラベル（バイアルに直接つけられる）は、以
下の情報を含み得る：製品名、注射用ＡＰ１９０３；製造業者のロット番号；製品濃度、
５ｍｇ／ｍＬ；バイアル中で利用可能な溶液の体積；バイアルの総ＡＰ１９０３含有量（
４０ｍｇまたは１０ｍｇ）；提示「ＩＶ投与に関しては、保存剤は含まない」およびＩＮ
Ｄ表記「警告：連邦法によって研究用途に限定された新薬」。上記生成物は、各監督官庁
の要求に従って表示され得る。
貯蔵： 注射用ＡＰ１９０３バイアルは、アクセスが限定され、適格な冷蔵庫の中で５
℃±３℃（４１°Ｆ±５°Ｆ）で貯蔵されなければならず、遮光して貯蔵され得る。
処置のための調製： 使用に関して、ＡＰ１９０３は、投与前に希釈され得る。ＡＰ１
９０３は、ＤＥＨＰ非含有食塩水バッグおよび溶液セットを使用して２時間かけて投与さ
れる容積を有し、ノーマルセーライン中に希釈した０．４ｍｇ／ｋｇの目標用量で、ＩＶ
注入を介して投与される。詳細は、薬学マニュアルの中に含まれる。
リミズシドでのＰＲＡＭＥ−ＴＣＲの自殺誘導
０．４ｍｇ／ｋｇのリミズシド（ＡＰ１９０３）の用量を注入し得る。アセトアミノフ
ェン、Ｈ１およびＨ２ブロッカーならびに任意の他の標準的施設内予備処置／予防措置は
、潜在的なアナフィラキシー様の輸液反応（ＳｏｌｕｔｏｌのようなＫｏｌｌｉｐｈｏｒ
製品で潜在的に認められる）の予防措置として、リミズシドの注入の前に必要とされる。
リミズシドの注入は、非ＤＥＨＰ食塩水バッグを使用して行われるものとし、詳細は、リ
ミズシド薬学マニュアルの中に見出され得る。血液サンプルは、注入前に、および注入後
４時間で生体マーカーモニタリングのために集められ得る。生体マーカーモニタリングは
、まとめられて評価され得る。このＡＥモニタリングを、注入後最低４時間継続する。予
測外のＡＥが起こらなければ、最大予測入院日数は一晩である。
オンターゲット−オフ腫瘍
Ｃｅｌｌ Ａ ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ Ｔ細胞が非腫瘍標的と反応する状況では、患者は
、支持医療、および研究者によって決定されるように、リミズシドの投与を受けるべきで
ある。
他の治験薬
他の治験薬または治験生物製剤は、患者の疾患状態が悪化していないかまたは非応答性
なければ、Ｃｅｌｌ Ａ後３ヶ月間投与されなくてもよい。被験体は、ＨＳＣＴへと進み
得る（may proceed to HSCT）。
臨床評価
臨床アセスメント
・被験体の臨床アセスメントが行われ得る。
・腎臓の状態は、連続クレアチニン検査の評価、および臨床的に示される場合にはさら
なるアセスメントによって評定され得る。
・ＡＭＬ（Ｃｈｅｓｏｎ， ２００３）およびＭＤＳ（Ｃｈｅｓｏｎ， ２００６）に
おける改正国際作業グループ（ＩＷＧ）応答基準に基づく処置に対する応答を決定するた
めの連続血液サンプリングおよび骨髄サンプリング。
・骨髄生検を、以下の時点で完了し得る：
・−登録前の７日間以内
・−Ｔ細胞注入前の７日間以内
・−Ｔ細胞注入後４日目
・−Ｔ細胞注入後２８日（±１日）
・−臨床的に示される場合
・微小残存病変に関する検査を、４日目に２つの方法を使用して開始して、各骨
髄吸引物を用いて行い得る。なぜなら患者は、１つの方法論のみによって検出可能である
ＭＲＤを有し得るからである。
○以前に同定された分子異常についての分子検査（Ｋｌｃｏ， ２０１５）
○８色フローサイトメトリーを使用するフローサイトメトリー（Ｇｒｉｍｗａｄｅ，
２０１４）
Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞機能アッセイ
利用可能なものとしての末梢血、腫瘍組織および任意の他の細胞標本中の遺伝子改変さ
れたＴ細胞の残留性は、表２中のスケジュールに従ってｑＰＣＲおよび／またはフローサ
イトメトリーアッセイによって行われ得る。さらに、Ｃｅｌｌ Ａ注入の前後に、ＰＢＭ
Ｃサンプルは、ＰＲＡＭＥ特異的細胞傷害性活性によって分析され得る。
一般的統計アプローチ
記述統計を利用して、個体群統計特徴およびベースライン特徴をまとめ得る。定量的パ
ラメーターに関する全ての要約表は、関連する場合、平均、標準偏差、メジアン、範囲（
最小および最大）、ならびに欠陥データの数を示す。定性的パラメーターに関する全ての
要約表は、関連する場合、数、パーセンテージ、および欠陥データの数を示す。
用量漸増アルゴリズム
ＭＴＤステージにおいて、そのデザインは、５つのコホート（表１）からなる。１コホ
ートあたり３〜６名の被験体からなるコホートは、３＋３用量漸増／漸減スキーマに従っ
て、Ｃｅｌｌ Ａ Ｔ細胞で処置され得る。被験体は、０日目にＣｅｌｌ Ａの１用量を
受ける。
登録は、コホート３から開始する。被験体は、Ｃｅｌｌ Ａの注入後に用量制限毒性（
ＤＬＴ）に関して評価され得る。観察されるＤＬＴは、さらなる被験体が、以下に概説さ
れる規則を使用して、同じ用量レベル、より高い用量レベルまたはより低い用量レベルに
登録されるべきかを決定するために使用され得る：
・１／３が出発用量（コホート３）においてＤＬＴを経験する場合；別の３名の被験体
は、コホート３に登録され得る。最初の３名の患者は、各患者の後に３週間追跡調査して
順次登録し、その後、任意のさらなる患者を登録する。全てのその後のコホートは、同時
に登録され得る。
・０／３または１／６の被験体がコホート３（出発用量）においてＤＬＴを経験する場
合、次に続く被験体は、コホート４に登録され得る。≧２／６の被験体がコホート３にお
いてＤＬＴを経験する場合；次に続く被験体は、コホート２に登録される。
・０／３または１／６の被験体がコホート４においてＤＬＴを経験する場合、次に続く
被験体は、コホート５に登録される。≧２／６の被験体がコホート４においてＤＬＴを経
験する場合、次にコホート３は、ＭＴＤと示され得、そしてわずか３名の被験体がコホー
ト３に登録されている場合、次にＭＴＤを確認するためにさらに３名の被験体が登録され
得る。
・０／３または１／６の被験体がコホート５においてＤＬＴを経験する場合、次にコホ
ート５は、ＭＴＤと示され得、わずか３名の被験体がコホート５に登録されている場合、
ＭＴＤを確認するためにさらに３名の被験体が登録され得る。≧２／６の被験体がコホー
ト５においてＤＬＴを経験する場合、次にコホート４は、ＭＴＤと示され得、わずか３名
の被験体がコホート４に登録されている場合、次にＭＴＤを確認するためにさらに３名の
被験体が登録され得る。
・０／３または１／６の被験体がコホート２においてＤＬＴを経験する場合、次にコホ
ート２はＭＴＤと示され得る；わずか３名の被験体がコホート２に登録されている場合、
次にＭＴＤを確認するためにさらに３名の被験体が登録され得る。≧２／６の被験体がコ
ホート２においてＤＬＴを経験する場合；続く被験体は、コホート１に登録され得る。
・０／３または１／６の被験体がコホート１においてＤＬＴを経験する場合、次にコホ
ート１はＭＴＤと示され得る。≧２／６の被験体がコホート１においてＤＬＴを経験する
場合；次にその研究は中断され得、そのデータは、臨床研究チームによって評価され得る
。
ＤＬＴは、以下のとおり定義される：
Ｃｅｌｌ Ａ： ＤＬＴは、治療の最初の２８日間で起こる新たな有害事象に基づき得、
有害事象が薬物関連でなければならない（すなわち、明らかに関連あり、関連がある可能
性が高い、またはおそらく関連あり）：
・≧グレード３ ＣＲＳ関連毒性または他のグレード３器官毒性
参考文献
Figure 2021090466
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Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
ＡＭＬにおける完全寛解は、国際作業グループによって確立された以下の基準を使用し
て定義されている（Ｄｏｈｎｅｒら， ２０１０； Ｃｈｅｓｏｎら， ２００１； ｄ
ｅ Ｇｒｅｅｆら， ２００５）：
・絶対好中球数の正常値（＞１０００／μＬ）および血小板数の正常値（＞１００，０
００／μＬ）、ならびに赤血球輸血からの独立性。
・芽細胞のクラスターまたはコレクションがないことを明らかにする骨髄生検。髄外白
血病（例えば、中枢神経系または軟組織の関与）は、非存在でなければならない。
・骨髄吸引は、全ての細胞構成要素（すなわち、赤血球、顆粒球、および巨核球のシリ
ーズ）の正常な成熟を明らかにする。骨髄細胞性に関する要件はない。
・５％未満の芽細胞が骨髄に存在し、白血病表現型（例えば、アウエル小体）は全く有
し得ない。異形成の残留は、残存ＡＭＬのインジケーターとして気にかかるが、寛解状態
の基準としては検証されていない。
・以前検出されたクローン性細胞遺伝学的異常の非存在（すなわち、完全な細胞遺伝学
的寛解、ＣＲｃ）は、ＣＲの形態診断を確認するが、現在では、必要とされる基準ではな
い。しかし、第１のＣＲの時点での異常な核型から正常な核型への変換は、重要な予後指
標であり、これは、ＡＭＬにおけるＣＲの基準としてＣＲｃの使用を裏付ける（Ｃｈｅｓ
ｏｎ， ２００３； Ｍａｒｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ， ２００４； Ｃｈｅｎ ｅｔ
ａｌ， ２０１１）。
・不完全血小板回収を伴うＣＲ（ＣＲｐ）：残存血小板減少症（血小板数＜１００×
１０９／Ｌ［１００，０００／μＬ］）を除く全てのＣＲ基準
・不完全な回収を伴うＣＲ（ＣＲｉ）：残存好中球減少症（絶対好中球数＜１．０×１
０９／Ｌ［１０００／μＬ］）を除く全てのＣＲ基準
より低い基底活性およびリガンドＩＣ５０の最小喪失を伴う改変カスパーゼ−９ポリペ
プチド
基底シグナル伝達（アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達）は、多く
の生体分子に一般的である。例えば、それは、複数のサブファミリーに由来する６０を超
える野生型Ｇプロテイン共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫ
およびａｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察さ
れている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、Ｂ細胞発生および分化［４〜
６］、Ｔ細胞分化［２、７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物耐性
［９］、自己免疫［１０］から、植物成長および発生［１１］まで、非常に種々の生物学
的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわ
けでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な結果をもたらし得る。
欠陥のある基底Ｇｓプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族
性ＡＣＴＨ不応（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＣＴＨ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、および家族性
低カルシウム尿性高カルシウム血症［１２、１３］）などの疾患をもたらした。
たとえ野生型イニシエーターカスパーゼ−９のホモ二量体化がエネルギー的に不利であ
り、野生型イニシエーターカスパーゼ−９を溶液中で大部分をモノマーにしても［１４〜
１６］、プロセシングされていないカスパーゼ−９の低レベルの固有の基底活性［１５，
１７］は、Ａｐａｆ−１ベースの「アポプトソーム」（その天然のアロステリック調節因
子［６］）の存在下で増強される。さらに、超生理学的発現レベルおよび／または共局在
は、近位にあることで駆動される二量体化（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｄｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらし得、さらには、基底活性化を増強し得る。本出願の改変
された細胞は、より低い基底シグナル伝達活性を有するキメラカスパーゼ−９ポリペプチ
ドをコードする核酸を含み得る。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ−９変異
体の例は、以下の表中に提供される。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ−９
変異体を含むポリヌクレオチドは、本明細書中での細胞療法に使用される改変された細胞
において発現され得る。これらの例では、その改変された細胞は、より低い基底シグナル
伝達キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む安全スイッ
チを含み得る。本明細書中のキメラ刺激分子またはキメラ抗原レセプターを含む改変され
た細胞の投与後の有害事象の事象では、カスパーゼ−９活性は、患者に二量体化剤を投与
し、従って、改変された細胞のうちのいくらかまたは全てのアポトーシスおよびクリアラ
ンスを誘導することによって誘導され得る。いくつかの例では、投与される二量体化剤の
量は、改変された細胞のうちの最高量、少なくとも８０％または９０％を除去するように
デザインされた量として決定され得る。他の例では、投与される二量体化剤の量は、負の
症候または状態を緩和するその一方で患者において治療用の改変された細胞の十分な量を
残しておくために、治療を継続するために、改変された細胞の一部のみを除去するように
デザインされた量として決定され得る。キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを使用してア
ポトーシスを誘導するための方法は、Ｍａｌｃｏｌｍ Ｋ． ＢｒｅｎｎｅｒらによるＰ
ＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７３８１（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉ
ｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日出願
）およびＭａｌｃｏｌｍ Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒらによる米国特許出願第１３／１１２，
７３９号（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａ
ｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日出願、米国特許第９，０８９，５２０号として
２０１５年７月２８日発行）において論じられる。改変された基底活性を有するキメラカ
スパーゼポリペプチドは、Ｄａｖｉｄ ＳｐｅｎｃｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／
ＵＳ２０１４／０２２００４（標題、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０１４年３月７日出願、ＷＯ２
０１４／１６４３４８として２０１４年１０月９日公開）、およびＤａｖｉｄ Ｓｐｅｎ
ｃｅｒらによる米国特許出願第１３／７９２，１３５号（標題、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａ
ｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ、２０１４
年３月７日出願）；およびＳｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願第１４／６４０，５５３
号（２０１５年３月６日出願）において論じられる。治療用の改変された細胞の部分的ア
ポトーシスを誘導するための方法は、Ｋｅｖｉｎ ＳｌａｗｉｎらによるＰＣＴ出願番号
ＰＣＴ／ＵＳ１４／０４０９６４（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ
Ｐａｒｔｉａｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ、２０１４年６月４日出願、ＷＯ２０１４／１９７６３８として２０１４年１２
月１１日公開）、およびＫｅｖｉｎ Ｓｌａｗｉｎらによる米国特許出願第１４／２９６
，４０４号（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｐａｒｔｉａｌ Ａｐ
ｏｐｔｏｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、２０１４年
６月４日出願）において論じられる。これらの特許出願および刊行物は、それらの全体に
おいて本明細書に全て参考として援用される。
Figure 2021090466
Figure 2021090466
レトロウイルスベクター構築物の生成
本出願において論じられるＰＲＡＭＥ由来ペプチドＳＬＬＱＬＩＧＬ（ＰＲＡＭＥ）に
特異的なヒトＴＣＲを、ＳＬＬＱＬＩＧＬポリペプチドを認識するＴ細胞クローンの単離
および同定後に、Ｔ２Ａ配列によって連結された、コドン最適化しかつシステイン改変し
たＴＣＲ−ＡＶ１Ｓ１およびＴＣＲ−ＢＶ１Ｓ１を使用してデザインした（Ｈｅｅｍｓｋ
ｅｒｋ ２００１； Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ， ２００４； ｖａｎ Ｌｏｅｎｅｎ， ２
０１１）。ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を、コドン最適化お
よびシステイン改変して、混合ＴＣＲ二量体形成を防止し、かつＴＣＲ発現を最適化した
。
レトロウイルス構築物ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＳＬＬ−ＴＣＲ（ＳＦＧ．ｉＣａ
ｓｐ９．２Ａ．ＰＲＡＭＥともいわれる）は、ＰＲＡＭＥ由来ペプチドＳＬＬＱＬＩＧＬ
（ＰＲＡＭＥ ４２５〜４３３）に特異的なヒトＴＣＲのα鎖およびβ鎖に連結された、
合成リガンド−誘導性ヒトカスパーゼ−９ｃＤＮＡ（ｉＣａｓｐ９）をコードする。
活性に重要な機能的構成要素は、以下である：
・ベクターの５’末端にある５’ ＬＴＲ−レトロウイルス長末端反復（プロモーター
配列として機能する）
・ψ− レトロウイルスキャプシド化シグナル（プサイ；ビリオン粒子の中にＲＮＡを
パッケージングするために必要）
・ＳＡ− スプライスアクセプター部位
・ｉＣａｓｐ９− 誘導性カスパーゼ−９発現カセット。ｉＣａｓｐ９は、６アミノ酸
Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して改変されたＣＡＲＤドメイン欠失ヒトカスパーゼ−９に
接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）から
なる
・ＦＫＢＰ１２− Ｆ３６Ｖ−ＡＰ１９０３に対する結合親和性を最適化するためにＦ
３６Ｖ変異を含む操作されたＦＫ５０６結合タンパク質。このＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖタ
ンパク質ドメインは、連結された治療用タンパク質の薬物結合／オリゴマー化ドメインと
して働く。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖは、カスパーゼ−９の調節因子として機能する：ＡＰ
１９０３の非存在下では、ｉＣａｓｐ９は、最小の活性を有する；ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６
ＶへのＡＰ１９０３結合は、二量体化を促進し、２個のカスパーゼ−９分子を並置した状
態にして、アポトーシスを開始する。従って、このＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖ部分は、Ａｐ
ａｆ−１関連オリゴマー化を媒介するカスパーゼ−９の内因性二量体化／活性化モジュー
ル（カスパーゼ活性化および補充ドメイン；ＣＡＲＤ）を機能的に置き換える。
・リンカー− スイッチ−調節因子配列をカスパーゼ−９に融合するために使用される
合成のＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙペプチドリンカー
・カスパーゼ−９− ヒトカスパーゼ−９ ｃＤＮＡ配列（重要なアポトーシス促進性
調節因子）および構築物の治療構成要素（調節された自殺遺伝子）。内因性二量体化／活
性化モジュール（カスパーゼ活性化および補充ドメイン；ＣＡＲＤ）を欠失させて、自発
的Ａｐａｆ１結合および従ってバックグラウンド殺滅を減少させた。
・２Ａ− Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルスに由来し、カスパーゼ−９タンパ
ク質とＴＣＲタンパク質との間で切断可能なリンカーとして機能する合成の２０アミノ酸
ペプチドをコードする。
・ＴＣＲ− ＰＲＡＭＥ由来ＳＬＬＱＬＩＧＬペプチドに特異的なヒトＴＣＲ。それは
、αおよびβ鎖からなる。
・ＴＣＲβ− Ｖβ１ファミリーに属する、ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲのβ鎖の配列。それは
、Ｓ５７Ｃ改変がＴＣＲ鎖対合を増大させるために挿入された、可変領域および定常領域
からなる。
・２Ａ− Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルスに由来し、カスパーゼ−９タンパ
ク質とＴＣＲタンパク質との間で切断可能なリンカーとして機能する合成の２０アミノ酸
ペプチドをコードする。その天然の配列は、第１の２Ａ配列との組換え事象を減少させる
ためにコドン最適化されている。
・ＴＣＲα− Ｖα８ファミリーに属するＰＲＡＭＥ−ＴＣＲのβ鎖の配列。それは、
Ｔ４８Ｃ改変がＴＣＲ鎖対合を増大させるために挿入された、可変領域および定常領域か
らなる。
・３’ ＬＴＲ− ベクターの３’末端にあるレトロウイルス長末端反復（ターミネー
ター／ポリアデニル化配列として機能する）。
ベクター模式図
生成物製造において使用されるレトロウイルスシャトルベクター（ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ
９．２Ａ．ＳＬＬ−ＴＣＲ）のプラスミドマップは、図２５に示される。特有の制限部位
および導入遺伝子特徴が図示される。
上記構築物の機能的エレメントは、以下の表４において定義される。
Figure 2021090466
参照電子ベクター配列（reference electronic vector sequence）を、ベクター構
築物の各構成要素についてＤＮＡ配列ファイルを組み合わせることによってアセンブリし
た。レトロウイルスゲノムはＲＮＡベースであるので、配列分析は、２９３ＶＥＣ細胞株
へのトランスフェクション（レトロウイルス生成物調製における最初の工程）に使用され
るプラスミドＤＮＡに対して行った。Ｏｓｐｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍ
ｂｉｎｏ Ｇｅｓｕ（ＯＰＢＧ）（Ｒｏｍｅ， Ｉｔａｌｙ）においてベクター全体に対
して２方向性配列決定を行った。配列決定実行を、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを使用
してアセンブリした。理論的参照電子配列と比較してミスマッチの塩基は、同定されなか
った。ＴＣＲβ Ｓ５７ＣおよびＴＣＲα−Ｔ４８Ｃを導入して、α−ＴＣＲ鎖とβ−Ｔ
ＣＲ鎖との間の対合を増大させた。従って、これらの差異は、変異ではなく、親構築物の
中へ実際に操作された。
参照配列からのヌクレオチドのずれは、カスパーゼ−９コードドメイン内で起こった（
ｎｔ ２４９３）。これは、アルギニンの代わりにグルタミンを使用する。これは、ヒト
カスパーゼ−９において天然に存在する一般的な多型を表し、ｉカスパーゼ−９のテンプ
レートとして作用する最初のカスパーゼ−９ ｃＤＮＡに存在した。従って、これもまた
、変異ではなかった。
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ ＳＬＬ−ＴＣＲレトロウイルスベクターは、親のＳＦＧ
．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＡＲに由来した。ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＡＲは、Ｍ
ＣＳＶ骨格からＳＦＧレトロウイルス骨格へと発現挿入物（Ｆ−Ｃａｓｐ９といわれ、ｉ
Ｃａｓｐ９と再命名）をクローニングすることによる、ＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベー
スの構築物に由来した。このｉＣａｓｐ９部分を、ＭＣＳＶ骨格からＳＦＧ骨格へと移し
て、（ｉ）ＭＣＳＶ構築物中の共発現されるＩＲＥＳ−ＧＦＰを排除した、および（ｉｉ
）ＳＦＧ骨格を利用した。さらに、ＳＦＧレトロウイルス構築物は、９年間までの安定性
を示した。ＳＦＧ骨格において、ｉＣａｓｐ９カセットを、２Ａ様の切断可能なリンカー
を介してＴＣＲ配列に接続した。この２Ａ様の配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫
ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残
基との間での＞９９％の切断を媒介して、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１９個の追加の
アミノ酸およびＴＣＲβ鎖のＮ末端において１つの追加のプロリン残基をもたらす。この
ＴＣＲエレメントは、第２のコトン最適化されたＴ２Ａによって連結される、全長ヒトＴ
ＣＲβ（可変領域および定常領域）および全長ヒトＴＣＲα（可変領域および定常領域）
からなる。
関連しないＣＡＲ配列を含むベクターカセットを、ＰＳＩ−１（ｉＣａｓｐ９の配列に
存在）およびＭＬＵ−１（関連しないＣＡＲ配列の終止コドン（codon stop）の後に存
在）での酵素消化を通じて除去した。構築物はＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａ
ｎｙによって合成され（このｉＣａｓｐ９配列は、ＰＳＩ−１部位の後ろの、２Ａペプチ
ド、ＴＣＲβ、第２の２ＡペプチドおよびＴＣＲαとともにインフレームで存在する）、
発現ベクターＰＵＣ中でＯＰＢＧセンターに輸送された。ＰＵＣベクター中に存在する関
連遺伝子カセットは、ＰＳＩ−１およびＭＬＵ−１での酵素消化後に得られ、ベクター骨
格（上記で記載されるように調製）におけるライゲーションのために使用した。
このＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＳＬＬ−ＴＣＲレトロウイルスベクターを、Ｏｓｐ
ｅｄａｌｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｏ Ｂａｍｂｉｎｏ Ｇｅｓu， Ｃｅｌｌ ａｎｄ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙにおいて製造した。レトロウイルスを生成するためのパッケージング細胞株を、専
用のＬａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ ＨｏｏｄｓおよびＣＯ２インキュベーターを使用して、
研究環境において生成した。このＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＳＬＬ−ＴＣＲレトロウ
イルスベクターを、ｃＧＭＰで保存された（ｃＧＭＰ−ｂａｎｋｅｄ）２９３ＶＥＣ Ｒ
Ｄ１１４プロデューサークローンから生成する。
ＢｉｏＶｅｃ ２９３Ｖｅｃ−ＲＤ１１４パッケージング細胞株は、ヒト胚性腎臓ＨＥ
Ｋ２９３ベースのパッケージング細胞株である。この２９３Ｖｅｃ−ＲＤ１１４細胞株を
、モロニーマウス白血病（ＭＬＶ）ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ１１４エンベロープ（ｅｎ
ｖ）ウイルスタンパク質を安定して発現するように、ゼオシンおよびピューロマイシン耐
性遺伝子を使用して開発した。２９３Ｖｅｃ−ＲＤ１１４細胞によって生成されるベクタ
ーは、広い範囲の哺乳動物細胞に感染し得る。
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＳＬＬ−ＴＣＲレトロウイルスベクターの生成の第１段
階のために、２９３ＶＥＣ ＧＡＬＶプロデューサー細胞株を使用して、一過性レトロウ
イルス上清を生成した。その後、それを使用して、２９３ＶＥＣ ＲＤ１１４プロデュー
サー細胞株を安定して形質導入した。ＯＰＢＧのＣｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙは、２９３Ｖ
ＥＣ ＧＡＬＶおよび２９３ＶＥＣ ＲＤ１１４のバイアルを受け取り、これをその後、
製薬グレードのウシ胎仔血清を使用して、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を生成するた
めに研究実験室の中で拡大および使用した。
ＷＣＢ ２９３ＶＥＣ ＧＡＬＶ細胞株のバイアルを、全て専用の材料および機器を使
用して、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに
おいて拡大した。この２９３ＶＥＣ ＧＡＬＶを、リポフェクタミン２０００試薬および
５μｇのＢＰＺ−７０１レトロウイルスベクターを使用して一過性にトランスフェクトし
た。
トランスフェクションに由来する上清のうちの２ｍｌを、ポリブレンの存在下で２９３
ＶＥＣ ＲＤ１１４細胞に適用した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生じた２
９３ＶＥＣ ＲＤ１１４クローン（上清中でのベクターの存在に関してはＰＣＲ分析を使
用する）を拡大し、ＯＰＢＧのｃＧＭＰ施設において保存し、無菌性およびマイコプラズ
マに関して試験した後、ｃＧＭＰ条件下でレトロウイルス生成のために使用した。
プロデューサー株を、１０％の製薬グレードのγ線照射したウシ胎仔血清を有する、Ｄ
ＭＥＭ−ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で成
長させる。２９３ＶＥＣプロデューサー細胞株に由来する上清を、０．２０μｍフィルタ
ーを通して濾過して、夾雑する２９３ＶＥＣ細胞を除去する。
初代Ｔ細胞を、無血清のゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）限定培地（Ｃｅｌｌｇｅｎ
ｉｘ）中で培養する。患者由来ＰＢＭＣを培養し、活性化する。組換えインターロイキン
２（ＩＬ−２； Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を添加し、Ｔ細胞を選択的に拡大する。ヒトフィ
ブロネクチンフラグメントのキメラペプチドであるＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒ
ａ Ｂｉｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ， Ｊａｐａｎ）を使用して、Ｔ細胞のレトロウ
イルス形質導入を促進する。形質導入された細胞を、ＩＬ−２を補充した培地中で再び培
養し、速度制御フリーザー（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒａｔｅ ｆｒｅｅｚｅｒ）を使用
して、限定凍結培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０， Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎｓ）中で凍結保存する。
自家Ｔ細胞は、Ｃｅｌｌ Ａ遺伝子改変の標的である。末梢血単核細胞を、Ｔ細胞特異
的条件下での拡大後に形質導入する。上記細胞は、適切なＴＣＲ機能のためにＣＤ３シグ
ナルを提供しなければならないので、そのＴ細胞のみが、最終生成物において機能的であ
る。
ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ−ｉＣａｓｐ９ベクターヌクレオチド配列
以下の配列、配列番号８５は、ＬＴＲ、リンカー、Ｔ２Ａ、および他の非ｉＣａｓｐ９
またはＰＲＡＭＥ ＴＣＲコード配列を含む。この配列に対するバリアントおよび改変は
、ベクターの機能を変化させることなく使用され得ることは、理解される。ある種のコー
ド配列は、順番に、以下である： ５’ＬＴＲ； ＦＫＢＰ１２ｖ； ＧＳリンカー；
ｄカスパーゼ９； Ｔ２Ａ； ＴＣＲβ； ２Ａ； ＴＣＲα； ３’ＬＴＲ。
配列番号８５： ＳＦＧ．ｉＣ９−２Ａ−ＳＬＬ．ＴＣＲ ｉＣａｓｐ９−ＰＲＡＭＥ
ＴＣＲコード配列
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
配列番号８６： 上記配列番号８５においてカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列
Figure 2021090466
配列番号８７： 上記の配列番号８５においてＴＣＲβをコードするヌクレオチド配列
Figure 2021090466
Figure 2021090466
配列番号８８： 上記の配列番号８５においてＴＣＲαをコードするヌクレオチド配列
Figure 2021090466
（引用されるかまたは本実施例に対するさらなる裏付けを提供する参考文献）
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
代表的実施形態
これ以降提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
Ａ１．
ａ．ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１
のポリヌクレオチド；および
ｂ．ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２
のポリヌクレオチド、
を含む、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）を認識するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３
領域をコードする核酸分子であって、ここで：
該ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一緒に、ＰＲＡ
ＭＥを認識する、核酸分子。
Ａ２．
ａ．前記第１のポリヌクレオチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１
のポリペプチドをコードする；および
ｂ．前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２の
ポリペプチドをコードする、
実施形態Ａ１に記載の核酸分子。
Ａ３．前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、
前記第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、実施形
態Ａ１またはＡ２のいずれかに記載の核酸分子。
Ａ４．前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか
１項に記載の核酸分子。
Ａ５．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含む
ＰＲＡＭＥポリペプチドを認識する、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか１項に記載の核酸分
子。
Ａ６．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含む
ＰＲＡＭＥポリペプチドを認識する、実施形態Ａ１〜Ａ４，のいずれか１項に記載の核酸
分子。
Ａ７．前記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、実施
形態Ａ３〜Ａ６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ８．前記第１のおよび第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常領域に由来
する、実施形態Ａ３〜Ａ７のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ９．前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ
８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ１０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド
配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ９に記載の核酸分子。
Ａ１１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜
Ａ１０のいずれか１項に記の載核酸分子。
Ａ１２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド
配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ１１に記載の核酸分子。
Ａ１３．前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１〜
Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ１４．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド
配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ１３に記載の核酸分子。
Ａ１５．前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８またはＡ１３〜Ａ１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ１６．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ１５に記載の核酸分子。
Ａ１７．前記第１のポリペプチドは、配列番号13もしくは配列番号１4のアミノ酸配列を
含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ１８．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号
１７のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ１７に記載の核酸分子。
Ａ１９．前記第２のポリペプチドは、配列番号１８もしくは配列番号１９のアミノ酸配列
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ１７〜Ａ１８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ２０．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番
号２２のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ１９に記載の核酸分子。
Ａ２１．前記第１のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ２２．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２１に記載の核酸分子。
Ａ２３．前記第２のポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８またはＡ２１〜Ａ２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ２４．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列番号２８のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２３に記載の核酸分子。
Ａ２５．前記第１のポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ２６．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０もしくは配列番号３１のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２５に記載の核酸分子。
Ａ２７．前記第２のポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８またはＡ２５〜Ａ２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ２８．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３３もしくは配列番号３４のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ２７に記載の核酸分子。
Ａ２９．前記第１のポリペプチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のアミノ酸配列
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ３０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番
号３９のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ２９に記載の核酸分子。
Ａ３１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４０もしくは配列番号４１のアミノ酸配列
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ２９〜Ａ３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ３２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４３、もしくは配列番
号４４のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ３１に記載の核酸分子。
Ａ３３．前記第１のポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ３４．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列番号４７のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ３３に記載の核酸分子。
Ａ３５．前記第２のポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８またはＡ３３〜Ａ３４のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ３６．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列番号５０のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ３５に記載の核酸分子。
Ａ３７．前記第１のポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ３８．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５２もしくは配列番号５３のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ３７に記載の核酸分子。
Ａ３９．前記第２のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ１
〜Ａ８またはＡ３７〜Ａ３８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ４０．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５５もしくは配列番号５６のヌクレオ
チド配列、またはその誘導体を含む、実施形態Ａ３９に記載の核酸分子。
Ａ４１．前記第１のポリペプチドは、配列番号５７もしくは配列番号５８のアミノ酸配列
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ４２．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５９、配列番号６０もしくは配列番号
６１のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ４１に記載の核酸分子。
Ａ４３．前記第２のポリペプチドは、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ４１〜Ａ４２のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ａ４４．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６４、配列番号６５、もしくは配列番
号６６のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ４３に記載の核酸分子。
Ｂ１．多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ４４
のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｂ２．前記ＴＣＲαもしくはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパ
ーゼ−９ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中
または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態Ｂ１に記載の核
酸分子。
Ｂ３．前記多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれ
か１項に記載の核酸分子。
Ｂ４．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからな
る群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｂ３に記載の方法。
Ｂ５．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｂ４に記載の
方法。
Ｂ６．前記多量体化領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２のいずれか１項
に記載の方法。
Ｂ７．前記多量体化領域は、配列番号７７もしくは配列番号７９のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２のいずれか１
項に記載の方法。
Ｂ８．前記多量体化領域は、配列番号７６もしくは配列番号７８のヌクレオチド配列、ま
たはその機能的フラグメントによってコードされる、実施形態Ｂ７に記載の方法。
Ｂ９．前記多量体化領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさら
に含む、実施形態Ｂ７に記載の方法。
Ｂ１０．前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｂ２〜Ｂ９の
いずれか１項に記載の核酸分子。
Ｂ１１．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｂ
１〜Ｂ１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｂ１２．組成物であって、該組成物は、
ａ）実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれか１項に記載の核酸分子；および
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子
を含む組成物。
Ｃ１．実施形態Ａ１〜Ｂ１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
Ｃ２．実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれか１項に記載の核酸分子または実施形態Ｃ１に記載
のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
Ｃ２．１．前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含
むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさ
らに含む、実施形態Ｃ２に記載の細胞。
Ｃ２．２．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ領域である、実施形態Ｃ２．１に記
載の細胞。
Ｃ２．３．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｃ２
．１またはＣ２．２のいずれか１項に記載の細胞。
Ｃ２．４．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態
Ｃ２．１〜Ｃ２．３のいずれか１項に記載の細胞。
Ｃ３．実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１項に記載の核酸分子または実施形態Ｂ７に記載の
組成物でトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
Ｃ４〜Ｃ１０．保留。
Ｃ１１．前記細胞は、自家Ｔ細胞である、実施形態Ｃ２〜Ｃ３のいずれか１項に記載の細
胞。
Ｃ１２．前記細胞は、同種異系Ｔ細胞である、実施形態Ｃ２〜Ｃ３のいずれか１項に記載
の細胞。
Ｃ１３．実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるか
、または配列番号１、配列番号４、配列番号２１、もしくは配列番号２３のアミノ酸配列
を含む、Ｔ細胞レセプター。
Ｃ１４．実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるか
、または配列番号４５もしくは配列番号４８のアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞レセプター。
Ｃ１５．実施形態Ｃ２〜Ｃ３のいずれか１項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャ
リアを含む、薬学的組成物。
Ｃ１６．実施形態Ｃ２〜Ｃ３のいずれか１項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャ
リアを含む、薬学的組成物。
Ｃ１７．実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれか１項に記載の核酸分子または実施形態Ｃ１に記
載のベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
Ｃ１８．過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被
験体に、実施形態Ｃ１５に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する
方法。
Ｃ１９．過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被
験体に、実施形態Ｃ１６に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する
方法。
Ｃ２０．過剰増殖性疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方
法は、該被験体に、実施形態Ｃ１７に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程
を包含する方法。
Ｃ２１．前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、実施形態Ｃ１８〜Ｃ２０のいず
れか１項に記載の方法。
Ｃ２２．前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少してい
る、実施形態Ｃ２１に記載の方法。
Ｃ２３．前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、または乳
がんからなる群より選択される疾患と診断されている、実施形態Ｃ１８〜Ｃ２０のいずれ
か１項に記載の方法。
Ｃ２４．前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを前記被験体に投与する工程をさら
に包含する、実施形態Ｃ１８〜Ｃ２３のいずれか１項に記載の方法。
Ｃ２５．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激する
ための方法であって、該方法は、実施形態Ｃ１５〜Ｃ１６のいずれか１項に記載の薬学的
組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで前記細胞は、該標的細胞上の抗原に結
合するＴ細胞レセプターまたはその機能的フラグメントを含む、方法。
Ｃ２６．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激する
ための方法であって、該方法は、実施形態Ｃ１７に記載の薬学的組成物を該被験体に投与
する工程を包含し、ここで前記核酸またはベクターは、該標的細胞上の抗原に結合するＴ
細胞レセプターまたはその機能的フラグメントをコードする方法。
Ｃ２７．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｃ２５またはＣ２６のいずれか１項
に記載の方法。
Ｃ２８．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減
少している、実施形態Ｃ２５〜Ｃ２７のいずれか１項に記載の方法。
Ｃ２９．前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標
的細胞の数または濃度を測定する工程、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる
第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中
の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の
増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態Ｃ２５〜Ｃ２８のいずれか１項に記
載の方法。
Ｃ３０．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の
濃度と比較して減少している、実施形態Ｃ２９に記載の方法。
Ｃ３１．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の
濃度と比較して増大している、実施形態Ｃ２９に記載の方法。
Ｃ３２．前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態Ｃ２５
〜Ｃ３１のいずれか１項に記載の方法。
Ｃ３３．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、実
施形態Ｃ１５〜Ｃ１７のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包
含する方法。
Ｃ３４．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するた
めの方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態Ｃ１５〜Ｃ１７のいずれか１項に記
載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する方法。
Ｃ３５．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｃ３４に記載の方法。
Ｃ３６．外因性Ｔ細胞レセプターをコードする単離されたＴ細胞であって、ここで該Ｔ細
胞レセプターは、ＰＲＡＭＥを認識する、単離されたＴ細胞。
Ｃ３７．前記Ｔ細胞レセプターは、配列番号１、配列番号４、配列番号２１、もしくは配
列番号２３のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、実施
形態Ｃ２５に記載の単離されたＴ細胞。
Ｃ３８．前記Ｔ細胞レセプターは、配列番号４５もしくは配列番号４８のアミノ酸配列、
またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、実施形態Ｃ２５に記載の単離され
たＴ細胞。
Ｃ３９．前記Ｔ細胞レセプターは、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むＰＲＡＭＥポ
リペプチドを認識する、実施形態Ｃ２５〜Ｃ２７のいずれか１項に記載の単離されたＴ細
胞。
Ｃ４０．前記Ｔ細胞レセプターは、アミノ酸配列ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含むＰＲＡＭＥポ
リペプチドを認識する、実施形態Ｃ２５〜Ｃ２７のいずれか１項に記載の単離されたＴ細
胞。
Ｄ１．ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで：
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に特異
的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードする；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む；および
該ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域および該ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域
は、一緒にＰＲＡＭＥに特異的に結合する、
核酸分子。
Ｄ２．
前記第１のポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペ
プチドをコードする；および
前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリ
ペプチドをコードする、
実施形態Ｄ１に記載の核酸分子。
Ｄ３．前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、
前記第２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、実施形
態Ｄ１に記載の核酸分子。
Ｄ４．前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれか
１項に記載の核酸分子。
Ｄ５．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含む
ＰＲＡＭＥポリペプチドに特異的に結合する、実施形態Ｄ１〜Ｄ４のいずれか１項に記載
の核酸分子。
Ｄ６．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含む
ＰＲＡＭＥポリペプチドに特異的に結合する、実施形態Ｄ１〜Ｄ４のいずれか１項に記載
の核酸分子。
Ｄ７．前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常
領域である、実施形態Ｄ３〜Ｄ６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ８．前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣ
Ｒ定常領域に由来する、実施形態Ｄ３〜Ｄ７のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ９．前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ１０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド
配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ９に記載の核酸分子。
Ｄ１１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４の配
列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む
、実施形態Ｄ１〜Ｄ１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ１２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド
配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１１に記載の核酸分子。
Ｄ１３．前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７の配
列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む
、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ１４．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド
配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１３に記載の核酸分子。
Ｄ１５．前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ１３〜Ｄ１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ１６．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列
番号１２のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１５に記載の核酸
分子。
Ｄ１７．前記第１のポリペプチドは、配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸配列
、または配列番号１３もしくは配列番号１４の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミ
ノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に
記載の核酸分子。
Ｄ１８．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、配列番号１６，もしくは配列番
号１７のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号
１５、配列番号１６、もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％
超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１７に記載の核酸分子。
Ｄ１９．前記第２のポリペプチドは、配列番号１８もしくは配列番号１９のアミノ酸配列
、または配列番号１８もしくは配列番号１９の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミ
ノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ１７〜Ｄ
１８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ２０．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１，もしくは配列番
号２２のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号
２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％
超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１９に記載の核酸分子。
Ｄ２１．前記第１のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ２２．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列
番号２５のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ２１に記載の核酸
分子。
Ｄ２３．前記第２のポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ２１〜Ｄ２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ２４．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列番号２８のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列
番号２８のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ２３に記載の核酸
分子。
Ｄ２５．前記第１のポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２９
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ２６．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０もしくは配列番号３１のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０もしくは配列
番号３１のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ２５に記載の核酸
分子。
Ｄ２７．前記第２のポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列、または配列番号３２
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ２５〜Ｄ２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ２８．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３３もしくは配列番号３４のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３３もしくは配列
番号３４のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ２７に記載の核酸
分子。
Ｄ２９．前記第１のポリペプチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のアミノ酸配列
、または配列番号３５もしくは配列番号３６の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミ
ノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に
記載の核酸分子。
Ｄ３０．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番
号３９のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号
３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％
超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ２９に記載の核酸分子。
Ｄ３１．前記第２のポリペプチドは、配列番号４０もしくは配列番号４１のアミノ酸配列
、または配列番号４０もしくは配列番号４１の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミ
ノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ２９〜Ｄ
３０のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ３２．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４３、もしくは配列番
号４４のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号
４２、配列番号４３、もしくは配列番号４４のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％
超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ３１に記載の核酸分子。
Ｄ３３．前記第１のポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列、または配列番号４５
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ３４．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列番号４７のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列
番号４７のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ３３に記載の核酸
分子。
Ｄ３５．前記第２のポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ３３〜Ｄ３４のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ３６．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列番号５０のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列
番号５０のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ３５に記載の核酸
分子。
Ｄ３７．前記第１のポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列、あるいは配列番号５
１の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメント
を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ３８．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５２もしくは配列番号５３のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５２もしくは配列
番号５３のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ３７に記載の核酸
分子。
Ｄ３９．前記第２のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４
の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ３７〜Ｄ３８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ４０．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５５もしくは配列番号５６のヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５５もしくは配列
番号５６のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有する
ヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ３９に記載の核酸
分子。
Ｄ４１．前記第１のポリペプチドは、配列番号５７もしくは配列番号５８のアミノ酸配列
、または配列番号５７もしくは配列番号５８の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミ
ノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１項に
記載の核酸分子。
Ｄ４２．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５９、配列番号６０、もしくは配列番
号６１のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号
５９、配列番号６０、もしくは配列番号６１のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％
超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ４１に記載の核酸分子。
Ｄ４３．前記第２のポリペプチドは、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列
、または配列番号６２もしくは配列番号６３の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミ
ノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８またはＤ４１〜Ｄ
４２のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ４４．前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６４、配列番号６５、もしくは配列番
号６６のヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号
６４、配列番号６５、もしくは配列番号６６のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％
超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを
含む、実施形態Ｄ４３に記載の核酸分子。
Ｄ４５．ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで：
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に特異
的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードする；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含み、ここで該第１のポリペプ
チドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、ここで該第２のポリペプ
チドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む；ならびに
該ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域および該ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域
は、一緒にＰＲＡＭＥに特異的に結合する、
核酸分子。
Ｄ４６．前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、前記第
２のポリヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｄ４５に記載
の核酸分子。
Ｄ４７．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、ヒトＰＲＡＭＥに結合する、実施形態
Ｄ１〜Ｄ４６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ４８．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、細胞表面上に発現されるＰＲＡＭＥに
結合する、実施形態Ｄ１〜Ｄ４７のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ４９．前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的に結
合し、ここで該ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子であり、該ペプチドは、ＰＲ
ＡＭＥエピトープである、実施形態Ｄ１〜４８のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ５０．前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ Ａ２．０１分子である。実施形態
Ｄ４９に記載の核酸分子。
Ｄ５１．前記ＰＲＡＭＥエピトープはＳＬＬＱＨＬＩＧＬであるか、または前記ＰＲＡＭ
Ｅエピトープは、ＱＬＬＡＬＬＰＳＬである、実施形態Ｄ４９またはＤ５０のいずれか１
項に記載の核酸分子。
Ｄ５２．前記ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターをさら
に含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ５３．前記第１のポリヌクレオチドに作用的に連結された第１のプロモーターおよび前
記第２のポリヌクレオチドに作用的に連結された第２のプロモーターをさらに含む、実施
形態Ｄ１〜Ｄ５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ５４．多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパ
ーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ５
３のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ５５．前記ＴＣＲαもしくはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカス
パーゼ−９ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳
中または翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態Ｄ５４に記載
の核酸分子。
Ｄ５６．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、実施形態Ｄ
５４またはＤ５５のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ５７．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｄ５５〜Ｄ
５６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ５８．前記ＦＫＢＰ１２領域は、３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ５７に
記載の核酸分子。
Ｄ５９．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンから
なる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ５７に記載の核酸分
子。
Ｄ６０．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択され
る３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ５９に記載の核酸分子。
Ｄ６１．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ５９に記
載の核酸分子。
Ｄ６２．前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｄ５４〜Ｄ５
７のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ６３．前記多量体リガンド結合領域は、配列番号７７のアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ５４〜Ｄ６１のいずれ
か１項に記載の核酸分子。
Ｄ６４．前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｄ５５〜Ｄ６
３のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ６５．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｄ
５５〜Ｄ６４のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ６６．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、
または配列番号７４のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｄ５５〜Ｄ６５
のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ６７．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３中のカスパーゼバリアントにおける置
換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実
施形態Ｄ５４〜Ｄ６６のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｄ６８．
ａ）実施形態Ｄ１〜Ｄ５５のいずれか１項に記載の核酸分子；および
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
Ｄ６９．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、実施形態Ｄ
６８に記載の組成物。
Ｄ７０．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｄ６８〜Ｄ
６９のいずれか１項に記載の組成物。
Ｄ７１．前記ＦＫＢＰ１２領域は、３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ７０に
記載の組成物。
Ｄ７２．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンから
なる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ７０に記載の組成物
。
Ｄ７３．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択され
る３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ７０に記載の組成物。
Ｄ７４．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ７１に記
載の組成物。
Ｄ７５．前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｄ６８〜Ｄ７
４のいずれか１項に記載の組成物。
Ｄ７６．前記多量体リガンド結合領域は、配列番号７７のアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ６８〜Ｄ７２のいずれ
か１項に記載の組成物。
Ｄ７７ 前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、
または配列番号７４のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｄ６８〜Ｄ７６
のいずれか１項に記載の組成物。
Ｄ７８．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３中のカスパーゼバリアントにおける置
換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、実
施形態Ｄ６８〜Ｄ７６のいずれか１項に記載の組成物。
Ｄ７９．実施形態Ｄ１〜Ｄ５３のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
Ｄ８０．前記ベクターは、プラスミドベクターである、実施形態Ｄ７９に記載のベクター
。
Ｄ８１．前記ベクターは、ウイルスベクターである、実施形態Ｄ７９に記載のベクター。
Ｄ８２．前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｄ８１に記載のベク
ター。
Ｄ８３．前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｄ８１に記載のベク
ター。
Ｄ８４．実施形態Ｄ１〜Ｄ５３のいずれか１項に記載の核酸分子または実施形態Ｄ７９〜
Ｄ８３のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された改変さ
れた細胞。
Ｄ８５．前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含む
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさら
に含む、実施形態Ｄ８４に記載の改変された細胞。
Ｄ８６．実施形態Ｄ５４〜Ｄ６７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
Ｄ８７．前記ベクターは、プラスミドベクターである、実施形態Ｄ８６に記載のベクター
。
Ｄ８８．前記ベクターは、ウイルスベクターである、実施形態Ｄ８６に記載のベクター。
Ｄ８９．前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｄ８８に記載のベク
ター。
Ｄ９０．前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｄ８８に記載のベク
ター。
Ｄ９１．実施形態Ｄ５４〜Ｄ６７のいずれか１項に記載の核酸分子または実施形態Ｄ８６
〜Ｄ９０のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改
変された細胞。
Ｄ９２．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、実施形態Ｄ
８５またはＤ９１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
Ｄ９３．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、実施形態Ｄ８５また
はＤ９１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
Ｄ９４．前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンから
なる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ９３に記載の改変さ
れた細胞。
Ｄ９５．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択され
る３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態Ｄ９３に記載の改変された細胞。
Ｄ９６．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ９４に記
載の改変された細胞。
Ｄ９７．前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、実施形態Ｄ９３に記載
の改変された細胞。
Ｄ９８．前記多量体リガンド結合領域は、配列番号７７のアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、もしくはその機能的フラグメント、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、もしくはその機能的フラグメントを含む、実施形態Ｄ９４に記載の改変され
た細胞。
Ｄ９９ 前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、
または配列番号７４のヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態Ｄ８５またはＤ
９１〜Ｄ９８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
Ｄ１００．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３中のカスパーゼバリアントにおける
置換から選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、
実施形態Ｄ８４またはＤ９１〜Ｄ９８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
Ｄ１０１．実施形態Ｄ１〜Ｄ６７のいずれか１項に記載の核酸分子、実施形態Ｄ７９〜Ｄ
８３もしくはＤ８６〜Ｄ９０のいずれか１項に記載のベクター、または実施形態Ｄ６８〜
Ｄ７８のいずれか１項に記載の組成物でトランスフェクトまたは形質導入された、改変さ
れた細胞。
Ｄ１０２．実施形態Ｄ８４、Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ１０１のいずれか１項に記載の改変
された細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
Ｄ１０３．実施形態Ｄ１〜Ｄ６７のいずれか１項に記載の核酸、実施形態Ｄ７９〜Ｄ８３
もしくはＤ８６〜Ｄ９０のいずれか１項に記載のベクター、または実施形態Ｄ６５〜Ｄ７
４のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成
物。
Ｄ１０４．過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するた
めの方法であって、該方法は、実施形態Ｄ８４〜Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ１０１のいずれ
か１項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法
。
Ｄ１０５．前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、実施形態Ｄ１０４に記載の方
法。
Ｄ１０６．前記腫瘍中の細胞は、ＰＲＡＭＥを発現する、実施形態Ｄ１０５に記載の方法
。
Ｄ１０７．前記腫瘍のＰＲＡＭＥ発現を決定する工程をさらに包含する、実施形態Ｄ１０
４〜Ｄ１０６のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１０８．前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少して
いる、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１０６のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１０９．前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、および
乳がんからなる群より選択される疾患と診断されている、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１０８の
いずれか１項に記載の方法。
Ｄ１１０．前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、急性リンパ
芽球性白血病、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイン
グ肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患
と診断されている、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１０８のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１１１．被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激す
るための方法であって、該方法は、実施形態Ｄ８４〜Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ１０１のい
ずれか１項に記載の改変された細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、
方法。
Ｄ１１２．前記標的細胞集団の細胞は、ＰＲＡＭＥを発現する、実施形態Ｄ１１１に記載
の方法。
Ｄ１１３．前記標的細胞のＰＲＡＭＥ発現を決定する工程をさらに包含する、実施形態Ｄ
１１１またはＤ１１２のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１１４．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｄ１１１〜Ｄ１１３のいずれか１
項に記載の方法。
Ｄ１１５．前記標的細胞は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、骨髄性新
生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶど
う膜黒色腫、および神経芽細胞腫の細胞からなる群より選択される、実施形態Ｄ１１１〜
Ｄ１１４のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１１６．前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後
に減少している、実施形態Ｄ１１１〜Ｄ１１５のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１１７．前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中
の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得
られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサン
プル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または
濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態Ｄ１１１〜Ｄ１１６のいずれ
か１項に記載の方法。
Ｄ１１８．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞
の濃度と比較して減少している、実施形態Ｄ１１７に記載の方法。
Ｄ１１９．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞
の濃度と比較して増大している、実施形態Ｄ１１７に記載の方法。
Ｄ１２０．前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、実施形態Ｄ
１１１〜Ｄ１１９のいずれか１項に記載方法。
Ｄ１２１．前記標的細胞は、ＰＲＡＭＥを発現する、実施形態Ｄ１１１〜Ｄ１２０のいず
れか１項に記載の方法。
Ｄ１２２．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、
実施形態Ｄ８４〜Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞
の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
Ｄ１２３．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置する
ための方法であって、該方法は、該被験体に、実施形態Ｄ８４〜Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ
１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方
法。
Ｄ１２４．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｄ１２３に記載の方法。
Ｄ１２５．前記標的抗原は、ＰＲＡＭＥである、実施形態Ｄ１２３またはＤ１２４のいず
れか１項に記載の方法。
Ｄ１２６．前記改変された細胞のさらなる用量を前記被験体に投与する工程をさらに包含
し、ここで前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出
される、実施形態Ｄ１２３〜Ｄ１２５のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１２７．
ａ）被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；または該被
験体から得られる細胞または組織サンプル中のＰＲＡＭＥ発現のレベルを決定する工程；
および
ｂ）（ｉ）実施形態Ｄ８４〜Ｄ８５もしくはＤ９１〜Ｄ１０１のいずれか１項に記載の
改変された細胞を投与するか、または投与する指示を伝える工程、（ｉｉ）該改変された
細胞のその後の投与量を維持するか、もしくは維持する指示を伝える工程、または該改変
された細胞のその後の投与量を調節する工程、あるいは（ｉｉｉ）該被験体において特定
された状態もしくは疾患の有無またはステージ、または該細胞または組織サンプル中のＰ
ＲＡＭＥ発現のレベルに基づいて、該被験体に投与される該改変された細胞のその後の投
与量を調節するか、または調節する指示を伝える工程、
をさらに包含する、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１２６のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１２８ 前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、骨髄性新生
物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ぶどう膜黒色腫、
滑膜肉腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されてい
る、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１２８のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１２９．前記被験体は、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神
経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、実施形態Ｄ１０
４〜Ｄ１２８のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１３０．前記被験体は、急性骨髄性白血病と診断されている、実施形態Ｄ１２９に記載
の方法。
Ｄ１３１．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１３０の
いずれか１項に記載の方法。
Ｄ１３２．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域
に結合する多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、実施形態Ｄ１３
１に記載の方法。
Ｄ１３３．前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含
む改変された細胞の数または濃度は、該多量体リガンドを投与する前に該被験体から得ら
れるサンプル中の該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または
濃度と比較して、該多量体リガンドの投与後に該被験体から得られるサンプル中で減少し
ている、実施形態Ｄ１３１またはＤ１３２のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１３４．改変された細胞の数または濃度は、前記多量体リガンドの投与後２４時間以内
に減少している、実施形態１３３に記載の方法。
Ｄ１３５．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、５０％
減少している、実施形態Ｄ１３３またはＤ１３４のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１３６．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、７５％
減少している、実施形態Ｄ１３３またはＤ１３４のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１３７．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％
減少している、実施形態Ｄ１３３またはＤ１３４のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１３８．前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に、負の症候を経験
していることを決定する工程、および該負の症候を減少または改善するために前記リガン
ドを投与する工程を包含する、実施形態Ｄ１３２〜Ｄ１３７のいずれか１項に記載の方法
。
Ｄ１３９．前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｄ１３
２〜Ｄ１３７のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１４０．前記改変された細胞は、自家Ｔ細胞である、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１３９のい
ずれか１項に記載の方法。
Ｄ１４１．前記改変された細胞は、同種異系Ｔ細胞である、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１３９
のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１４２．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１３９のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１４３．前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される
、実施形態Ｄ１０４〜Ｄ１３９のいずれか１項に記載の方法。
Ｄ１４４．前記改変された細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ｄ８４、Ｄ８５またはＤ９１
〜Ｄ１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
Ｄ１４５．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ｄ８４、Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞
。
Ｄ１４６．前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される
、実施形態Ｄ８４、Ｄ８５またはＤ９１〜Ｄ１０１のいずれか１項に記載の改変された細
胞。
Ｄ１４７．細胞においてＰＲＡＭＥに特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現するため
の方法であって、該方法は、実施形態Ｄ１〜Ｄ６４のいずれか１項に記載の核酸と細胞と
を、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該
細胞が該Ｔ細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
Ｄ１４８．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ｄ１４７に記
載の方法。
Ｄ１４９．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ｄ１４７に記載
の方法。
以下に示される実施例は、ある種の実施形態を例証するのであって、本技術を限定しな
い。
実施例１： ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞
ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の単離および分析
全ての研究を、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
（ＬＵＭＣ）の施設内審査委員会の承認を得て行った。インフォームドコンセントの後、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、単一ＨＬＡ−Ａ２ミスマッチのＳＣＴおよびその後のＤ
ＬＩの後に、急性ＧＶＨＤを経験したＡＭＬに罹患している患者から集めた。クロスオー
バーに基づいて、患者は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性であり、その同胞ドナーは、ＨＬＡ
−Ａ＊０２０１陰性であったのに対して、全ての他のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分
子は、完全にマッチした。ＧＶＨＤの間に集めた患者ＰＢＭＣを、抗ＨＬＡ−Ａ２−ＦＩ
ＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およ
び抗ＣＤ８−ＰＥ（ＢＤ）で３０分間４℃において染色し、活性化した（ＨＬＡ−ＤＲｐ
ｏｓ）ドナー由来（ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、セルソーティング（ＦＡ
ＣＳＡｒｉａ）によって単離した。ＰＢＭＣは限られていたので、そのソートしたＴ細胞
を、Ｔ細胞培地中、まず抗ＣＤ３／ＣＤ２８および照射した自家ＰＢＭＣ（０．５×１０
６／ｍｌ）で拡大した。Ｔ細胞培地は、１０％ ヒト血清（ＨＳ）、ＩＬ−２（１２０
ＩＵ／ｍｌ； Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）およびＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍｌ； Ｐｅｐｒｏ
ｔｅｃｈ）を有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ； Ｌｏｎｚａ）からなる。
Ｔ細胞を、照射した同種異系ＰＢＭＣ（０．５×１０６ ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１２０
ＩＵ／ｍｌ）、およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ， ０．８μｇ／ｍｌ； Ｍｕｒｅ
ｘ Ｂｉｏｔｅｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して、非特異的に刺激した。１４日間の培養
後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＢＤ）および異なるＴＡＡペプチドに対して特異的な
ＰＥ結合体化ＨＬＡ−Ａ２四量体で標識した（１−４）：ＰＲＡＭＥに関しては： ＶＬ
ＤＧＬＤＶＬＬ（ＶＬＤ）、ＳＬＹＳＦＰＥＰＥＡ（ＳＬＹ）、ＡＬＹＶＤＳＬＦＦＬ（
ＡＬＹ）、およびＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（ＳＬＬ）を、ＷＴ−１に関しては：ＲＭＦＰＮＡ
ＰＹＬを、Ｐｒ−１に関しては：ＶＬＱＥＬＮＶＴＶを試験した。単一細胞ソーティング
のために、Ｔ細胞を、ＡＰＣ結合体化四量体で、４℃において１時間、ＴＣＲ ＶＢレパ
ートリー染色キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）と組み合わせて染色し、ＳＬＬ
四量体＋ＶＢ１＋およびＳＬＬ四量体＋ ＶＢ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞をソートし、照射
した同種異系ＰＢＭＣ（０．５×１０６ ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１２０ ＩＵ／ｍｌ）、
およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、０．８μｇ／ｍｌ； Ｍｕｒｅｘ Ｂｉｏｔｅｃ
Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して非特異的に刺激した。自己拘束ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞ク
ローンを、完全にＨＬＡ同一ドナー移植片を移植したＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者から単離
した。ＳＣＴ後の患者に由来するＰＢＭＣを、ＰＥ結合体化ＳＬＬ四量体で１時間、４℃
において標識した。四量体陽性Ｔ細胞を、抗ＰＥコーティング磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳによって単離し、上記で提供されるように、１
０日間、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて拡大した。その後のソーティングのために、
Ｔ細胞を、ＰＥ結合体化ＳＬＬ四量体および抗ＣＤ８ ＡＰＣで１時間、４℃において染
色し、四量体陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１ウェルあたり単一細胞にソートし、拡大した。
３種のＰＲＡＭＥ−ＳＬＬ四量体陽性Ｔ細胞クローン、ＡＡＶ５４（クローン５４または
ＨＳＳ１ともいわれる）、ＡＡＶ４６（ＨＳＳ３ともいわれる）、およびＤＭＧ１６を選
択し、さらなる分析のために使用した。さらに、ＰＲＡＭＥ特異的クローンＤＳＫ３を選
択し、このＴ細胞クローンの特異性を、ペプチド溶離研究によって決定した。
ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンの機能的反応性
刺激アッセイを、９６ウェルプレート中のイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（
１０％ ヒト血清（ＨＳ）および１００ ＩＵ／ｍｌ インターロイキン２（ＩＬ−２）
を補充）中、５，０００個のＴ細胞および２０，０００個の標的で行った。種々の悪性細
胞および非悪性細胞を集め、調製した。安定なエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質
転換Ｂ細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）を、標準的手順を使用して生成し、ＩＭＤＭおよび１０
％ ＦＢＳ中で培養した。Ｋ５６２、ＣＯＳ、Ｔ２、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ １２５７
、ＲＣＣ １７７４、ＲＣＣ １８５１）、肺癌細胞株（Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２９２）
、メラノーマ細胞株（５１８Ａ２、ＦＭ３、ＦＭ６、ＳＫ２．３、ＭＩ−３０４６、ＢＭ
Ｌ、１．１４）、子宮頸癌細胞株（ＳＩＨＡ、ＨＥＬＡ、ＣＡＳＫＩ）、乳癌細胞株（Ｍ
ＣＦ７、ＢＴ５４９、ＭＤＡ２３１）および結腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、
ＬＳ４１１、ＬＳ１８０）を、ＩＭＤＭおよび１０％ ＦＢＳ中で培養した。ＨＬＡ−Ａ
２を発現しないＫ５６２、ＣＯＳ、Ｈ２９２、Ａ５４９、ＳＩＨＡおよびＨＥＬＡを、以
前に論じられたように５、ＨＬＡ−Ａ２をコードするレトロウイルスベクターで形質導入
した。
さらに、メラノーマ細胞を、切り刻んだ腫瘍細胞のフィコール（ficol）単離およびＣ
Ｄ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ５６陰性細胞のその後のＦＡＣＳソートによ
って、リンパ節転移メラノーマを有するＨＬＡ−Ａ２陽性患者から新たに単離した。選択
された実験のために、ＣＯＳ−Ａ２細胞を、野生型ヒトＰＲＡＭＥをコードするｐｃＤＮ
Ａ３．１発現ベクターでトランスフェクトした。原発性ＡＭＬ細胞（＞８０％ 芽細胞）
を有するＨＬＡ−Ａ２陽性患者の末梢血を、ＩＭＤＭおよび１０％ ＦＣＳ中で１日培養
し、刺激細胞（stimulator cell）として使用した。原発性ＡＭＬ細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ
（１００ｎｇ／ｍｌ； Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ； Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ； Ｉｍｍｕｎｅｘ）、ＩＬ−６（１０ｎ
ｇ／ｍｌ； Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）、ＰＧＥ−２（１μｇ／ｍｌ； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）、およびＩＦＮγ（５００ ＩＵ／ｍｌ； Ｉｍｍｕｋｉｎｅ， Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）で１日間活性化した。ＨＬＡ−Ａ２陽性ＡＬＬ細胞株
を、以前に論じられたとおり６に生成した。Ｂ細胞を、抗ＣＤ１９コーティング磁性ビー
ズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳによって、ＰＢＭＣから単離
した。ＡＬＬ細胞株および新たに単離したＢ細胞を、上記細胞をＩＬ−４（５００ Ｕ／
ｍｌ； Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（１０
μｇ／ｍｌ； Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）およびヒトＣＤ４０リガンド７でトランスフェク
トした１×１０５／ｍｌ マウス線維芽細胞の存在下で４８時間、１０６ 細胞／ｍｌの
濃度で２４ウェルプレートの中で培養することによって活性化した７）。インビボで活性
化したＢ細胞は、炎症した扁桃に由来した。Ｔ細胞の芽細胞を、ＰＨＡおよびＩＬ−２（
１２０ ＩＵ／ｍｌ）を用い７日間、ＰＢＭＣの刺激によって生成した。
単球を、抗ＣＤ１４コーティング磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使
用してＭＡＣＳによってＰＢＭＣから単離した。マクロファージ（ＭO）を、ＣＤ１４＋
細胞を６日間、０．５×１０６ 細胞／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートにおいてＩＭＤ
Ｍおよび１０％ ＨＳ中で培養することによって生成した。炎症促進性マクロファージ（
ＭO１）細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下での培養によって得、抗炎症マ
クロファージ（ＭO２）細胞を、Ｍ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ， Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ）とともに培養した。単球由来ＤＣを、ＣＤ１４＋ 細胞を４８時間、ＩＭ
ＤＭおよび１０％ ＨＳ中、０．５×１０６ 細胞／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに
おいてＩＬ−４（５００ Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下
で培養することによって生成した。ＣＤ１４ ＤＣの成熟のために、細胞を、さらに４８
時間、ＩＭＤＭおよび１０％ ＨＳ（ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ ／ｍｌ）、ＴＮＦα（
１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧ
Ｅ−２（１μｇ／ｍｌ）、およびＩＦＮγ（５００ ＩＵ／ｍｌ）を補充）中で培養した
。
ＣＤ３４＋細胞を、抗ＣＤ３４コーティング磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔ
ｅｃ）を使用するＭＡＣＳによって、末梢血幹細胞移植片から単離した。ＣＤ３４ ＤＣ
を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎによって
贈呈）、およびＴＮＦα（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で４日間、ＩＭＤＭおよび１０％ Ｈ
Ｓ中、０．２５×１０６ 細胞／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートにおいて、その後３日
間、さらにＩＬ−４（５００ ＩＵ／ｍｌ）とともにＣＤ３４細胞を培養することによっ
て生成した。ＣＤ３４ ＤＣを成熟させるために、上記細胞を、さらに４８時間、ＩＭＤ
Ｍおよび１０％ ＨＳ（ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）
、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／
ｍｌ）、ＰＧＥ−２（１μｇ／ｍｌ）、およびＩＦＮγ（５００ ＩＵ／ｍｌ）を補充）
中で培養した。血液由来骨髄様ＤＣ（ＭＤＣ）および形質細胞様ＤＣ（ＰＤＣ）を単離す
るために、ＰＢＭＣを、それぞれ、抗ＢＤＣＡ１−ＰＥ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
または抗ＢＤＣＡ２−ＰＥ ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で染色し、ＢＤ
ＣＡ１−ＰＥまたはＢＤＣＡ２−ＰＥ陽性細胞を、抗ＰＥコーティング磁性ビーズを使用
してＭＡＣＳによって単離した。ＭＡＣＳ単離した細胞を、ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ３、
抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（ＢＤ）で染色し、ＭＤＣおよびＰＤ
Ｃを、ＢＤＣＡ１またはＢＤＣＡ２陽性および系統マーカー陰性細胞に基づいて（on ba
ses of）、細胞ソーティングによって選択した。ＭＤＣおよびＰＤＣを成熟させるため
に、細胞を、２４時間、ＩＭＤＭおよび１０％ ＨＳ（それぞれ、ポリ−ＩＣ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）またはＣｐＧ（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかおよびＩＬ−３（５０ｎｇ／ｍｌ
；Ｎｏｖａｒｔｉｓによって贈呈）を補充）中で培養した。線維芽細胞を、ダルベッコ改
変イーグル培地（ＤＭＥＭ； Ｌｏｎｚａ）（１ｇ／ｌ グルコース（ＢｉｏＷｈｉｔｔ
ａｋｅｒ）および１０％ ＦＢＳを有する）中で皮膚生検から培養した。
ケラチノサイトを、ケラチノサイト無血清培地（３０μｇ／ｍｌ ウシ脳下垂体抽出物
および２ｎｇ／ｍｌ 上皮成長因子（ＥＧＦ）を補充（全ての構成要素をＩｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎから購入した））中で皮膚生検から培養した。線維芽細胞およびケラチノサイトを
、３日間、ＩＦＮγ（２００ ＩＵ／ｍｌ）の存在下または非存在下で培養した。初代気
管支上皮細胞（ＰＢＥＣ）を、以前に論じられたとおりに４得て、培養した。
間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、以前に論じられたとおり５、健康なドナーの骨髄
に由来し、ＤＭＥＭおよび１０％ ＦＢＳ中で培養した。結腸上皮細胞を、ＤＭＥＭ Ｆ
１２（Ｌｏｎｚａ）および１０％ ＦＣＳ中（ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ； Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）、Ｔ３ホルモン（２ｎｍｏｌ／ｌ； Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（０，４ｕｇ
／ｍｌ； Ｐｈａｒｍａｃｙ ＬＵＭＣ）、およびインスリン（５ｎｇ／ｍｌ； Ｓｉｇ
ｍａ）を補充）で培養した。肝細胞および肝内胆管上皮細胞（ＩＨＢＥＣ）（ともにＳｃ
ｉｅｎＣｅｌｌから購入）を、ＲＰＭＩ（Ｌｏｎｚａ）および１０％ ＦＢＳ中で培養し
た。近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）を、以前に論じられたとおり６に単離および培養し
た。
ペプチド力価のために、Ｔ２細胞を、種々の濃度のペプチドとともに１時間予備インキ
ュベートし、洗浄した。刺激の１８時間後、上清を採取し、ＩＦＮγ生成を、標準的ＥＬ
ＩＳＡによって測定した。細胞傷害性アッセイにおいて、Ｔ細胞を標準的な４時間の５１
Ｃｒ放出アッセイにおいて９６ウェルプレート中で１，０００個の５１Ｃｒ標識した標的
に対して種々のエフェクター−標的比で試験した。これら実験において、ＵＳＰ１１遺伝
子に対して特異的なコントロールＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔ細胞クローンＨＳＳ１２を含めた。
ペプチド溶離、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および質量分析（
ＭＳ）
ペプチド溶離、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳを、以前に論じられたとおり８に行った。簡
潔には、３×１０１０ エプスタインバーウイルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ−ＬＣＬ）を
溶解し、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体を、ＨＬＡ−Ａ２特異的ＢＢ７．２モノクローナ
ル抗体（ｍＡｂ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。その
後、ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２分子から溶離し、サイズ濾過によってＨＬＡ単量体および
s２−ミクログロブリンから分離した。凍結乾燥後、ペプチド混合物を、水／アセトニト
リル／ＴＦＡを使用して第１回のＲＰ−Ｃ１８−ＨＰＬＣに供し、画分を集めた。各画分
の小さなサンプルをＴ２細胞に負荷し、Ｔ細胞クローンによる認識に関して試験した。そ
の認識された画分を、第２回および第３回のＲＰ−Ｃ１８−ＨＰＬＣ分画に供した。第２
分画において、水／イソプロパノール／ＴＦＡ勾配を使用し、第３分画において、水／メ
タノール／ギ酸勾配を使用した。第３分画の後、その認識された画分中および隣接する認
識されていない画分中に存在するペプチド質量を、ＭＳによって決定した。その量がＴ細
胞クローンの認識パターンと相関するペプチドを、タンデム質量分析のために選択し、そ
れらの配列を決定した。
定量的リアルタイムＰＣＲによるＰＲＡＭＥ発現、およびサイレンシングＲＮＡによる
ＰＲＡＭＥ発現の阻害
ＰＲＡＭＥ発現を、リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって定量した。ＰＲＡＭ
Ｅの阻害を、Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄｓ博士（ＮＫＩ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎ
ｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）９によって贈呈されたピューロマイシン耐性遺伝子と組み合わせ
て、ＰＲＡＭＥに特異的な短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ配列をコードするレトロウイルス
ベクターを使用して行った。レトロウイルスにより形質導入した細胞を、試験前に、種々
の濃度のピューロマイシンとともに少なくとも１週間培養した。近位尿細管上皮細胞（Ｐ
ＴＥＣ）を３μｇ／ｍｌで、腎細胞癌細胞株ＲＣＣ１２５７を４μｇ／ｍｌで、およびＣ
Ｄ３４＋由来樹状細胞（ＣＤ３４ＤＣ）を０．４μｇ／ｍｌで培養した。ＣＤ３４ＤＣを
、本明細書で提供されるように生成し、培養の１日目に形質導入した。
ＴＣＲ遺伝子移入
クローンＡＡＶ５４（クローン５４またはＨＳＳ１とも称される）のＴＣＲＡＶおよび
ＴＣＲＢＶ遺伝子使用を、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲおよび配列決定を使用して決定し
た５。ＨＳＳ１は、ＴＣＲ−ＡＶ１Ｓ１（ＩＭＧＴ： ＴＲＡＶ８−４＊０４）およびＴ
ＣＲ−ＢＶ１Ｓ１（ＩＭＧＴ： ＴＲＢＶ９＊０１）を発現した。レトロウイルスベクタ
ーを、切断型神経成長因子レセプター（ΔＮＧＦ−Ｒ）と組み合わせて、Ｔ２Ａ配列によ
って連結された、コドン最適化しかつシステイン改変したＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖で構
築した１０，１１。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−ＩＥ１特異的ＨＬＡ−Ｂ８拘束Ｔ
細胞を、ＣＭＶ−ＩＥ１四量体を使用してソートし、ＰＨＡおよび照射した同種異系ＰＢ
ＭＣで２日間刺激し、ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲまたはモックで形質導入した。形質導入したＴ
細胞を、ΔＮＧＦ−Ｒに関する陽性に基づいてソートし、機能的反応性に関して試験した
。
定量的リアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲによるＰＲＡＭＥ発現
ＰＲＡＭＥ発現を、ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって定量した。総ＲＮＡを、Ｒ
Ｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはマイクロＲＮａｑｕｅｏｕｓキット（Ａｍ
ｂｉｏｎ）を使用して、細胞から単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成を、オリゴｄＴプライマ
ーを用いＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、またはＴｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。サンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７９００ＨＴ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで行った。以下の
ＰＲＡＭＥプライマーを使用した：センス ５’ ＣＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＣＣＡＴ
ＴＣ ３’、アンチセンス ５’ ＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣ ３’およびア
ンチセンスプローブとして ５’ ＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＴＣＴＣＣＧＴ
Ｇ ３’。プローブは、色素としてＶＩＣおよびクエンチャーとしてＴＡＭＲＡを使用し
た；両方のプライマーを、イントロン／エキソン境界にわたって選択した。各サンプルを
、５０ｎｇ 総ＲＮＡからのｃＤＮＡで、二連で行った。ポルフォビリノーゲンデアミナ
ーゼ（ＰＢＧＤ）遺伝子をハウスキーピング遺伝子として測定して、ｃＤＮＡの良好な品
質を担保した。
ＣＤ３４細胞増殖アッセイ
ＣＤ３４細胞増殖阻害アッセイにおいて、ＣＤ３４細胞を、以前に論じられたようにカ
ルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、
前駆細胞培養培地中に再懸濁した１２。
参考文献リスト
Figure 2021090466
Figure 2021090466
アロＨＬＡレパートリーに由来する高親和性ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲの単離
臨床的に関連する抗原であるメラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に対して特異的で
あるアロＨＬＡレパートリー由来のＴ細胞を単離し、基本的にはＡｍｉｒら Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１１において論じられるようにアッセイした。アロＨＬＡ拘
束ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を、単一ＨＬＡ−Ａ２ミスマッチ幹細胞移植を受けたことがある患
者において分析した。ＨＬＡ−Ａ２＋患者を化学療法および放射線療法で処置したところ
、悪性細胞のレベルおよびその患者の正常造血系が減少した。次に、この患者は、ＨＬＡ
ミスマッチ（ＨＬＡ−Ａ２−）幹細胞移植（ＳＣＴ）を受けた；ＳＣＴの後、正常な免疫
システムの存在と同様に、この患者の悪性細胞レベルは増大した。次いで、上記患者は、
ＨＬＡ−Ａ２−ドナー細胞リンパ球注入を受けたところ、有益な移植片対腫瘍（ＧＶＴ）
応答が提供され、悪性細胞レベルは減少したが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）ももたらさ
れた。活性化した腫瘍反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、上記患者から得た（図３）。５０個の
抗ＨＬＡ−Ａ２反応性Ｔ細胞クローンを同定した。その全ては、異なるＴ細胞レセプター
（ＴＣＲ）を発現した。ＴＣＲ特異性を、ＨＬＡ結合ペプチドの単離、多次元ＨＰＬＣ分
画、および質量分析によって分析した。高度に単一ペプチド特異的反応性を発揮する、Ｐ
ＲＡＭＥに対して特異的なＴ細胞を同定した。
この同定したＰＲＡＭＥ特異的アロＨＬＡ拘束Ｔ細胞クローンは、ＰＲＡＭＥ陽性腫瘍
細胞株、および新たに単離した（ＰＲＡＭＥ陽性）転移性メラノーマおよび原発性白血病
細胞の一団に対して高度に反応性であった（図４）。例えば、Ｔ細胞クローン５４を、Ｐ
ＲＡＭＥ特異的であると決定した（図５）。興味深いことには、アロＨＬＡレパートリー
に由来するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の抗原感受性とＨＬＡ−Ａ２発現個体から得たＰＲＡ
ＭＥ特異的Ｔ細胞とを比較すると、アロＨＬＡレパートリー由来のＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細
胞がＴ細胞活性化のために２００倍低いペプチド濃度を必要とすることが明らかになった
。さらに、アロＨＬＡ拘束Ｔ細胞のみが、腫瘍細胞株および白血病細胞を認識できた（図
６）。これらデータは、Ｔ細胞トレランスが患者レパートリーから得られ得る腫瘍特異的
Ｔ細胞の親和性を凌ぎ得ることを示唆する。
アロＨＬＡレパートリーに由来するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の高親和性を決定した後に
、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の安全サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を特徴付けた。上記Ｔ細
胞を、非悪性細胞の大きな一団に対して徹底的に試験した。非悪性細胞のこの一団は、異
なる組織（例えば、皮膚、肺、結腸、胆道、腎臓、肝臓）に由来する上皮細胞、ならびに
線維芽細胞、間葉系ストローマ細胞および全ての異なる造血系統（造血幹細胞を含む）か
らなった（図７および図８）。上記Ｔ細胞は、健康な細胞に対して低い反応性を有した。
近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）に対する低い反応性および成熟樹状細胞（ＣＤ３４−ｍ
ＤＣ）に対する中程度の反応性を除いて、非悪性細胞タイプのうちのいずれも認識されな
かった。反応性は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ならびにＰＲＡＭＥ特異的ｓｈＲＮＡ
形質導入によって分析されるとおり、ＰＲＡＭＥ発現と厳密に相関した（図９）。（Ａｍ
ｉｒら Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ ２０１１）。アロＨＬＡ拘束ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細
胞クローンのシグナルペプチド特異性を、サイレンシングｓｈＲＮＡを使用する認識され
た抗原の発現のダウンレギュレーションによって示した（図１０）。
ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲのクローニング
クローンＡＡＶ５４ ＳＬＬ（アロ５４もしくはＨＳＳ１ともいわれる）、ＡＡＶ４６
ＳＬＬ（ＨＳＳ３ともいわれる）、およびＤＳＫ３ ＱＬＬクローンによって発現され
るＴ細胞レセプターを、配列決定した。ＰＲＡＭＥのＳＬＬＱＨＬＩＧＬペプチドに対し
て特異的な２種の異なる高親和性ＴＣＲ（ＡＡＶ５４およびＡＡＶ４６）の配列は、図１
７および図１８において示される。さらに、ＰＲＡＭＥのＱＬＬＡＬＬＰＳＬエピトープ
に対して向けられた高親和性ＴＣＲ、クローンＤＳＫ３のこのＴＣＲ配列は、図１９に示
される。ＰＲＡＭＥ特異的ＨＬＡ−Ａ２拘束ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクター
を構築し、末梢血Ｔ細胞を形質導入するために使用した。末梢血に由来するＰＲＡＭＥ特
異的なＴＣＲ形質導入したＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＰＲＡＭＥ特異的認識パターンを有する
。
ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲ発現細胞の特徴付け
ＰＲＡＭＥ特異的四量体で染色した、ＴＣＲ形質導入したＣＤ８＋ Ｔ細胞は、その相
当する元のＴ細胞クローンと比較して類似の認識パターンを示した（図１１；またＡｍｉ
ｒら Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ ２０１１）。ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲがｉＣａｓｐ９自殺
スイッチに連結されているレトロウイルス構築物を生成した。ＭＰ７１−ＰＲＡＭＥ−Ｔ
ＣＲ−ｉＣａｓｐ９およびＭＰ７１−ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ−ｉＣａｓｐ９−ＮＧＦＲで形
質導入したＴ細胞の機能性は、ＭＰ７１−ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ−ＣＤ２０およびＭＰ７１
−ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ−ＮＧＦＲで形質導入したＴ細胞に類似であり、そしてＡＰ１９０
３と一晩インキュベートした後、Ｔ細胞のＰＲＡＭＥ特異的機能的活性は抑止された。こ
れは、ｉＣａｓｐ９の機能的発現を示す（図１２および図１５）。
図１２。 ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲをコードする異なるレトロウイルスベクターを、ウイル
ス特異的Ｔ細胞へと形質導入し、その反応性を、種々の濃度のＰＲＡＭＥペプチドを負荷
した標的細胞に対して、および２種のメラノーマ細胞株に対して測定する：ＨＬＡ−Ａ２
およびＰＲＡＭＥに関して陽性のＦＭ６、ならびにＨＬＡ−Ａ２に関して陽性であるがＰ
ＲＡＭＥに関して陰性のＭＩ３０４６／２。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に関して陽性でありか
つＰＲＡＭＥの中程度の発現を有するＪＹ、ＥＢＶ−ＬＣＬに対するこの形質導入された
Ｔ細胞の反応性もまたアッセイした。１００ｎＭのＡＰ１９０３で１８時間処理した後に
、ＰＲＡＭＥ反応性は、ｉＣａｓｐ９と組み合わせてＰＲＡＭＥ−ＴＣＲで形質導入した
Ｔ細胞において抑止された（図の右側部分）。
図１３。 ４種の異なるＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンを、ユーイング肉腫細胞株に
対して向けられた反応性に関して試験した。ＤＳＫ３は、ＱＬＬ特異的Ｔ細胞クローンで
あり、ＤＭＧ１６およびＡＡＶ５４は、２種の同一のＴ細胞クローンであり（同一のＴＣ
Ｒαおよびβ配列）、ＡＡＶ４６はまた、ＳＬＬエピトープに対して向けられるが、この
クローンは、異なるＴＣＲを発現する。ＡＡＶ１２は、ＵＳＰ１１遺伝子のペプチドを認
識する陽性コントロールＴ細胞クローンとして使用される。クローンＨＡ１ｋ４は、陰性
コントロールクローンである。上記ユーイング肉腫細胞株を、３００ ＩＵ／ｍｌのＩＦ
Ｎ−αまたは１００ ＩＵ／ｍｌ ＩＦＮ−γのいずれかで４８時間処理し、洗浄し、異
なるＴ細胞クローンに添加した。共培養の１８時間後、その上清を採取し、Ｔ細胞クロー
ンのＩＦＮ−γ生成を測定した。結果は、１２種のーイング肉腫細胞株のうちの８種がＰ
ＲＡＭＥを発現することを示す。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γでの処理は、細胞表面上の
ＨＬＡクラスＩ発現を増大させ、異なるＴ細胞クローンによるユーイング細胞株のより良
好な認識をもたらした。
図１４。 ４種の異なるＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンを、神経芽細胞腫（ＮＢ）細
胞株に対して向けられた反応性に関して試験した。ＤＳＫ３（ＱＬＬ特異的）、ＤＭＧ１
６およびＡＡＶ５４（ＳＬＬ特異的、同じＴＣＲ使用）、ならびにＡＡＶ４６（ＳＬＬ）
。ＡＡＶ１２を、ＵＳＰ１１のペプチドを認識する陽性コントロールとして使用した。ク
ローンＨＡ１ｋ４は、陰性コントロールであった。ＮＢ細胞株を、３００ ＩＵ／ｍｌの
ＩＦＮ−αまたは１００ ＩＵ／ｍｌ ＩＦＮ−γのいずれかで４８時間処理したＨＬＡ
−Ａ２（＋Ａ２）で形質導入し、洗浄し、異なるＴ細胞クローンに添加した。共培養の１
８時間後、その上清を採取し、Ｔ細胞クローンのＩＦＮ−γ生成を測定した。結果は、７
種のＮＢ細胞株のうちの５種が、ＰＲＡＭＥを発現することを示す（１種のＮＢ細胞株（
ＳＫ−Ｎ−Ｆ１）に関しては、ＰＲＡＭＥ発現は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γでの処理
後ですら、低いクラスＩ発現に起因して未知である）。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γでの
処理は、細胞表面上のＨＬＡクラスＩ発現を増大させ、異なるＴ細胞クローンによるＮＢ
細胞株のよりよい認識をもたらした。
定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＲＡＭＥ発現を、ユーイング肉腫細胞株および神経芽
細胞腫細胞株の両方において決定したところ、Ｔ細胞クローンによる認識と相関した。
図１５ ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲをコードする異なるレトロウイルスベクターを、ウイルス
特異的Ｔ細胞へと形質導入し、その反応性を、ＰＲＡＭＥペプチドを負荷した標的細胞（
Ｔ２細胞）ならびに２種のＰＲＡＭＥ陽性およびＨＬＡ−Ａ２陽性メラノーマ細胞株：５
１８．Ａ２およびＦＭ６、ならびに１種のＰＲＡＭＥ陰性であるがＨＬＡ−Ａ２陽性メラ
ノーマ細胞株ＭＩ３０４６／２に対して測定した。１００ｎＭのＡＰ１９０３で１８時間
処理した後に、ｉＣａｓｐ９と組み合わせてＰＲＡＭＥ−ＴＣＲで形質導入したＴ細胞に
おいてＰＲＡＭＥ反応性が抑止された。
図１６は、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンによるユーイング肉腫細胞の認識を示す棒
グラフである。ユーイング肉腫細胞株を、ＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしで４８
時間処理した。ユーイング肉腫細胞株のＩＦＮ−γ／ＩＦＮ−αありまたはなしでのＨＬ
Ａ発現を、図の右側部分に示す。
ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ配列の例
図１７〜１９は、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲアミノ酸配列の例を提供する。ＰＲＡＭＥ ＴＣ
Ｒクローンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、本明細書で提供される。
Figure 2021090466
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図２０において、本発明者らは、診断時にＡＭＬに罹患している患者に由来する種々の
原発性ＡＭＬサンプルに対するＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞の反応性を示す。分析した上記Ａ
ＭＬサンプルは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１であり（４１個のサンプル）、１個のＡＭＬサン
プルは、ＨＬＡ−Ａ２陰性であった（ＡＭＬ ５４）。図２０において、Ｔ細胞クローン
の反応性（Ｂ）およびｑＰＣＲによって測定されるＰＲＡＭＥの発現（Ａ）の両方を示す
。
原発性ＡＭＬサンプルを、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞による認識に関して分析した。４２
個のＡＭＬサンプルのうち、４１個は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性であり、１個は、Ｈ
ＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性であった（ＡＭＬ ５４）。４１個のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１
＋ ＡＭＬサンプルのうち、９個のＡＭＬサンプルは、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞によって
効率的に認識された。メラノーマ細胞株Ｍｅｌ１．１４（１００％に設定）において測定
されたＰＲＡＭＥ発現のレベルに対してＰＲＡＭＥ発現＞２．５％を有するＡＭＬサンプ
ルは、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞によって効率的に認識された。
結果は、ＡＭＬサンプルにおいてＰＲＡＭＥ発現がメラノーマ細胞株Ｍｅｌ１．１４（
１００％に設定）において測定されたＰＲＡＭＥ発現のレベルに対して＞２．５％である
場合、このＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞は上記ＡＭＬサンプルに対して効率的に反応し得るこ
とを示す。これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ＡＭＬ患者のうちのおよそ２０〜
２５％が、ＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ遺伝子移入で処置され得ることを示す。さらに、結果は、
ｑＰＣＲによるＡＭＬサンプルのＰＲＡＭＥ発現の測定が、患者をＰＲＡＭＥ−ＴＣＲ改
変Ｔ細胞で処置することが潜在的に有益であるかを決定するために使用され得ることを示
す。
実施例２：自殺遺伝子の付加−−改変された細胞の選択的アポトーシス
ＰＲＡＭＥ標的化ＴＣＲを発現する改変された細胞は、患者が負の効果を経験し、処置
を減らすかまたは停止する必要がある場合には、上記細胞のうちのいくらかまたは全てを
除去する機構により、提供され得る。これらの細胞は、全てのＴＣＲを発現する改変され
たＴ細胞に関して使用され得るか、または上記細胞は、致死的なオンターゲットオフ臓器
毒性を以前に引き起こしたことがあるかまたは引き起こすリスクがある抗原に対してＴＣ
Ｒが向けられた場合に、迅速に治療を終える選択肢が必要である場合に、この能力が提供
され得る。
上記改変された細胞において発現され得るキメラポリペプチドの一例は、本実施例にお
いて提供される。これらの例において、単一のポリペプチドは、核酸ベクターによってコ
ードされる。誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドは、ペプチド結合のスキッピングに起因
して、翻訳中にＣＡＲポリペプチドから分離される（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， ＭＬ ２００
１， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８２：１０１３−２５）。
（ベクター構築および発現の確認）
ヒトＴ細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示
される。ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６など
の）に融合された改変されたヒトカスパーゼ−９活性を含む、治療剤としての使用に適し
た発現ベクターを、構築した。このカスパーゼ−９／ＦＫ５０６ハイブリッド活性は、小
分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ−９活性の全長、短縮型および改変バ
ージョンを、リガンド結合ドメインまたは多量体化領域に融合し、蛍光マーカーＧＦＰの
発現をも可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰへと挿入した。
全長の誘導性カスパーゼ−９分子（Ｆ’−Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーで、カスパーゼ分子の小サブユニットおよび大
サブユニットに連結された、２個、３個、またはこれより多くのＦＫ５０６結合タンパク
質（ＦＫＢＰ−例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント）を含む。全長の誘導性カスパー
ゼ−９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、全長カスパーゼ−９を有し、Ｆ３６
Ｖ変異を含む２個の１２ｋＤａ ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； Ｇｅ
ｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）に連結されたカスパーゼ補充ドメイン（caspase rec
ruitment domain）（ＣＡＲＤ； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１ ２２９）をも含む。上
記ＦＫＢＰ（Ｆ’）のうちの１個もしくはこれより多くのアミノ酸配列は、レトロウイル
スにおいて発現される場合に相同組換えを防止するために、コドン揺らぎがあった（例え
ば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドが、本来コードされるアミノ酸を維持する
サイレント変異によって変化されていた）。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、その活性
化部位を破壊する２８７位でのシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ
ａｓｐ９、Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９、およびＦ’−Ｃａｓｐ９において、カスパーゼ活性化ド
メイン（ＣＡＲＤ）、１個のＦＫＢＰ、または両方のいずれかを、それぞれ、欠失さた。
全ての構築物を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ
へとクローニングした。
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞での予測されるサイズの誘導性カスパーゼ−９構
築物とマーカー遺伝子ＧＦＰとの共発現は、全長および短縮型のカスパーゼ分子の両方に
存在するアミノ酸残基２９９〜３１８に特異的なカスパーゼ−９抗体、ならびにＧＦＰ特
異的抗体を使用するウェスタンブロットによって示された。
最初のスクリーニングは、形質導入された細胞が導入遺伝子の基底活性によって排除さ
れることに恐らく起因して、全長ｉＣａｓｐ９がＴ細胞において高レベルで安定して維持
できないことを示した。上記ＣＡＲＤドメインは、アポトーシス性プロテアーゼ活性化因
子１（Ａｐａｆ−１）とのシトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）駆動性相互
作用によって、カスパーゼ−９分子の生理学的二量体化に関与する。ＣＩＤを使用して、
自殺スイッチの二量体化および活性化を誘導することから、ＣＡＲＤドメインの機能は、
この状況では不要であり、ＣＡＲＤドメインの除去を、基底活性を減少させるための方法
として調査した。
（ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子を使用して、半合致（haploidentical）幹細胞移植後に同種
枯渇されたＴ細胞の安全性を改善する）
半合致幹細胞移植後に同種枯渇されたＴ細胞の安全性を改善するための発現構築物およ
び発現構築物を使用するための方法が、本実施例において示される。類似の方法が、同種
枯渇されていない細胞においてカスパーゼ−９発現構築物を発現させるために使用され得
る。ｉＣａｓｐ９および選択マーカー（短縮型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベ
クターを、ドナーＴ細胞のための安全スイッチとして作製した。（抗ＣＤ２５免疫毒素を
使用する）同種枯渇後ですら、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入、拡大、およびその後
、ＣＤ１９免疫磁性選択によって＞９０％純度へと富化できた。その操作された細胞は、
抗ウイルス特異性および機能性を保持し、制御性の表現型および機能を有するサブセット
を含んだ。小分子二量体化剤でのｉＣａｓｐ９の活性化は、＞９０％のアポトーシスを迅
速に生じた。導入遺伝子発現は静止期Ｔ細胞においてダウンレギュレートされたが、ｉＣ
ａｓｐ９は、発現が活性化（同種反応性）Ｔ細胞において迅速にアップレギュレートされ
たので、効率的自殺遺伝子を保持した。
（材料および方法）
（同種枯渇されたＴ細胞の生成）
同種枯渇された細胞を、以前に示されたように健常志願者から生成した。簡潔には、健
常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で４０：１のレスポンダー 対 スティミ
ュレーター比において、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転
換リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活
性化Ｔ細胞は、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションに
よって共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１
％であり、３Ｈ−チミジン組み込みによる残りの増殖が＜１０％である場合に適切である
とみなした。
（プラスミドおよびレトロウイルス）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒト
ＣＤ１９へと連結された誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９
は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ
−９（ＣＡＳＰ９； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ
変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ０
０２ ８１８）からなる。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７また
はＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。カスパーゼ補充ドメイン（
ＣＡＲＤ）を、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、
ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を
増大させるからである。この２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由
来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間で
の＞９９％の切断を媒介して、ｉＣａｓｐ９のＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣ
Ｄ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、アミノ酸３３３（
ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７７０）か
らなり、これは、２４２から１９個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸
化の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１
３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４； ＡＴＣ
Ｃ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９で一過性に
トランスフェクトすることによって作製した。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを生成
した。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型化もしくはレトロウイ
ルスで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プ
ロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い
、最高力価を生じたＰＧ１３クローンを増やし、ベクター生成のために使用した。
（レトロウイルス形質導入）
Ｔ細胞活性化および拡大のための培養培地は、４５％ ＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、４５％ クリック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）および１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ； Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）からなった。同種枯渇された細胞を、レトロウイルスベクターでの形質導入前
に、４８時間にわたって固定化抗ＣＤ３（ＯＫＴ３； Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ，
Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， ＮＪ）によって活性化した。選択的同種枯渇を、ドナーＰＢ
ＭＣとレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬとを共培養することによって行って、同種反応性細胞
を活性化した：活性化した細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によ
って排除した。この同種枯渇された細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、レトロウイルス
ベクターで４８時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の４日目に行った；陽
性画分を、さらに４日間増やし、凍結保存した。
小規模実験では、組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏ
ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を、ＯＫＴ３ １ｇ／ｍｌで２
〜４時間、３７℃においてコーティングした。同種枯渇された細胞を、１×１０６ 細胞
／ウェルで添加した。２４時間で、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（
ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）
を添加した。レトロウイルス形質導入を、活性化の４８時間後に行った。組織培養用の処
理が行われていない２４ウェルプレートを、３．５ｕｇ／ｃｍ２ 組換えフィブロネクチ
ンフラグメント（ＣＨ−２９６； Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ； Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕ
ｓ Ｂｉｏ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）でコーティングし、そのウェルに、０．５ｍｌ
／ウェルにおいてレトロウイルスベクター含有上清を、３０分間、３７℃において２回負
荷した。その後、ＯＫＴ３活性化細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含
有上清およびＴ細胞培養培地（１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を補充）中で、５×１０５ 細
胞／ウェルにおいてプレーティングした。細胞を２〜３日後に採取し、５０Ｕ／ｍｌ Ｉ
Ｌ−２の存在下で増やした。
（遺伝子改変同種枯渇細胞のスケールアップ生成）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、組織培養用の処理が行われて
いないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を使用し、これを、
一晩４℃において、１０ｍｌのＯＫＴ３ １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチ
ン ７μｇ／ｍｌでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフ
ッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏ
ｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）も使用
した。同種枯渇された細胞を、１×１０６ 細胞／ｍｌでＯＫＴ３コーティングフラスコ
の中に播種した。１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を翌日添加した。レトロウイルス形質導入の
ために、レトロネクチンコーティングフラスコまたはバッグに、１０ｍｌのレトロウイル
ス含有上清を２〜３時間にわたって１回負荷した。ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を、３：１の比
の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびＴ細胞培養培地（１００ Ｕ／ｍｌ Ｉ
Ｌ−２を補充）中、１×１０６ 細胞／ｍｌで播種した。翌朝に細胞を採取し、約５０〜
１００Ｕ／ｍｌの間のＩＬ−２で補充した培養培地中、約５×１０５ 細胞／ｍｌ〜８×
１０５ 細胞／ｍｌの間の播種密度で組織培養用に処理したＴ７５またはＴ１７５フラス
コの中で増やした。
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナ
ルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳもしくはＬＳ
カラム上で、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで
選択した。ＣＤ１９選択した細胞を、さらに４日間増やし、形質導入後の８日目に凍結保
存した。これらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」とよんだ。
（免疫表現型決定およびペンタマー分析）
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフト
ウェア； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ
３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４
５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ ４Ｇ７； Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全
ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、ＣＤ１９に関する陰性
ゲートを設定した。ＨＬＡ−ペンタマー、ＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐｒｏｉｍ
ｍｕｎｅ， Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＶＡ）を使用して、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ
１）のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペン
タマーを使用して、ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。
（二量体化の化学的誘導物質、ＡＰ２０１８７でのアポトーシスの誘導）
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）をＣＤ１９免疫磁性選択
の翌日に１０ｎＭ 終濃度で添加することによって評価した。ＡＰ１９０３も使用され得
る。細胞を、２４時間でアネキシンＶおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）
（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ア
ネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネ
キシンＶ陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方に陽
性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導されるパーセンテージ殺滅を、以下の
とおり、ベースラインの生存率に関して較正した：パーセンテージ殺滅＝１００％−（Ａ
Ｐ２０１８７処理細胞の％生存率÷非処理細胞の％生存率）。
（長期培養および再活性化後の導入遺伝子発現の評価）
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を含むＴ細胞培地中で維持
した。細胞の一部を、１ｇ／ｍｌ ＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌ 抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎ
ｅ ＣＤ２８．２， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で４
８〜７２時間コーティングした２４ウェルプレートにおいて再活性化した。再活性化細胞
および非再活性化細胞の両方でのＣＤ１９発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の２
４日目または２５日目に測定した。
いくつかの実験では、細胞をまた、形質導入後３週間培養し、１：１レスポンダー：ス
ティミュレーター比において、３０Ｇガンマ線照射同種異系ＰＢＭＣで刺激した。共培養
の４日後、細胞の一部を、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７で処理した。殺滅を、２４時間での
アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって測定し、傍観者（bystander）ウイルス特異的Ｔ
細胞に対する二量体化剤の効果を、ＡＰ２０１８７処理細胞および未処理細胞においてペ
ンタマー分析によって評価した。
自殺遺伝子改変Ｔ細胞の免疫学的応答能を維持するための最適な培養条件を、安全スイ
ッチ、選択マーカーおよび細胞タイプの各組み合わせに関して決定して定義しなければな
らない。なぜなら表現型、レパートリーおよび機能性は、全て、ポリクローナルＴ細胞活
性化のために使用される刺激、形質導入細胞の選択のための方法、および培養の継続時間
によって影響を受け得るからである。
（半合致幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ−９自殺遺伝子で形質導入した同種枯渇Ｔ細
胞のフェーズＩ臨床試験）
この例は、代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ１臨床試験の結果を示す
。簡潔には、ドナー末梢血単核細胞を、レシピエントの照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細
胞とともに（４０：１）７２時間共培養し、ＣＤ２５免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清
で形質導入した；ΔＣＤ１９は、免疫磁性選択を介して＞９０％純度への富化を可能にし
た。
細胞療法生成物の生成のためのプロトコルの一例は、本明細書で提供される。
（原材料）
末梢血の２４０ｍｌまで（２回の収集にて）を、確立されたプロトコルに従って移植ド
ナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球
フェレーシス（leukopheresis）を行って、十分なＴ細胞を単離した。１０〜３０ｃｃの
血液をまた、レシピエントから採血し、刺激細胞として使用されるエプスタイン・バーウ
イルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球細胞株を生成するために使用した。場合によっては
、医療履歴および／または低いＢ細胞数の徴候に依存して、ＬＣＬを、適切な第１度近親
者（例えば、親、きょうだい、もしくは子孫）の末梢血単核細胞を使用して生成した。
（同種枯渇された細胞の生成）
同種枯渇された細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナ
ーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中４０：１のレスポンダー対スティミュレーター比にお
いて、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽
球細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞
を、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共
培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり
、３Ｈ−チミジン組み込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に、適切であるとみ
なす。
（レトロウイルス生成）
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９構築物のため
に生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター
細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびマイコプラズマ、
ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフル
エントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、−
８０℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って
、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス（Replication Competent Retrov
irus）（ＲＣＲ）を除外し、分析証明書を発行した。
（同種枯渇された細胞の形質導入）
同種枯渇されたＴリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートま
たはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔ
ｉｎＴＭ， Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）でコーティングし
た。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグの中でプロデューサー上清をイ
ンキュベートすることによってレトロネクチンに付着させた。次いで、細胞を、ウイルス
コーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、プロトコルに従って、同
種枯渇されたＴ細胞を、これらにＩＬ−２を１週間に２回供給して増やして、十分な細胞
数に到達させた。
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナ
ルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自
動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、
ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存するか、またはＩＬ−２でさらに増やして形質導入
後の６日目または８日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
（凍結）
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形
質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細
胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
（研究薬物）
（ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ）
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、ヘテロ−−二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオ
キシカルボニル−α−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介し
て化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化されたマウスＩｇＧ１
抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターα鎖）である。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを、０．５
ｍｇ／ｍｌで滅菌溶液として製剤化する。
（合成ホモ二量体化剤ＡＰ１９０３）
作用機構：ＡＰ１９０３誘導可能細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ
）由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト（カスパーゼ−９プロテイン）レセプター（
これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する）の細胞内部分を含むキメラタンパク質
を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架
橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するＡＰ１９０３の投与まで細
胞内で静止したままである。
毒物学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡによって治験薬（ＩＮＤ）として評価されており、フ
ェーズＩ臨床安全性研究を成功裡に終えた。ＡＰＩ９０３を０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０
ｍｇ／ｋｇ 用量範囲にわたって投与した場合に、重大な有害作用は注記されなかった。
薬理学／薬物動態：患者に、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を、２時間注入として（
０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって１０ｎｇ／ｍＬ〜Ｉ２７５ｎ
ｇ／ｍＬの血漿濃度を示し、投与後０．５時間および２時間において最大の１８％および
７％へと低下する血漿レベルを伴う公開されたＰＫデータに基づいて）与えた。
ヒトにおける副作用プロファイル：志願者でのフェーズ１研究の間には、重篤な有害事
象は起こらなかった。有害事象の発生率は、各処置後に非常に低く、全ての有害事象は、
重症度が軽度であった。唯一の有害事象は、おそらくＡＰＩ９０３に関連していると考え
られた。これは、１．０ｍｇ／ｋｇ ＡＰＩ９０３投与量で１名の志願者について「顔面
紅潮」として示された血管拡張というエピソードであった。この事象は、注入の開始後３
分で起こり、３２分の継続後に解決した。この研究の間に報告された全ての他の有害事象
は、研究者によって研究薬物には関連しないかまたは関連性がありそうもないと考えられ
た。これらの事象は、胸痛、インフルエンザ様症状（ｆｌｕ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、口臭
、頭痛、注射部位疼痛、血管拡張、増大した咳嗽、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出
血を含んだ。
グレード１ ＧｖＨＤを発症している患者を、２時間注入として、０．４ｍｇ／ｋｇ
ＡＰ１９０３で処置した。グレード１ ＧｖＨＤ患者へのＡＰ１９０３の投与プロトコル
を、以下のとおり確立した。同種枯渇されたＴ細胞の注入後にＧｖＨＤを発症している患
者を生検して診断を確定し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として与え
る。グレードＩ ＧｖＨＤを有する患者は、他の治療を最初に何も受けなかったが、彼ら
がＧｖＨＤの進行を示した場合、従来のＧｖＨＤ治療を、規制ガイドラインに従って施し
た。グレード２〜４ ＧｖＨＤを発症している患者に、規制ガイドラインに従って、ＡＰ
１９０３二量体化剤薬物に加えて、標準的な全身免疫抑制治療を施した。
調製および注入の指示：注射用ＡＰ１９０３を、３ｍｌ バイアル中、５ｍｇ／ｍｌの
濃度の２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、１０．６６ｍｇ／バイアル）として得る。投
与前に、その計算した用量を、注入用０．９％ ノーマルセーライン中で１００ｍＬへと
希釈した。１００ｍｌ容積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ
、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間かけてＩＶ注
入を介して投与した。
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１
９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）へと連結した
誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９； Ｇ
ｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接続されたＦ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０
６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）を含む。こ
のＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰＩ９０３に対するＦＫ
ＢＰ１２の結合親和性を増大させ得る。このカスパーゼ補充ドメイン（ＣＡＲＤ）は、ヒ
トカスパーゼ−９配列から欠失されており、その生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって
置き換えられている。ＣＡＲＤをＦＫＢＰ１２で置き換えると、導入遺伝子発現および機
能が増大する。上記２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の１８
アミノ酸のペプチドをコードし、それはグリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切
断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１７個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ
末端において１個の追加のプロリン残基をもたらす。ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３（Ｔ
ＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７７０）から
なり、これは、２４２から１９個のアミノ酸までの細胞質内ドメインを短縮し、リン酸化
の潜在的部位である保存された全てのチロシン残基を除去する。
（インビボ研究）
３名の患者に、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、約１×１０６〜約３×
１０６ 細胞／ｋｇの間の用量レベルでｉＣａｓｐ９＋ Ｔ細胞を与えた。
注入したＴ細胞を、１７０±５の最大倍数拡大（maximum fold expansion）（注入後
２９±９日目）とともに、注入後７日目ほどの早さで、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋
ΔＣＤ１９＋）またはｑＰＣＲによってインビボで検出した。２名の患者は、グレード
Ｉ／ＩＩ ａＧｖＨＤを発症し、ＡＰ１９０３投与は、注入の３０分以内に、ＣＤ３＋
ΔＣＤ１９＋細胞の＞９０％除去（２４時間以内にさらなる対数減少を伴う）、および２
４時間以内の皮膚および肝臓のａＧｖＨＤの消散を引き起こし、ｉＣａｓｐ９導入遺伝子
がインビボで機能することを示した。
エキソビボ実験は、このデータを確認した。さらに、残っている同種枯渇されたＴ細胞
は、拡大でき、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａ
ｔｕｓ）に対して反応性であった（ＩＦＮ−γ生成）。これらのインビボ研究は、二量体
化剤薬物の単一用量が、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の部分集団を減少または排除し得る
が、ウイルス特異的ＣＴＬ（これは、次いで、再拡大し得る）を残し得ることを見出した
。
（免疫再構築）
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再構築研究（免疫表現型決定、Ｔ細
胞およびＢ細胞機能）は、移植後一連の間隔で得られ得る。ｉカスパーゼ形質導入同種枯
渇Ｔ細胞から生じる免疫再構築を測定するいくつかのパラメーターを分析する。この分析
は、全リンパ球数、Ｔ細胞およびＣＤ１９ Ｂ細胞の数の反復測定、ならびにＴ細胞サブ
セット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４
、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、α／βおよびγ／δ
Ｔ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。患者Ｔ細胞の利用可能性に依存して、Ｔ調節
性細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１ＣＤ２５１ＦｏｘＰ３）もまた分析する。可能な場合
には、注入の４時間後、１ヶ月間毎週、毎月×９ヶ月間、および次に１年でおよび２年で
、およそ１０〜６０ｍｌの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサ
イズに依存し、いずれの１回の血液採取時にも（臨床上のケアおよび研究評価のために血
液が採取されることを考慮して）全体で１〜２ｃｃ／ｋｇを超えない。
同種枯渇されていないトランスフェクトまたは形質転換されたＴ細胞の投与
ＰＲＡＭＥ特異的ＴＣＲおよび誘導性カスパーゼポリペプチドを発現するＴ細胞の生成
および投与のための本明細書で提供されるプロトコルはまた、インビボでのＴ細胞同種枯
渇（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を、必要であれば、患者が毒性の症候を示した後に提
供するように改変され得る。このアプローチを、急性ＧｖＨＤなしで免疫再構築から利益
を受け得る被験体のより大きな群へと拡大するために、上記プロトコルは、インビボでの
Ｔ細胞枯渇方法を提供することによって簡略化され得る。予備処置の同種枯渇法において
、本明細書で論じられるように、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株を、レシピエントか
らまず調製し、次いで、それは、同種抗原提示細胞として働く。この手順には、８週間ま
でかかり得、悪性腫瘍を有する広範囲に予備処置した被験体において、特に彼らが最初の
治療の構成要素としてリツキシマブを受けたことがある場合、失敗し得る。その後、ドナ
ーＴ細胞を、レシピエントＥＢＶ−ＬＣＬとともに共培養し、同種反応性Ｔ細胞（これは
、活性化抗原ＣＤ２５を発現する）を、次に、ＣＤ２５−リシン結合体化モノクローナル
抗体で処理する。この手順は、各被験体に関しさらに多くの日数の実験作業がかかり得る
。
上記プロセスは、二量体化剤薬物による同種反応性Ｔ細胞の観察されたインビボでの迅
速な枯渇および刺激されていないがウイルス／真菌反応性Ｔ細胞の節約に基づいて、イン
ビボでの同種枯渇方法を使用することによって簡略化され得る。
グレードＩもしくはこれより高い急性ＧｖＨＤまたは他の毒性事象の発生が存在する場
合、二量体化剤薬物の単一用量を、例えば、２時間の静脈内注入として、０．４ｍｇ／ｋ
ｇのＡＰ１９０３の用量で投与する。二量体化剤薬物のさらなる最大３用量を、急性Ｇｖ
ＨＤが持続する場合に４８時間間隔で投与し得る。グレードＩＩもしくはこれより高い急
性ＧｖＨＤを有する被験体において、二量体化剤薬物のこれらのさらなる用量は、ステロ
イドと併用され得る。上記二量体化剤に対するグレードＩＩＩもしくはＩＶの反応に起因
して、上記二量体化剤のさらなる用量を受けられない、持続するＧＶＨＤを有する患者に
関して、上記患者は、上記二量体化剤の０または１用量のいずれかの後に、ステロイドの
みで処置され得る。
治療用Ｔ細胞の生成
２４０ｍｌまで（２回の収集で）の末梢血を、調達の同意（procurement consent）に
従って移植ドナーから得る。必要であれば、白血球搬出を使用して、十分なＴ細胞を得る
；（幹細胞動員の前またはＧ−ＣＳＦの最後の用量の７日後のいずれか）。余分な１０〜
３０ｍｌの血液をまた、感染症（例えば、肝炎およびＨＩＶ）について検査するために収
集してよい。
末梢血単核細胞を、０日目に抗ヒトＣＤ３抗体（例えば、ＯｒｔｈｏｔｅｃｈまたはＭ
ｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用して活性化し、２日目に組換えヒトインターロイキン−２（ｒ
ｈＩＬ−２）の存在下で拡大する。ＣＤ３抗体活性化Ｔ細胞を、組換えフィブロネクチン
フラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ， Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ
， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）でコーティングしたフラスコまたはプレート上で、ｉカス
パーゼ−９レトロウイルスベクターによって形質導入する。ウイルスを、レトロネクチン
コーティングしたプレートまたはフラスコ中でプロデューサー上清をインキュベートする
ことによって、レトロネクチンに付着させる。次いで、細胞を、ウイルスをコーティング
した組織培養デバイスに移す。形質導入後、Ｔ細胞を、プロトコルに従って、十分な細胞
数に達するように、それらにｒｈＩＬ−２を１週間に２回供給することによって拡大する
。
注入されるＴ細胞のうちの大部分が自殺遺伝子を有することを担保するために、選択マ
ーカー、切断型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）および市販の選択デバイスを使用して、形質
導入された細胞を＞９０％純度になるように選択し得る。ＣＤ１９の免疫磁性選択を、形
質導入後４日間行い得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）に結合体化した常磁性マイクロビ
ーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床注入
に必要とされる細胞の数に依存して、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存し得
るか、またはＩＬ−２でさらに拡大し得、そして十分な細胞が拡大されたら直ぐに凍結保
存し得る（生成開始から１４日目まで）かのいずれかである。
細胞のアリコートを、ＦＤＡにより最終発売試験のために要求されるとおりの形質導入
効率、同一性、表現型、自律的成長および微生物学的検査を試験するために除去し得る。
この細胞を、投与する前に凍結保存する。
治療用Ｔ細胞の代替の生成
動員されていないＴ細胞の白血球搬出の前に、被験体の血球数および白血球百分率数を
収集し、記録する。確立された規制ガイドラインに従う感染症モニタリングを行う。被験
体は、白血球搬出を開始する前に、ＣＢＣおよび血小板に関する施設内基準を満たさなけ
ればならない。白血球画分を、標準化連続フロー遠心分離を使用して集める。被験体を、
アフェレーシスの間にモニターする。およそ３〜４血液容積までの標準的アフェレーシス
手順を、白血病患者に対する基本的注意（precaution）を含め、施設内標準手順に従って
処理する。処理される容積および白血球搬出の継続時間は、文書化して記録される。５×
１０９ 未満の単核細胞が集められる場合、医療モニターに助言を求める。
Ｔ細胞の投与
形質導入したＴ細胞を、幹細胞移植後から、例えば、３０〜１２０日間患者に投与する
。凍結保存したＴ細胞を解凍し、ノーマルセーラインとともにカテーテルラインを通じて
注入する。小児に関しては、前投薬の薬剤（premedication）が体重によって投与される
。細胞の用量は、例えば、約１×１０４ 細胞／Ｋｇ〜１×１０８ 細胞／ｋｇ、例えば
、約１×１０５ 細胞／Ｋｇ〜１×１０７ 細胞／ｋｇ、約１×１０６ 細胞／Ｋｇ〜５
×１０６ 細胞／ｋｇ、約１×１０４ 細胞／Ｋｇ〜５×１０６ 細胞／ｋｇ、例えば、
約１×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約５×１０５、６×１０５
、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１
０６、約４×１０６、または約５×１０６ 細胞／Ｋｇの範囲であり得る
ＧｖＨＤの処置
グレード≧１の急性ＧＶＨＤを発症する患者は、２時間の注入として０．４ｍｇ／ｋｇ
ＡＰ１９０３で処置する。注射用のＡＰ１９０３は、例えば、３ｍｌバイアル中、５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度の２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、１０．６６ｍｇ／バイアル）とし
て提供され得る。投与前に、計算した用量を、注入用の０．９％ ノーマルセーライン中
で１００ｍＬへと希釈する。１００ｍｌの容積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋ
ｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、
２時間にわたってＩＶ注入を介して投与し得る。
サンプル処理スケジュール
Figure 2021090466
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを使用して、アポトーシスを導入するための方法は
、Ｍａｌｃｏｌｍ Ｋ． ＢｒｅｎｎｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１
／０３７３８１（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖ
ｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日出願）およびＭａｌｃｏｌｍ Ｋ． Ｂ
ｒｅｎｎｅｒらによる米国特許出願第１３／１１２，７３９号（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月
２０日出願）において論じられる。これら特許出願および刊行物は、全てそれらの全体に
おいて本明細書に参考として援用される。
引用されるまたは本実施例に対するさらなる裏付けを提供する参考文献
Figure 2021090466
Figure 2021090466
Figure 2021090466
実施例３：さらなる配列
Figure 2021090466
Figure 2021090466
本明細書で言及される各特許、特許出願、刊行物および文書の全体は、これによって本
明細書に参考として援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述
のいずれかが関連する先行技術であるということを許容するものでもなく、これら刊行物
または文書の内容または日付に関するいかなる許容をも構成しない。それらの引用は、関
連する開示の検索を示すものではない。文書の日付（複数可）または内容に関する全ての
陳述は、入手可能な情報に基づき、それらの精度または正確さに関する許容ではない。
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。
本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業
者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの
改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意
のエレメント（複数可）の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば
、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜
からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用され
てきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用
語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等
価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメント
のうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らか
でない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまた
は複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬
を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以
内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用
語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２
および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」とい
う重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細
書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６
％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．
４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって
具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが
、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技
術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
本技術のある種の実施形態は、以下の特許請求の範囲に示される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで：
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に特異
的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードする；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む；ならびに
該ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域および該ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域
は、一緒にＰＲＡＭＥに特異的に結合する、
核酸分子。
（項目２）
前記第１のポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペ
プチドをコードする；および
前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリ
ペプチドをコードする、
項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第
２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目１に記載
の核酸分子。
（項目４）
前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、項目１〜３のいずれか１項に記載の核
酸分子。
（項目５）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むＰＲＡ
ＭＥポリペプチドに特異的に結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含むＰＲＡ
ＭＥポリペプチドに特異的に結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目７）
前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域で
ある、項目３〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目８）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常
領域に由来する、項目３〜７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目９）
前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１の配列と９０
％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１
〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１０）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列を含
むか、または前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオ
チド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、
またはその機能的フラグメントを含む、項目９に記載の核酸分子。
（項目１１）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４の配列と９
０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目
１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１２）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列を含
むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレ
オチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列
、またはその機能的フラグメントを含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、あるいは配列番号７の配列と９
０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目
１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１４）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列を含
むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレ
オチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列
、またはその機能的フラグメントを含む、項目１３に記載の核酸分子。
（項目１５）
前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、あるいは配列番号１０の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８または１３〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１５に記載の核酸分子。
（項目１７）
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸配列、あるい
は配列番号１３もしくは配列番号１４の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配
列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子
。
（項目１８）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、配列番号１６、もしくは配列番号１７の
ヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、配
列番号１６、もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の
連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項
目１７に記載の核酸分子。
（項目１９）
前記第２のポリペプチドは、配列番号１８もしくは配列番号１９のアミノ酸配列、あるい
は配列番号１８もしくは配列番号１９の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配
列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜８または１７〜１８のいずれか１項
に記載の核酸分子。
（項目２０）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２の
ヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配
列番号２１、もしくは配列番号２２のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の
連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項
目１９に記載の核酸分子。
（項目２１）
前記第１のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列、あるいは配列番号２３の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２２）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目２１に記載の核酸分子。
（項目２３）
前記第２のポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列、あるいは配列番号２６の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８または２１〜２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２４）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列番号２８のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列番号２８
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目２３に記載の核酸分子。
（項目２５）
前記第１のポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列、あるいは配列番号２９の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２６）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０もしくは配列番号３１のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０もしくは配列番号３１
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目２５に記載の核酸分子。
（項目２７）
前記第２のポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列、あるいは配列番号３２の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８または２５〜２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２８）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３３もしくは配列番号３４のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３３もしくは配列番号３４
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目２７に記載の核酸分子。
（項目２９）
前記第１のポリペプチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のアミノ酸配列、あるい
は配列番号３５もしくは配列番号３６の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配
列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子
。
（項目３０）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９の
ヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３７、配
列番号３８、もしくは配列番号３９のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の
連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項
目２９に記載の核酸分子。
（項目３１）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４０もしくは配列番号４１のアミノ酸配列、あるい
は配列番号４０もしくは配列番号４１の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配
列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜８または２９〜３０のいずれか１項
に記載の核酸分子。
（項目３２）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４３、もしくは配列番号４４の
ヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配
列番号４３、もしくは配列番号４４のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の
連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項
目３１に記載の核酸分子。
（項目３３）
前記第１のポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列、あるいは配列番号４５の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３４）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列番号４７のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列番号４７
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目３３に記載の核酸分子。
（項目３５）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列、あるいは配列番号４８の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８または３３〜３４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３６）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列番号５０のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列番号５０
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目３５に記載の核酸分子。
（項目３７）
前記第１のポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列、あるいは配列番号５１の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目３８）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５２もしくは配列番号５３のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５２もしくは配列番号５３
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目３７に記載の核酸分子。
（項目３９）
前記第２のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列、あるいは配列番号５４の配列
と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む、
項目１〜８または３７〜３８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４０）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５５もしくは配列番号５６のヌクレオチド配列
を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５５もしくは配列番号５６
のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の連続ヌクレオチドを有するヌクレオ
チド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項目３９に記載の核酸分子。
（項目４１）
前記第１のポリペプチドは、配列番号５７もしくは配列番号５８のアミノ酸配列、あるい
は配列番号５７もしくは配列番号５８の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配
列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子
。
（項目４２）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５９、配列番号６０、もしくは配列番号６１の
ヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５９、配
列番号６０、もしくは配列番号６１のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の
連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項
目４１に記載の核酸分子。
（項目４３）
前記第２のポリペプチドは、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列、あるい
は配列番号６２もしくは配列番号６３の配列と９０％もしくは９０％超同一のアミノ酸配
列、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜８または４１〜４２のいずれか１項
に記載の核酸分子。
（項目４４）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６４、配列番号６５、もしくは配列番号６６の
ヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６４、配
列番号６５、もしくは配列番号６６のヌクレオチド配列と９０％もしくは９０％超同一の
連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメントを含む、項
目４３に記載の核酸分子。
（項目４５）
ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで：
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に特異
的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードする；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含み、ここで該第１のポリペプ
チドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む；
該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第
２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、ここで該第２のポリペプ
チドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む；ならびに
該ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域および該ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域
は、一緒にＰＲＡＭＥに特異的に結合する、
核酸分子。
（項目４６）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、前記第２のポリ
ヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目４５に記載の核酸分子。
（項目４７）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、ヒトＰＲＡＭＥに結合する、項目１〜４６のい
ずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４８）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、細胞表面上に発現されるＰＲＡＭＥに結合する
、項目１〜４７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目４９）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的に結合し、こ
こで該ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子であり、該ペプチドは、ＰＲＡＭＥエ
ピトープである、項目１〜４８のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目５０）
前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ Ａ２．０１分子である、項目４９に記載の
核酸分子。
（項目５１）
前記ＰＲＡＭＥエピトープは、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬであるか、または前記ＰＲＡＭＥエピ
トープは、ＱＬＬＡＬＬＰＳＬである、項目４９または５０のいずれか１項に記載の核酸
分子。
（項目５２）
前記ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドに作用的に連結されたプロモーターをさらに含む、
項目１〜５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目５３）
前記第１のポリヌクレオチドに作用的に連結された第１のプロモーターおよび前記第２の
ポリヌクレオチドに作用的に連結された第２のプロモーターをさらに含む、項目１〜５１
のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目５４）
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１〜５３のいずれか１項
に記載の核酸分子。
（項目５５）
前記ＴＣＲαもしくはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ−
９ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または
翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目５４に記載の核酸分子。
（項目５６）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、項目５４または５５
のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目５７）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目５５〜５６のいずれか１
項に記載の核酸分子。
（項目５８）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、３６位でのアミノ酸置換を有する、項目５７に記載の核酸分子
。
（項目５９）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群よ
り選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目５７に記載の核酸分子。
（項目６０）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される３６位
でのアミノ酸置換を有する、項目５９に記載の核酸分子。
（項目６１）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目５９に記載の核酸分子。
（項目６２）
前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目５４〜５７のいずれか１項
に記載の核酸分子。
（項目６３）
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号７７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、も
しくはその機能的フラグメント、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目５４〜６１のいずれか１項に記載の核
酸分子。
（項目６４）
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目５５〜６３のいずれか１項
に記載の核酸分子。
（項目６５）
前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目５５〜６４のい
ずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６６）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、または配
列番号７４のヌクレオチド配列によってコードされる、項目５５〜６５のいずれか１項に
記載の核酸分子。
（項目６７）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３中のカスパーゼバリアントにおける置換から選
択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目５４〜
６６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目６８）
ａ）項目１〜５５のいずれか１項に記載の核酸分子；および
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
（項目６９）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、項目６８に記載の組
成物。
（項目７０）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目６８〜６９のいずれか１
項に記載の組成物。
（項目７１）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、３６位でのアミノ酸置換を有する、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群よ
り選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目７０に記載の組成物。
（項目７３）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される３６位
でのアミノ酸置換を有する、項目７０に記載の組成物。
（項目７４）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目７１に記載の組成物。
（項目７５）
前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目６８〜７４のいずれか１項
に記載の組成物。
（項目７６）
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号７７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、も
しくはその機能的フラグメント、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目６８〜７２のいずれか１項に記載の組
成物。
（項目７７）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、または配
列番号７４のヌクレオチド配列によってコードされる、項目６８〜７６のいずれか１項に
記載の組成物。
（項目７８）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３中のカスパーゼバリアントにおける置換から選
択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目６８〜
７６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７９）
項目１〜５３のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目８０）
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目７９に記載のベクター。
（項目８１）
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目７９に記載のベクター。
（項目８２）
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目８１に記載のベクター。
（項目８３）
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目８１に記載のベクター。
（項目８４）
項目１〜５３のいずれか１項に記載の核酸分子または項目７９〜８３のいずれか１項に記
載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目８５）
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカ
スパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、
項目８４に記載の改変された細胞。
（項目８６）
項目５４〜６７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目８７）
前記ベクターは、プラスミドベクターである、項目８６に記載のベクター。
（項目８８）
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目８６に記載のベクター。
（項目８９）
前記ベクターは、レトロウイルスベクターである、項目８８に記載のベクター。
（項目９０）
前記ベクターは、レンチウイルスベクターである、項目８８に記載のベクター。
（項目９１）
項目５４〜６７のいずれか１項に記載の核酸分子または項目８６〜９０のいずれか１項に
記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目９２）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域である、項目８５または９１
のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目９３）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目８５または９１のいずれ
か１項に記載の改変された細胞。
（項目９４）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群よ
り選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目９３に記載の改変された細胞。
（項目９５）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ロイシンおよびイソロイシンからなる群より選択される３６位
でのアミノ酸置換を有する、項目９３に記載の改変された細胞。
（項目９６）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目９４に記載の改変された
細胞。
（項目９７）
前記多量体リガンド結合領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目９３に記載の改変された細
胞。
（項目９８）
前記多量体リガンド結合領域は、配列番号７７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、も
しくはその機能的フラグメント、または配列番号７９のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、もしくはその機能的フラグメントを含む、項目９４に記載の改変された細胞。
（項目９９）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を有するか、または配
列番号７４のヌクレオチド配列によってコードされる、項目８５または９１〜９８のいず
れか１項に記載の改変された細胞。
（項目１００）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表３中のカスパーゼバリアントにおける置換から選
択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである、項目８４ま
たは９１〜９８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１０１）
項目１〜６７のいずれか１項に記載の核酸分子、項目７９〜８３もしくは８６〜９０のい
ずれか１項に記載のベクター、または項目６８〜７８のいずれか１項に記載の組成物でト
ランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目１０２）
項目８４、８５または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞および薬学的
に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１０３）
項目１〜６７のいずれか１項に記載の核酸、項目７９〜８３もしくは８６〜９０のいずれ
か１項に記載のベクター、または項目６５〜７４のいずれか１項に記載の組成物、および
薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１０４）
過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するための方法で
あって、該方法は、項目８４〜８５または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変され
た細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１０５）
前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記腫瘍の中の細胞は、ＰＲＡＭＥを発現する、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記腫瘍のＰＲＡＭＥ発現を決定する工程をさらに包含する、項目１０４〜１０６のいず
れか１項に記載の方法。
（項目１０８）
前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目
１０４〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０９）
前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、および乳がんから
なる群より選択される疾患と診断されている、項目１０４〜１０８のいずれか１項に記載
の方法。
（項目１１０）
前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、急性リンパ芽球性白血
病、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑
膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群より選択される疾患と診断され
ている、項目１０４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１１）
被験体において標的細胞集団または組織への細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法
であって、該方法は、項目８４〜８５または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変さ
れた細胞の治療有効量を該被験体に投与する工程を包含する方法。
（項目１１２）
前記標的細胞集団の細胞は、ＰＲＡＭＥを発現する、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記標的細胞のＰＲＡＭＥ発現を決定する工程をさらに包含する、項目１１１または１１
２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目１１１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
前記標的細胞は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、骨髄性新生物、乳癌
、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫
、および神経芽細胞腫の細胞からなる群より選択される、項目１１１〜１１４のいずれか
１項に記載の方法。
（項目１１６）
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少して
いる、項目１１１〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１７）
前記改変された細胞を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞
の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られる第２
のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中の標
的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大
または減少を決定する工程を包含する、項目１１１〜１１６のいずれか１項に記載の方法
。
（項目１１８）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比
較して減少している、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比
較して増大している、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
前記改変された細胞のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目１１１〜１１９の
いずれか１項に記載の方法。
（項目１２１）
前記標的細胞は、ＰＲＡＭＥを発現する、項目１１１〜１２０のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１２２）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目８４〜
８５または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞の治療有効量を投与する
工程を包含する方法。
（項目１２３）
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法
であって、該方法は、該被験体に、項目８４〜８５または９１〜１０１のいずれか１項に
記載の改変された細胞の治療有効量を投与する工程を包含する方法。
（項目１２４）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記標的抗原は、ＰＲＡＭＥである、項目１２３または１２４のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１２６）
前記改変された細胞のさらなる用量を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、ここで
前記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項
目１２３〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２７）
ａ）被験体における状態または疾患の有無またはステージを特定する工程；あるいは該
被験体から得られる細胞または組織サンプル中のＰＲＡＭＥ発現のレベルを決定する工程
；および
ｂ）（ｉ）項目８４〜８５または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞
を投与する工程もしくは投与する指示を伝える工程、（ｉｉ）該改変された細胞のその後
の投与量を維持する工程、もしくは維持する指示を伝える工程、もしくは該改変された細
胞のその後の投与量を調節する指示を伝える工程、または（ｉｉｉ）該被験体において特
定された状態もしくは疾患の有無またはステージ、または該細胞または組織サンプル中の
ＰＲＡＭＥ発現のレベルに基づいて、該被験体に投与される該改変された細胞のその後の
投与量を調節する工程もしくは調節する指示を伝える工程、
をさらに包含する、項目１０４〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２８）
前記被験体は、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、骨髄性新生物、乳癌、
子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ぶどう膜黒色腫、滑膜肉腫、
および神経芽細胞腫からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、項目１
０４〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２９）
前記被験体は、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、および神経芽細胞腫
からなる群より選択される状態または疾患と診断されている、項目１０４〜１２８のいず
れか１項に記載の方法。
（項目１３０）
前記被験体は、急性骨髄性白血病と診断されている、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含
むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、項目１０４〜１３０のいずれか１項に記載
の方法。
（項目１３２）
前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する
多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変され
た細胞の数または濃度は、該多量体リガンドの投与前に前記被験体から得られるサンプル
中の該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数または濃度と比較し
て、該多量体リガンドの投与後に該被験体から得られるサンプル中で減少している、項目
１３１または１３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３４）
改変された細胞の数または濃度は、前記多量体リガンドの投与後２４時間以内に減少して
いる、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、５０％減少してい
る、項目１３３または１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３６）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、７５％減少してい
る、項目１３３または１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３７）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％減少してい
る、項目１３３または１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３８）
前記被験体が、該被験体への前記改変された細胞の投与後に、負の症候を経験しているこ
とを決定する工程、および該負の症候を減少または改善するために前記リガンドを投与す
る工程を包含する、項目１３２〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３９）
前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目１３２〜１３７のいず
れか１項に記載の方法。
（項目１４０）
前記改変された細胞は、自家Ｔ細胞である、項目１０４〜１３９のいずれか１項に記載の
方法。
（項目１４１）
前記改変された細胞は、同種異系Ｔ細胞である、項目１０４〜１３９のいずれか１項に記
載の方法。
（項目１４２）
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目１０４
〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４３）
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目１０
４〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４４）
前記改変された細胞は、Ｔ細胞である、項目８４、８５、または９１〜１０１のいずれか
１項に記載の改変された細胞。
（項目１４５）
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目８４、
８５、または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１４６）
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目８４
、８５、または９１〜１０１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１４７）
細胞においてＰＲＡＭＥに特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現するための方法であ
って、該方法は、項目１〜６４のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞
に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該細胞が該Ｔ細胞レセ
プターを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
（項目１４８）
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目１４７に記載の方法。
（項目１５０）
メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）を認識するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコ
ードする核酸分子であって、該核酸分子は、
ａ．ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１
のポリヌクレオチド；および
ｂ．ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２
のポリヌクレオチド、
を含み、ここで該ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は一
緒に、ＰＲＡＭＥを認識する、核酸分子。
（項目１５１）
ａ．前記第１のポリヌクレオチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１
のポリペプチドをコードし；そして
ｂ．前記第２のポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２の
ポリペプチドをコードする、
項目１５０に記載の核酸分子。
（項目１５２）
前記第１のポリペプチドは、前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、前記第
２のポリペプチドは、前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、項目１５０ま
たは１５１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１５３）
前記核酸分子は、Ｔ細胞レセプターをコードする、項目１５０〜１５２のいずれか１項に
記載の核酸分子。
（項目１５４）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むＰＲＡ
ＭＥポリペプチドを認識する、項目１５０〜１５３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１５５）
前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含むＰＲＡ
ＭＥポリペプチドを認識する、項目１５０〜１５３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１５６）
前記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、異種の定常領域である、項目１５２
〜１５５のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１５７）
前記第１のまたは第２のポリペプチドの定常領域は、マウスＴＣＲ定常領域に由来する、
項目１５２〜１５６のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１５８）
前記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７のい
ずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１５９）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、ま
たはその誘導体を含む、項目Ａ９に記載の核酸分子。
（項目１６０）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５９のい
ずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６１）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、ま
たはその誘導体を含む、項目１６０に記載の核酸分子。
（項目１６２）
前記第１のポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７のい
ずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６３）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９のヌクレオチド配列、ま
たはその誘導体を含む、項目１６２に記載の核酸分子。
（項目１６４）
前記第２のポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７ま
たは１６２〜１６３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６５）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号１１もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１６４に記載の核酸分子。
（項目１６６）
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含む、
項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６７）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５、配列番号１６、もしくは配列番号１７の
ヌクレオチド配列を含む、項目１６６に記載の核酸分子。
（項目１６８）
前記第２のポリペプチドは、配列番号１８もしくは配列番号１９のアミノ酸配列を含む、
項目１５０〜１５７または１６６〜１６７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１６９）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２２の
ヌクレオチド配列を含む、項目１６８に記載の核酸分子。
（項目１７０）
前記第１のポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７の
いずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１７１）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２４もしくは配列番号２５のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１７０に記載の核酸分子。
（項目１７２）
前記第２のポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７ま
たは１７０〜１７１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１７３）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列番号２８のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１７２に記載の核酸分子。
（項目１７４）
前記第１のポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７の
いずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１７５）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０もしくは配列番号３１のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１７４に記載の核酸分子。
（項目１７６）
前記第２のポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７ま
たは１７４〜１７５のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１７７）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３３もしくは配列番号３４のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１７６に記載の核酸分子。
（項目１７８）
前記第１のポリペプチドは、配列番号３５もしくは配列番号３６のアミノ酸配列を含む、
項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１７９）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、もしくは配列番号３９の
ヌクレオチド配列を含む、項目１７８に記載の核酸分子。
（項目１８０）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４０もしくは配列番号４１のアミノ酸配列を含む、
項目１５０〜１５７または１７８〜１７９のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１８１）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４３、もしくは配列番号４４の
ヌクレオチド配列を含む、項目１８０に記載の核酸分子。
（項目１８２）
前記第１のポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７の
いずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１８３）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４６もしくは配列番号４７のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１８２に記載の核酸分子。
（項目１８４）
前記第２のポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７ま
たは１８２〜１８３のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１８５）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号４９もしくは配列番号５０のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１８４に記載の核酸分子。
（項目１８６）
前記第１のポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７の
いずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１８７）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５２もしくは配列番号５３のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１８６に記載の核酸分子。
（項目１８８）
前記第２のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、項目１５０〜１５７ま
たは１８６〜１８７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１８９）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５５もしくは配列番号５６のヌクレオチド配列
、またはその誘導体を含む、項目１８８に記載の核酸分子。
（項目１９０）
前記第１のポリペプチドは、配列番号５７もしくは配列番号５８のアミノ酸配列を含む、
項目１５０〜１５７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１９１）
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５９、配列番号６０、もしくは配列番号６１の
ヌクレオチド配列を含む、項目１９０に記載の核酸分子。
（項目１９２）
前記第２のポリペプチドは、配列番号６２もしくは配列番号６３のアミノ酸配列を含む、
項目１５０〜１５７または１９０〜１９１のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目１９３）
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６４、配列番号６５、もしくは配列番号６６の
ヌクレオチド配列を含む、項目１９２に記載の核酸分子。
（項目１９４）
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１５０〜１９３のいずれ
か１項に記載の核酸分子。
（項目１９５）
前記ＴＣＲαもしくはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドと前記キメラカスパーゼ−
９ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または
翻訳後に、該ポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目１９４に記載の核酸分子。
（項目１９６）
多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域を含む、項目１９４または１９５のいずれか１項に記
載の核酸分子。
（項目１９７）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群よ
り選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、項目１９６に記載の方法。
（項目１９８）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目１９７に記載の方法。
（項目１９９）
前記多量体化領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓを含む、項目１９４〜１９５のいずれか１項に記載
の方法。
（項目２００）
前記多量体化領域は、配列番号７７もしくは配列番号７９のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、またはその機能的フラグメントを含む、項目１９４〜１９５のいずれか１項に記
載の方法。
（項目２０１）
前記多量体化領域は、配列番号７６もしくは配列番号７８のヌクレオチド配列、またはそ
の機能的フラグメントによってコードされる、項目２００に記載の方法。
（項目２０２）
前記多量体化領域は、残基３６がバリンであるＦｖポリペプチドバリアントをさらに含む
、項目２００に記載の方法。
（項目２０３）
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１９５〜２０２のいずれか
１項に記載の核酸分子。
（項目２０４）
前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目１９４〜２０３
のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目２０５）
ａ）項目１５０〜１９３のいずれか１項に記載の核酸分子；および
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子、
を含む組成物。
（項目２０６）
項目１５０〜２０５のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目２０７）
項目１５０〜１９３のいずれか１項に記載の核酸分子または項目２０６に記載のベクター
でトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
（項目２０８）
前記細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカ
スパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに含む、
項目２０７に記載の細胞。
（項目２０９）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ領域である、項目２０８に記載の細胞。
（項目２１０）
前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫ２０５ｖ３６領域である、項目２０８または２０９
のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２１１）
前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目２０８〜２１０
のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２１２）
項目１９４〜Ｂ６のいずれか１項に記載の核酸分子または項目２００に記載の組成物でト
ランスフェクトまたは形質導入された細胞。
（項目２１３）
前記細胞は、自家Ｔ細胞である、項目２０７〜２１２のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２１４）
前記細胞は、同種異系Ｔ細胞である、項目２０７〜２１２のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２１５）
項目１５０〜１９３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配
列番号１、配列番号４、配列番号２１、もしくは配列番号２３のアミノ酸配列を含む、Ｔ
細胞レセプター。
（項目２１６）
項目１５０〜１９３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるか、または配
列番号４５もしくは配列番号４８のアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞レセプター。
（項目２１７）
項目２０７〜２１２のいずれか１項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含
む、薬学的組成物。
（項目２１８）
項目２０７〜２１２のいずれか１項に記載の細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含
む、薬学的組成物。
（項目２１９）
項目１５０〜１９３のいずれか１項に記載の核酸分子または項目２０６に記載のベクター
および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目２２０）
過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、
項目２１７に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
（項目２２１）
過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、
項目２１８に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方法。
（項目２２２）
過剰増殖性疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該
被験体に、項目２１９に記載の薬学的組成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する方
法。
（項目２２３）
前記被験体は、少なくとも１個の腫瘍を有する、項目２２０〜２２２のいずれか１項に記
載の方法。
（項目２２４）
前記少なくとも１個の腫瘍のサイズは、前記薬学的組成物の投与後に減少している、項目
２２３に記載の方法。
（項目２２５）
前記被験体は、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、または乳がんから
なる群より選択される疾患と診断されている、項目２２０〜２２２のいずれか１項に記載
の方法。
（項目２２６）
前記被験体に、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに包含
する、項目２２０〜２２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２７）
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方
法であって、該方法は、項目２１７〜２１８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を該被
験体に投与する工程を包含し、ここで該細胞は、該標的細胞上の抗原に結合するＴ細胞レ
セプター、またはその機能的フラグメントを含む、方法。
（項目２２８）
被験体において標的細胞集団または組織に対する細胞媒介性免疫応答を刺激するための方
法であって、該方法は、項目２１９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包
含し、ここで前記核酸またはベクターは、該標的細胞上の抗原に結合するＴ細胞レセプタ
ー、またはその機能的フラグメントをコードする、方法。
（項目２２９）
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目２２７または２２８のいずれか１項に記載の方法
。
（項目２３０）
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記薬学的組成物の投与後に減少してい
る、項目２２７〜２２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３１）
前記薬学的組成物を投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の
数または濃度を測定する工程、該薬学的組成物の投与後に該被験体から得られる第２のサ
ンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル中の標的細
胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増大また
は減少を決定する工程を包含する、項目２２７〜２３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３２）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比
較して減少している、項目２３１に記載の方法。
（項目２３３）
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比
較して増大している、項目２３１に記載の方法。
（項目２３４）
前記薬学的組成物のさらなる用量は、前記被験体に投与される、項目２２７〜２３３のい
ずれか１項に記載の方法。
（項目２３５）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、該被験体に、項目２１７
〜２１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法
。
（項目２３６）
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法
であって、該方法は、該被験体に、項目２１７〜２１９のいずれか１項に記載の薬学的組
成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２３７）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目２３６に記載の方法。
（項目２３８）
外因性Ｔ細胞レセプターをコードする単離されたＴ細胞であって、ここで該Ｔ細胞レセプ
ターは、ＰＲＡＭＥを認識する、単離されたＴ細胞。
（項目２３９）
前記Ｔ細胞レセプターは、配列番号１、配列番号４、配列番号２１、もしくは配列番号２
３のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、項目２２７に
記載の単離されたＴ細胞。
（項目２４０）
前記Ｔ細胞レセプターは、配列番号４５もしくは配列番号４８のアミノ酸配列、またはそ
の機能的フラグメントもしくは変異体を含む、項目２２７に記載の単離されたＴ細胞。
（項目２４１）
前記Ｔ細胞レセプターは、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むＰＲＡＭＥポリペプチ
ドを認識する、項目２２７〜２２９のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞。
（項目２４２）
前記Ｔ細胞レセプターは、アミノ酸配列ＱＬＬＡＬＬＰＳＬを含むＰＲＡＭＥポリペプチ
ドを認識する、項目２２７〜２２９のいずれか１項に記載の単離されたＴ細胞。

Claims (22)

  1. ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで：
    該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）に特異的に結合するＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコードし；
    該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲαポリペプチドのＶＪ領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含み、該第１のポリペプチドは、該ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域を含み；
    該ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドは、ＴＣＲβポリペプチドのＶＤＪ領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、該第２のポリペプチドは、該ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域を含み、
    該第１のポリペプチドのＣＤＲ３領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；かつ、該第２のポリペプチドのＣＤＲ３領域が、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、
    該ＴＣＲαポリペプチドのＣＤＲ３領域および該ＴＣＲβポリペプチドのＣＤＲ３領域は、一緒にＰＲＡＭＥに特異的に結合する、
    核酸分子。
  2. 請求項１に記載の核酸分子であって、
    前記第１のポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列、または配列番号３１の配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み；かつ、前記第２のポリペプチドが、配列番号３４のアミノ酸配列、または配列番号３４の配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含む、
    核酸分子。
  3. 前記第１のポリペプチドが前記ＴＣＲαポリペプチドの定常領域をさらに含み、かつ、前記第２のポリペプチドが前記ＴＣＲβポリペプチドの定常領域をさらに含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 前記核酸分子がＴ細胞レセプターをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
    前記ＣＤＲ３領域が、アミノ酸配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬを含むＰＲＡＭＥポリペプチドに特異的に結合する、
    核酸分子。
  6. 前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域が、細胞表面に発現されるＰＲＡＭＥに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域が、ペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的に結合し、該ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子であり、かつ、該ペプチドがＰＲＡＭＥエピトープであり、任意に、該ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ Ａ２．０１分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
    ａ）前記ＣＤＲ３コードポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；または
    ｂ）前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーター、および前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター
    をさらに含む、核酸分子。
  9. 多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 請求項１または９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
  11. 前記ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターであり、任意に、該ウイルスベクターがレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
  12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子、または、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
  13. 請求項１２に記載の改変された細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  14. 請求項１〜９に記載の核酸、または、請求項１０もしくは１１に記載のベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  15. 過剰増殖性疾患または状態と診断された被験体において免疫応答を増強するための方法において使用するための、請求項１３または１４に記載の薬学的組成物の治療有効量を含む、組成物。
  16. 前記被験体が、メラノーマ、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、乳がん、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄性新生物、子宮頚癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、神経芽細胞腫、および卵巣がんからなる群より選択される疾患と診断されている、請求項１５に記載の使用のための組成物。
  17. 被験体において標的細胞集団または組織への細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法において使用するための、請求項１３または１４に記載の薬学的組成物の治療有効量を含む、組成物。
  18. 前記標的細胞が、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、骨髄性新生物、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ぶどう膜黒色腫、急性リンパ芽球性白血病、白血病、肺がん、結腸がん、腎細胞がん、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、および卵巣がんの細胞からなる群より選択される、請求項１７に記載の使用のための組成物。
  19. 被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法において使用するための、請求項１３または１４に記載の薬学的組成物の治療有効量を含む、組成物。
  20. 細胞においてＰＲＡＭＥに特異的に結合するＴ細胞レセプターを発現するための方法において使用するための、請求項１または９に記載の核酸を含む組成物であって、該方法は、該核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させる工程を包含し、それによって、該細胞が該Ｔ細胞レセプターを該組み込まれた核酸から発現する、組成物。
  21. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる、Ｔ細胞レセプター。
  22. 過剰増殖性疾患または状態を有する被験体を処置するための方法において使用するための、薬学的有効量の請求項１３または１４に記載の薬学的組成物。
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