BR112020016876A2

BR112020016876A2 - Células apresentadoras de antígeno universal e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112020016876A2
Application number: BR112020016876-9A
Authority: BR
Inventors: Sonny O.T. Ang; Enli LIU; Katy REZVANI; Elizabeth J. Shpall
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2020-12-15
Also published as: TW202000214A; US20200390815A1; SG11202008008UA; CN112292137A; EP3755347A4; RU2020130838A; MX2020008801A; CA3091671A1; WO2019165097A1; WO2019165097A8; EP3755347A1; AU2019226021A1; KR20200123459A; RU2020130838A3; JP2024086827A; JP2021513860A

Abstract

a presente invenção refere-se a células apresentadoras de antígeno universal. são também providos aqui métodos de expansão de células imunes usando as uapcs e métodos para o tratamento de uma doença, tal como câncer, usando as células imunes expandidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULAS APRESENTADORAS DE ANTÍGENO UNIVERSAL E USOS DAS MESMAS".

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 62/633.587, depositado em 21 de fevereiro de 2018, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] A listagem de sequência que está contida no arquivo chamado "UTFCP1355WO_ST25.txt", que é KB (conforme medido no Microsoft Windows) e foi criado em 21 de fevereiro de 2019, é depositada em conjunto por meio de apresentação eletrônica e é aqui incorporada a título de referência.

1. Campo

[003] A presente invenção refere-se em geral aos campos de medicina e imunologia. Mais particularmente, ela refere-se a células apresentadoras de antígeno e usos das mesmas, tais como células assassinas (NK) naturais expansivas.

2. Descrição de Técnica Relacionada

[004] Células assassinas naturais (NK) não necessitam exposição prévia a antígenos para ativação, o que está em contraste com células T, tornando-as altamente eficazes em imunovigilância contra tumores. Enquanto ativação prévia não é necessária, os imensos poderes de morte de células NK necessitam controle rigoroso para prevenir citotoxicidade e autoimunidade não intencionais. Geração de células NK em quantidades clinicamente suficientes e otimamente funcionais é um outro impedimento. Portanto, há uma necessidade de focar no maquinário molecular que governa a biologia de célula NK para discriminar células-alvo "resistentes" de "sensíveis" para projetar células auxiliares para aperfeiçoar a imunoterapia para câncer mediada por célula NK.

SUMÁRIO

[005] Portanto, certas modalidades da presente invenção proveem métodos e composições com relação à fabricação, expansão, controle de qualidade e caracterização funcional de células NK de grau clínico pretendidas para célula e imunoterapia.

[006] Em uma primeira modalidade, é provida uma célula apresentadora de antígeno universal (UAPC) engenheirada para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL). Em alguns aspectos, a UAPC expressa CD48. Em outros aspectos, a UAPC expressa CS1. Em aspectos particulares, a UAPC expressa CD48 e CS1.

[007] Em alguns aspectos, a UAPC não tem essencialmente nenhuma expressão de moléculas da classe I, II de HLA ou CD1d endógenas. Em certos aspectos, a UAPC expressa ICAM-1 (CD54) e LFA-3 (CD58).

[008] Em certos aspectos, a UAPC é definida ainda como uma aAPC derivada de célula de leucemia. Em alguns aspectos, a UAPC derivada de célula de leucemia é definida ainda como uma célula K562.

[009] Em alguns aspectos, engenheirada é definida ainda como transdução retroviral. Em alguns aspectos, a transdução retroviral é definida ainda como transdução de um construto viral de SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2. Em certos aspectos, a UAPC é irradiada.

[0010] Em uma modalidade adicional, é provido um método para expansão de células imunes compreendendo cultura das células imunes na presença de uma quantidade eficaz de UAPCs das modalidades (por exemplo, uma célula apresentadora de antígeno universal (UAPC) engenheirada para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL)). Em alguns aspectos, as células imunes e UAPCs são culturadas em uma razão de 3:1 a 1:3, tal como 3:1, 3:2, 1:1, 1:2 ou 1:3. Em aspectos particulares, as células imunes e UAPCs são culturadas em uma razão de 1:2.

[0011] Em alguns aspectos, a expansão é na presença de IL-2. Em aspectos específicos, a IL-2 está presente em uma concentração de 10- 500 U/mL, tal como 10-25, 25-50, 50-75, 75-10, 100-150, 150-200, 200- 250, 250-300, 300-350, 350-400 ou 400-500 U/mL. Em certos aspectos, a IL-2 está presente em uma concentração de 100-300 U/mL. Em aspectos particulares, a IL-2 está presente em uma concentração de 200 U/mL. Em alguns aspectos, a IL-2 é IL-2 humana recombinante. Em aspectos específicos, a IL-2 é reposta a cada 2-3 dias, tal como a cada 2 dias ou 3 dias.

[0012] Em certos aspectos, as UAPCs são adicionadas pelo menos uma segunda vez. Em alguns aspectos, as células imunes são células NK ou células T. Em aspectos particulares, as células imunes são células NK.

[0013] Em aspectos particulares, as células imunes são derivadas de sangue de cordão (CB), sangue periférico (PB), células-tronco ou medula óssea. Em aspectos específicos, as células-tronco são células- tronco pluripotentes induzidas. Em alguns aspectos, as células imunes são obtidas de CB. Em aspectos particulares, o CB é agrupado de 2 ou mais unidades de sangue de cordão individuais. Em aspectos específicos, o CB é agrupado de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 unidades de sangue de cordão individuais.

[0014] Em alguns aspectos, as células NK são células mononucleares de CB (CBMCs). Em certos aspectos, as células NK são definidas ainda como células NK CD56+.

[0015] Em certos aspectos, o método é realizado em meios livres de soro.

[0016] Em aspectos adicionais, as células imunes são engenheiradas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em alguns aspectos, o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno CD19, CD123, mesotelina, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 ou BCMA. Em alguns aspectos, o CAR é um CAR humanizado. Em alguns aspectos, o CAR compreende IL-15. Em certos aspectos, o CAR compreende um gene suicida. Em alguns aspectos, o gene suicida é CD20, CD52, EGFRv3 ou caspase 9 induzível.

[0017] É ainda provida aqui uma população de células imunes expandidas produzidas de acordo com as modalidades (por exemplo, cultura das células imunes na presença de uma quantidade eficaz de UAPCs das modalidades (por exemplo, uma célula apresentadora de antígeno universal (UAPC) engenheirada para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL)).

[0018] Em uma outra modalidade, é provida uma composição farmacêutica compreendendo a população de células imunes expandidas das modalidades e um veículo farmaceuticamente aceitável. É ainda provida aqui uma composição compreendendo uma quantidade eficaz das células imunes expandidas das modalidades para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

[0019] Uma modalidade adicional provê um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz das células imunes expandidas das modalidades ao indivíduo.

[0020] Em alguns aspectos, a doença ou distúrbio é câncer, inflamação, doença enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, um distúrbio autoimune, uma doença de imunodeficiência, um mal de célula B ou uma infecção. Em aspectos particulares, o câncer é uma leucemia. Em alguns aspectos, a leucemia é uma leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielógena aguda (AML) ou leucemia mielógena crônica (CML). Em aspectos particulares, o distúrbio é doença enxerto versus hospedeiro (GVHD). Em alguns aspectos, o distúrbio é esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide, diabetes tipo I, lúpus eritematoso sistêmico, hipersensibilidade de contato, asma ou síndrome de Sjogren. Em alguns aspectos, o indivíduo é um humano.

[0021] Em certos aspectos, as células imunes são alogeneicas. Em alguns aspectos, as células imunes são autólogas. Em alguns aspectos, as células imunes são células NK ou células T.

[0022] Em aspectos adicionais, o método compreende ainda administrar pelo menos um segundo agente terapêutico. Em alguns aspectos, o pelo menos um segundo agente terapêutico é uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anticâncer, agente imunomodulador ou um agente imunossupressor. Em certos aspectos, o agente anticâncer é quimioterapia, radioterapia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia antiangiogênica ou imunoterapia.

[0023] Em alguns aspectos, o agente imunossupressor é um inibidor de calcineurina, um inibidor de mTOR, um anticorpo, uma irradiação de agente terapêutico, uma quimiocina, uma interleucina ou um inibidor de uma quimiocina ou uma interleucina.

[0024] Em aspectos adicionais, as células imunes e/ou o pelo menos um segundo agente terapêutico são administrados intravenosamente, intraperitonealmente, intratraquealmente, intratumoralmente, intramuscularmente, endoscopicamente, intralesionalmente, percutaneamente, subcutaneamente, regionalmente ou através de injeção ou perfusão direta. Em alguns aspectos, o segundo agente terapêutico é um anticorpo. Em certos aspectos, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, biespecífico ou triespecífico. Em alguns aspectos, o anticorpo é rituximabe.

[0025] Outros objetos, elementos e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada que segue. Deve ser compreendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicando modalidades preferidas da invenção, são dados a título de ilustração apenas, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir dessa descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] Os desenhos que seguem fazem parte do presente pedido e são incluídos para demonstrar mais certos aspectos da presente invenção. A presente invenção pode ser compreendida melhor por meio de referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas aqui.

[0027] FIG. 1: modelo Zipper de interações de receptores de célula assassina natural humana e ligante de célula-alvo. Células NK humanas interagem com células-alvo por meio de muitos receptores, incluindo receptores de imunoglobulina assassina (KIRs), receptores citotóxicos naturais (NCRs), família NKG2 de receptores, receptores de ligação à nectina, receptores da família SLAM e outros. Receptores em células NK são ativadores (KIR2DL4, KIR3DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, CD94-NKG2C, DAP10, NKG2D, DAP10, CRTAM, DNAM, 2B4, NTB-A, CD3 zeta, CD100, CD160) ou inibidores (KIR2DL1/2/3/5A/5B, KIR3DL1/2/3, CD94-NKG2A, TIGIT, CD96, CEACAM-1, ILT2/LILRB1, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec-3/7/9).

[0028] FIGS. 2A-2E: (FIGS. 2A-2B) Razão de expansão de células NK frescas ou congeladas com IL-2 ou APCs. (FIG. 2C) Citometria de fluxo no Dia 0, Dia 7 ou Dia 14 para expressão de CD3 e CD56 em células NK. (FIG. 2D) Número de células de células NT-NK ou SG4-NK estimuladas com APCs. (FIG. 2E) Cinética de crescimento de células

NK estimuladas com APC Clone 9 ou UAPC.

[0029] FIGS. 3A-3D: (FIG. 3A) Citometria de fluxo de células K562 parentais para marcadores indicados. Nenhuma expressão observada de mb-IL21, 41BBL, CD48 e SLAMF7 (CS1). (FIG. 3B) Análise de citometria de fluxo de pós-transdução de APCs de clone 46 (mbIL-21, 41BBL). (FIG. 3C) Análise de citometria de fluxo de pós-transdução de APCs de construto de uAPC para expressão de CD48 (nmIL-21, 41BBL e CD48). (FIG. 3D) Análise de citometria de fluxo de pós-transdução de APCs de construto de uAPC2 para expressão de CS1 (mbIL-21, 41BBL e CS1).

[0030] FIGS. 4A-4D: mapas e anotações de construto de transferência retroviral de MMVL. (FIG. 4A) Vetores de transferência retroviral para mb-IL21. (FIG. 4) Vetores de transferência retroviral para 41BBL. (FIG. 4C) Vetores de transferência retroviral para CD48- Katushka. (FIG. 4D) Vetores de transferência retroviral para CS1-EGFP.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0031] Nos presentes estudos, células NK foram inicialmente caracterizadas por suas funções citolíticas antitumorais e antialogeneicas, distintas de outros componentes do compartimento de imunidade inata. Uma miríade de imunorreceptores governando os comportamentos de células NK é ilustrada como um gráfico de "zipper" na FIG. 1. A disposição de transdutores de sinal pode ser amplamente categorizada em 2 grupos grandes, a saber, ativador e inibidor. Modalidades estruturais e de sinalização fracionam mais as categorias em famílias relacionadas de imunorreceptores. Embora o proteoma de membrana de células NK tenha que ser ainda completamente elucidado, as redundâncias funcionais dentro do "zipper" de célula NK foram aproveitadas para modular funções citolíticas enquanto preservando o equilíbrio complexo e dinâmico entre vias complementares e antagonísticas.

[0032] Portanto, certas modalidades da presente invenção proveem métodos e composições que se referem à fabricação, expansão, controle de qualidade e caracterização funcional de células NK de grau clínico pretendidas para célula e imunoterapia. Crescimento e moldagem de números clinicamente relevantes de células NK para infusão em pacientes enquanto atendendo a restrições de tempo são desafiadores mesmo na melhor das circunstâncias. Em certos aspectos, os métodos e composições revelados detalham os processos técnicos de fabricação de célula NK, detalhes e cinética de expansões de célula NK atingíveis, e caracterização molecular para verificar moldagem celular bem-sucedida.

[0033] Em modalidades adicionais, é provida aqui uma tecnologia de plataforma robusta concretizada como células apresentadoras de antígeno universal (UAPC) para condicionar, moldar e armar células assassinas naturais (NK) humanas contra tumores. "UAPC(s)" se refere aqui a células apresentadoras de antígeno projetadas para a expansão otimizada de células imunes, tais como células NK. As presentes UAPCs foram geradas através de uma combinação única de moléculas coestimuladoras para superar sinais inibidores e induzir função de morte de célula NK ótima e específica. Teste extensivo mostrou que maquinário celular de NK regula bem UAPCs e melhorou a eliminação de tumor. As presentes UAPCs podem ser usadas para a imunoterapia para câncer mediada por célula NK.

[0034] APCs exemplares são geradas pela expressão forçada de interleucina 21 ligada à membrana (mbIL-21) e ligante 4-1BB na linhagem de célula apresentadora de antígeno (APC) K563 sensível à célula NK (referida como clone 46). Em uma outra modalidade, UAPCs foram produzidas pela expressão forçada de mbIL-21, ligante 4-1BB e CD48 em células K562 (chamada APC universal (UAPC)). Em uma outra modalidade, UAPCs foram geradas pela expressão forçada de mbIL-21, ligante 4-1BB e CS1 em células K562 (chamada UAPC2). As UAPCs podem ser geradas para expressar mbIL-2, 41BBL e um antígeno específico de célula NK, tal como um antígeno da família SLAM (Tabela 1).

[0035] A plataforma de UAPC pode ser também aplicada para expandir outros efetores imunes incluindo células T (por exemplo, células T alfa-beta e gama-delta). As células imunes, tais como células NK e células T, podem ser derivadas de sangue periférico, sangue de cordão umbilical, medula óssea ou células-tronco (incluindo células- tronco pluripotentes induzidas). Essas células imunes podem ser submetidas à expansão e ativação ex vivo usando as presentes UAPCs, que é requerido para cultivo para alcançar quantidades significantes para aplicações clinicamente relevantes tal como imunoterapia para câncer.

[0036] Portanto, a presente invenção provê uma série de linhagens de célula auxiliar projetadas e fabricadas para condicionar, modular, inicializar e expandir células imunes humanas, tal como NK, para imunoterapia para câncer. I. Definições

[0037] Como aqui usado, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que nenhum do componente especificado foi formulado propositadamente em uma composição e/ou está presente apenas como um contaminante ou em quantidades-traço. A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não pretendida de uma composição está, portanto, bem abaixo de 0,05%, preferivelmente abaixo de 0,01%. Mais preferida é uma composição em que nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com métodos analíticos padrão.

[0038] Como aqui usado, a especificação "um" ou "uma" pode significar um ou mais. Como aqui usado na(s) reivindicação(ções), quando usada em conjunto com a palavra "compreendendo", a palavra "um" ou "uma" pode significar um ou mais de um.

[0039] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou" a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a descrição dê suporte a uma definição que se refere a apenas alternativas e "e/ou". Como aqui usado, "um outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais. Os termos "cerca de", "substancialmente" e "aproximadamente" significam, em geral, o valor declarado mais ou menos 5%.

[0040] Um "distúrbio imune", "distúrbio imunorrelacionado" ou "distúrbio imunomediado" refere-se a um distúrbio em que a resposta imune desempenha um papel-chave no desenvolvimento ou progressão da doença. Distúrbios imunomediados incluem distúrbios autoimunes, rejeição de enxerto, doença enxerto versus hospedeiro e condições inflamatórias e alérgicas.

[0041] Uma "resposta imune" é uma resposta de uma célula do sistema imune, tal como uma célula B ou uma célula T ou uma célula imune inata, a um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno particular (uma "resposta específica de antígeno").

[0042] Uma "doença autoimune" se refere a uma doença em que o sistema imune produz uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de célula B ou célula T) contra um antígeno que é parte do hospedeiro normal (isto é, um autoantígeno), com lesão consequente a tecidos. Um autoantígeno pode ser derivado de uma célula hospedeira ou pode ser derivado de um organismo comensal tais como os micro-organismos (conhecidos como organismos comensais) que normalmente colonizam as superfícies mucosais.

[0043] "Tratar" ou tratamento de uma doença ou condição se refere à execução de um protocolo, que pode incluir administrar um ou mais fármacos a um paciente, em um esforço para aliviar sinais ou sintomas da doença. Efeitos desejáveis de tratamento incluem diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou paliativo do estado de doença e remissão ou prognóstico melhor. Alívio pode ocorrer antes dos sinais ou sintomas da doença ou condição aparecerem, bem como após seu aparecimento. Portanto, "tratar" ou "tratamento" pode incluir "prevenir" ou "prevenção" de doença ou condição indesejável. Ainda, "tratar" ou "tratamento" não requer alívio completo de sinais ou sintomas, não requer uma cura e inclui especificamente protocolos que têm apenas um efeito marginal sobre o paciente.

[0044] O termo "benefício terapêutico" ou "terapeuticamente eficaz" como usado em todo o presente pedido se refere a qualquer coisa que promova ou aumente o bem-estar do indivíduo com relação ao tratamento médico dessa condição. Isso inclui, mas não está limitado a, uma redução na frequência ou severidade dos sinais ou sintomas de uma doença. Por exemplo, tratamento de câncer pode envolver, por exemplo, uma redução no tamanho de um tumor, uma redução na invasividade de um tumor, redução na taxa de crescimento do câncer ou prevenção de metástase. Tratamento de câncer pode também se referir ao prolongamento da sobrevivência de um indivíduo com câncer.

[0045] "Indivíduo" e "paciente" se referem a um humano ou não humano, tais como primatas, mamíferos e vertebrados. Em modalidades particulares, o indivíduo é um humano.

[0046] A expressão "farmacêutica ou farmacologicamente aceitável" se refere a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação adversa, alérgica ou de outro modo indesejada quando administradas a um animal, tal como um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou ingrediente ativo adicional será conhecida daqueles de habilidade na técnica à luz da presente invenção. Além disso, para administração animal (por exemplo, humano), será compreendido que preparações devem satisfazer padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme exigido pelo FDA Office of Biological Standards.

[0047] Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes aquosos (por exemplo, água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenterais, tais como cloreto de sódio, dextrose de Ringer, etc.), solventes não aquosos (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila), meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos e antifúngicos, antioxidantes, agentes de quelação e gases inertes), agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção, sais, fármacos, estabilizadores de fármaco, géis, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçantes, agentes saborizantes, corantes, repositores de fluido e nutrientes, tais como materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido de um versado de habilidade comum na técnica. O pH e a concentração exata dos vários componentes em uma composição farmacêutica são ajustados de acordo com parâmetros bem conhecidos.

[0048] O termo "haplotipificação ou tipificação de tecido" se refere a um método usado para identificar o haplotipo ou tipos de tecido de um indivíduo, por exemplo, através da determinação de qual locus (ou loci) de HLA é expresso nos linfócitos de um indivíduo particular. Os genes de HLA estão localizados no complexo de histocompatibilidade principal (MHC), uma região no braço curto do cromossomo 6, e estão envolvidos em interação célula-célula, resposta imune, transplante de órgão,

desenvolvimento de câncer e susceptibilidade à doença. Existem seis loci genéticos importantes em transplante, designados HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ. Em cada locus, pode estar qualquer um de vários alelos diferentes.

[0049] Um método amplamente usado para haplotipificação usa a reação em cadeia da polimerase (PCR) para comparar o DNA do indivíduo com segmentos conhecidos dos genes codificando antígenos do MHC. A variabilidade dessas regiões dos genes determina o tipo de tecido ou haplotipo do indivíduo. Métodos sorológicos são também usados para detectar antígenos sorologicamente definidos nas superfícies de células. Determinantes HLA-A, -B e –C podem ser medidos através de técnicas sorológicas. Em suma, linfócitos do indivíduo (isolados de sangue periférico fresco) são incubados com antissoros que reconhecem todos os antígenos de HLA conhecidos. As células são espalhadas em uma bandeja com poços microscópicos contendo vários tipos de antissoro. As células são incubadas por 30 minutos, seguido por uma incubação de complemento por mais 60 minutos. Se os linfócitos tiverem em suas superfícies antígenos reconhecidos pelos anticorpos no antissoro, os linfócitos são lisados. Um corante pode ser adicionado para mostrar mudanças na permeabilidade da membrana celular e morte celular. O padrão de células destruídas pela lise indica o grau de incompatibilidade histológica. Se, por exemplo, os linfócitos de uma pessoa sendo testada para HLA-A3 forem destruídos em um poço contendo antissoro para HLA-A3, o teste é positivo para esse grupo de antígeno.

[0050] O termo "células apresentadoras de antígeno (APCs)" se refere a uma classe de células capaz de apresentar um ou mais antígenos na forma de um complexo de peptídeo-MHC reconhecível por células efetoras específicas do sistema imune, e dessa maneira induzindo uma reposta imune celular efetiva contra o antígeno ou antígenos sendo apresentados. O termo "APC" compreende células integrais intactas tais como macrófagos, células B, células endoteliais, células T ativadas e células dendríticas ou moléculas de ocorrência natural ou sintéticas capazes de apresentar antígeno, tais como moléculas da Classe I do MHC purificadas complexadas para ÿ2- microglobulina. II. Células Apresentadoras de Antígeno Universal

[0051] Algumas modalidades da presente invenção referem-se à produção e uso de células apresentadoras de antígeno universal (UAPCs). As UAPCs podem ser usadas para a expansão de células imunes, tais como células NK e células T. As UAPCs podem ser engenheiradas para expressar IL-21 ligada à membrana (mbIL-21) e 41BBL (ligante CD137).

[0052] As UAPCs podem ser engenheiradas para expressar ligante CD137 e/ou uma citocina ligada à membrana. A citocina ligada à membrana pode ser mIL-21 ou mIL-15. Em modalidades particulares, as UAPCs são engenheiradas para expressar ligante CD137 e mIL-21. As APCs podem ser derivadas de células de câncer, tais como células de leucemia. As APCs podem não ter nenhuma expressão de moléculas classe I, II de HLA ou CD1d endógenas. As APCs podem expressar ICAM-1 (CD54) e LFA-3 (CD58). Em particular, as APCs podem ser células K562, tais como células K562 engenheiradas para expressar ligante CD137 e mIL-21. As APCs podem ser irradiadas. A engenharia pode ser através de qualquer método conhecido na técnica, tal como transdução retroviral.

[0053] As citocinas exercem controles muito potentes sobre classes inteiras de células imunes (incluindo células NK), afetando o destino, atividade e eficácia celular de respostas celulares. O poder de estimulação da citocina em ativar células NK confirma suas funções efetoras "naturais" que são altamente suscetíveis à intervenção ambiental, e que inicialização pode regular comportamentos de célula NK in vivo.

[0054] Para se dirigir à questão de aquisição de quantidades clinicamente relevantes de células NK, os presentes métodos podem usar interleucina (IL-21) como o acionador para expansão de célula NK na presente tecnologia de plataforma de UAPC. Em humanos, estimulação de célula NK com IL-10 e IL-21 induz expressão de NKG2D de uma maneira dependente de STAT-3. Embora os receptores de citocina compartilhem componentes de sinalização celular similares em muitas células imunes, a sinalização específica de célula NK é dependente da relação receptor de IL-21-STAT3 para proliferação.

[0055] Sinalização de citocina é importante para manutenção de sobrevivência e proliferação de linfócito. In vivo, administração de IL-2 é o único método aprovado pelo FDA para expansão de células NK. IL- 15, um outro ativador de célula NK potente, está passando por teste clínico de Fase I como uma alternativa possível para IL-2, mas pode ter toxicidade significante seguindo administração sistêmica. Além das toxicidades significantes, essas citocinas também induzem proliferação de células T enquanto limitando a persistência de células NK. Apesar de compartilhar o mesmo receptor para transdução de sinal, receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21 têm efeitos distintos e específicos sobre células diversas. A. IL-21 ligada à membrana

[0056] Em certas modalidades, para energizar especificamente células NK, IL-21 pode ser usada para produção das presentes UAPCs. Receptor de IL-21 (IL21R), uma relação íntima com a cadeia beta do receptor de IL-2 capaz de transdução de sinais através de sua dimerização com a cadeia gama do receptor de citocina comum (gama(c), é suprarregulado em células NK humanas ativadas (células prontas para serem disparadas). Enquanto IL-21, uma citocina tipo I,

pode modular funções de células T, B e NK, os presentes estudos constataram que apenas células NK humanas sofrem expansão significante através da ativação da via de sinalização de receptor de IL21 (isto é, 100 vezes durante 21 dias). Por outro lado, IL21 desempenha um papel importante na contração de células T CD8+.

[0057] Sinalização de IL21R é alimentada principalmente por STAT3, um ativador de proliferação celular altamente potente. A relação IL21R-STAT3 é dirigida pela ligação de DNA de STAT3 induzida por IL- 21 a GAS e elementos induzíveis por cis como verificado por imunoprecipitação e Western blotting com anticorpo antifosfotirosina. A base molecular de proliferação mediada por IL21 pode ser especificamente traçada para tirosina 510 (Y510) em IL21R, que faz a mediação de fosforilação induzida por IL-21 de STAT1 e STAT33. Esse mecanismo é acentuado por respostas de IL-21 diminuídas em camundongos com inativação dupla de Stat1/Stat3.

[0058] Sinalização de IL21R é importante para citotoxicidade de NK. Deficiência de IL21R humana é ligada à citólise prejudicada de células- alvo K562 marcadas com 51Cr, enquanto citotoxicidade celular dependente de anticorpo não é afetada. O defeito letal não embriônico monogênico (mutação de perda-de-função em IL21R) representa uma excelente oportunidade para delinear, e então útil na modelagem, aumento e formação de respostas citolíticas de NK inatas.

[0059] Sinalização de IL-21 molda seletivamente subconjuntos de células NK, embora ambas as populações de CD56dim e CD56bright carreguem números similares de IL21R na superfície. Indução por IL-21 de fosforilação de STAT1 e STAT3 é maior em células NK CD56bright vs. CD56dim. Em contraste, IL-21 não tem nenhum efeito sobre ativação de STAT5, uma via de ativação de IL-2 que também dirige expansão de célula T. Em adição à ativação de STAT3, sinalização de IL-21 também envolve as vias de MAPK e PI3K e induz expressão de genes responsivos imunes inatos incluindo IFN-gama, T-bet, IL-12Rbeta2 e IL- 18R em células NK, iniciando-as para matar células de tumor.

[0060] Para utilização eficiente de IL-21, expressão de mbIL-21 (FIG. 4A) pode ser usada para concentrar e localizar interação trans com IL21R em células NK. A proximidade com membrana de mbIL21 assegura pronta disponibilidade onde ela for necessária, portanto, ela pode sustentar proliferação celular ótima sem quantidades e concentrações grandes de IL-21 fornecida exogenamente. Coculturas com K562-mb15-41BBL irradiados induziram uma expansão média de 21,6 vezes de células NK CD56+CD3- a partir de sangue periférico. Essa expansão é maior comparado com estimulação com apenas citocinas solúveis da família γc compartilhada incluindo IL-2, IL-12, IL- 15, IL-21 sozinhas ou em combinações. Através de comparação, as presentes UAPCs podem expandir células NK em pelo menos 1000 vezes (3-log) durante 14-21 dias. Expressão de mbIL21 em UAPCs pode também obviar a necessidade de citocina de grau clínico exógena. B. 4-1BBL (ligante 4-1BB, ligante CD137, CD137L, TNFSF9)

[0061] Em adição à noção de iniciação de citocina de função de célula NK, interações físicas diretas com moléculas de ativação em células NK resultam em respostas proliferativas celulares aumentadas. CD137 (4-1BB) é um membro de uma família de gene de receptor de necrose de tumor (TNF-R), que faz a mediação de proliferação celular, diferenciação e morte de célula programada (apoptose). O receptor de murino foi primeiro caracterizado seguido pelo homólogo humano, que compartilha uma identidade de 60% no nível de aminoácido, com conservação significante no domínio citoplásmico/de sinalização. CD137 é principalmente expresso em células T ativadas e células NK, com níveis variáveis detectáveis em timócitos, células mieloides e células endoteliais em sítios de inflamações. Sinalização de CD137 fisiológica é mediada por meio de 1) NF-κ que promove sobrevivência através da ativação de Bcl-XL e 2) via PI3K/ERK1/2 que dirige especificamente progressão de ciclo celular.

[0062] Em células NK ativadas, CD137 é uma molécula coestimuladora induzível por citocina, que por sua vez dirige respostas antitumor em células NK através do aumento de proliferação celular e secreção de IFN-γ. Estudos usando camundongos com inativação de CD137L-/- elucidaram a importância de sinalização de CD137/CD137L no desenvolvimento de células imunes antitumor. Camundongos com inativação de CD137-/- tinham uma frequência 4 vezes maior de metástases de tumor comparado com camundongos controle.

[0063] Ligante de CD137 (CD137L, ligante 4-1BB), um membro glicoproteína de 34 kDa da superfamília de TNF, é detectado principalmente em células apresentadoras de antígeno ativadas (APC), incluindo células B, macrófagos e células dendríticas, bem como transientemente expresso em níveis baixos em células T ativadas. CD137L humano é apenas 36% homólogo comparado com o correspondente de murino. De acordo com eficácias antitumor de anticorpos para CD137 agonísticos, ligação de CD137L foi mostrada elicitar atividades de CTL e antitumor.

[0064] Portanto, as presentes UAPCS podem ser engenheiradas para expressar ligante 4-1BB, o contrarreceptor fisiológico para CD137 para estimulação. C. SLAM/CD48

[0065] Além de condicionamento de citocina e coestimulação de 4- 1BBL, interações físicas diretas entre células NK e alvo também influenciam as respostas celulares, isto é, morte das células-alvo. A sinalização da família de molécula de ativação linfocítica (SLAM, anteriormente também conhecida como superfamília CD2) de receptores de imunoglobulina homólogos, que são amplamente expressos e desempenham papéis críticos no sistema imune, é especialmente importante em termos de interações intercelulares.

[0066] Portanto, as UAPCs da presente invenção podem expressar um ou mais antígenos da família SLAM. Membros da família SLAM incluem CD2, CD48, CD58 (LFA-3), CD244 (2B4), CD229 (Ly9), CD319 (CS1 (CD2 subconjunto 1); CRACC (células citotóxicas de ativação de receptor tipo CD2)) e CD352 (NTB-A (antígeno NK-T-B)). Em aspectos particulares, as UAPCs expressam CD48 e/ou CS1. Células NK expressam pelo menos três membros da família SLAM (SLAMF). Eles são 2B4, NK, antígeno de células T- e B- (NTB-A) e células citotóxicas de ativação de receptor tipo CD2, que reconhecem seus respectivos ligantes CD48, NTB-A e CRACC em células-alvo e possivelmente em outras células NK. Enquanto SLAMF 1, 3, 5, 6, 7, 8 e 9 são receptores homofílicos (autoligantes), SLAMF2 e SLAMF4 são contrarreceptores (heterofílicos) um para o outro. A faixa ampla (três ordens de magnitude) em afinidades homofílicas conhecidas (constante de dissociação, Kd, de <1 μM a 200 μM) aponta para uma base mecanística para a sobreposição, mas mecanismos de sinalização distintos para as glicoproteínas SLAM. Tabela 1. Afinidades de ligação de membros da família SLAM SLAMF CD Nome Aliases Interação Con- Afini- trarreceptor dade 1 150 SLAM SLAMF1, homofílica 200 CD150, CDw150 2 48 CD48 BCM1, heterofílica CD2 >500 BLAST, (roedores BLAST1, MEM-102 heterofílica 2B4 8 3 229 LY9 hly9, homofílica antígeno 9 de linfócito m 4 244 2B4 NAIL, heterofílica CD48 8 NKR2B4, Nmrk 5 84 CD84 LY9B homofílica <1

6 352 NTB-A KALI, KALIb, homofílica 2 Ly108, NTBA, SF2000 7 319 CRACC CS1, 19A homofílica 8 353 BLAME, homofílica SBBI42 9 CD2F10, homofílica CD84H1, SF2001, CD2F-10, CD84-H1

[0067] Em modalidades particulares, as presentes UAPCs são engenheiradas para expressar CD48 para reforçar interação célula- com-célula para aumentar respostas celulares de NK. CD48 é uma proteína ancorada a glicosilfosfatidilinositol (GPI-AP) encontrada na superfície de células NK, células T, monócitos e basófilos, e participa em vias de adesão e ativação nessas células. Apesar de sua falta de domínio intracelular, estimulação de CD48 induz rearranjo de fatores de sinalização em grande quantidade de lipídeos, atividade de Lck-cinase e fosforilação de tirosina. Como uma molécula de adesão e coestimuladora, CD48 induz vários efeitos em linfócitos B e T, células NK, mastócitos e eosinófilos. Em células NK humanas, CD48 é o contrarreceptor para 2B426, um ativador importante de células NK. A interação heterofílica é pensada competir para interação de CD244 com MHC-I. Interação de 2B4/CD48 então induz sinais de ativação em células NK humanas, enquanto em células NK de murino ela envia sinais inibidores.

[0068] Enquanto interações 2B4-CD48 entre células da mesma população, isto é, interações de célula NK-célula NK ou interações de célula T-célula T, levam à ativação aumentada, através da expressão de CD48 em APCs, tal como linhagem de célula mieloide K562 que é normalmente destituída de CD48, as UAPCs podem ativar a via de sinalização de 2B4 potente em células NK em trans.

D. SLAM/CS1

[0069] Em algumas modalidades, as presentes UAPCs são engenheiradas para expressar CS1, um outro membro da família SLAM, como uma molécula coestimuladora para ativar os poderes de morte de células NK. Diferente de CD48 que se liga contrário a 2B4, interações de CS1 são homofílicas, e podem ser caracterizadas no contexto de interações cis vs. trans. Células K562 que são normalmente livres de CS1 podem ser engenheiradas para expressar CS1. E. Administração de Ácidos Nucleicos

[0070] O mbIL-21, 41BBL e antígeno coestimulador podem ser engenheirados através de qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. O ácido nucleico é tipicamente administrado na forma de um vetor de expressão, tal como um vetor de expressão viral. Em alguns aspectos, o vetor de expressão é um vetor de expressão retroviral, um vetor de expressão adenoviral, um vetor de expressão de plasmídeo de DNA ou um vetor de expressão AAV. Em alguns aspectos, a administração é através de administração de um ou mais vetores, um ou mais transcritos dos mesmos e/ou uma ou mais proteínas transcritas a partir dos mesmos é administrado à célula.

[0071] Métodos para introdução de um construto de polinucleotídeo em células animais são conhecidos e incluem, como exemplos não limitantes, métodos de transformação estável em que o construto de polinucleotídeo é integrado ao genoma da célula, métodos de transformação transiente em que o construto de polinucleotídeo não é integrado ao genoma da célula e métodos mediados por vírus. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula através de, por exemplo, vetores virais recombinantes (por exemplo, retrovírus, adenovírus), lipossoma e similar. Por exemplo, em alguns aspectos, métodos de transformação transiente incluem microinjeção, eletroporação ou bombardeamento de partícula. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem ser incluídos em vetores, mais particularmente plasmídeos ou vírus, em vista de serem expressos nas células.

[0072] Métodos de administração não viral de ácidos nucleicos incluem lipofecção, nucleofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, policátion ou conjugados de lipídeo:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais e absorção de DNA aumentada por agente. Lipofecção é descrita nas (por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5.049.386, 4.946.787; e 4.897.355) e reagentes de lipofecção são comercialmente vendidos (por exemplo, Transfectam® e Lipofectina®). Lipídeos catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção de reconhecimento de receptor eficiente de polinucleotídeos incluem aqueles de Feigner, WO 91117424; WO 91116024. Administração pode ser a células (por exemplo, administração in vitro ou ex vivo) ou tecidos-alvo (por exemplo, administração in vivo).

[0073] Em algumas modalidades, administração é através do uso de sistemas de base viral de RNA ou DNA para a administração de ácidos nucleicos. Vetores virais em alguns aspectos podem ser administrados diretamente a pacientes (in vivo) ou eles podem ser usados para tratar células in vitro ou ex vivo, e então administrados a pacientes. Sistemas de base viral em algumas modalidades incluem vetores retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e de vírus herpes simplex para transferência de gene. III. Células Imunes

[0074] Algumas modalidades da presente invenção se referem ao isolamento e expansão de células imunes, tais como células NK ou células T, tal como para imunoterapia para câncer.

[0075] Em certas modalidades, células imunes são derivadas de células mononucleares de sangue periférico humanas (PBMC), produtos de leucaférese não estimulada (PBSC), células-tronco embriônicas humanas (hESCs), células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), medula óssea ou sangue de cordão umbilical através de métodos bem conhecidos na técnica. Especificamente, as células imunes podem ser isoladas de sangue de cordão (CB), sangue periférico (PB), medula óssea ou células-tronco. Em modalidades particulares, as células imunes são isoladas de CB agrupado. O CB pode ser agrupado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou mais unidades. As células imunes podem ser autólogas ou alogeneicas. As células imunes isoladas podem ser de haplotipo compatível com o indivíduo a ser administrada a terapia celular. Células NK podem ser detectadas através de marcadores de superfície específicos, tais como CD16, CD56 e CD8 em humanos.

[0076] Em certos aspectos, as células NK são isoladas através do método anteriormente descrito de expansão in vivo de células NK (Spanholtz e outros, 2011; Shah e outros, 2013). Nesse método, células mononucleares de CB são isoladas através de centrifugação de gradiente de densidade Ficoll. A cultura celular pode ser depletada de quaisquer células expressando CD3 e pode ser caracterizada para determinar a porcentagem de células CD56+/CD3- ou células NK. Em outros métodos, CB umbilical é usado para derivar células NK pelo isolamento de células CD34+. O método pode compreender depleção de células positivas para CD3, CD14 e/ou CD19.

[0077] As células imunes isoladas podem ser expandidas na presença das presentes UAPCs. A expansão pode ser por cerca de 2- 30 dias, tal como 3-20 dias, particularmente 12-16 dias, tal como 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 dias, especificamente cerca de 14 dias. As células imunes e UAPCs podem estar presentes em uma razão de cerca de 3:1-1:3, tal como 2:1, 1:1, 1:2, especificamente cerca de 1:2. A cultura de expansão pode compreender ainda citocinas para promover expansão, tal como IL-2. A IL-2 pode estar presente em uma concentração de cerca de 100-500 U/mL, tal como 100-300 U/mL, particularmente cerca de 200 U/mL. A IL-2 pode ser reposta na cultura de expansão, tal como a cada 2-3 dias. As UAPCs podem ser adicionadas à cultura pelo menos uma segunda vez, tal como em cerca de 7 dias de expansão.

[0078] Seguindo a expansão, as células imunes podem ser imediatamente infundidas ou podem ser armazenadas, tal como através de criopreservação. Em certos aspectos, as células podem ser propagadas por dias, semanas ou meses ex vivo como uma população a granel dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5 dias.

[0079] Células NK expandidas podem secretar citocinas tipo I, tal como interferon-γ, fator-α de necrose de tumor e fator de estimulação de colônia de granulócitos-macrófago (GM-CSF), que ativam ambas células imunes inatas e adaptativas, bem como outras citocinas e quimiocinas. A medição dessas citocinas pode ser usada para determinar o estado de ativação de células NK. Ainda, outros métodos conhecidos na técnica para determinação de ativação de célula NK podem ser usados para caracterização das células NK da presente invenção. IV. Receptores de Antígeno Quiméricos

[0080] Em certas modalidades, as presentes células imunes, tais como células T ou células NK, são geneticamente modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o CAR compreende: a) um domínio de sinalização intracelular, b) um domínio de transmembrana e c) um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação de antígeno.

[0081] Um CAR reconhece antígeno associado a tumor de superfície celular independente de antígeno leucocitário humano (HLA) e emprega uma ou mais moléculas de sinalização para ativar células NK geneticamente modificadas para morte, proliferação e produção de citocina. Em certas modalidades, as presentes células NK podem ser geneticamente modificadas através de métodos compreendendo (i) transferência de gene não viral usando um dispositivo de eletroporação (por exemplo, um nucleofector), (ii) CARs que sinalizam através de endodomínios (por exemplo, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ ou outras combinações), (iii) CARs com comprimentos variáveis de domínios extracelulares conectando o domínio de reconhecimento de antígeno à superfície celular e, em alguns casos, (iv) células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPCs) derivadas de K562 para serem capazes de robustamente e numericamente expandir células NK CAR+ (Singh e outros, 2011).

[0082] As modalidades da presente invenção se referem ao uso de ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleico codificando um polipeptídeo CAR específico de antígeno, incluindo um CAR que foi humanizado para reduzir imunogenicidade (hCAR), compreendendo um domínio de sinalização intracelular, um domínio de transmembrana e um domínio extracelular compreendendo um ou mais motivos de sinalização. Em certas modalidades, o CAR pode reconhecer um epítopo compreendendo o espaço compartilhado entre um ou mais antígenos. Em certas modalidades, a região de ligação pode compreender regiões de determinação de complementaridade de um anticorpo monoclonal, regiões variáveis de um anticorpo monoclonal e/ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. Em uma outra modalidade, essa especificidade é derivada de um peptídeo (por exemplo, citocina) que se liga a um receptor.

[0083] É compreendido que os ácidos nucleicos de CAR humanos podem ser genes humanos usados para melhorar a imunoterapia celular para pacientes humanos. Em uma modalidade específica, os presentes métodos usam um cDNA de CAR de comprimento integral ou região de codificação. As regiões de ligação a antígeno ou domínio podem compreender um fragmento das cadeias VH e VL de um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal humano particular, tais como aqueles descritos na Patente U.S.

7.109.304, incorporada aqui a título de referência. O fragmento também pode ser qualquer número de domínios de ligação a antígeno diferentes de um anticorpo específico de antígeno humano. Em uma modalidade mais específica, o fragmento é um scFv específico de antígeno codificado por uma sequência que é otimizada para uso de códon humano para expressão em células humanas.

[0084] O arranjo poderia ser multimérico, tal como um diacorpo ou multímeros. Os multímeros são mais provavelmente formados por emparelhamento cruzado da porção variável das cadeias leve e pesada em um diacorpo. A porção de dobra do construto pode ter alternativas múltiplas de ser totalmente deletada, ter a primeira cisteína mantida, uma substituição de prolina ao invés de serina, ser truncada até a primeira cisteína. A porção Fc pode ser deletada. Qualquer proteína que seja estável e/ou dimerize pode servir para esse propósito. Um dos domínios Fc, por exemplo, ou o domínio CH2 ou CH3 de imunoglobulina humana, pode ser usado. A dobra, região de CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana que foi modificada para melhorar dimerização pode ser usada. Em outros aspectos, apenas a porção de dobra de uma imunoglobulina ou porções de CD8α podem ser usadas.

[0085] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de CAR compreende uma sequência codificando outros receptores coestimuladores, tal como um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular CD28 modificado. Outros receptores coestimuladores incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 e 4-1BB (CD137). Em adição a um sinal primário iniciado por CD3ζ, um sinal adicional provido por um receptor coestimulador humano inserido em um CAR humano é importante para ativação integral de células NK e poderia ajudar a melhorar a persistência in vivo e o sucesso terapêutico da imunoterapia adotiva.

[0086] O domínio de sinalização intracelular de um receptor de antígeno quimérico é responsável por ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune em que o receptor de antígeno quimérico foi posto. A função efetora é uma função especializada de uma célula diferenciada, tal como uma célula NK. Em modalidades específicas, domínios de sinalização de receptor intracelular no CAR incluem aqueles do complexo de receptor de antígeno de célula T, tal como a cadeia zeta de CD3, também domínios de sinalização coestimuladores Fcγ RIII, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD20, sozinhos ou em uma série com CD3zeta, por exemplo. Em modalidades específicas, o domínio intracelular (que pode ser referido como o domínio citoplásmico) compreende parte ou todas de uma ou mais de cadeia zeta TCR, CD28, CD27, OX40/CD134, 4- 1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL2Rbeta/CD122, IL-2Ralfa/CD132, DAP10, DAP12 e CD40. Qualquer parte do complexo de receptor de célula T endógeno pode ser usada no domínio intracelular. Um ou múltiplos domínios citoplásmicos podem ser empregados, uma vez que os chamados CARs de terceira geração têm pelo menos dois ou três domínios de sinalização fundidos juntos para efeito aditivo ou sinérgico, por exemplo.

[0087] Em certas modalidades do CAR, a porção específica de antígeno do receptor (que pode ser referida como um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação a antígeno) compreende um antígeno associado a tumor ou um domínio de ligação de antígeno específico de patógeno. Antígenos incluem antígenos de carboidrato reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrão, tal como Dectina-1. Um antígeno associado a tumor pode ser de qualquer tipo, contanto que ele seja expresso na superfície celular de células de tumor. O domínio de ligação ao antígeno pode ser, mas não está limitado a, CD19, CD20, antígeno carcinoembriônico, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação a folato, glicoproteína envelope de HIV-1 gp120, glicoproteína envelope de HIV-1 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, cadeia kappa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII ou VEGFR2. O CAR pode compreender um scFv humanizado, tal como CD19 ou CD123 humanizado.

[0088] Em certas modalidades, o CAR pode ser coexpresso com uma citocina para melhorar a persistência quando há uma quantidade baixa de antígeno associado a tumor. Por exemplo, CAR pode ser coexpresso com IL-15.

[0089] A sequência da estrutura de leitura aberta codificando receptor quimérico pode ser obtida a partir de uma fonte de DNA genômico, uma fonte de cDNA ou pode ser sintetizada (por exemplo, via PCR) ou suas combinações. Dependendo do tamanho do DNA genômico e do número de íntrons, pode ser desejável usar cDNA ou uma combinação do mesmo uma vez que é verificado que íntrons estabilizam o mRNA. Também, pode ser ainda vantajoso usar regiões de não codificação endógenas ou exógenas para estabilizar o mRNA.

[0090] É compreendido que o construto quimérico pode ser introduzido em células NK como DNA nu ou em um vetor adequado. Métodos de transfectar estavelmente células através de eletroporação usando DNA nu são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 6.410.319. DNA nu geralmente se refere ao DNA codificando um receptor quimérico contido em um vetor de expressão de plasmídeo em orientação apropriada para expressão.

[0091] Alternativamente, um vetor viral (por exemplo, um vetor retroviral, vetor adenoviral, vetor viral adenoassociado ou vetor lentiviral) pode ser usado para introduzir o construto quimérico em células NK. Vetores adequados para uso de acordo com o método da presente invenção são não replicantes nas células NK. Um grande número de vetores é conhecido, os quais são baseados em vírus, onde o número de cópia dos vírus mantidos na célula é baixo o suficiente para manter a viabilidade da célula tais como, por exemplo, vetores baseados em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV.

[0092] O CAR pode expressar um gene suicida, tal como CD20, CD52, EGFRv3 ou caspase 9 induzível.

[0093] O CAR pode compreender um domínio de ligação ao antígeno de tumor. O domínio de ligação ao antígeno de tumor pode ser, mas não é limitado a, CD19, CD20, antígeno carcinoembriônico, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação a folato, glicoproteína envelope de HIV-1 gp120, glicoproteína envelope de HIV-1 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, cadeia kappa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII ou VEGFR2. O CAR pode compreender um scFv humanizado, tal como CD19 humanizado, CD123, mesotelina, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 e BCMA. V. Métodos de Uso

[0094] As modalidades da presente invenção referem-se a métodos para uso das células imunes, tal como NK ou T, providas aqui (por exemplo, expandidas pelas presentes UAPCs) para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio médico através da transferência de uma população de células imunes que elicita uma resposta imune. O método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz das células imunes expandidas, dessa maneira tratando ou prevenindo o distúrbio no indivíduo. Em certas modalidades da presente invenção, câncer ou infecção é tratado através de transferência de uma população de célula imune que elicita uma resposta imune. Devido à sua liberação de citocinas proinflamatórias, células imunes podem reverter o microambiente do tumor anti- inflamatório e aumentar respostas imunes adaptativas através da promoção de diferenciação, ativação e/ou recrutamento de célula imune acessório para sítios de malignidade.

[0095] Tumores para os quais os presentes métodos de tratamento são úteis incluem qualquer tipo de célula maligna, tais como aqueles encontrados em um tumor sólido ou um tumor hematológico. Tumores sólidos exemplares podem incluir, mas não estão limitados a, um tumor de um órgão selecionado do grupo consistindo em pâncreas, cólon, ceco, estômago, cérebro, cabeça, pescoço, ovário, rim, laringe, sarcoma, pulmão, bexiga, melanoma, próstata e mama. Tumores hematológicos exemplares incluem tumores da medula óssea, males de célula T ou B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas e similar. Exemplos de cânceres adicionais que podem ser tratados usando os métodos providos aqui incluem, mas não estão limitados a, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer gástrico ou do estômago (incluindo câncer gastrintestinal e câncer estromal gastrintestinal), câncer pancreático, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, vários tipos de câncer de cabeça e pescoço e melanoma.

[0096] O câncer pode ser especificamente do tipo histológico que segue, embora ele não seja limitada a esses: neoplasma, maligno; carcinoma; carcinoma, não diferenciado; carcinoma de célula gigante ou do eixo; carcinoma de pequenas células; carcinoma papilar; carcinoma de célula escamosa; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de célula basal; carcinoma pilomatrix; carcinoma de célula transitório; carcinoma de célula transitório papilar; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular combinado e colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma cístico adenoide; adenocarcinoma em pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, colo poliposo familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquiolo-alveloar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de célula granular; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apêndice da pele; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma com células em anel de sinete; carcinoma do duto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de Paget, mamária; carcinoma de célula acinar; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma com metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor estromal ovariano, maligno; tecoma, maligno; tumor de célula granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de célula de Sertoli; tumor de célula de Leydig, maligno; tumor de célula lipídica, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamário, maligno; feocromocitoma;

glomangiossarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de espalhamento superficial; melanoma lentigo maligno; melanomas lentiginosos acrais; melanomas nodulares; melanoma maligno em nevos pigmentados gigantes; melanoma de célula epitelioide; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrossarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomiossarcoma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor misto, maligno; tumor mülleriano misto; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filode, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; teratoma, maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiossarcoma; osteossarcoma; osteossarcoma justacortical; condrossarcoma; condroblastoma, maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de células gigantes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico, maligno; odontossarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrossarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodermal primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de célula granular, maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeno; linfoma maligno, de células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micose fungoide; outros linfomas não Hodgkin especificados; linfoma de célula B; linfoma não-Hodgkin de grau baixo/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL de grau intermediário difuso; NHL de grau alto imunoblástico; NHL de grau alto linfoblástico; NHL de grau alto de célula não clivada; NHL de doença volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; macroglobulinemia de Waldenstrom; histiocitose maligna; mieloma múltiplo; sarcoma de mastócito; doença do intestino delgado imunoproliferativa; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de célula do plasma; eritroleucemia; leucemia de célula de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastócitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; leucemia de célula pilosa; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); e leucemia mieloblástica crônica.

[0097] Modalidades particulares se referem a métodos de tratamento de leucemia. Leucemia é um câncer do sangue ou medula óssea e é caracterizada por uma proliferação anormal (produção através de multiplicação) de células do sangue, geralmente células brancas do sangue (leucócitos). Ela é parte do grande grupo de doenças chamadas neoplasmas hematológicos. A leucemia é um termo amplo compreendendo um espectro de doenças. A leucemia é clinicamente e patologicamente separada em formas aguda e crônica.

[0098] A leucemia aguda é caracterizada por proliferação rápida de células imaturas do sangue. Essa aglomeração torna a medula óssea incapaz de produzir células sanguíneas saudáveis. Formas agudas de leucemia podem ocorrer em crianças e adultos jovens. Tratamento imediato é requerido em leucemia aguda devido à progressão e acúmulo rápidos das células malignas, que então derramam na corrente sanguínea e se espalham para outros órgãos do corpo. Envolvimento do sistema nervoso central (SNC) é incomum, embora a doença possa causar ocasionalmente paralisias do nervo craniano. A leucemia crônica é distinguida pela formação de células sanguíneas relativamente maduras, mas ainda anormais. Tipicamente levando meses a anos para progredir, as células são produzidas em uma taxa muito maior do que as células normais, resultando em muitas células brancas do sangue anormais no sangue. Leucemia crônica ocorre principalmente em pessoas idosas, mas pode teoricamente ocorrer em qualquer grupo de idade. Enquanto a leucemia aguda deve ser tratada imediatamente, as formas crônicas são algumas vezes monitoradas por algum tempo antes do tratamento para assegurar eficácia máxima de terapia.

[0099] Ainda, as doenças são classificadas em linfocíticas e linfoblásticas, o que indica que a mudança cancerosa aconteceu em um tipo de célula da medula que normalmente segue para formar linfócitos, e mielógena ou mieloide, que indica que a mudança cancerosa aconteceu em um tipo de célula da medula que normalmente segue para formar células vermelhas, alguns tipos de células brancas e plaquetas.

[00100] Leucemia linfocítica aguda (também conhecida como leucemia linfoblástica aguda ou ALL) é o tipo mais comum de leucemia em crianças pequenas. A doença também afeta adultos, especialmente aqueles com 65 anos ou mais. A leucemia linfocítica crônica (CLL) afeta com mais frequência adultos com a idade de 55. Ela algumas vezes ocorre em adultos mais jovens, mas ela quase nunca afeta crianças. Leucemia mielógena aguda (também conhecida como leucemia mieloide aguda ou AML) ocorre mais comumente em adultos do que em crianças. Esse tipo de leucemia foi anteriormente chamado leucemia não linfocítica aguda. Leucemia mielógena crônica (CML) ocorre principalmente em adultos.

[00101] Linfoma é um tipo de câncer que se origina em linfócitos (um tipo de célula branca do sangue no sistema imune do vertebrado).

Existem muitos tipos de linfoma. De acordo com o U.S. National Institutes of Health, linfomas são responsáveis por cerca de cinco por cento de todos os casos de câncer nos Estados Unidos, e o linfoma de Hodgkin em particular é responsável por menos de um por cento de todos os casos de câncer nos Estados Unidos. Devido ao fato do sistema linfático ser parte do sistema imune do corpo, os pacientes com um sistema imune enfraquecido, tal como de infecção por HIV ou de certos fármacos ou medicação, também têm uma incidência maior de linfoma.

[00102] Em certas modalidades da presente invenção, células imunes são administradas a um indivíduo com necessidades das mesmas, tal como um indivíduo que tem câncer ou uma infecção. As células então reforçam o sistema imune do indivíduo para atacar as respectivas células de câncer ou patogênicas. Em alguns casos, o indivíduo é provido com uma ou mais doses das células imunes. Em casos onde o indivíduo é provido com duas ou mais doses das células imunes, a duração entre as administrações deve ser suficiente para permitir tempo para propagação no indivíduo, e em modalidades específicas a duração entre doses é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias.

[00103] A fonte de células imunes que são preativadas e expandidas pode ser de qualquer tipo, mas em modalidades específicas as células são obtidas de um banco de sangue de cordão umbilical, sangue periférico, células-tronco embriônicas humanas ou células-tronco pluripotentes induzidas, por exemplo. Doses adequadas para um efeito terapêutico seriam pelo menos 105 ou entre cerca de 105 e cerca de 1010 células por dose, por exemplo, preferivelmente em uma série de ciclos de dosagem. Um regime de dosagem exemplar consiste em quatro ciclos de dosagem de uma semana de doses crescentes, começando pelo menos em cerca de 105 células no Dia 0, por exemplo, aumentando incrementalmente até uma dose-alvo de cerca de 1010 células dentro de várias semanas de início de um esquema de aumento de dose intrapaciente. Modos de administração adequados incluem injeções intravenosa, subcutânea, intracavitária (por exemplo, através de dispositivo de acesso a reservatório), intraperitoneal e direta a uma massa de tumor.

[00104] Em um método exemplar, as células NK podem ser derivadas de uma amostra biológica, tal como uma ou mais unidades de sangue de cordão. A unidade de sangue do cordão pode ser uma unidade de sangue de cordão congelada. A unidade de sangue do cordão pode ser descongelada e submetida a um gradiente Ficoll para obter células mononucleares. As células mononucleares podem ser depletadas de células positivas para CD3, CD14 e CD19, tal como através de CliniMAS. As células NK negativamente selecionadas podem então ser culturadas na presença de APCs e IL-2 (por exemplo, 200 U/mL). As células NK podem então ser transduzidas com sobrenadante retroviral expressando um CAR e culturadas com APCs γ-irradiadas e IL-2. Finalmente, as células podem ser classificadas para expressão positiva do CAR, tal como CD56, CD16, CD3, CD19, CD14 ou CD45.

[00105] As células imunes geradas de acordo com os presentes métodos têm muitos usos potenciais, incluindo usos experimentais e terapêuticos. Em particular, é previsto que tais populações de células serão extremamente úteis em supressão de respostas imunes indesejáveis ou inapropriadas. Em tais métodos, um número pequeno de células imunes é removido de um paciente e então manipulado e expandido ex vivo antes da sua reinfusão no paciente. Exemplos de doenças que podem ser tratadas dessa maneira são doenças e condições autoimunes em que atividade imune suprimida é desejável, por exemplo, para tolerância de alotransplante. Um método terapêutico compreenderia provisão de um mamífero, obtenção de células imunes a partir do mamífero; expansão das células imunes ex vivo de acordo com os métodos dos presentes métodos como acima descrito; e administração das células imunes expandidas ao mamífero a ser tratado.

[00106] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros agentes bem estabelecidos úteis para tratamento de câncer. Seja administrada sozinha ou em combinação com outros agentes, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por meio de várias vias e a vários sítios no corpo de um mamífero, particularmente humano, para obter um efeito particular. Um versado na técnica reconhecerá que, embora mais de uma via possa ser usada para administração, uma via particular pode prover uma reação mais imediata e mais eficaz do que uma outra via. Por exemplo, administração intradérmica pode ser vantajosamente usada com relação à inalação para o tratamento de melanoma. Administração local ou sistêmica pode ser realizada através da administração compreendendo aplicação ou instilação da formulação nas cavidades do corpo, inalação ou insuflação de um aerossol ou através de introdução parenteral, compreendendo administração intramuscular, intravenosa, intraportal, intraepática, peritoneal, subcutânea ou intradérmica.

[00107] Certas modalidades da presente invenção proveem métodos para tratamento ou prevenção de distúrbio imunomediado. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença autoimune. Exemplos não limitantes de doenças autoimunes incluem: alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, doença de Addison autoimune, doenças autoimunes da glândula adrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, dermatite herpetiforme celíaca, síndrome da disfunção imune em fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, doença por aglutininas a frio, doença de Crohn, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia- fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Grave, Guillain-Barre, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, trombocitopenia púrpura idiopática (ITP), neuropatia de IgA, artrite juvenil, líquen plano, lúpus eritematoso, doença de Meniere, doença mista do tecido conectivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo 1 ou imunomediada, miastenia grave, síndrome nefrótica (tal como doença de mudança mínima, glomeruloesclerose focal ou nefropatia membranosa), pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromas poliglandulares, polimialgina reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artrite reumatoide, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso, colite ulcerativa, uveíte, vasculitide (tais como poliarterite nodosa, arterite de takayasu, arterite temporal/arterite de célula gigante ou dermatite herpetiforme vasculite), vitiligo e granulomatose de Wegener. Portanto, alguns exemplos de uma doença autoimune que pode ser tratada usando os métodos revelados aqui incluem, mas não estão limitados a, esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes mellitus tipo I, doença de Crohn; colite ulcerativa, miastenia grave, glomerulonefrite, espondilite anquilosante, vasculite ou psoríase. O indivíduo pode ter um distúrbio alérgico tal como Asma.

[00108] Em ainda uma outra modalidade, o indivíduo é o recipiente de um órgão ou células-tronco transplantados e células imunes são usadas para prevenir e/ou tratar rejeição. Em modalidades particulares, o indivíduo tem ou está sob risco de desenvolver doença enxerto versus hospedeiro.

GVHD é uma complicação possível de qualquer transplante que usa ou contém células-tronco de um doador ou parente ou não parente.

Existem dois tipos de GVHD, aguda e crônica.

GVHD aguda aparece dentro dos primeiros três meses seguindo transplante.

Sinais de GVHD aguda incluem uma erupção cutânea avermelhada nas mãos e pés que pode se espalhar e se tornar mais grave, com pele com descamação e bolha.

GVHD aguda pode também afetar o estômago e intestinos, caso em que cólicas, náusea e diarreia estão presentes.

Amarelecimento da pele e olhos (icterícia) indica que GVHD aguda afetou o fígado.

GVHD crônica é classificada com base em sua severidade: estágio/grau 1 é leve; estágio/grau 4 é severa.

GVHD crônica se desenvolve três meses ou mais seguindo o transplante.

Os sintomas de GVHD crônica são similares àqueles de GVHD aguda, mas, ainda, GVHD crônica pode também afetar as glândulas mucosas nos olhos, glândulas salivares na boca e glândulas que lubrificam o revestimento do estômago e intestinos.

Qualquer uma das populações de células imunes reveladas aqui pode ser utilizada.

Exemplos de um órgão transplantado incluem um transplante de órgão sólido, tal como rim, fígado, pele, pâncreas, pulmão e/ou coração, ou transplante celular tais como ilhotas, hepatócitos, mioblastos, medula óssea ou hematopoiéticas ou outras células-tronco.

O transplante pode ser um transplante compósito, tais como tecidos da face.

Células imunes podem ser administradas antes do transplante, concomitantemente com o transplante ou seguindo o transplante.

Em algumas modalidades, as células imunes são administradas antes do transplante, tal como pelo menos 1 hora, pelo menos 12 horas, pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas ou pelo menos 1 mês antes do transplante.

Em um exemplo não limitante, específico, administração da quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes ocorre 3-5 dias antes do transplante.

[00109] Em certas modalidades, as células imunes são administradas em combinação com um segundo agente terapêutico. Por exemplo, o segundo agente terapêutico pode compreender células T, um agente imunomodulador, um anticorpo monoclonal ou um agente quimioterapêutico. Em exemplos não limitantes, o agente imunomodulador é lenolidomida, o anticorpo monoclonal é rituximabe, ofatumabe ou lumiliximabe e o agente quimioterapêutico é fludarabina ou ciclofosfamida.

[00110] Uma composição da presente invenção pode ser provida em forma de dosagem unitária em que cada unidade de dosagem, por exemplo, uma injeção, contém uma quantidade predeterminada da composição, sozinha ou em combinação apropriada com outros agentes ativos. O termo forma de dosagem unitária como usado aqui se refere unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitária para indivíduos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição da presente invenção, sozinha ou em combinação com outros agentes ativos, calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, em associação com um diluente, veículo ou veículo farmaceuticamente aceitável, onde apropriado. As especificações para as formas de dosagem unitárias novas da presente invenção dependem da farmacodinâmica particular associada com a composição farmacêutica no indivíduo particular.

[00111] Desejavelmente, uma quantidade eficaz ou número suficiente das células imunes transduzidas isoladas está presente na composição e introduzida no indivíduo de modo que respostas antitumor, específicas, de longo prazo, são estabelecidas para reduzir o tamanho de um tumor ou eliminar o crescimento ou novo crescimento do tumor que de outro modo resultaria na ausência de tal tratamento. Desejavelmente, a quantidade de células imunes reintroduzida nos indivíduos causa uma diminuição de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% em tamanho de tumor quando comparado com as mesmas condições em que as células imunes não estão presentes.

[00112] Desta maneira, a quantidade de células imunes administradas deve levar em conta a via de administração e deve ser tal de modo que um número suficiente das células imunes será introduzido de modo a obter a resposta terapêutica desejada. Ainda, as quantidades de cada agente ativo incluídas nas composições descritas aqui (por exemplo, a quantidade por cada célula a ser contatada ou a quantidade por certo peso corporal) podem variar em aplicações diferentes. Em geral, a concentração de células imunes deve ser desejavelmente suficiente para prover no indivíduo sendo tratado pelo menos de a partir de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 109 células imunes, ainda mais desejavelmente de a partir de cerca de 1 x 107 a cerca de 5 x 108 células munes, embora qualquer quantidade adequada possa ser utilizada ou acima, por exemplo, mais do que 5 x 108 células, ou abaixo, por exemplo, menos do que 1 x 107 células. O programa de dosagem pode ser baseado em terapias à base de célula bem estabelecidas (vide, por exemplo, Topalian e Rosenberg, 1987; Pat. U.S. No. 4.690.915) ou uma estratégia de infusão contínua alternada pode ser empregada.

[00113] Esses valores proveem orientação geral da faixa de células imunes a ser utilizada pelo praticante quando da otimização do método da presente invenção para prática da invenção. A menção aqui de tais faixas de modo algum preclude o uso de uma quantidade maior ou menor de um componente, como seria garantido em uma aplicação particular. Por exemplo, a dose e o programa reais podem variar dependendo de se as composições são administradas em combinação com outras composições farmacêuticas ou dependendo de diferenças interindividuais em farmacocinética, disposição de fármaco e metabolismo. Um versado na técnica pode fazer prontamente quaisquer ajustes necessários de acordo com as exigências da situação particular. VI. Kits

[00114] Em algumas modalidades, um kit que pode incluir, por exemplo, um ou mais meios e componentes para a produção de UAPCs e/ou células imunes é provido. Tais formulações podem compreender um coquetel de fatores, em uma forma adequada para combinação com APCs e/ou células imunes. O sistema reagente pode ser empacotado ou em meio aquoso ou em forma liofilizada, onde apropriado. Os meios recipientes dos kits incluirão geralmente pelo menos um frasco, tubo de teste, balão de vidro, garrafa, seringa ou outros meios recipientes, nos quais um componente pode ser posto e, preferivelmente, adequadamente separados em alíquotas. Onde houver mais de um componente no kit, o kit conterá geralmente um segundo, terceiro ou outro recipiente adicional no qual os componentes adicionais podem ser postos separadamente. No entanto, várias combinações de componentes podem ser compreendidas em um frasco. Os componentes do kit podem ser providos como pó(s) seco(s). Quando reagentes e/ou componentes são providos como um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. É imaginado que o solvente pode ser também provido em um outro meio recipiente. Os kits também incluirão tipicamente um meio para conter o(s) componente(s) do kit em confinamento fechado para escala comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes plásticos moldados por injeção ou sopro em que os frascos desejados são retidos. O kit pode também incluir instruções para uso, tal como em formato impresso ou eletrônico, tal como formato digital. VII. Exemplos

[00115] Os exemplos que seguem são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser compreendido por aqueles de habilidade na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que seguem representam técnicas constatadas pelo inventor funcionar bem na prática da invenção, e então podem ser consideradas constituir modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles de habilidade na técnica devem, à luz da presente invenção, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Exemplo 1 - Combinação de mbIL21, 4-1BBL e SLAM (CD48/CS1)

[00116] Células apresentadoras de antígeno universal (UAPCs) foram geradas através de transdução de células K562 com construtos retrovirais para IL-21 ligada à membrana e 41BBL (ligante CD137) ou com CD48-Katushka ou CS1-EGFP. Os mapas e anotações de construto retroviral de MMLV são mostrados nas FIGS. 4A-4D. O clone 46 (FIG. 3B) foi produzido a partir da expressão reforçada de mbIL-21 e 41BBL em APCs K562 sensíveis à célula NK (HLA-A-, HLA-B-) (FIG. 3A). UAPC foi gerada pela expressão reforçada de mbIL-1, 41BBL e CD48 nas células K562 (IFG. 3C). UAPC2 foi gerada através da expressão reforçada de mbIL-21, 41BBL e CS1 nas células K562 (FIG. 3D).

[00117] Expansão numérica de células NK foi realizada com ativação pelo clone 46, UAPC ou UAPC2. Proliferação e expansão de células NK por cocultura de AP mostraram que o Clone 46 era superior em sua estabilidade em expandir ambas células NK não transduzidas (NT-NK) e transduzidas com CAR (SG4-NK) comparado com o clone 9 anteriormente publicado (FIG. 2B).

[00118] Expansão de células NK através de cocultura com UAPC foi demonstrada ser superior em sua habilidade em reduzir o tempo de duplicação de célula NK para 31,38 horas comparado com o clone 9 anteriormente publicado (tempo de duplicação de 33 horas), provendo uma vantagem proliferativa de 44% (expansão de 1671 vezes para UPAC vs. expansão de 1161 vezes para clone 9) durante 2 semanas (FIG. 2E). A relação entre tempo de duplicação, razão de expansão e início de população celular é encapsulada pela fórmula que segue:

𝑇 𝑁 = 𝑁 𝑒 𝑇𝐷𝑙𝑛2 𝑓 𝑏 onde Nf é o número de célula final, Nb é a célula inicial, e=2,71828 (constante matemática também conhecida como número de Euler), T é o período de tempo de cultura em horas, TD é o tempo e duplicação em horas. O tempo de duplicação afeta o número de célula final de uma maneira exponencial, dessa maneira aumentando a vantagem proliferativa com relação ao período de cultura de célula designado, permitindo que números clinicamente relevantes de células sejam coletados em um prazo compactado. Portanto, os presentes métodos permitem a produção eficiente de células NK através de cocultura com as UAPCs.

[00119] A presente tecnologia de plataforma obtém vantagem de vias terapêuticas combinatoriais específicas para prover métodos práticos para a fabricação de números grandes de células NK altamente funcionais de grau clínico e citotóxicas pretendidas para imunoterapia para câncer. As células expandidas são células 100% NK, sem quaisquer células T detectáveis, evitando efeitos colaterais enxerto- versus-hospedeiro não intencionais comuns em muitas preparações celulares imunes. ***

[00120] Todos os métodos revelados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora as composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será aparente àqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou nas sequências de etapas do método descrito aqui sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes descritos aqui enquanto os mesmos resultados ou resultados similares sendo obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes àqueles são considerados estar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações apensas.

REFERÊNCIAS

[00121] As referências que seguem, até o ponto que elas provejam detalhes de procedimento ou outros exemplares suplementares àqueles mostrados aqui, são especificamente aqui incorporadas a título de referência. Czerkinsky e outros, J. Immunol. Methods 1988;110:29-36. Fast e outros, Transfusion 2004;44:282-5. He Y. e outros, Journal of immunology research. 2014;2014:7. Publicação Internacional No. PCT/US95/01570 Publicação Internacional No. WO2000/06588 Publicação Internacional No. WO2005/035570 Olsson e outros, J. Clin. Invest. 1990;86:981-985. Taitano e outros, The Journal of Immunology, 196, 2016. Patente U.S. No. 5,939,281 Patente U.S. No. 6,218,132 Patente U.S. No. 6,264,951 Patente U.S. No. 7,488,490 Publicação de Patente U.S. No. 2007/0078113

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula apresentadora de antígeno universal (UAPC), caracterizada pelo fato de ser engenheirada para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL).

2. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC expressa CD48.

3. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC expressa CS1.

4. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC expressa CD48 e CS1.

5. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC não tem essencialmente nenhuma expressão de moléculas da classe I, II de HLA ou CD1d endógenas.

6. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC expressa ICAM-1 (CD54) e LFA-3 (CD58).

7. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC é uma UAPC derivada de célula de leucemia.

8. UAPC de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a UAPC derivada de célula de leucemia é definida ainda como uma célula K562.

9. UAPC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a UAPC foi engenheirada através de transdução retroviral.

10. UAPC de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a transdução retroviral é definida ainda como uma transdução usando um construto viral de SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2.

11. UAPC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a UAPC é irradiada.

12. Método para expansão de células imunes, caracterizado pelo fato de que compreende cultura das células imunes na presença de uma quantidade eficaz de UAPCs como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes e UAPCs são culturadas em uma razão de 3:1 a 1:3.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes e UAPCs são culturadas em uma razão de 1:2.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a expansão é na presença de IL-2.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a IL-2 está presente em uma concentração de 10-500 U/mL.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a IL-2 está presente em uma concentração de 100-300 U/mL.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a IL-2 está presente em uma concentração de 200 U/mL.

19. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a IL-2 é IL-2 humana recombinante.

20. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a IL-2 é reposta a cada 2-3 dias.

21. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as UAPCs são adicionadas pelo menos uma segunda vez.

22. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células NK ou células T.

23. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células NK.

24. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células T.

25. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes são derivadas de sangue de cordão (CB), sangue periférico (PB), células-tronco ou medula óssea.

26. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são células-tronco pluripotentes induzidas.

27. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as células imunes são obtidas de CB.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o CB é agrupado de 2 ou mais unidades de sangue de cordão individuais.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o CB é agrupado de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 unidades de sangue de cordão individuais.

30. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as células NK são células mononucleares de CB (CBMCs).

31. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que células NK são definidas ainda como células NK CD56+.

32. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em meio livre de soro.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 32, caracterizado pelo fato de que as células imunes são engenheiradas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR).

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno humanizado.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno CD19, CD123, mesotelina, CD5, CD47, CLL-1, CD33, CD99, U5snRNP200, CD200, CS1, BAFF-R, ROR-1 ou BCMA.

36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno CD19 ou CD123.

37. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende IL-15.

38. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende um gene suicida.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o gene suicida é CD20, CD52, EGFRv3 ou caspase 9 induzível.

40. População de células imunes expandidas, caracterizada pelo fato de que são produzidas de acordo com os métodos como definidos em qualquer uma das reivindicações 12 a 39.

41. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a população de células imunes expandidas como definida na reivindicação 40 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

42. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz das células imunes expandidas como definidas na reivindicação 40 para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

43. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz das células imunes expandidas como definidas na reivindicação 40 ao indivíduo.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é um câncer, inflamação, doença enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, um distúrbio autoimune, uma doença de imunodeficiência, um mal de célula B ou uma infecção.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma leucemia.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a leucemia é uma leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielógena aguda (AML) ou leucemia mielógena crônica (CML).

47. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células imunes são alogeneicas.

48. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células imunes são autólogas.

49. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células NK ou células T.

50. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células imunes são células NK.

51. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é doença enxerto versus hospedeiro (GVHD).

52. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, artrite reumatoide, diabetes tipo I, lúpus eritematoso sistêmico, hipersensibilidade de contato, asma e síndrome de Sjogren.

53. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

54. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administração de pelo menos um segundo agente terapêutico.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um segundo agente terapêutico é uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anticâncer, agente imunomodulador ou um agente imunossupressor.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o agente anticâncer é quimioterapia, radioterapia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia antiangiogênica ou imunoterapia.

57. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o agente imunossupressor é um inibidor de calcineurina, um inibidor de mTOR, um anticorpo, uma irradiação de agente quimioterapêutico, uma quimiocina, uma interleucina ou um inibidor de quimiocina ou uma interleucina.

58. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as células imunes e/ou o pelo menos um segundo agente terapêutico é administrado intravenosamente, intraperitonealmente, intratraquealmente, intratumoralmente, intramuscularmente, endoscopicamente, intralesionalmente, percutaneamente, subcutaneamente, regionalmente ou através de injeção ou perfusão direta.

59. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um anticorpo.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, biespecífico ou triespecífico.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é rituximabe.

Célula-alvo Célula NK

Petição 870200123113, de 30/09/2020, pág. 59/78 Desconhecido

FcR gama assassina

Desconhecido Receptores de imunoglobulina

Desconhecido 1/15

Desconhecido

BAG6 solúvel FcR gama Exossoma de BAG6 naturais

HA viral

HA viral FcR gama Receptores citotóxicos

Receptores Nectina de NKG2

(Continuação) CD113/Nectina-3

CD111/Nectina-1 CD112/Nectina-2

CD112/Nectina-2

Petição 870200123113, de 30/09/2020, pág. 61/78 CD16/Fc gama RIIIA FcR gama CD100/Semaforina 4D

CLASSE I HLA E-, N-, R- Caderinas 3/15 Colágeno Ácido Siálico (Continuação)

Razão de expansão de Células NK

Fresca + Fresca + Fresca + IL-2 APC APC

Fresca + IL-2 Fresca + APC Congelada + APC Expansão de Célula NK, x106

Dias

Petição 870200123113, de 30/09/2020, pág. 63/78 Dias 0 Dias 7 Dias 14 5/15

Razão de NK absoluta produzida Cd3 absoluta aumento (x10e6) (x 10e6) de NK

NT-NK Estimulada com Clone9

SG4-NK Estimulada com

Petição 870200123113, de 30/09/2020, pág. 64/78 Clnoe9 6/15

Cell Numbers (1x10e6) Dia3 Dia9 Dia16 Dias em Cultura

Cinéticas de Crescimento de Célula NK

Dias Clone9

Origem de rep ori

Ligante

Origem de rep ori

Ligante

Parada