CN113025575B - 一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法 - Google Patents

一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法。步骤S1：将新鲜的人胰腺癌标本用清洗液冲洗，机械剪碎；步骤S2：机械剪碎后的组织碎块进行酶消化；步骤S3：将酶消化后的组织碎块进行无酶消化，收集上清，离心后得到胰腺癌单细胞沉淀；步骤S4：将步骤S3得到的胰腺癌单细胞与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养。本发明采用机械剪碎‑酶消化‑无酶消化依次处理同一份胰腺癌标本，分离出类器官产率极佳的单细胞和细胞团块，提高了胰腺癌标本的利用率，保证了接种的胰腺癌细胞的数量和活性，较短的培养时间内获得满足高通量临床药筛要求的类器官数量，为类器官的临床转化打下了坚实的基础。

Description

一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法。
背景技术
癌症是一种极其复杂的疾病，在过去的几十年里，人们对部分类型癌症的基础科学研究取得了一些实质进展，但是应用至临床实际治疗时仍存在或多或少的问题。人们也已逐渐认识到，基础科学研究到临床实际治疗的转化成了发展新肿瘤治疗方案的主要障碍之一。这主要是因为许多肿瘤模型仅仅对肿瘤组织进行了大体概括，无法很好地维持肿瘤细胞的高度异质性，从而使许多在传统癌症模型中有效的药物在临床试验中无法得到验证。
传统的二维（2D）细胞培养在建立基础肿瘤生物学研究中发挥了重要作用，并且由于其具有广泛的可用性、易操作性、可重复性和低成本等优点而被常规使用。但是从原发肿瘤标本中生成2D细胞模型的方法效率极低，容易发生优势克隆选择，在体外扩增数代之后会发生大量且不可预测的遗传变化，丧失原始肿瘤的遗传异质性，因而临床相关性较低。相比之下，患者来源的异种移植（PDX）模型是通过手术方式从癌症患者病灶处取下来小块肿瘤，植入高度免疫缺陷的小鼠中，得到的模型更能体现临床上肿瘤的复杂性，其在传代过程中保留了肿瘤异质性和基因组稳定性，并且可以在体内重现复杂的癌症-基质相互作用。但是该方法具有成本高，周期长，成功率低等问题，移植的肿瘤可能发生小鼠特异性进化，无法充分地反映癌症患者的致病过程，并且不适合高通量药物筛选。
肿瘤类器官是通过原发癌细胞的三维（3D）培养产生的，在结构以及功能上高度模拟人体器官。其遗传稳定性高，即使经过多次传代，也能很好地再现亲本肿瘤的形态和遗传/表观遗传学特征；其具有高度的临床相关性，为建立具有相关临床材料的大型生物库提供了良好的契机。此外，肿瘤类器官可在短时间内进行高通量药敏检测，可以为一些恶性程度高、进展快的肿瘤（如胰腺癌）的个性化用药参考赢得宝贵时间。但是肿瘤类器官作为新型的药筛模型，培养的成本虽然较PDX低，但仍然远高于细胞系。主要是由于培养过程所用的基质胶（Matrigel）成本占比比较高。另外，相比于其他肿瘤，胰腺癌手术标本量少且标本中包含90%以上的基质成分，使得胰腺癌细胞难以分离，有效癌细胞数量较少，因而胰腺癌类器官培养成功率比其他的肿瘤更低，并且胰腺癌类器官密度在早期往往达不到高通量药筛的标准，阻碍了临床药筛的早期开展。
综上，亟待提供一种既能提高培养成功率又能降低成本的胰腺癌组织类器官模型的构建方法。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，从而提高胰腺癌标本的利用率以及提高接种的胰腺癌细胞的数量和活性，培养出满足高通量临床药筛要求的类器官数量，并降低胰腺癌组织类器官的培养成本。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1：将新鲜的人胰腺癌标本用清洗液冲洗，机械剪碎；
步骤S2：机械剪碎后的组织碎块进行酶消化；
步骤S3：将酶消化后的组织碎块进行无酶消化，收集上清，离心后得到胰腺癌单细胞沉淀；
步骤S4：将步骤S3得到的胰腺癌单细胞与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，机械剪碎后用基础培养基重悬，经100μm滤网过滤得到的滤液再经20μm滤网过滤，得到滤渣为细胞团块，将细胞团块与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，酶消化采用的酶消化液为含有2.5~5mg/mL胶原酶II，10~100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基。
优选的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，酶消化采用的酶消化液为含有5mg/mL胶原酶II，100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，酶消化的条件为37℃，40~50rpm，20~30min，消化1次。
优选的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，酶消化的条件为37℃，45rpm，20~30min，消化1次。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，无酶消化采用的无酶消化液为Gentle Cell Dissociation Reagent。
优选的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，无酶消化液中含有10.5μM Y-27632。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，无酶消化为加入无酶消化液后在37℃下消化10~20min，其中每消化5min吹打10~20下后继续消化，消化10~20min后吸取上清。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，无酶消化步骤重复2~3次。
优选的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，无酶消化的条件为加入无酶消化液后在37℃下消化15min，其中每消化5min吹打15下后继续消化，消化15min后吸取上清一；然后对剩余组织再加入无酶消化液在37℃下消化15min，其中每消化5min吹打15下后继续消化，消化15min后吸取上清二。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，所述清洗液为含有青霉素链霉素混合液的PBS或含有青霉素链霉素混合液和两性霉素的PBS；优选为含有1×青霉素链霉素混合液和1μg/mL两性霉素的PBS；更优选为含有1×青霉素链霉素混合液和1μg/mL两性霉素的基础培养基。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，所述基础培养基为含有15mM HEPES，1×GlutaMAX Supplement, 100μg/ml Primocin和 1% (w/v) BSA的DMEM/F12。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，所述完全培养基为含有10mM HEPES，1×GlutaMAX Supplement, 100μg/mL Primocin, 20ng/mL Wnt-3a,50ng/mL R-spondin1, 100ng/mL hNoggin, 50ng/mL hEGF, 100ng/mL hFGF10, 10nMhGastrin I, 1μM PGE2, 1.25mM N-acetylcysteine, 10mM Nicotinamide, 1×B27supplement, 500nM A83-01, 10.5μM Y27632的Advanced DMEM/F12。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，基质材料的用量按照每4~6×104个胰腺癌单细胞配比50μL的基质材料计算。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，所述基质材料由包括I型胶原、10×PBS、NaOH溶液的组分混合制成；所述基质材料的蛋白浓度为2.5~3.5mg/mL，pH为7.0~8.0。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，I型胶原、10×PBS、NaOH溶液的体积计算方法为：
I型胶原的体积VI=V×C/CI；
10×PBS的体积VPBS= V/10；
1M NaOH溶液的体积VNaOH= VI ×0.023；
其中，V为配置基质材料的体积、C为配制基质材料的蛋白浓度、CI为所用I型胶原的蛋白浓度。
进一步的，在上述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中，所述基质材料可以通过添加双蒸水调整基质材料的蛋白浓度。
本发明的有益效果为：
（一）本发明采用了机械剪碎-酶消化-无酶消化三联法依次处理同一份胰腺癌标本，通过机械剪碎从基质丰富的胰腺癌标本中分离出类器官发育速度较快的细胞团块，细胞团块可发育成良好的类器官模型；然后对机械剪碎后的组织碎块进一步酶消化和无酶消化，分离出类器官产率极佳的单细胞，最大限度地降低了对胰腺癌标本取材的要求，提高了胰腺癌标本的利用率，保证了接种的胰腺癌细胞的数量和活性，能在较短的培养时间内获得满足高通量临床药筛要求的类器官数量，为类器官的临床转化打下坚实的基础。
（二）本发明提供的类器官培养基质材料制备过程简单，无需过夜化冻，现配现用，耗时少，可在1.5h内完成胰腺癌细胞的接种；同时，可根据类器官生长需要调节类器官培养基质材料的硬度；基质材料的组分简单，成本远低于现有技术中常用的Matrigel，减少了对成本较高试剂的消耗。并且采用本发明提供的基质材料培养类器官增殖水平高于Matrigel组。本发明提供的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法对不同类型的胰腺癌标本适用性强，成功率高。
附图说明
图1为4倍物镜视野下的人胰腺癌类器官光学显微镜图；其中图1-1为本发明实施例1机械剪碎后得到的细胞团块培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图1-2为本发明实施例1获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图1-3为本发明实施例3获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图。
图2为10倍物镜视野下的人胰腺癌类器官光学显微镜图；其中图2-1为本发明实施例1机械剪碎后得到的细胞团块培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图2-2为本发明实施例1获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图2-3为本发明实施例3获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图。
图3为本发明对比例1培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图，其中4-1为4倍物镜下视野，4-2为10倍物镜下视野；
图4是本发明对比例3培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图，其中5-1为4倍物镜下视野，5-2为10倍物镜下视野；
图5是本发明实施例3和对比例3培养得到的胰腺癌类器官增殖水平对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例采用的100×青霉素链霉素混合液购自HyClone公司。
本发明实施例采用的两性霉素购自北京雷根生物技术有限公司。
本发明实施例采用的DMEM/F12购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的HEPES 购自GIBCO公司。
本发明实施例采用的GlutaMAX Supplement购自GIBCO公司。
本发明实施例采用的Primocin购自InvivoGen公司。
本发明实施例采用的BSA购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Wnt-3a购自PeproTech公司。
本发明实施例采用的R-spondin1购自PeproTech公司。
本发明实施例采用的hNoggin购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的hEGF购自PeproTech公司。
本发明实施例采用的hFGF10购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的hGastrin I购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的PGE2购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Nicotinamide购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的B27 supplement购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的A83-01购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的Y27632购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的Advanced DMEM/F12购自Thermo Fisher Scientific公司。
本发明实施例采用的胶原酶II购自Worthington公司。
本发明实施例采用的DNase I购自Roche公司。
本发明实施例采用的Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) 购自Stemcell公司。
本发明实施例采用的I型胶原购自Corning公司。
本发明实施例采用的Matrigel购自Corning公司。
本发明实施例采用的alamarBlue试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1：将新鲜的人胰腺癌标本用清洗液冲洗，机械剪碎；
具体为将人胰腺癌标本转入15mL离心管中，用5mL预冷的清洗液震荡洗涤30秒，弃上清，重新加入5mL预冷的清洗液洗涤，重复3次。然后在预冷的1.5mL EP管中用已高压蒸汽灭菌的直剪将标本剪碎至1mm3左右的组织碎块，用预冷的基础培养基重悬组织碎块，吸取上清液至预冷的15mL离心管中，重悬3次；
将3次吸取的上清液经100μm滤网过滤，得到的滤液再经20μm滤网过滤，得到滤渣，用5mL 预冷的基础培养基重悬滤渣。将重悬的滤渣在4℃，200g离心5min；弃上清，得到细胞团块沉淀，置于冰上。
37℃过夜预热24孔板，将基质材料与细胞团块充分混匀，以每孔50μL 接种于24孔板中央区域，静置2min，于37℃细胞培养箱中放置约30min，待充分凝固后, 每孔加入500μL预热的完全培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
步骤S2：机械剪碎后的组织碎块进行酶消化；
具体为将机械剪碎后的组织碎块转入装有5mL 37℃预热的酶消化液的15mL 离心管中，其中酶消化液为含有5mg/mL胶原酶II，100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基；在37℃，45rpm，震荡消化20min；待大部分胰腺癌组织碎块四周明显毛糙，加入5mL预冷的基础培养基终止消化。
步骤S3：将酶消化后的组织碎块进行无酶消化，收集上清，离心后得到胰腺癌单细胞沉淀；
具体为将步骤S2中酶消化后的组织碎块加入5mL GCDR（Gentle CellDissociation Reagent）于37℃水浴下消化15min，其中每消化5min后吹打15下继续水浴；消化15min后收集上清一于15mL离心管中；对剩余的组织碎块再加入5mL GCDR于37℃水浴下消化15min，其中每消化5min后吹打15下继续水浴；消化15min后收集上清二于15mL离心管中；将上清一与上清二合并，于4℃，300g离心5min，弃上清，加入5mL基础培养基清洗一遍，按相同条件离心得到胰腺癌单细胞沉淀。（为了提高单细胞活性，避免上清一中的细胞搁置过久，在第二次无酶消化期间，即可对上清一进行清洗离心，并将得到的第一部分胰腺癌单细胞进行接种。第二次无酶消化过程得到的第二部分胰腺癌单细胞另外进行接种。两次获得的胰腺癌单细胞培养得到的类器官并无明显差别。）
步骤S4：将步骤S3得到的胰腺癌单细胞与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养。
具体为37℃过夜预热24孔板，将基质材料与步骤S3中得到的胰腺癌单细胞沉淀充分混匀，以每孔50μL 接种于24孔板中央区域，静置2min，于37℃细胞培养箱中放置约30min，待充分凝固后, 每孔加入500μL预热的完全培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
本实施例中所用基质材料为Matrigel，在4℃冰上过夜化冻;
本实施例中所用的清洗液为含有1×青霉素链霉素混合液和1μg/mL两性霉素的基础培养基。
本实施例中所用的基础培养基为含有15mM HEPES，1×GlutaMAX Supplement,100μg/mL Primocin和 1% (w/v) BSA的DMEM/F12。
本实施例中所用的完全培养基为含有10mM HEPES，1×GlutaMAX Supplement,100μg/mL Primocin, 20ng/mL Wnt-3a, 50ng/mL R-spondin1, 100ng/mL hNoggin,50ng/mL hEGF, 100ng/mL hFGF10, 10nM hGastrin I, 1μM PGE2, 1.25mM N-acetylcysteine, 10mM Nicotinamide, 1×B27 supplement, 500nM A83-01, 10.5μMY27632的Advanced DMEM/F12。
实施例2
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，与实施例1不同之处在于，实施例2中所用酶消化液为含有2.5mg/mL胶原酶II，100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基，步骤S2中震荡消化30min，其余步骤及胰腺癌标本来源均与实施例1相同。
实施例3
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，与实施例1不同之处在于，实施例3中胰腺癌标本来源于不同的病人，实施例3中所用基质材料现配现用，无需过夜化冻；实施例3中所用基质材料由I型胶原、10×PBS、NaOH溶液混合制成；本实施例中购买的I型胶原蛋白浓度CI为3.17 mg/mL；本实施例中配置的基质材料体积V=511.5μL；所得基质材料的蛋白浓度C为2.79mg/mL；
I型胶原、10×PBS、NaOH溶液的体积计算方法为：
I型胶原的体积VI=V×C/CI；
10×PBS的体积VPBS= V/10；
1M NaOH溶液的体积VNaOH= VI ×0.023；
按照上述计算方式，分别需要51.15μL 10xPBS和10.35μL的1M NaOH溶液。本申请中，10xPBS与1M NaOH溶液先混合成中和液，可长期置于4°储存。为了方便制备以及减小吸取误差，可将10xPBS和1M NaOH溶液按照所需配制的体积比例放大配制。本实施例中将1023μL 10×PBS和207μL 1M NaOH溶液配置1230μL的中和液。取中和液61.5μL与450μL I型胶原充分混匀，得到蛋白浓度为2.79mg/mL，pH约为7.5的培养基质材料。
对比例1
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1：将新鲜的人胰腺癌标本用清洗液冲洗，机械剪碎；
具体为将人胰腺癌标本转入15mL离心管中，用5mL预冷的清洗液震荡洗涤30秒，弃上清，重新加入5mL预冷的清洗液洗涤，重复3次。然后在预冷的1.5mL EP管中用已高压蒸汽灭菌的直剪将标本剪碎至1mm3左右的组织碎块，用预冷的基础培养基重悬组织，吸取上清至预冷的15mL离心管中，重悬3次；
将3次吸取的上清液经100μm滤网过滤，得到的滤液再经20μm滤网过滤，得到滤渣，用5mL 预冷基础培养基重悬滤渣。将重悬的滤渣在4℃，200g离心5min；弃上清，得到细胞团块沉淀，置于冰上。
37℃过夜预热24孔板，将基质材料与细胞团块充分混匀，以每孔50μL 接种于24孔板中央区域，静置2min，于37℃细胞培养箱中放置约30min，待充分凝固后, 每孔加入500μL预热的完全培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
步骤S2：机械剪碎后的组织碎块进行第一次酶消化；
具体为将机械剪碎后的组织碎块转入装有5mL 37℃预热的酶消化液的15mL 离心管中，其中酶消化液为含有5mg/mL胶原酶II，100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基；在37℃，45rpm，震荡消化20min；加入5mL预冷的基础培养基终止消化。
收集上清经70μm的滤网过滤，收集滤液。将滤液于4℃，200g离心5min，弃上清，用5mL预冷的基础培养基洗涤后离心，将沉淀再次洗涤后离心，以清除残余的胶原酶II，得到的细胞沉淀一。用2mL基础培养基重悬细胞沉淀一，得到细胞悬液一，置于冰上。
步骤S3：第二次酶消化：将第一次酶消化后的组织碎块重复进行步骤S2操作处理，得到细胞沉淀二。用2mL基础培养基重悬，得到细胞悬液二，将细胞悬液一与细胞悬液二合并，4℃，200g离心5min，得到胰腺癌单细胞沉淀。
步骤S4：将胰腺癌单细胞沉淀与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养。具体步骤同实施例1。
对比例1中所用基质材料、清洗液、基础培养基、完全培养基及胰腺癌标本来源均与实施例1相同。
对比例2
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，与对比例1不同之处在于，对比例2中所用酶消化液为含有2.5mg/mL胶原酶II，100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基，步骤S2中震荡消化30min，其余步骤及胰腺癌标本来源均与对比例1相同。
对比例3
一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，所述方法步骤与实施例1相同，不同之处在于对比例3中的胰腺癌组织来源不同，对比例3中的胰腺癌组织与实施例3的胰腺癌组织来源相同。
数据说明
一、胰腺癌细胞团块的培养
将实施例1步骤S1得到的细胞团块培养2天后置于显微镜下观察，如图1-1和图2-1所示。由图1-1和图2-1可知，本发明提供的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法中步骤S1可以分离出类器官发育速度较快的细胞团块。而现有技术的研究中，忽略了细胞团块的作用，仅是对胰腺癌单细胞进行培养得到类器官。对于手术标本量少且有效癌细胞数量较少的胰腺癌组织，本申请提供的细胞团块和单细胞均可以较好地培养成胰腺癌类器官，提高类器官的培养数量。
二、胰腺癌单细胞细胞数量对比
将实施例1步骤S3中得到的胰腺癌单细胞、实施例2步骤S3中得到的胰腺癌单细胞、对比例1中步骤S3中得到的胰腺癌单细胞、对比例2中步骤S3中得到的胰腺癌单细胞分别进行计数和活性检测，检测结果如表1所示。
表1
组别 活细胞数量 细胞数量 活细胞比例
实施例1 2.29×10<sup>6</sup> 2.50×10<sup>6</sup> 92%
对比例1 1.42×10<sup>6</sup> 2.70×10<sup>6</sup> 53%
实施例2 3.08×10<sup>6</sup> 3.82×10<sup>6</sup> 81%
对比例2 5.45×10<sup>5</sup> 8.68×10<sup>5</sup> 63%
由表1可知，在经过酶消化处理后，采用无酶消化处理得到的胰腺癌单细胞数量和活细胞数量均较高，显著的提高了胰腺癌单细胞的活细胞比例。
三、胰腺癌单细胞培养类器官对比
3.1形态对比
按照实施例1、实施例3、对比例1、对比例3方法培养4天后进行观察。图1-2为4倍物镜视野下本发明实施例1获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图1-3为4倍物镜视野下本发明实施例3获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图2-2为10倍物镜视野下本发明实施例1获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图；图2-3为10倍物镜视野下本发明实施例3获得的胰腺癌单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图。图3为本发明对比例1获得的单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图，其中图3-1为4倍物镜下视野，图3-2为10倍物镜下视野。图4为本发明对比例3获得的单细胞培养得到的人胰腺癌类器官光学显微镜图，其中图4-1为4倍物镜下视野，图4-2为10倍物镜下视野。
对比可知，相对于仅采用机械剪碎和酶消化处理，本发明采用的机械剪碎-酶消化-无酶消化三联法得到的单细胞培养出的类器官形态更好，发育更好。相对于Matrigel培养的类器官，采用本发明制备的基质材料培养的类器官更大，发育更好。
3.2数量对比
将实施例3和对比例3得到的胰腺癌单细胞传代至第二天，分别用alamarBlue试剂盒检测细胞增殖，结果如图5所示。本发明实施例3的基质材料更利于细胞增殖，对比例3中Matrigel培养得到的人胰腺癌类器官增殖水平与本发明实施例3具有统计学差异（P<0.05）。
此外，本院在采用实施例3中提供的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法对临床获得的不同的胰腺癌组织标本进行处理，不论标本的质地和大小，均可以培养出良好的胰腺癌组织类器官，成功率极高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：将新鲜的人胰腺癌标本用清洗液冲洗，机械剪碎；
步骤S2：机械剪碎后的组织碎块进行酶消化；
步骤S3：将酶消化后的组织碎块进行无酶消化，收集上清，离心后得到胰腺癌单细胞沉淀；无酶消化为加入无酶消化液后在37℃下消化10~20min，其中每消化5min吹打10~20下后继续消化，消化10~20min后吸取上清；
步骤S4：将步骤S3得到的胰腺癌单细胞与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养；所述基质材料由包括I型胶原、10×PBS、NaOH溶液的组分混合制成；所述基质材料的蛋白浓度为2.5~3.5mg/mL，pH为7.0~8.0。
2.根据权利要求1所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，机械剪碎后用基础培养基重悬，经100μm滤网过滤得到的滤液再经20μm滤网过滤，得到滤渣为细胞团块，将细胞团块与基质材料充分混匀，种胶滴，加入完全培养基进行培养。
3.根据权利要求1所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，酶消化采用的酶消化液为含有2.5~5mg/mL胶原酶II，10~100μg/mL DNase I和10.5μM Y-27632的基础培养基。
4.根据权利要求1所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，酶消化的条件为37℃，40~50rpm，20~30min，消化1次。
5.根据权利要求1所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，无酶消化采用的无酶消化液为Gentle Cell Dissociation Reagent。
6.根据权利要求5所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，无酶消化液中含有10.5μM Y-27632。
7.根据权利要求2~3任意一项所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，所述基础培养基为含有15mM HEPES，1×GlutaMAX Supplement, 100μg/mL Primocin和1% (w/v) BSA的DMEM/F12。
8.根据权利要求1~6任意一项所述的人胰腺癌组织类器官模型的构建方法，其特征在于，所述完全培养基为含有10mM HEPES，1×GlutaMAX Supplement, 100μg/mL Primocin,20ng/mL Wnt-3a, 50ng/mL R-spondin1, 100ng/mL hNoggin, 50ng/mL hEGF, 100ng/mLhFGF10, 10nM hGastrin I, 1μM PGE2, 1.25mM N-acetylcysteine, 10mMNicotinamide, 1×B27 supplement, 500nM A83-01, 10.5μM Y27632的Advanced DMEM/F12。
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