KR20230058544A - 임상 제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일부 양태는 최대 48시간 또는 그 이상 보관 동안 세포 및 조직의 생존력, 재평판배양 효율, 및 재증식 능력을 지원하는 임상 배지를 제공한다. 본원에 제공된 임상 배지는 또한 임상 세척에 유용하다. 본원에 제공된 바와 같은 세포 집단 또는 조직 및 임상 배지를 포함하는 세포 또는 조직 조제물은 또한 이러한 조제물을 생성하는 방법과 같이 제공된다. 예를 들어, 세포 또는 조직의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하기 위하여, 본원에 제공된 임상 배지 및 세포 및 조직 조제물을 사용하는 방법이 또한 개시된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2015년 8월 18일에 출원된 "임상 제제"라는 명칭의 미국 가출원 제62/206,821호의 35 U.S.C.§ 119(e) 하에 우선권을 주장하며, 이 전체 내용은 참조로 본원에 포함되어 있다.
이식용 세포 및 조직의 보관 및 운반에 사용되는 현재 이용가능한 임상 배지는 비교적 짧은 기간(예컨대, 최대 4-6시간) 이후까지 세포 생존력 및 기능을 지원하지 않으며, 짧은 보관 기간 중에도 세포, 및 세포 기능의 유의한 손실이 흔히 관찰된다. 또한, 중탄산염 음이온을 포함하는 현재의 임상 배지는 가열 멸균을 견딜 수 없고 주위 온도에서 보관 중에도 종종 탄소 염 침전을 형성하여, 짧은 유효 기간(shelf life)을 초래한다.
다양한 의료 절차는, 예컨대 수술실의 세척(irrigation), 상처 세정, 수술후 유착 방지, 및 수술실로부터 파편 제거를 위해, 임상 용액의 사용에 의존한다. 세포 또는 조직 착상 또는 이식의 맥락에서, 임상 용액은 세포 또는 조직을 제제화하는데 사용되고, 제제화 후 대상에게 투여할 때까지 세포 또는 조직을 보관하는데 사용되며, 투여 동안, 예컨대, 세포 또는 조직의 주사 동안, 세포 또는 조직 구조물을 운반하는 배지로서 사용된다. 임상 문맥에서, 예컨대 세척, 상처 세정, 주사 등의 동안에 세포 또는 조직과 접촉되는 용액은 전형적으로 멸균이고, 발열원이 없으며, 생리학적 pH로 완충되고, 생리학적 삼투압몰농도를 나타낸다.
민감한 세포 또는 조직에 대한 외상을 예방하기 위해 수술 동안 사용하기 위한 현재 이용가능한 수술용 세척 용액과 연관된 한 가지 문제점은 완충화제로서 중탄산염 음이온과 함께 상기 중탄산염 음이온과 침전물을 형성할 수 있는 염, 예를 들어, 전형적으로 약제학적 부형제로서 사용되는 칼슘 및 마그네슘의 실질적으로 모든 이온 염을 사용하는 것이다. 탄산염의 형성 및 이후의 침전은 중탄산염 및 칼슘 및/또는 마그네슘을 함유하는 용액이 가열 멸균될 때 빠르게 일어날 수 있고, 또한 주위 보관 조건에서 시간이 지남에 따라 종종 일어날 수 있다.
침전 문제의 한 가지 가능한 해법은 하나의 부분은 중탄산염 완충제를 함유하고 다른 부분은 칼슘 및/또는 마그네슘 염을 함유하는 2-부분 키트로서 수술 세척 용액을 제공하는 것이다. 상기 부분들은 전형적으로 사용하기 직전에 혼합되어 단일 용액을 형성한다. 이러한 2-부분 용액의 사용은 2개의 개별 용액을 제조해야 하는 요건, 혼합 오류의 위험을 나타내는 불편한 혼합 단계, 및 혼합된 용액의 전형적으로 짧은 반감기를 포함하는, 몇 가지 단점과 연관된다. 따라서, 1-부분 세척 용액이 유리할 것이며 매우 바람직하다.
1-부분 세척 용액을 제조하기 위한 시도가 있었다. 예컨대, 유럽 특허 출원 EP 1067907 B1(Armitage)을 참조한다. 이러한 시도는 전형적으로 상기 논의된 탄산염 침전 문제점을 방지하기 위해, 양쪽성이온 유기 완충제, 예컨대 일반적으로 HEPES로 지칭되는 N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)의 사용에 의존하였다. 그러나, 이러한 1-부분 세척 용액에서 사용되는 양쪽성이온 유기 완충제는 전형적으로 세포 또는 조직 배양 배지와 양립가능하지 않으므로, 세포 보관 동안 침전물 형성의 문제점에 대해 광범위하게 적용가능한 해법을 제공하지 못한다.
상기 언급된 바와 같은 침전물 형성 및 일반적인 세포 배양 성분과의 비양립가능성의 문제 외에도, 일반적으로 사용되는 수술 세척 용액은 또한 전형적으로 증기 멸균을 견딜 수 없는 성분, 예컨대, 특정 탄수화물 또는 글루타티온 이황화물(GSSG)의 조합을 포함한다.
이전에 개발된 1-부분 세척 용액과 달리, 본 발명은 양쪽성이온 유기 완충제의 사용을 필요로 하지 않는 1-부분 용액을 제공한다. 본 발명의 안정화된 세척 용액은 현재의 세척 용액의 침전 및 연관된 짧은 유효 기간의 문제점을 해결한다. 본원에 제공된 용액은 현재 이용가능한 용액과 비교하여 유효 기간을 크게 개선하였다.
본원에 제공된 용액은 세척, 세포 재구성(예컨대, 동결보존되거나 펠렛화된 세포의 재구성), 세포 보관(예컨대, 선적 또는 이식을 위해 제제화 후), 운반, 및/또는 대상에 세포의 투여(예컨대, 세포 착상 또는 이식의 맥락에서)를 위해 사용된다. 본원에 제공된 용액은 상이한 세포 유형 및 상이한 투여 부위와 관련하여 사용될 수 있다. 안과적 적용이 바람직하지만, 다른 적용이 또한 고려되며 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명의 일부 양태는 세포 재구성, 보관, 운반, 및/또는 대상에 투여를 위한 용액을 제공한다. 일부 구현예에서, 용액은 (a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제; 및 (b) 적어도 2 mM 글루코스; 및 (c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 2-150 mM, 예컨대, 5-150 mM, 10-150 mM, 15-150 mM, 2-100 mM, 2-50 mM, 5-30 mM, 10-100 mM, 10-50 mM, 10-30 mM, 10-20 mM, 12-18 mM, 14-17 mM, 15-17 또는 16-17 mM 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 2.5 mM, 적어도 3 mM, 적어도 5 mM, 적어도 7.5 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 또는 적어도 30 mM 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루코스는 덱스트로스로 구성되거나 덱스트로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 2.5 mM, 적어도 3 mM, 적어도 5 mM, 적어도 6 mM, 적어도 7.5 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 또는 적어도 30 mM 덱스트로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 0.03%(w/v), 적어도 0.05%(w/v), 적어도 0.1%(w/v), 적어도 0.125%(w/v), 적어도 0.15%(w/v), 적어도 0.175%(w/v), 적어도 0.2%(w/v), 적어도 0.225%(w/v), 적어도 0.25%(w/v), 적어도 0.275%(w/v), 적어도 0.28%(w/v), 적어도 0.29%(w/v), 적어도 0.3%(w/v), 적어도 0.35%(w/v), 적어도 0.4%(w/v), 적어도 0.45%(w/v), 적어도 0.5%(w/v), 적어도 0.55%(w/v), 적어도 0.6%(w/v), 적어도 0.65%(w/v), 적어도 0.7%(w/v), 적어도 0.75%(w/v), 적어도 0.8%(w/v), 적어도 0.9%(w/v), 적어도 1%(w/v), 적어도 1.25%(w/v), 적어도 1.5%(w/v), 적어도 1.75%(w/v), 적어도 2%(w/v), 적어도 2.125%(w/v), 적어도 2.5%(w/v), 적어도 2.75%(w/v), 또는 적어도 3%(w/v) 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 2가 양이온의 공급원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온은 칼슘 및/또는 마그네슘 양이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 칼슘 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 칼슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산염 완충제 및/또는 구연산염 완충제를 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 세포 재구성, 보관, 운반, 및/또는 대상에 투여를 위한 용액을 제공하며, 용액은 (a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제; 및 (b) 글루코스; 및 (c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제; 및 (d) 2가 양이온의 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 칼슘 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산염 및/또는 구연산염 완충제를 포함한다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 글루코스는 D-글루코스(덱스트로스)이다. 일부 구현예에서, 글루코스의 농도는 5-50 mM이다. 일부 구현예에서, 글루코스의 농도는 10-25 mM이다. 일부 구현예에서, 글루코스의 농도는 10-20 mM이다. 일부 구현예에서, 글루코스의 농도는 약 10 mM, 약, 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 또는 약 20 mM이다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 2가 양이온의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 약제학적으로 허용가능한 칼슘 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 아세트산, 아스코르브산, 구연산, 염산, 말레산, 옥살산, 인산, 스테아르산, 석신산, 및 황산을 포함하는 군으로부터 선택되는 산을 이용하여 형성된 칼슘 및/또는 마그네슘 염의 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 칼슘 및/또는 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 칼슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원은 염화칼슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원은 염화칼슘 이수화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원은 염화마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원은 염화마그네슘 육수화물을 포함한다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 0.25-0.75 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 0.4-0.65 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 0.5-0.6 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 약 0.6 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 0.5-0.9 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 0.6-0.8 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 약 0.7 mM이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원의 농도는 0.05-5 mM이다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원의 농도는 0.1-0.3 mM이다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원의 농도는 약 0.3 mM이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염 완충제는 구연산염 또는 아세트산염 염의 형태로 제공된다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 구연산염 완충제는 구연산 나트륨으로서 제공된다. 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도는 0.1-5 mM이다. 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도는 0.5-2 mM이다. 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도는 약 1 mM이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액의 pH는 6.8-7.8이다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액의 pH는 7.2-7.6이다. 일부 구현예에서, 용액의 pH는 7.4-7.5이다. 일부 구현예에서, 용액의 pH는 약 7.5이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 삼투 활성제는 염이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제는 나트륨 염이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제는 염화나트륨이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제의 농도는 약 100-250 mM이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제의 농도는 약 125-175 mM이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제의 농도는 약 150 mM이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 등장성이다. 일부 구현예에서, 용액은 고장성이다. 일부 구현예에서, 용액은 약 270-345 mOsm/l의 삼투압몰농도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 용액은 약 300-330 mOsm/l의 삼투압몰농도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 용액의 삼투압몰농도는 약 315 mOsm/l이다.
일부 구현예에서, 용액은 칼륨 염을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 칼륨 염은 염화칼륨이다. 일부 구현예에서, KCl의 농도는 0.2-5 mM이다. 일부 구현예에서, KCl의 농도는 1-2.5 mM이다. 일부 구현예에서, KCl의 농도는 약 2 mM이다.
일부 구현예에서, 용액은 점탄성 중합체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 합성 중합체이다. 일부 구현예에서, 중합체는 용액 중의 세포가 전단 응력에 노출되는 것을 감소시키는데 효과적인 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 중합체의 농도는 0.001-5% w/v이다. 일부 구현예에서, 중합체의 농도는 약 0.05% w/v이다. 일부 구현예에서, 중합체는 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물이다. 일부 구현예에서, 중합체는 히알루론산 나트륨이다. 일부 구현예에서, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물은 힐론 엔도코트(Healon Endocoat®; Abbott), 히아시스(Hyasis®; Novozymes), 또는 프로-빅스(Pro-Visc®; Alcon)이다. 일부 구현예에서, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물의 농도는 약 0.001%-0.05% w/v, 예컨대, 0.01%-0.05% w/v, 약 0.02%-0.05% w/v, 약 0.01%, 약 0,02%, 약 0.03%, 약 0,04%, 또는 약 0,05% w/v이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 및 글루코스, 예컨대, D-글루코스를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 글루코스, 예컨대, D-글루코스, 및 염화칼륨을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 및 약 145 mM NaCl을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 약 0.5-0.9 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 및 약 116-174 mM NaCl을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 용액은 약 2 mM KCl을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 2 mM KCl을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 약 0.5-0.9 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 약 116-174 mM NaCl, 및 약 1.6-2.4 mM KCl을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 글루코스, 예컨대, D-글루코스, 및 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 글루코스, 예컨대, D-글루코스, 염화칼륨, 및 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 1-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 수용액 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 약 2 mM KCl, 및 약 0.01-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 약 0.01-0.05% w/v 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 2 mM KCl, 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 0.05% 히알루론산을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 약 0.5-0.8 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1.6-2.4 mM KCl, 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 약 116-174 mM NaCl, 및 약 0.04-0.06% 히알루론산을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 용액은 멸균이다. 일부 구현예에서, 용액은 본질적으로 발열원이 없다.
일부 구현예에서, 용액은 탄산염 완충제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 용액은 글루타티온, 또는 글루타티온 이황화물(GSSG)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 용액은 양쪽성이온 유기 완충제를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 용질의 측정가능한 침전 및/또는 용액에 보관된 세포의 생존 및 생존력을 지원하는 용액의 능력의 측정가능한 손실 없이 25℃에서 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 1개월 동안 보관될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 용질의 측정가능한 침전 및/또는 용액에 보관된 세포의 생존 및 생존력을 지원하는 용액의 능력의 측정가능한 손실 없이 2-8℃에서 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 1개월 동안 보관될 수 있다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 바와 같이 용액 중의 세포의 집단을 포함하는 조제물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 대상으로의 이식에 적합하다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 대상의 눈으로의 이식에 적합하다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 RPE 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 광수용체 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 중간엽 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 망막 신경절 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 망막 전구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 조혈 줄기 또는 전구 세포, 신경 줄기 또는 전구 세포, 신경 세포, 성상교세포 또는 성상교세포 전구체, 교세포 또는 교세포 전구체, 및/또는 췌장 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조제물은 냉장된다. 일부 구현예에서, 조제물은 약 2-8℃에서 냉장된다. 일부 구현예에서, 조제물은 조제물의 보관 동안 세포의 집단에서 세포의 생존을 지원한다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 세포의 적어도 70%는 2-8℃에서 조제물의 보관 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 또는 144시간 후 생존가능하다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 세포의 적어도 80%는 2-8℃에서 조제물의 보관 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 또는 144시간 후 생존가능하다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 세포의 적어도 90%는 2-8℃에서 조제물의 보관 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 또는 144시간 후 생존가능하다. 일부 구현예에서, 조제물은 조제물의 보관 동안 세포의 집단의 도말 효율의 유지를 지원한다. 일부 구현예에서, 2-8℃에서 조제물의 보관 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 또는 144시간 후, 세포의 집단은 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 나타내며, 상기 원래의 평판배양 효율은 보관 기간의 시작시에 세포의 집단의 평판배양 효율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 조제물은 보관 용기 내에 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 주사기 내에 있다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 조제물, 예컨대, 본원에 제공된 바와 같이 용액 중의 세포의 집단을 포함하는 조제물을 제공하는 방법을 제공하며, 방법은 세포의 집단을 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 동결보존되거나 펠렛화된 세포의 집단을 용액과 접촉시켜 세포를 재구성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 대상에게 투여하는데 적합한 약제학적 조성물을 제공하며, 약제학적 조제물은 본원에 제공된 바와 같은 용액을 포함하거나, 또는 본원에 제공된 바와 같은 용액 중에 세포의 집단을 포함하는 조제물을 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 바와 같은 용액 또는 조제물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 용액 또는 조제물을 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 24, 적어도 36, 적어도 24, 적어도 48, 적어도 60, 적어도 72, 적어도 96, 적어도 120, 또는 적어도 144시간 동안 조제물의 보관 후 조제물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 망막 질환을 갖거나 망막 질환으로 진단된다. 일부 구현예에서, 망막 질환은 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 망막 신경절 세포와 연관된 질환, 녹내장, 또는 스타가르트 질환이다. 일부 구현예에서, 조제물은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 RPE 세포, 광수용체 세포, 또는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 (a) 세포의 집단을 본원에 제공된 바와 같은 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (b) (a)의 세포 조제물을 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 18, 적어도 24, 적어도 36, 적어도 48, 적어도 60, 적어도 72, 적어도 96, 적어도 120, 또는 적어도 144시간 동안 보관하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (c) (b)의 보관 기간 후 대상에게 (a)의 세포 조제물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, (c)의 투여는 대상의 눈에 세포를 주사하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물에서 세포 생존력을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (b)의 보관 기간 동안 (a)의 세포 조제물을 냉장시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 냉장은 세포 조제물을 2-8℃의 온도에 보관하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (a)에서 생성된 조제물을 (b)의 보관 기간 내에 조제물이 생성된 위치와 상이한 위치로 운반하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 운반은 (c)의 투여가 발생하는 병원 또는 수술실로 조제물을 운반하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 망막 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 제공된 세포 조제물의 유효량을 망막 질환을 갖는 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 망막 질환을 갖거나 망막 질환으로 진단된다. 일부 구현예에서, 망막 질환은 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 병적 근시(pathologic myopia), 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 녹내장, 또는 스타가르트 질환이다. 일부 구현예에서, 조제물은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 RPE 세포, 광수용체 세포, 망막 신경절, 또는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 (a) 본원에 제공된 용액; 및 (b) 세포 집단을 (a)의 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하기 위한 지침; 및 (c) (b)의 접촉 및/또는 (b)의 세포 조제물을 보관하기 위한 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, (a)의 용액 및 (c)의 용기는 대상에게 이식하기 위한 (b)의 세포 조제물의 사용에 적합하다.
상기 요약은 비제한적인 방식으로 본원에 개시된 기술의 구현예, 장점, 특징, 및 용도의 일부를 예시하기 위한 것이다. 본원에 개시된 기술의 다른 구현예, 장점, 특징, 및 용도는 상세한 설명, 도면, 실시예, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1. RPE 세포는 배양에서 평판배양하고 성장하는 후속 능력의 명백한 손실 없이 24시간(48시간은 아님) 동안 하이포써모솔(HypoThermosol)에서 유지될 수 있다.
도 2. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. RPE 세포는 배양에서 생존가능 세포수 또는 평판배양하고 성장하는 후속 능력의 명백한 손실 없이 적어도 48시간 동안 GS2에서 유지될 수 있다.
도 3. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. RPE 세포는 세포 생존력의 단지 명목상의 손실만으로 그리고 생존가능한 세포 밀도의 유의한 감소 없이 4-5일 동안 GS2에서 유지될 수 있다.
도 4. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. 배양에서 평판배양하고 성장하는 RPE 세포 능력은 GS2 저온 보관시 5일 후 감소하기 시작한다.
도 5. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. GS2는 현재의 주사 시스템과 양립가능하다.
도 6. 3개의 튜브로부터의 평균 생존가능 세포 밀도 ± 표준 편차가 나타나 있다. 인간 RPE 세포 밀도를 혈구계를 사용하여 결정하였다. 세포 생존력을 트립판 블루 배제에 의해 평가하였다. 각 조건에 대해 제조된 세포의 3개 튜브로부터 평균값을 계산하고, 3개의 계수로부터 각 튜브에 대한 생존가능 세포 농도를 계산하였다. MedOne #3233 캐뉼라를 통해 세포 압출 후 관찰된 세포 수의 퍼센트 변화(델타)가 각 조건에 대한 값의 각 세트 위에 나타나 있다.
도 7. 시험된 각 조건에 대해 6개의 웰로부터 웰당 인간 RPE 세포의 평균 수 및 표준 편차(± SD)가 나타나 있다. 각 조건에 대해, 웰당 약 20,000개 세포를 젤라틴 코팅된 96-웰 플레이트에 접종하고 5% CO2, 37℃, 습도 조절 배양기에서 3일 동안 RPE 성장 배지(EGM2 Single Quots를 갖는 EBM-2, Stem Cell, Inc.)에서 배양하였다. 3일 성장 후 세포 수를 결정하기 위해, 세포를 트립신(Sigma) 및 HEPES 기반 해리 배지(Gibco.)의 1:1 혼합물로 들어올렸다. 세포가 들어 올려지면, 트립신을 10% 우태아혈청을 함유하는 배지로 중화시키고, 혈구계를 사용하여 세포를 계수하였다.
도 8. MSC의 보관을 위한 상이한 배지의 비교. 인간 배아 줄기 세포 유래의 MSC를 70% 컨플루언시로 성장시키고, 0.05% 트립신으로 수집하고, aMEM+15%FCS(MSC 배지)에 재현탁시키고, 200 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 소량의 MSC 배지에 재현탁시키고 트립판 블루 배제를 사용하여 생존력을 계수하였다. 그리고 나서, 5백만 개의 MSC를 4개의 에펜도르프 튜브 각각에 넣고, 회전시키고, 1 ml의 지시된 완충제 각각에 재현탁시켰다. 튜브를 지시된 시간 동안 4℃로 설정된 저온실에 넣었다. CS: 개 혈청; FBS: 우태아혈청.
도 9. MSC 생존력은 GS2에서 더 높은 밀도로 보관될 때 향상되는 반면, FBS의 존재는 24시간 동안 GS2에서 생존력을 거의 향상시키지 않는다.
도 10. MSC 생존력은 26G 바늘/주사기(4℃ GS2에서)에 보관되고 이를 통해 소멸될 때 보존된다.
도 11. BSS-Plus 또는 GS2 운반된 배지 단독(세포 없음)으로 처리되거나, 또는 모의 처리되거나 처리되지 않은 동물의 눈과 비교하여, BSS-Plus 또는 GS2 운반 배지에서 현탁된 RPE 세포로 처리된 16마리의 랫트 눈의 그룹에 대한 60일 처리 후 망막전위도(ERG).
도 2. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. RPE 세포는 배양에서 생존가능 세포수 또는 평판배양하고 성장하는 후속 능력의 명백한 손실 없이 적어도 48시간 동안 GS2에서 유지될 수 있다.
도 3. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. RPE 세포는 세포 생존력의 단지 명목상의 손실만으로 그리고 생존가능한 세포 밀도의 유의한 감소 없이 4-5일 동안 GS2에서 유지될 수 있다.
도 4. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. 배양에서 평판배양하고 성장하는 RPE 세포 능력은 GS2 저온 보관시 5일 후 감소하기 시작한다.
도 5. GS2(2-8℃)에서의 RPE 안정성. GS2는 현재의 주사 시스템과 양립가능하다.
도 6. 3개의 튜브로부터의 평균 생존가능 세포 밀도 ± 표준 편차가 나타나 있다. 인간 RPE 세포 밀도를 혈구계를 사용하여 결정하였다. 세포 생존력을 트립판 블루 배제에 의해 평가하였다. 각 조건에 대해 제조된 세포의 3개 튜브로부터 평균값을 계산하고, 3개의 계수로부터 각 튜브에 대한 생존가능 세포 농도를 계산하였다. MedOne #3233 캐뉼라를 통해 세포 압출 후 관찰된 세포 수의 퍼센트 변화(델타)가 각 조건에 대한 값의 각 세트 위에 나타나 있다.
도 7. 시험된 각 조건에 대해 6개의 웰로부터 웰당 인간 RPE 세포의 평균 수 및 표준 편차(± SD)가 나타나 있다. 각 조건에 대해, 웰당 약 20,000개 세포를 젤라틴 코팅된 96-웰 플레이트에 접종하고 5% CO2, 37℃, 습도 조절 배양기에서 3일 동안 RPE 성장 배지(EGM2 Single Quots를 갖는 EBM-2, Stem Cell, Inc.)에서 배양하였다. 3일 성장 후 세포 수를 결정하기 위해, 세포를 트립신(Sigma) 및 HEPES 기반 해리 배지(Gibco.)의 1:1 혼합물로 들어올렸다. 세포가 들어 올려지면, 트립신을 10% 우태아혈청을 함유하는 배지로 중화시키고, 혈구계를 사용하여 세포를 계수하였다.
도 8. MSC의 보관을 위한 상이한 배지의 비교. 인간 배아 줄기 세포 유래의 MSC를 70% 컨플루언시로 성장시키고, 0.05% 트립신으로 수집하고, aMEM+15%FCS(MSC 배지)에 재현탁시키고, 200 x g에서 5분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 소량의 MSC 배지에 재현탁시키고 트립판 블루 배제를 사용하여 생존력을 계수하였다. 그리고 나서, 5백만 개의 MSC를 4개의 에펜도르프 튜브 각각에 넣고, 회전시키고, 1 ml의 지시된 완충제 각각에 재현탁시켰다. 튜브를 지시된 시간 동안 4℃로 설정된 저온실에 넣었다. CS: 개 혈청; FBS: 우태아혈청.
도 9. MSC 생존력은 GS2에서 더 높은 밀도로 보관될 때 향상되는 반면, FBS의 존재는 24시간 동안 GS2에서 생존력을 거의 향상시키지 않는다.
도 10. MSC 생존력은 26G 바늘/주사기(4℃ GS2에서)에 보관되고 이를 통해 소멸될 때 보존된다.
도 11. BSS-Plus 또는 GS2 운반된 배지 단독(세포 없음)으로 처리되거나, 또는 모의 처리되거나 처리되지 않은 동물의 눈과 비교하여, BSS-Plus 또는 GS2 운반 배지에서 현탁된 RPE 세포로 처리된 16마리의 랫트 눈의 그룹에 대한 60일 처리 후 망막전위도(ERG).
도입
많은 진보된 수술 절차는 더 오래된 기술과 비교하여 세포 및 조직에 대한 손상을 최소화하지만, 특정한 섬세한 절차는 사용되는 기술 및 물질에 여전히 매우 민감하다. 예를 들어, 백내장 수술 및 유리체절제 수술과 같은 안과적 수술 절차는 매우 취약한 세포 및 조직(예컨대, 각막 내피층)을 포함하므로 오류에 대한 여지가 없고 이러한 안구 조직 및 환자의 시력에 해를 끼칠 가능성이 크다. 또한, 예컨대, 재생 의료 접근법의 맥락에서, 세포의 이식은 종종 부적절하게 취급시 또는 비생리학적 조건에 노출시 손상되거나 재생 능력을 잃을 수 있는 섬세하거나 취약한 세포를 제제화, 보관, 운반 및/또는 주사하는 것을 필요로 한다.
본 발명은 세척, 세포 재구성, 세포 보관, 세포 운반, 및/또는 대상에의 세포 투여를 위한 용액을 제공한다. 본원에 제공된 용액은 세척, 세포 재구성, 제제, 보관, 및/또는 이식을 위해 현재 이용가능한 용액에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 예를 들어, 현재 이용가능한 배지와 달리, 본원에 제공된 용액은 취약한 세포 및 조직을 포함하는 다양한 세포 및 조직 유형의 생존을 지원하고, 연장된 보관 기간 동안에도 세포 및 조직 생존력, 재평판배양 효율, 및 재증식 능력의 개선된 수준을 유지한다. 본원의 다른 곳에서 더 상세히 설명된 바와 같이, 수술전에 세척 또는 세포 제제화를 위해 현재 이용가능한 배지는 짧은 반감기(예컨대, 탄소 염의 침전에 기초하여)를 가지고/가지거나 긴 기간 동안(예컨대, 4-6시간 초과 동안) 보관된 세포의 생존, 재평판배양 효율, 및 재증식 능력을 지원하지 않는다. 짧은 반감기 및 비교적 짧은 기간 이상 세포 생존력 및 기능을 지원하지 못하기 때문에, 현재 이용가능한 배지의 사용은 배지 또는 세포 조제물이 사용되는(예컨대, 이식되는) 임상 현장에 근접한, 예를 들어, 병원 내부에서 또는 가까운 실험실에서, 배지의 제제 및/또는 각각의 배지 중의 세포 및 조직의 제제를 필요로 한다. 따라서, 현재 이용가능한 용액은 제제화된 세포 또는 조직의 임상적 용도를 세포 생존력, 재평판배양 효율, 및/또는 재증식 능력이 허용되는 짧은 시간 범위 내에서의 투여를 가능하게 하는 분야로 제한한다. 임상 현장과 근접한 제제의 요건은 추가 비용, 위험, 및 현장 외 처리의 추가 제한을 야기한다.
반면, 본원에 제공된 용액은 현재 이용가능한 용액과 비교하여 연장된 유효 기간을 가지며, 또한 긴 보관 기간(예컨대, 최대 24시간, 최대 48시간 이상의 보관 기간) 동안에도 RPE 및 광수용체 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 취약한 세포를 포함하는 다양한 세포 유형의 세포 기능, 생존력, 재평판배양 효율, 및 재증식 능력을 지원한다. 본원에 제공된 용액은 또한 생체적합성이므로 대상에게 투여하는데 적합하다. 따라서, 본원에 제공된 용액 내에 제제화된 세포 또는 조직은 배지를 대체할 필요없이 대상에게 직접 투여될 수 있다.
본원에 제공된 용액의 향상된 특징은 제제화된 용액, 세포, 및 조직을 제제화 현장에서 멀리 떨어진 임상 현장으로 운반할 수 있게 해주며, 이는 최종 제품의 중앙 처리 및 제제화를 가능하게 하고 임상 현장에 근접한 제제의 필요성을 제거한다. 본원에 제공된 용액의 개선된 보관 및 운반 능력은 추가로 최종 제품의 제제화 현장에서 더 멀리 떨어진 임상 현장을 사용할 수 있게 해주고, 또한 임상 적용의 일정을 잡는데 있어서, 예컨대, 본원에 제공된 용액에서 제제화된 세포 또는 조직의 투여를 위한 수술의 일정을 잡는데 있어 유연성을 증가시킨다. 보관을 위한 확장된 시간 창은 또한 임상 작업이 시작되기 전에, 예컨대, 수술 팀이 수술 준비를 시작하기 전에 또는 대상이 수술 준비가 되기 전에, 제제화된 제품의 품질 관리, 예컨대 최종 제제화된 제품에서 병원성 오염물의 존재의 시험을 위한 추가의 기회를 제공한다.
임상 용액
본 발명의 일부 양태는 세척를 위한, 및 세포 및 조직을 제제화, 보관, 운반, 및 투여하기 위한 임상 용액을 제공한다.
세척에 사용되는 현재 이용가능한 배지 및 세포 제제, 예컨대, 평형화된 염 용액, 또는 식염수와 달리, 본원에 기재된 임상 용액은 민감한 세포 또는 조직의 연장된 생존 및 기능을 지원하고, 제조하고 멸균하기 쉬우며, 연장된 유효 기간을 갖는다.
인산 완충 식염수 또는 0.9% 염화나트륨 용액과 같은 간단한 염 용액이 세포의 단기간 보관에 사용될 수 있지만, 이들 용액은 장기간 보관 동안 세포 생존력 는 세포 기능을 충분하게 지원하지 못하여, 단지 단기간 보관 후에도 세포 생존력재평판배양 효율, 및 재증식 능력을 유의하게 그리고 종종 허용가능하지 않게 감소시킨다.
보다 정교한 평형화된 염 용액이 임상 세척 또는 세포 및 조직 보관과 같은 임상 목적에 이용가능하며, 이는 전형적으로 삼투압몰농도를 유지하는 작용제, 칼슘의 공급원, 마그네슘의 공급원 및 완충화제를 포함한다.
염화나트륨은 일반적으로 용액의 삼투압몰농도를 유지하는데 사용된다. 칼슘 이온은, 예컨대 각막 내피에서, 세포간 접합을 유지하는 역할을 한다. 칼슘 이온과 같이 마그네슘 이온은 수양액(aqueous humor)에서 발견되며 많은 세포 과정에 필수적이다.
중탄산염 음이온은 많은 조직에 대한 생리학적 완충제에 해당하고 다른 용질과 광범위하게 양립가능하기 때문에 전형적으로 완충화제로서 사용된다. 그러나, 칼슘 및 마그네슘의 특정 형태는 중탄산염과 반응하여 특정 상황에서 용액으로부터 침전될 수 있는 탄산 칼슘 또는 탄산 마그네슘을 형성할 수 있다. 반응 및 침전은 중탄산염 및 칼슘 및/또는 마그네슘을 함유하는 용액이 가열 멸균될 때 빠르게 발생할 수 있으며, 주위 보관 조건에서 시간이 경과함에 따라 발생할 수 있다. 칼슘 또는 마그네슘 및 중탄산염 사이의 반응은 전형적으로 약제학적 부형제로서 사용되는 칼슘 및 마그네슘의 실질적으로 모든 이온 염으로 일어나는 것으로 보인다.
침전을 피하기 위한 한 가지 접근법은 적용 바로 전에 혼합되는 2개의 개별 스톡 용액으로서 중탄산염 완충제를 사용하는 임상 용액을 제공하는 것이다. 예를 들어, 한 가지 널리 사용되는 임상 배지는 BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액(Alcon Laboratories, Inc.)이다. BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액은 2-부분 용액이다. 상기 부분들은 수술 바로 전에 혼합되어 단일 용액을 형성한다. 이러한 혼합 단계는 불편할 수 있고 바쁜 수술실에서 혼합 오류 위험을 나타낸다. 또한, 2개의 개별 용액을 제조하는 것은 1-부분 제제를 제조하는 것보다 더 복잡하여 비용이 더 많이 든다. 따라서, 1-부분 임상 용액이 유리할 것이며 매우 바람직하다.
BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액의 부분 I은 주사용수에 용해된 염화나트륨, 염화칼륨, 중탄산 나트륨, 및 인산수소 이나트륨을 함유한다. 부분 I의 pH는 중성에 가깝고, 그것은 생리학적 유체에 대해 거의 등장성인 삼투질농도를 갖는다. BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액의 부분 II는 주사용수에 용해된 염화칼슘, 염화마그네슘, 덱스트로스, 및 글루타티온 이황화물(GSSG)을 함유한다. 부분 II의 pH는 3 내지 5로 조절되고, 용액은 저장성(hypotonic) 삼투질농도를 갖는다.
재구성된 BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액은 중성 pH 및 등장성의 삼투질농도를 갖는다. BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액의 2개의 부분이 조합되면, 부분 II에서의 칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온이 부분 I에서의 중탄산염 및 인산염과 반응하여 침전물을 형성할 것이다. 조합된 용액이 증기 멸균되면 이러한 반응은 거의 즉시 진행되며, 실온에서는 보다 느리게, 전형적으로 수 시간 내지 수일의 기간 동안 진행된다. 이러한 침전을 방지하기 위해, 재구성된 BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액의 표시 유효 기간은 6시간이며, 이 시간 동안 상기 용액이 사용되어야 한다.
이전에 1-부분 임상 용액을 2-부분 BSS PLUS® 멸균 안구내 세척 용액과 성능 면에서 대등하게 만들기 위한 시도가 있었다. 유럽 특허 출원 EP 1067907 B1(Armitage)은 상기 논의된 바와 같은 침전을 방지하기 위해 일반적으로 HEPES로 지칭되는 N-(2-하이드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄설폰산)과 같은 양쪽성이온 유기 완충제의 사용을 교시한다. 아르미타지(Armitage)에 의해 개시된 제제는 오토클레이브되거나 생리학적 pH 용액에 혼입될 때 불안정한 것으로 알려진 덱스트로스 및 GSSG와 같은 성분을 함유하지 않는다. 아르미타지에 의해 개시된 제제는 또한 아미노산과 같이 조직 배양 배지에 일반적으로 존재하는 유형의 성분을 함유하지 않는다. 따라서, 아르미타지의 교시는 침전물 형성의 문제점에 대한 해법을 제공하지 않는다.
이전에 개발된 1-부분 용액과 달리, 본 발명의 일부 양태는 용액을 생리학적 pH 범위 내에 유지시키기 위해 HEPES, BES, MOPS, TES, EPPS, 및 TRICINE과 같은 양쪽성이온 유기 완충제의 사용을 필요로 하지 않는 1-부분 임상 용액을 제공한다. 본 발명의 임상 용액은 짧은 유효 기간의 문제점을 해결한다. 본원에 제공된 임상 용액은 현재 이용가능한 임상 배지와 비교하여 크게 개선된 유효 기간을 가지며, 24, 48, 60, 72, 96, 120, 144, 또는 168시간 이상 장기간 보관 후에도 세포의 생존력, 재평판배양 효율, 및 재증식 능력을 지원한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "용액"은 주요 용매로서 물 및 용액에 용해된 하나 이상의 용질, 예를 들어, 완충화제, 삼투 활성제, 글루코스, 염, 중합체 등을 포함하는 수성 배지를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 임상적 용도를 위한 것이며, 따라서 무독성이고, 실질적으로 발열원이 없고, 멸균이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 생리학적 pH 및 생리학적 삼투압몰농도로도 지칭되는 생리학적 삼투압을 나타낸다. 생리학적 pH는 세포독성이 아니며 용액이 투여되는 세포 또는 조직의 pH와 유사한 pH를 지칭하거나 또는 용액에서 제제화된 세포 또는 조직이 그의 자연 환경과 만나는 pH를 지칭한다. 대부분의 세포 및 조직의 경우, 생리학적 pH는 약 6.8-7.8의 pH, 예를 들어, 7-7.7의 pH, 7.2-7.6의 pH, 7.2-7.4의 pH, 또는 7.4-7.5의 pH이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7. 또는 약 7.8의 pH를 나타낸다. 생리학적 삼투압은 세포독성이 아니며 용액이 투여되는 세포 또는 조직의 삼투압과 유사한 삼투압을 지칭하거나 또는 용액에 제제화된 세포 또는 조직이 그의 자연 환경과 만나는 삼투압을 지칭한다. 대부분의 세포 및 조직의 경우, 생리학적 삼투압은 약 270-345 mOsm/l, 예를 들어, 280-330 mOsm/l, 290-325 mOsm/l, 300-315 mOsm/l이다. 일부 구현예에서, 생리학적 삼투압은 약 300, 약 305, 약 310, 약 315, 약 320, 또는 약 325 mOsm/l이다.
용어 용액의 "삼투압" 또는 "삼투압몰농도"는 용매가 한쪽에는 순수한 용매 및 다른 쪽에는 용액으로 분리하는 반투막을 가로질러 용액 쪽으로 흐르는 것을 멈추게 하는데 필요한 압력이며, 반투막은 용매 분자에는 투과성이지만 용질 분자에는 비투과성이다. 용액의 삼투압은 용액 중의 용질 입자의 몰 농도에 비례하며, mOsm/l 또는 mOsm/kg로 측정된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 약 290 mOsm/l 내지 약 320 mOsm/l, 또는 약 300 mOsm/l 내지 310 mOsm/l 또는 약 305 mOsm/l의 삼투압몰농도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 용액은 약 300-330 mOsm/l의 삼투압몰농도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 용액의 삼투압몰농도는 약 300, 약 305, 약 310, 약 315, 약 320, 또는 약 325 mOsm/l이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액의 삼투압몰농도는 그의 긴장성의 용어로 언급되며, 고장성 용액은 세포를 수축시키는 용액이고, 저장성 용액을 세포를 팽윤시키는 용액이며, 등장성 용액은 세포 부피를 변화시키지 않는다. 용어 "고장성," "저장성," 및 "등장성"은 전형적으로 용액이 접촉하게 되는 세포, 세포 집단, 또는 조직과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 세척 용액이 제공되는 구현예에서, 등장성은 세척 동안 용액과 접촉하게 되는 세포 또는 조직의 부피를 변화시키지 않는 삼투압을 지칭한다. 유사하게, 용액이 세포, 세포 집단, 또는 조직을 임상 용도를 위해, 예컨대, 대상에의 이식을 위해 제제화하는데 사용되는 구현예에서, 등장성은 용액으로 제제화될 때 세포 집단의 세포, 또는 조직의 세포의 부피를 변화시키지 않는 삼투압을 지칭한다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 등장성이다. 일부 구현예에서, 용액은 고장성이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 삼투 활성제는 염이다. 일부 구현예에서, 염은 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제는 나트륨 염이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제는 염화나트륨이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제의 농도는 약 100-200 mM, 125-175 mM, 또는 140-160 mM이다. 일부 구현예에서, 삼투 활성제의 농도는 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175, 약 180, 약 185, 약 190, 약 195, 또는 약 200 mM이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "생리학적 삼투압몰농도"는 세포독성이 아니며(예컨대 주어진 세포 또는 세포 유형을 파열시키거나 세포를 손상시키지 않음) 용액이 투여되는 조직의 삼투압과 유사한 삼투압을 지칭하거나 용액으로 제제화된 세포 또는 조직이 그의 자연 환경에서 만나는 삼투압을 지칭한다. 대부분의 적용을 위한 생리학적 삼투압몰농도의 범위는 약 280 mOsm/l 내지 약 325 mOsm/l, 약 290 mOsm/l 내지 약 320 mOsm/l, 또는 약 300 mOsm/l 내지 310 mOsm/l, 또는 약 305 mOsm/l이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포 재구성, 보관, 운반, 및/또는 대상에의 투여를 위한 용액은 (a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제; 및 (b) 적어도 2 mM 글루코스; 및 (c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 2가 양이온의 공급원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 칼슘 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 칼슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 마그네슘 공급원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산염 완충제 및/또는 구연산염 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 4 mM, 적어도 5 mM, 적어도 6 mM, 적어도 7 mM, 적어도 7.5 mM, 적어도 8 mM, 적어도 9 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 또는 적어도 50 mM 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 0.5 mM, 적어도 1 mM, 적어도 2 mM, 적어도 2.5 mM, 적어도 3 mM, 적어도 5 mM, 적어도 6 mM, 적어도 7 mM, 적어도 7.5 mM, 적어도 8 mM, 적어도 9 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 16 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 또는 적어도 50 mM 덱스트로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 3 mM 이하, 4 mM 이하, 5 mM 이하, 6 mM 이하, 7 mM 이하, 7.5 mM 이하, 8 mM 이하, 9 mM 이하, 10 mM 이하, 15 mM 이하, 17 mM 이하, 20 mM 이하, 25 mM 이하, 30 mM 이하, 40 mM 이하, 또는 50 mM 이하의 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 0.5 mM 이하, 1 mM 이하, 2 mM 이하, 2.5 mM 이하, 3 mM 이하, 4 mM 이하, 5 mM 이하, 6 mM 이하, 7 mM 이하, 7.5 mM 이하, 8 mM 이하, 9 mM 이하, 10 mM 이하, 15 mM 이하, 20 mM 이하, 25 mM 이하, 30 mM 이하, 40 mM 이하, 또는 50 mM 이하의 덱스트로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 세포 재구성, 보관, 운반, 및/또는 대상에의 투여를 위한 용액은 (a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제; 및 (b) 글루코스; 및 (c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제; 및 (d) 칼슘 공급원; 및 (e) 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산염 및/또는 구연산염 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 0.5 mM, 적어도 1 mM, 적어도 2 mM, 적어도 2.5 mM, 적어도 3 mM, 적어도 4 mM, 적어도 5 mM, 적어도 6 mM, 적어도 7 mM, 적어도 7.5 mM, 적어도 8 mM, 적어도 9 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 16 mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 또는 적어도 50 mM 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 적어도 0.5 mM, 적어도 1 mM, 적어도 2 mM, 적어도 2.5 mM, 적어도 3 mM, 적어도 5 mM, 적어도 6 mM, 적어도 7 mM, 적어도 7.5 mM, 적어도 8 mM, 적어도 9 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 16mM, 적어도 20 mM, 적어도 25 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 또는 적어도 50 mM 덱스트로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 0.5 mM 이하, 1 mM 이하, 2 mM 이하, 2.5 mM 이하, 3 mM 이하, 4 mM 이하, 5 mM 이하, 6 mM 이하, 7 mM 이하, 7.5 mM 이하, 8 mM 이하, 9 mM 이하, 10 mM 이하, 15 mM 이하, 17mM 이하, 20 mM 이하, 25 mM 이하, 30 mM 이하, 40 mM 이하, 또는 50 mM 이하의 글루코스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 0.5 mM 이하, 1 mM 이하, 2 mM 이하, 2.5 mM 이하, 3 mM 이하, 4 mM 이하, 5 mM 이하, 6 mM 이하, 7 mM 이하, 7.5 mM 이하, 8 mM 이하, 9 mM 이하, 10 mM 이하, 15 mM 이하, 17 mM 이하, 20 mM 이하, 25 mM 이하, 30 mM 이하, 40 mM 이하, 또는 50 mM 이하의 덱스트로스를 포함한다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 글루코스 또는 덱스트로스의 농도는 0.5-150 mM, 0.5-50 mM, 2.5-50 mM, 5-50 mM, 10-50 mM, 0.5-25 mM, 2.5-25 mM, 5-25 mM, 10-25 mM, 또는 10-20 mM이다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 글루코스 또는 덱스트로스의 농도는 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 7.5 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 12.5 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 22.5 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 또는 약 50 mM이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 2가 양이온의 공급원을 포함한다. 적합한 2가 양이온은, 비제한적으로, 예컨대, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cr2+, Cu2+, Ba2+, 및 Sr2+를 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 칼슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 마그네슘 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 2개 이상의 상이한 2가 양이온의 공급원, 예컨대, 칼슘 공급원 및 마그네슘 공급원을 포함한다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 칼슘 공급원, 예컨대, 칼슘 이온의 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원은 약제학적으로 허용가능한 칼슘 염을 포함한다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 마그네슘 공급원, 예컨대, 마그네슘 이온의 공급원을 포함한다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원은 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 인간 대상에게 투여하는데 적합한 것으로 간주되는 염을 지칭한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염은 아세트산, 아스코르브산, 구연산, 염산, 말레산, 옥살산, 인산, 스테아르산, 석신산, 및 황산을 포함하는 군으로부터 선택되는 산을 이용하여 형성된 염이다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 2가 양이온의 공급원은 아세트산, 아스코르브산, 구연산, 염산, 말레산, 옥살산, 인산, 스테아르산, 석신산, 및 황산을 포함하는 군으로부터 선택되는 산을 이용하여 형성된 칼슘 및/또는 마그네슘 염의 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 이러한 구현예의 군의 약제학적으로 허용가능한 칼슘 염은 아세트산 칼슘, 아스코르브산 칼슘, 구연산 칼슘, 염화칼슘, 말레산 칼슘, 옥살산 칼슘, 인산 칼슘, 스테아르산 칼슘, 석신산 칼슘, 및 황산 칼슘을 포함할 것이다. 용액이 2개 이상의 약제학적으로 허용가능한 염(예컨대, 칼슘, 마그네슘, 및 칼륨 염)을 포함하는 구현예에서, 일부 또는 모든 염은 동일한 산을 이용하여 형성될 수 있거나(예컨대, 염화칼슘, 염화마그네슘, 및 염화칼륨), 또는 2개 이상의 염은 상이한 산을 이용하여 형성될 수 있음(예컨대, 염화칼슘, 염화마그네슘, 및 아세트산 칼륨; 염화칼슘, 구연산 마그네슘, 및 말레산 칼륨 등)이 당업자에게 명백할 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염, 예컨대, 약제학적으로 허용가능한 칼슘 또는 마그네슘 염은 1-하이드록시-2-나프토산, 2,2-디클로로아세트산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-옥소글루타르산, 4-아세타미도벤조산, 4-아미노살리실산, 아세트산, 아디프산, 아스코르브산(L), 아스파트산(L), 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포르산(+), 캄포르-10-설폰산(+), 카프르산(데카노산), 카프로산(헥사노산), 카프릴산(옥타노산), 카본산, 신남산, 구연산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산(D), 글루콘산(D), 글루쿠론산(D), 글루탐산, 글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염산, 이소부티르산, 젖산(DL), 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산(-L), 말론산, 만델산(DL), 메탄설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 니코틴산, 질산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, 피로글루탐산(- L), 살리실산, 세바스산, 스테아르산, 석신산, 황산, 타르타르산(+ L), 티오시안산, 톨루엔설폰산(p), 및 운데실렌산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산의 염이다. 추가의 바람직한 약제학적으로 허용가능한 염은 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명은 이 관점에서 제한되지 않음이 이해될 것이다.
일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 0.1-20 mM, 예컨대, 약 0.5-10 mM, 0.5-5 mM, 1-10 mM, 또는 2-10 mM의 2가 양이온의 총 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 공급원의 농도는 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 또는 약 5 mM이다. 일부 구현예에서, 2가 양이온의 공급원은 칼슘 및/또는 마그네슘 공급원을 포함한다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 칼슘 공급원은 염화칼슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원은 염화칼슘 이수화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원은 염화마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원은 염화마그네슘 육수화물을 포함한다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 0.1-1.2 mM, 0.25-0.75 mM, 0.4-0.65 mM, 또는 0.5-0.7 mM이다. 일부 구현예에서, 칼슘 공급원의 농도는 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 1.1 mM, 또는 약 1.2 mM이다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원의 농도는 0.05-5 mM, 0.1-0.5 mM, 0.25-2.5 mM, 0.1-1 mM, 또는 0.1-0.3 mM이다. 일부 구현예에서, 마그네슘 공급원의 농도는 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 또는 약 5 mM이다.
본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 완충화제를 포함한다. 본원에서 용어 "완충제"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "완충화제"는 부가된 산 또는 염기를 중화시킴으로써 용액의 pH를 비교적 안정하게 유지시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 전형적으로, 완충제는 약 공액 산-염기 쌍, 즉, 약산 및 그의 공액 염기, 또는 약 염기 및 그의 공액 산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액에 포함된 완충제는, 예컨대, 구연산염 또는 아세트산염 염의 형태로 제공되는 구연산염 또는 아세트산염 완충제이다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 구연산염 완충제는 구연산 나트륨으로서 제공된다. 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도는 0.1-5 mM이다. 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도는 0.5-2 mM이다. 일부 구현예에서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도는 약 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.09 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.9 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 또는 10 mM이다.
일부 구현예에서, 용액은 칼륨 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 칼륨 염을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 칼륨 염은 염화칼륨이다. 일부 구현예에서, KCl의 농도는 0.2-5 mM 또는 1-2.5 mM이다. 일부 구현예에서, KCl의 농도는 약 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.9 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 mM, 4 mM, 또는 5 mM이다.
일부 구현예에서, 용액은 점탄성 중합체를 추가로 포함한다. 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 점탄성 중합체의 첨가는 세포 및 조직을 전단 응력으로부터 보호함으로써 본원에 제공된 용액에서 보관 후 및/또는, 예컨대, 캐뉼레이션을 포함하는 투여 경로를 통해, 대상에게 투여 후 세포 및 조직 생존력, 재평판배양 효율, 및 재증식 능력을 향상시키는 것으로 여겨진다. 점탄성 중합체는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예시적인 적합한 점탄성 중합체는, 비제한적으로 히알루론산(예컨대, 힐론 엔도코트®(Abbott), 히아시스®(Novozymes), 및 프로-빅스®(Alcon)), 알긴산염(알긴산 나트륨 포함), 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)로도 알려진 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리아크릴아미드, 폴리(비닐 알콜)(PVA), 하이드록실에틸셀룰로오스(HEC), 폴리(N-하이드록시에틸 아크릴아미드)(PHEA), 하이드록실프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 하이드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(pHEMA), 폴리메타크릴산(카르보머), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(아크릴산)(PAA), 덱스트란, 황산 콘드로이틴, 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)(PMPC), 및 삼블록 공중합체, 예컨대, 폴록사머 188(PLURONIC® F68), 폴록사머 P108(PLURONIC® F38), 폴록사머 P184(PLURONIC® L64), 폴록사머 P401, 폴록사머 P402, 폴록사머 P407(PLURONIC® F127), 및 폴록사머 P408(PLURONIC® F108), 하이드록실프로필 구아 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머), 또는 이의 염 또는 혼합물을 포함하며, 이는 (비제한적으로) 히알루론산 및 알긴산염, 또는 이의 염의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 비이온 중합체이다. 특정 구현예에서, 중합체는 폴리에테르이다. 특정 구현예에서, 중합체는 폴리알킬에테르이다. 특정 구현예에서, 중합체는 폴리알킬에테르 및 또 다른 중합체(예컨대, 폴리알킬에테르)의 공중합체이다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴록사머(폴록시머로도 알려짐)이다. 폴록시머는 폴리옥시에틸렌(POE)(폴리에틸렌 글리콜(PEG)로도 알려짐)의 2개의 친수성 사슬에 측접한 폴리옥시프로필렌(POP)(폴리프로필렌 글리콜로도 알려짐)의 중앙 소수성 사슬로 구성된 비이온 삼블록 공중합체이다. 당업자는 본 발명에 기초하여 본원에 제공된 용액에서 사용하기 위한 부가적인 적합한 점탄성 중합체를 알 것이며, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 당업자는 본원에 제공된 용액 및 조제물에서 사용하는데 적합한 점탄성 중합체의 양이 중합체의 점탄성 특성, 예컨대, 그 중에서도, 사용된 중합체의 분자량에 좌우될 것임을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 점탄성 중합체는 본원에 제공된 용액 및 조제물 중에 0.001%w/v-5%w/v의 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 점탄성 중합체는 0.01%-0.05% 히알루론산을 포함하는 동일한 용액 또는 조제물의 점도, 예컨대, 0.01%-0.05% 힐론 엔도코트®를 포함하는 동일한 용액 또는 조제물이 나타내는 점도에 상응하는 본원에 제공된 용액 또는 조제물의 점도를 제공하는 농도로 사용된다.
특정 구현예에서, 운반 배지를 함유하는 점탄성 중합체는 1,000, 10,000, 50,000 또는 심지어 100,000 Pas를 초과하는 영점 전단 점도를 가지며, 바람직하게는 1,000 내지 200,000 Pas의 범위, 및 더욱 바람직하게는 1,000 내지 20,000 Pas의 범위의 영점 전단 점도를 갖는다. 특정 구현예에서, 점탄성 중합체는 점탄성 중합체가 없는 운반 배지에 비해, 생성된 운반 배지의 영점 전단 점도를 5%, 10%, 15%, 25% 또는 심지어 40%까지 증가시킨다.
용액이, 예컨대, 용액 중에 세포 또는 조직을 포함하는 조제물의 형태로, 대상에게 투여되는 구현예에서, 본 발명에 사용되는 중합체는 생체양립가능하고/하거나 생분해성이다.
일부 구현예에서, 중합체는 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물이다. 일부 구현예에서, 중합체는 히알루론산 나트륨이다. 일부 구현예에서, 중합체는 용액 중의 세포가 전단 응력에 노출되는 것을 감소시키는데 효과적인 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 중합체의 농도는 0.01-5% w/v이다. 일부 구현예에서, 중합체의 농도는 약 0.01%-0.05% w/v이다. 일부 구현예에서, 중합체는 힐론 엔도코트®이다.
일부 구현예에서, 용액은 탄산염 완충제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 용액은 글루타티온, 또는 글루타티온 이황화물(GSSG)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 용액은 양쪽성이온 유기 완충제를 포함하지 않는다.
본 발명은 2개 이상 또는 임의의 수의 기준(예컨대, pH, 삼투압몰농도, 용질(완충제, 글루코스, 삼투 활성제, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 중합체), 농도 등)을 조합한 용액을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 첨가된 중합체를 함유하거나 함유하지 않는 완충화제, 글루코스, 및 삼투 활성제를 포함하는 용액, 칼륨을 포함하는 용액 및 칼륨을 포함하지 않는 용액, 뿐만 아니라 각 용질에 대해 제공된 임의의 농도의 용질의 임의의 조합을 포함하는 용액을 포함한다. 또한, 본 발명은 열거된 용질을 포함하는 용액뿐만 아니라 열거된 용질 및 용매, 예컨대, 물로 본질적으로 이루어지거나 이루어지는 용액을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 이러한 대안은 간결성을 위해 본원에 설명되는 것은 아니다.
예를 들어, 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 및 글루코스, 예컨대, D-글루코스를 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 글루코스, 예컨대, D-글루코스, 및 염화칼륨을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.03 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 및 약 145 mM NaCl을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 약 2 mM KCl을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.03 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 2 mM KCl을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 2 mM KCl을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 점탄성 중합체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물이다. 일부 구현예에서, 중합체는 히알루론산 나트륨이다. 일부 구현예에서, 중합체는 용액 중의 세포가 전단 응력에 노출되는 것을 감소시키는데 효과적인 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 중합체의 농도는 0.01-5% w/v이다. 일부 구현예에서, 중합체의 농도는 약 0.01-0.05% w/v이다. 본원에 제공된 용액의 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 글루코스, 예컨대, D-글루코스, 및 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 글루코스, 예컨대, D-글루코스, 염화칼륨, 및 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.03 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 0.005-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.03 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 약 2 mM KCl, 및 약 0.005-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.85% NaCl, 약 0.015% KCl, 약 0.01% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.006% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.035% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.29% 덱스트로스를 포함하거나 본질적으로 이루어지며, 선택적으로 약 0.01-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물, 예를 들어, 0.01-0.05% 힐론 엔도코트®를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.68-1.02% NaCl, 약 0.008-0.012% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.0048-0.0072% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.028-0.042% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.23-0.35% 덱스트로스를 포함하거나 본질적으로 이루어지며, 선택적으로 약 0.01-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물, 예를 들어, 0.01-0.05% 힐론 엔도코트®를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 물 중에 약 0.68-1.02% NaCl, 약 0.012-0.018% KCl, 약 0.008-0.012% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.0048-0.0072% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.028-0.042% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.23-0.35% 덱스트로스를 포함하거나 본질적으로 이루어지며, 선택적으로 약 0.01-5% w/v의 점탄성 중합체, 예컨대, 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물, 예를 들어, 0.01-0.05% 힐론 엔도코트®를 포함한다.
세포 및 조직 조제물
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 용액 중에 세포 또는 조직의 집단을 포함하는 조제물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 대상 내로의 이식에 적합하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조제물은 대상에의 투여를 위해, 예를 들어, 주사 또는 세척를 통한 투여를 위해 제제화된다. 본원에 제공된 조제물은 단독 또는 하나 이상의 추가의 화합물 또는 작용제, 예컨대, 항산화제, 정균제, 또는 약제학적 활성제와 조합된 본원에 기재된 용액, 예컨대 GS2 중에 세포 또는 조직의 집단을 포함할 수 있다. 예시적인 약제학적 조제물은 본 발명의 실시예 1에 기재된 바와 같은 GS2 중에 세포 또는 조직을 포함한다.
본원에 제공된 용액 중에 예시적인 세포 또는 조직 조제물은 인간 환자를 치료하는데 사용하는데 적합하도록 제제화될 수 있으며, 예컨대, 발열원이 없거나 본질적으로 발열원이 없고, 병원균이 없으며, 멸균이고, 생리학적 pH 및 삼투압몰농도이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조제물은 특정 부위 내로, 예컨대, 망막 질환 또는 장애를 치료하기 위한 안과적 조제물의 경우, 망막 또는 맥락막 손상 부위로 전달하기 위한 유리체 내로, 주사하기 위해 제제화된다.
본 발명에 의해 제공되는 조제물은 추가적으로 치료제, 예를 들어, 면역억제제, 혈관신생 촉진제, 또는 조제물 중의 세포의 생존 및/또는 착상을 지원하는 영양소 또는 성장 인자를 포함할 수 있다.
조제물의 부피 및 조제물 중의 세포의 수는 특정 적용에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 세포 이식 적용을 위해, 투여되는 부피를 가능한 한 많이 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 조제물은 최소화된 부피가 전달될 수 있도록 제제화될 수 있다. 주사를 위한 세포 농도는 효과적이고 무독성인 임의의 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액, 예컨대, GS2 중에 적어도 약 104 세포/ml을 포함하는 이식을 위한 세포의 조제물이 제공된다. 일부 구현예에서, 이식을 위한 세포 조제물은 적어도 약 103, 적어도 약 104, 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 약 또는 1010 세포/ml의 용량으로 제제화된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조제물 중에 세포의 수 및/또는 세포의 농도는 생존가능 세포를 계수하고 비생존가능 세포를 제외함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 비생존가능 세포는 중요한 염료(예컨대, 트립판 블루)를 배제하지 못하는 것, 또는 기능적 분석(예컨대, 배양 기질, 식균작용 등을 고수하는 능력)을 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 원하는 세포 유형의 세포의 수 또는 세포의 농도는 그 세포 유형의 특징인 하나 이상의 세포 마커를 발현하는 세포를 계수하고/하거나 원하는 세포 유형 이외의 세포 유형을 나타내는 하나 이상의 마커를 발현하는 세포를 제외함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; 또는 9,000 세포를 포함하는 세포 조제물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 조제물은 적어도 약 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 또는 9x1010 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 조제물은 적어도 약 1x102-1x103, 1x102-1x104, 1x104-1x105, 또는 1x103-1x106 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 조제물은 적어도 약 10,000, 20,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 또는 200,000 세포를 포함할 수 있고, 예를 들어, 세포 조제물은 약 50-200 μl의 부피의 본원에 제공된 용액, 예컨대, GS2 중에 적어도 약 20,000-200,000개의 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 대상의 눈으로의 이식에 적합하다. 일부 구현예에서, 대상의 눈으로의 이식에 적합한 세포의 집단은 RPE 세포, RPE 전구 세포, 홍채 색소 상피(IPE) 세포, 및 다른 시각 연관 신경 세포, 예컨대 사이신경세포(예컨대, 내부 핵층(INL)의 "릴레이" 신경세포) 및 무축삭 세포, 망막 세포, 막대세포, 원뿔세포, 및 각막 세포, 신경 세포, 광수용체 세포, 및 중간엽 세포, 예컨대, 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 조제물은 본원에 제공된 용액, 예컨대, 실시예 1에 기재된 GS2 배지 중에 RPE 세포의 집단을 포함한다. 적합한 RPE 세포는 만능 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포로부터 분화될 수 있으며, 배아 줄기 세포, 성체 유래 RPE 세포, 및 태아 유래 RPE 세포와 분자적으로 구별될 수 있다. 일부 구현예에서, 성체 유래 RPE 세포, 및 태아 유래 RPE 세포가 사용된다.
ES 세포 유래 RPE 세포가 사용되는 경우, 일부 구현예에서, 조제물은 검출가능한 양의 잔류 ES 세포를 포함하지 않으므로, 본원에 제공된 조제물은 RPE 세포 배양 및 제조에서 허용되지 않는 오염의 위험을 끼치지 않는다.
일부 구현예에서, 대상의 눈으로 이식하는데 적합한 세포의 집단을 포함하는 조제물은 대상의 눈으로의 주사에 적합하다. 일부 구현예에서, 이러한 조제물은 비제한적으로, 망막 박리, 망막 이형성증, 혈관양선조(Angioid streak), 근시성 황반 변성, 또는 망막 위축 또는 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 시력 변형 질환과 관련된 망막 위축, 예를 들어, 맥락막 결손, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성(예컨대, 연령 관련 황반 변성), 색소성 망막염, 및 스타가르트 질환(황반안저)를 포함하는, 망막 변성 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
RPE 세포는 비-RPE 세포 유형으로 탈분화하지 않는 안정한 말단 분화된 RPE 세포일 수 있다. 본원에 기재된 RPE 세포는 인간 또는 비인간 동물 내로 각막, 망막하, 또는 다른 투여시 망막 내로 통합되는 능력을 특징으로 하는 기능적 RPE 세포일 수 있다.
RPE 세포는 RPE 세포 마커를 발현할 수 있다. 예를 들어, RPE65, PAX2, PAX6, 티로시나아제, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및/또는 MITF와 같은 마커의 발현 수준은 자연 발생 RPE 세포에서의 수준과 동등할 수 있다. RPE 세포의 성숙 수준은 PAX2, PAX6, 및 티로시나아제 중 적어도 하나의 발현, 또는 이들의 각각의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 본원에 제공된 조제물 중에 포함되는 RPE 세포는 세포의 색소화의 정도에 기초하여 확인되고 규명될 수 있다. 색소의 변화는 RPE 세포가 배양되고 유지되는 밀도 및 RPE가 배양에서 유지되는 기간에 의해 조절될 수 있다. 빠르게 분열하고 있는 분화된 RPE 세포는 더 연하게 색소화된다. 반면, 더 느리게 분열하거나 분열하지 않는 RPE는 특징적인 다각형 또는 육각형 모양을 채택하고 멜라닌 및 리포푸신을 축적함으로써 색소화 수준을 증가시킨다. 예를 들어, 정지된(quiescent) RPE 배양(예컨대, 컨플루언스로 인해)은 전형적으로 시간이 경과함에 따라 이들의 색소화 수준을 증가시킨다. 이와 같이, 색소화 축적은 RPE 분화의 지표로서 작용하고 세포 밀도와 연관된 증가된 색소화는 RPE 성숙의 지표로서 작용한다. 예를 들어, 성숙한 RPE 세포는 더 낮은 밀도로 계대배양될 수 있어서 색소화가 감소된다. 이 맥락에서, 성숙한 RPE 세포는 배양되어 덜 성숙한 RPE 세포를 생산할 수 있다. 이러한 RPE 세포는 RPE 분화의 마커를 발현하는 여전히 분화된 RPE 세포이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 8 pg/세포 미만, 7 pg/세포 미만, 6 pg/세포 미만, 또는 5 pg/세포 미만, 예컨대, 0.1-8 pg/세포, 0.1-7 pg/세포, 0.1-6 pg/세포, 0.1-5 pg/세포, 0.1-4 pg/세포, 0.1-3 pg/세포, 0.1-2 pg/세포, 0.1-1 pg/세포, 1-8 pg/세포, 1-7 pg/세포, 1-6 pg/세포, 1-5 pg/세포, 1-4 pg/세포, 1-3 pg/세포, 1-2 pg/세포, 2-6 pg/세포, 3-5 pg/세포, 또는 4-5 pg/세포, 예를 들어, 4.2-4.8 pg/세포, 또는 0.1-5 pg/세포의 평균 멜라닌 함량을 갖는 RPE 세포를 포함하는 조제물이 제공된다. 추가의 예에서, 평균 멜라닌 함량은 5 pg/세포 미만, 예컨대, 0.1-5 pg/세포, 0.2-5 pg/세포, 0.5-5 pg/세포, 1-5 pg/세포, 2-5 pg/세포, 3-5 pg/세포, 4-5 pg/세포, 또는 4.5-5 pg/세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 용액, 예컨대, GS2 중에 RPE 세포를 포함하는 조제물이 제공되며, 대상에게 RPE 세포의 이식 후, 예컨대, 대상의 눈으로 조제물의 주사 후, RPE 세포는 이들의 표현형을 유지한다. RPE 세포는 이식 후 수용자의 수명 동안 이들의 표현형을 유지할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 이식 후 이들의 표현형을 유지할 수 있다. 또한, RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 동안 이식 후 이들의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 이식 후 이들의 표현형을 유지할 수 있다. RPE 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20년 이상 동안 이식 후 이들의 표현형을 유지할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 대상의 눈으로 주사하기 위해 본원에 제공된 용액 중의 RPE 세포의 조제물을 제공한다. 이러한 구현예에서, 조제물은 안구내 주사를 위한 약제학적으로 허용가능한 안과 제제이다. 유리체내 주사에 의해 조제물을 투여할 때, 예를 들어, 조제물은 최소화된 부피가 전달될 수 있도록 제제화될 수 있다. 주사를 위한 농도는 효과적이고 무독성인 임의의 양일 수 있다. 환자의 치료를 위한 RPE 세포의 조제물은 본원에 제공된 용액의 적어도 약 104 세포/ml의 용량으로 제제화될 수 있다. 환자의 치료를 위한 RPE 세포 조제물은 적어도 약 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 1010 RPE 세포/mL의 용량으로 제제화된다.
본원에 기재된 RPE 세포의 조제물은 본원에 기재된 용액, 예컨대, 실시예 1에 기재된 바와 같은 GS2 중에 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 6,000; 7,000; 8,000; 또는 9,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 약제학적 조제물은 적어도 약 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 또는 9x1010개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 약제학적 조제물은 적어도 약 1x102-1x103, 1x102-1x104, 1x104-1x105, 또는 1x103-1x106개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. RPE 세포의 약제학적 조제물은 적어도 약 10,000, 20,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 또는 200,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포의 약제학적 조제물은 적어도 약 50-200 μL의 부피 중에 적어도 약 20,000-200,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 또한, RPE 세포의 약제학적 조제물은 150 μL의 부피 중에 약 50,000개의 RPE 세포, 150 μL의 부피 중에 약 200,000개의 RPE 세포, 또는 적어도 약 150 μl의 부피 중에 적어도 약 180,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.
RPE 세포는 약제학적으로 허용가능한 안구용 비히클 중의 전달을 위해 본원에 제공된 바와 같은 조제물로 제제화될 수 있어서, 조제물은 예를 들어, 전방(anterior chamber), 후방(posterior chamber), 유리체, 수양액, 유리체액, 각막, 홍채/섬모체, 렌즈, 맥락막, 망막, 공막, 맥락막위 공간, 결막, 결막하 공간, 공막바깥 공간, 각막내 공간, 각막바깥 공간, 편평부(pars plana), 수술 유도 무혈관 지역, 또는 황반과 같은 눈의 영향받은 지역을 통과할 수 있도록 충분한 시간 동안 안구 표면과 접촉하여 유지된다.
일부 구현예에서, RPE 세포가 세포의 시트에 함유되어 있는 세포 조제물이 본원에 제공된다. 예를 들어, RPE 세포를 포함하는 세포의 시트는 RPE 세포를 세포의 온전한 시트가 방출될 수 있는 기질, 예컨대, 열반응성 중합체, 예컨대 열반응성 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm)-이식된 표면상에서 배양함으로써 제조될 수 있고, 상기 표면에 세포가 부착되고 배양 온도에서 증식된 다음, 온도 변화시, 표면 특징이 변화되어 배양된 세포의 시트를 방출한다(예컨대, 더 낮은 임계 용액 온도(LCST) 미만으로 냉각함으로써(da Silva et al., Trends Biotechnol. 2007 Dec;25(12):577-83; Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb 15;81(3):473-6; Ide, T. et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614, Sumide, T. et al. (2005), FASEB J. 20, 392-394; Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385; and Nishida, K. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196 참고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있음). 세포의 시트는 예컨대, 세포를 이식을 위한 적합한 기질 상에서 배양함으로써, 또는 세포를 또 다른 기질(예컨대, 열반응성 중합체)로부터의 이식에 적합한 기질 상에 방출시킴으로써 제조된, 숙주 유기체 내로 시트가 이식될 때 생체내에서 용해될 수 있는 기질과 같은, 이식에 적합한 기질에 부착될 수 있다. 이식에 잠재적으로 적합한 예시적인 기질은 젤라틴을 포함할 수 있다(Hsiue et al., 상기 참고). 이식에 적합할 수 있는 대안적인 기질은 피브린계 매트릭스 등을 포함한다. 세포의 시트는 망막 변성의 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. RPE 세포의 시트는 본원에 기재된 용액, 예컨대, GS2 용액과 접촉시킴으로써 이를 필요로 하는 대상의 눈으로 도입하기 위한 세포 또는 조직 조제물로 제제화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 시트는 RPE 세포의 시트의 이식을 이용한 중심와하 막절제술(subfovealmembranectomy)에 의해 이를 필요로 하는 대상의 눈으로 도입될 수 있거나, 또는 중심와하 막절제술 후 이식을 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 의해 제공되는 조제물의 부피는 투여 방식, 전달될 세포의 수, 환자의 연령 및 체중, 및 치료되는 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되는 경우, 본 발명의 RPE 세포의 약제학적 조제물의 부피는 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 또는 5 ml일 수 있다. 부피는 약 1-2 mL일 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되는 경우, 본 발명의 RPE 세포의 약제학적 조제물의 부피는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200 μL(마이크로리터)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조제물의 부피는 약 10-50, 20-50, 25-50, 또는 1-200 μL일 수 있다. 본 발명의 조제물의 부피는 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μL 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조제물은 μL당 약 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 또는 9x104개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조제물은 μL당 2000개의 RPE 세포, 예를 들어, 50 μL당 100,000개의 RPE 세포 또는 90 μL당 180,000개의 RPE 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조제물은 냉장된다. 일부 구현예에서, 조제물은 약 2-8℃에서 냉장된다.
일부 구현예에서, 조제물은 조제물의 보관 동안 세포의 집단 중의 세포의 생존을 지원한다. 일부 구현예에서, 세포 집단 중의 세포의 적어도 70%는 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능하다. 일부 구현예에서, 세포 집단 중의 세포의 적어도 80%는 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능하다. 일부 구현예에서, 세포 집단 중의 세포의 적어도 90%는 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능하다. 일부 구현예에서, 조제물은 조제물의 보관 동안 세포의 집단의 평판배양 효율의 유지를 지원한다. 일부 구현예에서, 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후, 세포의 집단은 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 나타내며, 원래의 평판배양 효율은 보관 기간의 시작시 세포의 집단의 평판배양 효율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 조제물은 보관 용기 내에 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 주사기 내에 있다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 용액 중의 세포 및 조직의 약제학적 조제물을 제공한다. 이러한 조제물은 대상에의 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조제물은 본원에 제공된 바와 같은 세포, 세포 집단, 또는 조직 및 용액으로 본질적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 약제학적 조제물은 하나 이상의 약제학적 활성 성분, 예를 들어, 보존제, 항산화제, 라디칼 제거제, 면역억제제, 혈관신생 촉진 인자, 항-혈관신생 인자, 성장 호르몬, 또는 세포 성장, 생존, 및 착상을 지원하는 세포 영양소 또는 기질을 포함한다.
또한 약제학적 팩 및/또는 키트가 본 발명에 의해 포함된다. 제공되는 약제학적 팩 및/또는 키트는 본원에 제공된 세포 또는 조직 조제물 및 용기(예컨대, 바이알, 앰플, 병, 주사기, 및/또는 냉각기 패키지, 또는 다른 적합한 용기)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공되는 키트는 선택적으로 세포 또는 조직 조제물의 희석, 세정, 및/또는 재구성을 위해 조제물을 제제화하는데 사용되는 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 제제 용기 및 용매 용기의 내용물을 조합하여 적어도 하나의 단위 투여 형태를 형성한다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 조제물, 예컨대, 본원에 제공된 용액 중에 세포의 집단을 포함하는 조제물을 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 세포의 집단을 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 동결보존되거나 펠렛화된 세포의 집단을 용액과 접촉시켜, 세포를 재구성하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 일부 양태는 (a) 세포의 집단을 본원에 제공된 용액과 접촉시켜, 세포 조제물을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 (b)(a)의 세포 조제물을 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 18, 적어도 24, 적어도 36, 적어도 48, 적어도 60, 적어도 72 또는 적어도 96시간 동안 보관하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (c) (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, (c)의 투여는 세포를 대상의 눈에 주사하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물에서 세포 생존력을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 단계 (b)의 보관 기간 동안 (a)의 세포 조제물을 냉장시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 냉장은 세포 조제물을 2-8℃의 온도에서 보관하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 (a)에서 생성된 조제물을 (b)의 보관 기간 내에 조제물이 생성된 위치와 상이한 위치로 운반하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 운반은 조제물을 (c)의 투여가 일어나는 병원 또는 수술실로 운반하는 것을 포함한다.
예시적인 용도 및 방법
본 발명의 개시된 용액은 다양한 임상 적용에 사용될 수 있다. 이러한 적용은 예컨대, 펠렛화 또는 동결보존 후 임상 세척, 세포의 재구성 또는 제제화, 뿐만 아니라, 예컨대, 비제한적으로 대상에게 투여 전 세포 보관 및 운반을 포함하는 임상 적용을 위해, 및/또는 세포, 세포 단일층, 또는 조직의 대상에의 투여를 위한 캐리어 배지로서, 세포의 제제화를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 개시된 용액은, 일부 구현예에서, 세포 재구성을 위한 용액으로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포 재구성"은 세포의 집단을 포함하는 용액을 생성하기 위해, 세포의 집단을 용액, 예컨대, 본원에 제공된 용액과 접촉시키는 공정을 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 재구성하는 것은 세포의 펠렛, 예컨대, 상등액을 버림으로써 원심분리 단계 후에 수득된 세포의 펠렛으로부터 세포의 집단을 포함하는 용액을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액으로 세포의 집단을 재구성하는 것은 본원에 제공된 용액으로 본질적으로 이루어지거나 이루어지는 배지 중의 세포의 집단을 수득하기 위해 세포가 초기에 현탁된 임의의 배지를 희석하거나 대체하는 것을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 본원에 제공된 용액 이외의 배지에 현탁된 세포의 집단은 본원에 제공된 용액으로 1회 이상 세정될 수 있다. 세정 단계는, 일부 구현예에서, 세포를 본원에 제공된 용액과 접촉시키는 단계, 세포를, 예컨대 원심분리에 의해 펠렛화하는 단계, 상등액을 버리는 단계, 및 세포 펠렛을 용액으로 재구성하는 단계를 포함한다. 사용된 용액의 부피 및 세포 펠렛의 부피에 따라, 초기 배지는 본질적으로 단일 세정-재구성 사이클 후, 또는 이러한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 사이클 후 용액에 의해 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 세포 및 조직 제제에 사용될 수 있다. 세포 및 조직의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "제제"는, 세포, 세포의 집단, 또는 조직을 본원에 제공된 용액의 부피와 접촉시켜 임상 용도, 예컨대, 대상에의 투여에 적합한 세포 또는 조직 조제물을 수득하는 것을 지칭한다. 본원에 제공된 용액은, 비제한적으로, 성체 줄기 및 전구 세포, 분화된 세포, 및 이러한 세포를 포함하는 집단 및 조직을 포함하는, 다양한 세포 유형, 세포 집단, 및 조직과 광범위하게 양립가능하다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액에서 제제화된 세포, 세포 집단, 또는 조직은, 예컨대 재생 의학적 접근법에서의 임상 용도를 위한 치료 세포, 세포 집단, 또는 조직이다. 예를 들어, 본원에 제공된 용액에서 제제화된 세포, 세포 집단, 또는 조직은, 일부 구현예에서, 대상에서 소실되거나 변성된 세포를 대체할 수 있거나, 또는 대상에서 손상되거나 기능장애가 있는 조직을 대체할 수 있는 세포의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액에서 제제화된 세포, 세포 집단, 또는 조직은 만능 줄기 또는 전구 세포, 또는 기능적 분화 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 집단 또는 조직 또는 이러한 세포의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 RPE 세포, 광수용체 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 또는 신경 줄기 또는 전구 세포, 교 줄기 또는 전구 세포, 췌장 줄기 또는 전구 세포, 베타 세포, 케라티노사이트, 연골세포, 골아세포, 파골세포, 또는 이러한 세포를 포함하거나 본질적으로 이루어지는 집단 또는 조직, 예컨대, RPE 세포의 단일층, 췌장 섬, 또는 피부 이식편을 제제화하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액 중의 세포의 제제는 임상 용도 때까지(예컨대, 대상에 투여할 때까지) 보관될 수 있고/있거나 임상 현장에 운반될 수 있고, 제공된 대로 대상에게 투여되거나 제제를 원하는 부피 또는 세포의 원하는 농도로 희석시키는 것과 같은 최소로만 처리하여 대상에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 용액은 세포 또는 조직 보관에 유용하다. 세포 및 조직의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이 용어 "보관"은 본원에 제공된 용액 중의 세포(들) 또는 조직(들)의 제제화, 및 세포(들) 또는 조직(들)의 추가 처리 단계 또는 임상 용도 사이의 시간을 지칭한다. 이전에 이용가능한 용액과 달리, 본원에 제공된 용액은 세포 생존력, 재평판배양 효율, 또는 재증식 능력을 단지 최소한으로 감소시키면서, 연장된 기간 동안, 예컨대, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 12, 적어도 18, 적어도 24, 적어도 30, 적어도 36, 적어도 48시간, 적어도 60시간 또는 적어도 72시간 동안, RPE 세포, 광수용체, 및 MSC와 같은 민감한 세포 및 조직을 포함하는 다양한 세포 및 조직 유형의 보관을 지원한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 12, 적어도 18, 적어도 24, 적어도 30, 적어도 36, 적어도 48, 적어도 60 또는 적어도 72시간의 기간 동안 본원에 제공된 용액 중의 세포, 세포 집단, 또는 조직, 예컨대, RPE 세포, 광수용체 세포, 또는 MSC의 보관은 보관 기간의 시작시의 생존력, 재평판배양 효율, 및/또는 재증식 능력의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 세포 생존력, 재평판배양 효율, 및/또는 재증식 능력을 야기한다. 일부 구현예에서, 보관 시간, 예컨대, 세포 또는 조직의 제제화 및 이들의 임상 용도 사이의 시간은, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간을 초과하지 않을 것이다. 전형적으로, 본원에 제공된 용액에서 제제화된 세포 또는 조직은, 예컨대, 2-8℃의 온도로 보관을 위해 냉장된다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포 및 조직은 주위 온도 미만의 온도, 예컨대, 2-8℃의 온도에서 본원에 제공된 용액에 보관된다. 일부 구현예에서, 그러나, 더 높은 온도, 예컨대, 8℃ 내지 16℃ 사이의 온도, 16-22℃, 또는 주위 온도(전형적으로 약 25℃)에서의 보관이 고려된다.
본원에 제공된 용액은 또한 이들의 제제화 후 세포, 세포 집단, 및 조직을 임상 현장에 운반하는데 유용하다. 본원에 제공된 용액은 세포 생존을 지원하고 운반 동안 전단 응력을 포함하는 대사 및 물리적 응력을 최소화한다. 세포 또는 조직 운반은 전형적으로 세포 또는 조직의 보관 기간 내에, 따라서 상기 기재된 바와 같이 보관을 위한 적합한 조건 하에 수행될 것이다. 본원에 제공된 용액에서 제제화된 세포 또는 조직이 냉장 조건 하에, 예컨대, 주위 온도 미만의 온도에서 운반되는 구현예에서, 모바일 냉장 장비의 사용이 운반에 바람직하다. 이러한 장비는, 비제한적으로, 단열처리된 운반 또는 선적 용기, 젖은 얼음 팩, 냉각 젤, 냉각 용기, 및 모바일 냉장 단위를 포함한다. 냉장 운반을 위한 일부 예시적인 적합한 운반 방법, 용기, 및 장치는 본원의 다른 곳에 보다 상세히 기술되며, 당업자는 본 발명에 비추어 추가의 적합한 방법, 용기, 및 장치를 알 것이다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 기재된 바와 같은 임상 용액 또는 세포 또는 조직 조제물의 치료적 유효량을 대상에게 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상은 세포, 세포 집단, 또는 조직을, 예컨대, 본원에 기재된 세포 또는 조직 조제물의 형태로 투여함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖거나 상기 질환 또는 장애로 진단된다. 일부 구현예에서, 대상에게 투여되는 조제물은 대상에서 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 수술을 받고 있으며 본원에 기재된 용액 또는 조제물은 수술 현장을 세척하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에서 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
용어 "치료," "치료하다," 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같이, 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병을 역전시키거나, 개선하거나, 지연시키거나, 또는 이의 진행을 억제하기 위한 임상적 개입을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발병된 후 및/또는 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 치료는, 예컨대, 증상의 발병을 예방하거나 지연시키기 위해 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해, 증상의 부재하에 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 이전에 민감한 개인에게 투여될 수 있다(예컨대, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 요인에 비추어). 치료는 또한, 예를 들어, 이들의 재발을 예방하거나 지연하기 위해 증상이 호전된 후에도 계속될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 개별 유기체, 예를 들어, 개별 포유동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상은 인간이다. 일부 구현예에서, 대상은 비인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상은 비인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상은 설치류이다. 일부 구현예에서, 대상은 양, 염소, 소, 고양이, 또는 개이다. 일부 구현예에서, 대상은 연구 동물이다. 일부 구현예에서, 대상은 유전적으로 조작되고, 예컨대, 유전적으로 조작된 비인간 대상이다. 대상은 어느 한 성별이고 임의의 발달 병기에 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 생물학적 반응을 유발하는데 충분한 생물학적 활성 물질의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 조직 조제물의 유효량은 질환 또는 장애와 연관된 증상을 개선하는데 충분한, 예컨대, 망막 질환 또는 장애를 갖는 대상에서 시력을 개선하는데 충분한 세포의 수 또는 조직의 양을 포함하는 조제물의 양을 지칭할 수 있다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 본원에 제공된 용액 또는 조제물의 유효량은 다양한 인자, 예를 들어, 원하는 생물학적 반응, 예컨대, 치료되는 특정 질환, 완화될 특정 증상, 표적화되는 세포 또는 조직, 및 대상의 연령, 성별, 및 일반 건강 상태에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일부 양태는 본원에 제공된 바와 같은 용액 또는 조제물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 용액 또는 조제물을 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 24, 적어도 36, 또는 적어도 48시간 동안 조제물의 보관 후 조제물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 망막 질환을 갖거나 망막 질환으로 진단된다. 일부 구현예에서, 망막 질환은 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시, 또는 스타가르트 질환이다. 일부 구현예에서, 조제물은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 RPE 세포, 광수용체 세포, 또는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 망막 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 제공된 세포 조제물의 유효량을 망막 질환을 갖는 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 망막 질환을 갖거나 망막 질환으로 진단된다. 일부 구현예에서, 망막 질환은 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시, 또는 스타가르트 질환이다. 일부 구현예에서, 조제물은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 RPE 세포, 광수용체 세포, 또는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "질환의 증상을 모니터링하는 것"은 일정 기간 동안 복수의 시점에 질환의 증상의 중증도를 평가하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 증상의 중증도는 대상의 치료가 시작되기 전에 대상에서 평가될 수 있고 치료 후 일정 기간 후 다시 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 모니터링은 유사한 대상(예컨대, 동일한 종, 성별, 연령, 일반 건강 상태 등의 대상)에서 증상의 측정가능한 개선을 초래하는 치료에 충분한 것으로 알려지거나 예상되는 시간 후 증상의 중증도를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 모니터링은 규칙적인 간격으로 증상의 중증도를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 망막 장애를 치료받고 있는 대상에서, 대상의 시력에 대한 초기 평가가 수행될 수 있다. 당업자는 이러한 평가가 예시적이라는 것과 다른 평가가 대상의 시력 평가 대신에 또는 추가적으로 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 평가는 망막 변성, 망막 박리, 황반 변성 등의 수준을 포함할 수 있다. 대상이 본원에 제공된 세포 조제물, 예컨대, 본원에 제공된 바와 같이 GS2 배지 중에 RPE 세포의 유효량을 포함하는 조제물을 투여함으로써 치료되면, 대상의 시력은 이상적으로, 투여된 세포를 착상시키고 이들의 기능을 수행하게 하는 수술 후 시간이 경과한 후에, 예를 들어, 약 1주일, 약 2주일, 약 3주일, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 또는 약 1년 후에, 다시 평가될 수 있다. 수술 후 평가의 결과는 기록되고 증상이 개선되었는지, 예컨대, 대상에서 시력의 수준이 회복되었는지 결정하기 위해 수술 전 평가와 비교될 수 있다. 평가는 증상의 완화가 여전히 진행중인지 또는 종점에 도달하였는지 결정하기 위해 1회 또는 여러 번 반복될 수 있다. 수술 후 모니터링의 결과에 따라, 평가된 증상을 (더) 개선하기 위해 추가적인 수술 절차가 계획될 수 있다. 초기 수술 후 개선이 관찰되지 않으면, 증상의 완화를 용이하게 하기 위해 세포 또는 조직 조제물의 투여량이 증가될 수 있다.
망막 질환의 치료 방법은 본원에 제공된 바와 같은 유효량의 RPE 세포 조제물, 예컨대, 본원에 기재된 GS2 배지 중에 RPE 세포의 유효량을 포함하는 조제물의 단일 용량의 투여를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 치료 방법은 RPE 세포가 일정 기간 동안 여러 번 투여되고 세포의 각각의 투여량이 증상의 질환을 완화시키는데 효과적이거나 복수의 용량이 누적하여 유효량을 전달하는 요법의 과정을 포함할 수 있다. 예시적인 치료 과정은 주간, 격주, 월간, 분기별, 반년 또는 연간 치료를 포함할 수 있다. 대안적으로, 치료는 단계적으로 진행될 수 있고, 이에 의해 복수의 용량이 초기에 투여되고(예컨대, 첫 1주일 동안 매일 용량), 이후에는 더 적고 덜 빈번한 용량이 필요하다.
본원에 기재된 바와 같은 RPE 세포 조제물, 예컨대, GS2 용액 중에 RPE 세포를 포함하는 조제물이 안구내 주사에 의해 투여되는 경우, RPE 세포 조제물은 환자의 생애 내내 주기적으로 1회 이상 전달될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포 조제물은 1년에 1회, 6-12개월에 1회, 3-6개월에 1회, 1-3개월에 1회, 또는 1-4주에 1회로 전달될 수 있다. 대안적으로, 특정 병태 또는 장애의 경우 보다 빈번한 투여가 바람직할 수 있다. 임플란트 또는 장치에 의해 투여되는 경우, RPE 세포는 치료되는 특정 환자 및 장애 또는 병태에 필요한 바와 같이, 환자의 생애 내내 주기적으로 1회, 또는 1회 이상 투여될 수 있다. 시간이 경과함에 따라 변화하는 치료 요법이 유사하게 고려된다. 예를 들어, 처음에는 보다 빈번한 치료가 필요할 수 있다(예컨대, 매일 또는 매주 치료). 시간이 경과함에 따라, 환자의 병태는 개선되기 때문에, 덜 빈번한 치료가 필요하거나 또는 심지어 더 이상의 치료가 필요하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 방법은 대상에서 망막전위도 반응, 광운동시력 임계값, 또는 휘도 임계값을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 또한 눈에서 세포의 면역원성 또는 세포의 이동을 모니터링함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.
RPE 세포 또는 RPE 세포를 포함하는 조제물 및 본원에 제공된 임상 용액, 예컨대, GS2 용액은, 망막 변성을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 실명의 치료에서 본원에 개시된 RPE 세포를 포함하는 조제물의 용도를 포함한다. 예를 들어, 인간 RPE 세포를 포함하는 조제물은 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 많은 시력 변화 질환과 연관된 망막 변성, 예컨대 당뇨병성 망막병증, 황반 변성(연령 관련 황반 변성, 예컨대, 습식 연령 관련 황반 변성 및 건식 연령 관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 및 스타가르트 질환(황반안저)을 치료하는데 사용될 수 있다. 조제물은 광수용체 손상 및 실명을 초래하는 많은 시력 변화 질환과 연관된 망막 변성, 예컨대 당뇨병성 망막병증, 황반 변성(연령 관련 황반 변성 포함), 색소성 망막염, 및 스타가르트 질환(황반안저)을 치료하기 위해 망막에 투여될 수 있는 적어도 약 5,000-500,000개의 RPE 세포(예컨대, 100,00개의 RPE 세포)를 포함할 수 있다.
대상의 치료를 위한 조제물에 사용되는 세포, 예컨대, 본원에 제공된 RPE 세포 조제물에 사용되는 RPE 세포는 인간 세포일 수 있다. 인간 세포는 인간 환자뿐만 아니라 동물 모델 또는 동물 환자에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 세포는 망막 변성의 마우스, 랫트, 고양이, 개, 또는 비인간 영장류 모델에서 시험될 수 있다. 또한, 인간 세포는 수의학에서와 같이, 이를 필요로 하는 동물을 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 망막 질환을 치료하는 방법은 본원에 제공된 임상 조제물의 투여와 시간상 가까운 면역억제제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 면역억제제는 비제한적으로 항-림프구 글로불린(ALG) 다중클론 항체, 항-흉선 글로불린(ATG) 다중클론 항체, 아자티오프린, 바실릭시맙(BASILIXIMAB)®(항-IL-2Rα 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙(DACLIZUMAB)®(항-IL-2Rα 수용체 항체), 에베로리무스, 미코페놀산, 리툭시맙(RITUXIMAB)®(항-CD20 항체), 시로리무스, 및 타크로리무스를 포함한다. 면역억제제는 적어도 약 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg로 투여될 수 있다. 면역억제제가 사용되는 경우, 이들은 전신 또는 국소 투여될 수 있고, 이들은 RPE 세포의 투여 전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 면역억제 요법은 RPE 세포의 투여 후 몇 주, 몇 개월, 몇 년, 또는 무한으로 계속될 수 있다. 예를 들어, 환자는 RPE 세포의 투여 후 6주 동안 5 mg/kg 사이클로스포린이 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 용액은 임상 세척 용액으로 사용될 수 있다. 이러한 용액은 임상 세척, 예를 들어, 상처 또는 수술 부위의 세척에 유용하다. 용어 "세척"와 상호교환적으로 사용되는 본원에 사용된 용어 "임상 세척"는 일반적으로 용액, 전형적으로 수용액을 상처 또는 수술 부위에 투여하는 것을 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같은 세척 용액은 다양한 목적으로, 예를 들어, 조직 수화, 세정, 파편 또는 표면 병원균의 제거, 윤활, 조직 유착의 회피, 또는 시각적 검사를 돕기 위한 목적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세척는 개방된 상처 또는 수술 부위에 일정한 흐름의 세척 용액을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 간헐적으로 투여된다. 투여 방식뿐만 아니라 투여되는 세척 용액의 부피 및 유속은 특정 상황, 예컨대, 상처의 크기, 세척되는 조직, 및 상처 또는 수술 부위의 상태(예컨대, 파편의 존재, 표면 병원균에 대한 노출)에 따라 달라질 것이다. 당업자는 투여에 적합한 적절한 방법 및 장치뿐만 아니라 적합한 부피 및 유속을 확인할 수 있을 것이다.
일부 상황하에서 간단한 세척 용액이 세척 목적의 일부를 달성하는데 충분할 수 있지만, 종래의 세척 용액, 예컨대 식염수, 인산 완충 식염수(PBS), 소독제, 또는 항생제는 일부 수술 환경에서 민감한 세포 또는 조직의 생존을 지원하지 않을 수 있거나 이에 세포독성을 나타내지 않을 수 있어, 수술 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
한 가지 흔히 사용되는 임상 세정제인 정상 식염수(물 중에 0.9% NaCl)는 등장성이며, 낮은 독성, 생리학적 특성(pH 및 삼투압몰농도), 조제 및 멸균(증기 멸균 포함)의 편의성, 및 주위 온도에서 긴 유효 기간으로 인해 상처 세척에 자주 사용된다. 정상 식염수의 한 가지 단점은 민감한 세포 또는 조직의 연장된 생존을 지원하지 않는다는 점과 다른 세척 용액과 비교하여 정상 식염수로 세척 후 비교적 높은 상처 감염률이 보고되었다는 점이다.
민감한 수술 부위 또는 상처, 예컨대, 안구 수술 동안, 정상 식염수 또는 다른 간단한 세척 용액을 이용한 세척에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있는 부위 또는 상처를 세척하기 위해, 많은 상업적으로 이용가능한 수술 세척 용액이 개발되었다. 예컨대, 외과 수술 동안, 민감한 세포 또는 조직에 대한 외상을 방지하기 위해 수술 동안 사용하기 위한 현재 이용가능한 수술 세척 용액 내에는 전형적으로 4개의 핵심 성분인 삼투압몰농도를 유지하기 위한 작용제, 칼슘의 공급원, 마그네슘의 공급원 및 완충화제가 있다.
본 발명의 일부 구현예는 수술 부위를 본원에 제공된 용액, 예컨대, GS2 용액으로 세척하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 수술 부위는 대상의 눈이다.
수술 부위를 세척하기 위한 방법 및 장치는 당업자에게 널리 알려져 있다. 당업자는 사용된 전달 방법, 부피, 및 압력이 수술 부위의 성질 및 상태에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 임상 세척를 위한 적합한 장치는, 비제한적으로, 전구 주사기, 피스톤 주사기, 압력 용기, 월풀 교반기, 월풀 호스 분무기, 주입 캡 또는 노즐을 갖는 플라스틱 용기 내의 세척 유체, 및 펄스식 세정 장치(예컨대, 제트 세정, 기계 세정, 박동식 세정, 기계식 세척, 고압 세척 장치)를 포함한다.
일부 구현예에서, 세척는 연속적이며, 세정제의 중단되지 않는 흐름이 수술 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, 펄스식 또는 간헐적 세척가 사용되며, 여기서 세정제의 간헐적 또는 중단된 전달이 수행된다. 세척 부피는 수술 부위의 특징, 및 세척 목적(상처 세정, 수화 등)에 따라 달라질 것이다.
키트
본 발명의 일부 양태는 (a) 본원에 제공된 용액; 및 (b) 세포 집단을 (a)의 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하기 위한 지침; 및 (c) (b)의 접촉 및/또는 (b)의 세포 조제물의 보관을 위한 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, (a)의 용액 및 (c)의 용기는 대상에게 이식하기 위한 (b)의 세포 조제물의 사용에 적합하다.
따라서 본 발명은 특히 다음을 제공한다:
제1항. 용액으로서,
(a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제; 및
(b) 적어도 2 mM 또는 적어도 0.05%(w/v) 글루코스; 및
(c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제
를 포함하는 용액.
제2항. 제1항에 있어서, 용액이 적어도 5 mM 또는 적어도 0.1%(w/v) 글루코스를 포함하는 것인 용액.
제3항. 제1항에 있어서, 용액이 적어도 7.5 mM 또는 적어도 0.14%(w/v) 글루코스를 포함하는 것인 용액.
제4항. 제1항에 있어서, 용액이 적어도 10 mM 또는 적어도 0.2%(w/v) 글루코스를 포함하는 것인 용액.
제5항. 제1항에 있어서, 용액이 적어도 15 mM 또는 적어도 0.25%(w/v) 글루코스를 포함하는 것인 용액.
제6항. 제1항에 있어서, 용액이 적어도 20 mM 또는 적어도 0.4%(w/v) 글루코스항를 포함하는 것인 용액.
제7항. 제1항에 있어서, 용액이 적어도 25 mM 또는 적어도 0.5%(w/v) 글루코스를 포함하는 것인 용액.
제8항. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 2가 양이온의 공급원을 추가로 포함하는 것인 용액.
제9항. 제8항에 있어서, 2가 양이온의 공급원이 칼슘 및/또는 마그네슘 공급원을 포함하는 것인 용액.
제10항. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 아세트산염 완충제 및/또는 구연산염 완충제를 포함하는 것인 용액.
제11항. 용액으로서,
(a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제로서, 디카보네이트 완충제는 아닌 완충제; 및
(b) 글루코스; 및
(c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제; 및
(d) 2가 양이온의 공급원
을 포함하는 용액.
제12항. 제11항에 있어서, (d)의 2가 양이온의 공급원이 칼슘 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함하는 것인 용액.
제13항. 제11항 또는 제12항에 있어서, 완충제가 아세트산염 완충제 및/또는 구연산염 완충제를 포함하는 것인 용액.
제14항. 제9항, 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원은 약제학적으로 허용가능한 칼슘 염을 포함하는 것인 용액.
제15항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원은 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염을 포함하는 것인 용액.
제16항. 제14항 또는 제15항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 칼슘 및/또는 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염이 아세트산, 아스코르브산, 구연산, 염산, 말레산, 옥살산, 인산, 스테아르산, 석신산, 및 황산을 포함하는 군으로부터 선택되는 산을 이용하여 형성된 칼슘 및/또는 마그네슘 염의 군으로부터 선택되는 것인 용액.
제17항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원이 염화칼슘을 포함하는 것인 용액.
제18항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원이 염화칼슘 이수화물을 포함하는 것인 용액.
제19항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원이 염화마그네슘을 포함하는 것인 용액.
제20항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원이 염화마그네슘 육수화물을 포함하는 것인 용액.
제21항. 제10항 및 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 구연산염 완충제가 구연산 나트륨으로서 제공되는 것인 용액.
제22항. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스가 D-글루코스(덱스트로스)인 용액.
제23항. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제가 염인 용액.
제24항. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제가 나트륨 염인 용액.
제25항. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제가 염화나트륨인 용액.
제26항. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 및 글루코스를 포함하는 것인 용액.
제27항. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 pH가 6.8-7.8인 용액.
제28항. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 pH가 7.4-7.5인 용액.
제29항. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 pH가 약 7.5인 용액.
제30항. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 등장성인 용액.
제31항. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 고장성인 용액.
제32항. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 270-345 mOsm/l의 삼투압몰농도를 나타내는 것인 용액.
제33항. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 삼투압몰농도가 약 315 mOsm/l인 용액.
제34항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가 0.25-0.75 mM인 용액.
제35항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가 0.4-0.65 mM인 용액.
제36항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가 0.5-0.6 mM이거나, 또는 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가 0.5-0.9 mM이거나, 또는 칼슘 공급원의 농도가 0.6-0.8 mM인 용액.
제37항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가 약 0.6 mM이거나 또는 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가 약 0.7 mM인 용액.
제38항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원의 농도가 0.05-5 mM인 용액.
제39항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원의 농도가 0.1-0.3 mM인 용액.
제40항. 제9항, 제10항 및 제12항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원의 농도가 약 0.3 mM인 용액.
제41항. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스의 농도가 5-50 mM인 용액.
제42항. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스의 농도가 10-25 mM인 용액.
제43항. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스의 농도가 10-20 mM인 용액.
제44항. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스의 농도가 약 16 mM인 용액.
제45항. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제의 농도가 약 100-200 mM인 용액.
제46항. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제의 농도가 약 125-175 mM인 용액.
제47항. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제의 농도가 약 150 mM인 용액.
제48항. 제10항 및 제13항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도가 0.1-5 mM인 용액.
제49항. 제10항 및 제13항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도가 0.5-2 mM인 용액.
제50항. 제10항 및 제13항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도가 약 1 mM인 용액.
제51항. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 칼륨 염을 추가로 포함하는 것인 용액.
제52항. 제51항에 있어서, 칼륨 염이 염화칼륨인 용액.
제53항. 제51항 또는 제52항에 있어서, KCl의 농도가 0.2-5 mM인 용액.
제54항. 제53항에 있어서, KCl의 농도가 1-2.5 mM인 용액.
제55항. 제54항에 있어서, KCl의 농도가 약 2 mM인 용액.
제56항. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.03 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 및 약 145 mM NaCl을 포함하거나, 또는 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 및 약 145 mM NaCl를 포함하거나, 또는 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.5-0.9 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 및 약 116-174 mM NaCl을 포함하는 것인 용액.
제57항. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.85% NaCl, 약 0.01% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.006% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.035% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.29% 덱스트로스를 포함하거나, 또는 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.68-1.02% NaCl, 약 0.008-0.012% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.0048-0.0072% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.028-0.042% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.23-0.35% 덱스트로스를 포함하는 것인 용액.
제58항. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 2 mM KCl을 추가로 포함하는 것인 용액.
제59항. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 점탄성 중합체를 추가로 포함하는 것인 용액.
제60항. 제59항에 있어서, 중합체가 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물인 용액.
제61항. 제59항 또는 제60항에 있어서, 중합체가 히알루론산 나트륨인 용액.
제62항. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 용액 내의 세포가 전단 응력에 노출되는 것을 감소시키는데 효과적인 농도로 존재하는 것인 용액.
제63항. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체의 농도가 0.005-5% w/v인 용액.
제64항. 제63항에 있어서, 중합체의 농도가 약 0.05% w/v인 용액.
제65항. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.03 mM MgCl(염화마그네슘), 약 2 mM KCl, 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 0.05% 히알루론산을 포함하거나, 또는 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 2 mM KCl, 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 0.05% 히알루론산을 포함하거나, 또는 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 약 0.5-0.8 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1.6-2.4 mM KCl, 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 약 116-174 mM NaCl, 및 약 0.04-0.06% 히알루론산을 포함하는 것인 용액.
제66항. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 탄산염 완충제를 포함하지 않는 것인 용액.
제67항. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 글루타티온, 또는 글루타티온 이황화물(GSSG)을 포함하지 않는 것인 용액.
제68항. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 양쪽성이온 유기 완충제를 포함하지 않는 것인 용액.
제69항. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 용질의 측정가능한 침전 및/또는 용액 중에 보관된 세포의 생존 및 생존력을 지원하는 용액의 능력의 측정가능한 손실 없이, 용액이 25℃에서 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 1개월 동안 보관될 수 있는 것인 용액.
제70항. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 용질의 측정가능한 침전 및/또는 용액 중에 보관된 세포의 생존 및 생존력을 지원하는 용액의 능력의 측정가능한 손실 없이, 용액이 2-8℃에서 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 1개월 동안 보관될 수 있는 것인 용액.
제71항. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 대상에게 투여하는데 적합한 것, 대상의 눈에 투여하는데 적합한 것 및/또는 대상의 눈으로 세포를 이식하는데 적합한 것인 용액.
제72항. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 본질적으로 발열원이 없는 것인 용액.
제73항. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 멸균인 용액.
제74항. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 세척, 세포 재구성, 세포 보관, 세포 운반, 및/또는 대상에의 투여를 위한 것인 용액.
제75항. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액 중에 세포의 집단을 포함하는 조제물.
제76항. 제75항에 있어서, 세포의 집단이 대상으로의 이식에 적합한 것인 조제물.
제77항. 제76항에 있어서, 세포의 집단이 대상의 눈으로의 이식에 적합한 것인 조제물.
제78항. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 RPE 세포를 포함하는 것인 조제물.
제79항. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 광수용체 세포를 포함하는 것인 조제물.
제80항. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단이 중간엽 세포를 포함하는 것인 조제물.
제81항. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 조제물이 냉장되는 것인 조제물.
제82항. 제81항에 있어서, 조제물이 약 2-8℃에서 냉장되는 것인 조제물.
제83항. 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 조제물이 조제물의 보관 동안 세포의 집단 중의 세포의 생존을 지원하고, 세포 집단 중의 세포의 적어도 70%가 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후에 생존가능한 것인 조제물.
제84항. 제83항에 있어서, 세포 집단 중의 세포의 적어도 80%가 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능한 것인 조제물.
제85항. 제83항에 있어서, 세포 집단 중의 세포의 적어도 90%가 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능한 것인 조제물.
제86항. 제75항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 조제물이 조제물의 보관 동안 세포의 집단의 평판배양 효율의 유지를 지원하고, 세포의 집단이 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 70%를 나타내며, 원래의 평판배양 효율은 보관 기간의 시작시의 세포의 집단의 평판배양 효율인 조제물.
제87항. 제86항에 있어서, 세포의 집단이 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 80%를 나타내는 것인 조제물.
제88항. 제86항에 있어서, 세포의 집단이 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 90%를 나타내는 것인 조제물.
제89항. 제75항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 조제물이 보관 용기 내에 있는 것인 조제물.
제90항. 제75항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 조제물이 주사기 내에 있는 것인 조제물.
제91항. 세포의 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조제물을 제조하는 방법.
제92항. 제91항에 있어서, 방법이 동결보존되거나 펠렛화된 세포의 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액과 접촉시켜 세포를 재구성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제93항. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액 또는 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조제물을 포함하는 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물은 대상에게 투여하는데 적합한 것인 약제학적 조성물.
제94항. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액 또는 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조제물 또는 제88항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제95항. 제94항에 있어서, 방법이 용액 또는 조제물을 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제96항. 제94항 또는 제95항에 있어서, 방법이 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 24, 적어도 36, 또는 적어도 48시간 동안 조제물의 보관 후 조제물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제97항. 제96항에 있어서, 대상이 망막 질환을 갖거나 망막 질환으로 진단된 것인 방법.
제98항. 제97항에 있어서, 망막 질환이 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시, 또는 스타가르트 질환인 방법.
제99항. 제97항 또는 제98항에 있어서, 조제물이 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포의 집단을 포함하는 것인 방법.
제100항. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제101항. (a) 세포의 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하는 단계
를 포함하는 방법.
제102항. 제101항에 있어서,
(b)(a)의 세포 조제물을 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 18, 적어도 24, 적어도 36, 적어도 48, 적어도 60, 또는 적어도 72시간 동안 보관하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제103항. 제102항에 있어서, 방법이
(c) (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물을 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제104항. 제103항에 있어서, (c)의 투여가 세포를 대상의 눈에 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
제105항. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물에서 세포 생존력을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제106항. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 단계 (b)의 보관 기간 동안 (a)의 세포 조제물을 냉장시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제107항. 제106항에 있어서, 냉장이 세포 조제물을 2-8℃의 온도에 보관하는 것을 포함하는 것인 방법.
제108항. 제75항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조제물 또는 제93항의 약제학적 조성물의 유효량을 망막 질환을 갖는 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 망막 질환을 치료하는 방법.
제109항. 제108항에 있어서, 망막 질환이 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시, 또는 스타가르트 질환인 방법.
제110항. (a) 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 용액;
(b) 세포 집단을 (a)의 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하기 위한 지침; 및
(c) (b)의 접촉 및/또는 (b)의 세포 조제물의 보관을 위한 용기
를 포함하는 키트.
제111항. 제110항에 있어서, (a)의 용액 및 (c)의 용기가 대상에의 이식을 위한 (b)의 세포 조제물의 사용에 적합한 것인 키트.
실시예
도입
RPE 세포를 SMD 및 AMD를 갖는 대상의 눈에 투여하기 위한 1상 임상 시험을 RPE 세포 제제, 보관, 및 이식 배지 배지로서 알콘(Alcon) BSS PLUS®을 사용하여 수행하였다. BSS PLUS®은 안구내 수술에서 사용하기 위해 승인된 생리학적으로 양립가능한(삼투압몰농도 ~310 mOs, pH ~ 7.4) 용액이다. BSS PLUS®에서 제제화된 RPE 세포의 유효 기간은 임상 투여(주사) 전에 2-8℃에서 보관될 때 약 4시간으로 제한된다. 이러한 제한된 제품 유효 기간으로 인해, 위성 세포(satellite cell) 처리 실험실은 시험에 참여하는 각 임상 현장에 근접하여 확립되어야 했다.
최종 제품 유효 기간을 유의하게 연장시키는(예컨대, 48시간 이상) 배지를 개발하는 것은 많은 이점을 제공할 것이다. 향상된 유효 기간은 최종 제품이 미국 내의 모든 임상 현장으로 선적될 수 있는 단일 위치에서 최종 제품 제제가 통합될 수 있게 할 것이다. 이 방식으로, cGMP 처리 현장에 근접하여 위치하는 것으로 현재 제한된 임상 현장의 수가 확장될 수 있다. 연장된 제품 유효 기간은 또한 다수의 물질 재고를 유지하고, 인력을 훈련시키고, 다수의 위성 처리 현장을 감독하는 것과 연관된 물류 복잡성을 제거한다. 연장된 유효 기간은 현재 빡빡한 4시간 창 내에서 일어나야 하는 이식을 계획하는데 있어 유연성을 향상시킨다.
최종 제품 유효 기간을 연장하는 것은 환자가 수술을 준비하거나 수술실(OR)에 들어가기 전에 임의의 지연 또는 취소의 통지를 위한 충분한 시간을 허용할 것이다. 또한, 최종 제품이 품질 방출 시험을 실패하면, 수술을 지연하거나 취소하지 않고 동일한 날에 최종 제품의 추가의 제제를 제조할 수도 있다. 유효 기간을 연장하는 것은 아래에 제안된 미생물 오염물의 존재를 검출하기 위해 범(pan) 프라이머를 사용하는 DNA qPCR과 같은 최종 제품 방출 시험을 보완하기 위한 추가의 시간을 허용한다.
BSS Plus®에서 제제화된 RPE 최종 제품을 MedOne REF 3233 폴리팁(PolyTip)® 캐뉼라 23/38을 통해 전달하였다. 현재의 BSS PLUS® 제제를 사용하여, ~23%의 생존가능 세포 밀도의 평균 손실이 관찰되었다. 이러한 손실은 시험된 모든 세포 밀도에서 일관되었고, 생존력 또는 이후에 배양에서 시드하고, 증식하고, 분화하는 능력 측면에서 캐뉼라를 통해 압출된 세포의 나머지 77%에 명백한 영향을 미치지 않았다. 유착으로 인한 일부 세포 손실이 예상될 수 있지만, 이후 실험은 캐뉼라 압출 동안 생성된 전단력에 기여하는 세포 손실 및 아마도 세포 용해와 일치하였다. 따라서, 예상된 손실을 보상하기 위해, 캐뉼라 부하 밀도는 이에 따라 증가되어 필요한 용량이 전달되는 것을 보장한다. 유효 기간을 향상시키는 것 외에도, 적합한 점탄성 특성을 갖는 최종 제제 배지는 캐뉼라 전달 동안 세포 손실을 최소화한다. 세포 손실을 최소화하는 것은 세포 파편의 전달을 감소시켜 세포내 성분에 대한 잠재적인 면역 반응을 완화시킨다.
실시예 1: 배지 조성
GS2 배지
세포 재구성, 보관, 운반, 및/또는 대상에의 투여를 위한 배지를 제조하였다. "GS2"로 불리는 배지를 하기와 같이 제조하였다:
48.75 ml의 물 중의 0.9% NaCl;
13.10 ml의 물 중의 알콘 평형화된 염 용액(BSS®), 300 mOsm; 및
3.75 ml의 0.9% NaCl(물 중에서) 중의 5% 덱스트로스(560 mOsm)
를 조합하여 0.29% 덱스트로스의 최종 농도 및 315 mOsm의 삼투압몰농도를 갖는 65.6 mL 배지를 수득하였다.
따라서, 기본 GS2 배지는 물 중에,
약 145 mM NaCl(약 0.85% NaCl),
약 2 mM KCl(약 0.015% KCl),
약 0.7 mM CaCl(염화칼슘)(약 0.01% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물)),
약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘)(약 0.006% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물)),
약 1 mM 구연산 나트륨(약 0.035% 구연산 나트륨 이수화물), 및
약 16 mM 글루코스(약 0.29% 덱스트로스)
를 포함한다.
선택적으로, GS2 배지는, 예컨대, 약 0.005-5% w/v의 최종 농도로, 세포 상의 전단 응력을 감소시키는데 효과적인 양의 점탄성 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 점탄성 중합체는 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물이다.
알콘 평형화된 염 용액(BSS®)
알콘 평형화된 염 용액(BSS® 멸균 세척 용액)은 멸균 평형화된 염 용액으로,
0.64% 염화나트륨(NaCl),
0.075% 염화칼륨(KCl),
0.048% 염화칼슘 이수화물(CaCl2·2H2O),
0.03% 염화마그네슘 육수화물(MgCl2·6H2O),
0.39% 아세트산 나트륨 삼수화물(C2H3NaO2·3H2O),
0.17% 구연산 나트륨 이수화물(C6H5Na3O7·2H2O),
수산화나트륨 및/또는 염산(pH를 조절하기 위해),
및 주사용수
를 함유한다.
BSS®의 pH는 약 7.5이며 삼투질농도는 약 300 mOsm/Kg이다.
따라서, 알콘 BSS는
약 109 mM NaCl,
약 10 mM KCl
약 3 mM CaCl(염화칼슘)
약 0.1 mM MgCl(염화마그네슘)
약 5 mM 구연산 나트륨
을 포함한다
알콘 평형화된 염 용액 PLUS(BSS® PLUS)
알콘 평형화된 염 용액 PLUS(BSS PLUS®)는 안구내 수술 절차 동안 사용하기 위한 멸균 안구내 세척 용액이다. 그것은 "부분 I" 및 "부분 II"로 불리는 2개의 부분으로부터 사용하기 전에 재구성된다.
부분 I은 500 mL 단일 용량 병 내의 멸균 480 mL 용액이며, 상기 병에 부분 II 농축물이 첨가된다. BSS PLUS®의 부분 I은
7.440 mg/ml 염화나트륨,
0.395 mg/ml 염화칼륨,
0.433 mg/ml 인산수소 이나트륨,
2.190 mg/ml 중탄산 나트륨,
염산 및/또는 수산화나트륨(pH를 조절하기 위해), 및
주사용수
를 함유한다.
부분 II은 부분 I에 첨가하기 위한 20 ml 단일 용량 바이알 내의 멸균 농축물이다. BSS PLUS®의 부분 II는:
3.85 mg/ml 염화칼슘 이수화물,
5 mg/ml 염화마그네슘 육수화물,
23 mg/ml 덱스트로스,
4.6 mg/ml 글루타티온 이황화물(산화된 글루타티온), 및
주사용수
를 함유한다.
BSS PLUS® 부분 II를 부분 I 병에 첨가 후, 재구성된 제품은:
주사용수 중에,
7.14 mg/ml 염화나트륨,
0.38 mg/ml 염화칼륨,
0.154 mg/ml 염화칼슘 이수화물,
0.2 mg/ml 염화마그네슘 육수화물,
0.42 mg/ml 인산수소 이나트륨,
2.1 mg/ml 중탄산 나트륨,
0.92 mg/ml 덱스트로스,
글루타티온 이황화물(산화된 글루타티온) 0.184 mg/ml,
염산 및/또는 수산화나트륨(pH를 조절하기 위해)
을 함유한다.
재구성된 제품은 약 7.4의 pH 및 약 305 mOsm의 삼투질농도를 갖는다.
실시예 2: BSS-Plus®에서 제제화된 RPE 최종 제품의 유효 기간
BSS Plus®에서 제제화된 RPE 최종 제품은 저온 보관(2-8℃)에서 4시간 동안 그의 생존력을 유지하였다. 최종 제품 유효 기간의 더 포괄적인 평가가 완료되었다. 이 연구에서, RPE 벌크 제품을 해동하고 2개의 생존가능한 세포 밀도로 제제화화하였고, 이를 2,000개의 생존가능한 세포/μl의 최종 보관 밀도로 일괄하여 다루었다. 이 보관 밀도는 제조된 모든 용량에 대해 일정하였다. 미리 측정된 부피의 BSS Plus®을 이용한 세포의 최종 희석은 주사기에 로딩하기 바로 전에 OR에서 수행된다. 이 희석 단계는 150μL 주사 부피(또한 모든 용량에 대해 일정함)로 전달된 최종 세포 밀도를 결정한다.
저온에서 보관된 최종 BSS-Plus® 제제화된 RPE 세포 제품의 세포 생존력, 생존가능 세포 밀도, 순도, 및 효능을 제제시(0시간)에 그리고 저온 보관(2-8℃)에서 4 및 6시간 후 평가하였다. 생존가능 세포 밀도 및 세포 생존력은 저온 보관에서 6시간 동안 일정한 것으로 나타났다. 또한, 0, 4, 및 6시간 동안 보관된 제제화된 RPE 세포를 후속 순도 및 효능 평가를 위해 시딩하고 배양하였다. 시딩된 각 시점(0, 4, 및 6시간)에 대해, 순도를 MITF 및 PAX6 면역염색에 의해 평가하였고, 효능을 식균된 입자의 FACS 분석을 측정함으로써 평가하였다. 데이터는 시험된 모든 제품 속성이 평가된 6시간 동안 일정하게 유지되었음을 보여준다.
BSS Plus®에서 12시간 동안 보관된 RPE 세포는 일반적으로 70% 미만의 생존력을 나타내며 BSS-Plus에서 24시간 후, RPE 세포 생존력은 전형적으로 20% 미만이다.
실시예 3: 개선된 세포 재구성, 보관, 운반, 및/또는 이식 배지의 개발
세포 재구성(예컨대, 동결보존된 상태로부터), 세포 보관(예컨대, 세포 배양으로부터 재구성 또는 채취 및 이식 시설로의 운반 또는 대상에의 투여 사이에 저온 보관), 세포 운반, 및 세포 이식을 위한 개선된 배지를 개발하였다. 생성된 배지(GS2)의 성분이 하기 표 1에 열거되어 있다. 예시적인 공급업체가 제공된다. 당업자는 열거된 성분의 추가 공급원이 존재한다는 것을 알 것이며, 이들 시약의 적합한 공급원을 확인할 수 있을 것이다:
GS2 최종 제제는 pH(7.2-7.6) 및 삼투압몰농도(계산된 삼투압몰농도 315)의 관점에서 생리학적이다.
GS2 배지를 Iso-5 BSC 내의 전용 RPE 세포 최종 제품 Iso-7 클린룸에서 제제화하고 분배하였다. 표 1의 멸균 성분을 멸균 저장조에 첨가하고 회전 쉐이커(30-40 RPM)에 두었다. 최소 3시간 후, 샘플을 저장조에서 꺼내어 pH를 측정하고 0.1N NaOH를 증분 첨가하여 7.4 +/- 0.2의 pH로 조정하였다. 충진을 위한 GS2는 pH 탐침과 접촉하지 않았다. 용액을 막 필터 멸균하고 pH를 재확인하였다.
GS2의 3 ml 분취량을 USP 클래스 VI 한계를 충족시키는 버진 폴리프로필렌 수지로 구성된 감마 조사된 냉동바이알 내로 분배하였다. 샘플을 충진된 각 바이알로부터 꺼내어, 바이알의 뚜껑을 덮었다. QC 시험을 하기에 기재된 바와 같이 모은 샘플 상에서 수행하였다. 각 바이알을 가시광선 및 자외선 하에 육안 검사하여 미립자의 부존재를 확인하였다. 바이알을 라벨링을 위해 멸균 조건으로 되돌리고, 2-8℃에서 보관하였다. 저온 보관에서 최소 하루 후, 몇 개의 바이알을 꺼내고 pH를 2-8℃ pH 표준으로 보정된 pH 측정기를 사용하여 재시험하여 사용 온도(2-8℃)에서 허용성을 확인하였다.
실시예 4: GS2에서 RPE 세포 최종 제품에 대한 품질 관리 및 방출 사양
모든 충진된 바이알에서 제거된 샘플로 이루어진 모든 GS2의 분취량을 14일 USP 멸균성, pH, 삼투압몰농도, 및 내독소에 대해 시험하였다. 제제화 및 주사 캐뉼라를 통한 압출 후, RPE 세포 생존력 및 성장을 유지하는 GS2의 각 롯트의 성능을 또한 평가하였다. 예시적인 품질 관리 시험 및 방출 사양이 하기 표 2에 제공되어 있다:
표 2에 열거된 방출 기준은 예시적이라는 것과 방출 시험 및 품질 관리를 위해 표 2에 열거된 임의의 기준의 임의의 조합이 단독으로, 또는 추가 기준과 조합되어 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
RPE 세포 성장 분석의 예시적인 구현예에서, GS2 보관 기간 후, 세포를 초기 밀도로, 예컨대, RPE GM 또는 EGM2/EBM2 배지(Lonza, 예컨대, Cat. #: CC-3156, CC-4176)에서 웰당 20,000개 세포의 밀도로 젤라틴 코팅된 96웰 플레이트에 시딩한다. 세포를 적합한 조건하에, 예컨대, 5% CO2, 37℃, 및 습도 조절 배양기에서 2-3일 동안 성장시킨다. 세포를, 예컨대, 트립신 소화에 의해 웰로부터 들어올린 다음 계수한다. 만약 배양 기간의 말기에 웰당 세포 수가 초기 세포 밀도의 125% 이상인 경우(예컨대, 20,000개 세포/웰의 초기 밀도에 대해 >/=25,000개 세포/웰), 이 시험에 대한 GS2 품질 방출 시험 기준을 만족한다.
실시예 5: RPE 최종 제품 제제, 패키징, 및 선적
하기에 설명된 공정에서, BSS Plus®은 GS2 처리를 위한 초기 세정 단계에서 사용된다. BSS Plus® 대신에 GS2에서 세정하는 것이 또한 본 발명의 구현예에 의해 고려되고 포함된다. 임상 사용을 위해 방출된 동결보존된 MA09-hRPE 세포의 바이알을 액체 질소 보관으로부터 회수하였다. 용량에 따라, 세포의 2-4개의 바이알이 필요하였다. 냉동바이알을 클린룸으로 옮기고 37℃ 수조에서 빠르게 해동시켰다. 각 바이알의 해동된 내용물(동결보존시 200만 개의 세포를 함유하는 1 ml의 동결보존 배지(90% FCS + 10% DMSO))을 따뜻한 DMEM에 부드럽게 재현탁시키고, 50 ml 코니컬 튜브로 옮기고, 추가의 따뜻한 DMEM으로 40 ml의 최종 부피로 맞추었다. 재현탁된 세포의 각 튜브를 원심분리하고(실온에서 5분간 160 x g) 각 펠렛을 40 ml의 실온 BSS Plus®에 재현탁시켰다. 각 세포 현탁액을 다시 원심분리하고, 펠렛을 모으고, 10 ml의 실온 BSS Plus®에서 재현탁시켰다. 재현탁된 모은 세포를 3회 원심분리하고(실온에서 5분간 160 x g), 상등액을 흡인하였다.
하기는 상기 설명된 제품 제제화의 단계를 예시하는 흐름도이다(GS2 처리 단계가 밑줄로 표시되어 있음):
가능한 많은 상등액을 제거한 후, 해동된 100만 개의 세포마다 50 μl의 최종 부피를 목표로, 펠렛을 일정한 부피의 차가운 BSS Plus®(현재의 처리) 또는 차가운 GS2(GS2 처리)에 재현탁시켰다. 이 시점부터, 나머지 공정 단계를 위해 세포를 2-8℃에 유지시키기 위해 세포를 미리 냉각된 튜브 랙에 유지시켰다. 15-25% 목표 부피의 전형적인 회수는 약 4,000개의 생존가능 RPE 세포/μl의 세포 현탁액을 생성할 것이다.
샘플을 제거하고, 생존가능 세포를 계수하고, 생존가능 세포 밀도 및 회수된 세포의 총수를 결정하였다. 추가의 차가운 BSS Plus® 또는 차가운 GS2를 세포 현탁액에 첨가하여 최종 세포 농도를 2,300개의 생존가능 RPE 세포/μl(2,000개의 생존가능 RPE 세포/μl의 목표 최종 제제 농도보다 300개 세포 초과)로 맞추었다. 확인 세포 계수를 수행하고, 추가의 차가운 BSS Plus® 또는 차가운 GS2를 첨가하여 최종 농도를 2,000개의 생존가능 RPE 세포/μl로 맞추었다. 필요한 부피의 세포를 최종 제품 클로저(0.5 ml 멸균 원심분리 튜브; Fisher, Cat no. 02-707-351) 내로 분배하였다. 제품 라벨을 BSS Plus® 처리를 위한 각 튜브에 부착하거나 또는 GS2 처리를 위한 제품 튜브를 함유하는 웰-팩(Whirl-Pak) 백에 부착하고, 이를 BSS Plus® RPE에 대해 4시간 만료 또는 GS2 RPE에 대해 48시간 만료로 명명하였다. 샘플을 각 제품 튜브로부터 꺼내고, 이들 샘플을 보관 및 QC 시험을 위해 모았다.
또한, 배양된 세포의 제제에 대한 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜에서, 동결보존된 RPE 세포를 해동시키고 GS2 이식 배지에서 세포 제제화 전에 3-7일간 미리 배양하였다. 배양된 세포를 배양 접시로부터 들어올려, 먼저 DMEM에서 세정한 다음, BSS-Plus에서 세정하고, 최종적으로 GS2 배지와 1:1로 혼합된 BSS-Plus에서 세정하였다. 최종 세정 단계 후, 세포를 차가운(2-8℃) GS2 배지로 옮겼다. 샘플 제거, 시험, 및 최종 세포 밀도를 위한 부피 조절은 상기 기재된 바와 같았다.
하기는 상기 설명된 제품 제제화 단계를 예시하는 흐름도이다(GS2 처리 단계가 밑줄로 표시되어 있음):
BSS PLUS ® 에서 RPE의 포장 및 선적. 임상 시험 이식(SMD 및 AMD)을 위해, 각 용량을 한 쌍의 튜브인 2,000개의 생존가능 RPE 세포/μl로 제제화된 미리 측정된 부피의 RPE 세포를 함유하는 튜브 및 미리 측정된 부피의 BSS Plus®를 함유하는 또 다른 튜브로 구성하였다. 각 쌍의 튜브를 2-8℃의 랩탑 튜브 냉각기 랙에 넣었다. 냉각기 랙을 봉지에 넣고, 미리 냉각된 ~16 파운드의 Insul-Ice를 함유하는 콜맨 냉각기에 넣고, 택배에 의해 병원에 전달하였다.
OR에서, 이식 직전에, 무딘 충진 바늘을 사용하여 BSS Plus®을 세포에 첨가하였다. 세포를 혼합하고 1 ml 주사기에 로딩하였다. 제품(모든 용량에 대해 150 μl)을 주사 캐뉼라를 통해 망막하 공간으로 압출시켰다. 캐뉼라 압출 동안 25% 예상 손실을 보상하기 위해 주사기 내의 로딩 세포 밀도를 1.33 x 전달 밀도로 설정하였다.
하기는 BSS PLUS®에서의 포장 및 선적의 단계를 예시하는 흐름도이다:
GS2에서 RPE의 포장 및 선적. 각 용량은 2,300개의 생존가능 RPE 세포/μl로 제제화된 250μl의 RPE 세포를 함유하는 하나의 미세원심분리 튜브로 구성되었다. 최종 제제화된 RPE 제품의 하나의 용량을 함유하는 단일 튜브를 2온스의 멸균 월팩 봉지에 넣고, 상기 봉지에 최종 제품 라벨을 부착하였다. 봉지에 넣은 튜브를 깨끗한 미리 냉각된(2-8℃) 고유 번호가 매겨진 휴대용 튜브 냉각기에 넣었다. 라벨링된 제품 튜브(들) 이외에, 30 μl의 RPE 제품 세포를 함유하는 라벨링된 위성 튜브(봉지에 담기지 않음) 및 100 μl의 0.4% 트립판 블루를 함유하는 개별 튜브를 또한 각 칠레트(Chillette) 냉각기에 넣었다. 최종 제품 라벨을 각 칠레트 냉각기에도 부착하였다. 제품을 갖는 각 냉각기를 멸균 조건하에 멸균 월팩 봉지에 넣었다. 제품을 갖는 봉지에 넣은 냉각기, 첨부된 임상 주문 양식 및 2개의 제품 라벨을 최종 포장 및 선적 구역으로 안내하는 무균실 통과 지점에 넣었다. 혼합을 피하기 위해, 각각의 칠레트 냉각기에 멸균 조건하에 제품 튜브를 로딩하고, 한번에 하나씩 클린룸 통과 지점에 넣었다.
포장 직원은 클린룸 통과 지점으로부터 각각의 칠레트 냉각기 및 첨부된 서류 및 최종 제품 라벨을 회수하고, 봉지에 담긴 칠레트 냉각기, 버블 랩, 무딘 충진 바늘, 주사기, 주사 캐뉼라, 및 혈구계를 미리 냉각된 나노 쿨 냉각 단위의 선적 구획에 넣었다. 냉각 단위의 뚜껑을 고정시키고 외부 운송장치를 영수증, 검사, 보관 및 선적후 생존력 시험을 위한 서류와 함께 포장한다. 모든 제품 방출 시험이 수행되고 "이식을 위한 RPE 세포 최종 제품 방출 인증서"가 발행될 때까지 포장된 제품을 검역하에 두었다. 제품 및 서류를 갖는 NanoCool 운송장치를 밤새 병원으로 보냈다. 수취시, 운송장치는 최종 충진 시간으로부터 48시간 이내에 제품을 사용할 때까지 실온 또는 2-8℃에 보관될 수 있다. 만료일 및 시간이 있는 최종 제품 라벨은 외부 운송장치, 칠레트 튜브 냉각기, 및 최종 제품 튜브를 함유하는 백에 부착된다.
RPE 최종 제품 품질 방출 시험. 이식 전에 수행된 현재의 최종 제품(BSS PLUS®에서) 품질 방출 시험은 세포 생존력 확인 및 그램 염색을 포함한다. 이식후 보고된 결과와 함께 샘플을 USP 14일 멸균성 시험을 위해 보낸다.
오염물 검출을 위한 qPCR. RPE 최종 제품 유효 기간은 BSS-Plus®에서 4시간으로부터 GS2에서 적어도 48시간까지 연장되므로, 제품 방출 전에 더 긴 처리 시간을 갖는 분석이 수행될 수 있다. 예를 들어, RPE 최종 제품을 PCR 분석하고 제품의 방출 및 사용 전에 품질 관리 및 방출 목적에 대한 결과를 받을 수 있다. 수행될 수 있는 한 가지 적합한 분석은 범(pan)-프라이머 DNA qPCR 분석이다. 이러한 분석은 2시간 이내에 완료될 수 있다. qPCR 분석은 매우 민감하여 광범위한 병원성 오염물, 예컨대, 환경, 미생물 및 바이러스 오염물뿐만 아니라 일반적인 피부 공생균을 검출하는데 사용될 수 있다. qPCR 분석은 그램 염색 및 USP 멸균성 시험 외에도 미생물 오염물을 검출하기 위한 보조적인 최종 제품 방출 분석으로서 사용될 수 있다. qPCR 결과는 제품 선적 전에 알려질 것이므로 잠재적으로 오염된 제품이 시설을 떠나는 것을 방지할 것이다. 본원에 기재된 qPCR 분석은 예시적이라는 것과 다른 적합한 분석이 대신에 또는 추가적으로 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이며, 이는, 비제한적으로, 최종 RPE 제품의 연장된 유효 기간 내에서 수행될 수 있는 다른 PCR 분석 및 다른 유형의 분석을 포함한다.
최종 제품 선적후 검사 및 생존력 확인. 임상 현장에서 수령시, 숙련된 직원은 외부 운송장치를 회수하고, 정확한 배치 및 롯트 정보를 확인하고, 운송장치에서 손상 흔적을 확인한다. 임상 현장이 세포 생존력 확인을 수행하는 능력을 가진 경우, 이때 세포를 함유하는 위성 튜브 및 트립판 블루를 함유하는 튜브가 칠레트 냉각기로부터 제거된다. 튜브는 선적후 세포 생존력 확인을 위해 시험 연구소로 옮겨진다. 세포 생존율이 70% 미만이면, 제품은 폐기될 것이다.
주사 캐뉼라를 로딩하기 위한 지침. OR에서 이식 직전에, 세포를 무딘 충진 바늘을 사용하여 혼합하고 1 ml 주사기에 로딩한다. 제품(150 μl)을 주사 캐뉼라를 통해 망막하 공간으로 압출한다. GS2에서의 캐뉼라 압출 동안 단지 명목상의 세포 손실만 있기 때문에, 주사기 내의 로딩 세포 밀도(2,000개의 생존가능 RPE 세포/μl)는 300K 용량을 위해 주입되는 150μL로 전달되는 밀도이다.
실시예 6: GS2에서의 세포 안정성
도 1은 RPE 세포가 배양에서 평판배양하고 성장하는 후속 능력의 명백한 손실 없이 24시간 동안(48시간 동안은 아님) 하이포써모솔(BioLife Solutions, Inc., Bothell, WA, USA)에서 유지될 수 있음을 예시한다.
도 2-5는 2-8℃에서 GS2에서의 RPE 안정성을 예시한다. 도 2는 RPE 세포가 생존가능 세포수 또는 배양에서 평판배양하고 성장하는 후속 능력의 명백한 손실 없이 적어도 48시간 동안 GS2에서 유지될 수 있음을 보여준다. 도 3은 RPE 세포가 세포 생존력의 단지 명목상의 손실만이 있고 생존가능한 세포 밀도의 유의한 감소 없이 4-5일 동안 GS2에서 유지될 수 있음을 보여준다. 도 4는 배양에서 평판배양하고 성장하는 RPE 세포 능력이 GS2 저온 보관에서 5일 후 감소하기 시작한다는 것을 보여준다. 도 5는 GS2가 현재의 주사 시스템과 양립가능하다는 것을 보여준다.
실시예 7: GS2 이식 배지 -점탄성 중합체의 효과
다양한 농도의 점탄성 중합체가 캐뉼레이션 후 세포 생존력에 미치는 효과를 평가하였다. 인간 망막 색소 상피 세포(RPE) 벌크 롯트 NRPE-313 5C P2를 cGMP 절차에 따라 제조하고 동결보존하였다. 실험 당일, 바이알을 해동하고 제제화하였다. 세포를 미리 가온된(37℃) DMEM(Gibco) 내로 해동하였다. 그리고 나서, 세포를 원심분리하였다(160 x g에서 5분). 각 펠렛을 40 ml 실온 BSS Plus®(Alcon)에 재현탁시키고 다시 원심분리하였다. 그리고 나서, 펠렛을 단일 원심분리 튜브 내로 모으고, 실온 BSS Plus®에서 재현탁시킨 다음, 튜브당 10 ml 부피로 최종 회전 단계 전에 다수(6)의 튜브로 나누었다. 세포 펠렛을 GS2 TM으로 불리는 상이한 이식 배지 제제에 넣었다.
멸균 저장소에서, 식염수(0.9 % NaOH), 브라운(Braun) NDC # 00264-7610-00 또는 박스터(Baxter) NDC # 0338-0089-04 중의 5% 덱스트로스; 식염수(0.9 % NaOH,) Baxter NDC# 0338-0049-11; 알콘 BSS 세척 용액, NDC# 0065-0795-15; 및 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨(HA), 예컨대 애보트 힐론 엔드코트, NDC# 05047-4547-06을 조합하고 궤도 진탕기 상에서 성분들을 혼합함으로써 이식 배지 GS2 TM을 제조하였다. pH를 측정하고 멸균 여과 전에 0.1N NaOH의 증분 첨가로 7.4 +/- 0.2의 pH로 조절하였다. 이 실험에서, 힐론 엔도코트(Abbott)로부터 0.15%, 0.1%, 0.05%, 또는 0%의 히알루론산(HA)의 최종 농도를 함유하는 GS2 TM을 제조하였다.
세포를 증분 희석하여 마이크로리터당 약 2,000개 세포의 최종 보관 세포 밀도를 생성하였다. 상이한 이식 배지에서 재구성하고 희석한 후, 세포의 3개의 바이알을 각 조건에 대해 제조하였다. 세포의 바이알을 2-8℃의 냉장고에서 2일 동안 보관하였다. 이후, 세포수를 혈구계를 사용하여 결정하였다. 세포 생존력을 트립판 블루 배제에 의해 평가하였다. 각 조건에 대해 제조된 세포의 3개의 튜브로부터 평균값을 계산하였고, 각 튜브에 대한 생존가능 세포 농도를 3개의 계수로부터 결정하였다. MedOne #3233 캐뉼라를 통한 압출 전과 후에 세포 수의 차이, 또는 델타를 계산하였다.
이 실험의 결과가 도 6에 나타나 있다. 3개의 튜브로부터의 평균 생존가능 세포 밀도 ± 표준 편차가 나타나 있다. 인간 RPE 세포 밀도를 혈구계를 사용하여 결정하였다. 세포 생존율을 트립판 블루 배제에 의해 평가하였다. 각 조건에 대해 제조된 세포의 3개의 튜브로부터 평균값을 계산하였고, 각 튜브에 대한 생존가능 세포 농도를 3개의 계수로부터 결정하였다. MedOne #3233 캐뉼라를 통한 세포 압출 후 관찰된 세포 수의 백분율 변화(델타)가 각 조건에 대해 값의 각 세트 위에 나타나 있다.
시험된 HA의 모든 농도가 캐뉼레이션 후 개선된 세포 생존력 값을 나타내었지만, 0.05% HA의 첨가는 이식 배지 제제에 바람직한 것으로 결정되었다. HA 없이 제조되었거나 또는 0.1% 또는 0.15%의 HA를 사용하여 제조된 GS2 TM보다 0.05% HA를 함유한 GS2 TM에서 MedOne #3233 캐뉼라를 통한 RPE 세포의 압출 후 적은 세포 손실이 관찰되었다. 특히, HA가 첨가되지 않은 GS2 TM과 비교하여 0.05% HA 함유시 10% 적은 손실이 관찰되었다.
실시예 8: GS2 배지 -세포 생존력에 대한 글루코스 농도의 효과
다양한 농도의 점탄성 중합체가 캐뉼레이션 후 세포 생존율에 미치는 효과를 평가하였다. 이를 위해, 인간 망막 색소 상피 세포(RPE) 벌크 롯트 NRPE-313 5C P2를 cGMP 절차에 따라 제조하고 동결보존하였다. 실험 당일, 바이알을 해동하고 세포를 미리 가온된(37℃) DMEM(Gibco)에서 재구성하였다. 그리고 나서, 세포를 원심분리하였다(160 x g에서 5분). 각 펠렛을 40 ml 실온 BSS Plus®(Alcon)에 재현탁시키고 다시 원심분리하였다. 그리고 나서, 펠렛을 단일 원심분리 튜브 내로 모으고, 실온 BSS Plus®에서 재현탁시킨 다음, 최종 회전 단계 전에 튜브당 10 ml BSS Plus®를 갖는 다수(4)의 튜브로 나누었다. 세포 펠렛을 상이한 이식 배지 GS2 TM에 넣었다.
멸균 저장소에서, 식염수(0.9 % NaOH) 중의 5% 덱스트로스; 식염수(0.9% NaOH); 및 알콘 BSS 세척 용액, NDC# 0065-0795-15를 조합하고 궤도 진탕기 상에서 혼합하여 이식 배지 GS2 TM을 제조하였다. pH를 측정하고 멸균 여과 전에 0.1N NaOH의 증분 첨가로 7.4 +/- 0.2의 pH로 조절하였다. 이 실험을 위한 GS2 TM 배지를 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 다양한 농도의 글루코스를 이용하여 제조하였다. 표시된 부피는 밀리리터이다:
표 3:
다양한 GS2 이식 배지에서 제제화되면, 세포를 증분 희석하여 밀리리터당 약 2,000개 세포의 최종 보관 세포 밀도를 생성하였다. 그리고 나서, 세포를 2-8℃의 냉장고에서 3일 동안 멸균 바이알(Fischer)에서 보관하였다. 이후, 생존가능 세포 수를 혈구계를 사용하여 결정하고, 웰당 대략 20,000개의 생존가능 세포를 젤라틴 코딩된(Stem Cell, Inc.) 96-웰 조직 배양 플레이트(COSTAR)에 평판배양하였다. 세포를 5% CO2, 37℃, 습도 조절 배양기에서 3일간 RPE 성장 배지(EGM2 Single Quots를 갖는 EBM-2, Stem Cell, Inc., 예컨대, Lonza Cat. #: CC-3156, CC-4176)에서 배양하였다. 이후, 세포를 40 μl/웰의 1:1 트립신(Sigma) 및 HEPES 기반 해리 배지(Gibco)를 사용하여 플레이트로부터 들어올렸다. 혈청 함유 배지(40 μl/웰)를 사용하여 트립신 작용을 중화시키고, 세포를 피펫으로 적정하여 들어올리고 혈구계를 사용하여 계수하였다. 도 7은 시험된 각 조건에 대한 6개의 웰로부터 웰당 인간 RPE 세포의 평균 수 ± SD를 나타낸다. 글루코스의 각 농도는 글루코스를 함유하지 않는 대조군과 비교하여 향상된 결과를 나타내었다.
실시예 9: GS2 배지에서 중간엽 줄기 세포의 향상된 생존력
도 8은 상이한 제제 배지에서 중간엽 줄기 세포(MSC)의 세포 생존력을 예시한다. 인간 배아 줄기 세포 유래의 MSC를 70% 컨플루언시까지 성장시키고, 0.05% 트립신으로 채취하고, aMEM+15%FCS(MSC 배지)에서 재현탁시키고, 200 x g에서 5분간 회전시켰다. 세포 펠렛을 소량의 MSC 배지에서 재현탁시키고, 트립판 블루 배제를 사용하여 생존력을 계수하였다. 500만 개의 MSC를 4개의 에펜도르프 튜브 각각에 넣고, 회전시키고, 1 ml의 각각의 지시된 배지에서 재현탁시켰다. 튜브를 지정된 기간 동안 4℃의 저온실에 넣었다. CS: 개 혈청; FBS: 우태아혈청. 도 8은 혈청을 갖거나 혈청을 갖지 않는 GS2 중의 제제가 MSC 세포 생존력을 향상시키고 MSC 보관 시간을 연장시킨다는 것을 예시한다.
도 9는 더 높은 세포 밀도(ml당 100만 개 세포로 나타남)가 GS2에서 보관될 때 MSC 생존율을 향상시킨다는 것을 예시한다. 혈청(여기에서 FBS)의 존재는 GS2에서 24시간 동안 보관 후 세포 생존력에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(화살표).
도 10은 MSC 생존력이 4℃에서 보관한 후 26G 바늘/주사기를 통해 배출 후에 보존된다는 것을 예시한다.
실시예 10: GS2 운반 배지에 대한 예시적인 분석 증명서
품질 관리의 일부로서, 인간 및/또는 수의 환자에서 사용하기 위한 대상 운반 배지는 약제학적 또는 수술 공정의 일부로서 배지의 유용성을 최대화하고, 역반응 또는 부작용의 가능성을 최소화하고자 일련의 시험을 거친다. 예를 들어, 내독소는 매우 강력하고, 열에 안정하며, 대부분의 멸균 막 필터를 통과하고, 박테리아가 존재하거나 존재했던 모든 곳에 존재한다. 주사를 위해 RPE 세포를 제제화하는데 사용될 때 의도되는 망막하 공간과 같이, 운반 배지가 국소화된 전달에 사용되는 경우 내독소는 매우 중요하다. 따라서, GS2 운반 제제는 일련의 시험을 거쳤으며, 다음 기준을 충족하는 것으로 입증되었다:
실시예 11: 광 차단법에 의한 운반 배지의 시험
또한 품질 관리의 일부로서, 특히 인간 환자에서 사용하기 위해 제제화된 세포의 사용을 위해, 본 발명의 운반 배지는 허용되지 않는 양의 미립자 물질이 일반적으로 없을 것이다. 미립자 물질은, 전형적으로, 그것이 나타내는 물질의 작은 크기 및 그의 이질적인 조성으로 인해 화학적 분석에 의해 정량될 수 없는 이동성의 비용해 입자(즉, 기체 버블은 아님)로 이루어진다. 전자 입자 계수기를 사용하여 미립자 물질을 계수하는 광 차단법(USP 788 시험 공정)을 사용하여 시험할 때, 본 발명의 운반 배지는 운반 배지의 mL당 ≥10 마이크론 크기인 25개 이하의 입자 및 운반 배지의 mL당 ≥25 마이크론 크기인 3개 이하의 입자를 갖는 것으로 입증되었다.
USP 788은 미립자 물질의 결정을 위한 절차인 방법 1(광 차단 입자 계수 시험) 및 방법 2(현미경 입자 계수 시험)를 제공한다. 운반 배지를 육안으로 보이지 않는(sub-visible) 입자에 대해 조사할 때, 방법 1이 바람직하게 적용된다. 그러나, 대상 제제의 일부 경우, 요건 적합성에 대한 결론에 도달하기 위해, 광 차단 입자 계수 시험 후 현미경 입자 계수 시험에 의해 제제를 시험하는 것이 필요할 수 있다.
모든 비경구 제제를 이들 방법 중 하나 또는 둘에 의해 육안으로 보이지 않는 입자에 대해 검사할 수 있는 것은 아니다. 방법 1을 적용할 수 없을 때, 예컨대 감소된 투명도 또는 증가된 점도를 갖는 제제의 경우, 시험을 방법 2에 따라 수행해야 한다. 운반 배지가 성분으로서 콜로이드 또는 리포좀을 포함하는 경우가 후자의 예이다. 유사하게, 센서에 흡인될 때 공기 또는 기체 기포를 생산할 수 있는 운반 배지의 구현예가 또한 현미경 입자 계수 시험을 필요로 할 수 있다. 대상 운반의 현재의 바람직한 구현예가 지나치게 점성은 아니지만, 시험될 제제의 점도가 어느 시험 방법에 의한 검사를 배제하기에 충분히 높으면, 필요한 경우 적절한 희석제로 정량 희석하여 점도를 낮추어 분석을 수행할 수 있다.
USP 방법 1. 광 차단 입자 계수 시험. 히알루론산 성분이 있거나 없는 GS2 운반 배지의 샘플을 입자의 크기 및 크기에 따른 입자의 수를 자동으로 결정할 수 있는 광 차단의 원리에 기초한 적합한 장치에서 시험하였다. 장치를 10 μm 내지 25 μm의 알려진 크기의 구형 입자의 분산액인 USP 입자 계수 참고 표준을 사용하여 보정하였다. 이러한 표준 입자는 입자가 없는 물에 분산된다. 분산 동안 입자의 응집을 피하기 위해 주의를 기울였다. 미립자 물질 시험을 미립자 물질을 제한하는 조건하에, 즉 층류(laminar-flow) 캐비닛에서 수행하였다. 유리 제품 및 여과 장비를 매우 조심스럽게 세정하고 헹구었다. 사용 직전에, 장비를 입자가 없는 물로 위아래, 외부 및 내부를 헹구었다. 분석될 운반 배지의 통계적으로 타당한 평가를 제공하는데 적합한 다수의 시험 표본을 사용하여, 샘플을 10 마이크론 및 25 마이크론 이상인 입자의 수에 대해 분석하였다. 시험한 GS2 운반 배지 샘플 각각의 경우, 샘플은 운반 배지의 mL당 ≥10 마이크론 크기의 ≤25 입자, 및 운반 배지의 mL당 ≥25 마이크론 크기의 ≤3 입자를 포함하였다.
실시예 12: GS2 배지에서 RPE 세포 생체내 생존력 및 효율의 확인
이 목적은 1) BSS PLUS®에서 제제화되고 4시간 이내에 이식된 배아 줄기 세포(ES) 주 MA09로부터 유래된 인간 망막 색소 상피(hRPE) 세포; 2) BSS PLUS®에서 제제화된 ES 세포주 J1로부터 유래된 hRPE 세포; 및 3) GS2 운반 배지에서 제제화되고 (a) 22-28시간 이내 및 (b) 44-52시간 이내에 이식된 J1 세포주로부터 유래된 hRPE 세포의 안전성, 생착성, 및 기능성을 평가하고 비교하는 것이었다. 이 연구는 GS2 배지가 현재 사용된 임상 제제 배지(BSS-PLUS)와 비교하여 최종 제품의 유효 기간을 연장한다는 것을 확인시켜 준다.
연구를 위해 총 32마리의 RCS(Royal College of Surgeon) 유년기 랫트(16마리 수컷 및 16마리 암컷)를 받았다. 랫트는 투약 개시 시점에 21-25일령이었다.
순응 기간: 최소 7일. 1일은 망막하 주사일에 해당한다.
실험 설계: 8마리의 RCS 랫트(4/성별)를 각각 3개의 하위그룹으로 구성된 4개의 용량 그룹 MA09-hRPE(그룹 1) 및 J1-hRPE(그룹 2, 3, 4)로 무작위로 나누었다(하기 표 1). 모든 랫트는 마취하에 경공막 투여 경로를 통해 오른쪽 눈(OD)에 hRPE 세포의 망막하 주사를 투여받았다. 그룹 1은 BSS PLUS® 중의 MA-09 hRPE(4시간 이내)를 투여받았고, 그룹 2는 BSS Plus® 중의 J1 hRPE 세포(4시간 이내)가 주사되었고, 그룹 3은 GS2 중의 J1 hRPE 세포(22-28시간 이내)가 주사되었고 그룹 4는 GS2 중의 J1 hRPE 세포(44-52시간 이내)가 주사되었다. 하위그룹은 왼쪽 눈의 투약에 의해 정의되었고; 모의 하위그룹(1/성별)은 왼쪽 눈의 망막하 공간에 바늘 천공만을 받았으며; 주사없음(NI 또는 치료되지 않은) 하위그룹(1/성별)은 왼쪽 눈에 주사를 받지 않았고; 2개의 비히클 하위그룹(2/성별)은 GS2 또는 BSS Plus 비히클의 망막하 주사를 받았다. 랫트를 주사 후 70-80일에 안락사시켰다.
표 1 실험 연구 설계
NI = 주사없음 모의 = 빈 피펫으로 망막하 공간을 천공함.
BSS PLUS® = 2μL 비히클(세포 없음) GS2 = 2μL 비히클(세포 없음) hRPE = 2μL의 BSS PLUS® 또는 GS2 비히클 중에 100,000개 세포.
수행된 평가를 위한 생존 측정, 검시 및 조직병리학 종점의 요약이 하기 표 2에 나타나 있다.
표 2 평가 파라미터 및 간격
BSS-PLUS®을 라벨링에 따라 투여일에 재구성하고, 제제화 동안 RPE 세포를 희석시키는 용도를 위해서뿐만 아니라 외과의가 주사 장치를 충진하기 위한 용도를 위해서 그리고 비히클 참고 물품으로서의 용도를 위해서 냉장 보관하였다(2-8℃). 요약하면, BSS PLUS® 부분 II의 내용물을 BSS PLUS® 부분 I로 옮기고, 6시간의 재구성 이내에 RPE 세포를 재현탁시키는데 사용하였다. 재구성 및 주사 시간을 기록하고 연구 기록에 유지하였다.
본 연구에 사용된 GS2 배지 롯트를 제제화하여 2-8℃에 보관하였다. GS2는 제제화 동안 세포를 세정하기 위해 실온에서 사용되며, RPE 세포 최종 제제화를 위해서뿐만 아니라, 외과의가 주사 장치를 충진하기 위한 용도를 위해서 그리고 주사되는 비히클 참고 물품으로서 2-8℃에서 사용된다.
BBS-Plus 제제: 동결보존된 MA09-hRPE 및 J1-hRPE 세포를 액체 질소(LN2)에 보관하여 ≤135℃ 온도에서 증기상에서 세포를 유지하였다. 세포를 처리 및 이식일까지 LN2 보관에 유지하였다. 이식 당일, 동결보존된 hRPE를 해동하고 약 50,000개 생존가능 세포/μL로 BSS-PLUS®에서 제제화하였다. 농축된 hRPE 세포를 제제화 4시간 이내에 사용하기 위해 랩탑 냉각기의 젖은 얼음 위에 놓인 최종 충진 튜브로 외과의에게 전달하였다(도 11, "MA-09 RPE <4h" 및 "J1 RPE < 4h"). 재구성 및 주사 시간을 기록하고 연구 기록에 유지하였다.
GS2 제제: 동결보존된 J1-hRPE를 ≤135℃의 온도에서 증기상에서 건조 액체 질소(LN2)에서 보관하였다. 세포를 처리일까지 LN2 보관에 유지하였다. 이식 1일 또는 2일 전에, J1-hRPE 세포를 해동하고 약 1,500개 생존가능 세포/μL로 GS2에서 제제화하였다. 그리고 나서, 제제화된 RPE를 2-8℃에서 보관하고 제제화 후 2-6시간 후에 생존가능 세포수를 평가하였다. 제제화후 약 20시간 또는 42시간에, RPE 세포를 GS2에서 약 50,000개 생존가능 세포/μL로 농축시켰다. 농축된 hRPE 세포를 랩탑 냉각기 내의 젖은 얼음 상에 놓인 최종 충진 튜브로 외과의에게 전달하였다. RPE 세포를 GS2에서 제제화 후 약 22시간 또는 44시간에 이식하였다(도 11, 각각 "J1 RPE <22" 및 "J1 RPE < 44" 참고).
용량 투여: 망막하 주사
동물을 용량 투여를 위해 SQ를 통해 케타민(75mg/kg) 및 덱스메데토미딘(0.25mg/kg)의 칵테일 후 카르프로펜(5mg/kg)으로 마취시켰다. 투여하기 전, 눈을 주사용 0.9% 염화나트륨(멸균 NaCl) USP로 씻어내었다. 그리고 나서, 눈을 0.3% 오큐플럭스(Ocuflux) 안과 용액 USP 2방울로 세정하고 산동(mydriatic) 점안제(1% 트로피카미드) 후 2.5% 염산페닐에프린 안과 용액 USP로 확장시켰다. 시험 항목인 BSS PLUS® 중의 MA09 및 J1 hRPE 세포를 0.25 내지 4시간의 제제화 이내에 주사하였다(그룹 1 및 2, 표 1). 시험 항목인 GS2 중의 J1 hRPE 세포는 22 또는 44시간의 제제화 이내였다(그룹 3 및 4, 표 1). 각 그룹에 대한 시험 항목(MA09-hRPE 세포 또는 J1-hRPE 세포 중 하나를 받음)을 상기 실험 설계(및 표 1)에 표시된 바와 같이 그룹당 8마리의 동물의 오른쪽 눈에 망막하 주사에 의해 투여하였다. 그룹 1 및 2 각각에서 4마리의 동물의 왼쪽 눈에 참고 항목인 BSS PLUS®을 투여하였다. 그룹 3 및 4 각각에서 4마리의 동물의 왼쪽 눈에 참고 항목인 GS2를 투여하였다. 4개의 그룹 각각에서 2마리의 동물의 왼쪽 눈은 주사 절차를 거쳤지만, 어떠한 물질도 주사되지 않을 것이다(모의 주사). 4개의 그룹 각각에서 남아있는 2마리의 동물의 왼쪽 눈은 주사를 받지 않았다(치료되지 않음).
요약하면, 망막하 주사를 수술 현미경을 사용하여 수행하였다. 눈을 안구 주위에 쌈지(purse-string) 루프를 사용하여 안구의 적도(equator) 뒤에 봉합사(Ethicon 4-0 Perma-Hand Silk)를 사용하여 고정하였다. 히프로멜로스(또는 유사한) 용액을 눈에 도포하고 링으로 고정시켰다. 가위를 사용하여 결막의 작은 부위를 잘라내고 30 G x ½" 금속 바늘을 적용하여 안구의 상부 등 측두 영역(upper dorsal temporal region)에서 공막절개술을 수행하였다. 보정된 멸균 유리 피펫(World Precision Instruments, Item #1B150-4)으로 구성된 투여 장치를 연구 설계에서 기재된 바와 같은 적절한 비히클로 미리 충진된 25μL 해밀톤 주사기(Model #702 LT Catalog #804010)에 연결된 18G 무딘 바늘(Becton-Dickenson, Inc. Reference #305196)에 연결된 약 0.8 mm bore Tygon™ 플라스틱 튜빙(Saint-Gobain Performance Plastics #R-3603)에 연결하였다(표 1). 소량의 공기를 라인 내로 도입하여 주입물을 투여 장치 내의 비히클로부터 분리시킨 후, 시험 또는 참고 항목을 2μL의 부피로 유리 피펫 내로 흡인하였다. 새로운 멸균 유리 피펫을 각 주사/눈에 사용하였다.
공막절개를 비흡수성 수술 봉합사(Ethicon Prolene 10-0)로 봉합하였다. 안구 주위의 봉합사(Ethicon 4-0 Perma-Hand Silk®)를 제거하고, 눈꺼풀을 최종적으로 정상 위치로 되돌렸다. 국소 항생제(5 mg/g 에리트로마이신 안연고제)를 주사 절차의 완료 후 치료된 눈에 도포하였다.
수술 동안, 여과포(bleb)의 크기 및 위치뿐만 아니라 임의의 다른 눈의 변화를 기록하기 위한 주의깊은 수술중 안저 사진.
동물을 완전히 회복될 때까지 가온판 위에 또는 가열 블랭킷(~37℃) 하에 유지시킨 후, 이들의 사육실로 되돌려보냈다. 0.5% 에리트로마이신 안연고제의 추가 투여는 동물이 완전히 깨어 정상으로 눈을 깜박일 때까지 건조되는 것을 방지하기 위해 눈이 표면에 필요에 따라 도포될 것이다.
모든 동물을 음용수 중에 투여된 경구 사이클로스포린 A(CsA)(약 300 g/L의 목표 혈중 농도을 야기하는 210 g/L)에 유지시켰다. 덱사메타손의 복강내 주사는 또한 수술 후 14일 동안 매일 1회였다(1.6 mg/kg/일).
사망률(mortality)/빈사상태(moribundity) 및 임상 관찰에 대한 케이지 관찰을 매일 적어도 1회 수행하였다. 질병에 대한 임상 증상이나 치료에 대한 반응이 없었다. 동물을 순응 동안 적어도 1회 및 연구 동안 및 검시(최종 체중) 직후에 대략 매주 체중을 측정하였다. 연구 동물에서 어떤 이례적인 체중 변화가 관찰되지 않았다. 투여전, 투여 후 약 40일 및 검시 전에 눈 검사를 다시 수행하였다. 동물의 눈을 검사를 위해 눈에 1방울로서 주입된 1% 트로피카미드를 사용하여 확장시켰다. 다양한 RPE 제제 그룹 간에 안과 검사로부터 나타난 명백한 차이가 없었다. 마찬가지로, 시운동반응(OKR)을 표 2에 기재된 시간에 모든 동물에 대해 다양한 공간 주파수의 움직이는 줄을 사용하여 수행하였다. 시력을 실험 및 대조군의 모든 눈에서 OKR에 의해 측정하였다. 사용되는 방법인 안과 검사 장치(Prusky et al., 2000)는 정사각형으로 배열된 4개의 컴퓨터 모니터 위에 가상의 3차원 공간(3-D)으로 제공된, 수직 사인파 격자로 덮인 회전 실린더로 구성되어 있다. 랫트를 정사각형의 중심에 있는 플랫폼에 구속되지 않은 상태로 두고, 여기서 반사적인 머리 움직임을 갖는 격자를 추적하였다. 격자의 공간 주파수를 시험 대상의 머리 위에 '실린더'를 반복적으로 중심을 맞춰 관찰 위치에 고정하였다. 시운동 반사가 없어질 때까지 정신물리학 계단 진행을 사용하여 격자의 공간 주파수를 증가시켜 최대 임계값을 얻음으로써 시력을 정량화하였다. 측정을 c/d(사이클/정도)로 수행하였다. 다양한 RPE 제제 그룹 사이의 OKR 실험으로부터 나타난 명백한 차이는 없었다. 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층촬영(SD-OCT)을 또한 상기와 같이 수행하였고, 다양한 RPE 제제 그룹 사이의 안과검사로부터 나타난 명백한 차이는 없었다. 랫트를 마취제를 IP 주사하여 마취시켰다. 트로피카미드를 양쪽 눈의 도포하여 망막의 더 나은 영상화를 위해 눈동자를 확장시켰다. 랫트를 영상화 시스템에 넣고, 각막을 촉촉하게 유지시키기 위해 젠틸(Genteal) 및 시스탄(Systane)의 점안제를 각막에 도포하였다.
도 11은 16마리의 랫트의 그룹에 대해 치료 후 60일에 망막전위도(ERG)의 결과를 나타낸다. 상기와 같이, 다양한 RPE 제제 그룹 사이의 ERG 검사로부터 나타난 명백한 차이는 없었다. 요약하면, 동물을 밤새(적어도 12시간) 완전히 어두운 곳에서 두어 망막의 암순응 상태를 달성하였다. ERG를 기록하기 위해, 마취제를 IP 주사하여 동물을 마취시키고, 정위 머리 고정대(stereotaxic head holder)에 두었다. 희미한 적색 조명하에, 기록 전극(중성 콘택트 렌즈에 부착된 와이어 직경 50 um의 2개의 동축 와이어 루프)을 리도카인으로 전처리한 동물의 눈에 두었다. 뒷다리 1개를 전기 면도기로 털이 없도록 깎고, 피부를 캐뉼라를 삽입하기 전에 베타딘(betadyne)으로 미리 준비시켰다(캐뉼라는 절차 동안 뒷다리 근육에 포매될 것이다). 동공을 트로피카미드로 확장시켰다. 기록하기 전에, 추가적인 1시간의 암 순응을 사용하여 동물 준비 후 순응을 회복시켰다. 전체 ERG 기록은 양쪽 눈에 대해 약 20분간 지속된다(눈은 정사각형에서, 왼쪽에서 오른쪽, 또는 오른쪽에서 왼쪽으로 연속적으로 시험될 것임). 눈을 전체 영역(full-field) 라이트 플래쉬로 자극시켰다. 각막 전위를 전극에 연결된 증폭기로 기록하였다. 플래시 제공을 컴퓨터 프로그램으로 제어하였다. 반응을 ERG 강도에 따라 5-100개의 자극 제공에 대해 평균하였는데, 이는 진행성 망막 변성을 갖는 동물에서 매우 낮을 수 있다.
요약하면, 이들 연구의 결과는 GS2 운반 배지가 4시간 미만 동안(이는 RPE 세포 주사를 위한 BSS-Plus의 용도에 대해 현재 FDA 및 EMA 승인된 유효 기간임) 현탁 후의 BSS Plus 배지와 비교하여 GS2 운반 배지에서 최대 44시간의 현탁 후에도 생존가능하고 기능적인 RPE 세포의 거의 동일한 유효량을 제공한다는 것을 나타낸다. 각각의 경우, 대조군으로서, 동물의 모의 및 치료되지 않은 눈은 BSS-Plus 및 GS2 운반 배지 그룹에서 RPE 세포 처리된 눈과 비교하여 어떠한 개선도 나타내지 않았다.
등가물 및 범위, 참조에 의한 포함
당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 구현예의 많은 등가물을 인식할 것이거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 한정되는 것이 아니라 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다.
"a," "an," 및 "the"와 같은 관사는 문맥이 달리 분명히 나타내지 않는 한 단수 및 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "제제"의 언급은 단일 제제 및 복수의 이러한 제제를 포함한다.
그룹의 둘 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 반대로 표시되어 있지 않거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 그룹 구성원 중 하나, 둘 이상, 또는 전부가 존재하는 경우 충족되는 것으로 간주된다. 둘 이상의 그룹 멤버 사이에 "또는"을 포함하는 그룹의 개시는 그룹의 정확히 하나의 멤버가 존재하는 구현예, 그룹의 둘 이상의 멤버가 존재하는 구현예 및 그룹의 모두가 존재하는 구현예를 제공한다. 간결성을 위해, 이들 구현예는 본 명세서에서 개별적으로 표기되지는 않았지만, 이들 구현예 각각이 본원에 제공되며 명시적으로 청구되거나 부인될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 하나 이상의 청구항 또는 하나 이상의 설명의 관련 부분으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 절 또는 기술 용어가 또 다른 청구범위 내로 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 또 다른 청구항에 대한 종속 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 청구항이 조성물을 언급하는 경우, 달리 표시되지 않는 한 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것임이 당업자에게 명백하지 않는 한, 본원에 개시된 제조 또는 사용 방법 중 어느 것에 따라 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 조성물을 제조하거나 사용하는 방법이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
요소가 목록, 예를 들어 마쿠시 그룹 형식으로 제시되는 경우, 요소의 모든 가능한 하위그룹이 또한 개시되고 요소의 임의의 요소 또는 하위그룹이 상기 그룹으로부터 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는"은 개방되어 있는 것으로 의도되고, 추가의 요소 또는 단계를 포함한다는 것에 유의해야 한다. 일반적으로, 구현예, 제품 또는 방법이 특정한 요소, 특징, 또는 단계를 포함하는 것으로 언급되는 경우, 이러한 요소, 특징 또는 단계로 구성되거나 본질적으로 구성되는 구현예, 제품 또는 방법이 또한 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 간결성을 위해, 이들 구현예는 본원에서 개별적으로 표기되지는 않았지만, 이들 구현예 각각은 본원에 제공되며 명시적으로 청구되거나 부인될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 달리 표시되거나 또는 달리 문맥 및/또는 당업자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은, 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한, 상기 범위의 하한 단위의 10분의 1까지, 일부 구현예에 기술된 범위 내의 임의의 특정 값을 추정할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 간결성을 위해 각 범위 내의 값이 본원에 개별적으로 표기되지 않았지만, 이 값들은 각각 본원에 제공되며 명시적으로 청구되거나 부인될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 달리 표시되거나 또는 달리 문맥 및/또는 당업자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은 주어진 범위 내의 임의의 하위범위를 추정할 수 있으며, 하위범위의 종점은 범위의 하한 단위의 10분의 1과 동일한 정확도로 표현된다.
또한, 본 발명의 임의의 특정 구현예는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 범위가 주어지는 경우, 범위 내의 임의의 값이 임의의 하나 이상의 청구항에서 명시적으로 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 임의의 구현예, 요소, 특징, 용도 또는 양태는 임의의 하나 이상의 청구 범위로부터 배제될 수 있다. 간결성을 위해, 하나 이상의 요소, 특징, 목적 또는 양태가 배제되는 모든 구현예는 본원에 명시적으로 제시되지 않는다.
예컨대, 배경, 요약, 상세한 설명, 실시예 및/또는 참조 섹션에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 공개 및 데이터베이스 엔트리(예를 들어, 서열 데이터베이스 엔트리)는 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 공개 및 데이터베이스 엔트리가 구체적으로 그리고 개별적으로 본원에 참조로 포함된 것처럼 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 충돌이 있는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본원이 우선할 것이다.
Claims (42)
- 용액으로서,
(a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제; 및
(b) 적어도 2 mM 또는 적어도 0.05%(w/v) 글루코스; 및
(c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제
를 포함하는 용액. - 제1항에 있어서, 적어도 5 mM 또는 적어도 0.1%(w/v) 글루코스; 또는 적어도 7.5 mM 또는 적어도 0.14%(w/v) 글루코스; 또는 적어도 10 mM 또는 적어도 0.2%(w/v) 글루코스; 또는 적어도 15 mM 또는 적어도 0.25%(w/v) 글루코스; 또는 적어도 20 mM 또는 적어도 0.4%(w/v) 글루코스; 또는 적어도 25 mM 또는 적어도 0.5%(w/v) 글루코스를 포함하는 용액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 2가 양이온의 공급원으로서, 선택적으로 칼슘 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함하는 것인 2가 양이온의 공급원, 및/또는
(b) 아세트산염 완충제 및/또는 구연산염 완충제
를 추가로 포함하는 용액. - 용액으로서,
(a) 용액을 생리학적 pH로 유지시키는 완충제로서, 디카보네이트 완충제가 아닌 완충제; 및
(b) 글루코스; 및
(c) 용액을 생리학적 삼투압몰농도로 유지시키는 삼투 활성제; 및
(d) 2가 양이온의 공급원
을 포함하고,
선택적으로 2가 양이온의 공급원이 칼슘 공급원 및/또는 마그네슘 공급원을 포함하고/하거나, 완충제가 아세트산염 완충제 및/또는 구연산염 완충제를 포함하는 것인 용액. - 제3항 또는 제4항에 있어서, 칼슘 공급원은 약제학적으로 허용가능한 칼슘 염을 포함하고/하거나, 마그네슘 공급원은 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염을 포함하는 것인 용액.
- 제5항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 칼슘 염 및/또는 약제학적으로 허용가능한 마그네슘 염은 아세트산, 아스코르브산, 구연산, 염산, 말레산, 옥살산, 인산, 스테아르산, 석신산 및 황산을 포함하는 군으로부터 선택된 산을 이용하여 형성된 칼슘 염 및/또는 마그네슘 염의 군으로부터 선택되는 것인 용액.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원은 염화칼슘을 포함하고, 선택적으로 칼슘 공급원은 염화칼슘 이수화물을 포함하는 것인 용액.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원은 염화마그네슘을 포함하고, 선택적으로 마그네슘 공급원은 염화마그네슘 육수화물을 포함하는 것인 용액.
- 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 구연산염 완충제는 구연산 나트륨으로서 제공되는 것인 용액.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스는 D-글루코스(덱스트로스)인 용액.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제는 염이고, 선택적으로 삼투 활성제는 나트륨 염이며, 추가로 선택적으로 삼투 활성제는 염화나트륨인 용액.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염화칼슘, 염화마그네슘, 구연산 나트륨, 염화나트륨, 및 글루코스를 포함하는 용액.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 pH가 6.8-7.8, 또는 7.4-7.5, 또는 약 7.5인 용액.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 등장성 또는 고장성인 용액.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약 270-345 mOsm/l 또는 약 315 mOsm/l의 삼투압몰농도를 나타내는 용액.
- 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 공급원의 농도가
(a) 0.25-0.75 mM, 또는 0.4-0.65 mM, 또는 0.5-0.6 mM, 또는 약 0.6 mM; 또는
(b) 0.5-0.9 mM, 또는 0.6-0.8 mM, 또는 약 0.7 mM
인 용액. - 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘 공급원의 농도가 0.05-5 mM, 또는 0.1-0.3 mM, 또는 약 0.3 mM인 용액.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스의 농도가 5-50 mM, 또는 10-25 mM, 또는 10-20 mM, 또는 약 16 mM인 용액.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 삼투 활성제의 농도가 약 100-200 mM, 또는 약 125-175 mM, 또는 약 150 mM인 용액.
- 제3항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 구연산염 또는 아세트산염의 농도가 0.1-5 mM, 또는 0.5-2 mM, 또는 약 1 mM인 용액.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 칼륨 염을 추가로 포함하고, 선택적으로 칼륨 염은 염화칼륨이며, 추가로 선택적으로 KCl의 농도가 0.2-5 mM, 또는 1-2.5 mM, 또는 약 2 mM인 용액.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
(a) 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 및 약 145 mM NaCl, 또는
(b) 약 0.5-0.9 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 및 약 116-174 mM NaCl, 또는
(c) 약 0.85% NaCl, 약 0.01% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.006% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.035% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.29% 덱스트로스, 또는
(d) 약 0.68-1.02% NaCl, 약 0.008-0.012% CaCl 이수화물(염화칼슘 이수화물), 약 0.0048-0.0072% MgCl 육수화물(염화마그네슘 육수화물), 약 0.028-0.042% 구연산 나트륨 이수화물, 및 약 0.23-0.35% 덱스트로스
를 포함하는 것인 용액. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
(a) 약 2 mM KCl, 및/또는
(b) 점탄성 중합체
를 추가로 포함하며, 선택적으로 중합체는 히알루론산 또는 이의 염 또는 용매화물이고, 추가로 선택적으로 중합체는 히알루론산 나트륨인 용액. - 제23항에 있어서, 중합체는 용액 중의 세포가 전단 응력에 노출되는 것을 감소시키는데 효과적인 농도로 존재하고, 선택적으로 중합체의 농도가 0.005-5% w/v 또는 약 0.05% w/v인 용액.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
(a) 약 0.7 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.3 mM MgCl(염화마그네슘), 약 2 mM KCl, 약 1 mM 구연산 나트륨, 약 16 mM 덱스트로스, 약 145 mM NaCl, 및 약 0.05% 히알루론산, 또는
(b) 약 0.5-0.8 mM CaCl(염화칼슘), 약 0.2-0.4 mM MgCl(염화마그네슘), 약 1.6-2.4 mM KCl, 약 0.8-1.2 mM 구연산 나트륨, 약 13-19 mM 덱스트로스, 약 116-174 mM NaCl, 및 약 0.04-0.06% 히알루론산
을 포함하는 것인 용액. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
(a) 탄산염 완충제, 및/또는
(b) 글루타티온, 또는 글루타티온 이황화물(GSSG), 및/또는
(c) 양쪽성이온 유기 완충제
을 포함하지 않는 것인 용액. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
(a) 용질의 측정가능한 침전 및/또는 용액 중에 보관된 세포의 생존 및 생존력을 지원하는 용액의 능력의 측정가능한 손실 없이 25℃에서 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 1개월 동안 보관될 수 있고/있거나
(b) 용질의 측정가능한 침전 및/또는 용액 중에 보관된 세포의 생존 및 생존력을 지원하는 용액의 능력의 측정가능한 손실 없이 2-8℃에서 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 1주일, 적어도 2주일, 적어도 3주일, 또는 적어도 1개월 동안 보관될 수 있는 것인 용액. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
(a) 대상에게 투여하는데 적합한 것, 대상의 눈에 투여하는데 적합한 것 및/또는 대상의 눈에 세포를 이식하는데 적합한 것이고/이거나
(b) 본질적으로 발열원이 없고/없거나
(c) 멸균이고/이거나
(d) 세척(irrigation), 세포 재구성, 세포 보관, 세포 운반, 및/또는 대상에의 투여를 위한 것인 용액. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액 중에 세포의 집단을 포함하는 조제물로서, 선택적으로 세포의 집단은
(a) 대상으로 이식하는데 적합하고, 추가로 선택적으로 대상의 눈에 이식하는데 적합하고/하거나
(b) RPE 세포를 포함하고/하거나
(c) 광수용체 세포를 포함하고/하거나
(d) 중간엽 세포를 포함하는 것
인 조제물. - 제29항에 있어서, 조제물은 냉장되고, 선택적으로 조제물은 약 2-8℃에서 냉장되는 것인 조제물.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 조제물은 조제물의 보관 동안 세포의 집단 내의 세포의 생존을 지원하고, 세포 집단 내의 세포의 적어도 70%가 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능하며,
선택적으로 세포 집단 내의 세포의 적어도 80%가 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능하거나,
세포 집단 내의 세포의 적어도 90%가 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 생존가능한 것인 조제물. - 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 조제물은 조제물의 보관 동안 세포의 집단의 평판배양 효율의 유지를 지원하고, 세포의 집단은 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 70%를 나타내며, 원래의 평판배양 효율은 보관 기간의 시작시의 세포의 집단의 평판배양 효율이고,
선택적으로 세포의 집단이 2-8℃에서 조제물의 보관 48시간 후 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 80%를 나타내거나,
세포의 집단이 그의 원래의 평판배양 효율의 적어도 90%를 나타내는 것인 조제물. - 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 보관 용기, 및/또는
(b) 주사기
내에 있는 조제물. - 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조제물을 제조하는 방법으로서, 세포의 집단을 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 동결보존되거나 펠렛화된 세포의 집단을 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액과 접촉시켜 세포를 재구성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액 또는 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조제물을 포함하고, 대상에 투여하는데 적합한 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액 또는 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조제물 또는 제35항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 선택적으로 용액 또는 조제물을 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함하고, 추가로 선택적으로 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 24, 적어도 36, 또는 적어도 48시간 동안 조제물의 보관 후 조제물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서, 대상은 망막 질환을 갖거나 망막 질환으로 진단되고, 선택적으로 망막 질환은 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 또는 스타가르트 질환인 방법.
- 제37항에 있어서, 조제물은 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 효과적인 크기의 세포의 집단을 포함하고, 선택적으로 대상에서 망막 질환의 적어도 하나의 증상을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (a) 세포의 집단을 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하는 단계
를 포함하고, 선택적으로
(b) (a)의 세포 조제물을 적어도 4, 적어도 6, 적어도 12, 적어도 18, 적어도 24, 적어도 36, 적어도 48, 적어도 60, 또는 적어도 72시간 동안 보관하는 단계
를 추가로 포함하며, 선택적으로
(c) (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물을 대상에게 투여하는 단계로서, 선택적으로 투여는 세포를 대상의 눈에 주입하는 것을 포함하는 것인 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제39항에 있어서,
(i) (b)의 보관 기간 후 (a)의 세포 조제물에서의 세포 생존력을 결정하는 단계, 및/또는
(ii) 단계 (b)의 보관 기간 동안 (a)의 세포 조제물을 냉장시키는 단계로서, 선택적으로 냉장은 세포 조제물을 2-8℃의 온도에 보관하는 것을 포함하는 것인 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조제물 또는 제35항의 약제학적 조성물의 유효량을 망막 질환을 갖는 대상의 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 망막 질환을 치료하는 방법으로서, 선택적으로 망막 질환이 막대세포 또는 원뿔세포 이상증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시, 또는 스타가르트 질환인 방법.
- (a) 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 용액;
(b) 세포 집단을 (a)의 용액과 접촉시켜 세포 조제물을 생성하기 위한 지침; 및
(c) (b)의 접촉 및/또는 (b)의 세포 조제물의 보관을 위한 용기
를 포함하는 키트로서, 선택적으로 (a)의 용액 및 용기가 대상에게 이식하기 위한 (b)의 세포 조제물의 사용에 적합한 키트.
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