BR112018003031B1

BR112018003031B1 - Solução salina de vida útil prolongada, preparação celular, seus usos, método de obtenção e armazenamento de preparação celular, composição farmacêutica e kit

Info

Publication number: BR112018003031B1
Application number: BR112018003031-7A
Authority: BR
Inventors: Roger GAY; Judson Ratliff; Romma E. Southwick
Original assignee: Astellas Institute For Regenerative Medicine
Priority date: 2015-08-18
Filing date: 2016-08-18
Publication date: 2023-12-26
Also published as: IL291163B1; TWI772270B; EP3334415A1; IL291163B2; EA202190722A1; IL299326A; IL257551A; JP7043392B2; JP7449915B2; TWI833293B; AU2022206757A1; MX2022010363A; AU2022206757B2; BR112018003031A2; US11957754B2; CN108697641A; TW201717912A; TW202245816A; US11013808B2; EA201890516A1

Abstract

formulações clínicas. alguns aspectos desta descrição fornecem meios clínicos que suportam a viabilidade, a eficiência de rechapeamento e a capacidade de repopulação de células e dos tecidos durante armazenagem por até 48 horas ou mais tempo. os meios clínicos providos no presente documento também são úteis para a irrigação clínica. as preparações de células ou de tecidos que compreendem uma população de células ou um tecido e um meio clínico tal como provido no presente documento também são providos, bem como os métodos para a geração de tais preparações. também são divulgados os métodos para usar os meios clínicos e as preparações de células e de tecidos providos no presente documento, por exemplo, para a administração de uma quantidade eficaz de célula ou tecido a um indivíduo com necessidade do mesmo.

Description

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício sob o 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de série 62/206.821, depositado em 18 de agosto de 2015, intitulado "FORMULAÇÕES CLÍNICAS", cujo teor integral é incorporado no presente documento a título de referência.

ANTECEDENTES

[002] Os meios clínicos atualmente disponíveis usados para a armazenagem e o transporte de células e de tecidos para o transplante não suportam a viabilidade de células e função além de períodos de tempo relativamente curtos (por exemplo, um máximo de 4 a 6 horas), e até mesmo durante esses tempos curtos de armazenagem, uma perda significativa das células e da função celular é normalmente observada. Além disso, os meios clínicos atuais que compreendem ânions de bicarbonato não podem tolerar a esterilização térmica e formam frequentemente a precipitação de sal de carbono até mesmo durante a armazenagem à temperatura ambiente, tendo por resultado uma vida útil curta.

SUMÁRIO

[003] Uma ampla variedade de procedimentos médicos se baseia no uso de soluções clínicas, por exemplo, para a irrigação de sítios cirúrgicos, limpeza de ferida, prevenção de aderência pós-cirúrgica, e remoção de resíduos dos sítios cirúrgicos. No contexto do implante ou do transplante de células ou de tecidos, as soluções clínicas são usadas para a formulação das células ou dos tecidos, armazenagem das células ou dos tecidos após a formulação até ser administrada a um indivíduo, e como um meio para carregar construtos de células ou tecidos durante a administração, por exemplo, durante a injeção das células ou dos tecidos. As soluções que entram em contato com as células ou os tecidos em um contexto clínico, por exemplo, durante a irrigação, a limpeza da ferida, a injeção, etc., são tipicamente estéreis, livres de pirogênio, tamponadas até o pH fisiológico, e exibem uma osmolaridade fisiológica.

[004] Um problema associado com as soluções de irrigação cirúrgica atualmente disponíveis para o uso durante a cirurgia para prevenção de trauma às células ou aos tecidos sensíveis é o uso de ânions de bicarbonato como agentes tampão junto com sais que podem formar precipitados com ânions de bicarbonato, tais como, por exemplo, virtualmente todos os sais iônicos de cálcio e magnésio que são usados tipicamente como excipientes farmacêuticos. A formação dos carbonatos e a precipitação subsequente podem ocorrer rapidamente quando uma solução que contém bicarbonato e cálcio e/ou magnésio é esterilizada a quente e também ocorrem frequentemente com o passar do tempo em condições de armazenagem ambiente.

[005] Uma solução possível para o problema da precipitação é a provisão de soluções de irrigação cirúrgica como kits de duas partes, nos quais uma parte contém o agente tampão de bicarbonato e a outra parte contém os sais de cálcio e/ou de magnésio. As partes são misturadas entre si tipicamente para formar uma única solução imediatamente antes do uso. O uso de tais soluções de duas partes é associado com vários inconvenientes, os quais incluem a necessidade de fabricar duas soluções separadas, uma etapa de misturação inconveniente que representa um risco que leva a erros de misturação, e uma vida útil tipicamente curta da solução misturada. Portanto, uma solução de irrigação de uma parte seria vantajosa e é muito desejável.

[006] Houve algumas tentativas de produzir uma solução de irrigação de uma parte. Vide, por exemplo, o Pedido de Patente Europeu EP 1067907 B1 (Armitage). Tais tentativas se basearam tipicamente no uso de agentes tampão orgânicos zwitteriônicos tais como o ácido N-(2- hidroxietil)piperazina-N'-(2-etano sulfônico), normalmente indicado como HEPES, para prevenir os problemas da precipitação de carbonato discutidos acima. No entanto, os agentes tampão orgânicos zwitteriônicos usados em tais soluções de irrigação de uma parte não são tipicamente compatíveis com meios de cultura de células ou de tecidos, e desse modo não proveem uma solução amplamente aplicável ao problema da formação de precipitados durante a armazenagem da célula.

[007] Além do problema da formação de precipitados e da incompatibilidade com os componentes de culturas de células comuns tal como indicado acima, as soluções de irrigação cirúrgica normalmente usadas também compreendem tipicamente uma combinação dos componentes que não podem suportar a esterilização a vapor, por exemplo, determinados carboidratos ou dissulfeto de glutationa (GSSG).

[008] Ao contrário das soluções de irrigação de uma parte previamente desenvolvidas, a presente invenção provê soluções de uma parte que não requerem o uso de agentes tampão orgânicos zwitteriônicos. As soluções de irrigação estabilizadas da presente invenção resolvem o problema da precipitação e da vida útil curta associada das soluções de irrigação atuais. As soluções providas no presente documento têm uma vida útil extremamente incrementada em comparação àquela de soluções atualmente disponíveis.

[009] As soluções providas no presente documento são úteis para a irrigação, a reconstrução celular (por exemplo, de células criopreservadas ou em péletes), a armazenagem de células (por exemplo, após a formulação para o envio ou o transplante), o transporte, e/ou a administração das células a um indivíduo (por exemplo, no contexto do implante ou do transplante de células). As soluções providas no presente documento podem ser usadas em conexão com diferentes tipos de células e com diferentes sítios de administração. Embora as aplicações oftalmológicas sejam as preferidas, outras aplicações também são contempladas e englobadas pela presente invenção.

[0010] Alguns aspectos da presente invenção proveem soluções para a reconstituição, a armazenagem, o transporte, e/ou a administração de células a um indivíduo. Em algumas modalidades, a solução compreende (a) um agente tampão, que mantém a solução a um pH fisiológico; e (b) pelo menos 2 mM de glicose; e (c) um agente osmoticamente ativo que mantém a solução a uma osmolaridade fisiológica. Em algumas modalidades, a solução compreende de 2 a 150 mM de glicose, por exemplo, 5 a 150 mM, 10 a 150 mM, 15 a 150 mM, 2 a 100 mM, 2 a 50 mM, 5 a 30 mM, 10 a 100 mM, 10 a 50 mM, 10 a 30 mM, 10 a 20 mM, 12 a 18 mM, 14 a 17 mM, 15 a 17 ou 16 a 17 mM. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 2,5 mM, pelo menos 3 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 7,5 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, ou pelo menos 30 mM de glicose. Em algumas modalidades, a glicose consiste em ou compreende dextrose. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 2,5 mM, pelo menos 3 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 6 mM, pelo menos 7,5 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, ou pelo menos 30 mM de dextrose. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 0,03% (em peso/volume), pelo menos 0,05% (em peso/volume), pelo menos 0,1% (em peso/volume), pelo menos 0,125% (em peso/volume), pelo menos 0,15% (em peso/volume), pelo menos 0,175% (em peso/volume), pelo menos 0,2% (em peso/volume), pelo menos 0,225% (em peso/volume), pelo menos 0,25% (em peso/volume), pelo menos 0,275% (em peso/volume), pelo menos 0,28% (em peso/volume), pelo menos 0,29% (em peso/volume), pelo menos 0,3 % (em peso/volume), pelo menos 0,35% (em peso/volume), pelo menos 0,4% (em peso/volume), pelo menos 0,45% (em peso/volume), pelo menos 0,5% (em peso/volume), pelo menos 0,55% (em peso/volume), pelo menos 0,6% (em peso/volume), pelo menos 0,65% (em peso/volume), pelo menos 0,7% (em peso/volume), pelo menos 0,75% (em peso/volume), pelo menos 0,8% (em peso/volume), pelo menos 0,9% (em peso/volume), pelo menos 1% (em peso/volume), pelo menos 1,25% (em peso/volume), pelo menos 1,5% (em peso/volume), pelo menos 1,75% (em peso/volume), pelo menos 2% (em peso/volume), pelo menos 2,125% (em peso/volume), pelo menos 2,5% (em peso/volume), pelo menos 2,75% (em peso/volume), ou pelo menos 3% (em peso/volume) de glicose. Em algumas modalidades, a solução também compreende uma fonte de cátions divalentes. Em algumas modalidades, os cátions divalentes compreendem cátions de cálcio e/ou de magnésio. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de cálcio e/ou uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, a solução compreende uma fonte de cálcio. Em algumas modalidades, a solução compreende uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, o agente tampão compreende um agente tampão de acetato e/ou de citrato.

[0011] Alguns aspectos desta invenção proveem soluções para a reconstituição, a armazenagem, o transporte, e/ou a administração de células a um indivíduo, em que a solução compreende (a) um agente tampão, que mantém a solução a um pH fisiológico; e (b) glicose; e (c) um agente osmoticamente ativo que mantém a solução a uma osmolaridade fisiológica; e (d) uma fonte de cátions divalentes. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de cálcio e/ou uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, o agente tampão compreende um agente tampão de acetato e/ou de citrato.

[0012] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a glicose é a D-glicose (Dextrose). Em algumas modalidades, a concentração de glicose é de 5 a 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração de glicose é de 10 a 25 mM. Em algumas modalidades, a concentração de glicose é de 10 a 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de glicose é de cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, ou cerca de 20 mM.

[0013] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a fonte de cátions divalentes compreende um sal farmaceuticamente aceitável de um cátion divalente. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende um sal de cálcio farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende um sal de magnésio farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende um sal de cálcio farmaceuticamente aceitável e/ou um sal de magnésio farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo dos sais de cálcio e/ou de magnésio formados com um ácido selecionado do grupo que compreende o ácido acético, o ácido ascórbico, o ácido cítrico, o ácido clorídrico, o ácido maleico, o ácido oxálico, o ácido fosfórico, o ácido esteárico, o ácido succínico e o ácido sulfúrico. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de cálcio. Em algumas modalidades, a fonte de cálcio compreende o cloreto de cálcio. Em algumas modalidades, a fonte de cálcio compreende o cloreto de cálcio di-hidratado. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, a fonte de magnésio compreende o cloreto de magnésio. Em algumas modalidades, a fonte de magnésio compreende o cloreto de magnésio hexaidratado. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a concentração da fonte de cálcio é de 0,25 a 0,75 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de 0,4 a 0,65 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de 0,5 a 0,6 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de cerca de 0,6 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de 0,5 a 0,9 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de 0,6 a 0,8 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de cerca de 0,7 mM.

[0014] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a concentração da fonte de magnésio é de 0,05 a 5 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de magnésio é de 0,1 a 0,3 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de magnésio é de cerca de 0,3 mM.

[0015] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o agente tampão de citrato ou acetato é provido na forma de um sal de citrato ou acetato. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o agente tampão de citrato é provido como o citrato de sódio. Em algumas modalidades, a concentração de citrato ou de acetato é de 0,1 a 5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato ou de acetato é de 0,5 a 2 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato ou de acetato é de cerca de 1 mM.

[0016] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o pH da solução é de 6,8 a 7,8. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o pH da solução é de 7,2 a 7,6. Em algumas modalidades, o pH da solução é de 7,4 a 7,5. Em algumas modalidades, o pH da solução é de cerca de 7,5.

[0017] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o agente osmoticamente ativo é um sal. Em algumas modalidades, o agente osmoticamente ativo é um sal de sódio. Em algumas modalidades, o agente osmoticamente ativo é o cloreto de sódio. Em algumas modalidades, a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 100 a 250 mM. Em algumas modalidades, a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 125 a 175 mM. Em algumas modalidades, a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 150 mM.

[0018] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução é isotônica. Em algumas modalidades, a solução é hipertônica. Em algumas modalidades, a solução exibe uma osmolaridade de cerca de 270 a 345 mOsm/l. Em algumas modalidades, a solução exibe uma osmolaridade de cerca de 300 a 330 mOsm/l. Em algumas modalidades, a osmolaridade da solução é de cerca de 315 mOsm/l.

[0019] Em algumas modalidades, a solução também compreende um sal de potássio. Em algumas modalidades, o sal de potássio é o cloreto de potássio. Em algumas modalidades, a concentração de KCl é de 0,2 a 5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de KCl é de 1 a 2,5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de KCl é de cerca de 2 mM.

[0020] Em algumas modalidades, a solução também compreende um polímero viscoelástico. Em alguma modalidade, o polímero é um polímero sintético. Em algumas modalidades, o polímero está presente a uma concentração eficaz para reduzir a exposição das células na solução à tensão de cisalhamento. Em algumas modalidades, a concentração do polímero é de 0,001 a 5% em peso/volume. Em algumas modalidades, a concentração do polímero é de cerca de 0,05% em peso/volume. Em algumas modalidades, o polímero é o ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo. Em algumas modalidades, o polímero é o hialuronato de sódio. Em algumas modalidades, o ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo é Healon Endocoat® (Abbott), Hyasis® (Novozymes), ou Pro-Visc® (Alcon). Em algumas modalidades, a concentração de ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo é de cerca de 0,001% a 0,05% em peso/volume, por exemplo, 0,01% a 0,05% em peso/volume, cerca de 0,02% a 0,05% em peso/volume, cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, ou cerca de 0,05% em peso/volume.

[0021] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, e glicose, por exemplo, D-glicose, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, glicose, por exemplo, D-glicose, e cloreto de potássio, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, e cerca de 145 mM de NaCl, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,5 a 0,9 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,2 a 0,4 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 0,8 a 1,2 mM de citrato de sódio, cerca de 13 a 19 mM de dextrose, e cerca de 116 a 174 mM de NaCl, em uma solução aquosa.

[0022] Em algumas modalidades, a solução também compreende cerca de 2 mM de KCl. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 2 mM de KCl, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,5 a 0,9 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,2 a 0,4 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 0,8 a 1,2 mM de citrato de sódio, cerca de 13 a 19 mM de dextrose, cerca de 116 a 174 mM de NaCl, e cerca de 1,6 a 2,4 mM de KCl, em uma solução aquosa.

[0023] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, glicose, por exemplo, D-glicose, e um polímero viscoelástico, por exemplo, o ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, glicose, por exemplo, a D-glicose, cloreto de potássio, e um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 1 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, cerca de 2 mM de KCl, e cerca de 0,01 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, cerca de 0,01 a 0,05% em peso/volume de ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 2 mM de KCl, cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 0,05% de ácido hialurônico em peso/volume. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,5 a 0,8 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,2 a 0,4 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1,6 a 2,4 mM de KCl, cerca de 0,8 a 1,2 mM de citrato de sódio, cerca de 13 a 19 mM de dextrose, cerca de 116 a 174 mM de NaCl, e cerca de 0,04 a 0,06% de ácido hialurônico em peso/volume.

[0024] Em algumas modalidades, a solução é estéril. Em algumas modalidades, a solução é essencialmente livre de pirogênio.

[0025] Em algumas modalidades, a solução não compreende um agente tampão de carbonato. Em algumas modalidades, a solução não compreende a glutationa, ou o dissulfeto de glutationa (GSSG). Em algumas modalidades, a solução não compreende um agente tampão orgânico zwitteriônico.

[0026] Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento podem ser armazenadas por pelo menos 4 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos 120 horas, pelo menos 144 horas, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, ou pelo menos um mês a 25°C sem precipitação mensurável dos solutos e/ou perda mensurável da capacidade da solução de suportar a sobrevivência e a viabilidade das células armazenadas na solução. Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento podem ser armazenadas por pelo menos 4 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos 120 horas, pelo menos 144 horas, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, ou pelo menos um mês a 2 a 8°C sem precipitação mensurável dos solutos e/ou perda mensurável da capacidade da solução de suportar a sobrevivência e a viabilidade das células armazenadas na solução.

[0027] Alguns aspectos da presente invenção proveem *preparações que compreendem uma população de células em uma solução tal como provido no presente documento. Em algumas modalidades, a população de células é apropriada para ser transplantada a um indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células é apropriada para ser transplantada ao olho de um indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células compreende células RPE. Em algumas modalidades, a população de células compreende células fotorreceptoras. Em algumas modalidades, a população de células compreende células mesenquimais. Em algumas modalidades, a população de células compreende células gangliais da retina. Em algumas modalidades, a população de células compreende célula progenitoras da retina. Em algumas modalidades, a população de células compreende células-tronco ou progenitoras hematopoiéticas, células-tronco ou progenitoras neurais, células neurais, astrócitos ou progenitoras de astrócitos, células gliais ou progenitoras de células gliais, e/ou células pancreáticas. Em algumas modalidades, a preparação é refrigerada. Em algumas modalidades, a preparação é refrigerada a cerca de 2 a 8°C. Em algumas modalidades, a preparação suporta a sobrevivência das células na população de células durante a armazenagem da preparação. Em algumas modalidades, pelo menos 70% das células na população de células ficam viáveis depois de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, ou depois de 144 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C. Em algumas modalidades, pelo menos 80% das células na população de células ficam viáveis depois de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, ou depois de 144 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C. Em algumas modalidades, pelo menos 90% das células na população de células ficam viáveis depois de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, ou depois de 144 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C. Em algumas modalidades, a preparação suporta a manutenção da eficiência de chapeamento da população de células durante a armazenagem da preparação. Em algumas modalidades, depois de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, ou depois de 144 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C, a população de células exibe pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua eficiência de chapeamento original, em que a eficiência de chapeamento original se refere à eficiência de chapeamento da população de células no início do período de armazenagem. Em algumas modalidades, a preparação fica dentro de um recipiente de armazenagem. Em algumas modalidades, a preparação fica dentro de uma seringa.

[0028] Alguns aspectos desta invenção proveem métodos para a preparação de preparações providasprovidas no presente documento, por exemplo, as preparações que compreendem uma população de células em uma solução tal como provido no presente documento, em que o método compreende a colocação da população de células em contato com a solução. Em algumas modalidades, o método compreende a colocação de uma população de células criopreservadas ou em péletes em contato com a solução, desse modo reconstituindo as células.

[0029] Alguns aspectos desta invenção proveem as composições farmacêuticas apropriadas para a administração a um indivíduo, em que as preparações farmacêuticas compreendem uma solução tal como provido no presente documento, ou uma preparação que compreende uma população de células em uma solução tal como provido no presente documento.

[0030] Alguns aspectos da presente invenção proveem métodos, os quais compreendem a administração de uma solução ou uma preparação tal como provido no presente documento a um indivíduo com necessidade da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende a administração da solução ou da preparação ao olho do indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende a administração da preparação ao indivíduo após a armazenagem da preparação por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 24, pelo menos 36, pelo menos 24, pelo menos 48, pelo menos 60, pelo menos 72, pelo menos 96, pelo menos 120, ou pelo menos 144 horas. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou é diagnosticado com uma doença da retina. Em algumas modalidades, a doença da retina é uma distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber, doenças associadas com as células ganglionais da retina, glaucoma, ou doença de Stargardt. Em algumas modalidades, a preparação compreende uma população de células de um tamanho eficaz para melhorar pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células compreende células RPE, células fotorreceptoras, ou células- tronco mesenquimais. Em algumas modalidades, o método também compreende o monitoramento de pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo.

[0031] Alguns aspectos desta invenção proveem métodos que compreendem (a) a colocação de uma população de células em contato com uma solução tal como provido no presente documento, desse modo gerando uma preparação de células. Em algumas modalidades, o método também compreende (b) a armazenagem da preparação de células de (a) por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 36, pelo menos 48, pelo menos 60, pelo menos 72, pelo menos 96, pelo menos 120, ou pelo menos 144 horas. Em algumas modalidades, o método também compreende (c) a administração da preparação de células de (a) a um indivíduo após o período de armazenagem de (b). Em algumas modalidades, a administração de (c) compreende a injeção das células no olho de um indivíduo. Em algumas modalidades, onde o método também compreende a determinação da viabilidade da célula na preparação de células de (a) após o período de armazenagem de (b). Em algumas modalidades, o método compreende a refrigeração da preparação de células de (a) durante o período de armazenagem da etapa (b). Em algumas modalidades, a refrigeração compreende a armazenagem da preparação de células a uma temperatura de 2 a 8°C. Em algumas modalidades, o método também compreende o transporte da preparação gerado em (a) para um local diferente do local no qual a preparação foi gerada dentro do período de armazenagem de (b). Em algumas modalidades, o transporte compreende o transporte da preparação para uma clínica ou uma sala de operação, onde ocorre a administração de (c).

[0032] Alguns aspectos desta invenção proveem métodos para o tratamento de uma doença da retina, em que os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma preparação de células provido no presente documento no olho de um indivíduo que tem uma doença da retina. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou é diagnosticado com a doença da retina. Em algumas modalidades, a doença da retina é uma distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, miopia patológica, amaurose congênita de Leber, glaucoma, ou doença de Stargardt. Em algumas modalidades, a preparação compreende uma população de células de um tamanho eficaz para melhorar pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células compreende células RPE, células fotorreceptoras, gânglios da retina, ou células-tronco mesenquimais. Em algumas modalidades, o método também compreende o monitoramento de pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo.

[0033] Alguns aspectos desta invenção proveem kits que compreendem (a) uma solução tal como provida no presente documento; e (b) instruções para a colocação de uma população de células em contato com a solução de (a) para gerar uma preparação de células; e (c) um recipiente para o contato de (b) e/ou para a armazenagem da preparação de células de (b). Em algumas modalidades, a solução de (a) e o recipiente de (c) são apropriados para o uso da preparação de células de (b) para o transplante a um indivíduo.

[0034] O objetivo da descrição resumida acima é ilustrar, de uma maneira não limitadora, algumas das modalidades, vantagens, características, e usos da tecnologia divulgada no presente documento. Outras modalidades, vantagens, características, e usos da tecnologia divulgada no presente documento serão aparentes a partir da Descrição Detalhada, dos Desenhos, dos Exemplos e das Reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] Figura 1. As células RPE podem ser mantidas em HypoThermosol por 24 (mas não 48 horas) sem nenhuma perda aparente na capacidade subsequente de chapeamento e crescimento em cultura.

[0036] Figura 2. A estabilidade de RPE em GS2 (2 a 8°C). As células RPE podem ser mantidas em GS2 por pelo menos 48 horas sem nenhuma perda aparente no número de células viáveis ou na capacidade subsequente de chapeamento e crescimento em cultura.

[0037] Figura 3. A estabilidade de RPE em GS2 (2 a 8°C). As células RPE podem ser mantidas em GS2 por 4 a 5 dias com somente uma perda nominal na viabilidade celular e nenhuma diminuição significativa na densidade das células viáveis.

[0038] Figura 4. A estabilidade de RPE em GS2 (2 a 8°C). A capacidade das células RPE de chapeamento e crescimento em cultura começa a diminuir depois de 5 dias em armazenagem a frio em GS2.

[0039] Figura 5. A estabilidade de RPE em GS2 (2 a 8°C). GS2 é compatível com o sistema de injeção atual.

[0040] Figura 6. São mostradas as densidades médias das células viáveis dos tubos em triplicata ± desvios padrão. A densidade das células RPE humanas foi determinada a usar um hemocitômetro. A viabilidade das células foi obtida pela exclusão de Trypan Blue. Os valores médios foram calculados a partir de tubos em triplicata de células que foram produzidas para cada condição, com concentrações de células viáveis para cada tubo determinadas a partir das contagens em triplicata. A porcentagem de mudança (delta) nos números de células observada após a extrusão das células através da cânula de MedOne #3233 é mostrada acima através de cada conjunto de valores, para cada condição.

[0041] Figura 7. São mostrados os números médios e os desvios padrão (± SD) de células RPE humanas por poço de seis poços para cada condição testada. Para cada condição, cerca de 20.000 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços revestidas com gelatina e cultivadas em meios de crescimento de RPE (EBM-2 com Quotas Únicas de EGM2, Stem Cell, Inc.) por três dias em uma incubadora com umidade controlada a 5% de CO2, e a 37 graus Celsius. Para determinar os números das células depois de 3 dias de crescimento, as células foram elevadas com uma mistura de 1:1 de tripsina (Sigma) e um Meio de Dissociação à base de HEPES (Gibco.) Uma vez que as células foram elevadas, a tripsina foi neutralizada com um meio que contém soro fetal bovino a 10% e as células foram contadas ao usar um hemocitômetro.

[0042] Figura 8. Comparação de meios diferentes para a armazenagem de MSCs. As MSCs derivadas de células-tronco embrionárias humanas foram desenvolvidas até 70% de confluência, colhidas, com 0,05% de tripsina, ressuspensas em um meio de MEM+15% de FCS (meio de MSC) e giradas a 200 x g por 5 minutos.As células peletizadas foram ressuspensas em um volume pequeno de meio de MSC e contadas quanto à viabilidade ao usar a exclusão de trypan blue. A seguir, 5 milhões de MSCs foram colocados em cada um dos 4 tubos Eppendorf, girados e ressuspensos em 1 ml de cada um dos agentes tampão indicados. Os tubos foram colocados em uma sala fria ajustada a 4°C para a quantidade de tempo indicada. CS: soro canino; FBS: soro fetal bovino.

[0043] Figura 9. A viabilidade da MSC é melhorada quando armazenada a uma densidade mais elevada em GS2, enquanto a presença do FBS contribui pouco para melhorar a viabilidade em GS2 por 24 horas.

[0044] Figura 10. A viabilidade da MSC é preservada quando armazenada dentro e expurgada através de uma agulha 26G/seringa (em GS2 a 4°C).

[0045] Figura 11. Os eletroretinogramas (ERG) realizados 60 dias após o tratamento para um grupo de olhos de 16 ratos tratados tanto com as células RPE suspensas em BSS-Plus quanto com o meio de transporte GS2, em comparação aos olhos dos animais tratados tanto com BSS-Plus quanto com um meio de transporte GS2 apenas (nenhuma célula), ou sujeitados a um tratamento simulado ou a nenhum tratamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA Introdução

[0046] Embora muitos procedimentos cirúrgicos avançados minimizem os danos às células e aos tecidos em comparação a técnicas mais antigas, determinados procedimentos delicados permanecem muito sensíveis às técnicas e aos materiais usados. Por exemplo, os procedimentos cirúrgicos oftálmicos, tais como a cirurgia de catarata e a cirurgia de vitrectomia, envolvem células e tecidos muito frágeis (tal como a camada endotelial da córnea) e, por conseguinte, têm pouco espaço para erro e um grande potencial para causar dano a tais tecidos oculares e à visão do paciente. Além disso, o transplante de células, por exemplo, no contexto de uma abordagem de medicina regenerativa, frequentemente requer a formulação, a armazenagem, o transporte, e/ou a injeção de células delicadas ou frágeis que podem ser danificadas ou perder a capacidade de repovoamento mediante a manipulação inadequada ou a exposição às condições não fisiológicas.

[0047] A presente invenção provê soluções para a irrigação, a reconstituição da célula, a armazenagem da célula, o transporte da célula, e/ou a administração da célula a um indivíduo. As soluções providas no presente documento possuem várias vantagens em comparação às soluções atualmente disponíveis para a irrigação, a reconstituição, a formulação, a armazenagem, e/ou o transplante de células. Por exemplo, ao contrário dos meios atualmente disponíveis, as soluções providas no presente documento suportam a sobrevivência de vários tipos de células e tecidos, incluindo células e tecidos frágeis, e mantêm níveis melhorados da viabilidade das células e dos tecidos, da eficiência de rechapeamento, e da capacidade de repovoamento até mesmo durante períodos prolongados de armazenagem. Tal como explicado em mais detalhes em outra parte no presente documento, os meios atualmente disponíveis para a irrigação ou a formulação de células antes da cirurgia têm uma vida útil curta (por exemplo, baseado na precipitação de sais do carbono), e/ou não suportam a sobrevivência, a eficiência de rechapeamento, e a capacidade de repovoamento de células armazenadas por longos períodos de tempo (por exemplo, por mais de 4 a 6 horas). Por causa da vida útil curta e da falta de suporte da viabilidade e função das células, além dos períodos de tempo relativamente curtos, o uso dos meios atualmente disponíveis requer a formulação dos meios e/ou das células e dos tecidos nos respectivos meios bastante próximos do sítio clínico onde os meios ou as preparações de células são usados (por exemplo, transplantados), por exemplo, tanto internamente na clínica quanto em um laboratório bastante próximo. Por conseguinte, as soluções atualmente disponíveis limitam o uso clínico das células ou dos tecidos formulados às aplicações que permitem a administração dentro do curto período de tempo durante o qual a viabilidade das células, a eficiência de rechapeamento, e/ou a capacidade de repovoamento são aceitáveis. O requisito para a formulação bastante próxima do sítio clínico gera despesas adicionais, riscos, e limitações adicionais de processamento fora do sítio.

[0048] Por outro lado, as soluções providas no presente documento têm uma vida útil prolongada em comparação às soluções atualmente disponíveis, e também suportam a função das células, a viabilidade, a eficiência de rechapeamento, e a capacidade de repovoamento de vários tipos de células, incluindo células frágeis, tais como as células RPE e fotorreceptoras e as células-tronco mesenquimais, até mesmo durante longos períodos de armazenagem (por exemplo, períodos de armazenagem de até 24 horas, até 48 horas, ou mais longos). As soluções providas no presente documento também são biocompatíveis e desse modo apropriadas para a administração a um indivíduo. As células ou os tecidos formulados em uma solução provida no presente documento podem desse modo ser diretamente administrados a um indivíduo sem a necessidade de uma substituição do meio.

[0049] As características melhoradas das soluções providas no presente documento permitem o transporte de soluções, células, e tecidos formulados até os sítios clínicos distantes do sítio de formulação, o que permite o processamento central e a formulação do produto final e elimina a necessidade da formulação bastante próxima ao sítio clínico. As capacidades de armazenagem e de transporte melhoradas das soluções providas no presente documento também permitem o uso dos sítios clínicos que ficam mais distantes do sítio de formulação do produto final, e também aumentam a flexibilidade na programação de aplicações clínicas, por exemplo, na programação de cirurgias para a administração das células ou dos tecidos formulados nas soluções providas no presente documento. O período de tempo ampliado para a armazenagem também provê oportunidades adicionais para o controle de qualidade do produto formulado, por exemplo, o teste quanto à presença de contaminantes patogênicos no produto formulado final, antes que as operações clínicas comecem, por exemplo, antes que uma equipe cirúrgica inicie a preparação da cirurgia ou antes que um indivíduo seja preparação para a cirurgia.

Soluções Clínicas

[0050] Alguns aspectos desta invenção proveem soluções clínicas para a irrigação, e para a formulação, a armazenagem, o transporte, e a administração de células e tecidos.

[0051] Ao contrário dos meios atualmente disponíveis usados para a irrigação e a formulação de células, por exemplo, as soluções de sal balanceadas, ou salinas, as soluções clínicas atualmente descritas suportam a sobrevivência prolongada e a função das células ou tecidos sensíveis, são fáceis de preparar e esterilizar, e têm uma vida útil prolongada.

[0052] As soluções de sal simples, tais como a solução salina tamponada com fosfato ou as soluções de cloreto de sódio a 0,9% podem ser usadas para a armazenagem a curto prazo das células, mas estas soluções não suportam suficientemente a viabilidade das células ou a função das células para a armazenagem a longo prazo, tendo por resultado uma diminuição frequentemente inaceitável e significativa na viabilidade das células, na eficiência de rechapeamento, e na capacidade de repovoamento até mesmo somente após breves períodos de armazenagem.

[0053] Soluções de sal balanceadas mais sofisticadas estão disponíveis para finalidades clínicas, tais como a irrigação clínica ou a armazenagem de células e tecidos, que compreendem tipicamente um agente para manter a osmolaridade, uma fonte de cálcio, uma fonte de magnésio e um agente tampão.

[0054] O cloreto de sódio é usado normalmente para manter a osmolaridade da solução. Os íons de cálcio exercem um papel na manutenção das junções intercelulares, por exemplo, no endotélio da córnea. Os íons de magnésio, tais como os íons de cálcio, são encontrados no humor aquoso e são essenciais a uma série de processos celulares.

[0055] Os ânions de bicarbonato são usados tipicamente como agente tampão, uma vez que eles representam um agente tampão fisiológico para muitos tecidos e são amplamente compatíveis com outros solutos. Determinadas formas de cálcio e de magnésio, no entanto, podem reagir com o bicarbonato para formar carbonatos de cálcio ou de magnésio que podem precipitar da solução sob determinadas circunstâncias. A reação e a precipitação podem ocorrer rapidamente quando uma solução que contém bicarbonato e cálcio e/ou magnésio é esterilizada a quente e podem ocorrer com o passar do tempo em condições de armazenagem ambiente. A reação entre o cálcio ou o magnésio e o bicarbonato parece ocorrer virtualmente com todos os sais iônicos de cálcio e de magnésio que são usados tipicamente como excipientes farmacêuticos.

[0056] Uma abordagem para evitar a precipitação consiste em prover uma solução clínica ao usar um agente tampão de bicarbonato como duas soluções de partida separadas que são misturadas logo antes da aplicação. Por exemplo, um meio clínico amplamente usado é a Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® (Alcon Laboratories, Inc.). A Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® é uma solução de duas partes. As partes são misturadas uma à outra para formar uma única solução apenas antes da cirurgia. Esta etapa de misturação pode ser inconveniente e representa um risco para erros de misturação em uma sala de operação agitada. Além disso, a manufatura de duas soluções separadas é mais complexa e onerosa do que a manufatura de uma formulação de uma parte. Portanto, uma solução clínica de uma parte seria vantajosa e é muito desejável.

[0057] A Parte I da Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® contém cloreto de sódio, cloreto de potássio, bicarbonato de sódio, e fosfato de sódio dibásico dissolvidos em água para a injeção. O pH da Parte I é próximo do neutro, e ela tem uma osmolalidade que é quase isotônica com relação aos fluidos fisiológicos. A Parte II da Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® contém cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, dextrose, e dissulfeto de glutationa (GSSG) dissolvidos em água para a injeção. O pH da Parte II é ajustado até entre 3 e 5 e a solução tem uma osmolalidade hipotônica.

[0058] A Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® reconstituída tem um pH neutro e uma osmolalidade que é isotônica. Os cátions divalentes tais como o cálcio e o magnésio na Parte II irão reagir com o bicarbonato e o fosfato na Parte I para formar um precipitado se as duas partes da Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® forem combinadas. Esta reação prossegue quase imediatamente se a solução combinada for esterilizada a vapor, e de maneira mais lenta à temperatura ambiente, tipicamente por um período de horas a vários dias. Para evitar esta precipitação, a vida útil na etiqueta da Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® reconstituída é de seis horas, durante a qual a solução deve ser usada.

[0059] Houve tentativas anteriores de produzir uma solução clínica de uma parte comparável em desempenho à Solução de Irrigação Intraocular Estéril BSS PLUS® de duas partes. O Pedido de Patente Europeu EP 1067907 B1 (Armitage) ensina o uso de agentes tampão orgânicos zwitteriônicos tais como o ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'- (2-etano sulfônico), normalmente indicado como HEPES, para evitar a precipitação tal como discutido acima. As formulações divulgadas pela Armitage não contêm componentes tais como a dextrose e o GSSG que são conhecidos por serem instáveis quando autoclivados ou incorporados em soluções de pH fisiológico. As formulações divulgadas pela Armitage também não contêm componentes do tipo normalmente presentes em meios de cultura de tecidos, tais como aminoácidos. Os ensinamentos da Armitage desse modo não proveem uma solução para o problema da formação do precipitado.

[0060] Ao contrário das soluções de uma parte previamente desenvolvidas, alguns aspectos da presente invenção proveem as soluções clínicas de uma parte que não requerem o uso de agentes tampão orgânicos zwitteriônicos tais como HEPES, BES, MOPS, TES, EPPS, e TRICINE para manter a solução dentro de uma faixa de pH fisiológico. As soluções clínicas da presente invenção resolvem o problema da vida útil curta. As soluções clínicas providas no presente documento melhoraram bastante a vida útil em comparação aos meios clínicos atualmente disponíveis, e o suporte da viabilidade, da eficiência de rechapeamento, e da capacidade de repovoamento das células até mesmo após uma armazenagem a longo prazo de 24, 48, 60, 72, 96, 120, 144, ou 168 horas ou mais.

[0061] O termo "solução," tal como usado no presente documento, refere-se a um meio aquoso que compreende a água como solvente principal e um ou mais solutos dissolvidos na solução, por exemplo, um agente tampão, um agente osmoticamente ativo, a glicose, um sal, um polímero, etc. Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento são para o uso clínico, e desse modo são atóxicas, essencialmente livres de pirogênio, e estéreis.

[0062] Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento exibem um pH fisiológico e uma pressão osmótica fisiológica, também indicada como uma osmolaridade fisiológica. Um pH fisiológico refere-se a um pH que não é citotóxico e se assemelha ao pH da célula ou do tecido ao qual a solução é administrada, ou que uma célula ou tecido formulado na solução encontra em seu ambiente natural. Para a maior parte das células e tecidos, um pH fisiológico é um pH de cerca de 6,8 a 7,8, por exemplo, um pH de 7 a 7,7, um pH de 7,2 a 7,6, um pH de 7,2 a 7,4, ou um pH de 7,4 a 7,5. Por conseguinte, em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento exibem um pH de cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, ou cerca de 7,8. Uma pressão osmótica fisiológica refere-se a uma pressão osmótica que não é citotóxica e se assemelha à pressão osmótica da célula ou tecido ao qual a solução é administrada, ou que uma célula ou tecido formulado na solução encontra em seu ambiente natural. Para a maior parte das células e tecidos, uma pressão osmótica fisiológica é de cerca de 270 a 345 mOsm/l, por exemplo, 280 a 330 mOsm/l, 290 a 325 mOsm/l, 300 a 315 mOsm/l. Em algumas modalidades, uma pressão osmótica fisiológica é de cerca de 300, cerca de 305, cerca de 310, cerca de 315, cerca de 320, ou cerca de 325 mOsm/l.

[0063] O termo "pressão osmótica" ou "osmolaridade" de uma solução é a pressão necessária para interromper o fluxo do solvente para uma solução através de uma membrana semipermeável que separa o solvente puro em um lado e a solução no outro lado, em que a membrana semipermeável é permeável para as moléculas do solvente, mas impermeável para as moléculas do soluto. A pressão osmótica de uma solução é proporcional à concentração molar das partículas do soluto na solução, e é medida em mOsm/l ou em mOsm/kg. Em algumas modalidades, a solução provida no presente documento exibe uma osmolaridade entre cerca de 290 mOsm/l e cerca de 320 mOsm/l, ou entre cerca de 300 mOsm/l e 310 mOsm/l ou cerca de 305 mOsm/l. Em algumas modalidades, a solução exibe uma osmolaridade de cerca de 300 a 330 mOsm/l. Em algumas modalidades, a osmolaridade da solução é de cerca de 300, cerca de 305, cerca de 310, cerca de 315, cerca de 320, ou cerca de 325 mOsm/l.

[0064] Em algumas modalidades, a osmolaridade de uma solução provida no presente documento também é indicada em termos de sua tonicidade, em que uma solução hipertônica é uma solução que faz com que as células encolham, uma solução hipotônica é uma solução que faz com que as células intumesçam, e uma solução isotônica não produz mudança alguma no volume das células. Os termos "hipertônica", "hipotônica", e "isotônica" são usados tipicamente com relação a uma célula, a uma população de células, ou a um tecido com o qual a solução é colocada em contato. Por exemplo, nas modalidades, onde uma solução de irrigação é provida, a isotonicidade refere-se a uma pressão osmótica que não causa uma mudança no volume das células ou tecidos que entram em contato com a solução durante a irrigação. Similarmente, nas modalidades, onde a solução é usada para formular uma célula, uma população de células, ou um tecido para o uso clínico, por exemplo, para o transplante a um indivíduo, a isotonicidade refere-se a uma pressão osmótica que não causa uma mudança no volume da célula, das células da população de células, ou das células do tecido quando formulado na solução. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução é isotônica. Em algumas modalidades, a solução é hipertônica.

[0065] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o agente osmoticamente ativo é um sal. Em algumas modalidades, o sal é um sal farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o agente osmoticamente ativo é um sal de sódio. Em algumas modalidades, o agente osmoticamente ativo é o cloreto de sódio. Em algumas modalidades, a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 100 a 200 mM, 125 a 175 mM, ou 140 a 160 mM. Em algumas modalidades, a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155, cerca de 160, cerca de 165, cerca de 170, cerca de 175, cerca de 180, cerca de 185, cerca de 190, cerca de 195, ou cerca de 200 mM.

[0066] O termo "osmolaridade fisiológica", tal como usado no presente documento, refere-se a uma pressão osmótica que não é citotóxica (por exemplo, que não faz com que uma determinada célula ou tipo de célula se rompa ou então não cause danos à célula), e se assemelha à pressão osmótica do tecido ao qual a solução é administrada, ou que uma célula ou tecido formulado na solução encontra em seu ambiente natural. A faixa da osmolaridade fisiológica para a maior parte das aplicações fica entre cerca de 280 mOsm/l e cerca de 325 mOsm/l, entre cerca de 290 mOsm/l e cerca de 320 mOsm/l, ou entre cerca de 300 mOsm/l e 310 mOsm/l, ou cerca de 305 mOsm/l.

[0067] Em algumas modalidades, as soluções para a reconstituição, a armazenagem, o transporte, e/ou a administração de células a um indivíduo providas no presente documento compreendem (a) um agente tampão, que mantém a solução a um pH fisiológico; e (b) pelo menos 2 mM de glicose; e (c) um agente osmoticamente ativo que mantém a solução a uma osmolaridade fisiológica. Em algumas modalidades, a solução também compreende uma fonte de cátions divalentes. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de cálcio e/ou uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, a solução compreende uma fonte de cálcio. Em algumas modalidades, a solução também compreende uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, o agente tampão compreende um agente tampão de acetato e/ou um agente tampão de citrato. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 4 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 6 mM, pelo menos 7 mM, pelo menos 7,5 mM, pelo menos 8 mM, pelo menos 9 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 40 mM, ou pelo menos 50 mM de glicose. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 0,5 mM, pelo menos 1 mM, pelo menos 2 mM, pelo menos 2,5 mM, pelo menos 3 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 6 mM, pelo menos 7 mM, pelo menos 7,5 mM, pelo menos 8 mM, pelo menos 9 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 16 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 40 mM, ou pelo menos 50 mM de dextrose. Em algumas modalidades, a solução compreende não mais do que 3 mM, não mais do que 4 mM, não mais do que 5 mM, não mais do que 6 mM, não mais do que 7 mM, não mais do que 7,5 mM, não mais do que 8 mM, não mais do que 9 mM, não mais do que 10 mM, não mais do que 15 mM, não mais do que 17 mM, não mais do que 20 mM, não mais do que 25 mM, não mais do que 30 mM, não mais do que 40 mM, ou não mais do que 50 mM de glicose. Em algumas modalidades, a solução compreende não mais do que 0,5mM, não mais do que 1 mM, não mais do que 2 mM, não mais do que 2,5 mM, não mais do que 3 mM, não mais do que 4 mM, não mais do que 5 mM, não mais do que 6 mM, não mais do que 7 mM, não mais do que 7,5 mM, não mais do que 8 mM, não mais do que 9 mM, não mais do que 10 mM, não mais do que 15 mM, não mais do que 20 mM, não mais do que 25 mM, não mais do que 30 mM, não mais do que 40 mM, ou não mais do que 50 mM de dextrose.

[0068] Em algumas modalidades, as soluções para a reconstituição, a armazenagem, o transporte, e/ou a administração de células a um indivíduo providas no presente documento compreendem (a) um agente tampão, que mantém a solução a um pH fisiológico; e (b) glicose; e (c) um agente osmoticamente ativo que mantém a solução a uma osmolaridade fisiológica; e (d) uma fonte de cálcio; e (e) uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, o agente tampão compreende um agente tampão de acetato e/ou de citrato. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 0,5 mM, pelo menos 1 mM, pelo menos 2 mM, pelo menos 2,5 mM, pelo menos 3 mM, pelo menos 4 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 6 mM, pelo menos 7 mM, pelo menos 7,5 mM, pelo menos 8 mM, pelo menos 9 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 16 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 40 mM, ou pelo menos 50 mM de glicose. Em algumas modalidades, a solução compreende pelo menos 0,5 mM, pelo menos 1 mM, pelo menos 2 mM, pelo menos 2,5 mM, pelo menos 3 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 6 mM, pelo menos 7 mM, pelo menos 7,5 mM, pelo menos 8 mM, pelo menos 9 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 16 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 25 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 40 mM, ou pelo menos 50 mM de dextrose. Em algumas modalidades, a solução compreende não mais do que 0,5 mM, não mais do que 1 mM, não mais do que 2 mM, não mais do que 2,5 mM, não mais do que 3 mM, não mais do que 4 mM, não mais do que 5 mM, não mais do que 6 mM, não mais do que 7 mM, não mais do que 7,5 mM, não mais do que 8 mM, não mais do que 9 mM, não mais do que 10 mM, não mais do que 15 mM, não mais do que 17 mM, não mais do que 20 mM, não mais do que 25 mM, não mais do que 30 mM, não mais do que 40 mM, ou não mais do que 50 mM de glicose. Em algumas modalidades, a solução compreende não mais do que 0,5 mM, não mais do que 1 mM, não mais do que 2 mM, não mais do que 2,5 mM, não mais do que 3 mM, não mais do que 4 mM, não mais do que 5 mM, não mais do que 6 mM, não mais do que 7 mM, não mais do que 7,5 mM, não mais do que 8 mM, não mais do que 9 mM, não mais do que 10 mM, não mais do que 15 mM, não mais do que 17 mM, não mais do que 20 mM, não mais do que 25 mM, não mais do que 30 mM, não mais do que 40 mM, ou não mais do que 50 mM de dextrose.

[0069] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a concentração de glicose ou de dextrose é de 0,5 a 150 mM, 0,5 a 50 mM, 2,5 a 50 mM, 5 a 50 mM, 10 a 50 mM, 0,5 a 25 mM, 2,5 a 25 mM, 5 a 25 mM, 10 a 25 mM, ou 10 a 20 mM. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a concentração de glicose ou de dextrose é de cerca de 0,5 mM, cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 2,5 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 7,5 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 12,5 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 22,5 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cerca de 35 mM, cerca de 40 mM, cerca de 45 mM, ou cerca de 50 mM.

[0070] Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento compreendem uma fonte de cátions divalentes. Os cátions divalentes apropriados incluem, sem limitação, por exemplo, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cr2+, Cu2+, Ba2+ e Sr2+. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de cálcio. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de magnésio. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de dois ou mais cátions divalentes diferentes, por exemplo, uma fonte de cálcio e uma fonte de magnésio.

[0071] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução compreende uma fonte de cálcio, por exemplo, uma fonte de íons de cálcio. Em algumas modalidades, a fonte de cálcio compreende um sal de cálcio farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução compreende uma fonte de magnésio, por exemplo, uma fonte de íons de magnésio. Em algumas modalidades, a fonte de magnésio compreende um sal de magnésio farmaceuticamente aceitável.

[0072] O termo "sal farmaceuticamente aceitável", tal como usado no presente documento, refere-se a um sal que é considerado como apropriado para a administração a um indivíduo humano. Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável é um sal formado com um ácido selecionado do grupo que compreende o ácido acético, o ácido ascórbico, o ácido cítrico, o ácido clorídrico, o ácido maleico, o ácido oxálico, o ácido fosfórico, o ácido esteárico, o ácido succínico e o ácido sulfúrico. Em algumas modalidades, a fonte farmaceuticamente aceitável de cátions divalentes é selecionada do grupo dos sais de cálcio e/ou de magnésio formados com um ácido selecionado do grupo que compreende o ácido acético, o ácido ascórbico, o ácido cítrico, o ácido clorídrico, o ácido maleico, o ácido oxálico, o ácido fosfórico, o ácido esteárico, o ácido succínico e o ácido sulfúrico. Por exemplo, um sal de cálcio farmaceuticamente aceitável deste grupo de modalidades deve incluir o acetato do cálcio, o ascorbato de cálcio, o citrato de cálcio, o cloreto de cálcio, o maleato de cálcio, o oxalato de cálcio, o fosfato de cálcio, o estearato de cálcio, o succinato de cálcio e o sulfato de cálcio. Deve ficar aparente aos elementos versados na técnica que, nas modalidades, onde uma solução compreende dois ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, cálcio, magnésio, e sais de potássio), alguns ou todos os sais podem ser formados com o mesmo ácido (por exemplo, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, e cloreto de potássio), ou dois ou mais sais podem ser formados com ácidos diferentes (por exemplo, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, e acetato de potássio; cloreto de cálcio, citrato de magnésio, e maleato de potássio; etc.).

[0073] Em algumas modalidades, o sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, o sal de cálcio ou de magnésio farmaceuticamente aceitável, é um sal de um ácido selecionado do grupo que consiste em ácido 1-hidróxi-2-naftoico, ácido 2,2-dicloro acético, ácido 2-hidróxi etano sulfônico, ácido 2-oxoglutárico, ácido 4- acetamido benzoico, ácido 4-amino salicílico, ácido acético, ácido adípico, ácido ascórbico (L), ácido aspártico (L), ácido benzeno sulfônico, ácido benzoico, ácido canfórico (+),ácido canfor-10-sulfônico (+), ácido cáprico (ácido decanoico), ácido caproico (ácido hexanoico), ácido caprílico (ácido octanoico), ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido dodecil sulfúrico, ácido etano-1,2- dissulfônico, ácido etano sulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptônico (D), ácido glucônico (D), ácido glucurônico (D), ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido isobutírico, ácido láctico (DL), ácido lactobiônico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico (-L), ácido malônico, ácido mandélico (DL), ácido metano sulfônico, ácido naftaleno-1,5- dissulfônico, ácido naftaleno-2-sulfônico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido oleico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido piroglutâmico (-L), ácido salicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfúrico, ácido tartárico (+L), ácido tiociânico, ácido tolueno sulfônico (p) e ácido undecilênico. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis apropriados serão aparentes aos elementos versados na técnica, e deve ser apreciado que a presente invenção não é limitada a este respeito.

[0074] Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma concentração total de cátions divalentes de 0,1 a 20 mM, por exemplo, de cerca de 0,5 a 10 mM, 0,5 a 5 mM, 1 a 10 mM, ou 2 a 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cátions divalentes é de cerca de 0,2 mM, cerca de 0,3 mM, cerca de 0,4 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM, cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM, cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, ou cerca de 5 mM. Em algumas modalidades, a fonte de cátions divalentes compreende uma fonte de cálcio e/ou de magnésio.

[0075] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a fonte de cálcio compreende o cloreto de cálcio. Em algumas modalidades, a fonte de cálcio compreende o cloreto de cálcio di-hidratado. Em algumas modalidades, a fonte de magnésio compreende o cloreto de magnésio. Em algumas modalidades, a fonte de magnésio compreende o cloreto de magnésio hexaidratado. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a concentração da fonte de cálcio é de 0,1 a 1,2 mM, 0,25 a 0,75 mM, 0,4 a 0,65 mM, ou 0,5 a 0,7 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de cálcio é de cerca de 0,2 mM, cerca de 0,3 mM, cerca de 0,4 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM, cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM, cerca de 1 mM, cerca de 1,1 mM, ou cerca de 1,2 mM. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a concentração da fonte de magnésio é de 0,05 a 5 mM, 0,1 a 0,5 mM, 0,25 a 2,5 mM, 0,1 a 1 mM, ou 0,1 a 0,3 mM. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de magnésio é de cerca de 0,05 mM, cerca de 0,1 mM, cerca de 0,2 mM, cerca de 0,3 mM, cerca de 0,4 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM, cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM, cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, ou cerca de 5 mM.

[0076] Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, as soluções compreendem um agente tampão. O termo "agente tampão", que é usado intercambiavelmente com o termo "tampão" no presente documento, refere-se a um agente que pode manter o pH de uma solução relativamente estável enquanto neutraliza o ácido ou a base adicionada. Tipicamente, um agente tampão compreende um par de ácido e base conjugado fraco, isto é, tanto um ácido fraco e a sua base conjugada quanto uma base fraca e o seu ácido conjugado.

[0077] Em algumas modalidades, o agente tampão compreendido nas soluções providas no presente documento é um agente tampão de citrato ou de acetato, por exemplo, provido na forma de um sal de citrato ou de acetato. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, o agente tampão de citrato é provido como um citrato de sódio. Em algumas modalidades, a concentração de citrato ou de acetato é de 0,1 a 5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato ou de acetato é de 0,5 a 2 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato ou de acetato é de cerca de 0,05 mM, 0,06 mM, 0,07 mM, 0,09 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,9 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, ou 10 mM.

[0078] Em algumas modalidades, a solução também compreende um sal de potássio, de preferência um sal de potássio farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o sal de potássio é o cloreto de potássio. Em algumas modalidades, a concentração de KCl é de 0,2 a 5 mM ou 1 a 2,5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de KCl é de cerca de 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,9 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 4 mM, ou 5 mM.

[0079] Em algumas modalidades, a solução também compreende um polímero viscoelástico. Sem desejar ficar vinculado à teoria, acredita-se que a adição de um polímero viscoelástico realce a viabilidade das células e dos tecidos, a eficiência de rechapeamento, e a capacidade de repovoamento depois da armazenagem em uma solução provida no presente documento e/ou após a administração a um indivíduo, por exemplo, através de uma rota de administração que compreende a canulação, mediante a proteção de células e tecidos contra a tensão de cisalhamento. Os polímeros viscoelásticos são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica, e os polímeros viscoelásticos apropriados exemplificadores incluem, mas sem ficar a eles limitados, o ácido hialurônico (por exemplo, Healon Endocoat® (Abbott), Hyasis® (Novozymes), e Pro-Visc® (Alcon)), alginatos (incluindo o alginato de sódio), Poli(etileno glicol) (PEG), também conhecido como poli(óxido de etileno) (PEO), poliacrilamida, poli(álcool vinílico) (PVA), hidróxi etil celulose (HEC), poli(N-hidróxi etil acrilamida) (PHEA), hidróxi propil metil celulose (HPMC), hidróxi etil celulose, carbóxi metil celulose, poli(metacrilato de 2-hidróxi etila (pHEMA), ácido polimetacrílico (carbômero), poli(vinil pirrolidona) (PVP), poli(ácido acrílico) (PAA), dextrana, sulfato de condroitina, poli(2-metacriloilóxi etil fosforil colina) (PMPC), e copolímeros de tribloco, por exemplo, poloxamer 188 (PLURONIC® F68), poloxamer P108 (PLURONIC® F38), poloxamer P184 (PLURONIC® L64), poloxamer P401, poloxamer P402, poloxamer P407 (PLURONIC® F127), e poloxamer P408 (PLURONIC® F108), hidróxi propil guar polivinil pirrolidona, copolímero de polioxietileno e polioxipropileno (poloxâmero), ou sais ou misturas do mesmo, incluindo (mas sem ficar limitado a) uma mistura de ácido hialurônico e alginato, ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, o polímero é um polímero não iônico. Em determinadas modalidades, o polímero é um poliéter. Em determinadas modalidades, o polímero é um polialquil éter. Em determinadas modalidades, o polímero é um copolímero de um polialquil éter e de outro polímero (por exemplo, um polialquil éter). Em algumas modalidades, o polímero é um poloxâmero (também conhecido como poloxímero). Os poloxímeros são copolímeros de tribloco não iônicos compostos de uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (POP) (também conhecido como polipropileno glicol) flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (POE) (também conhecido como polietileno glicol (PEG)). Os elementos versados na técnica estarão cientes de outros polímeros viscoelásticos apropriados para o uso nas soluções providas no presente documento com base na presente invenção, e deve ficar entendido que a invenção não fica limitada a este respeito. Os elementos versados na técnica irão compreender que a quantidade de polímeros viscoelásticos apropriada para o uso nas soluções e nas preparações providas no presente documento irá depender das propriedades viscoelásticas do polímero, por exemplo, entre outros, do peso molecular do polímero usado. Em algumas modalidades, o polímero viscoelástico é usado a uma concentração de 0,001% em peso/volume a 5% em peso/volume nas soluções e nas preparações providas no presente documento. Em algumas modalidades, o polímero viscoelástico é usado em uma concentração que provê uma viscosidade das soluções ou das preparações providas no presente documento que corresponde à viscosidade da mesma solução ou preparação que compreende 0,01% a 0,05% de ácido hialurônico, por exemplo, à viscosidade que a mesma solução ou preparação que compreende 0,01% a 0,05% de Healon Endocoat® exibe.

[0080] Em determinadas modalidades, o polímero viscoelástico que contém meios de transporte tem uma viscosidade de cisalhamento nula maior do que 1.000, 10.000, 50.000 ou até mesmo 100.000 Pas, e tem de preferência uma viscosidade de cisalhamento nula na faixa de 1.000 a 200.000 Pas, e com mais preferência na faixa de 1.000 a 20.000 Pas. Em determinadas modalidades, o polímero viscoelástico aumenta a viscosidade de cisalhamento nula do meio de transporte resultante, com relação ao meio de transporte sem o polímero viscoelástico, em 5%, 10%, 15%, 25% ou até mesmo 40%.

[0081] Nas Modalidades, Onde A Solução É Administrada A Um Indivíduo, Por Exemplo, Na Forma De Uma Preparação Que Compreende Células Ou Tecidos Na Solução, O Polímero Utilizado Na Presente Invenção É Biocompatível E/Ou Biodegradável.

[0082] Em algumas modalidades, o polímero é o ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo. Em algumas modalidades, o polímero é o hialuronato de sódio. Em algumas modalidades, o polímero está presente a uma concentração eficaz para reduzir a exposição das células na solução à tensão de cisalhamento. Em algumas modalidades, a concentração do polímero é de 0,01 a 5% em peso/volume. Em algumas modalidades, a concentração do polímero é de cerca de 0,01% a 0,05% em peso/volume. Em algumas modalidades, o polímero é o Healon Endocoat®.

[0083] Em algumas modalidades, a solução não compreende um agente tampão de carbonato. Em algumas modalidades, a solução não compreende a glutationa, ou o dissulfeto de glutationa (GSSG). Em algumas modalidades, a solução não compreende um agente tampão orgânico zwitteriônico.

[0084] A invenção engloba as soluções que combinam dois ou mais ou qualquer número de critérios (por exemplo, pH, osmolaridade, solutos (agente tampão, glicose, agente osmoticamente ativo, magnésio, cálcio, potássio, polímero), concentrações, etc.). Por exemplo, a invenção engloba as soluções que compreendem um agente tampão, glicose, e um agente osmoticamente ativo com ou sem polímero adicionado, soluções que compreendem potássio e soluções que não compreendem potássio, bem como as soluções que compreendem qualquer combinação de solutos a qualquer concentração provida para o respectivo soluto. Também deve ser compreendido que a invenção engloba as soluções que compreendem os solutos listados bem como as soluções que consistem essencialmente em ou consistem nos solutos listados e um solvente, por exemplo, a água. Estas alternativas não são especificadas aqui para finalidades de abreviação.

[0085] Por exemplo, em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio e glicose, por exemplo, D-glicose, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, glicose, por exemplo, D-glicose e cloreto de potássio, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,03 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose e cerca de 145 mM de NaCl, em água. Em algumas modalidades, a solução também compreende cerca de 2 mM de KCl. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,03 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl e cerca de 2 mM de KCl, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 2 mM de KCl, em água. Em algumas modalidades, a solução também compreende um polímero viscoelástico. Em algumas modalidades, o polímero é o ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo. Em algumas modalidades, o polímero é o hialuronato de sódio. Em algumas modalidades, o polímero está presente a uma concentração eficaz para reduzir a exposição das células na solução à tensão de cisalhamento. Em algumas modalidades, a concentração do polímero é de 0,01 a 5% em peso/volume. Em algumas modalidades, a concentração do polímero é de cerca de 0,01 a 0,05% em peso/volume. Em algumas modalidades das soluções providas no presente documento, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, glicose, por exemplo, D- glicose, e um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, cloreto de sódio, glicose, por exemplo, D-glicose, cloreto de potássio, e um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,03 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 0,005 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,03 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, cerca de 2 mM de KCl, e cerca de 0,005 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, em água. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,85% de NaCl em peso/volume, cerca de 0,015% de KCl em peso/volume, cerca de 0,01% de CaCl di-hidratado (cloreto de cálcio di-hidratado) em peso/volume, cerca de 0,006% de MgCl hexaidratado (cloreto de magnésio hexaidratado) em peso/volume, cerca de 0,035% de citrato de sódio di- hidratado em peso/volume, e cerca de 0,29% de dextrose em água em peso/volume, e opcionalmente compreende cerca de 0,01 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, tal como, por exemplo, 0,01 a 0,05% de Healon Endocoat®. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,68 a 1,02% de NaCl em peso/volume, cerca de 0,008 a 0,012% de CaCl di- hidratado (cloreto de cálcio di-hidratado) em peso/volume, cerca de 0,0048 a 0,0072% de MgCl hexaidratado (cloreto de magnésio hexaidratado) em peso/volume, cerca de 0,028 a 0,042% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume, e cerca de 0,23 a 0,35% de dextrose em água em peso/volume, e opcionalmente compreende cerca de 0,01 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, tal como, por exemplo, 0,01 a 0,05% de Healon Endocoat®. Em algumas modalidades, a solução compreende ou consiste essencialmente em cerca de 0,68 a 1,02% de NaCl em peso/volume, cerca de 0,012 a 0,018% de KCl em peso/volume, cerca de 0,008 a 0,012% de CaCl di- hidratado (cloreto de cálcio di-hidratado) em peso/volume, cerca de 0,0048 a 0,0072% de MgCl hexaidratado (cloreto de magnésio hexaidratado) em peso/volume, cerca de 0,028 a 0,042% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume, e cerca de 0,23 a 0,35% de dextrose em água em peso/volume, e opcionalmente compreende cerca de 0,01 a 5% em peso/volume de um polímero viscoelástico, por exemplo, ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo, tal como, por exemplo, 0,01 a 0,05% de Healon Endocoat®.

Preparações de células e tecidos

[0086] Alguns aspectos desta invenção proveem preparações que compreendem uma população de células ou um tecido em uma solução tal como provido no presente documento. Em algumas modalidades, a população de células é apropriada para o transplante a um indivíduo. Em algumas modalidades, as preparações providas no presente documento são formulados para a administração a um indivíduo, por exemplo, para a administração através de injeção ou irrigação.As preparações providas no presente documento podem compreender a população de células ou o tecido na solução descrita no presente documento, por exemplo, GS2, tanto sozinha quanto em combinação com um ou mais compostos ou agentes adicionais, por exemplo, com antioxidantes, agentes bacteriostáticos, ou agentes farmaceuticamente ativos.As preparações farmacêuticas exemplificadores compreendem células ou tecidos em GS2 tal como descritos no EXEMPLO 1 da presente invenção.

[0087] As preparações de células ou tecidos exemplificadores nas soluções providas no presente documento podem ser formulados para serem apropriados para o uso no tratamento de um paciente humano, por exemplo, livres de pirogênio ou essencialmente livres de pirogênio, livres de patógeno, estéreis, e a uma osmolaridade e um pH fisiológico. Em algumas modalidades, as preparações providas no presente documento são formulados para a injeção em um sítio específico, por exemplo, no caso de preparações oftalmológicas para o tratamento de doenças ou distúrbios da retina, no humor vítreo para a aplicação ao local do dano da retina ou coroidal.

[0088] As preparações providas pela presente invenção também podem incluir agentes terapêuticos, por exemplo, um imunossupressor, um agente pró-angiogênico, ou nutrientes ou fatores de crescimento que suportam a sobrevivência e/ou o implante das células na preparação.

[0089] O volume da preparação e o número de células na preparação irá depender da aplicação específica. Tipicamente, para aplicações de transplante de células, é desejável reduzir o volume administrado tanto quanto possível. Por conseguinte, a preparação pode ser formulada de maneira tal que os volumes minimizados possam ser aplicados. As concentrações de células para a injeção podem estar a qualquer quantidade que seja eficaz e não tóxica. Por exemplo, em algumas modalidades, as preparações de células para o transplante são providas de modo a compreender pelo menos cerca de 104 células/ml em uma solução provida no presente documento, por exemplo, em GS2. Em algumas modalidades, as preparações de células para o transplante são formuladas a uma dose de pelo menos cerca de 103, pelo menos cerca de 104, pelo menos cerca de 105, pelo menos cerca de 106, pelo menos cerca de 107, pelo menos cerca de 108, pelo menos cerca de 109, pelo menos cerca de ou 1010 células/ml.

[0090] Em algumas modalidades, o número de células e/ou a concentração de células em uma preparação provida no presente documento podem ser determinados por meio da contagem de células viáveis e da exclusão de células não viáveis. Por exemplo, as células não viáveis podem ser detectadas pela falha em excluir um corante vital (tal como Trypan Blue), ou ao usar um ensaio funcional (tal como a capacidade de aderir a um substrato da cultura, fagocitose, etc.). Além disso, o número de células ou a concentração de células de um tipo de célula desejado podem ser determinados por meio da contagem de células que expressam um ou mais marcadores de células característicos deste tipo de célula e/ou da exclusão de células que expressam um ou mais marcadores indicativos de um outro tipo de célula que não o tipo de célula desejado.

[0091] Em algumas modalidades, uma preparação de células é provido no presente documento de maneira tal que compreende pelo menos cerca de 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; ou 9.000 células. Em algumas modalidades, a preparação de células pode compreender pelo menos cerca de 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, ou 9 x 1010 células. Em algumas modalidades, a preparação de células pode compreender pelo menos cerca de 1 x 102 a 1 x 103, 1 x 102 a 1 x 104, 1 x 104 a 1 x 105, ou 1 x 103 a 1 x 106 células. Em algumas modalidades, a preparação de células pode compreender pelo menos cerca de 10.000, 20.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 125.000, 150.000, 175.000, 180.000, 185.000, 190.000, ou 200.000 células, por exemplo, a preparação de células pode compreender pelo menos cerca de 20.000 a 200.000 células em um volume de cerca de 50 a 200 μl de uma solução provida no presente documento, por exemplo, de GS2.

[0092] Em algumas modalidades, a população de células é apropriada para o transplante no olho de um indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células apropriada para o transplante no olho de um indivíduo compreende células RPE, células RPE progenitoras, células epiteliais pigmentadas da íris (IPE), e outras células neurais associadas à visão, tais como os neurônios internunciais (por exemplo, neurônios de "retransmissão" da camada nuclear interna (INL)) e células da amacrina, células da retina, bastonetes, cones, e células da córnea, células neurais, células fotorreceptoras, e células mesenquimais, tais como, por exemplo, células-tronco mesenquimais (MSCs).

[0093] Em algumas modalidades, a preparação provida compreende uma população de células RPE em uma solução provida no presente documento, por exemplo, no meio GS2 descrito no Exemplo 1. As células RPE apropriadas podem ser diferenciadas das células- tronco pluripotentes, tais como as células-tronco embrionárias humanas ou as células iPS, e podem ser molecularmente distintas das células- tronco embrionárias, das células RPE derivadas de adultos, e das células RPE derivadas de fetos. Em algumas modalidades, são usadas células RPE derivadas de adultos e células RPE derivadas de fetos.

[0094] Onde as células RPE derivadas de células ES são usadas, a preparação, em algumas modalidades, não compreende uma quantidade detectável de células ES residuais, de maneira tal que as preparações providas no presente documento não acarretam um risco inaceitável de contaminação nas culturas e nas preparações de células RPE.

[0095] Em algumas modalidades, a preparação que compreende uma população de células apropriada para o transplante no olho de um indivíduo é apropriado para a injeção no olho do indivíduo. Em algumas modalidades, tal preparação pode ser usado para o tratamento de doenças ou distúrbios de degeneração da retina, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, o deslocamento da retina, a displasia da retina, as estrias angioides, a Degeneração Macular Miópica, ou a atrofia da retina, ou associados com uma série de doenças que alteram a visão que resultam em danos fotorreceptores e cegueira, tais como, por exemplo, a coroideremia, a retinopatia diabética, a degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada ao envelhecimento), a retinite pigmentosa, e a Doença de Stargardt (fundus flavimaculatus).

[0096] As células RPE podem ser células RPE terminalmente diferenciadas estáveis que não se desdiferenciam em um tipo de célula que não RPE. As células RPE descritas no presente documento podem ser células RPE funcionais, caracterizadas pela capacidade de integrar na retina por meio da administração na córnea, sob a retina, ou outra em um humano ou em um animal não humano.

[0097] As células RPE podem expressar marcadores de células RPE. Por exemplo, o nível de expressão dos marcadores tais como RPE65, PAX2, PAX6, tirosinase, bestrofina, PEDF, CRALBP, Otx2, e/ou MITF pode ser equivalente àquele nas células RPE de ocorrência natural. O nível da maturidade das células RPE pode ser avaliado ao medir a expressão de pelo menos um dos PAX2, PAX6, e tirosinase, ou seus níveis de expressão respectivos.

[0098] Em algumas modalidades, as células RPE compreendidas em uma preparação provida no presente documento descrito no presente documento podem ser identificadas e caracterizadas com base no grau de pigmentação da célula. As mudanças no pigmento podem ser controladas por meio da densidade à qual as células RPE são cultivadas e mantidas, e da duração em que as células RPE são mantidas em cultura. As células RPE diferenciadas que estão se dividindo rapidamente são mais levemente pigmentadas. Por outro lado, as células RPE que se dividem mais lentamente ou não se dividem adotam seus formatos poligonal ou hexagonal característicos e aumentam o nível de pigmentação por meio do acúmulo de melanina e lipofuscina. Por exemplo, as culturas de células RPE quiescentes (por exemplo, devido à confluência) aumentam tipicamente o seu nível de pigmentação com o passar do tempo. Dessa maneira, a acumulação de pigmentação serve como um indicador da diferenciação das células RPE, e a pigmentação aumentada associada com a densidade da célula serve como um indicador da maturidade das células RPE. Por exemplo, as células RPE maduras podem ser subcultivadas a uma densidade mais baixa, de maneira tal que a pigmentação diminui. Neste contexto, as células RPE maduras podem ser cultivadas para produzir células RPE menos maduras. Tais células RPE são ainda células RPE diferenciadas que expressam marcadores de diferenciação das células RPE.

[0099] Por exemplo, em algumas modalidades, é provida uma preparação que compreende células RPE com o teor médio de melanina que é menor do que 8 pg/célula, menor do que 7 pg/célula, menor do que 6 pg/célula, ou menor do que 5 pg/célula, por exemplo, entre 0,1 e 8 pg/célula, entre 0,1 e 7 pg/célula, entre 0,1 e 6 pg/célula, entre 0,1 e 5 pg/célula, entre 0,1 e 4 pg/célula, entre 0,1 e 3 pg/célula, entre 0,1 e 2 pg/célula, entre 0,1 e 1 pg/célula, entre 1 e 8 pg/célula, entre 1 e 7 pg/célula, entre 1 e 6 pg/célula, entre 1 e 5 pg/célula, entre 1 e 4 pg/célula, entre 1 e 3 pg/célula, entre 1 e 2 pg/célula, entre 2 e 6 pg/célula, entre 3 e 5 pg/célula, ou entre 4 e 5 pg/célula, tais como, por exemplo, 4,2 e 4,8 pg/célula, ou entre 0,1 e 5 pg/célula. Em um outro exemplo, o teor médio de melanina pode ser menor do que 5 pg/célula, por exemplo, entre 0,1 e 5 pg/célula, entre 0,2 e 5 pg/célula, 0,5 e 5 pg/célula, 1 e 5 pg/célula, 2 e 5 pg/célula, 3 e 5 pg/célula, 4 e 5 pg/célula, ou 4,5 e 5 pg/célula.

[00100] Em algumas modalidades, é provida uma preparação que compreende células RPE em uma solução descrita no presente documento, por exemplo, GS2, no qual as células RPE mantêm o seu fenótipo após o transplante das células RPE a um indivíduo, por exemplo, após a injeção da preparação no olho do indivíduo. As células RPE podem manter seu fenótipo durante o período de vida do receptor após o transplante. Por exemplo, as células RPE podem manter seu fenótipo após o transplante por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 dias. Além disso, as células RPE podem manter seu fenótipo após o transplante por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 semanas. As células RPE podem manter seu fenótipo após o transplante por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses. As células RPE podem manter seu fenótipo após o transplante por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais anos.

[00101] Em algumas modalidades, a presente invenção provê preparações de células RPE em uma solução provida no presente documento para a injeção no olho de um indivíduo. Em tais modalidades, a preparação é uma formulação oftálmica farmaceuticamente aceitável para a injeção intraocular. Quando a preparação é administrado por meio da injeção intravitreal, por exemplo, a preparação pode ser formulada de maneira tal que os volumes minimizados possam ser aplicados. As concentrações para as injeções podem estar a qualquer quantidade que seja eficaz e atóxica. uma preparação de células RPE para o tratamento de um paciente pode ser formulado a doses de pelo menos cerca de 104 células/ml da solução provida no presente documento.As preparações de células RPE para o tratamento de um paciente são formuladas a doses de pelo menos cerca de 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, ou 1010 células RPE/ml.

[00102] As preparações de células RPE descritas no presente documento podem compreender pelo menos cerca de 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; ou 9.000 células RPE em uma solução descrita no presente documento, por exemplo, em GS2 tal como descrito no Exemplo 1.As preparações farmacêuticas de células RPE podem compreender pelo menos cerca de 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 1 x 105, 2 x 105, 3 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105, 7 x 105, 8 x 105, 9 x 105, 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107, 6 x 107, 7 x 107, 8 x 107, 9 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, ou 9 x 1010 células RPE.As preparações farmacêuticas de células RPE podem compreender pelo menos cerca de 1 x 102 a 1 x 103, 1 x 102 a 1 x 104, 1 x 104 a 1 x 105, ou 1 x 103 a 1 x 106 células RPE.As preparações farmacêuticas de células RPE podem compreender pelo menos cerca de 10.000, 20.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 125.000, 150.000, 175.000, 180.000, 185.000, 190.000, ou 200.000 células RPE. Por exemplo, a preparação farmacêutica de células RPE pode compreender pelo menos cerca de 20.000 a 200.000 células RPE em um volume de pelo menos cerca de 50 a 200 μl. Além disso, a preparação farmacêutica de células RPE pode compreender cerca de 50.000 células RPE em um volume de 150 μl, cerca de 200.000 células RPE em um volume de 150 μl, ou pelo menos cerca de 180.000 células RPE em um volume de pelo menos cerca de 150 μl.

[00103] As células RPE podem ser formuladas em uma preparação tal como provido no presente documento para a aplicação em um veículo oftálmico farmaceuticamente aceitável, de maneira tal que a preparação é mantido em contato com a superfície ocular por um período de tempo suficiente para permitir que as células penetrem nas regiões afetadas do olho tais como, por exemplo, a câmara anterior, a câmara posterior, o corpo vítreo, o humor aquoso, o humor vítreo, a córnea, a íris/ciliar, a lente, o coroide, a retina, a esclera, o espaço supracoroidal, a conjuntiva, o espaço subconjuntivo, o espaço episcleral, o espaço intracorneal, o espaço epicorneal, a pars plana, as regiões avasculares induzidas cirurgicamente, ou a mácula.

[00104] Em algumas modalidades, uma preparação de células é provida no presente documento, no qual as células RPE estão contidas em uma folha de células. Por exemplo, uma folha de células que compreende células RPE pode ser preparada por meio do cultivo de células RPE em um substrato do qual uma folha de células intacta pode ser liberada, por exemplo, um polímero termorresponsivo tal como uma superfície enxertada com poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) termorresponsiva, sobre a qual as células aderem e proliferam à temperatura da cultura, e então mediante uma mudança de temperatura as características da superfície são alteradas, causando a liberação da folha de células cultivada (por exemplo, por meio do resfriamento até menos da temperatura crítica mais baixa da solução (LCST) (vide da Silva et al., Trends Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):577-83; Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb 15;81(3):473-6; Ide, T. et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614, Sumide, T. et al. (2005), FASEB J. 20, 392394; Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385; e Nishida, K. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196 cada um dos quais é incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade). A folha de células pode ser aderente a um substrato apropriado para o transplante, tal como um substrato que pode se dissolver in vivo quando a folha é transplantada em um organismo hospedeiro, por exemplo, preparação por meio do cultivo de células em um substrato apropriado para o transplante, ou da liberação das células de um outro substrato (tal como um polímero termorresponsivo) em um substrato apropriado para o transplante. Um substrato exemplificador potencialmente apropriado para o transplante pode compreender gelatina (vide Hsiue et al., supra). Os substratos alternativos que podem ser apropriados para o transplante incluem matrizes baseadas em fibrina e outros. A folha de células pode ser usada na manufatura de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de uma doença de degeneração da retina. A folha de células RPE pode ser formulada em uma preparação de células ou de tecidos para a introdução no olho de um indivíduo com necessidade da mesma por meio do contato a mesma com uma solução descrita no presente documento, por exemplo, uma solução GS2. Em algumas modalidades, a folha de células pode ser introduzida em um olho de um indivíduo com necessidade da mesma por meio da membranectomia subfoveal com o transplante da folha de células RPE, ou pode ser usada para a manufatura de um medicamento para o transplante após a membranectomia subfoveal.

[00105] O volume de uma preparação provida por meio de algumas modalidades desta invenção depende de fatores tais como o modo de administração, o número de células a ser aplicado, a idade e o peso do paciente, e o tipo e a gravidade da doença que está sendo tratada. Por exemplo, se for administrado por meio de injeção, o volume de uma preparação de células RPE farmacêutica da invenção pode ser de cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, ou 5 ml. O volume pode ser de cerca de 1 a 2 ml. Por exemplo, se for administrado por meio de injeção, o volume de uma preparação de células RPE farmacêutica da invenção pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, ou 200 μl (microlitros). Por exemplo, o volume de uma preparação da invenção pode ser de cerca de 10 a 50, 20 a 50, 25 a 50, ou 1 a 200 μl. O volume de uma preparação da invenção pode ser de cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 μl, ou superior.

[00106] Em algumas modalidades, uma preparação provida no presente documento pode compreender cerca de 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, ou 9 x 104 células RPE por μl. Por exemplo, em algumas modalidades, a preparação pode compreender 2.000 células RPE por μl, por exemplo, 100.000 células RPE por 50 μl ou 180.000 células RPE por 90 μl.

[00107] Em algumas modalidades, a preparação é refrigerada. Em algumas modalidades, a preparação é refrigerada a cerca de 2 a 8°C.

[00108] Em algumas modalidades, a preparação suporta a sobrevivência das células na população de células durante a armazenagem da preparação. Em algumas modalidades, pelo menos 70% das células na população de células são viáveis depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C. Em algumas modalidades, pelo menos 80% das células na população de células são viáveis depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C. Em algumas modalidades, pelo menos 90% das células na população de células são viáveis depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C. Em algumas modalidades, a preparação suporta a manutenção da eficiência de chapeamento da população de células durante a armazenagem da preparação. Em algumas modalidades, depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C, a população de células exibe pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua eficiência de chapeamento original, onde a eficiência de chapeamento original refere-se à eficiência de chapeamento da população de células no início do período de armazenagem. Em algumas modalidades, a preparação fica dentro de um recipiente de armazenagem. Em algumas modalidades, a preparação fica dentro de uma seringa.

[00109] Alguns aspectos desta invenção proveem preparações farmacêuticas de células e de tecidos em uma solução provida no presente documento. Tais preparações são apropriadas para a administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica consiste essencialmente em células, em uma população de células, ou em um tecido e uma solução tal como provido no presente documento. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica compreende um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos, por exemplo, um conservante, um antioxidante, um depurador de radical, um imunossupressor, um fator pró-angiogênico, um fator antiangiogênico, um hormônio do crescimento, ou um nutriente celular ou um substrato que suporte o crescimento, a sobrevivência e o implante da célula.

[00110] A presente invenção também engloba os pacotes e/ou kits farmacêuticos. Os pacotes e/ou kits farmacêuticos providos podem compreender uma preparação de células ou de tecidos provido no presente documento e um recipiente (por exemplo, um frasco, uma ampola, uma garrafa, uma seringa, e/ou uma embalagem para resfriamento, ou outro recipiente apropriado). Em algumas modalidades, os kits providos podem opcionalmente também incluir um segundo recipiente que compreende a solução usada para formular a preparação para a diluição, a lavagem, e/ou a reconstituição da preparação de células ou de tecidos. Em algumas modalidades, os conteúdos do recipiente de formulação e do recipiente de solvente providos combinam para formar pelo menos uma forma de dosagem unitária.

[00111] Alguns aspectos da presente invenção proveem métodos para preparação de preparações providas no presente documento, por exemplo, as preparações que compreendem uma população de células em uma solução tal como provido no presente documento, em que o método compreende a colocação da população de células em contato com a solução. Em algumas modalidades, o método compreende a colocação de uma população de células criopreservadas ou em péletes em contato com a solução, desse modo reconstituindo as células.

[00112] Por exemplo, alguns aspectos da presente invenção proveem os métodos que compreendem (a) a colocação de uma população de células em contato com uma solução tal como provido no presente documento, desse modo gerando uma preparação de células. Em algumas modalidades, o método também compreende (b) a armazenagem da preparação de células de (a) por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 36, pelo menos 48, pelo menos 60, pelo menos 72, ou pelo menos 96 horas. Em algumas modalidades, o método também compreende (c) a administração da preparação de células de (a) a um indivíduo após o período de armazenagem de (b). Em algumas modalidades, a administração de (c) compreende a injeção das células no olho de um indivíduo. Em algumas modalidades, onde o método também compreende a determinação da viabilidade da célula na preparação de células de (a) após o período de armazenagem de (b). Em algumas modalidades, o método compreende a refrigeração da preparação de células de (a) durante o período de armazenagem da etapa (b). Em algumas modalidades, a refrigeração compreende a armazenagem da preparação de células a uma temperatura de 2 a 8°C. Em algumas modalidades, o método também compreende o transporte da preparação gerada em (a) para um local diferente do local no qual a preparação foi gerada dentro do período de armazenagem de (b). Em algumas modalidades, o transporte compreende o transporte da preparação para uma clínica ou uma sala de operação, onde ocorre a administração de (c).

Usos e Métodos Exemplificadores

[00113] As soluções atualmente divulgadas podem ser usadas para várias aplicações clínicas. Tais aplicações incluem a irrigação clínica, a reconstituição ou a formulação de células, por exemplo, após a pelotização ou a criopreservação, assim como a formulação de células, por exemplo, para aplicações clínicas, incluindo, mas sem ficar a elas limitadas, a armazenagem e o transporte de células antes da administração a um indivíduo, e/ou como um meio carreador para a administração das células, das células de uma só camada, ou dos tecidos a um indivíduo.

[00114] Por exemplo, as soluções atualmente divulgadas podem ser usadas, em algumas modalidades, como soluções para a reconstituição de células. O termo "reconstituição de células", tal como usado no presente documento, refere-se ao processo de colocação de uma população de células em contato com uma solução, por exemplo, uma solução provida no presente documento, com o objetivo de gerar uma solução que compreende a população de células. Em algumas modalidades, a reconstituição de uma população de células compreende a geração de uma solução que compreende uma população de células de uma célula peletizada, por exemplo, uma célula peletizada obtida após uma etapa de centrifugação por meio do descarte do sobrenadante. Em algumas modalidades, a reconstituição de uma população de células com uma solução provida no presente documento compreende a diluição ou a substituição de qualquer meio nos quais as células estão suspensas inicialmente para obter uma população de células em um meio que consiste essencialmente ou consiste na solução provida no presente documento. Em algumas de tais modalidades, uma população de células suspensas em um meio que não uma solução provida no presente documento pode ser lavada uma ou mais vezes com uma solução provida no presente documento. Uma etapa de lavagem pode, em algumas modalidades, compreender a colocação das células em contato com uma solução provida no presente documento, a pelotização das células, por exemplo, por meio de centrifugação, descarte do sobrenadante e reconstituição da célula peletizada com a solução. Dependendo do volume da solução usada e do volume da célula peletizada, o meio inicial pode ser essencialmente substituído pela solução depois de um único ciclo de lavagem e reconstituição, ou depois de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 de tais ciclos.

[00115] Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento podem ser usadas para a formulação de células e de tecidos. O termo "formulação" tal como usado no presente documento no contexto das células e dos tecidos, refere-se à colocação de uma célula, uma população de células, ou um tecido, em contato com um volume de uma solução provida no presente documento para obter uma preparação de células ou de tecidos que seja apropriado para o uso clínico, por exemplo, para a administração a um indivíduo. As soluções providas no presente documento são amplamente compatíveis com vários tipos de células, populações de células e tecidos, incluindo, mas sem ficar a elas limitadas, células-tronco e progenitoras adultas, células diferenciadas, e populações e tecidos que compreendem tais células. Em algumas modalidades, a célula, a população de células, ou o tecido formulado dessa maneira em uma solução provida no presente documento, é uma célula terapêutica, uma população de células, ou um tecido, por exemplo, para o uso clínico em uma abordagem de medicina regenerativa. Por exemplo, a célula, a população de células, ou o tecido formulado em uma solução provida no presente documento, pode compreender, em algumas modalidades, uma população de células que pode substituir as células perdidas ou degeneradas em um indivíduo, ou reparar ou substituir um tecido que tenha sido danificado ou está em um estado não funcional em um indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, a célula, a população de células, ou o tecido que é formulado em uma solução provida no presente documento pode compreender uma célula-tronco ou progenitora multipotente, ou uma célula diferenciada funcional, ou uma população ou um tecido que compreende tais células ou uma combinação de tais células. Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento são usadas para formular uma célula RPE, uma célula fotorreceptora, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula-tronco ou progenitora neural ou neuronal, uma célula-tronco ou progenitora glial, uma célula-tronco ou progenitora pancreática, uma célula beta, um queratinócito, um condrócito, um osteoblasto, um osteoclasto, ou uma população ou um tecido que compreende ou consiste essencialmente em tais células, por exemplo, uma monocamada de células RPE, uma ilhota pancreática, ou um enxerto de pele. Em algumas modalidades, uma formulação de células em uma solução provida no presente documento pode ser armazenada até o uso clínico (por exemplo, até a administração a um indivíduo) e/ou transportada a um sítio clínico, e administrada a um indivíduo tanto tal como provida quanto com somente um processamento mínimo, tal como diluindo a formulação até um volume desejado ou até uma concentração desejada de células.

[00116] Em algumas modalidades, as soluções providas no presente documento são úteis para a armazenagem de células ou de tecidos. O termo "armazenagem," tal como usado no presente documento no contexto de células e tecidos, refere-se a um período de tempo entre a formulação da(s) célula(s) ou do(s) tecido(s) em uma solução provida no presente documento, e tanto uma outra etapa de processamento quanto o uso clínico da(s) célula(s) ou do(s) tecidos(s). Ao contrário das soluções previamente disponíveis, as soluções providas no presente documento suportam a armazenagem de vários tipos de células e tecidos, incluindo células e tecidos sensíveis tais como células RPE, fotorreceptoras, e MSCs, por prolongados períodos de tempo, por exemplo, por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 30, pelo menos 36, pelo menos 48 horas, pelo menos 60 horas ou pelo menos 72 horas com apenas diminuições mínimas na viabilidade das células, eficiência de rechapeamento, ou capacidade de repovoamento. Por exemplo, em algumas modalidades, a armazenagem de uma célula, população de células, ou tecidos, por exemplo, de células RPE, células fotorreceptoras, ou MSCs, em uma solução provida no presente documento por um período de pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 30, pelo menos 36, pelo menos 48, pelo menos 60 ou pelo menos 72 horas resulta em uma viabilidade das células, eficiência de rechapeamento, e/ou capacidade de repovoamento de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da viabilidade, eficiência de rechapeamento, e/ou capacidade de repovoamento no início do período de armazenagem. Em algumas modalidades, o período de tempo de armazenagem, por exemplo, o período de tempo entre a formulação das células ou dos tecidos e seu uso clínico, não irá exceder 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas ou 72 horas. Tipicamente, as células ou os tecidos formulados em uma solução provida no presente documento são refrigerados para a armazenagem, por exemplo, a temperaturas entre 2 e 8°C. Por conseguinte, em algumas modalidades, as células e os tecidos são armazenados em uma solução provida no presente documento a temperaturas abaixo de temperaturas ambiente, por exemplo, a temperaturas entre 2 e 8°C. Em algumas modalidades, no entanto, a armazenagem a temperaturas mais altas é contemplada, por exemplo, a temperaturas entre 8°C e 16°C, a 16 e 22°C, ou à temperatura ambiente (tipicamente cerca de 25°C).

[00117] As soluções providas no presente documento também são úteis para o transporte de células, populações da célula, e tecidos após sua formulação para um sítio clínico. As soluções providas no presente documento suportam a sobrevivência das células e minimizam a tensão metabólica e física, incluindo a tensão de cisalhamento, durante o transporte. O transporte de células ou tecidos tipicamente será realizado dentro do período de armazenagem das células ou dos tecidos, e desse modo mediante condição apropriadas para a armazenagem, tal como descrito acima. Em modalidades, onde as células ou os tecidos formulados em uma solução provida no presente documento são transportados sob condições refrigeradas, por exemplo, a uma temperatura abaixo da temperatura ambiente, o uso do equipamento de refrigeração móvel é preferido para o transporte. Tal equipamento inclui, mas sem ficar a eles limitado, recipientes de transporte ou embarque isolados, pacotes de gelo úmido, géis de resfriamento, recipientes de resfriamento, e unidades de refrigeração móveis. Alguns métodos de transporte, recipientes, e dispositivos para o transporte refrigerado apropriados exemplificadores são descritos em mais detalhes em alguma outra parte no presente documento, e os elementos versados na técnica estarão cientes dos métodos, recipientes, e dispositivos apropriados adicionais em vista da presente invenção.

[00118] Alguns aspectos desta invenção proveem métodos para o tratamento de um indivíduo com necessidade do mesmo por meio da administração de uma quantidade eficaz de uma solução clínica ou de uma preparação de células ou tecidos tal como descrito no presente documento ao indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou é diagnosticado com uma doença ou distúrbio que pode ser tratado por meio da administração de uma célula, população de células, ou tecido, por exemplo, na forma de uma preparação de células ou tecidos descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a preparação que está sendo administrada ao indivíduo compreende uma população de células de um tamanho eficaz para melhorar pelo menos um sintoma da doença ou do distúrbio no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo está sendo submetido a uma cirurgia e a solução ou a preparação descrita no presente documento é administrada para irrigar o sítio cirúrgico. Em algumas modalidades, o método também compreende o monitoramento de pelo menos um sintoma da doença no indivíduo.

[00119] Os termos "tratamento", "tratar", e "tratando" referem-se a uma intervenção clínica destinada a inverter, aliviar, retardar o surgimento de, ou inibir o progresso de uma doença ou de um distúrbio, ou um ou mais sintomas dos mesmos, tal como descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado depois que um ou mais sintomas tiverem sidos desenvolvidos e/ou depois que uma doença tiver sido diagnosticada. Em outras modalidades, o tratamento pode ser administrado na ausência de sintomas, por exemplo, para impedir ou retardar o surgimento de um sintoma ou inibir o surgimento ou a progressão de uma doença. Por exemplo, o tratamento pode ser administrado a um indivíduo suscetível antes do surgimento dos sintomas (por exemplo, à luz de um histórico de sintomas e/ou à luz de fatores de susceptibilidade genéticos ou outros). O tratamento também pode ser continuado depois que os sintomas tenham sido eliminados, por exemplo, para impedir ou retardar a sua recorrência.

[00120] O termo "indivíduo", tal como usado no presente documento, refere-se a um organismo individual, por exemplo, um mamífero individual. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um primata não humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um roedor. Em algumas modalidades, o indivíduo é um carneiro, uma cabra, um bovino, um gato, ou um cão. Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal de pesquisa. Em algumas modalidades, o indivíduo é submetido a engenharia genética, por exemplo, um indivíduo não humano submetido a engenharia genética. O indivíduo pode ser de qualquer sexo e estar em qualquer estágio de desenvolvimento.

[00121] O termo "quantidade eficaz" tal como usado no presente documento, refere-se a uma quantidade de um agente biologicamente ativo que é suficiente para acarretar uma resposta biológica desejada. Por exemplo, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma preparação de células ou tecidos tal como descrito no presente documento pode se referir à quantidade da preparação que compreende um número células ou à quantidade de tecidos que é suficiente para melhorar um sintoma associado a uma doença ou um distúrbio, por exemplo, suficiente para melhorar a visão em um indivíduo com uma doença ou distúrbio da retina. Tal como deve ser apreciado pelo elemento versado na técnica, a quantidade eficaz de uma solução ou preparação provida no presente documento pode variar dependendo de vários fatores tais como, por exemplo, da resposta biológica desejada, por exemplo, da doença específica que estão sendo tratada, do sintoma específico a ser aliviado, da célula ou do tecido que está sendo visado, e da idade do indivíduo, gênero, e do estado de saúde geral.

[00122] Alguns aspectos da presente invenção proveem métodos, que compreendem a administração de uma solução ou de uma preparação tal como provido no presente documento a um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o método compreende a administração da solução ou da preparação no olho do indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende a administração da preparação ao indivíduo após a armazenagem da preparação por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 24, pelo menos 36, ou pelo menos 48 horas. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou é diagnosticado com uma doença da retina. Em algumas modalidades, a doença da retina é distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber, ou doença de Stargardt. Em algumas modalidades, a preparação compreende uma população de células de um tamanho eficaz para melhorar pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células compreende células RPE, células fotorreceptoras, ou células-tronco mesenquimais. Em algumas modalidades, o método também compreende o monitoramento de pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo.

[00123] Alguns aspectos desta invenção proveem métodos para o tratamento de uma doença da retina, em que os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma preparação de células provido no presente documento no olho de um indivíduo que tem uma doença da retina. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou é diagnosticado com a doença da retina. Em algumas modalidades, a doença da retina é distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber, ou doença de Stargardt. Em algumas modalidades, a preparação compreende uma população de células de um tamanho eficaz para melhorar pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo. Em algumas modalidades, a população de células compreende células RPE, células fotorreceptoras, ou células- tronco mesenquimais. Em algumas modalidades, o método também compreende o monitoramento de pelo menos um sintoma da doença da retina no indivíduo.

[00124] O termo "monitoramento de um sintoma de uma doença" tal como usado no presente documento, refere-se à avaliação da gravidade de um sintoma de uma doença em uma pluralidade de pontos do tempo por um período de tempo. Por exemplo, a gravidade de um sintoma pode ser avaliada em um indivíduo antes que o tratamento do indivíduo comece e então novamente após um período de tempo posterior ao tratamento. Em algumas modalidades, o monitoramento pode incluir a avaliação da gravidade de um sintoma após um período conhecido ou que se espera seja suficiente para que o tratamento resulte em uma melhoria mensurável do sintoma em um indivíduo similar (por exemplo, um indivíduo da mesma espécie, gênero, idade, estado de saúde geral, etc.). Em algumas modalidades, o monitoramento pode incluir a avaliação da gravidade de um sintoma em intervalos regulares. Por exemplo, nos indivíduos que estão sendo tratados de um distúrbio da retina, uma avaliação inicial da visão do indivíduo pode ser realizada. Um elemento versado na técnica irá compreender que essa avaliação é exemplificadora e que outras avaliações podem ser realizadas ao invés ou além da avaliação da visão do indivíduo. Tais avaliações podem incluir o nível da degeneração da retina, ablação da retina, degeneração macular, e assim por diante. Uma vez que o indivíduo é tratado por meio da administração de uma preparação de células provida no presente documento, por exemplo, uma preparação que compreende um número eficaz de células RPE em um meio GS2 tal como provido no presente documento, a visão do indivíduo pode ser avaliada novamente, idealmente depois que um período de tempo tiver transcorrido após a cirurgia que permita que as células administradas implantem e desempenhem sua função, por exemplo, depois de cerca de uma semana, cerca de duas semanas, cerca de três semanas, cerca de um mês, cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses, cerca de seis meses, ou depois de cerca de um ano. O resultado da avaliação pós-operatória pode ser gravado e comparado à avaliação pré-operatória para determinar se o sintoma melhorou, por exemplo, se um nível da visão foi restaurado no indivíduo. A avaliação pode ser repetida uma ou múltiplas vezes para determinar se a melhora do sintoma ainda está em andamento ou se foi atingido um ponto extremo. Dependendo do resultado do monitoramento após a cirurgia, procedimentos cirúrgicos adicionais podem ser programados para (também) melhorar o sintoma avaliado. Se nenhuma melhoria for observada após uma cirurgia inicial, a dosagem da preparação de células ou tecidos pode ser aumentada a fim de facilitar uma melhora do sintoma.

[00125] O método de tratamento da doença da retina pode compreender a administração de uma única dose de uma quantidade eficaz de uma preparação de células RPE tal como provida no presente documento, por exemplo, uma preparação que compreende uma quantidade eficaz de células RPE em um meio GS2 descrito no presente documento. Além disso, os métodos de tratamento descritos no presente documento podem compreender um curso de terapia onde as células RPE são administradas múltiplas vezes por algum período e onde cada dosagem de células é eficaz para o alívio de um sintoma da doença ou em que uma pluralidade de doses aplica cumulativamente uma quantidade eficaz. Os cursos de tratamento exemplificadores podem compreender tratamentos semanais, bisemanais, mensais, trimestrais, semestrais, ou anuais. Alternativamente, o tratamento pode prosseguir em fases por meio do qual doses múltiplas são administradas inicialmente (por exemplo, doses diárias para a primeira semana), e subsequentemente doses menores e menos frequentes são necessárias.

[00126] Se uma preparação de células RPE tal como descrito no presente documento, por exemplo, uma preparação que compreende células RPE em uma solução GS2, for administrada por meio de injeção intraocular, a preparação de células RPE pode ser aplicada uma ou mais vezes periodicamente durante toda a vida de um paciente. Por exemplo, a preparação de células RPE pode ser aplicada uma vez por ano, uma vez a cada 6 a 12 meses, uma vez a cada 3 a 6 meses, uma vez a cada 1 a 3 meses, ou uma vez a cada 1 a 4 semanas. Alternativamente, uma administração mais frequente pode ser desejável para determinadas condições ou distúrbios. Se forem administradas por meio de um implante ou dispositivo, as células RPE podem ser administradas uma vez, ou uma ou mais vezes periodicamente durante o período de vida do paciente, tal como necessário para o paciente e para o distúrbio ou a condição que está sendo tratada em particular. Um regime terapêutico que muda com o passar do tempo é similarmente contemplado. Por exemplo, um tratamento mais frequente pode ser necessário no início (por exemplo, tratamento diário ou semanal). Com o passar do tempo, à medida que a condição do paciente melhora, um tratamento menos frequente ou até mesmo nenhum tratamento adicional pode ser necessário.

[00127] Os métodos descritos no presente documento também podem compreender a etapa de monitoramento da eficácia do tratamento ou prevenção ao medir as respostas do electroretinograma, o limite de acuidade optomotora, ou o limite de luminância no indivíduo. O método também pode compreender o monitoramento da eficácia do tratamento ou prevenção ao monitorar a imunogenicidade das células ou a migração das células no olho.

[00128] As células RPE ou uma preparação que compreende as células RPE e uma solução clínica provida no presente documento, por exemplo, uma solução GS2, podem ser usadas na manufatura de um medicamento para tratar a degeneração da retina. A invenção também engloba o uso das preparações que compreendem as células RPE divulgadas no presente documento no tratamento da cegueira. Por exemplo, as preparações que compreendem célula RPE humanas podem ser usadas para tratar a degeneração da retina associada com uma série de doenças de alteração da visão que resultam em danos fotorreceptores e cegueira, tais como, a retinopatia diabética, a degeneração macular (incluindo a degeneração macular relacionada com a idade, por exemplo, a degeneração macular seca relacionada com a idade e a degeneração macular úmida relacionada com a idade), a retinite pigmentosa, e a doença de Stargardt (fundus flavimaculatus). A preparação pode compreender pelo menos cerca de 5.000 a 500.000 células RPE (por exemplo, 100.000 células RPE) que podem ser administradas à retina para tratar a degeneração da retina associada com uma série de doenças de alteração da visão que resultam em danos fotorreceptores e cegueira, tais como, a retinopatia diabética, a degeneração macular (incluindo a degeneração macular relacionada com a idade), a retinite pigmentosa, e a doença de Stargardt (fundus flavimaculatus).

[00129] As células usadas nas preparações para o tratamento de indivíduos, por exemplo, células RPE usadas nas preparações de células RPE providas no presente documento, podem ser célula humanas. As células humanas podem ser usadas em pacientes humanos, bem como em modelos animais ou em pacientes animais. Por exemplo, as células humanas podem ser testadas em modelos de degeneração da retina em camundongos, ratos, gatos, cães, ou primatas não humanos. Além disso, as células humanas podem ser usadas terapeuticamente para tratar animais com necessidade das mesmas, tal como na medicina veterinária.

[00130] Em algumas modalidades, o método de tratamento de doenças da retina também pode compreender a administração de um imunossupressor em proximidade temporal à administração da preparação clínica provida no presente documento. Os imunossupressores que podem ser usados incluem, mas sem ficar a eles limitados, o anticorpo policlonal de globulina antilinfócito (ALG), o anticorpo policlonal de globulina antitimócito (ATG), azatioprina, BASILIXIMAB® (anticorpo de receptor anti-IL-2Rα), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMAB® (anticorpo de receptor anti-IL-2Rα), everolimus, ácido micofenólico, RITUXIMAB® (anticorpo anti-CD20), sirolimus, e tacrolimus. Os imunossupressores podem ser dosados a pelo menos cerca de 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 mg/kg. Quando os imunossupressores são usados, eles podem ser administrados sistêmica ou localmente, e podem ser administrados antes de, concomitantemente com, ou depois da administração das células RPE. A terapia imunossupressora pode continuar por semanas, meses, anos, ou indefinidamente depois da administração das células RPE. Por exemplo, ao paciente podem ser administrados 5 mg/kg de ciclosporina por 6 semanas depois da administração das células RPE.

[00131] Em alguns aspectos, as soluções providas no presente documento podem ser usadas como soluções de irrigação clínica. Tais soluções são úteis para a irrigação clínica, por exemplo, para a irrigação de feridas ou sítios cirúrgicos. O termo "irrigação clínica", usado no presente documento intercambiavelmente com o termo "irrigação" refere-se geralmente à administração de uma solução, tipicamente uma solução aquosa, a uma ferida ou a um sítio cirúrgico. Uma solução de irrigação tal como provida no presente documento pode ser administrada para várias finalidades, por exemplo, para a finalidade de hidratação de tecidos, limpeza, remoção de resíduos ou patógenos da superfície, lubrificação, prevenção de aderência de tecidos, ou para ajudar no exame visual. Em algumas modalidades, a irrigação compreende a administração de um fluxo estável de uma solução de irrigação através de uma ferida aberta ou de um sítio cirúrgico. Em algumas modalidades, a solução de irrigação é administrada intermitentemente. A maneira de administração, bem como o volume e a vazão da solução de irrigação administrada, irão depender de circunstâncias específicas, por exemplo, o tamanho da ferida, o tecido que está sendo irrigado, e o estado da ferida ou do sítio cirúrgico (por exemplo, a presença de resíduos, a exposição a patógenos da superfície). Os elementos versados na técnica serão capazes de verificar os métodos e dispositivos apropriados adequados para a administração, bem como os volumes e vazões apropriados.

[00132] Quando sob algumas circunstâncias, uma solução de irrigação simples pode ser suficiente para atingir algumas das finalidades da irrigação, soluções de irrigação convencionais, tais como solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS), antissépticos, ou antibióticos, podem não suportar a sobrevivência de ou serem citotóxicas às células ou aos tecidos sensíveis em alguns ajustes cirúrgicos, e desse modo afetar negativamente o resultado cirúrgico.

[00133] Um irrigante clínico geralmente usado, a solução salina normal (0.9% de NaCl em água), é isotônico e normalmente usado para a irrigação de ferida devido à sua baixa toxicidade, propriedades fisiológicas (pH e osmolaridade), facilidade de preparação e esterilização (incluindo a esterilização a vapor), e vida útil longa à temperatura ambiente. Uma desvantagem da salina normal é que ela não suporta a sobrevivência prolongada de células ou tecidos sensíveis, e que as taxas de infecção de ferida relativamente altas foram relatadas após a irrigação com a solução salina normal em comparação a outras soluções de irrigação.

[00134] A fim de irrigar sítios cirúrgicos ou feridas sensíveis, por exemplo, sítios ou feridas que podem ser afetados negativamente pela irrigação com salina normal ou outras soluções de irrigação simples, por exemplo, durante a cirurgia ocular, uma série de soluções de irrigação cirúrgica comercialmente disponíveis foi desenvolvida. Há tipicamente quatro ingredientes chaves nas soluções de irrigação cirúrgica atualmente disponíveis para o uso durante a cirurgia para impedir o trauma às células ou aos tecidos sensíveis, por exemplo, durante a cirurgia ocular: um agente para manter a osmolaridade, uma fonte de cálcio, uma fonte de magnésio e um agente tampão.

[00135] Algumas modalidades da presente invenção proveem métodos para irrigar um sítio cirúrgico com uma solução provida no presente documento, por exemplo, com a solução GS2. Em algumas modalidades, o sítio cirúrgico é o olho de um indivíduo.

[00136] Os métodos e dispositivos para a irrigação de um sítio cirúrgico são bem conhecidos de um elemento versado na técnica. O elemento versado na técnica irá compreender que o método de aplicação, o volume, e a pressão usados irão depender da natureza e da condição do sítio cirúrgico. Os dispositivos apropriados para a irrigação clínica incluem, sem limitação, seringa de bulbo, seringas de pistão, vasilhas de pressão, agitadores com turbilhonamento, aspersores de mangueira com turbilhonamento, fluido de irrigação em recipientes de plásticos com uma tampa ou bocal de aplicação, e dispositivos de lavagem pulsados (por exemplo, dispositivos de lavagem a jato, lavagem mecânica, lavagem pulsátil, irrigação mecânica, e irrigação a alta pressão).

[00137] Em algumas modalidades, a irrigação é contínua, na qual uma corrente ininterrupta de irrigante é administrada ao sítio cirúrgico. Em outras modalidades é empregada a irrigação pulsada ou intermitente, na qual uma aplicação intermitente ou interrompida de um irrigante é realizada. O volume da irrigação vai depender das características do sítio cirúrgico, e da finalidade da irrigação (limpeza de ferida, hidratação, etc.).

Kits

[00138] Alguns aspectos da presente invenção proveem kits que compreendem (a) uma solução tal como provido no presente documento; e (b) instruções para colocar uma população de células em contato com a solução de (a) para gerar uma preparação de células; e (c) um recipiente para o contato de (b) e/ou para armazenar a preparação de células de (b). Em algumas modalidades, a solução de (a) e o recipiente de (c) são apropriados para o uso da preparação de células de (b) para o transplante a um indivíduo.

[00139] Portanto, a presente invenção provê, inter alia, o que segue:

[00140] Cláusula 1. Solução, a qual compreende (a) um agente tampão, que mantém a solução a um pH fisiológico; e (b) pelo menos 2 mM ou pelo menos 0,05% (em peso/volume) de glicose; e (c) um agente osmoticamente ativo que mantém a solução a uma osmolaridade fisiológica.

[00141] Cláusula 2. A solução da cláusula 1, em que a solução compreende pelo menos 5 mM ou pelo menos 0,1% (em peso/volume) de glicose.

[00142] Cláusula 3. A solução da cláusula 1, em que a solução compreende pelo menos 7,5 mM ou pelo menos 0,14% (em peso/volume) de glicose.

[00143] Cláusula 4. A solução da cláusula 1, em que a solução compreende pelo menos 10 mM ou pelo menos 0,2% (em peso/volume) de glicose.

[00144] Cláusula 5. A solução da cláusula 1, em que a solução compreende pelo menos 15 mM ou pelo menos 0,25% (em peso/volume) de glicose.

[00145] Cláusula 6. A solução da cláusula 1, em que a solução compreende pelo menos 20 mM ou pelo menos 0,4% (em peso/volume) de glicose.

[00146] Cláusula 7. A solução da cláusula 1, em que a solução compreende pelo menos 25 mM ou pelo menos 0,5% (em peso/volume) de glicose.

[00147] Cláusula 8. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que a solução também compreende uma fonte de cátions divalentes.

[00148] Cláusula 9. A solução da cláusula 8, em que a fonte de cátions divalentes compreende um cálcio e/ou uma fonte de magnésio.

[00149] Cláusula 10. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 9, em que o agente tampão compreende um agente tampão de acetato e/ou um agente tampão de citrato.

[00150] Cláusula 11. Solução, a qual compreende (a) um agente tampão, que mantém a solução a um pH fisiológico, em que o agente tampão não é um agente tampão de dicarbonato; e (b) glicose; e (c) um agente osmoticamente ativo que mantém a solução a uma osmolaridade fisiológica; e (d) uma fonte de cátions divalentes.

[00151] Cláusula 12. A solução da cláusula 11, em que a fonte de cátions divalentes de (d) compreende uma fonte de cálcio e/ou uma fonte de magnésio.

[00152] Cláusula 13. A solução de qualquer uma das cláusulas 11 a 12, em que o agente tampão compreende um agente tampão de acetato e/ou um agente tampão de citrato.

[00153] Cláusula 14. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 13, em que a fonte de cálcio compreende um sal de cálcio farmaceuticamente aceitável.

[00154] Cláusula 15. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 14, em que a fonte de magnésio compreende um sal de magnésio farmaceuticamente aceitável.

[00155] Cláusula 16. A solução de qualquer uma das cláusulas 14 a 15, em que o cálcio farmaceuticamente aceitável e/ou o sal de magnésio farmaceuticamente aceitável são selecionados do grupo dos sais de cálcio e/ou de magnésio formados com um ácido selecionado do grupo que compreende o ácido acético, o ácido ascórbico, o ácido cítrico, o ácido clorídrico, o ácido maleico, o ácido oxálico, o ácido fosfórico, o ácido esteárico, o ácido succínico e o ácido sulfúrico.

[00156] Cláusula 17. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 16, em que a fonte de cálcio compreende o cloreto de cálcio.

[00157] Cláusula 18. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 17, em que a fonte de cálcio compreende o cloreto de cálcio di-hidratado.

[00158] Cláusula 19. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 18, em que a fonte de magnésio compreende o cloreto de magnésio.

[00159] Cláusula 20. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 18, em que a fonte de magnésio compreende o cloreto de magnésio hexa-hidratado.

[00160] Cláusula 21. A solução de qualquer uma das cláusulas 10 ou 13 a 20, sendo o agente tampão de citrato é provido como o citrato de sódio.

[00161] Cláusula 22. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 21, em que a glicose é a D-glicose (Dextrose).

[00162] Cláusula 23. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 22, em que o agente osmoticamente ativo é um sal.

[00163] Cláusula 24. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 23, em que o agente osmoticamente ativo é um sal de sódio.

[00164] Cláusula 25. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 24, em que o agente osmoticamente ativo é o cloreto de sódio.

[00165] Cláusula 26. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 25, em que a solução compreende o cloreto de cálcio, o cloreto de magnésio, o citrato de sódio, o cloreto de sódio e a glicose.

[00166] Cláusula 27. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 26, em que o pH da solução é de 6,8 a 7,8.

[00167] Cláusula 28. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 27, em que o pH da solução é de 7,4 a 7,5.

[00168] Cláusula 29. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 28, em que o pH da solução é de cerca de 7,5.

[00169] Cláusula 30. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 29, em que a solução é isotônica.

[00170] Cláusula 31. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 29, em que a solução é hipertônica.

[00171] Cláusula 32. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 31, em que a solução exibe uma osmolaridade de cerca de 270 a 345 mOsm/l.

[00172] Cláusula 33. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 32, em que a osmolaridade da solução é de cerca de 315 mOsm/l.

[00173] Cláusula 34. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 33, em que a concentração da fonte de cálcio é de 0,25 a 0,75 mM.

[00174] Cláusula 35. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 34, em que a concentração da fonte de cálcio é de de 0,4 a 0,65 mM.

[00175] Cláusula 36. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 35, em que a concentração da fonte de cálcio é de 0,5 a 0,6 mM, ou a solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 35, em que a concentração da fonte de cálcio é de 0,5 a 0,9 mM, ou sendo que a concentração da fonte de cálcio é de 0,6 a 0,8 mM.

[00176] Cláusula 37. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 36, em que a concentração da fonte de cálcio é de cerca de 0,6 mM ou a solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 36, em que a concentração da fonte de cálcio é de cerca de 0,7 mM.

[00177] Cláusula 38. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 37, em que a concentração da fonte de magnésio é de 0,05 a 5 mM.

[00178] Cláusula 39. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 38, em que a concentração da fonte de magnésio é de 0,1 a 0,3 mM.

[00179] Cláusula 40. A solução de qualquer uma das cláusulas 9 a 10 ou 12 a 39, em que a concentração da fonte de magnésio é de cerca de 0,3 mM.

[00180] Cláusula 41. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 40, em que a concentração de glicose é de 5 a 50 mM.

[00181] Cláusula 42. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 41, em que a concentração de glicose é de 10 a 25 mM.

[00182] Cláusula 43. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 42, em que a concentração de glicose é de 10 a 20 mM.

[00183] Cláusula 44. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 43, em que a concentração de glicose é de cerca de 16 mM.

[00184] Cláusula 45. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 44, em que a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 100 a 200 mM.

[00185] Cláusula 46. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 45, em que a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 125 a 175 mM.

[00186] Cláusula 47. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 46, em que a concentração do agente osmoticamente ativo é de cerca de 150 mM.

[00187] Cláusula 48. A solução de qualquer uma das cláusulas 10 ou 13 a 47, em que a concentração de citrato ou de acetato é de 0,1 a 5 mM.

[00188] Cláusula 49. A solução de qualquer uma das cláusulas 10 ou 13 a 48, em que a concentração de citrato ou de acetato é de 0,5 a 2 mM.

[00189] Cláusula 50. A solução de qualquer uma das cláusulas 10 ou 13 a 39, em que a concentração de citrato ou de acetato é de cerca de 1 mM.

[00190] Cláusula 51. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 51, em que a solução também compreende um sal de potássio.

[00191] Cláusula 52. A solução da cláusula 51, em que o sal de potássio é o cloreto de potássio.

[00192] Cláusula 53. A solução da cláusula 51 ou 52, em que a concentração de KCl é de 0,2 a 5 mM.

[00193] Cláusula 54. A solução da cláusula 53, em que a concentração de KCl é de 1 a 2,5 mM.

[00194] Cláusula 55. A solução da cláusula 54, em que a concentração de KCl é de cerca de 2 mM.

[00195] Cláusula 56. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 55, em que a solução compreende cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,03 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, e cerca de 145 mM de NaCl, ou a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 55, em que a solução compreende cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, e cerca de 145 mM de NaCl, ou a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 55, em que a solução compreende cerca de 0,5 a 0,9 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,2 a 0,4 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 0,8 a 1,2 mM de citrato de sódio, cerca de 13 a 19 mM de dextrose, e cerca de 116 a 174 mM de NaCl.

[00196] Cláusula 57. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 55, em que a solução compreende cerca de 0,85% de NaCl em peso/volume, cerca de 0,01% de CaCl di-hidratado (cloreto de cálcio di- hidratado) em peso/volume, cerca de 0,006% de MgCl hexa-hidratado (cloreto de magnésio hexa-hidratado) em peso/volume, cerca de 0,035% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume, e cerca de 0,29% de dextrose em peso/volume, ou a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 55, em que a solução compreende cerca de 0,68 a 1,02 % de NaCl em peso/volume, cerca de 0,008 a 0,012% de CaCl di- hidratado (cloreto de cálcio di-hidratado) em peso/volume, cerca de 0,0048 a 0,0072% de MgCl hexa-hidratado (cloreto de magnésio hexa- hidratado) em peso/volume, cerca de 0,028 a 0,042% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume, e cerca de 0,023 a 0,35% de dextrose em peso/volume.

[00197] Cláusula 58. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 57, em que a solução também compreende cerca de 2 mM de KCl.

[00198] Cláusula 59. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 58, em que a solução também compreende um polímero viscoelástico.

[00199] Cláusula 60. A solução da cláusula 59, em que o polímero é o ácido hialurônico ou um sal ou solvato do mesmo.

[00200] Cláusula 61. A solução da cláusula 59 ou 60, em que o polímero é o hialuronato de sódio.

[00201] Cláusula 62. Solução de qualquer uma das cláusulas 59 a 61, em que o polímero está presente em uma concentração eficaz para reduzir a exposição das células na solução à tensão de cisalhamento.

[00202] Cláusula 63. A solução de qualquer uma das cláusulas 59 a 62, em que a concentração do polímero é de 0,005 a 5% em peso/volume.

[00203] Cláusula 64. A solução da cláusula 63, em que a concentração do polímero é de cerca de 0,05% em peso/volume.

[00204] Cláusula 65. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 64, em que a solução compreende cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,03 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 2 mM de KCl, cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 0,05% de ácido hialurônico, ou a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 64, em que a solução compreende cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 2 mM de KCl, cerca de 1 mM de citrato de sódio, cerca de 16 mM de dextrose, cerca de 145 mM de NaCl, e cerca de 0,05% de ácido hialurônico, ou a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 64, em que a solução compreende cerca de 0,5 a 0,8 mM de CaCl (cloreto de cálcio), cerca de 0,2 a 0,4 mM de MgCl (cloreto de magnésio), cerca de 1,6 a 2,4 mM de KCl, cerca de 0,8 a 1,2 mM de citrato de sódio, cerca de 13 a 19 mM de dextrose, cerca de 116 a 174 mM de NaCl, e cerca de 0,04 a 0,06% de ácido hialurônico.

[00205] Cláusula 66. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 65, em que a solução não compreende um agente tampão de carbonato.

[00206] Cláusula 67. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 66, em que a solução não compreende a glutationa, ou o dissulfeto de glutationa (GSSG).

[00207] Cláusula 68. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 67, em que a solução não compreende um agente tampão orgânico zwitteriônico.

[00208] Cláusula 69. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 68, em que a solução pode ser armazenada por pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos 120 horas, pelo menos 144 horas, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, ou pelo menos um mês a 25°C sem precipitação mensurável de solutos e/ou perda mensurável da capacidade da solução de suportar a sobrevivência e a viabilidade das células armazenadas na solução.

[00209] Cláusula 70. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 69, em que a solução pode ser armazenada por pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos 120 horas, pelo menos 144 horas, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, ou pelo menos um mês a 2 a 8°C sem precipitação mensurável de solutos e/ou perda mensurável da capacidade da solução de suportar a sobrevivência e a viabilidade das células armazenadas na solução.

[00210] Cláusula 71. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 70, em que a solução é apropriada para a administração a um indivíduo, apropriada para a administração ao olho de um indivíduo, e/ou apropriada para o transplante de células ao olho de um indivíduo.

[00211] Cláusula 72. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 71, em que a solução é essencialmente livre de pirogênio.

[00212] Cláusula 73. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 72, em que a solução é estéril.

[00213] Cláusula 74. A solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 73, em que a solução é para a irrigação, a reconstituição de células, a armazenagem de células, o transporte de células e/ou a administração a um indivíduo.

[00214] Cláusula 75. Uma preparação, o qual compreende uma população de células na solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74.

[00215] Cláusula 76. A preparação da cláusula 75, em que a população de células é apropriada para o transplante a um indivíduo.

[00216] Cláusula 77. A preparação da cláusula 76, em que a população de células é apropriada para o transplante ao olho de um indivíduo.

[00217] Cláusula 78. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 77, em que a população de células compreende células RPE.

[00218] Cláusula 79. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 78, em que a população de células compreende células fotorreceptoras.

[00219] Cláusula 80. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 79, em que a população de células compreende células mesenquimais.

[00220] Cláusula 81. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 80, em que a preparação é refrigerada.

[00221] Cláusula 82. a preparação da cláusula 81, em que a preparação é refrigerada a cerca de 2 a 8°C.

[00222] Cláusula 83. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 82, em que a preparação suporta a sobrevivência das células na população de células durante a armazenagem da preparação, e em que pelo menos 70% das células na população de células são viáveis depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C.

[00223] Cláusula 84. a preparação da cláusula 83, em que pelo menos 80% das células na população de células são viáveis depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C.

[00224] Cláusula 85. a preparação da cláusula 83, em que pelo menos 90% das células na população de células são viáveis depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C.

[00225] Cláusula 86. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 85, em que a preparação suporta a manutenção da eficiência de chapeamento da população de células durante a armazenagem da preparação, e em que a população de células exibe pelo menos 70% de sua eficiência de chapeamento original depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C, em que a eficiência de chapeamento original é a eficiência de chapeamento da população de células no começo do período de armazenagem.

[00226] Cláusula 87. a preparação da cláusula 86, em que a população de células exibe pelo menos 80% de sua eficiência de chapeamento original depois de 48 horas de armazenagem da preparação a 2 a 8°C.

[00227] Cláusula 88. a preparação da cláusula 86, em que a população de células exibe pelo menos 90% de sua eficiência de chapeamento original.

[00228] Cláusula 89. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 88, em que a preparação fica dentro de um recipiente de armazenagem.

[00229] Cláusula 90. a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 89, em que a preparação fica dentro de uma seringa.

[00230] Cláusula 91. Um método para a preparação da preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 90, em que o método compreende a colocação de uma população de células em contato com a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74.

[00231] Cláusula 92. O método da cláusula 91, em que o método compreende a colocação de uma população de células criopreservadas ou em péletes em contato com a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74, reconstituindo desse modo as células.

[00232] Cláusula 93. Uma composição farmacêutica que compreende a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74 ou a preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 90, em que a composição farmacêutica é apropriada para a administração a um indivíduo.

[00233] Cláusula 94. Um método, o qual compreende a administração da solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74, da preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 90 ou da composição farmacêutica da cláusula 88, a um indivíduo com necessidade dos mesmos.

[00234] Cláusula 95. O método da cláusula 94, em que o método compreende a administração da solução ou da preparação ao olho do indivíduo.

[00235] Cláusula 96. O método da cláusula 94 ou 95, em que o método compreende a administração da preparação ao indivíduo após a armazenagem da preparação por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 24, pelo menos 36 ou pelo menos 48 horas.

[00236] Cláusula 97. O método da cláusula 96, em que o indivíduo tem ou é diagnosticado com uma doença da retina.

[00237] Cláusula 98. O método da cláusula 97, em que a doença da retina é a distrofia de bastonete ou de cone, a degeneração da retina, a retinite pigmentosa, a retinopatia diabética, a degeneração macular, a amaurose congênita de Leber ou a doença de Stargardt.

[00238] Cláusula 99. O método da cláusula 97 ou 98, em que a preparação compreende uma população de células de um tamanho eficaz para melhorar pelo menos um sintoma da doença de retina no indivíduo.

[00239] Cláusula 100. O método de qualquer uma das cláusulas 97 a 99, em que o método também compreende o monitoramento de pelo menos um sintoma da doença de retina no indivíduo.

[00240] Cláusula 101. Um método, o qual compreende (a) a colocação de uma população de células em contato com a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74, gerando desse modo uma preparação de células.

[00241] Cláusula 102. O método da cláusula 101, o qual também compreende (b) a armazenagem da preparação de células de (a) por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 36, pelo menos 48, pelo menos 60 ou pelo menos 72 horas.

[00242] Cláusula 103. O método da cláusula 102, em que o método também compreende (c) a administração da preparação de células de (a) a um indivíduo após o período de armazenagem de (b).

[00243] Cláusula 104. O método da cláusula 103, em que a administração de (c) compreende a injeção das células no olho de um indivíduo.

[00244] Cláusula 105. O método de qualquer uma das cláusulas 101 a 104, em que o método também compreende a determinação da viabilidade da célula na preparação de células de (a) após o período de armazenagem de (b).

[00245] Cláusula 106. O método de qualquer uma das cláusulas 101 a 105, em que o método compreende a refrigeração da preparação de células de (a) durante o período de armazenagem da etapa (b).

[00246] Cláusula 107. O método da cláusula 106, em que a refrigeração compreende a armazenagem da preparação de células a uma temperatura de 2 a 8°C.

[00247] Cláusula 108. Um método para o tratamento de uma doença da retina, em que o método compreende a administração de uma quantidade eficaz da preparação de qualquer uma das cláusulas 75 a 90 ou da composição farmacêutica da cláusula 93 ao olho de um indivíduo que tem uma doença da retina.

[00248] Cláusula 109. O método da cláusula 108, em que a doença da retina é uma distrofia de bastonete ou de cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber ou doença de Stargardt.

[00249] Cláusula 110. Um kit, o qual compreende (a) a solução de qualquer uma das cláusulas 1 a 74; (b) instruções para colocar uma população de células em contato com a solução de (a) para gerar uma preparação de células; e (c) um recipiente para o contato de (b) e/ou para a armazenagem da preparação de células de (b).

[00250] Cláusula 111. O kit da cláusula 110, em que a solução de (a) e o recipiente de (c) são apropriados para uso da preparação de células de (b) para o transplante a um indivíduo.

EXEMPLOS Introdução

[00251] As experimentações clínicas da fase 1 para administração de células RPE ao olho de indivíduos com SMD e AMD foram realizadas ao usar Alcon BSS PLUS® como meio de formulação, de armazenagem e de transplante de células RPE. O BSS PLUS® é uma solução fisiologicamente compatível (osmolaridade ~310 mOs, pH ~ 7,4) aprovada para uso em cirurgia intraocular. A vida útil das células RPE formuladas em BSS PLUS® é limitada a cerca de quatro horas quando armazenadas a 2 a 8°C antes da administração clínica (injeção). Devido a essa vida útil limitada do produto, laboratórios satélite de processamento de células tiveram que se estabelecer nas proximidades de cada sítio clínico que participou das experimentações.

[00252] O desenvolvimento de um meio que amplia de maneira significativa a vida útil do produto final (por exemplo, para 48 horas ou mais) propicia numerosas vantagens. Uma vida útil incrementada permite que as formulações do produto final sejam consolidadas em uma única localização da qual o produto final pode ser enviado a todos os sítios clínicos nos Estados Unidos. Dessa maneira, o número de sítios clínicos, atualmente restrito àqueles situados nas proximidades dos sítios de processamento cGMP, pode ser expandido. A vida útil prolongada do produto elimina também as complexidades de logística associadas com a manutenção de múltiplos estoques de materiais, treinamento de pessoal e supervisão de múltiplos sítios de processamento satélite. Uma vida útil prolongada melhora a flexibilidade na programação de transplantes que atualmente devem ocorrer dentro de uma janela estreita de quatro horas.

[00253] A ampliação da vida útil do produto final permite um tempo amplo para notificação de qualquer atraso ou cancelamento bem antes de os pacientes serem preparações para a cirurgia ou entrarem na sala de cirurgia (OR). Além disso, se o produto final falhar em um teste de liberação de qualidade, é possível preparar uma formulação adicional do produto final no mesmo dia, sem atraso ou cancelamento da cirurgia. A ampliação da vida útil permite um tempo adicional para complementar um teste de liberação do produto final como o DNA qPCR ao usar primers de autoclave a fim de detectar a presença dos contaminantes microbianos propostos abaixo.

[00254] O produto final de RPE formulado em BSS Plus® foi obtido através do instrumento MedOne 23 REF 3233 PolyTip® Cannula 23/38. Ao usar a formulação atual de BSS PLUS®, foi observada uma perda média na densidade da célula viável de ~23%. Esta perda foi consistente em todas as densidades de célula testadas e não teve nenhum impacto aparente nos 77% de células restantes extrudadas através de cânula em termos de viabilidade ou de capacidade subsequente de semeadura, proliferação e diferenciação na cultura. Embora possa ser esperada alguma perda de células devido à aderência, as experiências subsequentes foram consistentes com a perda de células e presumivelmente o lise de células atribuíveis às forças de cisalhamento geradas durante a extrusão da cânula. Para compensar a perda antecipada, as densidades de carregamento da cânula são aumentadas de acordo para garantir que as doses requeridas sejam aplicadas. Além de melhorar a vida útil, um meio de formulação final com propriedades viscoelásticas apropriadas minimiza a perda de células durante a aplicação da cânula. A minimização da perda de células reduz a aplicação de resíduos celulares, atenuando reações imunes potenciais aos componentes intracelulares.

EXEMPLO 1: Composições do meio Meio GS2

[00255] Foi preparado um meio para a reconstituição, a armazenagem, o transporte e/ou a administração de células a um indivíduo. O meio, chamado "GS2," foi preparado tal como segue: 48,75 ml de NaCl a 0,9% em água em peso/volume; 13,10 ml de Alcon Balanced Salt Solution (BSS®), 300 mOsm, em água; e 3,75 ml de dextrose a 5% em NaCl em peso/volume a 0,9% (em água) (560 mOsm) em peso/volume, foram combinados para obter 65,6 ml de um meio com uma concentração final de dextrose de 0,29% em peso/volume e uma osmolaridade de 315 mOsm.

[00256] O meio GS2 básico compreende desse modo cerca de 145 mM de NaCl (cerca de 0,85% de NaCl em peso/volume), cerca de 2 mM de KCl (cerca de 0,015% de KCl em peso/volume), cerca de 0,7 mM de CaCl (cloreto de cálcio) (cerca de 0,01% de CaCl di-hidratado (cloreto de cálcio di-hidratado) em peso/volume), cerca de 0,3 mM de MgCl (cloreto de magnésio) (cerca de 0,006% de MgCl hexa-hidratado (cloreto de magnésio hexa-hidratado) em peso/volume), cerca de 1 mM de citrato de sódio (cerca de 0,035% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume), e cerca de 16 mM de glicose (cerca de 0,29% de dextrose em peso/volume), em água.

[00257] Opcionalmente, o meio GS2 também pode compreender um polímero viscoelástico em uma quantidade eficaz para reduzir a tensão de cisalhamento nas células, por exemplo, a uma concentração final de cerca de 0,005 a 5% em peso/volume. Em algumas modalidades, o polímero viscoelástico é o ácido hialurônico ou um sal ou um solvato do mesmo.

Alcon Balanced Salt Solution (BSS®)

[00258] A Alcon Balanced Salt Solution (Solução para Irrigação Estéril BSS®) é uma solução de sal balanceada estéril, a qual contém 0,64% de cloreto de sódio (NaCl) em peso/volume, 0,075% de cloreto de potássio (KCl) em peso/volume, 0,048% de cloreto de cálcio di-hidratado (CaC^2H2O) em peso/volume, 0,03% de cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgC^6H2O) em peso/volume, 0,39% de acetato de sódio triidratado (C2HβNaO2^3H2O) em peso/volume, 0,17% de de citrato de sódio di-hidratado (C6H5NaaOy2H2O) em peso/volume, hidróxido de sódio e/ou ácido clorídrico (para ajustar o pH), e água para a injeção.

[00259] O pH de BSS® é de cerca de 7,5 e a osmolaridade é de cerca de 300 mOsm/Kg.

[00260] Desse modo, Alcon BSS compreende cerca de 109 mM de NaCl, cerca de 10 mM de KCl cerca de 3 mM de CaCl (cloreto de cálcio) cerca de 0,1 mM de MgCl (cloreto de magnésio) cerca de 5 mM de citrato de sódio

Alcon Balanced Salt Solution PLUS (BSS® PLUS)

[00261] A Alcon Balanced Salt Solution PLUS (BSS® PLUS) é uma solução para irrigação intraocular estéril para uso durante procedimentos cirúrgicos intraoculares. Ela é reconstituída antes do uso em duas partes, denominadas "Parte I" e "Parte II".

[00262] A Parte I é uma solução estéril de 480 ml em um frasco de dose única de 500 ml ao qual o concentrado da Parte II é adicionado. A Parte I de BSS PLUS® contém 7,440 mg/ml de cloreto de sódio, 0,395 mg/ml de cloreto de potássio, 0,433 mg/ml de fosfato de sódio dibásico, 2,190 mg/ml de bicarbonato de sódio, ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio (para ajustar o pH), e água para a injeção.

[00263] A Parte II é um concentrado estéril em um frasco de dose única de 20 ml para adição à Parte I. A Parte II de BSS PLUS® contém: 3,85 mg/ml de cloreto de cálcio di-hidratado, 5 mg/ml de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 23 mg/ml de dextrose, 4,6 mg/ml de dissulfeto de glutationa (glutationa oxidada), e água para a injeção.

[00264] Após a adição da Parte II de BSS PLUS® ao frasco da Parte I, o produto reconstituído contém: 7,14 mg/ml de cloreto de sódio, 0,38 mg/ml de cloreto de potássio, 0,154 mg/ml de cloreto de cálcio di-hidratado, 0,2 mg/ml de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 0,42 mg/ml de fosfato de sódio dibásico, 2,1 mg/ml de bicarbonato de sódio, 0,92 mg/ml de dextrose, 0,184 mg/ml de dissulfeto de glutationa (glutationa oxidada), ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio (para ajustar o pH), em água para a injeção.

[00265] O produto reconstituído tem um pH de cerca de 7,4 e uma osmolaridade de cerca de 305 mOsm.

EXEMPLO 2: Vida útil do produto final de RPE formulado em BSS-Plus®

[00266] O produto final de RPE formulado em BSS Plus® manteve a sua viabilidade por 4 horas sob armazenagem a frio (2 a 8°C). Uma avaliação mais detalhada da vida útil do produto final foi realizada. Neste estudo, o produto de RPE a granel foi descongelado e formulado em duas densidades de célula viável que suportaram a densidade de armazenagem final de 2.000 células viáveis/pl. Essa densidade de armazenagem foi constante em todas as doses preparadas. A diluição final das células com um volume pré-medido de BSS Plus® é realizada em OR somente antes de carregar a seringa. Essa etapa de diluição determina a densidade da célula final aplicada em um volume de injeção de 150 μl (também constante para todas as doses).

[00267] A viabilidade celular, a densidade da célula viável, a pureza e a potencialidade do produto de célula RPE formulado com BSS-Plus® final armazenado a frio foram avaliadas no momento da formulação (0 horas) e depois de 4 e 6 horas de armazenagem a frio (2 a 8°C). A densidade da célula viável e a visibilidade da célula se mostraram constantes por seis horas de armazenagem a frio. Além disso, as células RPE formuladas armazenadas por 0, 4 e 6 horas foram semeadas e cultivadas para futuras avaliações de pureza e de potencialidade. Para cada ponto no tempo semeado (0, 4 e 6 horas), a pureza foi avaliada por imunomarcação MITF e a potencialidade foi avaliada pela medição da análise FACS de partículas submetidas à fagocitose. Os dados mostraram que todos os atributos do produto testado permaneceram constantes durante o período de 6 horas avaliado.

[00268] As células RPE armazenadas em BSS Plus® por 12 horas geralmente exibiram viabilidades menores do que 70% e depois de 24 horas em BSS-PLUS a viabilidade das células RPE era tipicamente menor do que 20%.

EXEMPLO 3: Desenvolvimento de um meio de reconstituição, armazenagem, transporte e/ou transplante de células incrementado

[00269] Foram desenvolvidos um meio para a reconstituição das células (por exemplo, de um estado criopreservado), a armazenagem de células (por exemplo, a armazenagem a frio entre a reconstituição ou a colheita da cultura de células, bem como o transporte a um centro de transplante ou administração a um indivíduo), o transporte de células e o transplante de células incrementados. Os componentes do meio resultante (GS2) estão listados na Tabela 1 a seguir. São providos os fornecedores exemplificadores. Os elementos versados no estado da técnica irão compreender que existem fontes adicionais dos componentes listados e poderão verificar as fontes apropriadas destes reagentes:

[00270] A formulação final GS2 é fisiológica em termos de pH (7,2 a 7,6) e de osmolaridade (osmolaridade calculada 315.)

[00271] O meio GS2 foi formulado e dispensado em uma sala limpa com Produto Final de Célula RPE Isso-7 dedicada dentro de um BSC Iso-5. Os componentes estéreis da Tabela 1 foram adicionados a um reservatório estéril e colocados em um agitador rotativo (30 a 40 rpm). Depois de um período mínimo de três horas, as amostras foram removidas do reservatório e o pH foi medido e ajustado a um pH de 7,4 +/- 0,2 com a adição incremental de NaOH 0,1N. O GS2 para o preenchimento não entrou em contato com a sonda do pH. A solução foi esterilizada em um filtro de membrana e o pH foi verificado novamente.

[00272] Alíquotas de 3 ml de GS2 foram colocadas em criofrascos sob irradiação de raios gama compostos de resina de polipropileno virgem que satisfazem os limites USP Class VI. As amostras foram removidas de cada frasco cheio e os frascos foram tampados. O teste de QC foi realizado na amostra aglomerada tal como descrito a seguir. Cada frasco foi submetido a inspeção visual sob luz visível e UV para confirmar a ausência de particulados. Os frascos retornaram às condições estéreis para etiquetagem e foram armazenados a 2 a 8°C. Depois de um mínimo de um dia em armazenagem a frio, vários frascos foram removidos e o pH foi novamente testado ao usar um medidor de pH calibrado com padrões de pH de 2 a 8°C a fim de confirmar a aceitabilidade à temperatura de uso (2 a 8°C).

EXEMPLO 4: Especificações de controle de qualidade e liberação para o produto final de célula RPE em GS2

[00273] As alíquotas de GS2 aglomerado compostas de amostras removidas de todos os frascos preenchidos foram submetidas a 14 dias de teste de esterilidade USP 14, pH, osmolaridade e endotoxina. O desempenho de cada lote de GS2 para manter a viabilidade e o crescimento da célula RPE após a formulação e a extrusão através da cânula de injeção também foi avaliado. Os testes de Controle de Qualidade e as especificações de liberação de exemplo são apresentados na Tabela 2 a seguir:

[00274] Deve ser compreendido que os critérios de liberação listados na Tabela 2 são exemplificadores e que qualquer combinação de quaisquer critérios listados na Tabela 2 pode ser combinada e usada, tanto sozinha quanto em combinação com critérios adicionais, para testes de liberação e de controle de qualidade.

[00275] Em uma modalidade exemplificadora do ensaio de crescimento de células RPE, após o período de armazenagem de GS2, as células foram semeadas em placas com poços revestidas com gelatina 96 em uma densidade inicial, por exemplo, em densidade de 20.000 células por poço nos meios RPE GM ou EGM2/EBM2 (Lonza, por exemplo, Cat. #: CC-3156, CC-4176). As células cresceram por 2 a 3 dias sob condições apropriadas, por exemplo, em 5% de CO2, a 37°C, e em uma incubatora com umidade controlada. As células foram retiradas dos poços, por exemplo, por digestão de tripsina, e então contadas. Os Critérios para os Testes de Liberação de Qualidade GS2 para este teste serão atendidos se, ao final do período de cultura, a contagem de células por poço for 125% ou maior que a densidade inicial da célula, por exemplo, >/= 25.000 células/poço para uma densidade inicial de 20.000 células).

EXEMPLO 5: Formulação final do produto RPE, acondicionamento e expedição

[00276] No processo descrito a seguir, o BSS Plus® é usado nas etapas de lavagem iniciais para processamento de GS2. A lavagem em GS2 em vez de em BSS Plus® também é contemplada e adotada pelas modalidades da presente descrição. Os frascos de células MA09-hRPE criopreservadas liberadas para uso clínico foram recuperados da armazenagem em nitrogênio líquido. Dependendo da dose, 2 a 4 frascos de células foram necessários. Os criofrascos foram transportados a uma sala limpa e descongelados rapidamente em um banho de água a 37°C. O conteúdo descongelado de cada frasco (1 ml de meio de criopreservação (90% FCS + 10% DMSO) contendo 2 milhões de células no momento da criopreservação) foi novamente suspenso delicadamente em DMEM morno, transferido para um tubo cónico de 50 ml e formou um volume final de 40 ml com o DMEM morno adicional. Cada tubo de células ressuspensas foi centrifugado (160 x g por 5 minutos à temperatura ambiente) e cada pélete foi ressuspenso em 40 ml de BSS Plus® à temperatura ambiente. Cada suspensão de célula foi centrifugada outra vez, os péletes foram aglomerados e ressuspensos em 10 ml de BSS Plus® à temperatura ambiente. As células ressuspensas, aglomeradas, foram centrifugadas (160 x g por 5 minutos à temperatura ambiente) uma terceira vez e o sobrenadante foi aspirado.

[00277] Segue abaixo um fluxograma que ilustra as etapas da formulação do produto esboçadas acima (as etapas de processamento de GS2 são identificadas pelo sublinhado): FORMULAÇÃO DE PRODUTO RPE - I

[00278] Após a remoção de uma quantidade possível de sobrenadante, o pélete foi ressuspenso em um volume de BSS Plus® frio (processamento atual) ou GS2 frio (processamento de GS2) tendo como alvo um volume final de 50 μl para cada milhão de células descongeladas. A partir deste ponto as células foram mantidas em um suporte de tubos pré-refrigerado a fim de manter as células a 2 a 8°C para as etapas de processamento restantes. As recuperações típicas de volume alvo de 15 a 25% vão resultar uma suspensão de células de cerca de 4.000 células RPE viáveis/pl.

[00279] As amostras foram removidas, uma contagem das células viáveis foi realizada e a densidade das células viáveis e o número total de células recuperadas foram determinados. O BSS Plus® frio adicional ou o GS2 frio foram adicionados à suspensão de células para formar uma concentração de células final de 2.300 células RPE viáveis/pl (300 células acima da concentração da formulação final alvo de 2.000 células RPE viáveis/pl). Uma contagem de células confirmatória foi realizada e o BSS Plus® frio ou o GS2 frio adicionais foram adicionados para formar uma concentração final de 2.000 células RPE viáveis/pl. O volume de células necessário foi dispensado em invólucros do produto final (tubos de microcentrífuga estéreis de 0,5 ml; Fisher, Cat. no. 02-707-351). Uma etiqueta de produto foi fixada em cada tubo de processamento BSS Plus® ou em um saco Whirl-Pak contendo o tubo do produto de processamento GS2, indicando um vencimento de 4 horas para o BSS Plus® RPE ou um vencimento de 48 horas para o GS2 RPE. Uma amostra foi removida de cada tubo de produto e essas amostras foram aglomeradas para arquivo e teste de QC.

[00280] Além disso, foi desenvolvido um protocolo para a formulação de células cultivadas. Neste protocolo, as células RPE criopreservadas foram descongeladas e pré-cultivadas por 3 a 7 dias antes da formulação das células no Meio do Transplante GS2. As células cultivadas foram retiradas das placas de cultura e lavadas primeiramente em DMEM, então em BSS-Plus, e finalmente em BSS- Plus misturado em 1:1 com o meio GS2. Depois da etapa de lavagem final, as células foram transferidas para um meio de GS2 frio (2 a 8°C). A remoção de amostra, os testes e o ajuste do volume para a densidade de célula final foram realizados tal como descrito acima.

[00281] Segue abaixo um fluxograma que ilustra as etapas de formulação do produto descritas acima (as etapas de processamento de GS2 estão indicadas pelo sublinhado): FORMULAÇÃO DE PRODUTO RPE - II

[00282] Acondicionamento e Expedição de RPE em BSS PLUS®. Para transplantes de experimentações clínicas (SMD e AMD), cada dose consistiu de um par de tubos: um contendo um volume pré-medido de células RPE formulado com 2.000 células RPE viáveis^l e outro tubo contendo um volume pré-medido de BSS Plus®. Cada par de tubos foi colocado em um suporte refrigerado de tubos Labtop a 2 a 8°C. Os suportes refrigerados foram ensacados, colocados em um refrigerador Coleman contendo ~16 libras de Insul-Ice pré-refrigerado e entregues em mãos por um mensageiro à clínica.

[00283] Em OR, somente antes do transplante o BSS Plus® foi adicionado às células ao usar uma agulha rombuda. As células foram misturadas e carregadas em uma seringa de injeção de 1 ml. O produto (150 μl para todas as doses) foi expelido através da cânula de injeção para o espaço sub-retinal. A densidade da célula de carregamento na seringa foi ajustada a 1,33 x densidade de aplicação a fim de compensar 25% de perda antecipada durante a expulsão pela cânula.

[00284] Segue abaixo um fluxograma que ilustra as etapas de acondicionamento e expedição em BSS PLUS®:

[00285] Acondicionamento e Expedição de RPE em GS2. Cada dose consistiu em um tubo de microcentrífuga contendo 250 μl de células RPE formuladas em 2.300 células RPE viáveis/pl. Um único tubo contendo uma dose do produto de RPE formulado final foi colocado em um saco Whirl-Pak estéril de 2 onças ao qual uma etiqueta de produto final foi fixada. Os tubos ensacados foram colocados em um refrigerador de tubos limpo, pré-refrigerado (2 a 8°C), exclusivamente numerado e portátil. Além do(s) tubo(s) etiquetado(s) do produto, um tubo satélite etiquetado (ensacado) contendo 30 μl de células do produto de RPE e um tubo separado contendo 100 μl de 0,4% de Tryptan Blue também foi colocado em cada refrigerador Chillette. Uma etiqueta de produto final também foi fixada a cada refrigerador Chillette. Cada refrigerador com produto foi colocado em um saco estéril Whirl-Pak sob condições estéreis. O refrigerador ensacado com produto, um formulário de pedido clínico associado e duas etiquetas do produto foi colocado em uma passagem estreita da sala limpa que conduz à área de acondicionamento e expedição final. A fim de evitar qualquer confusão, cada refrigerador Chillette foi carregado com os tubos do produto sob condições estéreis e colocado na passagem estreita da sala limpa, um de cada vez.

[00286] O pessoal do acondicionamento apanhou cada refrigerador Chillette, a papelada associada e as etiquetas de produto final da passagem estreita da sala limpa e colocou o refrigerador Chillette ensacado, o plástico-bolha, a agulha rombuda, a seringa, a cânula de injeção e um hemocitômetro no compartimento de transporte de uma unidade de refrigeração NanoCool pré-refrigerada. A tampa da unidade de refrigeração foi fixada e o transportador externo foi acondicionado com os documentos para recebimento, inspeção, armazenagem e teste de viabilidade pós-expedição. O produto acondicionado foi colocado sob quarentena até que todo o teste de liberação do produto fosse executado e um Certificado de Produto Final de Célula RPE de Liberação para Transplante fosse emitido. O transportador NanoCool com o produto e os documentos foi enviado para a clínica durante a noite. Até o recebimento o transportador pode ser armazenado à temperatura ambiente ou em 2 a 8°C até o uso do produto dentro de 48 horas do tempo de preenchimento final. As etiquetas do produto final com data e hora da validade são fixadas no transportador externo, no refrigerador de tubos Chillette e no saco que contém o tubo de produto final.

[00287] Teste de Liberação de Qualidade do Produto Final de RPE. O teste de liberação de qualidade do produto final (em BSS PLUS®) realizado antes do transplante inclui uma verificação de viabilidade das células e coloração de Gram. As amostras são enviadas para teste de esterilidade USP 14 dias com os resultados relatados pós- transplante.

[00288] qPCR para a Detecção de Contaminantes. Uma vez que a vida útil do produto final RPE é ampliada em 4 horas em BSS-Plus® para pelo menos 48 horas em GS2, podem ser realizados ensaios com tempo de entrega mais longo antes da liberação de produto. Por exemplo, é possível submeter o produto final de RPE a ensaios PCR e receber os resultados para controle da qualidade e fins de liberação antes da liberação e do uso do produto. Um ensaio apropriado que pode ser realizado é um ensaio qPCR de DNA com primers de autoclave. Tal ensaio pode ser feito em duas horas. Os ensaios qPCR são extremamente sensíveis e podem ser usados para detectar uma ampla variedade de contaminantes patogênicos, por exemplo, contaminantes ambientais, microbianos e virais, bem como comensais comuns da pele. Os ensaios qPCR podem ser usados como ensaios de liberação de produto finais adjuvantes para detecção de contaminantes microbianos, além dos testes de coloração de Gram e de esterilidade USP. Os resultados do qPCR serão conhecidos antes da expedição do produto, desse modo impedindo que um produto potencialmente contaminado saia das instalações. Deve ser compreendido que o ensaio qPCR descrito no presente documento é exemplificador e que outros ensaios apropriados podem ser realizados em vez de ou além do mesmo, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, outros ensaios PCR e outros tipos de ensaios que podem ser realizados dentro da vida útil prolongada do produto final de RPE.

[00289] Inspeção de Pós-Expedição do Produto Final e Verificação de Viabilidade. Quando do recebimento no local clínico, o pessoal treinado irá apanhar o transportador externo, confirmar a informação correta de grupo e de lote e verificar sinais de danos ao transportador. Se o local clínico tiver a capacidade de realizar uma verificação de viabilidade das células, o tubo satélite que contém as células e o tubo que contém Tryptan Blue são removidos do refrigerador Chillette neste momento. Os tubos são transferidos ao laboratório de testes para verificação da viabilidade das células pós-expedição. Se a viabilidade celular estiver abaixo de 70%, o produto deve ser rejeitado.

[00290] Instruções para carregar a cânula de injeção. Somente antes do transplante em OR, as células são misturadas usando-se uma agulha rombuda e carregadas em uma seringa de injeção de 1 ml. O Produto (150 μl) é expelido através da cânula de injeção para o espaço sub-retinal. Tendo em vista que só há uma perda de célula nominal durante a expulsão da cânula em GS2, a densidade da célula do carregamento na seringa (2.000 células RPE viáveis^l) é a densidade aplicada com 150 μL injetados para uma dose de 300K.

EXEMPLO 6: Estabilidade da célula em GS2

[00291] A Figura 1 ilustra que as células RPE podem ser mantidas em HypoThermosol (BioLife Solutions, Inc., Bothell, WA, EUA) por 24 horas (mas não por 48 horas) sem nenhuma perda aparente na capacidade subsequente de chapeamento e crescimento em cultura.

[00292] As Figuras 2 a 5 ilustram a estabilidade de RPE em GS2 em 2 a 8°C. A Figura 2 mostra que as células RPE podem ser mantidas em GS2 por pelo menos 48 horas sem nenhuma perda aparente no número de células viáveis ou na capacidade subsequente de chapamento e crescimento na cultura. A Figura 3 mostra que as células RPE podem ser mantidas em GS2 por 4 a 5 dias somente com uma perda nominal na viabilidade celular e sem nenhuma diminuição significativa na densidade das células viáveis. A Figura 4 mostra que a capacidade da célula RPE de chapeamento e crescimento na cultura começa a diminuir após 5 dias em GS2 com armazenagem a frio. A Figura 5 mostra que o GS2 é compatível com o sistema de injeção atual.

EXEMPLO 7: Meio de Transplante GS2 - Efeito do Polímero Viscoelástico

[00293] O efeito de várias concentrações de um polímero viscoelástico na viabilidade da célula após a canulação foi avaliado. O lote a granel de células epiteliais de pigmento de retina (RPE) humanas foi manufaturado de acordo com procedimentos cGMP e criopreservado. No dia da experiência, os frascos foram descongelados e formulados. As células foram descongeladas em um instrumento DMEM (Gibco) pré-aquecido (37°C). As células foram então centrifugadas (5 minutos a 160 x g). Cada pélete foi ressuspenso em 40 ml de BSS Plus® (Alcon) à temperatura ambiente e centrifugada novamente. Os péletes foram então aglomerados em um tubo de centrífuga simples, ressuspensos em BSS Plus® à temperatura ambiente e divididas então em múltiplos tubos (4) antes da etapa final da rotação em 10 ml de volume por tubo. As células peletizadas foram colocadas em formulações de meios de transplante diferentes, chamadas GS2 TM.

[00294] O meio de transplante, GS2 TM, foi obtido ao combinar 5% de dextrose (0,9% de NaOH) em solução salina Braun NDC # 002647610-00 ou Baxter NDC # 0338-0089-04; (0,9% de NaOH) Baxter NDC # 0338-0049-11 salina; Solução de Irrigação BBS Alcon, NDC# 00650795-15; e ácido hialurônico ou hialuronato de sódio (HA), tal como Abbott Healon EndoCoat, NDC # 05047-4547-06; em um reservatório estéril e ao misturar os componentes em um agitador orbital. O pH foi medido e ajustado a um pH de 7,4 +/- 0,2 com a adição incremental de NaOH 0,1N antes da filtração estéril. Nesta experiência, foi obtido GS2 TM contendo uma concentração final de 0,15%, 0,1%, 0,05% ou 0% de ácido hialurônico (HA) da Healon EndoCoat (Abbott).

[00295] As células foram diluídas incrementalmente para obter densidades finais da célula sob armazenagem de cerca de 2.000 células por microlitro. Depois da reconstituição e da diluição em meios de transplante diferentes, frascos em triplicata das células foram produzidos para cada condição. Os frascos das células foram armazenados por 2 dias em um refrigerador a 2 a 8°C. Em seguida, os números das células foram determinados ao usar um hemocitômetro. As viabilidades das células foram acessadas pela exclusão de Trypan Blue. Os valores médios foram calculados a partir de tubos em triplicata de células que foram produzidas para cada condição, com as concentrações de células viáveis para cada tubo determinadas a partir de contagens em triplicata. A diferença no número de células antes e depois da extrusão através da cânula MedOne #3233, ou delta, foi calculada.

[00296] Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 6. As densidades médias de células viáveis dos tubos em triplicata ± desvios padrão são mostradas. As densidades de células RPE humanas foram determinadas ao usar um hemocitômetro. As viabilidades de células foram acessadas pela exclusão de Tryptan Blue. Os valores médios foram calculados a partir de tubos em triplicata das células que foram produzidas para cada condição, com as concentrações de células viáveis para cada tubo determinadas a partir das contagens em triplicata. A porcentagem de mudança (delta) nos números de células observados após a extrusão de célula através da cânula MedOne #3233 é mostrada acima de cada conjunto de valores, para cada condição.

[00297] Embora todas as concentrações de HA testadas exibissem valores da viabilidade de células incrementados após a canulação, a adição de 0,05% de HA foi determinada com sendo a preferível para a formulação dos meios de transplante. Menos perda de células após a extrusão de células RPE através da cânula de MedOne #3233 foi observada com GS2 TM que continha 0,05% de HA em relação a GS2 TM que foi obtido sem HA ou com 0,1% ou 0,15% de HA. De modo mais marcante, 10% menos de perda foi observado com a inclusão de 0,05% de HA em comparação a GS2 TM sem HA adicionado.

EXEMPLO 8: Meio GS2 - Efeito da Concentração de Glicose na Viabilidade de Células

[00298] O efeito de várias concentrações de um polímero viscoelástico na viabilidade de células após a canulação foi avaliado. Para esta finalidade, o lote a granel de células epiteliais de pigmento de retina (RPE) humanas NRPE-313 5C P2 foi manufaturado de acordo com os procedimentos de GMP e criopreservado. No dia da experiência, os frascos com as células descongeladas foram reconstituídos em um instrumento DMEM (Gibco) preaquecido (37°C). As células foram então centrifugadas (5 minutos a 160 x g). Cada pélete foi ressuspenso em 40 ml de BSS Plus® (Alcon) à temperatura ambiente e centrifugada outra vez. Os péletes foram então aglomerados em um tubo de centrífuga simples, ressuspensos em BSS Plus® à temperatura ambiente e divididas então em múltiplos tubos (6) antes de uma etapa de rotação final, com 10 ml de BSS Plus® por tubo.As células peletizadas foram colocadas em meios de transplante diferentes, GS2 TM.

[00299] Os meios de transplante, GS2 TM, foram obtidos ao combinar 5% de dextrose em solução salina (0,9% de NaOH); salina (0,9% de NaOH); e Solução de Irrigação Alcon BSS, NDC # 0065-079515; em um reservatório estéril e com misturação em um agitador orbital. O pH foi medido e ajustado a um pH de 7,4 +/- 0,2 com a adição incremental de NaOH 0,1N antes da filtração estéril. Os meios de GS2 TM para esta experiência foram obtidos com várias concentrações de glicose, tal como mostrado na Tabela 3 a seguir. O volume indicado é em mililitros: Tabela 3:

[00300] Uma vez formuladas nos vários meios de transplante GS2, as células foram diluídas incrementalmente para resultar em densidades finais da célula sob armazenagem de cerca de 2.000 células por microlitro. As células foram armazenadas então em frascos estéreis (Fischer) por 3 dias em um refrigerador a 2 a 8°C. Subsequentemente, os números de células viáveis foram determinados ao usar um hemocitômetro e cerca de 20,000 células viáveis por poço foram chapeadas em placas de cultura de tecido de 96 poços revestidas com gelatina (Stem Cell, Inc.) (COSTAR). As células foram cultivadas no meio do crescimento de RPE (EBM-2 com EGM2 Single Quots, Stem Cell, Inc., por exemplo, Lonza Cat. #: CC-3156, CC-4176) por 3 dias em uma incubadora com umidade controlada a 5% de CO2 a 37°C. As células foram removidas subsequentemente das placas ao usar 40μl/poço de 1:1 Tripsina (Sigma) e um Meio de Dissociação à base de HEPES (Gibco.) Meios contendo soro (40 μl/poço) foram usados para neutralizar a ação da tripsina, e as células foram tituladas com uma pipeta para a remoção e contadas ao usar um hemocitômetro. A Figura 7 mostra números médios de células RPE humanas por poço de seis poços para cada condição testada, ± desvios padrão. Cada concentração de glicose acarretou resultados realçados em comparação a um controle que não contém nenhuma glicose.

EXEMPLO 9: Viabilidade Realçada de Células-tronco Mesenquimais em meio GS2

[00301] A Figura 8 ilustra a viabilidade de células das células-tronco mesenquimais (MSCs) em meios de formulação diferentes. As MSCs derivadas de células-tronco embrionárias humanas foram cultivadas até 70% de confluência, colhidas, com 0,05% de tripsina, ressuspensos em aMEM + 15%FCS (meio MSC), e giradas a 200 x g por 5 minutos.As células peletizadas foram ressuspensas em um volume pequeno de meio MSC e foram contadas para a viabilidade ao usar a exclusão de Tryptan Blue. Cinco milhões de MSCs foram colocados em cada um de 4 tubos Eppendorf, girados e novamente suspensos em 1 ml de cada dos meios indicados. Os tubos foram colocados em um quarto frio a 4°C durante o período de tempo indicado. CS: soro canino; FBS: soro fetal de bovino. A Figura 8 ilustra que a formulação em GS2, com e sem soro, realça a viabilidade das células MSC e amplia o tempo de armazenagem de MSC.

[00302] A Figura 9 ilustra que uma densidade maior de células (mostrada em milhões de células por ml) realça a viabilidade de MSC quando armazenadas em GS2. Foi verificado que a presença do soro (aqui FBS) tem pouco efeito na viabilidade das células após a armazenagem em GS2 por 24 horas (seta).

[00303] A Figura 10 ilustra que a viabilidade de MSC é preservada após a armazenagem em GS2 a 4°C e a expulsão subsequente através de uma agulha 26G/seringa.

EXEMPLO 10: Certificado Exemplificador de Análise para o Meio de Transporte de GS2

[00304] Como parte do controle de qualidade, o presente meio de transporte destinado para o uso em pacientes humanos e/ou veterinários é indivíduo a uma bateria de testes destinados a maximizar a utilidade do meio como parte de um processo farmacêutico ou cirúrgico, e a minimizar o potencial de reações ou eventos adversos. Por exemplo, as endotoxinas são extremamente potentes, estáveis sob calor e passam pela maioria dos filtros de membrana de esterilização, e estão presentes em toda parte onde as bactérias estão ou estiveram presentes. As endotoxinas são de grande importância onde o meio de transporte deve ser usado para a aplicação localizada, tal como no espaço subretinal tal como pretendido quando usadas para formular células RPE para a injeção. Por conseguinte, as formulações de transporte de GS2 foram sujeitadas a uma bateria de testes, e foi demonstrado que satisfazem os critérios a seguir: EXEMPLO 11: Teste do Meio do Transporte Pelo Método de Obscurecimento de Luz

[00305] Também como parte do controle de qualidade, em particular para o uso das células formuladas para o uso em pacientes humanos, o meio de transporte da presente invenção será geralmente livre de uma quantidade inaceitável de matéria particulada. A matéria particulada consiste em partícula não dissolvidas móveis (isto é, que não são bolhas de gás) que, tipicamente, não podem ser quantificadas pela análise química devido à pequena quantidade de material que representa e é uma composição heterogênea. Quando testadas ao usar o método de obscurecimento da luz (processo de teste USP 788), isto é, que conta a matéria particulada com o uso de um contador eletrônico de partículas, foi demonstrado que as formulações de meios de transporte da presente invenção têm não mais do que 25 partículas > 10 micra no tamanho por ml do meio do transporte e não mais do que 3 partículas > 25 micra no tamanho por ml do meio de transporte.

[00306] USP 788 fornece os procedimentos para a determinação de matéria particulada, Método 1 (Teste de Contagem de Partículas com Obscurecimento da Luz) e Método 2 (Teste de Contagem de Partículas Microscópicas). Ao examinar o meio do transporte quanto às partículas subvisíveis, de preferência é aplicado o Método 1. No entanto, em alguns exemplos das presentes formulações, pode ser necessário testar as preparações pelo teste de contagem de partículas com obscurecimento da luz seguido pelo teste de contagem de partículas microscópicas para chegar a uma conclusão em conformidade com os requisitos.

[00307] Nem todas as preparações parenterais podem ser examinadas quanto às partículas subvisíveis por um ou ambos esses métodos. Quando o método 1 não for aplicável, por exemplo, no caso em que as preparações têm uma claridade reduzida ou uma viscosidade aumentada, o teste é realizado de acordo com o Método 2. Onde o meio de transporte inclui coloides ou lipossomas como componentes, trata- se de exemplos deste último. Similarmente, para as modalidades do meio de transporte que podem produzir bolhas de ar ou de gás quando extraídas para o sensor também podem requerer teste de contagem de partículas microscópicas. Embora as atuais modalidades preferidas do presente transporte não sejam excessivamente viscosas, se a viscosidade da preparação a ser testada for suficientemente elevada para impossibilitar o seu exame por um ou outro método de teste, uma diluição quantitativa com um diluente apropriado pode ser feita para diminuir a viscosidade, tal como necessário, para permitir que a análise seja executada.

[00308] Método USP 1. Teste de contagem de partículas com obscurecimento da luz. As amostras do meio de transporte de GS2, com e sem componentes de ácido hialurônico, foram testadas em um aparelho apropriado com base no princípio de bloqueio da luz que permite uma determinação automática do tamanho das partículas e do número das partículas de acordo com o tamanho. O aparelho foi calibrado ao usar dispersões de partícula esféricas de tamanhos conhecidos entre 10 μm e 25 μm, Padrão de Referência de Contagem de Partículas USP. Essas partículas padrão são dispersas em água livre de partículas. Foi tomado cuidado para evitar a agregação das partículas durante a dispersão. Os testes de matéria particulada foram realizados sob condições que limitam a matéria particulada, isto é, em um armário de fluxo laminar. Utensílios de vidro e equipamento de filtração foram lavados com muito cuidado e enxaguados. Imediatamente antes do uso, o equipamento foi enxaguado de cima para baixo, dentro e fora, com água livre de partículas. Ao usar um número de espécimes de teste adequados para prover uma avaliação estatisticamente fundamentada do meio de transporte que está sendo analisado, as amostras foram analisadas quanto ao número de partículas iguais a ou maiores do que 10 micra e 25 micra. Para cada uma das amostras de meio de transporte de GS2 testadas, as amostras incluíram < 25 partículas = > 10 micra no tamanho por ml do meio de transporte, e < 3 partícula = > 25 micra no tamanho por ml do meio de transporte.

EXEMPLO 12: Confirmação da Viabilidade e da Eficácia in vivo de Células RPE no Meio GS2

[00309] O objetivo deste consistia em avaliar e comparar a segurança, o enxertamento e a funcionalidade de 1) células do epitélio de pigmento da retina humanas (hRPE) derivadas da linhagem de células-tronco (ES) embrionárias MA09 formuladas em BSS PLUS® e transplantadas dentro de 4 horas; 2) células hRPE derivadas da linhagem de células ES J1 formuladas em BSS PLUS®; e 3) células hRPE derivadas da linhagem de células J1 formuladas no meio de transporte de GS2 e transplantadas (a) dentro de 22 a 28 horas e (b) dentro de 44 a 52 horas. Este estudo confirma que o meio GS2 amplia a vida útil do produto final em comparação ao meio de formulação clínica atualmente usado (BSS-PLUS).

[00310] Um total de 32 ratos juvenis do RCS (Royal College of Surgeon) (16 machos e 16 fêmeas) foi recebido para o estudo. Os ratos tinham entre 21 a 25 dias de idade no início da dosagem.

[00311] Período de aclimatação: Mínimo de 7 dias. O dia 1 corresponde ao dia da injeção subretinal.

[00312] Projeto Experimental: Oito ratos RCS (4/sexo) foram randomizados em quatro grupos de dose, MA09-hRPE (Grupo 1) e J1- hRPE (Grupos 2, 3, 4), cada um deles consistindo em três subgrupos (Tabela 1 a seguir). Todos os ratos receberam a injeção subretinal de células hRPE no olho direito (OD) através da via de administração transcleral sob anestesia. O Grupo 1 foi dosado com MA-09 hRPE em BSS PLUS® (dentro de 4 horas), o Grupo 2 foi injetado com células hRPE J1 em BSS Plus® (dentro de 4 horas), o Grupo 3 foi injetado com células hRPE J1 em GS2 (dentro de 22 a 28 horas) e o Grupo 4 foi injetado com células hRPE J1 em GS2 (dentro de 44 a 52 horas). Os subgrupos foram definidos pela dosagem do olho esquerdo; os subgrupos do simulacro (1/sexo) receberam somente uma picada de agulha no espaço subretinal do olho esquerdo; os subgrupos Sem Injeção (NI ou Não tratados) (1/sexo) não receberam nenhuma injeção no olho esquerdo; e os dois subgrupos de veículo (2/sexo) receberam uma injeção subretinal de GS2 ou do veículo BSS Plus. Os ratos foram submetidos à eutanásia em 70 a 80 dias após a injeção. Tabela 1 Projeto de Estudo Experimental

[00313] NI = Nenhuma injeção; Simulação = Perfuração do espaço subretinal com uma pipeta vazia.

[00314] BSSPLUS® = 2 μl de veículo (nenhuma célula); GS2 = 2 μl de veículo (nenhuma célula).

[00315] hRPE = 100.000 células em 2 μl de veículo de BSS PLUS® ou GS2.

[00316] Um resumo das medições em vida, da necropsia e dos pontos extremos de histopatologia para as avaliações que foram feitas é apresentado na Tabela 2 a seguir. Tabela 2 Parâmetros de Avaliação e Intervalos

[00317] BSS-PLUS® foi reconstituído no dia da dosagem tal como na etiqueta e armazenado refrigerado (2 a 8°C) para ser usado para diluir as células RPE durante a formulação, bem como para ser usado pelo cirurgião para encher o aparelho de injeção e para ser usado como um artigo de referência do veículo. Resumidamente, o conteúdo da Parte II de BSS PLUS® foram transferidos à Parte I de BSS PLUS® e usados para ressuspender as células RPE dentro de 6 horas da reconstituição. O tempo de reconstituição e de injeção foi documentado e mantido nos registros do estudo.

[00318] O lote de meio GS2 usado neste estudo foi formulado e armazenado a 2 a 8°C. O GS2 é usado à temperatura ambiente para lavar as células durante a formulação e de 2 a 8°C para a formulação final das células RPE, bem como para ser usado pelo cirurgião para encher o aparelho de injeção e como um artigo de referência do veículo a ser injetado.

[00319] Preparações de BBS-Plus: Células MA09-hRPE e J1-hRPE criopreservadas foram armazenadas em nitrogênio líquido (LN2) para manter as células na fase de vapor a temperaturas < 135°C. As células foram mantidas sob armazenagem em LN2 até o dia do processamento e transplante. No dia do transplante, as células hRPE criopreservadas foram descongeladas e formuladas em BSS-PLUS® a cerca de 50.000 célula viáveis/pl. As células hRPE concentradas foram entregues ao cirurgião em um Final Fill Tube colocado em gelo úmido em um refrigerador LabTop para serem usadas dentro de 4 horas da formulação (Figura 11, vide "MA-09 RPE < 4h" e "J1 RPE < 4h"). O tempo de reconstituição e de injeção foi documentado e mantido nos registros do estudo.

[00320] Preparações de GS2: Células J1-hRPE criopreservadas foram armazenadas em nitrogênio líquido (LN2) seco na fase de vapor a temperaturas < 135°C. As células foram mantidas sob armazenagem em LN2 até o dia do processamento. Um ou dois dias antes do transplante, as células J1-hRPE foram descongeladas e formuladas em GS2 a cerca de 1.500 célula viáveis/pl. As células RPE formuladas foram então armazenadas a 2 a 8°C e avaliadas quanto ao número de células viáveis depois de 2 a 6 horas após a formulação. Em cerca de 20 horas ou 42 horas após a formulação, as células RPE foram concentradas em GS2 até cerca de 50,000 células viáveis/pl. As células hRPE concentradas foram entregues ao cirurgião em um Final Fill Tube colocado em gelo úmido em um refrigerador LabTop. As células RPE foram transplantadas em cerca de 22 horas ou 44 horas após a formulação em GS2 (Figura 11, vide "J1 RPE < 22" e "J1 RPE < 44", respectivamente).

Administração da Dose: Injeção Sub-retinal

[00321] Os animais foram anestesiados com um coquetel de cetamina (75 mg/kg) e dexmedetomidina (0,25 mg/kg), seguidos por Carprofen (5 mg/kg) através de SQ para a administração da dose. Antes da dosagem, os olhos foram umedecidos com cloreto de sódio a 0,9% para a injeção (NaCl estéril) USP. Os olhos foram então limpos com duas gotas de uma solução oftálmica Ocuflux USP a 0,3% e dilatados com gotas midriáticas (tropicamida a 1%) seguidas pela solução oftalmológica de cloridreto de fenilefrina USP a 2,5%. Os itens de teste, células hRPE MA09 e J1 em BSS PLUS®, foram injetados dentro de 0,25 a 4 horas da formulação (Grupos 1 e 2, Tabela 1). O item de teste, células hRPE J1 em GS2, estavam dentro de 22 ou 44 horas da formulação (Grupos 3 e 4, Tabela 1). Os itens de teste para cada grupo (recebendo tanto células MA09-hRPE quanto células J1-hRPE) foram administrados por meio de injeção subretinal aos olhos direitos de 8 animais por grupo tal como indicado no projeto experimental acima (e na Tabela 1). Ao olho esquerdo de quatro animais em cada um dos Grupos 1 e 2 foi administrado o artigo de referência, BSS PLUS®. Ao olho esquerdo de quatro animais em cada um dos Grupos 3 e 4 foi administrado o item de da referência, GS2. O olho esquerdo de 2 animais em cada um dos quatro grupos foi sujeitado ao procedimento de injeção, mas nenhum material será injetado (injeção de simulação). Os olhos esquerdos dos dois animais restantes em cada um dos quatro grupos não receberam uma injeção (não tratados).

[00322] Resumidamente, as injeções subretinais foram aplicadas ao usar um microscópio cirúrgico. O olho foi estabilizado ao usar uma sutura (Ethicon 4-0 Perma-Hand Silk) atrás do equador do globo ocular ao usar um laço de cordão de bolsa em torno do globo ocular. Uma solução de hipromelose (ou similar) foi aplicada ao olho e mantida no lugar com um anel. Uma tesoura foi usada para cortar uma área pequena da conjuntiva e metal de uma agulha de metal calibre 30 G x ^" aplicada para realizar uma esclerotomia na região temporal dorsal superior do globo ocular. O aparelho de dosagem, que consiste em uma pipeta de vidro estéril calibrada (World Precision Instruments, Item # 1B150-4), conectada a uma tubulação de plástico Tygon™ com um furo de cerca de 0,8 mm (Saint-Gobain Performance Plastics # R-3603) conectada a uma agulha rombuda 18Ge (Becton-Dickenson, Inc. Referência # 305196) conectada a uma seringa Hamilton de 24 μl (Modelo #702 LT Catálogo #804010 pré-carregada com o veículo apropriado tal como descrito no projeto do estudo (Tabela 1). Uma pequena quantidade de ar foi introduzida na linha para separar o material a ser injetado do veículo no aparelho de dosagem depois do que os itens de teste ou de referência foram extraídos para a pipeta de vidro a um volume de 2 μl. Uma pipeta de vidro estéril nova foi usada para cada injeção/olho.

[00323] A esclerotomia foi suturada com uma sutura cirúrgica não absorvível (Ethicon Prolene 10-0). A sutura (Ethicon 4-0 Perma-Hand Silk®) em torno do globo ocular foi removida e a pálpebra foi por fim retornada a uma posição normal. Antibióticos tópicos (5 mg/g de pomada oftálmica de eritromicina) foram aplicados aos olhos tratados depois da conclusão do procedimento de injeção.

[00324] Durante a cirurgia, desenhos cuidadosos do fundo intraoperativo para registrar o tamanho e a posição da bolha, bem como algumas outras mudanças oculares.

[00325] Os animais foram mantidos em uma placa de aquecimento ou sob um cobertor de aquecimento (~37°C) até serem recuperados completamente, depois do que foram retornados à sua gaiola nativa. Administrações adicionais de 0,5% de pomada oftálmica de eritromicina serão aplicadas tal como necessário na superfície do olho para impedir a desidratação até que o animal esteja totalmente desperto e pode piscar normalmente.

[00326] Todos os animais foram mantidos sob a administração oral de ciclosporina A (CsA) na água de beber (210 g/l, resultando em uma concentração de sangue visada de cerca de 300 g/l). Uma injeção intraperitoneal de dexametasona também foi aplicada uma vez ao dia por 14 dias (1,6 mg/kg/dia) após a cirurgia.

[00327] As observações do lado da gaiola quanto à mortalidade/definhamento e a observação clínica foram feitas pelo menos uma vez ao dia. Não havia nenhum sinal clínico da doença ou da reação ao tratamento. Os animais foram pesados pelo menos uma vez durante a aclimatação e quase que semanalmente durante o estudo e imediatamente antes da necropsia (peso terminal). Nenhuma mudança excepcional no peso do corpo foi observada para os animais do estudo. Os exames do olho foram realizados na pré-dose, em cerca de 40 dias e outra vez antes da necropsia. Os olhos dos animais foram dilatados para o exame ao usar tropicamida a 1% instilada como 1 gota/olho. Não havia nenhuma diferença aparente revelada a partir dos exames oftálmicos entre os vários grupos de formulação de RPE. Do mesmo modo, a resposta optocinética (OKR) foi realizada ao usar listras moveis de frequência espacial variada que será medida para todos os animais descritos em tempos na Tabela 2. A acuidade visual foi medida por OKR em todos os olhos, experimentais e de controle. O método a ser usado, um aparelho de teste da optometria (Prusky et al., 2000), consiste em um cilindro rotativo coberto com uma grade de onda senoidal vertical, apresentado no espaço tridimensional (3-D) virtual em quatro monitores de computador arranjados em um quadrado. Os ratos foram colocados sem restrições em uma plataforma no centro do quadrado, onde acompanharam a grade com movimentos da cabeça reflexivos. A frequência espacial da grade foi marcada na posição de visualização ao recentralizar repetidamente o 'cilindro' na cabeça do indivíduo sob teste. A acuidade visual foi quantificada ao aumentar a frequência espacial da grade ao usar uma progressão de escadaria psicofísica até o reflexo optocinético ser perdido, obtendo desse modo um limite máximo. As medições foram feitas em c/d (ciclo/grau). Não havia nenhuma diferença aparente revelada a partir das experiências de OKR entre os vários grupos de formulação de RPE. A tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) também foi executada, tal como acima, e não havia nenhuma diferença aparente revelada a partir dos exames oftálmicos entre os vários grupos de formulação de RPE. Os ratos foram anestesiados através de injeção IP de agentes anestésicos. Tropicamida foi aplicado a ambos os olhos para dilatar as pupilas para a formação de imagem da retina. Os ratos foram colocados no sistema de formação de imagem, colírios de Genteal e Systane foram aplicados às córneas para manter as córneas úmidas.

[00328] A Figura 11 mostra os resultados dos eletroretinogramas (ERG) 60 dias após o tratamento para um grupo de 16 dos ratos. Tal como acima, não havia nenhuma diferença aparente revelada a partir dos exames de ERG entre os vários grupos de formulação de RPE. Resumidamente, os animais foram mantidos no escuro total durante toda a noite (pelo menos 12 horas) para obter o estado adaptado ao escuro da retina. Para registrar o ERG, o animal foi anestesiado com injeção IP do agente anestésico e foi colocado em um suporte de cabeça estereotáxico. Sob uma iluminação vermelha não ofuscante, o eletrodo de gravação (dois laços de arame coaxiais, diâmetros de fio de 50 μm, unidos à lente de contato neutra) foi colocado no olho do animal previamente tratado com lidocaína. Um membro traseiro foi tosado com tosquiadeiras elétricas e a pele foi preparada com betadina antes de inserir uma cânula (a cânula será encaixada no músculo do membro traseiro durante o período do procedimento). A pupila foi dilatada com Tropicamida. Antes de começar as gravações, um período de 1 hora adicional de adaptação ao escuro foi usado para restaurar a adaptação em relação às preparações animais. Toda a gravação de ERG dura cerca de 20 minutos para ambos os olhos (os olhos serão testados em sequência da esquerda para a direita, ou da direita para a esquerda). O olho foi estimulado com flashes de luz de campo integral. Os potenciais da córnea foram gravados com o amplificador conectado ao eletrodo. As apresentações com flash foram controladas com um programa de computador. As respostas foram calculadas na média para 5 a 100 apresentações do estímulo, dependendo da intensidade de ERG, que pode ser muito baixa nos animais com degeneração de retina progressiva.

[00329] Em resumo, os resultados desses estudos indicam que o meio de transporte de GS2 fornecem doses mais ou menos igualmente eficazes de células RPE viáveis e funcionais até mesmo depois de até 44 horas de suspensão no meio de transporte de GS2 quando comparado ao meio BSS Plus após a suspensão por menos de 4 horas - esta última é a vida útil atualmente aprovada pelo FDA e pelo EMA para o uso de BSS-Mais para de injeções de células RPE. Em cada caso, como controles, os olhos de simulação e não tratados dos animais não mostraram nenhuma melhoria em comparação aos olhos tratados com células RPE nos grupos de meios de transporte de BSS-Plus e GS2.

EQUIVALENTES E ÂMBITO, INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[00330] Os elementos versados na técnica irão reconhecer, ou poderão verificar, ao usar não mais do que a experimentação rotineira, muitos equivalentes das modalidades descritas no presente documento. O âmbito da presente invenção não deve ficar limitado à descrição acima, mas, ao invés disto, é tal como indicado nas reivindicações anexas.

[00331] Artigos tais como "um", "uma" e "o/a" incluem a referência singular e plural a menos que o contexto indique claramente de alguma outra maneira. Desse modo, por exemplo, uma referência a "um agente" inclui um único agente e uma pluralidade de tais agentes.

[00332] As reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre dois ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitos se um, mais de um, ou todos os membros do grupo estiverem presentes, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira ou então seja evidente a partir do contexto. A divulgação de um grupo que inclui "ou" entre dois ou mais membros do grupo provê modalidades em que exatamente um membro do grupo está presente, modalidades em que mais do que os membros de um do grupo estão presentes, e modalidades em que todos os membros do grupo estão presentes. Para finalidades de abreviação, essas modalidades não foram apresentadas individualmente no presente documento, mas deve ser compreendido que cada uma destas modalidades é provida no presente documento e pode ser especificamente reivindicada ou renunciada.

[00333] Deve ser compreendido que a invenção abrange todas as variações, combinações e permutações em que uma ou mais limitações, elementos, cláusulas ou termos descritivos, de uma ou mais das reivindicações ou uma ou mais partes relevantes da descrição, são introduzidos em uma outra reivindicação. Por exemplo, uma reivindicação que é dependente de uma outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais das limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que é dependente da mesma reivindicação base. Além disso, onde as reivindicações recitam uma composição, deve ser compreendido que os métodos de produção e uso da composição de acordo com qualquer um dos métodos de produção ou uso divulgados no presente documento ou de acordo com os métodos conhecidos no estado da técnica, se houver algum, são incluídos, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira ou menos que seja evidente a um elemento versado no estado da técnica que deve surgir uma contradição ou uma inconsistência.

[00334] Onde os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato do grupo de Markush, deve ser compreendido que cada subgrupo possível dos elementos também é divulgado, e que qualquer elemento ou subgrupo de elementos pode ser removido do grupo. Também deve ser observado que o termo "que compreende" deve ser aberto e permitir a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Deve ser compreendido que, de modo geral, onde uma modalidade, um produto ou um método são indicados como compreendendo elementos, características, ou etapas, modalidades, produtos, ou métodos particulares que consistem em, ou consistem essencialmente em tais elementos, características ou etapas, também são providos. Para finalidades de abreviação, as modalidades não foram apresentadas individualmente no presente documento, mas deve ser compreendido que cada uma dessas modalidades é provida no presente documento e pode ser especificamente reivindicada ou renunciada.

[00335] Onde são providas faixas, os pontos extremos são incluídos. Além disso, deve ser compreendido que, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira ou então evidente a partir do contexto e/ou da compreensão de um elemento versado no estado da técnica, os valores que são expressos como faixas podem assumir qualquer valor específico dentro das faixas indicadas em algumas modalidades, ao décimo da unidade do limite inferior da faixa, a menos que o contexto dite claramente de alguma outra maneira. Para finalidades de abreviação, os valores em cada faixa não foram apresentados individualmente no presente documento, mas deve ser compreendido que cada um desses valores é provido no presente documento e pode ser especificamente reivindicado ou renunciado. Também deve ser compreendido que, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira ou então evidente a partir do contexto e/ou da compreensão de um elemento versado no estado da técnica, os valores expressos como faixas podem assumir qualquer subfaixa dentro da faixa em questão, em que os os pontos extremos da subfaixa são expressos ao mesmo grau de exatidão que o décimo da unidade do limite inferior da faixa.

[00336] Além disso, deve ser compreendido que qualquer modalidade particular da presente invenção pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Onde as faixas são fornecidas, qualquer valor dentro da faixa pode ser explicitamente excluído de qualquer uma ou mais das reivindicações. Qualquer modalidade, elemento, característica, aplicação ou aspecto das composições e/ou dos métodos da invenção podem ser excluídos de qualquer uma ou mais reivindicações. Para finalidades de abreviação, todas as modalidades em que um ou mais elementos, características, finalidades ou aspectos são excluídos não são apresentadas explicitamente no presente documento.

[00337] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, publicações, e entradas de bancos de dados (por exemplo, entradas de bancos de dados da sequência) mencionadas no presente documento, por exemplo, na seções Antecedentes, Descrição Resumida, Descrição Detalhada, Exemplos e/ou Referências, são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade tal como se cada publicação, patente, pedido de patente, publicação, e entrada em banco de dados individuais fossem incorporadas específica e individualmente no presente documento a título de referência. No caso de conflito, o presente pedido de patente, incluindo todas as definições no presente documento, irá prevalecer.

Claims

1. Solução, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 0,5 a 0,9 mM de CaCl2 (cloreto de cálcio), 0,2 a 0,4 mM de MgCl2 (cloreto de magnésio), 1 ,6 a 2,4 mM de KCl (cloreto de potássio), 0,8 a 1,2 mM de citrato de sódio, 13 a 19 mM de dextrose, e 116 a 174 mM de NaCl (cloreto de sódio); ou (b) 0,68 a 1,02% de NaCl (cloreto de sódio) em peso/volume, 0,008 a 0,012% de CaCl2 di-hidratado (cloreto de cálcio di- hidratado) em peso/volume, 0,012 a 0,018% KCl (cloreto de potássio) em peso/volume, 0,0048 a 0,0072% MgCl2 hexa-hidratado (cloreto de magnésio hexa-hidratado) em peso/volume, 0,028 a 0,042% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume, e 0,23 a 0,35% de dextrose em peso/volume; ou (c) 0,1 a 1,2 mM de CaCl2, 0,05 a 5 mM MgCl2, 1 a 2,5 mM de KCl, 0,5 a 2 mM de citrato de sódio, 15 a 17 mM de dextrose, e 125 a 175 mM de NaCl.

2. Solução, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 0,7 mM de CaCl2, 0,3 mM de MgCl2, 2 mM de KCl, 1 mM de citrato de sódio, 16 mM de dextrose, e 145 mM de NaCl; ou (b) 0,85% de NaCl em peso/volume, 0,01% de CaCl2 di-hidratado em peso/volume, 0,015% de KCl em peso/volume, 0,006% de hexahidrato de MgCl2 em peso/volume, 0,035% de citrato de sódio di-hidratado em peso/volume, e pelo menos 0,25% de dextrose; ou (c) 0,9 mM de CaCl2, 0,3 mM de MgCl2, 2 mM de KCl, 1,2 mM de citrato de sódio, 15 mM de dextrose, e 145 mM de NaCl.

3. Solução, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zada pelo fato de que compreende ainda: (a) um polímero viscoelástico, opcionalmente em que a concentração do polímero é de 0,005 a 5% em peso/volume, 0,01 a 0,05% em peso/volume, ou 0,05% em peso/volume, opcionalmente em que o polímero é ácido hialurônico ou um sal do mesmo, ainda, opcionalmente em que o polímero é hialuronato de sódio; e/ou (b) acetato de sódio.

4. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a solução pode ser: a) armazenada durante pelo menos 48 horas a 25°C sem precipitação mensurável de solutos e/ou perda mensurável da capaci-dade da solução em suportar a sobrevivência e a viabilidade de células armazenadas na solução; e/ou b) armazenada durante pelo menos 48 horas a 2 a 8°C sem precipitação mensurável de solutos e/ou perda mensurável da capaci-dade da solução em suportar a sobrevivência e a viabilidade de células armazenadas na solução.

5. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma população de células, opcionalmente em que a população de células: (a) é adequada para transplante em um indivíduo, ainda, opcionalmente adequada para transplante no olho de um indivíduo; (b) compreende células RPE; (c) compreende células fotorreceptoras; e/ou (d) compreende células mesenquimais.

6. Método para preparar uma preparação compreendendo uma população de células em uma solução, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma população de células com a solução, opcionalmente em que o método compreende o contato de uma população de células criopreservadas ou peletizadas com a solução, reconstituindo assim as células.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda armazenar a preparação de células por pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 36, pelo menos 60, pelo menos, ou pelo menos 72 horas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que após o armazenamento, a preparação de células é adequada para administração a um indivíduo, opcionalmente, em que a referida administração deve compreender a injeção da preparação celular no olho de um indivíduo.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células em uma solução, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a população de células é uma população de células RPE, células fotorreceptoras, ou células mesenquimais.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a população de células é uma população de células RPE ou células fotorreceptoras.

11. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é para uso em medicina, opcionalmente em que: (i) o uso compreende administrar a solução ou a composição farmacêutica a um olho de um indivíduo, opcionalmente em que o indivíduo tem uma doença retiniana; (ii) o uso compreende administrar a solução ou a composição farmacêutica a um indivíduo após armazenamento da preparação durante pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 24, pelo menos 36, ou pelo menos 48 horas, opcionalmente em que o indivíduo tem uma doença retiniana; (iii) a solução é adequada para administração a um indivíduo, adequada para administração no olho de um indivíduo, e/ou adequada para transplante de células em um olho de um indivíduo, opcionalmente em que o indivíduo tem uma doença retiniana; (iv) a solução é essencialmente isenta de pirogênio; (v) a solução é estéril; e/ou (vi) a solução é para irrigação, reconstituição celular, arma-zenamento celular, transporte celular e/ou administração a um indivíduo, opcionalmente em que o indivíduo tem uma doença retiniana.

12. Preparação celular produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um indivíduo com uma doença retiniana, em que a doença retiniana é distrofia de bastonetes ou cones, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, dege-neração macular, amaurese congênita de Leber ou doença de Stargardt.

13. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a solução, como definida em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 4; (b) instruções para contatar uma população de células com a solução de (a) para gerar uma preparação celular; e (c) um recipiente para o contato de (b) e/ou para armazenar a preparação de células de (b), opcionalmente em que a solução de (a) e o recipiente são adequados para uso da preparação celular de (b) para transplante para um indivíduo.

14. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma população celular com a solução como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 10, gerando assim uma preparação celular, compreendendo ainda (b) armazenar a preparação celular de (a) pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 12, pelo menos 18, pelo menos 24, pelo menos 36, pelo menos 48, pelo menos 60, ou pelo menos 72 horas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (i) determinar a viabilidade celular na preparação celular de (a) após o período de armazenamento de (b), e/ou (ii) refrigeração da preparação celular de (a) durante o período de armazenamento da etapa (b), opcionalmente em que a refrigeração compreende o armazenamento da preparação celular a uma temperatura de 2 a 8°C.

16. Uso de uma solução, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição, medicamento ou kit para o tratamento de uma doença da retina, em que a doença da retina é distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber, ou doença de Stargardt.

17. Preparação celular produzida pelo método, como definido na reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um indivíduo tendo uma doença retiniana, em que a doença retiniana é distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber, ou doença de Stargardt.

18. Uso de uma preparação celular produzida pelo método como definido na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição, medicamento ou kit para o tratamento de uma doença retiniana, em que a doença retiniana é distrofia de bastonete ou cone, degeneração da retina, retinite pigmentosa, retinopatia diabética, degeneração macular, amaurose congênita de Leber, ou doença de Stargardt.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a preparação celular é adequada para injeção no olho de um indivíduo.