TW202416830A - 細胞冷凍保存調配物及使用方法 - Google Patents

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莎曼沙 珍 保羅森
小島宏行
蜂谷翔平
井上敦
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美商安斯泰來再生醫藥協會
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Abstract

本發明之一些態樣提供改良之冷凍保存調配物及用於冷凍保存及解凍細胞之改良方法。此等調配物有助於高密度、低體積細胞冷凍保存策略，其克服洗滌解凍後細胞之需求，且因此導致更大之細胞恢復及存活率。亦提供包含細胞群體及如本文所提供的冷凍保存調配物之醫藥組合物。亦提供用於治療患有受益於經冷凍保存且經解凍之細胞群體移植之疾病或病狀的個體之方法。

Description

細胞冷凍保存調配物及使用方法
有效細胞冷凍保存係許多細胞療法策略之一個重要態樣。冷凍、儲存各種時間期及視需要在冷凍狀態下運輸基於細胞之療法之能力擴大其臨床用途。不當的冷凍保存可導致細胞損傷，包括細胞特徵、功能、代謝活性及細胞死亡之變化。
冷凍保存基於細胞之治療劑之能力使得細胞療法之製造及臨床用途在時間及地點上脫鉤。適宜冷凍保護劑調配物之設計及選擇對於確保細胞存活及維持功能很重要。本發明提供可用於冷凍保存且視需要運輸細胞群體(包括彼等意欲用作治療劑者)之新穎冷凍保護調配物。重要的是，本發明審慎考慮使用此類調配物以高密度且以低體積冷凍保存細胞群體，使得藉由添加稀釋劑達成後續解凍，接著投與至個體，而無需在解凍後洗滌該等細胞。依此方式，該等方法允許以最少處理及操縱冷凍及解凍基於細胞之治療劑。此減少可由於解凍後期中細胞之操縱所致之細胞損失(例如細胞死亡)之可能性。
因此，本發明提供冷凍保護調配物及其使用方法。該等冷凍保護調配物可與多種細胞類型一起使用。與用於冷凍細胞之先前技術方法及市售冷凍保護調配物相比，本文所提供的冷凍保護調配物導致更大之解凍後存活率及細胞生長。雖然本文列舉眼科應用，但本發明亦審慎考慮及涵蓋其他應用。
本發明之一些態樣提供包含約4至10% (v/v)冷凍保護劑、約2至8% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖及緩衝液之調配物。
在一些實施例中，該冷凍保護劑係選自DMSO、甘油及乙二醇。
在一些實施例中，該冷凍保護劑為DMSO。
在一些實施例中，該調配物包含約4至6% (v/v)冷凍保護劑。
在一些實施例中，該調配物包含約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖。
在一些實施例中，該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約2.5% (w/v)白蛋白、約0.09% (w/v)葡萄糖及緩衝液。
在一些實施例中，該調配物包含約0.6% (w/v)葡萄糖。
在一些實施例中，該調配物包含約5% DMSO、約2.5%白蛋白、約0.6%葡萄糖及緩衝液。
在一些實施例中，白蛋白為人類白蛋白。
在一些實施例中，白蛋白為重組人類白蛋白。
在一些實施例中，該緩衝液為緩衝鹽水。
在一些實施例中，該緩衝液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在一些實施例中，該緩衝鹽水包含Ca2+及Mg2+。
在一些實施例中，該緩衝鹽水不包含Ca2+及Mg2+。
在一些實施例中，該調配物進一步包含細胞群體或組織。
在一些實施例中，該細胞群體為解離細胞群體。
在一些實施例中，該細胞群體包含細胞單層、細胞層片、細胞簇、細胞球體或細胞聚集體。
在一些實施例中，該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
在一些實施例中，該調配物經冷凍保存。
在一些實施例中，該調配物不包含聚合物賦形劑。
在一些實施例中，該調配物不包含聚葡萄糖。
本發明之一些態樣提供包含(a)本文所述的調配物及(b)細胞群體之細胞製劑。
在一些實施例中，該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
在一些實施例中，該細胞群體為約300個細胞至1000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。在一些實施例中，該細胞群體為約300個細胞至10000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。在一些實施例中，該細胞群體為約1000個細胞至10000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。
在一些實施例中，該細胞群體為約3,000個細胞至5,000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中或為約3,000個細胞至4,000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。
在一些實施例中，該細胞群體為約10,000個細胞至100000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。
在一些實施例中，該細胞群體為約15,000個細胞至150000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。
在一些實施例中，該細胞群體為約15,000至50,000個細胞/µL之濃度含在細胞製劑中。
在一些實施例中，本文所述的細胞製劑係含在冷凍保存小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中。
在一些實施例中，約10至約500 µL之該製劑係含在該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中。
在一些實施例中，小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至約10 7個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約4 x 10 5個細胞至約5 x 10 5個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約4.5 x 10 5個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約1 x 10 6個細胞至約2 x 10 6個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約1.5 x 10 6個細胞。在此等實施例中，該等細胞為RPE細胞。注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中可存在類似的細胞數量。
在一些實施例中，小瓶中存在約0.5 x 10 6個細胞至約1.5 x 10 6個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約1 x 10 6個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約5 x 10 6個細胞至約7 x 10 6個細胞。在一些實施例中，小瓶中存在約6 x 10 6個細胞。在此等實施例中，該等細胞為PRC細胞。注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中可存在類似的細胞數量。
在一些實施例中，該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至5 x 10 6個細胞。
在一些實施例中，該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至2 x 10 6個細胞。
在一些實施例中，該細胞製劑係經冷凍保存。
本發明之一些態樣提供製備細胞製劑之方法，其包括使本文所述的調配物與細胞群體接觸。
在一些實施例中，本文所述的方法進一步包括冷凍保存該細胞製劑。
在一些實施例中，該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
本發明之一些態樣提供治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括解凍本文所述的細胞製劑及投與該細胞製劑至該個體。
本發明之一些態樣提供治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括解凍本文所述的細胞製劑，用稀釋劑以在1:2至1:20範圍內之比率(包括選自由1:2、1:3、1:4及1:5組成之群之比率)或1:10至1:15 (包括1:10、1:11、1:12、1:13、1:14及1:15)之比率稀釋該細胞製劑，及將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。
在一些實施例中，該病症或病狀係選自由視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕(Angioid streak)、近視性黃斑退化(Myopic Macular Degeneration)、或視網膜萎縮組成之群或與導致光受體損傷及失明之許多視力改變疾病諸如(例如)無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(Stargardt’s Disease) (眼底黃色斑點症(fundus flavimaculatus))相關聯。
在一些實施例中，該稀釋劑為GS2、GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM或白蛋白。
本發明之一些態樣提供治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括解凍本文所述的該細胞製劑，用稀釋劑以在1:2至1:20範圍內之比率(包括選自由1:15、1:16、1:17、1:18及1:19組成之群之比率)稀釋該細胞製劑，及將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。
在一些實施例中，該病症或病狀係選自由視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕、近視性黃斑退化、或視網膜萎縮組成之群或與導致光受體損傷及失明之許多視力改變疾病諸如(例如)無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)相關聯。
在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM或白蛋白。
本發明之一些態樣提供套組，其包括含(a)本文所述的經冷凍保存的細胞製劑、(b)稀釋劑及(c)用於在投與至個體之前稀釋該細胞製劑之說明書。
在一些實施例中，該等說明書進一步包含用於解凍該經冷凍保存的細胞製劑之說明書。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的調配物與細胞群體之組合。
在一些實施例中，該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
在一些實施例中，該細胞群體包含神經細胞、神經幹細胞或神經前驅細胞。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的調配物之醫藥組合物，其中該醫藥組合物適合於投與至個體。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的調配物及稀釋劑之醫藥組合物，其中該調配物與稀釋劑比率係在1:2至1:100 (包括1:2至1:20，包括1:2至1:5，包括1:2、1:3、1:4、1:5)範圍內或為1:10至1:15 (包括1:10、1:11、1:12、1:13、1:14及1:15)之比率，其中該醫藥組合物適合於投與至個體。
在一些實施例中，該醫藥組合物適合於投與至眼睛。
在一些實施例中，該醫藥組合物適合於投與至視網膜下(subretina)。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的細胞製劑之醫藥組合物，其中該醫藥組合物適合於投與至個體。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的細胞製劑及稀釋劑之醫藥組合物，其中該細胞製劑與稀釋劑比率係在1:2至1:100 (包括1:2至1:20，包括1:2至1:5，包括1:2、1:3、1:4、1:5)範圍內或為1:10至1:15 (包括1:10、1:11、1:12、1:13、1:14及1:15)之比率，其中該醫藥組合物適合於投與至個體。
在一些實施例中，該醫藥組合物適合於投與至眼。
在一些實施例中，該醫藥組合物適合於投與至視網膜下。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的調配物之細胞製劑，其中該調配物包含細胞群體，其中該細胞群體適合於投與至個體。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的調配物及稀釋劑之細胞製劑，其中該調配物與稀釋劑比率係在1:2至1:100 (包括1:2至1:20，包括1:2至1:5，包括1:2、1:3、1:4、1:5)之範圍內或1:10至1:15 (包括1:10、1:11、1:12、1:13、1:14及1:15)之比率，其中該調配物包含細胞群體，其中該細胞製劑適合於投與至個體。
在一些實施例中，該細胞製劑適合於投與至眼睛。
在一些實施例中，該細胞製劑適合於投與至視網膜下。
在一些實施例中，該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前或之後未經洗滌。
在一些實施例中，該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前或之後未經離心。
在一些實施例中，該醫藥組合物或該細胞製劑未經稀釋(例如在投與至個體之前未經稀釋)。
在一些實施例中，該調配物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前經冷凍保存。
在一些實施例中，DMSO係以等於或小於約1% (v/v)之水準之可偵測量存在。
在一些實施例中，DMSO係以等於或小於約0.037 mg/劑量之水準之可偵測量存在。
本發明之一些態樣提供包含本文所述的調配物及細胞群體之細胞製劑，其中該細胞群體藉由用稀釋劑稀釋解凍且未經洗滌。
在一些實施例中，該細胞製劑係用稀釋劑以選自由1:2至1:100 (包括1:2至1:20，包括1:2至1:5，包括1:2、1:3、1:4、1:5)組成之群之比率或以1:10至1:15 (包括1:10、1:11、1:12、1:13、1:14及1:15之比率稀釋。
在一些實施例中，DMSO係以等於或小於約0.037 mg/劑量之水準之可偵測量存在。
在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。
以上概述旨在以非限制性方式說明本文所揭示的技術之一些實施例、優點、特徵及用途。將自實施方式、圖式、實例及申請專利範圍明白本文所揭示的技術之其他實施例、優點、特徵及用途。
相關申請案
本申請案依35 U.S.C. § 119(e)主張2022年12月7日申請之題為「CELL CRYOPRESERVATIVE FORMULATIONS AND METHODS OF USE」之美國臨時申請案序號63/430,976及2022年8月23日申請之題為「CELL CRYOPRESERVATIVE FORMULATIONS AND METHODS OF USE」之美國臨時申請案序號63/400,382之權益，各案之全部內容係以引用之方式併入本文中。
基於細胞之療法(包括彼等涉及細胞之移植者)例如在再生醫學方法之情形中經常需要調配、儲存、運輸及/或注射可在不適當之處置、廣泛操縱及/或處理步驟或曝露至非生理條件後受到損傷或喪失再生能力(repopulation capacity)之精緻或脆弱細胞。
本發明提供用於細胞冷凍保存、細胞儲存、細胞運輸及最終至個體之細胞投與之調配物及方法，其對細胞進行最少處理及操縱，且增加解凍後存活率。本文所提供的調配物具有優於目前可用之調配物之若干優點。例如，與目前可用之冷凍保存調配物相反，本文所提供的調配物需要最小解凍後處理，且可連同治療劑一起投與至個體且具有(若有的話)很小不良效應(諸如毒性)。本文所提供的調配物允許以高密度以低體積冷凍保存，此提供許多優點，包括僅需要單一步驟添加稀釋劑之解凍方案。由於在解凍後不需要將該調配物洗去，因此細胞損失及細胞損傷之機會較小，從而增加經冷凍保存的細胞製劑之治療功效。目前可用之冷凍保護劑及冷凍保護調配物需要廣泛細胞處理程序，其可能係昂貴、耗時、易於發生人為錯誤，且最終可減少其中所含細胞之細胞存活、再植板效率(re-plating efficiency)及再生能力。此外，值得注意的是，與先前技術冷凍保存調配物及方法相比，已觀察到使用本文所提供的調配物冷凍保存的細胞群體之增加之存活率。當使用本文所提供的調配物時，亦已觀察到改良之解凍後細胞生長。本文所提供的調配物可提供細胞群體之改良之功能性、存活期及穩定性。
除了前述優點外，本發明之冷凍保存調配物亦驚人地且意外地與培養物中(特別是RPE細胞培養物中)多核細胞之降低之頻率(或流行率)相關。已使用其他調配物觀察到多核細胞，諸如多核RPE細胞。然而，驚人地，本文所提供的冷凍保存調配物似乎降低此類細胞之頻率。
本發明提供最小化地包含冷凍保護劑及白蛋白之新穎冷凍保護調配物。在某些實施例中，該等冷凍保護調配物最小化地包含冷凍保護劑、白蛋白及視需要之糖。該冷凍保護劑可為DMSO、甘油、乙二醇、海藻糖或牛磺酸。在一些實施例中，該冷凍保護劑為DMSO。該白蛋白可為人類白蛋白。該糖可為葡萄糖。該調配物可進一步包含緩衝液或緩衝鹽水，諸如(但不限於)磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。該調配物可具有為約生理pH (例如在6至8範圍內)之pH。該冷凍保護劑可以約1%至約10%體積/體積(v/v)之範圍存在。該冷凍保護劑可以約2%至約10%體積/體積(v/v)之範圍存在。該冷凍保護劑可以約3%至約10%體積/體積(v/v)之範圍存在。該冷凍保護劑可以約4%至約10%體積/體積(v/v)之範圍(例如4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%)存在。該白蛋白可以約2%至約3% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約2%至約10% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約2%至約8% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約2%至約7.5% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約3.5%至約7.5% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約4%至約7.5% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約4%至約8% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約4%至約8.5% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約4%至約9% (w/v)之範圍存在。該白蛋白可以約4%至約10% (w/v)之範圍存在。該糖可以約0至約1.5% (w/v)之範圍存在。
在一些實施例中，該冷凍保存調配物包含約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、約0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。該調配物可基本上由約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、約0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。該調配物可由約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、約0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。該白蛋白可為人類白蛋白，包括重組人類白蛋白。該緩衝鹽水可為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在一些實施例中，該冷凍保存調配物包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。在一些實施例中，該冷凍保存調配物基本上由約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。在一些實施例中，該冷凍保存調配物由約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。該白蛋白可為人類白蛋白，包括重組人類白蛋白。該緩衝鹽水可為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。表1及圖1說明放置在包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%重組白蛋白(w/v)及約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)於具有鈣及鎂之PBS中之調配物中之RPE細胞具有超過96%之存活率。當將該等細胞在此等調配物中冷凍且然後解凍，其存活率在94至98%範圍內。在此等調配物中，解凍後細胞生長亦相對均勻。
在一些實施例中，該冷凍保存調配物包含約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、約0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。該調配物可基本上由約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、約0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。該調配物可由約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、約0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。該白蛋白可為人類白蛋白，包括重組人類白蛋白。該緩衝鹽水可為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在一些實施例中，該冷凍保存調配物包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。在一些實施例中，該冷凍保存調配物基本上由約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。在一些實施例中，該冷凍保存調配物由約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水組成。該白蛋白可為人類白蛋白，包括重組人類白蛋白。該緩衝鹽水可為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。表1及圖1說明放置在包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%重組白蛋白(w/v)及約0.08%至約0.1%葡萄糖(w/v)於具有鈣及鎂之PBS中之調配物中之RPE細胞具有超過96%之存活率。當將該等細胞在此等調配物中冷凍且然後解凍，其存活率在94至98%範圍內。在此等調配物中，解凍後細胞生長亦相對均勻。
包含約2.5% (v/v) DMSO、約50 mM海藻糖、約7.5% (w/v)聚葡萄糖-40、約2.5%白蛋白(w/v)及緩衝鹽水之調配物與在冷凍及解凍後每一細胞具有多於4個核之多核RPE細胞之降低之發生率相關聯。與冷凍及解凍後在1% v/v水準下之DMSO相比，在2.5% v/v水準下之DMSO在降低每一細胞具有多於4個核之多核RPE細胞之發生率上更有效。包含甚至更高水準之DMSO (例如5%)且視需要亦含有乙二醇(例如5%)之調配物與每一細胞具有多於3個核之多核細胞之降低之發生率相關聯。包含5%甘油之調配物不會產生每一細胞具有多於4個核之細胞。
在一些實施例中，該冷凍保護劑為細胞穿透冷凍保護劑，諸如DMSO、甘油或乙二醇，發現其全部均與受關注細胞(包括(但不限於) RPE細胞、光受體細胞、光受體祖細胞、光受體拯救細胞、角膜內皮細胞、角膜內皮祖細胞、間質細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、神經或神經元幹細胞或祖細胞、神經膠質幹細胞或祖細胞、胰臟幹細胞或祖細胞、β細胞、角質細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、或群體或組織內之細胞(例如RPE細胞之單層或層片或聚集體或簇)、角膜內皮細胞、光受體拯救細胞、胰島或皮膚移植物)之多核化相關聯。
在一些實施例中，該冷凍保護劑為細胞穿透冷凍保護劑，諸如DMSO、甘油或乙二醇，發現所有此等均與多核RPE細胞之降低之發生率相關聯。
再其他調配物包含約5% DMSO (v/v)、約2.5%白蛋白(w/v)、約0.09%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。其他調配物包含約2.5%白蛋白(w/v)、約0.09%葡萄糖(w/v)、約5% (v/v)丙三醇、約200 mM牛磺酸及緩衝液或緩衝鹽水。其他調配物包含2.5%白蛋白(w/v)、約0.09%葡萄糖(w/v)、約5% (v/v)丙三醇、約100 mM海藻糖及緩衝液或緩衝鹽水。
再其他調配物包含約5% DMSO (v/v)、約2.5%白蛋白(w/v)、約0.6%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。其他調配物包含約2.5%白蛋白(w/v)、約0.6%葡萄糖(w/v)、約5% (v/v)丙三醇、約200 mM牛磺酸及緩衝液或緩衝鹽水。其他調配物包含2.5%白蛋白(w/v)、約0.6%葡萄糖(w/v)、約5% (v/v)丙三醇、約100 mM海藻糖及緩衝液或緩衝鹽水。
再其他調配物包含約5% DMSO (v/v)、約7.5%白蛋白(w/v)、約0.6%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水。其他調配物包含約7.5%白蛋白(w/v)、約0.6%葡萄糖(w/v)、約5% (v/v)丙三醇、約200 mM牛磺酸及緩衝液或緩衝鹽水。其他調配物包含7.5%白蛋白(w/v)、約0.6%葡萄糖(w/v)、約5% (v/v)丙三醇、約100 mM海藻糖及緩衝液或緩衝鹽水。
本發明進一步審慎考慮，在本文所提供的任何實施例中，「甘油(glycerol)」亦可涵蓋「丙三醇(glycerin)」，且相反地，在本文所提供的任何實施例中，「丙三醇(glycerin)」亦可涵蓋「甘油(glycerol)」。
在一些實施例中，該經冷凍保存的細胞製劑可包含受關注細胞(例如RPE細胞、光受體拯救細胞、光受體細胞、角膜內皮細胞、角膜內皮祖細胞、神經細胞或神經幹細胞或神經祖細胞或本文所揭示的其他細胞類型)、5%或10% DMSO、27 µg葡萄糖、750 µg重組人類白蛋白、110 µg氯化鈉、26.6 µg磷酸鈉、2.10 µg氯化鈣、4.19 µg氯化鉀、4.19 µg磷酸二氫鉀、2.10 µg氯化鎂-6H 2O、168 µg氯化鈉及24.1 µg磷酸氫二鈉。在一些實施例中，該經冷凍保存的細胞製劑可包含受關注細胞(例如RPE細胞)、5%或10% DMSO、0.9 μg/ml葡萄糖、259.5 μg/ml Recombumin Elite (重組人類白蛋白)，及作為緩衝劑之杜貝卡氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco’s phosphate buffered saline)。
在如本文所提供的稀釋劑中解凍及稀釋後，在一些實施例中，待投與至個體之最終細胞製劑可包含受關注細胞(例如RPE細胞)、透明質酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉十二水合物、右旋糖(無水)、氯化鈣二水合物、氯化鎂六水合物、乙酸鈉三水合物及檸檬酸鈉二水合物。
與標準先前技術技術相比，該等細胞可以更高濃度(或密度)冷凍保存。例如，該等細胞可以約3 x 10 2個細胞/µL或更高(包括約10 3個細胞/µL、約2 x 10 3個細胞/µL、約3 x 10 3個細胞/µL、10 4個細胞/µL或更高，包括約2 x 10 4個細胞/µL、約3 x 10 4個細胞/µL、約4 x 10 4個細胞/µL、約5 x 10 4個細胞/µL、約6 x 10 4個細胞/µL、約7 x 10 4個細胞/µL、約8 x 10 4個細胞/µL、約9 x 10 4個細胞/µL、或約10 5個細胞/µL或更高)之濃度(或密度)冷凍保存。在一些實施例中，該細胞密度為約3 x 10 2個細胞/µL。在一些實施例中，該細胞密度為約3.3 x 10 3個細胞/µL。在一些實施例中，該細胞密度為約5 x 10 4個細胞/µL。
在一些實施例中，該細胞密度係在約10 3個細胞/µL至約6 x 10 4個細胞/µL，包括約3 x 10 3個細胞/µL至約5 x 10 4個細胞/µL範圍內。在一些實施例中，該細胞密度係在約10 4個細胞/µL至約6 x 10 4個細胞/µL (包括1.5 x 10 4個細胞/µL至約5 x 10 4個細胞/µL，包括約2 x 10 4個細胞/µL至約5 x 10 4個細胞/µL、及約3 x 10 4個細胞/µL至約5 x 10 4個細胞/µL)範圍內。在一些實施例中，該細胞密度為約3 x 10 2個細胞/µL。在一些實施例中，該細胞密度為約3.3 x 10 3個細胞/µL。在一些實施例中，該細胞密度為約5 x 10 4個細胞/µL。
在一些實施例中，每一小瓶的細胞數量為約10 5至10 7個細胞/小瓶。在一些實施例中，每一小瓶的細胞數量為約450,000至1,500,000個細胞/小瓶。在一些實施例中，每一小瓶的細胞數量為約1,750,000至約3,500,000個細胞/小瓶。
另外，與標準先前技術技術細胞相比，可減小經冷凍保存的細胞製劑之體積。例如，在一些實施例中，該等細胞可以在約10 µL至約100 µL範圍內之體積(包括約10 µL至約50 µL之體積，包括約10 µL、約20 µL、約30 µL、約40 µL、約50 µL、約60 µL、約70 µL、約80 µL、約90 µL或約100 µL之體積)冷凍保存。在一些實施例中，該等細胞可以在約10 µL至約500 µL範圍內之體積冷凍保存，在一些實施例中，包括10 µL、約20 µL、約30 µL、約40 µL、約50 µL、約60 µL、約70 µL、約80 µL、約90 µL、約100 µL、約150 µL、約 200 µL、約250 µL、約300 µL、約350 µL、約400 µL、約450 µL或約500 µL之體積。由於該等細胞可以大數目但以低體積冷凍，因此冷凍的製劑可接著用適宜稀釋劑稀釋以達到所需體積及濃度，且然後在不需要進行洗滌步驟下直接投與至個體。標準先前技術技術通常以較大體積(例如約1 mL)冷凍較低濃度之細胞，然後要求將經解凍之製劑洗滌，有時洗滌多次，以便在投與至個體之前移除冷凍保護劑。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約10% DMSO (w/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成，且用於冷凍保存RPE細胞。此調配物導致至少90%或至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%之解凍後RPE細胞之存活率。其亦導致較低頻率之多核細胞。在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約10% DMSO (v/v)、約2.4%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液、基本上由其組成或由其組成，且用於冷凍保存光受體拯救細胞、光受體細胞或光受體祖細胞。該DMSO可以約5%或約10%使用。該等細胞可以約50 x 10 3個細胞/µL之濃度冷凍。與市售冷凍保護調配物CS10相比，該調配物導致解凍後該等細胞之改良之存活率。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成，且用於冷凍保存角膜內皮祖細胞或角膜內皮細胞。該DMSO可以約5%或約10% (v/v)存在。該等細胞可以約30 x 10 3個細胞/µL之濃度冷凍。與90% FBS (v/v)及10% DMSO (v/v)之習知冷凍保護調配物相比，該調配物導致解凍後該等細胞之改良之存活率。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成。該DMSO可以約4% (v/v)、約5% (v/v)及約6% (v/v)存在。該白蛋白可為人類白蛋白，包括重組人類白蛋白，且可以約2% (w/v)、或約2.5% (w/v)、或約3% (w/v)存在。該葡萄糖可為不存在，或其可以約0.08% (w/v)或約0.09% (w/v)或約0.1% (w/v)存在。該緩衝鹽水可為磷酸鹽緩衝鹽水。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成。該白蛋白可以約2% (w/v)、約2.5% (w/v)或約3% (w/v)存在。該葡萄糖可以約0.08% (w/v)、或約0.09% (w/v)、或約0.10% (w/v)存在。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約10% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成。該DMSO可以約4% (v/v)、約5% (v/v)及約6% (v/v)存在。該白蛋白可為人類白蛋白，包括重組人類白蛋白，且可以約2% (w/v)、或約2.5% (w/v)、或約3% (w/v)、或約4% (w/v)、或約5% (w/v)、或約6% (w/v)、或約7% (w/v)、或約7.5% (w/v)、或約8% (w/v)、或約9% (w/v)或約10% w/v)存在。該葡萄糖可為不存在，或其可以約0.08% (w/v)或約0.09% (w/v)、或約0.1% (w/v)存在。該緩衝鹽水可為磷酸鹽緩衝鹽水。
在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約3%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成。該白蛋白可以約2% (w/v)、約2.5% (w/v)或約3% (w/v)存在。在一些實施例中，該冷凍保護調配物包含約4%至約6% DMSO (v/v)、約2%至約7.5%白蛋白(w/v)、0至1.5%葡萄糖(w/v)及緩衝液或緩衝鹽水、基本上由其組成或由其組成。該白蛋白可以約2% (w/v)、約5% (w/v)或約7.5% (w/v)存在。該葡萄糖可以約0.08% (w/v)、或約0.09% (w/v)、或約0.10% (w/v)存在。 冷凍保存調配物
在一些實施例中，本文所提供的調配物或製劑展現生理pH及生理滲透壓(亦稱為生理滲透度)。生理pH係指為非細胞毒性且類似於細胞或組織在其天然環境中之pH之pH。對於大多數細胞及組織，生理pH為約6.8至約7.8之pH，例如約7至約7.7之pH、約7.2至約7.6之pH、約7.2至約7.4之pH、或約7.4至約7.5之pH。因此，在一些實施例中，本文所提供的調配物或製劑展現約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7或約7.8之pH。生理滲透壓係指為非細胞毒性且類似於細胞或組織在其天然環境中之滲透壓之滲透壓。對於一些細胞及組織，生理滲透壓為約270至約345 mOsm/l，例如約280至約330 mOsm/l、約290至約325 mOsm/l、約300至約315 mOsm/l。在一些實施例中，生理滲透壓為約300、約305、約310、約315、約320或約325 mOsm/l。在一些實施例中，本文所提供的調配物或製劑展現生理pH及大於生理滲透壓之滲透壓，例如約350至約450 mOsm/l，例如約360至約440 mOsm/l、約370至約430 mOsm/l、約380至約420 mOsm/l、或約390至約410 mOsm/l。在一些實施例中，大於生理滲透壓之滲透壓為約350、約355、約360、約365、約370、約375、約380、約385、約390、約395、約400、約405、約410、約415、約420、約425、約430、約435、約440、約445或約450 mOsm/l。在一些實施例中，本文所提供的調配物或製劑具有約1250 mOsm/kg，例如約1250 mOsm/kg、約1000 mOsm/kg、約900 mOsm/kg、約800 mOsm/kg、約700 mOsm/kg、約600 mOsm/kg、約500 mOsm/kg、約400 mOsm/kg或約300 mOsm/kg之滲透度。在一些實施例中，本文所提供的調配物或製劑具有約300至450 mOsm/kg、約300至400 mOsm/kg、約300至450 mOsm/kg、約350至450 mOsm/kg、或約350至400 mOsm/kg之滲透度。
在一些實施例中，本文所提供的冷凍保存調配物包含(a)冷凍保護劑；(b)白蛋白；(c)將該溶液維持在生理pH之緩衝液；及(d)葡萄糖。
在一些實施例中，該等調配物包含冷凍保護劑。冷凍保護劑用於保護細胞在冷凍製程期間免於損傷。在一些實施例中，該等調配物包含選自二甲基亞碸(DMSO)、甘油及乙二醇之冷凍保護劑。在一些實施例中，該冷凍保護劑為DMSO。在一些實施例中，該等調配物包含約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%或約10% (體積/體積，v/v) DMSO。在一些實施例中，該溶液包含約4%至10%、約4%至9.5%、約4%至9%、約4%至8.5%、約4%至8%、約4%至7.5%、約4%至7%、約4%至6.5%、約4%至6%、約4%至5.5%、約4%至5%、約4%至4.5%、約4.5%至10%、約4.5%至9.5%、約4.5%至9%、約4.5%至8.5%、約4.5%至8%、約4.5%至7.5%、約4.5%至7%、約4.5%至6.5%、約4.5%至6%、約4.5%至5.5%、約4.5%至5%、約5%至10%、約5%至9.5%、約5%至9%、約5%至8.5%、約5%至8%、約5%至7.5%、約5%至7%、約5%至6.5%、約5%至6%、約5%至5.5%、約5.5%至10%、約5.5%至9.5%、約5.5%至9%、約5.5%至8.5%、約5.5%至8%、約5.5%至7.5%、約5.5%至7%、約5.5%至6.5%、約5.5%至6%、約6%至10%、約6%至9.5%、約6%至9%、約6%至8.5%、約6%至8%、約6%至7.5%、約6%至7%、約6%至6.5%、約6.5%至10%、約6.5%至9.5%、約6.5%至9%、約6.5%至8.5%、約6.5%至8%、約6.5%至7.5%、約6.5%至7%、約7%至10%、約7%至9.5%、約7%至9%、約7%至8.5%、約7%至8%、約7%至7.5%、約7.5%至10%、約7.5%至9.5%、約7.5%至9%、約7.5%至8.5%、約7.5%至8%、約8%至10%、約8%至9.5%、約8%至9%、約8%至8.5%、約8.5%至10%、約8.5%至9.5%、約8.5%至9%、約9%至10%、約9%至9.5%、或約9.5%至10% (v/v) DMSO。在一些實施例中，該等調配物包含約4%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5%、約5.1%、約5.2%、約5.3%、約5.4%、約5.5%、約5.6%、約5.7%、約5.8%、約5.9%、約6%、約6.1%、約6.2%、約6.3%、約6.4%、約6.5%、約6.6%、約6.7%、約6.8%、約6.9%、約7%、約7.1%、約7.2%、約7.3%、約7.4%、約7.5%、約7.6%、約7.7%、約7.8%、約7.9%、約8%、約8.1%、約8.2%、約8.3%、約8.4%、約8.5%、約8.6%、約8.7%、約8.8%、約8.9%、約9%、約9.1%、約9.2%、約9.3%、約9.4%、約9.5%、約9.6%、約9.7%、約9.8%、約9.9%或約10% (體積/體積，v/v) DMSO。
在一些實施例中，該等調配物包含白蛋白。在一些實施例中，該白蛋白為重組白蛋白。在一些實施例中，該白蛋白為重組人類(rh)白蛋白。術語「重組白蛋白」可與術語「rA」或「r白蛋白」互換使用。術語「重組人類白蛋白」可與術語「rHA」、「rHSA」或「rh白蛋白」互換使用。在一些實施例中，該等冷凍保存調配物包含約2.0%、約2.1%、約2.2%、約2.3%、約2.4%、約2.5%、約2.6%、約2.7%、約2.8%、約2.9%、約3.0%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4.0%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5.0%、約5.1%、約5.2%、約5.3%、約5.4%、約5.5%、約5.6%、約5.7%、約5.8%、約5.9%、約6.0%、約6.1%、約6.2%、約6.3%、約6.4%、約6.5%、約6.6%、約6.7%、約6.8%、約6.9%、約7.0%、約7.1%、約7.2%、約7.3%、約7.4%、約7.5%、約7.6%、約7.7%、約7.8%、約7.9%、約8.0%、約8.1%、約8.2%、約8.3%、約8.4%、約8.5%、約8.6%、約8.7%、約8.8%、約8.9%、約9.0%、約9.1%、約9.2%、約9.3%、約9.4%、約9.5%、約9.6%、約9.7%、約9.8%、約9.9%或約10.0% (w/v)白蛋白。
在一些實施例中，該等冷凍保存調配物包含約2.0%至10.0%、約2.0%至9.5%、約2.0%至9.0%、約2.0%至8.5%、約2.0%至8.0%、約2.0%至7.5%、約2.0%至7.0%、約2.0%至6.5%、約2.0%至6.0%、約2.0%至5.5%、約2.0%至5.0%、約2.0%至4.5%、約2.0%至4.0%、約2.0%至3.5%、約2.0%至3.0%、約2.0%至2.5%、約2.5%至10.0%、約2.5%至9.5%、約2.5%至9.0%、約2.5%至8.5%、約2.5%至8.0%、約2.5%至7.5%、約2.5%至7.0%、約2.5%至6.5%、約2.5%至6.0%、約2.5%至5.5%、約2.5%至5.0%、約2.5%至4.5%、約2.5%至4.0%、約2.5%至3.5%、約2.5%至3.0%、約3.0%至10.0%、約3.0%至9.5%、約3.0%至9.0%、約3.0%至8.5%、約3.0%至8.0%、約3.0%至7.5%、約3.0%至7.0%、約3.0%至6.5%、約3.0%至6.0%、約3.0%至5.5%、約3.0%至5.0%、約3.0%至4.5%、約3.0%至4.0%、約3.0%至3.5%、約3.5%至10.0%、約3.5%至9.5%、約3.5%至9.0%、約3.5%至8.5%、約3.5%至8.0%、約3.5%至7.5%、約3.5%至7.0%、約3.5%至6.5%、約3.5%至6.0%、約3.5%至5.5%、約3.5%至5.0%、約3.5%至4.5%、約3.5%至4.0%、約4.0%至10.0%、約4.0%至9.5%、約4.0%至9.0%、約4.0%至8.5%、約4.0%至8.0%、約4.0%至7.5%、約4.0%至7.0%、約4.0%至6.5%、約4.0%至6.0%、約4.0%至5.5%、約4.0%至5.0%、約4.0%至4.5%、約4.5%至10.0%、約4.5%至9.5%、約4.5%至9.0%、約4.5%至8.5%、約4.5%至8.0%、約4.5%至7.5%、約4.5%至7.0%、約4.5%至6.5%、約4.5%至6.0%、約4.5%至5.5%、約4.5%至5.0%、約5.0%至10.0%、約5.0%至9.5%、約5.0%至9.0%、約5.0%至8.5%、約5.0%至8.0%、約5.0%至7.5%、約5.0%至7.0%、約5.0%至6.5%、約5.0%至6.0%、約5.0%至5.5%、約5.5%至10.0%、約5.5%至9.5%、約5.5%至9.0%、約5.5%至8.5%、約5.5%至8.0%、約5.5%至7.5%、約5.5%至7.0%、約5.5%至6.5%、約5.5%至6.0%、約6.0%至10.0%、約6.0%至9.5%、約6.0%至9.0%、約6.0%至8.5%、約6.0%至8.0%、約6.0%至7.5%、約6.0%至7.0%、約6.0%至6.5%、約6.5%至10.0%、約6.5%至9.5%、約6.5%至9.0%、約6.5%至8.5%、約6.5%至8.0%、約6.5%至7.5%、約6.5%至7.0%、約7.0%至10.0%、約7.0%至9.5%、約7.0%至9.0%、約7.0%至8.5%、約7.0%至8.0%、約7.0%至7.5%、約8.0%至10.0%、約8.0%至9.5%、約8.0%至9.0%、約8.0%至8.5%、約8.5%至10.0%、約8.5%至9.5%、約8.5%至9.0%、約9.0%至10.0%、或約9.5%至10.0% (w/v)白蛋白。
在一些實施例中，該等冷凍保存調配物包含約2.0%至3.0%、約2.0%至2.9%、約2.0%至2.8%、約2.0%至2.7%、約2.0%至2.6%、約2.0%至2.5%、約2.0%至2.4%、約2.0%至2.3%、約2.0%至2.2%、約2.0%至2.1%、約2.1%至3.0%、約2.1%至2.9%、約2.1%至2.8%、約2.1%至2.7%、約2.1%至2.6%、約2.1%至2.5%、約2.1%至2.4%、約2.1%至2.3%、約2.1%至2.2%、約2.2%至3.0%、約2.2%至2.9%、約2.2%至2.8%、約2.2%至2.7%、約2.2%至2.6%、約2.2%至2.5%、約2.2%至2.4%、約2.2%至2.3%、約2.3%至3.0%、約2.3%至2.9%、約2.3%至2.8%、約2.3%至2.7%、約2.3%至2.6%、約2.3%至2.5%、約2.3%至2.4%、約2.4%至3.0%、約2.4%至2.9%、約2.4%至2.8%、約2.4%至2.7%、約2.4%至2.6%、約2.4%至2.5%、約2.5%至3.0%、約2.5%至2.9%、約2.5%至2.8%、約2.5%至2.7%、約2.5%至2.6%、約2.6%至3.0%、約2.6%至2.9%、約2.6%至2.8%、約2.6%至2.7%、約2.7%至3.0%、約2.7%至2.9%、約2.7%至2.8%、約2.8%至3.0%、約2.8%至2.9%、或約2.9%至3.0% (w/v)白蛋白。
在一些實施例中，該等冷凍保存調配物包含緩衝液。緩衝液係指可藉由中和經添加酸或鹼維持溶液、製劑或調配物之pH相對穩定之試劑。通常，緩衝液包含弱共軛酸-鹼對，亦即，弱酸及其共軛鹼，或弱鹼及其共軛酸。在一些實施例中，包含在本文所提供的冷凍保存調配物中之緩衝液為包含磷酸氫二鈉(Na 2HPO 4)及氯化鈉(NaCl)之水基鹽溶液。在一些實施例中，包含在本文所提供的調配物中之緩衝液進一步包含氯化鉀(KCl)及磷酸二氫鉀(KH 2PO 4)。在一些實施例中，該等調配物包含緩衝鹽水，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些實施例中，該緩衝液為杜貝卡氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)。在一些實施例中，該緩衝液為4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)。在一些實施例中，該緩衝液為3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)。在一些實施例中，該緩衝液為N,N-雙-(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸(BES)。在一些實施例中，該緩衝液為3-嗎啉基-2-羥基丙烷磺酸鈉鹽(MOPSO)。在一些實施例中，該緩衝液為N-參(羥甲基)甲基甘胺酸(Tricine)。在一些實施例中，該緩衝液為2-[參(羥甲基)甲基胺基]-1-乙烷磺酸(TES)。在一些實施例中，該緩衝液為4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)。
在一些實施例中，該緩衝液包含二價陽離子。適宜二價陽離子包括(但不限於)例如Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Fe 2+、Mn 2+、Cr 2+、Cu 2+、Ba 2+及Sr 2+。在一些實施例中，該等二價陽離子包含鈣。在一些實施例中，該等二價陽離子包含鎂。在一些實施例中，該等二價陽離子包含兩個或更多個不同二價陽離子，例如鈣及鎂。在一些實施例中，該緩衝液包含鈣。在一些實施例中，該緩衝液包含醫藥上可接受之鈣鹽。在一些實施例中，該緩衝液包含鎂。在一些實施例中，該緩衝液包含醫藥上可接受之鎂鹽。在本文所提供的溶液之一些實施例中，該緩衝液包含氯化鈣。在一些實施例中，該緩衝液包含氯化鈣二水合物。在一些實施例中，該緩衝液包含氯化鎂。在一些實施例中，該緩衝液包含氯化鎂六水合物。
在一些實施例中，本文所提供的冷凍保存調配物包含葡萄糖。在一些實施例中，該溶液包含約0%至5.0% (w/v)葡萄糖。例如，在一些實施例中，該冷凍保存調配物包含約0%、約0.01%、約0.02%、約0.03%、約0.04%、約0.05%、約0.06%、約0.07%、約0.08%、約0.09%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2%、約2.1%、約2.2%、約2.3%、約2.4%、約2.5%、約2.6%、約2.7%、約2.8%、約2.9%、約3%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約4%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%或約5% (w/v)葡萄糖。葡萄糖之量可表示為某一範圍。本發明審慎考慮且在此提供選自以下任一者為下限及以下任一者為上限之任何範圍之葡萄糖。本文揭示此等之任何組合。該範圍的下限包括以下中之任一者：0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%及4.9%且該範圍包括以下中之任一者的上限：0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或5% (w/v)葡萄糖。本發明審慎考慮具有所揭示的下限及所揭示的上限之任何組合之任何範圍之葡萄糖。例如，本文提供範圍諸如約0至.5%、約0至1%、約0至1.5%、約0至2%、約0至2.5%、約0至3%、約0至3.5%、約0至4%、約0至4.5%、約0至5%、約0.5至1%、約0.5至1.5%、約0.5至2%、約0.5至2.5%、約0.5至3%、約0.5至3.5%、約0.5至4%、約0.5至4.5%、約0.5至5%、約1至1.5%、約1至2%、約1至2.5%、約1至3%、約1至3.5%、約1至4%、約1至4.5%、約1至5%、約1.5至2%、約1.5至2.5%、約1.5至3%、約1.5至3.5%、約1.5至4%、約1.5至4.5%、約1.5至5%、約2至2.5%、約2至3%、約2至3.5%、約2至4%、約2至4.5%、約2至5%、約2.5至3%、約2.5至3.5%、約2.5至4%、約2.5至4.5%、約2.5至5%、約3至3.5%、約3至4%、約3至4.5%、約3至5%、約3.5至4%、約3.5至4.5%、約3.5至5%、約4至4.5%、約4至5%、及約4.5至5% (w/v)葡萄糖。在一些實施例中，該溶液包含約0至1.5% (w/v)葡萄糖。應理解，作為一個實例，約1至1.5%之範圍意指約1%至約1.5%。本文所引述的各及每一個範圍賦予相似含義。
在一些實施例中，該調配物包含約4至10% (v/v)細胞冷凍保護劑、約2至3% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖，及緩衝液，視需要為緩衝鹽水。在一些實施例中，該調配物包含約4至10% (v/v)細胞冷凍保護劑、約2至3% (w/v)白蛋白、約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖，及緩衝液，視需要為緩衝鹽水。在一些實施例中，該調配物包含約4至6% (v/v)細胞冷凍保護劑、約2至3% (w/v)白蛋白、約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖，及緩衝液，視需要為緩衝鹽水。
在一些實施例中，該調配物包含約4至10% (v/v) DMSO、約2至3% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約4至10% (v/v) DMSO、約2至3% (w/v)白蛋白、約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約4至6% (v/v) DMSO、約2至3% (w/v)白蛋白、約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約2.5% (w/v)白蛋白、約0.09% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約2.5% (w/v)白蛋白、約0.6% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約4至10% (v/v) DMSO、約2至8% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約4至6% (v/v) DMSO、約2至8% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約2.5% (w/v)白蛋白、約0.6% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。在一些實施例中，該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約7.5% (w/v)白蛋白、約0.6% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。
本發明進一步審慎考慮包含約0%至5% (w/v)葡萄糖或包含本文所規定(諸如在前述段落中)的範圍中之任何一者之前述調配物中之任一者。
在一些實施例中，本文所提供的調配物進一步包含至少一種其他賦形劑。在一些實施例中，該調配物包含約1 mM至500 mM、約5 mM至400 mM、約10 mM至300 mM、約25 mN至250 mM、約50 mM至200 mM之至少一種其他賦形劑。在一些實施例中，該調配物包含約25 mM、26 mM、27 mM、28 mM、29 mM、30 mM、31 mM、32 mM、33 mM、34 mM、35 mM、36 mM、37 mM、38 mM、39 mM、40 mM、41 mM、42 mM、43 mM、44 mM、45 mM、46 mM、47 mM、48 mM、49 mM、50 mM、51 mM、52 mM、53 mM、54 mM、55 mM、56 mM、57 mM、58 mM、59 mM、60 mM、61 mM、62 mM、63 mM、64 mM、65 mM、66 mM、67 mM、68 mM、69 mM、70 mM、71 mM、72 mM、73 mM、74 mM、75 mM、76mM、77 mM、78 mM、79 mM、80 mM、81 mM、82 mM、83 mM、84 mM、85 mM、86 mM、87 mM、88 mM、89 mM、90 mM、91 mM、92 mM、93 mM、94 mM、95 mM、96 mM、97 mM、98 mM、99 mM、100 mM、101 mM、102 mM、103 mM、104 mM、105 mM、106 mM、107 mM、108 mM、109 mM、110 mM、111 mM、112 mM、113 mM、114 mM、115 mM、116 mM、117 mM、118 mM、119 mM、120 mM、121 mM、122 mM、123mM、124 mM、125 mM、126 mM、127 mM、128 mM、129 mM、130 mM、131 mM、132 mM、133 mM、134 mM、135mM、136 mM、137 mM、138 mM、139 mM、140 mM、141 mM、142 mM、143 mM、144mM、145 mM、146 mM、147 mM、148 mM、149 mM、150 mM、151 mM、152 mM、153 mM、154 mM、155 mM、156 mM、157 mM、158 mM、159 mM、160 mM、161 mM、162 mM、163 mM、164 mM、165 mM、166 mM、167 mM、168 mM、169 mM、170 mM、171 mM、172 mM、173 mM、174 mM、175 mM、176 mM、177 mM、178 mM、179 mM、180 mM、181 mM、182 mM、183 mM、184 mM、185 mM、186 mM、187 mM、188 mM、189 mM、190 mM、191 mM、192 mM、193mM、194 mM、195 mM、196 mM、197 mM、198 mM、199 mM、200 mM、201 mM、202 mM、203 mM、204 mM、205 mM、206 mM、207 mM、208 mM、209 mM、210 mM、211 mM、212 mM、213 mM、214 mM、215 mM、216 mM、217 mM、218 mM、219 mM、220 mM、221 mM、222 mM、223 mM、224 mM、225 mM、226 mM、227 mM、228 mM、229 mM、230 mM、231 mM、232 mM、233 mM、234 mM、235 mM、236 mM、237 mM、238 mM、239 mM、240 mM、241 mM、242 mM、243 mM、244 mM、245 mM、246 mM、247 mM、248 mM、249 mM或250 mM之至少一種其他賦形劑。在一些實施例中，該至少一種其他賦形劑係選自由牛磺酸、海藻糖、蔗糖、乳糖、丙烷二酸、甘露醇、山梨糖醇、脯胺酸、麩胱甘肽、甘胺酸、丙胺酸或離胺酸組成之群。在一些實施例中，該至少一種其他賦形劑為牛磺酸。在一些實施例中，該至少一種其他賦形劑為海藻糖。在一些實施例中，該至少一種其他賦形劑為1,2丙烷二酸或1,3丙烷二酸。在一些實施例中，該至少一種其他賦形劑為丙二醇。
在一些實施例中，該等調配物包含聚合物賦形劑。在一些實施例中，該等調配物包含約1%至20%之聚合物賦形劑。在一些實施例中，該等調配物包含約3%至18%、約5%至15%、或約7.5%至12.5%之聚合物賦形劑。在一些實施例中，該等調配物包含約1%、約1.5%、約2%、約2.5%、約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約10.5%、約11%、約11.5%、約12%、約12.5%、約13%、約13.5%、約14%、約14.5%、約15%、約15.5%、約16%、約16.5%、約17%、約17.5%、約18%、約18.5%、約19%、約19.5%或約20%之聚合物賦形劑。在一些實施例中，該聚合物賦形劑係選自由聚(乙二醇) (PEG)、聚葡萄糖及聚(乙烯基吡咯啶酮) (PVP)組成之群。在一些實施例中，該聚合物賦形劑為聚葡萄糖。在一些實施例中，該等調配物不包含聚合物賦形劑。在一些實施例中，該等調配物不包含聚葡萄糖。 細胞製劑
本發明之一些態樣提供包含細胞群體或組織於如本文所提供的冷凍保存調配物中之細胞製劑。在一些實施例中，該細胞製劑係經冷凍保存。本文所提供的細胞製劑可藉由在此項技術中已知的任何適宜溫度下低溫冷凍來冷凍保存。例如，在一些實施例中，本文所提供的細胞製劑係在介於-100℃與-200℃之間之溫度下冷凍保存。在一些實施例中，本文所提供的細胞製劑係在低於-125℃之溫度下冷凍保存。在一些實施例中，本文所提供的細胞製劑係在處於或低於-135℃之溫度下冷凍保存。在一些實施例中，本文所提供的細胞製劑係在低於-150℃之溫度下冷凍保存。
本文所提供的冷凍保存調配物及細胞製劑可與不同細胞類型及與不同投與部位結合使用。雖然眼科應用為較佳，但本發明亦審慎考慮及涵蓋其他應用。在一些實施例中，該細胞群體係選自視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體細胞及/或其祖細胞、光受體拯救細胞及角膜內皮細胞及/或其祖細胞。
在一些實施例中，一旦解凍，視需要無需進行稀釋，該細胞製劑適合於移植至個體中。在一些實施例中，一旦解凍且用稀釋劑稀釋，該細胞製劑適合於移植至個體中。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2、GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM、白蛋白或任何其他適宜稀釋劑。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。在一些實施例中，該稀釋劑為包含以下之溶液：(a)將該溶液維持在生理pH之緩衝液；(b)至少2 mM葡萄糖；及(c)將該溶液維持在生理滲透度之滲透活性劑。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。在一些實施例中，該稀釋劑為包含以下之溶液：(a)將該溶液維持在生理pH之緩衝液；(b)至少2 mM葡萄糖；及(c)將該溶液維持在高於例如在350至450 mOsm/kg範圍內之生理滲透度或在300至1250 mOsm/kg範圍內之滲透度之滲透度之滲透活性劑。在一些實施例中，該稀釋劑進一步包含二價陽離子。在一些實施例中，二價陽離子包含鈣及/或鎂。在一些實施例中，該稀釋劑包含鈣。在一些實施例中，該稀釋劑進一步包含鎂。在一些實施例中，該稀釋劑包含乙酸鹽緩衝液及/或檸檬酸鹽緩衝液。在一些實施例中，該稀釋劑為將兩種或更多種或任何數目之標準(例如pH、滲透度、溶質(緩衝液、葡萄糖、滲透活性劑、鎂、鈣、鉀、聚合物)、濃度等)組合之溶液。在一些實施例中，該稀釋劑為包含緩衝劑、葡萄糖及具有或不具有經添加聚合物之滲透活性劑之溶液、包含鉀之溶液及不包含鉀之溶液以及包含該各別溶質所提供的任何濃度之溶質之任何組合之溶液。亦應理解，本發明涵蓋包含所列溶質之溶液以及基本上由所列溶質及溶劑(例如水)組成或由其組成之溶液。出於簡潔之目的，此處不闡述此等替代物。
例如，在一些實施例中，該稀釋劑為包含氯化鈣、氯化鎂、檸檬酸鈉、氯化鈉及葡萄糖(例如D-葡萄糖)於水中或基本上由其組成之溶液。在一些實施例中，該稀釋劑為包含氯化鈣、氯化鎂、檸檬酸鈉、氯化鈉、葡萄糖(例如D-葡萄糖)及氯化鉀於水中或基本上由其組成之溶液。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus，如WO2017/031312A1中所述，該案之內容係以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，該稀釋劑為包含約0.1至約1.2 mM CaCl 2、約0.05至約5 mM MgCl 2、約1至約2.5 mM KCl、約0.5至約2 mM檸檬酸鈉、約14至約17 mM右旋糖及約125至約175 mM NaCl之溶液。在一些實施例中，該稀釋劑為包含約0.9 mM CaCl 2、約0.3 mM MgCl 2、約2 mM KCl、約1.2 mM檸檬酸鈉、約15 mM右旋糖及約145 mM NaCl之溶液。該稀釋劑可進一步包含乙酸鈉。該稀釋劑可進一步包含聚合物，諸如透明質酸或其溶劑合物，諸如透明質酸鈉，視需要以約0.01至約0.05% (w/v) (包括約0.05% (w/v))之濃度。其可進一步包含緩衝組分，諸如磷酸氫二鈉七水合物及/或磷酸二氫鈉單水合物及/或磷酸二氫鈉二水合物。
在一些實施例中，該稀釋劑為包含約0.008%至約0.012% CaCl 2二水合物、約0.0048%至約0.0072% MgCl 2六水合物、約0.012%至約0.018% KCl、約0.028%至約0.042%檸檬酸鈉二水合物、約0.23%至約0.35%右旋糖及約0.68%至約1.02% NaCl之溶液。在一些實施例中，該稀釋劑為包含約0.01% CaCl 2二水合物、約0.006% MgCl 2六水合物、約0.015% KCl、約0.035%檸檬酸鈉二水合物、至少0.25%右旋糖及約0.85% NaCl之溶液。該稀釋劑可進一步包含乙酸鈉。該稀釋劑可進一步包含聚合物，諸如透明質酸或其溶劑合物，諸如透明質酸鈉，視需要以約0.01至約0.05% (w/v) (包括約0.05% (w/v))之濃度。其可進一步包含緩衝組分，諸如磷酸氫二鈉七水合物及/或磷酸二氫鈉單水合物及/或磷酸二氫鈉二水合物。
在一些實施例中，該稀釋劑包含5%右旋糖、0.9% NaCl、BSS®無菌灌洗溶液、0.1N NaOH及0.9% NaCl灌洗劑。在一些實施例中，該稀釋劑包含3%透明質酸鈉、5%無水右旋糖、磷酸氫二鈉十二水合物、BSS®無菌灌洗溶液(例如0.64% NaCl、0.075% KCl、0.048% CaCl 2二水合物、0,03% MgCl 2六水合物、0.39%乙酸鈉三水合物及0.17%檸檬酸鈉二水合物)。
在一些實施例中，該稀釋劑包含約0.27%葡萄糖、約0.84%氯化鈉、約0.016%氯化鉀、約0.01%氯化鈣、約0.006%氯化鎂、約0.036%檸檬酸鈉及視需要之乙酸鈉(例如約0.08%)、視需要之透明質酸鈉(例如約0.049%)、及視需要之磷酸氫二鈉七水合物(例如約0.0007%)及磷酸二氫鈉單水合物(例如約0.0001%)。在一些實施例中，該稀釋劑包含約15 mM葡萄糖、約144 mM氯化鈉、約2.1 mM氯化鉀、約0.9 mM氯化鈣、約0.3 mM氯化鎂、約1.2 mM檸檬酸鈉、視需要之乙酸鈉(例如約6 mM)、視需要之透明質酸鈉、及視需要之磷酸氫二鈉七水合物(例如約0.027 mM)及磷酸二氫鈉單水合物(例如約0.007 mM)。此類稀釋劑包括GS2。
在一些實施例中，該稀釋劑包含約0.27%葡萄糖、約0.84%氯化鈉、約0.016%氯化鉀、約0.01%氯化鈣、約0.006%氯化鎂、約0.036%檸檬酸鈉及視需要之乙酸鈉(例如約0.08%)、視需要之透明質酸鈉(例如約0.049%)、及視需要之磷酸二氫鈉二水合物(例如約0.047%)。在一些實施例中，該稀釋劑包含約15 mM葡萄糖、約144 mM氯化鈉、約2.1 mM氯化鉀、約0.9 mM氯化鈣、約0.3 mM氯化鎂、約1.2 mM檸檬酸鈉、視需要之乙酸鈉(例如約6 mM)、視需要之透明質酸鈉、及視需要之磷酸二氫鈉二水合物(例如約3 mM)。此類稀釋劑包括GS2 Plus。
在一些實施例中，一旦解凍及稀釋，本文所提供的細胞製劑經調配用於投與至個體，例如，用於經由注射投與。本文所提供的細胞製劑可包含細胞群體，諸如RPE細胞及/或其祖細胞、光受體細胞及/或其祖細胞、及角膜內皮細胞及/或其祖細胞及光受體拯救細胞。
示例性細胞或組織製劑在解凍後可經調配成適合用於治療人類患者，例如不含热源或基本上不含热源、不含病原體、無菌及在生理pH及滲透度下。在一些實施例中，本文所提供的製劑經調配成用於注射至特定部位中，例如，在用於治療視網膜疾病或病症之眼科製劑之情況下，注射至玻璃狀液中用於遞送至視網膜或脈絡膜損傷之部位。
本發明所提供的細胞製劑可另外包括治療劑，例如免疫抑制劑、促血管生成劑、或支持製劑中該等細胞之存活及/或植入之營養素或生長因子。
待投與的細胞製劑之細胞之體積及數量將取決於特定應用。通常，對於細胞移植應用，期望儘可能多地減少所投與的體積。因此，該等細胞製劑可經調配成使得可遞送最小化體積。用於注射之細胞濃度可為有效且非毒性之任何濃度。在一些實施例中，待投與的細胞製劑之體積係介於1至1000 µL之間。在一些實施例中，待投與的細胞製劑之體積係介於1至50 μl之間、或介於10至50 μl之間或介於25至50 μl之間或介於50至100 μl之間或介於50至200 μl之間或介於50至300 μl之間或介於50至400 μl之間或介於50至500 μl之間、或介於100至500 μl之間、或介於100至400 μl之間或介於100至300 μl之間、或介於100至300 μl或約200 μl或約150 μl之間。在一些實施例中，待投與的細胞製劑之體積為約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、950或1000 μl。
在一些實施例中，本文所提供的細胞製劑中之細胞數量及/或細胞濃度可藉由計數活細胞且排除非活細胞來測定。例如，非活細胞可藉由無法排除活體染料 (諸如台盼藍)、或使用功能檢定(諸如黏著至培養基質、吞噬等之能力)來偵測。另外，所需細胞類型之細胞數量或細胞濃度可藉由計數表現該細胞類型之一或多種細胞標記特性之細胞及/或排除表現指示除了所需細胞類型外的細胞類型之一或多種標記之細胞來測定。
在一些實施例中，待投與的細胞製劑包含約或至少1x10 3、2x10 3、3x10 3、4x10 3、5x10 3、6x10 3、7x10 3、8x10 3、9x10 3、1x10 4、2x10 4、3x10 4、4x10 4、5x10 4、6x10 4、7x10 4、8x10 4、9x10 4、1x10 5、2x10 5、3x10 5、4x10 5、5x10 5、6x10 5、7x10 5、8x10 5、9x10 5、1x10 6、2x10 6、3x10 6、4x10 6、5x10 6、6x10 6、7x10 6、8x10 6、9x10 6、1x10 7、2x10 7、3x10 7、4x10 7、5x10 7、6x10 7、7x10 7、8x10 7、9x10 7、1x10 8、2x10 8、3x10 8、4x10 8、5x10 8、6x10 8、7x10 8、8x10 8、9x10 8、1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、9x10 9、1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10或9x10 10個細胞或更多個細胞。
在一些實施例中，在冷凍保存之前，每一小瓶的細胞數量為約10 5至10 7個細胞/小瓶。在一些實施例中，在冷凍保存之前，每一小瓶的細胞數量為約450,000至1,500,000個細胞/小瓶。在一些實施例中，在冷凍保存之前，每一小瓶的細胞數量為約1,750,000至約3,500,000個細胞/小瓶。在一些實施例中，在冷凍保存之前，每一小瓶的細胞數量為約10 5至10 7個細胞/小瓶。在一些實施例中，在冷凍保存、解凍及稀釋後，每一小瓶的細胞數量為約450,000至1,500,000個細胞/小瓶。在一些實施例中，在冷凍保存、解凍及稀釋後，每一小瓶的細胞數量為約1,750,000至約3,500,000個細胞/小瓶。
前述數目之細胞可存在於單一cryovial中之經冷凍保存的細胞製劑中。該等細胞可存在於約10至約500 µL之冷凍保護調配物中、包含存在於約10至約200 µL之冷凍保護調配物中、或存在於約10至約100 µL之冷凍保護調配物中、或約10至約50 µL之冷凍保護調配物、或約20至約50 µL之冷凍保護調配物中。
在一些實施例中，該細胞群體適合於移植至個體之眼睛中。在一些實施例中，適合於移植至個體之眼睛中之該細胞群體包含RPE細胞、RPE祖細胞、虹膜色素上皮(IPE)細胞、及其他視覺相關神經細胞，諸如連系神經元(例如內核層(INL)之「中繼」神經元)及無軸突神經細胞、視網膜細胞、桿、錐體及角膜細胞(例如角膜內皮細胞)、神經細胞、神經祖細胞、神經幹細胞、光受體細胞(例如光受體祖細胞)、光受體拯救細胞及間質細胞(諸如(例如)間質幹細胞(MSC))。經如此調配之細胞可藉由多能(pluripotent)或多潛能(multipotent)幹細胞(包括誘導型人類多能幹細胞(hiPSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)及體細胞(包括經轉分化之細胞及幹細胞))之定向分化來產生。
在一些實施例中，該等細胞製劑包含含在本文所提供的冷凍保存調配物中之RPE細胞群體。適宜RPE細胞可自多能幹細胞(諸如人類胚胎幹(ES)細胞或誘導型多能幹細胞(iPS細胞))分化，且係分子上不同於胚胎幹細胞、iPS細胞、成年衍生之RPE細胞及胎兒衍生之RPE細胞。在一些實施例中，使用成年衍生之RPE細胞及胎兒衍生之RPE細胞。
在使用ES細胞衍生之RPE細胞之情況下，在一些實施例中，該細胞製劑不包含可偵測量之殘餘ES細胞，使得本文所提供的細胞製劑不會對此種製劑之接受者造成不可接受之風險。在使用iPS細胞衍生之RPE細胞之情況下，在一些實施例中，該細胞製劑不包含可偵測量之殘餘iPS細胞，使得本文所提供的細胞製劑不會對此種製劑之接受者造成不可接受之風險。
在一些實施例中，該等細胞製劑包含含在本文所提供的冷凍保存調配物中之光受體拯救細胞群體。適宜光受體拯救細胞可自多能幹細胞(諸如人類胚胎幹細胞或iPS細胞)分化，且係分子上不同於胚胎幹細胞、iPS細胞、成年衍生之光受體拯救細胞及胎兒衍生之光受體拯救細胞。在一些實施例中，使用成年衍生之光受體拯救細胞及胎兒衍生之光受體拯救細胞。
在使用ES細胞衍生之光受體拯救細胞之情況下，在一些實施例中，該細胞製劑不包含可偵測量之殘餘ES細胞，使得本文所提供的細胞製劑不會對此種製劑之接受者造成不可接受之風險。在使用iPS細胞衍生之光受體拯救細胞之情況下，在一些實施例中，該細胞製劑不包含可偵測量之殘餘iPS細胞，使得本文所提供的細胞製劑不會對此種製劑之接受者造成不可接受之風險。
在一些實施例中，該等細胞製劑包含含在本文所提供的冷凍保存調配物中之角膜內皮細胞群體。適宜角膜內皮細胞可自多能幹細胞(諸如人類胚胎幹細胞或iPS細胞)分化，且係分子上不同於胚胎幹細胞、iPS細胞、成年衍生之角膜內皮細胞及胎兒衍生之角膜內皮細胞。在一些實施例中，使用成年衍生之角膜內皮細胞及胎兒衍生之角膜內皮細胞。
在使用ES細胞衍生之角膜內皮細胞之情況下，在一些實施例中，該細胞製劑不包含可偵測量之殘餘ES細胞，使得本文所提供的細胞製劑不會對此種製劑之接受者造成不可接受之風險。在使用iPS細胞衍生之角膜內皮細胞之情況下，在一些實施例中，該細胞製劑不包含可偵測量之殘餘iPS細胞，使得本文所提供的細胞製劑不會對此種製劑之接受者造成不可接受之風險。
在一些實施例中，包含適合移植至個體之眼睛中之細胞群體之細胞製劑適合注射至該個體之眼睛中。在一些實施例中，此一細胞製劑可用於治療視網膜退化疾病或病症，包括(但不限於)視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕、近視性黃斑退化、或視網膜萎縮或與導致光受體損壞及失明之許多視力改變疾病諸如(例如)無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)相關聯。
該等RPE細胞可為不會去分化成非-RPE細胞類型之穩定、經末端分化之RPE細胞。本文所述的RPE細胞可為功能性RPE細胞，其特徵在於在角膜、視網膜下或其他投與至人類或非人類的動物中時整合至視網膜之能力。
該等RPE細胞可表現RPE細胞標記。例如，標記(諸如RPE65、PAX2、PAX6、酪胺酸酶、斑萎蛋白(bestrophin)、PEDF、CRALBP、Otx2及/或MITF)之表現量可等效於天然存在RPE細胞中之表現量。該等RPE細胞之成熟程度可藉由量測PAX2、PAX6及酪胺酸酶中之至少一者之表現或其各自的表現量來評估。
在一些實施例中，包含在本文所提供的醫藥組合物中之RPE細胞可基於細胞之色素沉著程度來識別及表徵。色素變化可藉由培養及維持RPE細胞之密度及在培養物中維持RPE之持續時間來控制。快速分裂的分化RPE細胞色素化更輕。相比之下，更緩慢分裂或非分裂RPE採用其特徵性多邊形或六邊形形狀且藉由積聚黑色素及脂褐質來增加色素沉著程度。例如，靜止RPE培養物(例如由於匯合所致)通常隨著時間的推移而增加其色素沉著程度。因此，色素沉著之積聚充當RPE分化之指標及與細胞密度相關聯之增加之色素沉著充當RPE成熟度之指標。例如，成熟RPE細胞可以較低密度繼代培養，使得該色素沉著減少。在此內文中，成熟RPE細胞可經培養以產生較不成熟之RPE細胞。此類RPE細胞仍為表現RPE分化之標記之分化RPE細胞。
例如，在一些實施例中，提供一種包含RPE細胞之製劑，該等RPE細胞之平均黑色素含量為小於8 pg/細胞、小於7 pg/細胞、小於6 pg/細胞、或小於5 pg/細胞，例如介於0.1至8 pg/細胞之間、介於0.1至7 pg/細胞之間、介於0.1至6 pg/細胞之間、介於0.1至5 pg/細胞之間、介於0.1至4 pg/細胞之間、介於0.1至3 pg/細胞之間、介於0.1至2 pg/細胞之間、介於0.1至1 pg/細胞之間、介於1至8 pg/細胞之間、介於1至7 pg/細胞之間、介於1至6 pg/細胞之間、介於1至5 pg/細胞之間、介於1至4 pg/細胞之間、介於1至3 pg/細胞之間、介於1至2 pg/細胞之間、介於2至6 pg/細胞之間、介於3至5 pg/細胞之間、或介於4至5 pg/細胞(諸如，例如，4.2至4.8 pg/細胞)之間、或介於0.1-5 pg/細胞之間。在另一個實例中，該平均黑色素含量可為小於5 pg/細胞，例如介於0.1-5 pg/細胞之間、介於0.2至5 pg/細胞之間、0.5至5 pg/細胞、1至5 pg/細胞、2至5 pg/細胞、3至5 pg/細胞、4至5 pg/細胞、或4.5至5 pg/細胞。
在一些實施例中，提供包含含在本文所述的細胞保存調配物中之RPE細胞之製劑，其中在將該等RPE細胞移植至個體後，例如在將該製劑注射至該個體之眼睛中後，該等RPE細胞維持其表型。該等RPE細胞可在移植後的接受者之壽命期限內維持其表型。例如，該等RPE細胞可在移植後維持其表型至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。此外，該等RPE細胞可在移植後維持其表型至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週。該等RPE細胞可在移植後維持其表型至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。該等RPE細胞可在移植後維持其表型至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多年。
細胞可調配於如本文中所提供的製劑中以用於在醫藥上可接受之眼科媒劑中遞送，使得該製劑維持與眼表面接觸一段足以允許該等細胞穿透眼睛之受影響區域(如例如前房、後房、玻璃體(vitreous body)、水樣液、玻璃狀液(vitreous humor)、角膜、虹膜/睫狀體、晶狀體(lens)、脈絡膜、視網膜、鞏膜、脈絡膜上腔、結膜、結膜下腔、鞏膜上腔、角膜內腔、角膜上皮腔(epicorneal space)、睫狀體平坦部(pars plana)、手術誘導之無血管區域或黃斑)之時間期。細胞可具有幾種可能的排列，諸如個別細胞、簇、球體、聚集體、層片或其任何組合，其可包含在水性媒劑、凝膠、基質、聚合物或類似者中。
在一些實施例中，本文提供製劑，其中細胞包含在細胞之層片中。例如，RPE細胞或角膜內皮細胞或光受體細胞或光受體拯救細胞可包含在層片中。例如，包含RPE細胞之細胞層片可藉由在可釋放完整細胞層片之基質(例如熱反應性聚合物，諸如熱反應性聚(N-異丙基丙烯醯胺) (PNIPAAm)-接枝表面)上培養RPE細胞來製備，細胞在培養溫度下黏附在該基質上並增殖，且然後在溫度變化後，該等表面特性經改變而引起經培養之細胞層片之釋放(例如藉由冷卻至低於更低臨界溶液溫度(LCST) (參見da Silva等人，Trends Biotechnol. 2007年12月；25(12):577-83；Hsiue等人，Transplantation. 2006年2月15；81(3):473-6；Ide, T.等人 (2006)；Biomaterials 27，607–614，Sumide, T.等人(2005)，FASEB J. 20，392–394；Nishida, K.等人(2004)，Transplantation 77，379–385；及Nishida, K.等人(2004)，N. Engl. J. Med. 351，1187–1196，該等案中之各者以其全文引用之方式併入本文中)。該細胞層片可附著至適合於移植之基質，諸如當將層片移植至宿主生物中時可體內溶解之基質，該細胞層片係例如藉由在適合於移植之基質上培養該等細胞、或自另一基質(諸如熱反應性聚合物)釋放該等細胞至適合於移植之基質上來製備。潛在地適合於移植之一種示例性基質可包含明膠(參見Hsiue等人，同上)。可適合於移植之替代基質包括基於纖維蛋白之基質及其他基質。該細胞層片可用於製造用於預防或治療視網膜退化疾病之藥物。
在一些實施例中，本文提供一種製劑，其中細胞係呈簇、球體或聚集體。在一些實施例中，本文所提供的細胞係與生物材料(例如可聚合的生物材料)組合投與。
在一些實施例中，本文所提供的細胞(例如RPE細胞)係以植入體或裝置投與。在某些實施例中，該裝置為用於治療眼睛之醫學病狀之包含分散於生物可降解聚合物基質中之活性劑之生物可侵蝕植入體，其中該活性劑之顆粒的至少約75%具有小於約10 pm之直徑。該生物可侵蝕植入體經尺寸調整用於植入於眼部區域中。該眼部區域可為前房、後房、玻璃體腔、脈絡膜、脈絡膜上腔、結膜、結膜下腔、鞏膜上腔、角膜內腔、角膜上皮腔、鞏膜、睫狀體平坦部、手術誘導之無血管區域、黃斑及視網膜中之任何一者或多者。該生物可降解聚合物可為例如聚(乳酸-共聚-乙醇酸) (PLGA)共聚物。在某些實施例中，該聚合物中之乳酸與乙醇酸單體之比率為約25/75、40/60、50/50、60/40、75/25重量百分比，更佳係約50/50。另外，該PLGA共聚物可為該生物可侵蝕植入體的約20、30、40、50、60、70、80至約90重量百分比。在某些較佳實施例中，該PLGA共聚物可為該生物可侵蝕植入體的約30至約50重量百分比，較佳約40重量百分比。本文所提供的細胞(例如RPE細胞、光受體細胞、光受體拯救細胞及角膜內皮細胞)可與生物相容性聚合物(諸如聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)、PDLGA 50:50、Pd Lg A 85:15及生物可降解膜INION GTR® (生物相容性聚合物之混合物))結合移植。參見美國專利第6,331,313號、第7,462,471號及第7,625,582號。亦可參見Hutala等人(2007) 「 In vitrobiocompatibility of degradable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues: Direct contact studies」。Journal of Biomedical Materials Research 83A (2): 407-413；Lu等人(1998) J Biomater Sci Polym，第9版：1187 205；及Tomita等人(2005) Stem Cells 23: 1579-88。在一些情況下，該生物可降解材料可經聚合。
本發明之一些實施例所提供的醫藥組合物之體積取決於因素諸如投與模式、待遞送的細胞之數量、患者的年齡及體重、及所治療的疾病之類型及嚴重度。例如，若藉由注射投與，則本發明之細胞之醫藥組合物之體積可為約1至1000 µL。在一些實施例中，該體積可為約1至200 µL。例如，本發明之組合物之體積可為約10至50、20至50、25至50、或1至200 µL。本發明之組合物之體積可為約10、20、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或450 µL或更高。
在一些實施例中，該冷凍保存調配物(或該經冷凍保存的細胞製劑)中之細胞濃度為約300、500、1 x 10 3、1.5 x 10 3、2 x 10 3、2.5 x 10 3、3 x 10 3、3.333 x 10 3、3.5 x 10 3、4 x 10 3、4.4 x 10 3、5 x 10 3、5.5 x 10 3、7.5 x 10 3、1 x 10 4、1.5 x 10 4、2 x 10 4、2.5 x 10 4、3 x 10 4、3.5 x 10 4、4 x 10 4、4.5 x 10 4、5 x 10 4、5.5 x 10 4、6 x 10 4、6.5 x 10 4、7 x 10 4、7.5 x 10 4、8 x 10 4、8.5 x 10 4、9 x 10 4、9.5 x 10 4、1 x 10 5、1.05 x 10 5、1.1 x 10 5、1.15 x 10 5、1.2 x 10 5、1.25 x 10 5、1.3 x 10 5、1.35 x 10 5、1.4 x 10 5、1.45 x 10 5或1.5 x 10 5個細胞/µL。在一些實施例中，該冷凍保存調配物(或該經冷凍保存的細胞製劑)中之細胞濃度為約2,000至80,000個細胞/µL、2,000至70,000個細胞/µL、3,000至70,000個細胞/µL、3,000至60,000個細胞/µL、3,000至50,000個細胞/µL、3,000至10,000個細胞/µL、3,000至5,000個細胞/µL、3,000至4,000個細胞/µL、3,500個細胞/µL、10,000至100,000個細胞/µL、10,000至90,000個細胞/µL、10,000至80,000個細胞/µL、10,000至70,000個細胞/µL、10,000至60,000個細胞/µL、10,000至50,000個細胞/µL、10,000至40,000個細胞/µL、10,000至30,000個細胞/µL、10,000至20,000個細胞/µL、20,000至100,000個細胞/µL、20,000至90,000個細胞/µL、20,000至80,000個細胞/µL、20,000至70,000個細胞/µL、20,000至60,000個細胞/µL、20,000至50,000個細胞/µL、20,000至40,000個細胞/µL、20,000至30,000個細胞/µL、30,000至100,000個細胞/µL、30,000至90,000個細胞/µL、30,000至80,000個細胞/µL、30,000至70,000個細胞/µL、30,000至60,000個細胞/µL、30,000至50,000個細胞/µL、30,000至40,000個細胞/µL、40,000至100,000個細胞/µL、40,000至90,000個細胞/µL、40,000至80,000個細胞/µL、40,000至70,000個細胞/µL、40,000至60,000個細胞/µL、40,000至50,000個細胞/µL、50,000至100,000個細胞/µL、50,000至90,000個細胞/µL、50,000至80,000個細胞/µL、50,000至70,000個細胞/µL、50,000至60,000個細胞/µL、60,000至100,000個細胞/µL、60,000至90,000個細胞/µL、60,000至80,000個細胞/µL、60,000至70,000個細胞/µL、70,000至100,000個細胞/µL、70,000至90,000個細胞/µL、70,000至80,000個細胞/µL、80,000至100,000個細胞/µL、80,000至90,000個細胞/µL、90,000至100,000個細胞/µL、10,000至150,000個細胞/µL、20,000至150,000個細胞/µL、30,000至150,000個細胞/µL、40,000至150,000個細胞/µL、50,000至150,000個細胞/µL、60,000至150,000個細胞/µL、70,000至150,000個細胞/µL、80,000至150,000個細胞/µL、90,000至140,000個細胞/µL、100,000至150,000個細胞/µL、100,000至130,000個細胞/µL、120,000至150,000個細胞/µL、或120,000至125,000個細胞/µL。
在一些實施例中，該製劑在儲存該製劑期間支持該細胞群體中該等細胞之存活。在一些實施例中，該製劑支持該等細胞在儲存期間存活至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週、至少16週、至少20週、至少24週、至少28週、至少32週、至少36週、至少40週、至少44週、至少48週、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或更長。在一些實施例中，該製劑支持該等細胞在儲存期間存活約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約1週至約8週、約1週至約4週、約1週至約2週。在一些實施例中，該製劑支持該等細胞在儲存期間存活約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、或約7天、或約1天至約7天、約1天至約5天、約1天至約3天或約1天至約2天。該製劑可於在約-100至約-200℃、或約-135℃至約-200℃之溫度下儲存，但不限於此。
在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少30%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，在該細胞群體中該等細胞的至少40%在-100至-200℃，較佳在-135℃或低於-135℃儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年，或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，在該細胞群體中該等細胞的至少50%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少55%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少60%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少65%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少70%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少80%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該細胞群體中該等細胞的至少90%於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後為活的。在一些實施例中，該製劑支持維持儲存該製劑期間該細胞群體之植板效率。在一些實施例中，於在-100至-200℃下，較佳在-135℃或低於-135℃下儲存該製劑約1至10年、約1至9年、約1至8年、約1至7年、約1至6年、約1至5年、約1至4年、約1至3年或約1至2年或更短後，該細胞群體展現其原始植板效率的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%，其中該原始植板效率係指在該儲存器開始時該細胞群體之植板效率。在一些實施例中，該製劑係在儲存容器內。在一些實施例中，該儲存容器為小瓶、安瓿、瓶、注射器、冷卻器包裝或其他適宜儲存容器。在一些實施例中，該製劑係在小瓶內。在一些實施例中，該製劑係在注射器內。
本文所提供的細胞製劑在解凍後適合於在最少處理(例如稀釋)後投與至個體。在一些實施例中，該製劑基本上由細胞、細胞群體或組織及如本文所提供的冷凍保存調配物組成。在一些實施例中，該製劑包含一或多種醫藥活性成分，例如防腐劑、抗氧化劑、自由基清除劑、免疫抑制劑、促血管生成因子、抗血管生成因子、激素(例如生長激素)、或支持細胞生長、存活及植入之細胞營養素或基質。
防腐劑可包括(但不限於)氯化苯二甲烴銨(BAK)、氯化苯索寧、氯丁醇、乙酸苯汞(phenylmercuric acetate)或硝酸苯汞、硫柳汞(thimerosal)、聚四級銨-1 (POLYQUAD®)、穩定氧氯複合物(PURITE®)或對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯。抗氧化劑及/或自由基清除劑可包括(但不限於)維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、輔酶Q-10、硒、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱甘肽、α-生育酚、L-半胱胺酸及N-乙醯基半胱胺酸(NAC)、抗壞血酸-2-磷酸(AAP)、鋅(例如氧化鋅)、銅(例如氧化銅)、二甲基亞碸(DMSO)、甘油、甘露醇及多元酚化合物。免疫抑制劑可包括(但不限於)抗淋巴細胞球蛋白(ALG)多株抗體、抗胸腺細胞球蛋白(ATG)多株抗體、硫唑嘌呤、BASILIXIMAB® (抗-IL-2Rα受體抗體)、環孢菌素(環孢菌素A)、DACLIZUMAB® (抗-IL-2Rα受體抗體)、依維莫司(everolimus)、黴酚酸、RITUXIMAB® (抗-CD20抗體)、西羅莫司(sirolimus)、及他克莫司(tacrolimus)、間質幹細胞、及黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)。促血管生成因子可包括(但不限於) VEGF、HGF、KGF、bFGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF、TGF-β1、MMP-9及MMP-2。抗血管生成因子可包括(但不限於)體抑素、血管抑素、及內皮抑素(endostatin)、血小板反應蛋白(thrombospondin) (TSP)、色素上皮衍生因子(PEDF)、轉變生長因子β (TGF-beta)、蘭尼單抗(ranibizurnab) (LUCENTIS®)或貝伐單抗(bevacizumab) (AVASTIN®)、金屬蛋白酶之組織抑制劑(TiMP)、血漿蛋白原活化因子抑制物(Plasminogen Activator Inhibitor) (PAI)、泌乳素、干擾素及血管生長素2。激素及激素拮抗劑可包括17B-雌二醇、促腎上腺皮質激素、腎上腺髓素、α-黑色素細胞刺激激素、慢性促性腺激素、皮質類固醇結合球蛋白、皮質酮、地塞米松(dexamethasone)、雌三醇(estriol)、濾泡刺激激素、胃泌素1、升糖素、促性腺激素、氫皮質酮、胰島素、類胰島素生長因子結合蛋白、L-3,3',5'-三碘甲腺胺酸、瘦素、黃體生成激素(leutinizing hormone)、L-甲狀腺素、褪黑激素、MZ4、催產素、副甲狀腺激素、PEC-60、垂體生長激素、黃體酮、泌乳素、分泌素、性激素結合球蛋白、甲狀腺刺激激素、促甲狀腺素釋放因子、甲狀腺素結合球蛋白及血管加壓素。細胞營養素可包括(但不限於)白蛋白、B-27補充劑、胎牛血清(FBS)、乙醇胺、胎球蛋白(fetuin)、麩醯胺酸、胰島素、蛋白腖、經純化之脂蛋白材料、亞硒酸鈉、運鐵蛋白、維生素A、維生素B9、維生素B12、維生素C，或維生素E、葡萄糖、半乳糖、核黃素、硫胺素、生物素、膽固醇、鐵、鋅、銅、硒、鎂及三羧酸。支持細胞生長、存活及植入之基質可包括(但不限於)來自牛角膜上皮之細胞外基質、Matrigel ™ (基底膜基質)或明膠。
本發明亦涵蓋醫藥包裝及/或套組。所提供的醫藥包裝及/或套組可包括本文所提供的醫藥組合物、稀釋劑、及用於藉由在投與至個體之前稀釋該醫藥組合物(較佳在添加該稀釋劑之前不洗滌該等細胞)解凍該醫藥組合物之說明書。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2、GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM、白蛋白或任何其他適宜稀釋劑。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。在一些實施例中，該醫藥組合物係經冷凍保存。在一些實施例中，該等說明書進一步包含用於解凍經冷凍保存的醫藥組合物，及視需要用於將該組合物與該稀釋劑組合且然後將所得組合物投與至個體之說明書。在一些實施例中，該醫藥組合物未經冷凍保存。在一些實施例中，該等說明書進一步包括用於將該組合物與該稀釋劑組合且然後將所得組合物投與至個體之說明書。
本發明之一些態樣提供包括使細胞群體與本文所提供的細胞冷凍保存調配物接觸之方法。該細胞群體可為RPE細胞群體、間質幹細胞群體、間質細胞群體、光受體細胞群體、光受體祖細胞群體、光受體拯救細胞群體、視網膜神經節細胞群體、視網膜神經節祖細胞群體、角膜內皮細胞群體、或角膜內皮祖細胞群體。該細胞群體可藉由多能幹細胞(諸如胚胎幹細胞或誘導型多能幹細胞)之體外分化來產生。該細胞群體可為人類細胞或非人類細胞。
本發明之一些態樣提供包括使細胞群體與本文所提供的細胞冷凍保存調配物接觸以形成醫藥組合物，且然後冷凍保存該醫藥組合物之方法。該等醫藥組合物可使用任何適宜製程(包括在任何適宜溫度下)冷凍保存。例如，該等醫藥組合物可在介於-100℃與-200℃之間之溫度下冷凍保存。在一些實施例中，該等醫藥組合物在低於-125℃之溫度下冷凍保存。在一些實施例中，該等醫藥組合物在處於或低於-135℃之溫度下冷凍保存。在一些實施例中，該等醫藥組合物在低於-150℃之溫度下冷凍保存。可將該等醫藥組合物冷凍保存在液氮或液氮之氣相中。
本發明之一些態樣提供用於治療疾病或病狀之方法，其包括(a)解凍本文所提供的冷凍保存的細胞製劑，藉由用稀釋劑以在約1:1至約1:20、或約1:2至約1:20、或約1:3至約1:20、或約1:4至約1:20、或約1:5至約1:20、或約1:4至約1:19、或約1:4至約1:18、或約1:4至約1:17範圍內之比率(例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19及1:20或更大，例如1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100)稀釋該細胞製劑以形成經稀釋之細胞製劑，及(b)將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。在一些實施例中，該細胞製劑用加溫稀釋劑進行稀釋。在一些實施例中，該細胞製劑用冷稀釋劑進行稀釋。在一些實施例中，該細胞製劑在稀釋之後被輕輕吸移。在一些實施例中，該細胞製劑在稀釋之後被強力吸移。如該等實例中所提供，在其中用加溫稀釋劑稀釋該細胞製劑之實施例與其中用冷稀釋劑稀釋該細胞製劑之實施例之間沒有差異。在其中該等細胞製劑在稀釋之後被輕輕吸移之實施例與其中該等細胞製劑在稀釋之後被強力吸移例如至其中轉移該等細胞製劑用於稀釋之儲存容器或任何容器中之實施例之間細胞之存活率亦沒有差異。 示例性用途及方法
本文所揭示的細胞製劑(包括經冷凍保存的調配物)一旦解凍即可用於各種臨床應用中。如本文所述，該等經冷凍保存的調配物可透過簡單添加稀釋劑(諸如GS2或GS2 Plus)解凍，此後，可在不需要洗滌或其他操縱下將其投與至個體。在一些實施例中，該等經冷凍保存的調配物可在不添加稀釋劑下解凍，此後，可在不需要洗滌或其他操縱下將其投與至個體。
該等經冷凍保存的調配物可包含解離細胞或細胞單層或細胞聚集體或簇或層片。本文所提供的冷凍保存調配物與各種細胞類型、細胞群體及組織(包括(但不限於)成體幹細胞及祖細胞、分化細胞、及包含此類細胞之群體及組織)相容。在一些實施例中，經如此調配之細胞、細胞群體或組織旨在臨床用於再生醫學方法中。例如，該細胞、細胞群體或組織可為可取代個體中損失或退化的細胞或修復或取代個體中已受到損傷或為功能障礙之組織之細胞、細胞群體或組織。例如，在一些實施例中，該細胞、細胞群體或組織可包含多能幹細胞，例如iPS細胞或ES細胞、多潛能幹細胞或祖細胞、或功能性分化細胞、或包含此類細胞或此類細胞之組合之群體或組織。
意欲使用本文所揭示的調配物及方法冷凍保存之細胞、細胞群體或組織包括(但不限於) RPE細胞、光受體細胞、光受體祖細胞、光受體拯救細胞、角膜內皮細胞、角膜內皮祖細胞、間質細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、神經或神經元幹細胞或祖細胞、神經膠質幹細胞或祖細胞、胰臟幹細胞或祖細胞、β細胞、角質細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、或包含此類細胞或基本上由其組成之群體或組織，例如RPE細胞、角膜內皮細胞、光受體拯救細胞之單層或層片或聚集體或簇、胰島或皮膚移植物。
在一些實施例中，該經冷凍保存的細胞製劑可無限期儲存或其可儲存限定時間期，且視需要其可運輸至診所或其他終端使用者位置。明顯地，其可透過僅添加稀釋劑解凍，且然後在無需進一步操縱下投與至個體。該經冷凍保存的調配物通常為低體積調配物。例如，其可具有小於1 mL、小於500 μL、小於250 μL、小於100 μL或小於或約50 μL之體積或本文所揭示的任何體積。其可經稀釋至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍或更多，以便達到適合於所欲臨床使用之體積及細胞濃度。冷凍保護調配物體積與稀釋劑體積之比率可以比率表示且可包括(但不限於)約1:1至約1:20、或約1:2至約1:20、或約1:3至約1:20、或約1:4至約1:20、或約1:5至約1:20、或約1:4至約1:19、或約1:4至約1:18、或約1:4至約1:17，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1: 80、1:85、1:90、1:95、1:100或更大之比率。
該經冷凍保存的細胞製劑通常以諸如(但不限於)至少或約3x10 2/μL、或至少或約10 3/μL、或至少或約2 x 10 3/μL、或至少或約3 x 10 3/μL、或至少或約3.5 x 10 3/μL、或至少或約5 x 10 3/μL、或至少或約10 4/μL、或至少或約5 x 10 4/μL、或至少或約10 5/μL、或至少或約5 x 10 5/μL或更高之高密度包含細胞。如熟練技術者所可明瞭，細胞濃度及所欲用途將引導在投與至個體之前所需的稀釋程度。
該等經冷凍保存的調配物可在冷凍狀態下(諸如在液氮槽之氣相中)儲存一段延長之時間期，諸如彼等本文所述者且包括(但不限於)至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週、至少16週、至少20週、至少24週、至少28週、至少32週、至少36週、至少40週、至少44週、至少48週、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或更長，且對例如藉由染料排除、再植板效率或再生能力測定的細胞存活率或細胞功能具有最小影響。根據本發明冷凍保存且解凍之細胞或細胞群體可具有冷凍保存前的存活率、再植板效率及/或再生能力的至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之細胞存活率、再植板效率及/或再生能力。
在一些實施例中，在介於-100℃與-200℃之間之溫度下，包括在低於-125℃之溫度下、在低於-135℃之溫度下或在低於-150℃之溫度下儲存本文所提供的經冷凍保存的細胞製劑。在一些實施例中，將本文所提供的經冷凍保存的細胞製劑儲存於液氮或液氮之氣相中。
該等經冷凍保存之細胞製劑係藉由將受關注細胞、細胞群體或組織在本文所提供的冷凍保護調配物中組合，視需要將該等細胞、細胞群體、組織分散於該調配物中，且然後緩慢冷凍該混合物組合來產生。緩慢冷凍可手動或藉由裝置完成，如實例中所述。在一個實施例中，該製劑以-1℃/分鐘之速率冷凍直至達到所需、視需要中間之溫度，諸如(例如)-80℃。或者，冷凍速率可為-1.5℃/分鐘或-2℃/分鐘等。該經冷凍保存的細胞製劑可保持在中間溫度數小時、數天或數週或更長。然後可將其保持在更低溫度。作為一個實例，該製劑可使用緩慢冷凍製程達到-80℃，在此之後，可將其儲存在-80℃過夜(或長至約12或約24小時)，在此之後，可將其儲存在液氮槽之氣相中(例如約-125℃)。一旦處於該更低溫度，則即可將其儲存在此數天、數週、數月或甚至數年。在較低溫度下呈經冷凍保存形式時，其甚至可運輸至例如臨床部位，若如此要求的話。冷凍保護調配物之溫度可例如介於0℃與45℃之間，例如，約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36%、約37℃及約40℃。
本發明之一些態樣提供用於治療患有將受益於細胞移植之病症或病狀的個體之方法。該等方法可包括解凍包含如本文所提供的細胞保存調配物之經冷凍保存的細胞製劑，且然後將該經解凍之細胞製劑投與至有需要的個體，視需要無需用稀釋劑稀釋。在一些實施例中，該等方法可包括藉由添加稀釋劑解凍包含如本文所提供的冷凍保存調配物之經冷凍保存的細胞製劑，且然後投與該經解凍且經稀釋之細胞製劑至有需要的個體。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2、GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM或白蛋白。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。在一些實施例中，該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。該個體可患有或可能已經診斷為患有可藉由投與細胞、細胞群體或組織治療的疾病或病症。該細胞製劑以有效於治療該個體中之病症或病狀之細胞劑量投與。在一些實施例中，該病症或病狀包括(但不限於)視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕、近視性黃斑退化、或視網膜萎縮，或與導致光受體損壞及失明之許多視力改變疾病，諸如無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、乾性或濕性年齡相關黃斑退化、色素性視網膜炎，及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)相關聯。在一些實施例中，該方法進一步包括監測該個體中之病症或病狀之至少一種症狀，視需要以確定此種症狀在投與後之嚴重度或頻率是否減低。
術語「治療(treatment/treat/treating)」係指旨在逆轉、減輕、延遲病症或病狀之發作，或抑制病症或病狀之進展之臨床介入。在一些情況下，介入之效應可藉由監測與病症或病狀相關之症狀評估。在一些實施例中，該細胞製劑可在已發生一或多種症狀之後及/或在已診斷出病症或病狀之後投與。在其他實施例中，該細胞製劑可在無症狀下投與，例如以防止或延遲症狀之發作，或抑制病症或病狀之發作或進展。例如，該細胞製劑可在症狀發作(例如根據症狀史及/或根據遺傳或其他易感因素)之前投與至易感個體。該細胞製劑可投與一次或多於一次，包括在規則及限定時間點或根據需要。
該個體可為人類或非人類的哺乳動物。在一些實施例中，該個體為非人類的靈長類動物。在一些實施例中，該個體為嚙齒動物。在一些實施例中，該個體為綿羊、山羊、牛、貓或狗。在一些實施例中，該個體為研究動物。在一些實施例中，該個體為經基因改造，例如經基因改造的非人類個體。該個體可為任何性別及處於任何發展階段。
術語「有效量」如本文所用係指足以引發所需生物反應之生物活性劑之量。例如，在一些實施例中，細胞製劑之有效量可指足以對患有病症或病狀的個體提供治療益處(例如足以改良患有視網膜疾病或病症的個體之視力)之包含一定數目之細胞或一定量之組織之製劑之量。如熟練技術者所瞭解，該有效量可根據各種因素，如例如根據所需生物反應，例如根據所治療的特定病症、待緩解的特定症狀或所靶向的細胞或組織、及根據個體的年齡、性別及一般健康狀態而改變。
本發明之一些態樣提供用於治療視網膜疾病之方法，其中該等方法包括對患有視網膜疾病的個體之眼睛投與有效量之本文所提供的細胞製劑。在一些實施例中，該個體患有視網膜疾病或經診斷為患有視網膜疾病。在一些實施例中，該視網膜疾病為視桿或視錐異常、視網膜退化、色素性視網膜炎、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化，例如濕式或乾式年齡相關黃斑退化、萊伯氏先天性黑矇(Leber congenital amaurosis)或斯特格氏病。在一些實施例中，所投與的該等細胞包含RPE細胞、光受體細胞、光受體祖細胞、光受體拯救細胞、角膜內皮細胞、角膜內皮祖細胞、或視網膜神經節細胞或視網膜神經節祖細胞，其中任何者可藉由多能幹細胞(諸如胚胎幹細胞或誘導型多能幹細胞)之體外分化來產生。 套組
本發明之一些態樣提供套組，其包含(a)包含如本文所提供的受關注細胞之經冷凍保存的醫藥組合物；(b)稀釋劑，諸如(但不限於) GS2或GS2 Plus、及(c)用於添加該稀釋劑至該組合物，藉此解凍且稀釋該組合物，且使得其適合於投與至個體之說明書。彼等說明書亦可規定在解凍後無需經冷凍保存的組合物之洗滌或其他操縱。該套組可進一步包含用於投與該組合物之裝置，諸如注射器及針。
因此，本發明尤其提供以下： 子句1.    一種調配物，其包含約4至10% (v/v)冷凍保護劑、約2至8% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖及緩衝液。 子句2.    如子句1之調配物，其中該冷凍保護劑係選自DMSO、甘油及乙二醇。 子句3.    如子句1之調配物，其中該冷凍保護劑為DMSO。 子句4.    如前述子句中任一項之調配物，其中該調配物包含約4至6% (v/v)冷凍保護劑。 子句5.    如前述子句中任一項之調配物，其中該調配物包含約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖。 子句6.    如前述子句中任一項之調配物，其中該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約2.5% (w/v)白蛋白、約0.09% (w/v)葡萄糖及緩衝液。 子句7.    如子句1至4中任一項之調配物，其中該調配物包含約0.6% (w/v)葡萄糖。 子句8.    如子句1至4及7中任一項之調配物，其中該調配物包含約5% DMSO、約2.5%白蛋白、約0.6%葡萄糖及緩衝液。 子句9.    如前述子句中任一項之調配物，其中白蛋白為人類白蛋白。 子句10.  如前述子句中任一項之調配物，其中白蛋白為重組人類白蛋白。 子句11.  如前述子句中任一項之調配物，其中該緩衝液為緩衝鹽水。 子句12.  如前述子句中任一項之調配物，其中該緩衝液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。 子句13.  如子句11或12之調配物，其中該緩衝鹽水包含Ca2+及Mg2+。 子句14.  如子句11或12之調配物，其中該緩衝鹽水不包含Ca2+及Mg2+。 子句15.  如前述子句中任一項之調配物，其進一步包含細胞群體或組織。 子句16.  如子句15之調配物，其中該細胞群體為解離細胞群體。 子句17.  如子句15之調配物，其中該細胞群體包含細胞單層、細胞層片、細胞簇、細胞球體或細胞聚集體。 子句18.  如子句15之調配物，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。 子句19.  如前述子句中任一項之調配物，其中該調配物係經冷凍保存。 子句20.  如前述子句中任一項之調配物，其中該調配物不包含聚合物賦形劑。 子句21.  如前述子句中任一項之調配物，其中該調配物不包含聚葡萄糖。 子句22.  一種細胞製劑，其包含 (a)如子句1至14中任一項之調配物及 (b)細胞群體。 子句23.  如子句22之細胞製劑，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。 子句24.  如子句22或23之細胞製劑，其中該細胞群體為約10,000個細胞至100000個細胞/μL之濃度含在細胞製劑中。 子句25.  如子句22或23之細胞製劑，其中該細胞群體為約15,000至50,000個細胞/μL之濃度含在細胞製劑中。 子句26.  如子句22至25中任一項之細胞製劑，其係含在冷凍保存小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中。 子句27.  如子句26之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10至約500 µL之該製劑。 子句28.  如子句26或27之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至10 7個細胞。 子句29.  如子句24或25之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至5 x 10 6個細胞。 子句30.  如子句24或25之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至2 x 10 6個細胞。 子句31.  如子句22至30中任一項之細胞製劑，其中該細胞製劑係經冷凍保存。 子句32.  一種製備細胞製劑之方法，其包括使如子句1至14中任一項之調配物與細胞群體接觸。 子句33.  如子句29之方法，其進一步包括冷凍保存該細胞製劑。 子句34.  如子句32或33之方法，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。 子句35.  一種治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括， 解凍如子句31之細胞製劑，用稀釋劑以選自由1:2、1:3、1:4及1:5組成之群之比率稀釋該細胞製劑，及 將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。 子句36.  如子句35之方法，其中該病症或病狀係選自由視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕、近視性黃斑退化、或視網膜萎縮組成之群或與導致光受體損傷及失明之許多視力改變疾病諸如(例如)無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)相關聯。 子句37.  如子句35之方法，其中該稀釋劑為GS2、GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM或白蛋白。 子句38.  一種治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括， 解凍如子句31之細胞製劑，用稀釋劑以選自由1:15、1:16、1:17、1:18及1:19組成之群之比率稀釋該細胞製劑，及 將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。 子句39.  如子句37之方法，其中該病症或病狀係選自由視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕、近視性黃斑退化、或視網膜萎縮組成之群或與導致光受體損傷及失明之許多視力改變疾病諸如(例如)無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)相關聯。 子句40.  如子句38之方法，其中該稀釋劑為GS2或GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM或白蛋白。 子句41.  一種套組，其包含 (a)如子句31之經冷凍保存的細胞製劑， (b)稀釋劑，及 (c)用於在投與至個體之前稀釋該細胞製劑之說明書。 子句42.  如子句41之套組，其中該等說明書進一步包含用於解凍該經冷凍保存的細胞製劑之說明書。 子句43.  一種醫藥組合物，其包含如子句1至14中任一項之調配物與細胞群體之組合。 子句44.  如子句43之醫藥組合物，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。 子句45.  如子句43之醫藥組合物，其中該細胞群體包含神經細胞、神經幹細胞或神經前驅細胞。 子句46.  一種醫藥組合物，其包含如子句15至21中任一項之調配物及稀釋劑，其中該調配物與稀釋劑比率係在1:2至1:20範圍內，其中該醫藥組合物適合於投與至個體，視需要投與至眼睛，另視需要投與至視網膜下。 子句47.  一種包含如子句22至25及31中任一項之細胞製劑及稀釋劑之醫藥組合物，其中該細胞製劑與稀釋劑比率係在1:2至1:20範圍內，其中該醫藥組合物適合於投與至個體，視需要投與至眼睛，另視需要投與至視網膜下。 子句48.  一種包含如子句1至14、19、20及21中任一項之調配物及稀釋劑之細胞製劑，其中該調配物與稀釋劑比率係在1:2至1:20範圍內，其中該調配物包含細胞群體，其中該細胞製劑適合於投與至個體，視需要投與至眼睛，進一步視需要投與至視網膜下。 子句49.  如子句46或47之醫藥組合物或如子句48之細胞製劑，其中該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前或之後未經洗滌。 子句50.  如子句46或47之醫藥組合物或如子句48之細胞製劑，其中該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前或之後未經離心。 子句51.  如子句46或47之醫藥組合物或如子句48之細胞製劑，其中該調配物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前經冷凍保存。 子句52.  如子句48至51中任一項之醫藥組合物或細胞製劑，其中DMSO係以等於或小於約1% (v/v)之水準下之可偵測量存在。 子句53.  如子句48至51中任一項之醫藥組合物或細胞製劑，其中DMSO係以等於或小於約0.037 mg/劑量之水準下之可偵測量存在。 子句54.  一種包含如子句1至14中任一項之調配物及細胞群體之細胞製劑，其中該細胞製劑係藉由用稀釋劑稀釋來解凍且未經洗滌。 子句55.  如子句54之細胞製劑，其中該細胞製劑係用稀釋劑以選自由1:2至1:20組成之群之比率稀釋。 子句56.  如子句54或55之細胞製劑，其中DMSO係以等於或小於約0.037 mg/劑量之水準下之可偵測量存在。 子句57.  如子句54至56中任一項之細胞製劑，其中該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。 實例
現大體上描述本發明，其藉由參考以下實例而更易於理解，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例之目的而包括，而非意圖限制本發明。 實例 1 – 冷凍保護調配物保存解凍後細胞存活率及細胞生長
將衍生自人類胚胎幹細胞之RPE組併於225 mL瓶中且用200 mL 0.5% rHA/DPBS藉由以160 x g離心5分鐘而洗滌。重複洗滌總共3次。
用0.09%葡萄糖/2.5% rHA/DPBS再懸浮RPE細胞，接著以1:1之體積比與含有DMSO、rHA及葡萄糖之緩衝液混合。如表1中所顯示製備九(9)種含有不同濃度之DMSO、白蛋白及葡萄糖之調配物。 表1
將三十(30) µL經調配之RPE細胞填充於Crystal Zenith ®(CZ)小瓶(West Pharmaceutical Services, Inc. Exton，PA)中且使用Corning ®CoolCell ®容器 (Corning Life Sciences，Tewksbury，MA)冷凍保存用於緩慢冷凍保存。然後將該等小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。
使用台盼藍細胞計數方法來評估預冷凍細胞存活率。因此，在九種調配物當中未觀察到顯著差異(參見圖1)。所有調配物之預冷凍存活率均高於95%。
使用手動台盼藍細胞計數方法及使用NucleoCounter ®NC-200™ (ChemoMetec Inc. Bohemia，NY)裝置之自動方法來評估解凍後細胞存活率。使用任一種方法，在九種調配物當中未觀察到顯著差異(參見圖2) (n=3)。所有調配物之解凍後存活率均高於90%且在94%至98%範圍內。
使用CyQUANT ®細胞增殖檢定(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)來評估解凍後細胞生長。經冷凍保存的RPE小瓶經解凍、接種且培養於96孔板中之生長培養基中。在第2天及第4天冷凍板以評估其細胞生長指數，該指數藉由在細胞裂解後自細胞提取之DNA濃度定義。在九種調配物當中未觀察到顯著差異(參見圖3)。 實例 2 – 冷凍保護劑減少多核細胞之產生
將衍生自人類胚胎幹細胞之RPE細胞組併於50 mL管中且用30 mL 0.5% rHA/DPBS藉由以160x g離心5分鐘而洗滌。重複洗滌總共3次。
將RPE細胞以50K個細胞/μl之密度再懸浮於2.5% rHA/DPBS中，接著以1:1之體積比與含冷凍保護劑之緩衝液混合。如表2中所顯示製備五(5)種含有1% DMSO、2.5% DMSO、5% DMSO、5%甘油或5%乙二醇之調配物，該5種調配物中之各者均含有50 mM海藻糖、7.5%聚葡萄糖40及2.5% rHA於DPBS中。 表2
A B C D E
DMSO 1% 2.5% 5% - -
甘油 5% -
乙二醇 - - - - 5%
賦形劑 50 mM 海藻糖、7.5% 聚葡萄糖40 、2.5% r 白蛋白，PBS
細胞密度 50K 個細胞/µL
十(10) µL經調配之RPE細胞添加至cryovial且使用Mr.Frosty™冷凍容器(Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham，MA)冷凍保存以進行緩慢冷凍保存。然後將小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。
經冷凍保存的RPE細胞經解凍、接種且培養於生長培養基中3天，且在顯微鏡下評估多核細胞之存在。調配物A (1% DMSO)中之RPE細胞顯示在數百個RPE細胞視野中存在細胞中具有多於四個核之一些多核細胞(參見圖4A)，然而調配物B (2.5% DMSO)顯示在數百個RPE細胞視野中存在細胞中具有多於四個核之一個多核細胞。
調配物C (5% DMSO)及E (5%乙二醇)中之RPE細胞顯示在數百個RPE細胞當中之視野中沒有細胞中具有多於三個核之多核細胞，及調配物D (5%甘油)中之RPE細胞沒有顯示在數百個RPE細胞當中之視野中存在細胞具有多於四個核之任何多核細胞(圖4B)。
此等結果指示細胞穿透冷凍保護劑(諸如DMSO、甘油及乙二醇)減少多核細胞之產生。 實例 3 – 其他賦形劑於多核化、細胞生長及存活率之效應
將衍生自人類胚胎幹細胞之RPE細胞組併於50 mL管中且用30 mL 0.5% rHA/DPBS藉由以160x g離心5分鐘而洗滌。重複洗滌總共3次。
用2.5% rHA/DPBS再懸浮RPE細胞，接著以1:1之體積比與含有冷凍保護劑之緩衝液混合。如表3中所顯示製備八(8)種含有不同量之甘油及聚葡萄糖40之調配物，各含有0.09%葡萄糖及2.5% rHA於DPBS (具有或不具有Ca、Mg)中。 表3
條件 賦形劑1 賦形劑2 其他 細胞密度
G5D10 PBS- 5%甘油 10%聚葡萄糖40 0.09%葡萄糖 2.5% r白蛋白 PBS (-Ca、-Mg) 50K個細胞/µL
G2.5D10 PBS- 2.5%甘油 10%聚葡萄糖40
G5D7.5 PBS- 5%甘油 7.5%聚葡萄糖40
G2.5D7.5 PBS- 2.5%甘油 7.5%聚葡萄糖40
G5D10 PBS+ 5%甘油 10%聚葡萄糖40 0.09%葡萄糖 2.5% r白蛋白 PBS (+Ca、+Mg)
G2.5D10 PBS+ 2.5%甘油 10%聚葡萄糖40
G5D7.5 PBS+ 5%甘油 7.5%聚葡萄糖40
G2.5D7.5 PBS+ 2.5%甘油 7.5%聚葡萄糖40
將十(10) µL經調配之RPE細胞添加至cryovial且使用Mr.Frosty™冷凍容器(Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham，MA)冷凍保存以進行緩慢冷凍保存。然後將小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。
使用台盼藍細胞計數方法來評估解凍後細胞存活率。亦使用CyQUANT ®細胞增殖檢定(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)來評估解凍後細胞生長。經冷凍保存的RPE小瓶經解凍、接種且培養於96孔板中之生長培養基中。在第2天及第3天冷凍板以評估DNA濃度作為細胞生長指數。在八種調配物當中未觀察到顯著差異(參見圖5A) (存活率：n=1，細胞生長：n=3)。針對所有2.5%甘油條件均觀察到多核細胞，但針對5%甘油未觀察到多核細胞(圖5B)。
將RPE細胞組併於50 mL管中且用30 mL 0.5% rHA/DPBS藉由以160x g離心5分鐘而洗滌。重複洗滌總共3次。
用2.5% rHA/DPBS再懸浮RPE細胞，接著以1:1之體積比與含有冷凍保護劑之緩衝液混合。如表4中所顯示製備五(5)種調配物。 表4
條件 賦形劑1 賦形劑2 其他 細胞密度
D5 5% DMSO - 0.09%葡萄糖 2.5% r白蛋白 PBS (-Ca、-Mg)    50K個細胞/µL
G5 5%甘油 7.5%聚葡萄糖40
D0 - 7.5%聚葡萄糖40
G2.5 2.5%甘油 7.5%聚葡萄糖40
P2.5 2.5%丙烷二酸 7.5%聚葡萄糖40
將十(10) µL經調配之RPE細胞添加至cryovial且使用Mr. Frosty™冷凍容器(Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham，MA)冷凍保存以進行緩慢冷凍保存。然後將小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。
使用台盼藍細胞計數方法來評估解凍後細胞存活率。亦使用CyQUANT ®細胞增殖檢定(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)來評估解凍後細胞生長。經冷凍保存的RPE小瓶經解凍、接種且培養於96孔板中之生長培養基中。在第2天及第3天冷凍板以評估DNA濃度作為細胞生長指數。在五種調配物當中未觀察到顯著差異(參見圖6A) (存活率：n=1，細胞生長：n=3)。針對2.5%甘油及2.5%丙烷二酸(例如1,2丙烷二酸)觀察到多核細胞但針對5% DMSO或5%甘油未觀察到多核細胞(參見圖6B)。 實例 4 – 於吸附及冷凍保護之白蛋白效應
將RPE細胞組併於225 mL瓶中且用200 mL 0.5% rHA/DPBS藉由以500x g離心5分鐘而洗滌。重複洗滌總共4次。
用2.5% rHA/0.09%葡萄糖/DPBS再懸浮RPE細胞，接著以1:1之體積比與含有DMSO之緩衝液混合。如表5中所示製備含有不同密度之細胞及白蛋白濃度之四(4)種調配物。 表5
細胞密度 DMSO rh白蛋白 葡萄糖 緩衝液
50,000個細胞/µL    2.5% 0.09% 5%
-
15,000個細胞/µL 2.5%
-
將三十(30) µL經調配之RPE細胞添加至Crystal Zenith ®(CZ)小瓶(West Pharmaceutical Services, Inc. Exton，PA)且使用受控速率冷凍器在不同冷凍保存條件(例如不同類型之儲存容器、不同預冷凍儲存溫度及不同預冷凍持續時間)下冷凍保存，如表6中所顯示。然後將小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。 表6
使用Vi-CELL BLU細胞存活率分析儀(Beckman Coulter, Inc.，Indianapolis，IN)，使用台盼藍方法來評估解凍後細胞存活率。含有白蛋白之調配物顯示比不含白蛋白之調配物更高之解凍後存活率，尤其是在冷凍前儲存長至6小時，如表7中所顯示。 表7
基於該等結果，白蛋白顯示在調配製程中之穩定效應。 實例 5 – 細胞藥物產品調配物證實無毒性
如表8中所顯示製備以下四(4)種測試媒劑或物品以及GS2及GS2 Plus且進行非-GLP急性毒性研究。 表8
測試媒劑或測試物品之名稱 測試物品之簡要說明
冷凍保存調配物#1 包含5% DMSO、0.09%葡萄糖、2.5% rh白蛋白及DPBS之冷凍保存調配物，使用前用GS2 Plus稀釋
冷凍保存調配物#3 包含5%甘油、7.5%聚葡萄糖40、0.09%葡萄糖、2.5% rh白蛋白及DPBS之冷凍保存調配物 使用前用GS2 Plus稀釋
冷凍保存調配物#4 包含5%丙烷二酸、7.5%聚葡萄糖40、0.09%葡萄糖、2.5% rh白蛋白及DPBS之冷凍保存調配物 使用前用GS2 Plus稀釋
CryoStor CS5 (BioLife Solutions) 含有5% DMSO之市售冷凍介質 使用前用GS2 Plus稀釋
將6種調配物中之各者添加至塑膠小瓶且在2至8°C或-10至-30°C下儲存。冷凍調配物在投與前加以解凍並稀釋，且以單一單邊劑量經由視網膜下注射投與至NIH- Lyst bg-JFoxn1 nuBtk xid (NIH III)免疫功能不全小鼠。在1天及14天觀察期後評估動物。毒性之評估係基於臨床觀察結果、體重及攝食量量測、眼科檢查、及臨床及解剖病理評估。
在任何調配物中均未觀察到毒性。 實例 6 – 對不同類型之細胞之適用性
將光受體拯救細胞(PRC)組併於50 mL管中且使用OptiPrep TM(STEMCELL Technologies, Inc.，Vancouver，Canada)離心以自細胞懸浮液移除死細胞及碎片，接著首先用生長培養基以300x g洗滌10分鐘，然後用0.5% rHA/DPBS藉由以300x g離心10分鐘而洗滌。
用0.5% rHA/DPBS再懸浮光受體拯救細胞，接著以1:2之體積比與含有冷凍保護劑之緩衝液混合。在含有2.5% rHA、具有Ca/Mg之DPBS、0.6%葡萄糖及不同濃度之DMSO (10% DMSO及5% DMSO)之調配物中製備PRC細胞。為了比較，亦在市售CryoStor® CS10細胞冷凍介質(STEMCELL Technologies, Inc.，Vancouver，Canada) (其含有10% DMSO)中調配PRC細胞。
將細胞以70,000個細胞/μl含在50 µL (每一小瓶總共350萬個細胞)中添加至Crystal Zenith ®(CZ)小瓶(West Pharmaceutical Services, Inc. Exton，PA)且使用受控速率冷凍器以-1℃/min冷凍保存。然後將小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。藉由使用70,000個細胞/μl含在50 μL中，可達成以下標靶劑量：當將該等細胞在緩衝液(例如GS2 Plus緩衝液)中1:4稀釋時，1,000,000個細胞含在150 μl中(佔由於細胞死亡及恢復損失所致細胞損失約50%)；當將該等細胞在GS2 Plus緩衝液中1:17稀釋時，300,000個細胞含在150 μl中(佔由於細胞死亡及恢復損失所致細胞損失約50%)。
使用台盼藍細胞計數方法來評估解凍後細胞存活率。本發明之含有5% DMSO、2.5% rHA、具有Ca/Mg之DPBS及0.6%葡萄糖之調配物顯示與本發明之含有10% DMSO、2.5% rHA、具有Ca/Mg之DPBS及0.6%葡萄糖之調配物相似之存活率(參見圖7A) (n=3)。與市售CryoStor® CS10相比，本發明之兩種調配物顯示更高之存活率。亦使用本發明之含有5% DMSO、7.5% DMSO及10% DMSO之調配物確定冷凍-解凍後PRC之存活率(參見圖7B) 實例 7 – 對不同類型之細胞之適用性 (2)
將衍生自人類誘導型多能幹(iPS)細胞之人類角膜內皮細胞(CEC)離心以移除培養基組分及任何解離酵素，接著用0.5% rHA/DPBS藉由以200x g離心5分鐘而洗滌。
然後用包含2.5% rHA、0.09%葡萄糖、具有Ca及Mg之DPBS、及5% DMSO或10% DMSO中之任一者之調配物再懸浮CEC細胞集結粒。靶細胞密度為30,000個細胞/µL。
將五十(50) µL經調配之CEC細胞添加至cryovial且以約-1℃/min之冷凍速率在Corning ®CoolCell ®容器(Corning Life Sciences，Tewksbury，MA)中冷凍保存。在-80℃下過夜儲存之後，轉移小瓶且儲存於液氮之氣相中。
使用台盼藍細胞計數方法來評估解凍後細胞存活率。將小瓶在37℃水浴中解凍且用DPBS稀釋，然後與台盼藍試劑進行混合。對於含有DMSO 5%及10%之冷凍緩衝液，細胞存活率分別為89.3%及88.2%。
作為比較，亦以更低細胞密度(3百萬個細胞/mL)且以標準體積(1 mL/小瓶)在2.5% rHA、0.09%葡萄糖、具有Ca及Mg之DPBS及5% DMSO中冷凍保存CEC細胞。當藉由台盼藍細胞計數方法測定時，在此等條件下之解凍後細胞存活率為86.2%(參見圖8)。 實例 8 - 細胞藥物產品調配物之另外候選者
將衍生自人類胚胎幹細胞之RPE細胞組併於50 mL管中且用30 mL 0.5% rHA/DPBS藉由以160x g離心5分鐘而洗滌。重複洗滌總共3次。
用2.5% rHA/0.09%葡萄糖/DPBS再懸浮RPE細胞，接著以1:1之體積比與含有冷凍保護劑之緩衝液混合。如表9中所顯示，製備含有5%甘油、200 mM牛磺酸或100 mM海藻糖、0.09%葡萄糖及2.5% rHA於DPBS中之調配物(冷凍保存調配物#5及冷凍保存調配物#6)。 表9
冷凍保存調配物 DMSO rh白蛋白 葡萄糖 丙三醇 丙二醇 聚葡萄糖40 牛磺酸 海藻糖 緩衝液
#1 5 v/v% 2.5 w/v% 0.09 w/v% - - - - - DPBS
#2 - 2.5 w/v% 0.09 w/v% - - 7.5 w/v% - -
#3 - 2.5 w/v% 0.09 w/v% 5 v/v% - 7.5 w/v% - -
#4 - 2.5 w/v% 0.09 w/v% - 5 v/v% 7.5 w/v% - -
#5 - 2.5 w/v% 0.09 w/v% 5 v/v% - - 200 mM -
#6 - 2.5 w/v% 0.09 w/v% 5 v/v% - - - 100 mM
將十(10) µL經調配之RPE細胞添加至cryovial且使用Corning ®CoolCell ®容器(Corning Life Sciences，Tewksbury，MA)冷凍保存以進行緩慢冷凍保存。然後將小瓶轉移且儲存於液氮之氣相中。
使用台盼藍細胞計數方法來評估解凍後細胞存活率。亦使用CyQUANT ®細胞增殖檢定(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)來評估解凍後細胞生長。經冷凍保存的RPE小瓶經解凍、接種且培養於96孔板中之生長培養基中。在第2天及第3天冷凍板以評估DNA濃度作為細胞生長指數。如表10中所顯示，在冷凍保存調配物#1、冷凍保存調配物#5及冷凍保存調配物#6當中未觀察到顯著差異且在具有冷凍保存調配物#1、冷凍保存調配物#5及冷凍保存調配物#6之數百個RPE細胞當中未觀察到在一個細胞中具有多於四個核之多核細胞。 表10
調配物 存活率(%) 第2天時的標準化細胞生長 第3天時的標準化細胞生長 多核細胞
陽性對照 (冷凍保存調配物#1) 97.1 106.3 100.2 陰性
5%丙三醇、0.2M牛磺酸(冷凍保存調配物#5) 96.8 102.2 101.2 陰性
5%丙三醇、0.1M海藻糖(冷凍保存調配物#6) 98.0 101.7 107.4 陰性
冷凍保存調配物#2不含有任何細胞穿透細胞保護劑且因此可潛在地對細胞產生毒性，且亦顯示由於聚葡萄糖40所致之高黏度。此外，在冷凍保存於細胞保存調配物#2中之RPE細胞中觀察到多核細胞。雖然冷凍保存調配物#3及冷凍保存調配物#4顯示較少多核細胞，但其亦顯示由於聚葡萄糖40含在調配物中所致之高黏度。冷凍保存調配物#5及冷凍保存調配物#6缺乏多核細胞且展現由於缺乏聚合物賦形劑所致之低黏度。 等效物及範疇以引用方式併入
熟習此項技術者當知曉或能夠使用不超過例行實驗來確定本文所述的實施例之許多等效物。本發明之範疇無意受限於以上描述，而是如隨附申請專利範圍中所述。
除非本文清楚地另作指明，否則冠詞諸如「一(a/an)」及「該」包括單數及複數個指示物。因此，例如，提及「一藥劑」時包括單一藥劑及複數種此類藥劑。
若存在一個、多於一個或所有組成員，則在該組之兩個或更多更成員之間包括「或」之請求項或描述被認為是滿足的，除非指明相反情況或另外自內文顯而易見。在兩個或更多個組成員之間包括「或」之組之揭示內容提供其中存在該組之恰好一個成員之實施例、其中存在該組之多於一個成員之實施例及其中存在所有組成員之實施例。出於簡潔之目的，彼等實施例尚未個別地在此處闡明，但應理解，此等實施例中之各者提供於本文中且可經明確主張或不主張。
應理解，本發明涵蓋其中將來自一或多個該等請求項或來自本描述之一或多個相關部分之一或多個限制、要素、子句或描述性術語引入至另一請求項中之所有變型、組合及排列。例如，附屬於另一請求項之請求項可經修改以包括在附屬於相同基礎請求項的任何其他請求項中找到之一或多個該等限制。此外，在該等請求項列舉組合物之情況下，應理解，包括根據本文所揭示的任何製造或使用方法或根據此項技術中已知的方法(若有的話)製造或使用組合物之方法，除非另有指示或除非一般技術者明白會出現矛盾或不一致。
在要素以清單例如以馬庫西群組(Markush group)格式呈現之情況下，應理解，亦揭示該等要素之每個可能子組，及可自該組移除要素之任何要素或子組。亦應注意，術語「包含」意欲為開放性且允許包含另外要素或步驟。應理解，一般而言，在實施例、產品或方法稱為包含特定要素、特徵或步驟之情況下，亦提供由此類要素、特徵或步驟組成或基本上由其組成之實施例、產品或方法。出於簡潔之目的，彼等實施例尚未個別地在此處闡明，但應理解，此等實施例中之各者提供於本文中且可經明確主張或不主張。
在範圍給定之情況下，包括端點。此外，應理解，除非另有指示或另外自內文及/或一般技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值在一些實施例中可假定在規定範圍內的任何特定值，至該範圍之下限之十分之一單位，除非內文清楚地另作指明。出於簡潔之目的，每個範圍中之值尚未個別地在此處闡明，但應理解，此等值中之各者提供於本文中且可經明確主張或不主張。亦應理解，除非另有指示或另外自內文及/或一般技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可假定在給定範圍內之任何子範圍，其中該子範圍之端點表示為與該範圍之下限之十分之一單位相同的準確度。
此外，應理解，本發明之任何特定實施例可明確地自該等請求項中之任何一者或多者排除。在給定範圍之情況下，可明確地自該等請求項中之任何一者或多者排除在該範圍內之任何值。可自任何一或多個請求項排除本發明之組合物及/或方法之任何實施例、要素、特徵、應用或態樣。出於簡潔之目的，本文未明確闡述其中排除一或多個要素、特徵、目的或態樣之所有實施例。
本文例如在先前技術、發明內容、實施方式、實例及/或參考文獻部分中提及的所有公開案、專利、專利申請案、公開案及資料庫條目(例如序列資料庫條目)以其全文引用之方式併入本文中，其引入程度如同每個個別公開案、專利、專利申請案、公開案及資料庫條目以引用之方式特定地及個別地併入本文中。在發生衝突之情況下，將以本申請案(包括本文中的任何定義)為準。
圖 1顯示在如表1中所顯示的含有不同濃度之二甲基亞碸(DMSO)、白蛋白及葡萄糖之調配物中製備的視網膜色素上皮(RPE)細胞之預冷凍細胞存活率。冷凍保存調配物#1及冷凍保存調配物#1 (第2個)係指相同調配物之不同製劑。
圖 2顯示在如表1中所顯示的含有不同濃度之DMSO、白蛋白及葡萄糖之調配物中製備的RPE細胞之解凍後細胞存活率。每個雙柱之第一柱代表手動(台盼藍)存活率量測，及每個雙柱之第二柱代表使用NC-200裝置之自動存活率量測。
圖 3顯示在如表1中所顯示的含有不同濃度之DMSO、白蛋白及葡萄糖之調配物中製備的RPE細胞之解凍後細胞生長，使用CyQUANT®細胞增殖檢定評估。每個雙柱之第一柱代表在解凍後第2天時進行之量測，及每個雙柱之第二柱代表在解凍後第4天時進行之量測。
圖 4A為在解凍、接種且在生長培養基中培養3天之後在顯微鏡下之經冷凍保存的RPE細胞(包括多核細胞)之影像。箭頭指示多核細胞。圖4B為顯示存在於調配物A至E中之解凍後培養物中之多核細胞之定量分析之圖。每個分組之第一柱代表雙核細胞，第二柱代表三核細胞，第三柱代表四核細胞，及第四柱代表具有五個或更多個之細胞。
圖 5A顯示在如表3中所顯示的含有2.5%或5%甘油(「G」)、7.5%或10%聚葡萄糖40 (「D」)及2.5% rHA於DPBS (具有或不具有Ca及Mg，分別表示為「PBS-」及「PBS+」)中之調配物中製備的RPE細胞之解凍後細胞存活率(柱狀圖上方的圓圈)及解凍後第2天(每個雙柱的第一柱)及第3天(每個雙柱的第二柱)時之解凍後細胞生長，其藉由DNA濃度評估。圖5B為顯示存在於調配物中之解凍後培養物中之多核細胞之定量分析之圖。每個分組之第一柱代表雙核細胞，第二柱代表三核細胞，第三柱代表四核細胞，及第四柱代表具有五個或更多個之細胞。
圖 6A顯示在含有5% DMSO (D5)或5%甘油 + 7.5%聚葡萄糖40 (G5)或7.5%聚葡萄糖40 (D0)或2.5%甘油 + 7.5%聚葡萄糖40 (G2.5)或2.5%丙烷二酸(P2.5) + 7.5%聚葡萄糖40 (P2.5)之調配物中製備的RPE細胞之解凍後細胞存活率(柱狀圖上方的圓圈)及第2天(每個雙柱之第一柱)及第3天(每個雙柱之第二柱)時之解凍後細胞生長，其藉由DNA濃度評估，每種調配物亦含有0.09%葡萄糖、2.5% rHA於PBS (+Ca、+Mg)，如表4中所顯示。圖6B為顯示存在於調配物中之解凍後培養物中之多核細胞之定量分析之圖。每個分組之第一柱代表雙核細胞，第二柱代表三核細胞，第三柱代表四核細胞，及第四柱代表具有五個或更多個之細胞。
圖 7A顯示在含有2.5% rHA、具有Ca及Mg之DPBS、0.6%葡萄糖及不同濃度之DMSO (5% DMSO或10% DMSO)之調配物中製備的光受體拯救細胞(PRC)細胞及在含有10% DMSO之市售CryoStor® CS10細胞冷凍調配物中調配的PRC細胞(用於比較)之解凍後細胞存活率。圖7B顯示在含有2.5% rHA、具有Ca及Mg之DPBS、0.6%葡萄糖及不同濃度之DMSO (5% DMSO、7.5% DMSO或10% DMSO)之調配物中製備的光受體拯救細胞(PRC)細胞之解凍後細胞存活率。
圖 8顯示在含有2.5% rHA、0.09%葡萄糖、具有Ca及Mg之DPBS及不同濃度之DMSO (5%或10%)之調配物中以30,000個細胞/μL之密度及50 μL之體積製備的角膜內皮細胞(CEC)細胞之解凍後細胞存活率與以更低細胞密度(3百萬個細胞/mL)且以標準體積(1 mL/小瓶)冷凍保存於2.5% rHA、0.09%葡萄糖、具有Ca及Mg之DPBS及5% DMSO濃度中之CEC細胞之解凍後細胞存活率之比較。

Claims (57)

  1. 一種調配物，其包含約4至10% (v/v)冷凍保護劑、約2至8% (w/v)白蛋白、約0至1.5% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。
  2. 如請求項1之調配物，其中該冷凍保護劑係選自DMSO、甘油，及乙二醇。
  3. 如請求項1之調配物，其中該冷凍保護劑為DMSO。
  4. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該調配物包含約4至6% (v/v)冷凍保護劑。
  5. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該調配物包含約0.08至0.10% (w/v)葡萄糖。
  6. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該調配物包含約5% (v/v) DMSO、約2.5% (w/v)白蛋白、約0.09% (w/v)葡萄糖，及緩衝液。
  7. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該調配物包含約0.6% (w/v)葡萄糖。
  8. 如請求項1至4及7中任一項之調配物，其中該調配物包含約5% DMSO、約2.5%白蛋白、約0.6%葡萄糖，及緩衝液。
  9. 如前述請求項中任一項之調配物，其中白蛋白為人類白蛋白。
  10. 如前述請求項中任一項之調配物，其中白蛋白為重組人類白蛋白。
  11. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該緩衝液為緩衝鹽水。
  12. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該緩衝液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
  13. 如請求項11或12之調配物，其中該緩衝鹽水包含Ca2+及Mg2+。
  14. 如請求項11或12之調配物，其中該緩衝鹽水不包含Ca2+及Mg2+。
  15. 如前述請求項中任一項之調配物，其進一步包含細胞群體或組織。
  16. 如請求項15之調配物，其中該細胞群體為解離細胞群體。
  17. 如請求項15之調配物，其中該細胞群體包含細胞單層、細胞層片、細胞簇、細胞球體或細胞聚集體。
  18. 如請求項15之調配物，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞，或角膜內皮細胞。
  19. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該調配物係經冷凍保存。
  20. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該調配物不包含聚合物賦形劑。
  21. 如前述請求項中任一項之調配物，其中該調配物不包含聚葡萄糖。
  22. 一種細胞製劑，其包含 (a)如請求項1至14中任一項之調配物及 (b)細胞群體。
  23. 如請求項22之細胞製劑，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
  24. 如請求項22或23之細胞製劑，其中在細胞製劑中該細胞群體濃度為約10,000個細胞至100,000個細胞/μL。
  25. 如請求項22或23之細胞製劑，其中在細胞製劑中該細胞群體濃度為約15,000至50,000個細胞/μL。
  26. 如請求項22至25中任一項之細胞製劑，其係在冷凍保存小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中。
  27. 如請求項26之細胞製劑，其中約10至約500 μL之該製劑係含在該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中。
  28. 如請求項26或27之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至10 7個細胞。
  29. 如請求項24或25之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至5 x 10 6個細胞。
  30. 如請求項24或25之細胞製劑，其中該小瓶、注射器、安瓿、瓶或冷卻器包裝中存在約10 5至2 x 10 6個細胞。
  31. 如請求項22至30中任一項之細胞製劑，其中該細胞製劑係經冷凍保存。
  32. 一種製備細胞製劑之方法，其包括使如請求項1至14中任一項之調配物與細胞群體接觸。
  33. 如請求項32之方法，其進一步包括冷凍保存該細胞製劑。
  34. 如請求項32或33之方法，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
  35. 一種治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括， 解凍如請求項31之細胞製劑，該細胞製劑用稀釋劑以選自由1:2、1:3、1:4及1:5組成之群之比率稀釋，及 將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。
  36. 如請求項35之方法，其中該病症或病狀係選自由視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕(Angioid streak)、近視性黃斑退化(Myopic Macular Degeneration)、或視網膜萎縮組成之群，或與導致光受體損傷及失明之許多視力改變疾病，諸如無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎，及斯特格氏病(Stargardt’s Disease) (眼底黃色斑點症(fundus flavimaculatus))相關聯。
  37. 如請求項35之方法，其中該稀釋劑為GS2、GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM，或白蛋白。
  38. 一種治療患有病症或病狀的個體之方法，其包括， 解凍如請求項31之細胞製劑，該細胞製劑用稀釋劑以選自由1:15、1:16、1:17、1:18及1:19組成之群之比率稀釋，及 將該經稀釋之細胞製劑投與至該個體。
  39. 如請求項38之方法，其中該病症或病狀係選自由視網膜脫落、視網膜發育不全、血管狀痕、近視性黃斑退化、或視網膜萎縮組成之群，或與導致光受體損傷及失明之許多視力改變疾病，諸如無脈絡膜、糖尿病性視網膜病變、黃斑退化(例如年齡相關黃斑退化)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)相關聯。
  40. 如請求項38之方法，其中該稀釋劑為GS2或GS2 Plus、BSS、BSS Plus®、聚葡萄糖及HSA溶液、PBS、DMEM、MEM，或白蛋白。
  41. 一種套組，其包含 (a)如請求項31之經冷凍保存的細胞製劑， (b)稀釋劑，及 (c)用於投與個體之前稀釋該細胞製劑之說明書。
  42. 如請求項41之套組，其中該等說明書進一步包含用於解凍該經冷凍保存的細胞製劑之說明書。
  43. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之調配物與細胞群體組合。
  44. 如請求項43之醫藥組合物，其中該細胞群體包含視網膜色素上皮(RPE)細胞、光受體拯救細胞、光受體祖細胞或角膜內皮細胞。
  45. 如請求項43之醫藥組合物，其中該細胞群體包含神經細胞、神經幹細胞，或神經前驅細胞。
  46. 一種醫藥組合物，其包含如請求項15至21中任一項之調配物及稀釋劑，其中該調配物與稀釋劑比率係在1:2至1:20範圍內，其中該醫藥組合物適合投與至個體，視需要投與至眼睛，另視需要投與至視網膜下(subretina)。
  47. 一種醫藥組合物，其包含如請求項22至25及31中任一項之細胞製劑及稀釋劑，其中該細胞製劑與稀釋劑比率係在1:2至1:20範圍內，其中該醫藥組合物適合投與至個體，視需要投與至眼睛，另視需要投與至視網膜下。
  48. 一種細胞製劑，其包含如請求項1至14、19、20及21中任一項之調配物及稀釋劑，其中該調配物與稀釋劑比率係在1:2至1:20範圍內，其中該調配物包含細胞群體，其中該細胞製劑適合投與至個體，視需要投與至眼睛，進一步視需要投與至視網膜下。
  49. 如請求項46或47之醫藥組合物或如請求項48之細胞製劑，其中該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前或之後未洗滌。
  50. 如請求項46或47之醫藥組合物或如請求項48之細胞製劑，其中該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前或之後未離心。
  51. 如請求項46或47之醫藥組合物或如請求項48之細胞製劑，其中該醫藥組合物或該細胞製劑在用稀釋劑稀釋之前經冷凍保存。
  52. 如請求項48至51中任一項之醫藥組合物或細胞製劑，其中DMSO係以等於或小於約1% (v/v)之可偵測量存在。
  53. 如請求項48至51中任一項之醫藥組合物或細胞製劑，其中DMSO係以等於或小於約0.037 mg/劑量之可偵測量存在。
  54. 一種細胞製劑，其包含如請求項1至14、19、20及21中任一項之調配物及細胞群體，其中該細胞製劑係用稀釋劑稀釋解凍且未洗滌。
  55. 如請求項54之細胞製劑，其中該細胞製劑係用稀釋劑以選自由1:2至1:20組成之群之比率稀釋。
  56. 如請求項54或55之細胞製劑，其中DMSO係以等於或小於約0.037 mg/劑量之可偵測量存在。
  57. 如請求項54至56中任一項之細胞製劑，其中該稀釋劑為GS2或GS2 Plus。
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