CN113786417A - 人rpe细胞的药物制剂及其用途 - Google Patents

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R·盖伊
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R·兰扎
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Abstract

本披露提供了移植到人类患者体内的hESC衍化的细胞的首次说明。结果是针对各患有斯图加特氏黄斑萎缩(SMD)和干性年龄相关性黄斑变性(AMD)的一位患者进行报告的。受控的hESC分化产生接近100％纯的RPE群体。紧接着在手术之后，在两位患者的移植部位处可见过度色素沉着，随后有这些细胞附着并整合到天然RPE层中的证据。未观察到炎症或过度增殖的迹象。这些hESC衍化的RPE细胞在本报告时尚未显示排斥反应或肿瘤发生的迹象。视觉测量表明了两位患者的改善。

Description

人RPE细胞的药物制剂及其用途
本专利申请是CN201280066325.9的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2011年11月14日提交的美国临时申请序列号61/559,521、2012年11月8日提交的美国临时申请序列号61/724,047以及2012年1月23日提交的美国临时申请序列号61/589,741的权益，每个申请特此通过引用以其全部内容结合在此。
背景
人胚胎干细胞(hESC)被认为是用于再生医学的替代细胞的有前景的来源(1)。尽管已有重大科学进展，但hESC仍然在迄今为止建议用于临床使用的最复杂的生物治疗实体之中(2)。除了它们的生物学的动态复杂性之外，众多管理顾虑阻碍了临床转化，包括畸胎瘤形成的风险和与组织不相容性相关联的挑战。直到细胞重编程技术如体细胞核转移(3)或诱导的多能干细胞(4、5)得到进一步发展，影响眼睛和其他免疫豁免部位的疾病才有可能成为在患者中基于多能干细胞的首要治疗。已经充分确立视网膜下腔受血眼屏障保护，并且特征在于细胞和体液免疫应答两者的抗原特异性抑制(6)。
在视网膜内，视网膜色素上皮细胞(RPE)的变性在多种危害视力的疾病中导致感光细胞损失，这些危害视力的疾病包括干性年龄相关性黄斑变性(AMD)和斯塔加特氏黄斑营养不良(SMD)，它们分别是世界上成人和青少年致盲的两个主要病因。虽然两者当前是无法医治的，但在黄斑变性的临床前模型中有证据表明hESC衍化的RPE的移植可以挽救感光细胞并且阻止视力丧失(7、8)。在其功能中，RPE通过循环光色素，递送、代谢并储存维生素A，吞噬感光细胞外部片段，在视网膜与脉络膜之间转运铁和小分子以及吸收杂散光以允许更好的图像分辨率来维持感光细胞的健康(9、10)。在皇家外科医学院(RCS)的大鼠(视力因RPE功能障碍而劣化的动物模型)中，hESC衍化的RPE的视网膜下移植引起广泛的感光细胞挽救和视力性能的改善(100％大于未处理的对照)而无不良病状的迹象(7)。
视网膜色素上皮(RPE)是下伏脉络膜(视网膜后的血管层)与上伏视网膜视力细胞(例如，感光细胞-视杆细胞和视锥细胞)之间的感觉神经视网膜外侧的着色细胞层。RPE对于感光细胞和视网膜的功能和健康来说是关键的。RPE通过循环光色素，递送、代谢并储存维生素A，吞噬视杆感光细胞外部片段，在视网膜与脉络膜之间转运铁和小分子，维持布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)以及吸收杂散光以允许更好的图像分辨率来维持感光细胞功能。恩格尔曼(Engelmann)&法尔丁克(Valtink)(2004)“RPE细胞培养(RPE CellCultivation)。”格拉芙临床与实验眼科学文献(Graefe’sArchive for Clinical and Experimental Ophthalmology)242(1)：65–67；还参见伊琳娜克利曼斯卡亚(IrinaKlimanskaya)，胚胎干细胞衍化的视网膜色素上皮(Retinal Pigment EpitheliumDerived From Embryonic Stem Cells)，见干细胞选集(Stem Cell Anthology)335–346(布鲁斯卡森(Bruce Carlson)编著，2009)。RPE的变性会引起与许多改变视力的微症相关联的视网膜脱离、视网膜发育异常或视网膜萎缩，这些改变视力的微症会导致感光细胞损伤和失明，如无脉络膜、糖尿病性视网膜病、黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、以及斯图加特氏疾病(眼底黄斑病)。参见，例如，WO 2009/051671。
共有的美国申请和专利披露了包括制作RPE细胞的方法、RPE细胞的组合物及其用途的某些主题，这些美国申请和专利包括2005年7月20日提交的美国序列号11/186720，现为美国专利号7736896；2006年7月21日提交的美国序列号11/490953，现为美国专利号7795025；2005年1月24日提交的美国序列号11/041382，现为美国专利号7794704；2004年1月23日提交的美国临时申请号60/538964；2010年10月10日提交的美国序列号12/682,712；2007年10月12日提交的美国临时申请号60/998668；2007年10月12日提交的美国临时申请号60/998766；2008年1月2日提交的美国临时申请号61/009908；2008年1月2日提交的美国临时申请号61/009911；2010年7月23日提交的美国临时申请号61/367038；2010年11月17日提交的美国临时申请号61/414770；2011年7月25日提交的国际专利申请号PCT/US 11/45232；2010年12月14日提交的美国序列号12/682712；2005年1月24日提交的国际专利申请号PCT/US 05/02273；2010年11月17日提交的国际专利申请号PCT/US 2010/57056(公开为WO 2011/063005)；以及2009年11月17日提交的美国临时专利申请号61/262,002，每个美国申请和专利均通过引用以其全部内容结合在此。
虽然先前已在人类受试者中尝试进行原代RPE细胞的完整薄片和悬浮液的移植，但就移植物存活和视力改善两方面来说，结果是混乱的(11至19)。迄今为止，使用原代RPE细胞进行持续有效的人体治疗尚未见报导。
概述
本披露报告了1/2期临床数据，这些临床数据帮助证明了人胚胎干细胞(hESC)衍化的视网膜色素上皮(RPE)细胞用于治疗斯图加特氏黄斑萎缩(SMD)和干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)的安全性。结果是针对两名患者报告的，即每次1/2期临床试验的第一位患者。除了未示出不利安全问题之外，结构证据证实了hESC衍化的细胞在报告的研究阶段期间存活并且继续持续下去。两名患者的视力均具有持续至少一年的适度的改善。
在一年的后继治疗中，在任何时候任一患者中均未观察到过度增殖、肿瘤发生、异位组织形成或明显的排斥反应。在多次移植后评价时进行详细的临床和诊断实验室评定。异常生长(或肿瘤形成)将被认为是基于干细胞的疗法、尤其是来源于hESC的那些的一个重大安全问题，因为hESC具有多能性；因此控制hESC的分化是关键的。报导的结果表明干细胞分化在这些患者中得到良好控制。未检测到不利安全信号。
在临床上并且在患有SMD的患者中用高分辨率成像技术观察到成功的干细胞衍化的RPE移植的解剖学证据。这个证据包括在移植后一周开始并且贯穿整个跟踪期在移植区域内在RPE水平上的增加的色素沉着。移植的干细胞衍化的RPE表现出植入到合适的位置并且呈现正常的RPE形态。在干性AMD患者中未检测到植入和增加的色素沉着。然而，两名患者在四个月的跟踪期内示出了某种视力改善，这种视力改善持续至少直至一年跟踪期。
如下文进一步描述，斯图加特氏患者的视敏度从从手的运动提高到20/800视力。在治疗之前，患者无法读取ETDRS视敏度表上的任何字母。然而，截止移植后两周，她能够开始读取字母，在一个月到三个月时，已经提高到五个字母，并且在一年时治疗的眼睛能够读取15个字母(20/500视力)。
虽然若干新药可用于治疗湿型AMD，但当前并不存在用于干性AMD或斯图加特氏疾病的经过证明的治疗。尽管这些病状具有进展性质，但两名患者的视力在移植细胞之后表现出有所改善，即使是在最低剂量的情况下。申请人预期在疾病过程早期治疗患者时有更显著的改善，其中可能潜在地预期更显著的结果。增加的细胞剂量还可以带来更显著的改善。
人胚胎干细胞可以通过产生无限数量的健康“年轻”而又具有潜在地降低的免疫原性的细胞来提供替代组织的一个优异来源。眼睛是一个免疫豁免部位，因为视网膜下的间隙受到血-眼屏障的保护，并且因此仅使用低和瞬时剂量的免疫抑制。任一患者中均未观察到排斥或炎症的迹象，并且医生将继续监护两名患者。
在此呈现的结果强调了干细胞疗法和再生医学实现修复或替代因疾病而损伤的组织的可能性的潜力。
hESC衍化的RPE细胞在移植之前进行了大量安全性研究。这些细胞被证实不含动物和人病原体，并且进行一个高灵敏度测定来排除最终产物中任何未分化hESC(肿瘤形成的危险因素)的存在。受控的hESC分化产生近100％纯的RPE。hESC的中心特征是体外分化阶段可以被控制来最大化存活率和功能性。此处数据显示RPE成熟度和色素沉着的程度可以显著影响移植之后细胞随后的附着和生长。
两次实验均是前瞻性的开放标记的研究，该研究被设计来确定hESC衍化的RPE细胞在视网膜下移植到患有SMD和干性AMD的患者体内后12个月时的安全性和耐受性(研究的主要终点)。每次试验将各自招募12名患者，其中按剂量递升形式每组三名患者。SMD和干性AMD患者两者均具有hESC衍化的完全分化的RPE细胞的最低剂量(50,000个细胞)的视网膜下移植。
在一方面，本披露提供一种药物组合物，该药物组合物包含：多个视网膜色素上皮(RPE)细胞；以及一种药学上可接受的载体；其中所述多个RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞。所述RPE细胞可以包含于悬浮液、凝胶、胶体、基质、底物、支架或移植物中。
所述药学上可接受的载体可以包含具有介于约290mOsm/kg与约320mOsm/kg之间，或介于约300mOsm/kg与310mOsm/kg或约305mOsm/kg之间的渗透压的一种无菌溶液。所述药学上可接受的载体可以包含一种平衡盐溶液。所述平衡盐溶液可以包含，由以下各项组成，或基本上由以下各项组成：在每mL水中，氯化钠7.14mg、氯化钾0.38mg、氯化钙二水合物0.154mg、氯化镁六水合物0.2mg、磷酸氢二钠0.42mg、碳酸氢钠2.1mg、葡萄糖0.92mg、谷胱甘肽二硫化物(氧化谷胱甘肽)0.184mg、以及盐酸和/或氢氧化钠(将pH调节至约7.4)。
所述药物组合物的体积可以介于约100 L与1000 L之间或可以是至少约150μL。所述药物组合物可以包含介于约1,000与约1×109个活RPE细胞。所述药物组合物可以包含介于约333个活RPE细胞/μL与约2,000个活RPE细胞/μL、介于约444个活RPE细胞/μL与约1766个活RPE细胞/μL、约333个活RPE细胞/μL、约444个活RPE细胞/μL、约666个活RPE细胞/μL、约888个活RPE细胞/μL、约999个活RPE细胞/μL、或约1,333个活RPE细胞/μL。
所述药物组合物中RPE细胞的浓度可以足够高以使得所述RPE细胞的不超过约30％在60分钟内失去活力，并且任选地所述RPE细胞的不超过约10％在4小时内失去活力。RPE细胞的所述浓度可以是至少约1,000细胞/μL、至少约2,000细胞/μL、介于约1,000与10,000细胞/μL之间，或介于约2,000与5,000细胞/μL之间。
药物制剂可以包含小于约25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的可能不是RPE细胞的细胞。
所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞以及至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间或介于1与5pg/细胞之间。
所述药物组合物中有至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的细胞可以是卵黄状黄斑病蛋白+。所述药物组合物中有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以是PAX6+和/或MITF+。所述药物组合物中有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以是PAX6+和/或卵黄状黄斑病蛋白+。所述药物组合物中有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以是ZO-1+。所述药物组合物中有至少50％、至少60％、或至少70％的细胞可以是PAX6+和卵黄状黄斑病蛋白+。所述药物组合物中有至少90％、至少95％、或至少99％的细胞可以是PAX6+。
在一个示例性实施例中，所述药物组合物中每百万细胞不超过约一个细胞和任选地每九百万细胞不超过两个细胞对于OCT-4和碱性磷酸酶(AP)表达两者可以呈阳性。
针或注射套管可以含有所述RPE细胞的至少一部分。所述RPE细胞在装入所述针或注射套管时的浓度可以介于约444个活细胞/μL与约1,766个活细胞/μL之间。有待于从所述针或注射套管递送的活RPE细胞的浓度可以介于约333个活细胞/μL与约1,333个活细胞/μL之间。所述针或注射套管的直径可以是介于约0.3mm与约0.9mm之间。所述针或注射套管的直径可以是介于约0.5mm与约0.6mm之间。所述针或注射套管可以包括具有介于约0.09mm与约0.15mm之间的直径的一个尖端。所述套管可以是一个MEDONE
Figure BDA0003183443810000071
套管25/38g(具有0.12mm(38g)×5mm尖端的0.50mm(25g)×28mm套管)或一个Synergetics Angled 39g注射套管。
所述RPE细胞可以包含已冷冻保存和解冻的RPE细胞。
所述RPE细胞可以是人的。
药物组合物可以进一步包含至少一种血管生成抑制剂，该至少一种血管生成抑制剂可以在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与它们一起投与有需要的受试者。示例性血管生成抑制剂可以选自下组，该组由以下各项组成：哌加他尼钠；阿柏西普；贝伐西尼；雷帕霉素；AGN-745；维他兰尼(vitalanib)；帕唑帕尼；NT-502；NT-503；PLG101；CPD791；抗-VEGF抗体或其功能性片段；贝伐单抗；兰尼单抗；抗-VEGFR1抗体；抗-VEGFR2抗体；抗-VEGFR3抗体；IMC-1121(B)；IMC-18F1；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap(阿柏西普)；AZD-2171(西地尼布)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；抑制VEGFR-1和/或VEGFR-2的TKI；索拉非尼(多吉美)；SU5416(司马沙尼)；SU11248/舒尼替尼(索坦)；凡德他尼(ZD6474)；Ly317615(恩扎妥林)；抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段；伏洛昔单抗；3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基氨基)-甲基]-吡咯烷-3-基氧基}-乙酰基氨基)-2-(烷基-氨基)-丙酸；(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺酰基]氨基-3-[7-卞氧羰基-8-(2--吡啶基氨基甲基)-1-氧杂-2,7-二氮杂螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基氨基丙酸；EMD478761；或RC*D(硫代P)C*(Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys)(星号表示通过半胱氨酸残基以二硫键环化)；2-甲氧基雌二醇；αVβ3抑制剂；血管生成素2；血管抑制性类固醇和肝素；血管抑制素；血管抑制素相关分子；抗-组织蛋白酶S抗体；抗凝血酶III片段；钙网蛋白；卡斯达丁；羧基酰胺基三唑；软骨衍化血管生成抑制因子；CDAI；CM101；CXCL10；内皮生长抑制素；IFN-α；IFN-β；IFN-γ；IL-12；IL-18；IL-4；利诺胺；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；Meth-1；Meth-2；骨桥蛋白；哌加他尼；血小板因子-4；促乳素；增殖素相关蛋白；凝血酶原(kringle结构域-2)；静息蛋白；可溶NRP-1；可溶VEGFR-1；SPARC；SU5416；苏拉明；替可加兰；四硫钼酸盐；萨力多胺；雷利度胺；血栓粘合素；TIMP；TNP-470；TSP-1；TSP-2；血管形成抑制素；VEGFR抗拮剂；VEGI；伏洛昔单抗(M200)；纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林(anastellin)；乐伐替尼(E7080)；莫特塞尼(AMG 706)；帕唑帕尼(福退癌)；VEGF的抑制剂；VEGFR1的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；α5β1整合蛋白的抑制剂；VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、和/或α5β1整合蛋白的肽、肽模拟物、小分子、化学、和/或核酸抑制剂；IL-6抗拮剂；抗-IL-6抗体；以及其任何组合；任选地量足以预防或治疗增生性(新生血管性)眼睛疾病。
所述RPE细胞可以是基因工程化的。例如，所述RPE细胞可以由基因工程化的一种多能细胞产生。所述基因工程化可能导致所述RPE细胞产生抑制血管生成的一种或多种因子。抑制血管生成的示例性因子包括选自下组的至少一种因子，该组由以下各项组成：纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；特异性抗-VEGF抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-VEGF受体抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段或结构域；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap；以及其任何组合。
抑制血管生成的所述因子的产生可以通过一种RPE特异性启动子来调控。所述RPE特异性启动子可以选自下组，该组由以下各项组成：RPE65启动子、组织蛋白酶D近侧启动子、以及VMD2启动子。
所述RPE细胞可以由一种多能细胞产生。所述多能干细胞对于一种或多种标记物的表达可以呈阳性，这些标记物可以包括OCT-4、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。所述多能细胞可以是人多能细胞，这些人多能细胞可以在多层群体或胚状体中培养，持续足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的一段时间。足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的所述时间可以包括至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周或至少约7周、至少约8周。所述多层群体或胚状体可以在可能包含DMEM的一种培养基中培养。所述培养基可以包含EB-DM，基本上由、或由EB-DM组成。所述着色上皮细胞可以被分离和培养，从而产生RPE细胞的一个群体。所述分离可以包括使细胞或细胞块酶促地、化学地或物理地从培养物中解离，并且选择着色上皮细胞或可能包含着色上皮细胞的细胞块。所述胚状体可以悬浮培养和/或作为一个附着培养物进行培养(例如，悬浮后附着培养)。作为一种附着培养物而培养的所述胚状体可以产生包含着色上皮细胞的一种或多种外部生长物。所述多能干细胞具有降低的HLA抗原复杂性。在RPE形成之前，所述多能细胞可以在一种基质上培养，该基质可以选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)、CellStart、人基底膜提取物、以及其任何组合。所述基质可以包含Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)。
该药物组合物可能包含对一种或多种胚胎干细胞标记物缺乏实质性表达的细胞。所述一种或多种胚胎干细胞标记物可以包括OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。
所述RPE细胞对于一种或多种RPE细胞标记物的表达可以呈阳性。所述一种或多种RPE细胞标记物可以包括RPE65、CRALBP、PEDF、卵黄状黄斑病蛋白、MITF、Otx2、PAX2、PAX6、ZO-1、和/或酪氨酸酶。
所述RPE细胞可以通过一种包括以下的方法来产生：将RPE细胞维持作为休眠细胞，持续足以获得所述平均黑色素含量的一段时间。所述RPE细胞可以通过一种包括以下的方法来产生：将RPE细胞维持作为休眠细胞，持续足以在所述RPE细胞的至少50％中建立卵黄状黄斑病蛋白表达的一段时间。
所述药物组合物基本上可以不含小鼠胚胎饲养细胞(MEF)和人胚胎干细胞(hES)。
所述RPE可以通过一种包括以下的方法来产生：在增加一种或多种α整合蛋白亚单位的表达的条件下培养所述RPE细胞，这种或这些α整合蛋白亚单位例如α整合蛋白亚单位1、α整合蛋白亚基2、α整合蛋白亚单位3、α整合蛋白亚单位4、α整合蛋白亚单位5、α整合蛋白亚单位6或α整合蛋白亚单位9。所述条件可以包括暴露在锰下、暴露在一种抗-CD29抗体下、暴露在单克隆抗体HUTS-21下、暴露在单克隆抗体mAb TS2/16下、和/或对所述RPE细胞传代至少约4代。
这些RPE细胞满足表5中列举的至少一个标准和/或根据良好生产规范(GMP)来制造。
药物组合物可以进一步包含至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂，该至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂可以在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与它们一起投与有需要的受试者。所述免疫抑制剂或免疫耐受剂可以包括以下各项中的一种或多种：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、
Figure BDA0003183443810000111
(抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、
Figure BDA0003183443810000112
(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、
Figure BDA0003183443810000113
(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、以及麦考酚酸酯。
在一方面，本披露提供一种试剂盒，该试剂盒包括如上所述的药物组合物和一个单独的容器，该单独的容器包含体积足以将所述多个RPE细胞稀释到一个所希望的目标浓度的一种药学上可接受的稀释剂。所述药学上可接受的稀释剂的体积可以是以下这样的：使得将所述药学上可接受的稀释剂的整个体积与所述多个RPE细胞的整体进行组合导致所述多个RPE细胞具有所述所希望的目标浓度。所述药学上可接受的稀释剂的温度可以是介于约0℃与10℃之间，任选地介于约2℃与8℃之间。所述多个RPE细胞或含有所述多个RPE细胞的药学上可接受的载体的温度可以介于约0℃与10℃之间，任选地介于约2℃与8℃之间。
该试剂盒可以进一步包含至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂，该至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂可以在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与它们一起投与有需要的受试者，该免疫抑制剂或免疫耐受剂可以包括上文列出的那些中的一种或多种。
该试剂盒可以进一步包含一种或多种血管生成抑制剂，这些血管生成抑制剂可以在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与它们一起投与有需要的受试者，这些血管生成抑制剂如上文列出的血管生成抑制剂中的一种或多种。
在另一方面，本披露提供一种冷冻保存的组合物，该组合物包含：多个冷冻保存的视网膜色素上皮(RPE)细胞，这些视网膜色素上皮细胞在冷冻时具有以下这样一个平均成熟度水平：使得在解冻后可以回收的这些RPE细胞具有至少约60％的接种效率。所述接种效率可以是至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。所述平均成熟度水平可以通过测量代表所述多个冷冻保存的RPE细胞的一个细胞群体的平均黑色素含量来确定。所述多个冷冻保存的RPE细胞的平均黑色素含量可以小于8pg/细胞。
在一方面，本披露提供一种冷冻保存的组合物，该组合物包含：多个冷冻保存的视网膜色素上皮(RPE)细胞；其中所述多个冷冻保存的RPE细胞的平均黑色素含量可以小于8pg/细胞。
所述细胞可以包含于一种冷冻保存培养基中。所述冷冻保存培养基可以包含以下各项中的一种或多种：DMSO(二甲基亚砜)、乙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、丙二醇、以及蔗糖，例如，介于约5％与约50％之间的DMSO和介于约30％与约95％之间的血清，其中所述血清可以任选地是胎牛血清(FBS)。所述冷冻保存培养基可以包含约90％FBS和约10％DMSO。
在解冻后可以回收的这些RPE细胞具有至少约60％、如至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的接种效率。
所述冷冻保存的组合物在冷冻时可以包含介于约5,000与约1×108之间的活RPE细胞，如在冷冻时介于约200,000与约10,000,000之间、介于约20,000与约50,000,000之间、介于约250,000与约5,000,000之间、介于约500,000与约4,000,000之间或介于约1,000,000与约4,000,000之间的活RPE细胞
在解冻后回收的这些RPE细胞在冷冻后的至少约3、6、9或12个月的时间时可以具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的接种效率。
在解冻时存活的细胞的至少85％在解冻后，在2℃与8℃之间储存时仍然可以存活多达1小时、多达2小时、多达3小时、多达4小时、多达5小时或多达6小时。
冷冻保存的组合物可以包含小于约25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的不是RPE细胞的细胞。
所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞以及至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间或介于1与5pg/细胞之间。
在一个实施例中，所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于10pg/细胞。在一个实施例中，所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于9pg/细胞。在一个实施例中，所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于8pg/细胞。在一个实施例中，所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于7pg/细胞。在一个实施例中，所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于6pg/细胞。在一个实施例中，所述RPE细胞的平均黑色素含量可以小于5pg/细胞。
所述冷冻保存的组合物中有至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的细胞可以是卵黄状黄斑病蛋白+。所述冷冻保存的组合物中有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以是PAX6+和/或MITF+。所述冷冻保存的组合物中有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以是PAX6+和/或卵黄状黄斑病蛋白+。所述冷冻保存的组合物中有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞可以是ZO-1+。该冷冻保存的组合物中有至少50％、至少60％、或至少70％的细胞可以是PAX6+和卵黄状黄斑病蛋白+。所述冷冻保存的组合物中至少95％或至少99％的细胞可以是PAX6+。
在该冷冻保存的组合物中任选地每百万细胞不超过约一个细胞和在所述冷冻保存的组合物中任选地每九百万细胞不超过两个细胞对于OCT-4和碱性磷酸酶(AP)表达两者可以呈阳性。
该冷冻保存的组合物可以进一步包含至少一种血管生成抑制剂，该至少一种血管生成抑制剂可以在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与它们一起投与有需要的受试者，如以上所列的一种或多种血管生成抑制剂。
所述RPE细胞可以是基因工程化的。所述RPE细胞可以由一种多能细胞产生。所述RPE细胞可以由一种多能细胞产生，该多能细胞可以是基因工程化的。所述基因工程化导致所述RPE细胞产生抑制血管生成的一种或多种因子。抑制血管生成的所述一种或多种因子包括选自下组的至少一种因子，该组由以下各项组成：纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；特异性抗-VEGF抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-VEGF受体抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段或结构域；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap；以及其任何组合，它们例如通过一种RPE特异性启动子调控，该启动子如RPE65启动子、组织蛋白酶D近侧启动子、以及VMD2启动子。
所述多能干细胞对于一种或多种标记物的表达可以呈阳性，这些标记物包括OCT-4、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。
所述多能细胞可以是人多能细胞，这些人多能细胞可以在多层群体或胚状体中培养，持续足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的一段时间。
足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的所述时间可以包括至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周或至少约7周、至少约8周。
在一方面，本披露提供一种产生用于在药物制剂中使用的视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：(a)在附着条件下培养RPE细胞以便形成具有一种鹅卵石形态的着色RPE细胞的一个实质上单层的培养物；并且(b)从该培养物收获RPE细胞以用于冷冻保存或药物配制，其中在收获时所收获的着色RPE细胞群体具有小于8pg/细胞的平均黑色素含量。
可收获至少106个RPE细胞用于冷冻保存或药物配制。所述RPE细胞可从多能干细胞产生，其中所述多能干细胞可任选地是人胚胎干细胞或人iPS细胞。
平均黑色素含量可以针对排除了5％着色最多和5％着色最少的所收获的RPE细胞的细胞群体来进行确定。所述平均黑色素含量可为小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞，且至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间、或介于1与5pg/细胞之间。
在一方面，本披露提供一种产生用于在药物制剂中使用的视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：(a)在附着条件下培养RPE细胞以便形成具有一种鹅卵石形态的着色RPE细胞一个实质上单层的培养物；(b)在这些RPE细胞达到大于8pg/细胞的平均黑色素含量之前的一个时刻对这些RPE细胞传代至少一次；并且(c)任选地，在该一次或多次传代之后，收获RPE细胞用于冷冻保存或药物配制，其中在收获时，所述RPE细胞具有小于8pg/细胞的平均黑色素含量。
在一方面，本披露提供一种产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：(a)培养多能干细胞以便形成胚状体(EB)或培养多能干细胞以便形成一个多层群体，其中所述多能干细胞可以任选地是人胚胎干细胞或人iPS细胞；(b)将该多层细胞群体或EB培养持续足以使着色细胞出现的一段时间，这些细胞可以包含分散在它们的细胞质中的褐色色素；并且(c)分离和培养(b)的这些着色细胞以便产生含有RPE细胞的一个培养的群体，这些细胞具有一个平均色素沉着水平。步骤(b)可以包括培养所述胚状体以便形成一种附着培养物。步骤(a)可以包括允许多能细胞的一个培养物过度生长，从而形成一个多层群体。步骤(a)可以包括允许多能细胞的一个培养物过度生长，从而形成一个多层群体。所述多能干细胞可以是诱导的多能干(iPS)细胞、胚胎干(ES)细胞、成人干细胞、造血干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞、多能干细胞、或胚胎生殖细胞。这些多能干细胞可以是人ES细胞或人iPS细胞。所述多能干细胞可以是基因工程化的。所述基因工程化导致了所述RPE细胞产生抑制血管生成的一种因子，如上文鉴别的那些。步骤(a)中可以形成这些胚状体和/或步骤(c)中可以培养这些着色细胞的培养基可以包含DMEM。步骤(a)中可以形成这些胚状体和/或步骤(c)中可以培养这些着色细胞的所述培养基可以包含，基本上由，或由EB-DM组成。在步骤(c)中可以培养所述着色细胞的该培养基可以包含EB-DM。在步骤(c)中可以培养所述着色上皮细胞的所述培养基包含，基本上由或由RPE-GM/MM组成。步骤(b)中培养的持续时间是可以至少约1、2、3、4、5、6、7或8周，或至少约1、2、3、4、5或6个月。步骤(a)、(b)或(c)中使用的该培养基可以是EB-DM、RPE-GM/MM、MDBK-GM、OptiPro SFM、VP-SFM、EGM-2或MDBK-MM。步骤(c)可以包括使该培养物与选自下组的一种酶相接触，该组由以下各项组成：胰蛋白酶、胶原酶、分散酶、木瓜蛋白酶、胶原酶与分散酶的混合物、以及胶原酶与胰蛋白酶的混合物，或可以包括该培养物的机械破坏或分离，或可以包括使该培养物与EDTA或EGTA相接触，从而破坏所述着色细胞与该培养基底的附着。这些多能干细胞可以具有降低的HLA抗原复杂性。这些RPE细胞可以缺乏对一种或多种胚胎干细胞标记物的实质性表达。所述一种或多种胚胎干细胞标记物可以是OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、DPPA-2、和/或DPPA-4。
这些胚状体可以在它们形成之后作用附着培养物进行培养，例如以便允许长出物生长。RPE细胞对于至少一种RPE细胞标记物可呈阳性。所述至少一种RPE细胞标记物包括以下各项中的一种或多种：RPE65、CRALBP、PEDF、卵黄状黄斑病蛋白、MITF、Otx2、PAX2、PAX6或酪氨酸酶或任选地PAX6和卵黄状黄斑病蛋白。
所述方法可以进一步包括在增加α整合蛋白亚单位的表达的条件下培养所述RPE细胞，例如如以上所述。
所述EB可以在rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂如Y-27632存在下形成。在所述RPE形成之前，所述多能细胞可以在Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)上培养。
在一方面，本披露提供一种包含RPE细胞、适于治疗视网膜变性的药物制剂，其中所述RPE细胞含有小于8pg/细胞的平均黑色素含量，并且其中所述RPE细胞可以具有以下特性中的至少一个：在移植后维持它们的表型持续至少约一个月；在培养中维持它们的表型持续至少约一个月；在移植后整合到宿主中；在移植之后基本上不增殖；可以是噬菌性的；递送、代谢或储存维生素A；在移植后在视网膜与脉络膜之间传输铁；在移植后附着到布鲁赫氏膜上；在移植后吸收杂散光；具有α整合蛋白亚单位的提高的表达；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大的平均端粒长度；在培养中具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大的复制寿命；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大的一种或多种α整合蛋白亚单位的表达；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的A2E含量；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的脂褐质含量；展现出比来源于捐赠人组织的RPE细胞更少的累积的紫外线损伤，或含有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大数量的吞噬体。在一方面，本披露提供一种可以包含适于治疗视网膜变性的RPE细胞的药物制剂，其中所述RPE细胞含有小于8pg/细胞的平均黑色素含量，并且其中所述RPE细胞具有以下特性中的至少一个：在移植后附着到布鲁赫氏膜上；在移植后吸收杂散光；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大的平均端粒长度；在培养中具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大的复制寿命；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的A2E含量；具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的脂褐质含量；展现出比来源于捐赠人组织的RPE细胞更少的累积的紫外线损伤，或含有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大数量的吞噬体。
在一方面，本披露提供一种治疗视网膜变性病状的方法，该方法包括将有效治疗所述视网膜变性病状的量的药物制剂(根据如上所述方法制造的药物制剂)投与有需要的受试者的眼睛，包括投与组合物或试剂盒的RPE细胞。
该视网膜变性病状可以包括无脉络膜、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性(干性或湿性)、视网膜脱离、色素性视网膜炎、斯图加特氏疾病、血管样纹症或近视性黄斑变性。所述投与步骤可以包括将所述RPE细胞眼内投与到有需要的眼睛。所述眼内投与可以包括将所述RPE细胞注射到视网膜下间隙中。所述眼内投与可以包括将一种水溶液(任选地是一种等渗溶液和/或一种生理食盐水溶液)注射到视网膜下间隙，从而形成一个预水泡，并且去除所述水溶液，之后将所述RPE细胞投与到与所述水溶液相同的视网膜下间隙中。所述注射可以是通过一个针或注射套管。所述针或注射套管的直径可以是介于约0.3mm与0.9mm之间或介于约0.5mm与约0.6mm之间。所述针或注射套管可以包括具有介于约0.09mm与约0.15mm之间的直径的一个尖端。所述套管可以是一个MEDONE
Figure BDA0003183443810000191
套管25/38g(具有0.12mm(38g)×5mm尖端的0.50mm(25g)×28mm套管)。治疗的有效性可以通过以下各项中的一个或多个确定视力结果来评定：裂隙灯生物显微照相术、眼底照相术、IVFA和SD-OCT、以及最佳矫正视敏度(BCVA)。该方法可以使矫正视敏度(BCVA)改善和/或使早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)视敏度图表上可读取的字母增加。视网膜变性的病状可以是干性AMD或斯图加特氏疾病。
有效治疗所述视网膜变性病状的量可以是介于约20,000与200,000个RPE细胞之间，介于约20,000与500,000个RPE细胞之间，介于约20,000与2,000,000个RPE细胞之间，或至少约20,000个RPE细胞，或至少约20,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000、200,000或500,000个RPE细胞。
所述受试者在所述RPE细胞的所述投与之前或同时可不投与皮质类固醇，如泼尼松龙或甲泼尼松龙。所述受试者在所述RPE细胞的所述投与之前至少3、6、12、24、48、72或96小时内或在所述RPE细胞的所述投与的同时可不投与皮质类固醇。所述受试者在所述RPE细胞的所述投与之前至少1小时内或在所述RPE细胞的所述投与之前或同时可不投与皮质类固醇。所述受试者在所述RPE细胞的所述投与之后至少12、24、48、72或96小时内可不投与皮质类固醇。所述受试者在所述RPE细胞的所述投与之后至少48小时内可不投与皮质类固醇。
所述RPE细胞可以与选自下组的一种或多种试剂组合来投与患者，该组由以下各项组成：血管生成抑制剂、抗氧化剂、抗氧化剂辅助因子、促使抗氧化活性增加的其他因子、黄斑叶黄素、长链Ω-3脂肪酸、淀粉样蛋白抑制剂、CNTF激动剂、RPE65的抑制剂、靶向A2E和/或脂褐质累积的因子、感光细胞功能和/或代谢的下调剂或抑制剂、α2-肾上腺素能受体激动剂、选择性血清素1A激动剂、靶向C-5的因子、膜攻击复合物(C5b-9)和任何其它玻璃疣组分、免疫抑制剂、以及预防或治疗脂褐质累积的试剂。
所述一种或多种试剂可以在所述RPE细胞制剂同时、之前和/或之后投与所述患者。
所述组合物、试剂盒或药物制剂可以用于制造供治疗视网膜变性病状的一种药剂，该视网膜变性病状如无脉络膜、糖尿病性视网膜病、干性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、视网膜脱离、色素性视网膜炎、斯图加特氏疾病、血管样纹症或近视性黄斑变性。
所述多能干细胞表达选自下组的一种或多种标记物，该组由以下各项组成：OCT-4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、以及TRA-1-80。
所述RPE细胞展现出以下特征中的一个或多个：复制寿命可比从其他来源获得的RPE细胞的复制寿命更大；平均端粒长度可以是hESC和/或人iPS细胞(或hESC和/或人iPS细胞的平均群体)的端粒长度的至少30％，或是hESC和/或人iPS细胞的端粒长度的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％；平均末端限制性片段长度(TRF)可长于4kb，或长于5、6、7、8、9、10、11、12或甚至13kb，或10kb或更长；平均脂褐质含量可小于从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的50％，或小于从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的40％、30％、20％或10％；平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量可小于从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的50％，或小于从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的40％、30％、20％或10％；平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量可小于50ng/105(100,000)个细胞；感光细胞外部片段(POS)的吞噬率可比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的POS吞噬率至少大50％，或比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的POS吞噬率至少大75％、100％、150％或200％；感光细胞外部片段(POS)的吞噬率可以是24小时之后POS的总浓度的至少20％，或是24小时之后POS的总浓度的至少25％、30％、25％、40％或50％；与从成人宿主分离的RPE细胞相比，累积氧化应力和/或DNA损伤水平降低；平均蛋白酶体活性可比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均蛋白酶体活性大至少50％，或比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均蛋白酶体活性大至少60％、70％、80％、90％或100％；平均泛素蛋白缀合物累积可比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均泛素蛋白缀合物累积小至少50％，或比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均泛素蛋白缀合物累积小40％、30％、20％或甚至10％。
附图简要说明
图1：从hESC MA09产生的RPE的表征。A：一个六孔板示出在胚状体的分化培养物中形成的RPE的着色斑点；B-H：解冻和配制的RPE中的分子标记物的评定。在具有新鲜配制的细胞的过夜培养物中评定MITF和PAX6(C-D)并且在3周龄培养物上进行卵黄状黄斑病蛋白/PAX6和ZO-1免疫染色。B：3周龄RPE后配制品的HMC微照相术，它示出建立了具有培养基色素沉着的汇合卵石单层。C：MITF/PAX6合并(MITF-原始红色，PAX6–原始绿色)，D：DAPI与MITF/PAX6对应；E：卵黄状黄斑病蛋白/PAX6合并，F：对应的DAPI；G：ZO-1，H：对应的DAPI。注意，C-H中近似100％的细胞对于所评定的一种或多种标记物呈阳性。放大倍数，400倍(B-H)。I：q-PCR示出了与参考RPE批次(每组的左图，原始蓝色)相比较，示出了解冻的临床RPE(每组的右图，原始绿色)中的RPE标记物上调和hESC标记物下调。所示的基因(从左至右的顺序)是：卵黄状黄斑病蛋白、Pax-6、MITF、RPE-65、NANOG、OCT-4、以及SOX-2。J：FACS示出了在37℃下和在4℃(对照)hES-RPE的PhRodo生物颗粒的吞噬作用。示出了未处理细胞(原始黑线；最左侧曲线)和4℃对照细胞(原始红色；曲线的左侧部分稍高于未处理细胞曲线的右侧并且曲线的右侧部分与未处理细胞曲线的右侧部分重叠)，以及37℃处理细胞(原始蓝色；最右侧曲线)。K：临床RPE批次的正常雌性(46XX)核型。
图2：九个月后的存活和将从hESC-MA09产生的RPE整合到NIH III小鼠眼睛中。切片用抗人线粒体(A，原始红色)和抗人卵黄状黄斑病蛋白(B，原始绿色)染色。注意：在相同细胞中染色的人线粒体和卵黄状黄斑病蛋白的精确共同定位(C：A和B合并)以及在小鼠RPE中染色的缺少(F：A、B、C、E合并)。在“D”中放大了亮场图像(E)上的帧以便示出人RPE的形态。放大倍数200倍(A-C、E、F)，D是另外放大4.5倍。
图3：具有不同程度的色素沉着的RPE的附着和生长的差异。显微照片示出了较亮(A-C)和较暗(D-F)着色批次的附着和行为。G示出了较暗批次的RPE的生长率(每组的左图)并且较亮批次(每组的右图)示出了在铺板后连续三天内每孔细胞的总数量。A和D示出了在铺板后21小时的总细胞群体，B和E示出在去除漂浮细胞之后与A和D中相同的培养物，C和F示出在铺板后三天的相同培养物。应注意，在较亮着色批次(A、B、G)中大多数细胞在解冻后21小时时已附着，而较暗着色批次的仅一些细胞附着(D、E、G箭头)，并且大多数细胞是飘浮的。在培养三天后，较亮着色批次(C)具有大量细胞，并且建立了一个汇合单层，而较暗着色批次仍然处于汇合中。放大倍数：200倍。
图4：hESC衍化的RPE移植部位的图像。SMD患者的左侧黄斑手术前和手术后的眼底彩色照片(A-C)。矩形内的区域与外科手术移植部位的边沿相交并且与外科注射中不包括的黄斑萎缩对应。A：具有广泛分布的RPE和感觉神经黄斑萎缩的基线黄斑彩色图像。B：在hESC-RPE移植后一周的黄斑彩色图像。注意，轻度色素沉着在基线RPE萎缩的区域中最明显。这种色素沉着在第6周增加(C)。图D和图E示出谱域眼部相干断层扫描(SD-OCT)和登记黑白照片(海德堡工程(Hiedelberg Engineering)。图E中所示的截面视图与图D中箭头所指示的水平线(原始亮绿色)对应。图E中的虚线圆(原始红色)突出了沉降到或附着到受损的天然RPE层上的表现出是hESC-RPE细胞。
图5：AMD患者的荧光素血管造影图像。在不同的时间间隔内未注意到泄露的证据。A：基线早期，B：基线晚期，C：4周早期，D：4周晚期，E：8周早期，F：8周晚期。(所选择图像偏离中心向下，表示移植区域)。
图6：斯图加特氏疾病患者的荧光素血管造影图像。在不同的时间间隔内未注意到泄露的证据。A：基线早期，B：基线晚期，C：4周早期，D：4周晚期，E：8周早期，F：8周晚期。(所选择图像偏离中心向下，表示移植区域)。
图7：斯图加特氏疾病患者在不同时间间隔的OCT图像。在不同时期内，任何图像中都未注意到水肿或视网膜下液体的证据。(所选择OCT表示移植区域)。图A：基线，B：1周，C：4周，D：8周。
图8：AMD患者的裂隙灯图像。图A和图B：手术后1周。未注意到前段炎症或角膜水肿的证据。
图9：斯图加特氏疾病患者的裂隙灯图像。图A和图B：手术后1周。未注意到前段炎症或角膜水肿的证据。
图10：在AMD患者上进行的戈德曼视野(Goldmann Visual fields)：图A：基线，图B：6周。观察到了稍小的中心性暗点。
图11：斯图加特氏疾病患者上进行的戈德曼视野：图A：基线，图B：6周。观察到了暗点的最小程度减少。
图12：使用不同培养基产生的两批RPE细胞的吞噬测定结果。使用MDBK培养基(图A)或EB-DM和RPE-GM/MM(图B)产生RPE。对于在没有荧光生物颗粒情况下孵育的细胞(“未处理”)、在4℃下用荧光生物颗粒孵育的阴性对照细胞(“4℃”)以及在37℃下用荧光生物颗粒孵育的细胞(“37℃”)，来自FACS分析的结果呈现为直方图。
图13：患有斯图加特氏黄斑萎缩的患者的hESC-RPE移植部位的图像。患者的左侧黄斑手术前和手术后的眼底彩色照片(A-C)。矩形内的区域与外科手术移植部位的边沿相交并且与外科注射中不包括的黄斑萎缩对应。(A)具有广泛分布的RPE和感觉神经黄斑萎缩的基线黄斑彩色图像。(B)在hESC-RPE移植后1周的黄斑彩色图像。注意，轻度色素沉着在基线RPE萎缩的区域中最明显。这种色素沉着在第6周增加(C)。(D–G)基线(D)和移植后3个月(F)的眼底彩色照片和SD-OCT图像。彩色图像示出了从基线至3个月RPE水平的增加的色素沉着。登记的SD-OCT图像(E、G)示出了增加的色素沉着是处于RPE水平，正常单层RPE移入，以及不含天然RPE的裸布鲁赫氏膜区域附近第3个月的存活(箭头)。hESC＝人胚胎干细胞。RPE＝视网膜色素上皮。SD-OCT＝谱域眼部相干断层扫描。
图14：患有斯图加特氏黄斑萎缩的患者在hESC-RPE移植之后未处理眼睛(“对侧眼睛”)中和针对SMD患者注射了RPE细胞的眼睛(“动手术的眼睛”)中的视敏度变化的列表总结。动手术的眼睛示出了通过ETDRS和BCVA可检测的改善，然而在未处理眼睛中未检测到视敏度的变化。hESC＝人胚胎干细胞。RPE＝视网膜色素上皮。BCVA＝最佳矫正视敏度。ETDRS＝早期治疗糖尿病性视网膜病研究视敏度图表。
图15示出了两个眼底照片，这些眼底照片包括两位另外的斯图加特氏疾病患者的视网膜、视盘、黄斑、以及后极，两位患者各自用从一个hESC源衍化的50,000个RPE细胞处理。每个照片指示了注射部位和在注射含有这些RPE细胞的溶液之后产生的水泡的区域。
图16和图17(另两位不同的SMD患者)示出了三个眼底照片，这些照片针对每个患者各自在指示的时间点拍摄(即，在基线、1个月、以及两个月或三个月)，示出了在注射水泡内具有着色RPE细胞的增加的斑点的区域的建立，从而建议用一个新RPE层移入视网膜区域并且重修该视网膜区域的表面。
图18示出了图16的上图和图17中所示患者的处理的(“已注射”)和未处理的(“未注射”)眼睛的测量的视敏度。竖直轴线指示早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)评分)并且水平轴线示出手术后的天数。
图19：可见光显微照片示出了从hESC产生的RPE培养物的期望的色素沉着和形态，这些培养物是在没有胚胎破坏的情况下产生。上部三个图(A、B、C)示出了从三种不同人iPS(hiPS)细胞系产生的RPE。下部三个图(D、E、F)示出了由活检卵裂体(称为D30469和NED7的细胞系)产生的hES细胞产生的RPE，其中剩余胚胎仍然存活并且被冷冻保存。
图20：图4中较早时间点处所示将RPE长期移入到同一SMD患者中。(A)在基线和(B)在RPE注射一年后拍摄的眼底照片示出了着色细胞的存在，从而指示RPE细胞的长期移入在注射后持续至少一年。
图21：AMD患者ETDRS/BCVA评分–外周，从治疗到至多一年的时间点。
图22：SMD患者ETDRS/BCVA评分–中心，从治疗到至多一年的时间点。
详细说明
本披露描述了两位患者在两个有前景的临床试验中的初始结果，这些临床试验探索这些hESC衍化的RPE在患有干性AMD和斯图加特氏疾病的患者中的安全性和耐受性。这些hESC衍化的RPE细胞在本报告时尚未显示排斥反应或肿瘤发生的迹象。视力测量表明了两位患者的改善。这些结果指示了hESC可以用作RPE的一个潜在安全又用之不竭的来源，以用于有效治疗大量视网膜变性疾病。
还描述了产生具有有利特征的hESC衍化的RPE细胞群体的方法。证明了控制分化路径(包括基因和色素表达的程度)能显著增强在注射之后细胞的存活、附着以及生长。确切地说，此处呈现的数据显示RPE成熟度和色素沉着的程度会显著影响体外细胞随后的附着和生长。这些结果说明了与使用原代细胞相比，使用从hESC分化的细胞用于治疗用途可以获得的优点。这些结果证实除了产生无限数量的健康“年轻”而又具有潜在地降低的免疫原性的细胞之外(20、21)，体外分化阶段还可以控制在细胞和分子水平上以便在移植到患者体内之前确保安全性、身份、纯度、以及效力。
我们起动了两个有前景的临床研究以便确定hESC衍化的视网膜色素上皮(RPE)在患有斯图加特氏黄斑萎缩(SMD)和干性年龄相关性黄斑变性(AMD)的患者中的视网膜下移植的安全性和耐受性，SMD和AMD是发达国家中失明的主要病因。在每次试验中对第一位患者进行手术前和手术后眼科检查，包括视敏度、荧光素血管造影、光学相干断层扫描(OCT)、以及视野测试。
受控的hESC分化产生近似100％纯的RPE群体。紧接着在手术之后，在两名患者的移植部位处可见色素沉着过度，以及随后有细胞附着和整合到天然RPE层中的证据。未观察到炎症或过度增殖的迹象。视力测量显示出前两个月期间改善的迹象。在2周时，在AMD患者的研究眼睛中，最佳矫正视敏度(BCVA)已从治疗前的20/500提高到20/200，并且继续显示改善(20/200至20/320)以及早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)视敏图表上字母增加。SMD患者在同一时期从手的运动提高到数手指；截止1个月和2个月，BCVA提高到20/800。在RPE移植之前，患者无法读取ETDRS图表上的任何字母，但在2周时开始读取字母，在研究期间继续改善(在1个月和2个月时5个字母)。
这些hESC衍化的RPE细胞在本报告时尚未显示排斥反应或肿瘤发生的迹象。视力测量证实了两名患者的改善。
定义
为了可以完全理解在此描述的发明，阐述了以下详细说明。本发明的多个实施例被详细描述并且可以通过提供的实例来进一步说明。
除非另外限定，否则在此所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可以用于本发明或本发明的测试，但以下描述了适合的方法和材料。这些材料、方法以及实例仅是说明性的并且不意图具有限制性。在此提供了以下术语和定义。
如在此的说明书和贯穿随后的整个权利要求书中所使用，“一个”、“一种”以及“该”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如在此的说明书中所使用，“在…中”的含义包括“在…中”和“在…上”，除非上下文清楚地另外指明。
贯穿本说明书，“包括(comprise)”一词或变化形式如“包括了(comprises)”或“包括着(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的整体或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。
如在此所使用的“有效量”广义上是指在将一种化合物或细胞投与患者用于治疗一种疾病时足以实现对疾病的这种治疗的该化合物或细胞量。有效量可以是有效用于防御(prophylaxis)的量，和/或有效用于预防(prevention)的量。有效量可以是有效减少的量，有效预防体征/症状的发生、减少发生的体征/症状的严重程度、消除体征/症状的发生、减缓发生的体征/症状的发展、预防发生的体征/症状的发展、和/或有效防御体征/症状的发生的量。“有效量”可取决于有待治疗的患者的疾病和其严重程度以及年龄、体重、病史、易感性、以及在先病况而变化。出于本披露的目的，术语“有效量”与“治疗有效量”同义。
如在此所使用的“胚胎”或“胚胎的”广义上是指尚未植入母体宿主的子宫膜内的正在发育的细胞团。“胚胎细胞”是从胚胎分离或包含于胚胎的细胞。这还包括早到两细胞阶段获得的卵裂球和聚集的卵裂球。
如在此所使用的“胚胎干细胞”(ES细胞)广义上是指来源于胚泡或桑椹胚的内细胞团的、已作为细胞系连续传代的细胞。ES细胞可以来源于以下：卵细胞用精子或DNA受精、核转移、单性生殖，或通过在HLA区内用纯合子来产生ES细胞的手段。ES细胞还可以是指来源于以下的细胞：接合子、卵裂球，或通过以下产生的胚泡期哺乳动物胚胎：精子和卵细胞的融合、核转移、单性生殖，或染色质的重编程和重编程染色质随后结合到质膜来产生细胞。胚胎干细胞(不管它们的来源或用于产生它们的具体方法如何)可以基于以下各项来鉴别：(i)分化成所有三个胚层的细胞的能力，(ii)至少Oct-4和碱性磷酸酶的表达，以及(iii)移植到免疫受损的动物体内时产生畸胎瘤的能力。该术语还包括从胚胎的一个或多个卵裂球分离的细胞，优选在不破坏胚胎的剩余部分的情况下(参见，例如，钟(Chung)等人，细胞干细胞(Cell Stem Cell)2008年2月7日；2(2):113-7；美国预授权公开号20060206953；美国预授权公开号2008/0057041，每个参考文献通过引用以其全部内容结合在此)。该术语还包括通过体细胞核转移产生的细胞，甚至是过程中使用非胚胎细胞的情况下。ES细胞可以来源于以下：卵细胞用精子或DNA受精、核转移、单性生殖，或通过在HLA区内用纯合子来产生ES细胞的手段。ES细胞还是来源于以下的细胞：接合子、卵裂球，或通过以下产生的胚泡期哺乳动物胚胎：精子和卵细胞的融合、核转移、单性生殖，或染色质的重编程和重编程染色质随后结合到质膜来产生细胞。本披露的人胚胎干细胞可以包括但不限于MA01、MA09、ACT-4、3号、H1、H7、H9、H14以及ACT30胚胎干细胞。在某些实施例中，用于产生RPE细胞的人ES细胞根据GMP标准来衍化和维持。
如在此所使用的“胚胎来源的细胞”(EDC)广义上是指桑椹胚来源的细胞；包括内细胞团、胚盾或上胚层的那些的胚泡来源的细胞；或早期胚胎的其他多能干细胞，包括原始内胚层、外胚层、以及中胚层和它们的衍化物。“EDC”还包括来自聚集的单个卵裂球或发育的不同阶段的胚胎的卵裂球和细胞团，但排除已作为细胞系传代的人胚胎干细胞。
如在此所使用的“黄斑变性”广义上是指特征在于以下的疾病：与布鲁赫氏膜、神经视网膜、以及视网膜色素上皮的异常相关联的中央视力的逐渐失去。黄斑变性疾病包括但不限于年龄相关性黄斑变性、北卡罗莱纳黄斑萎缩、索斯比眼底萎缩(Sorsby’s fundusdystrophy)、斯图加特氏疾病、图形样萎缩、贝斯特疾病(Best disease)、malattialeventinese、多因蜂窝状脉络膜炎、显性玻璃疣、以及辐射状玻璃疣。
如在此所使用的“多能干细胞”广义上是指以下这样的细胞：能够体外长时间或实际上无限增殖，而同时保持它们的未分化状态，展现出稳定的(优选地正常的)核型，并且具有在合适的条件下分化成所有三个胚层(即，外胚层、中胚层以及内胚层)的能力。
如在此使用的“多能胚胎干细胞”广义上是指以下这样的细胞：(a)在移植到免疫缺陷(SCID)的小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化成所有三个胚层的细胞类型(例如，外胚层、中胚层、以及内胚层细胞类型)；以及(c)表达至少一个分子胚胎干细胞标记物(例如，表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、NANOG、TRA 1 60、TRA 181、SOX2、REX1)。作为一个另外的实例，多能细胞可以表达OCT-4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。示例性多能干细胞可以使用例如本领域中已知的方法来产生。示例性多能干细胞包括从胚泡期胚胎的ICM来源的胚胎干细胞、以及从分裂期的一个或多个卵裂球或桑椹胚期胚胎来源的胚胎干细胞(任选地不破坏胚胎的剩余部分)。这类胚胎干细胞可以从通过受精或通过无性手段(包括体细胞核转移(SCNT)、单性生殖、以及单雄生殖)产生的胚胎材料产生。另外的示例性多能干细胞包括通过表达或诱导因子组合(在此称为重编程因子)的表达而对体细胞重编程产生的诱导的多能干细胞(iPS细胞)。iPS细胞可以使用胎儿、产后、新生儿、青少年或成人体细胞来产生。在某些实施例中，可以用于将体细胞重编程成多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc、以及Klf4的组合。在其他实施例中，可以用于将体细胞重编程成多能干细胞的因子包括例如Oct4、Sox2、Nanog、以及Lin28的组合。在其他实施例中，体细胞通过表达至少2个重编程因子、至少三个重编程因子或四个重编程因子来重编程。在其他实施例中，另外的重编程因子被鉴别并且单独或与一个或多个已知的重编程因子组合使用来将体细胞重编程成多能干细胞。iPS细胞典型地可以通过表达与胚胎干细胞相同的标记物来鉴别，但是具体iPS细胞系的表达轮廓可以变化。
如在此所使用的“RPE细胞”、“分化的RPE细胞”、“ES衍化RPE细胞”全文可以互换使用以便在广义上指例如使用在此披露的一种方法从多能干细胞分化的RPE细胞。该术语一般用于指分化的RPE细胞，而不管细胞的成熟度水平如何，并且因此可以涵盖不同成熟度水平的RPE细胞。RPE细胞可以通过它们的卵石形态以及初始的色素出现来视觉识别。RPE细胞还可以基于胚胎干细胞标记物如Oct-4和NANOG的表达的实质性缺乏以及基于RPE标记物如RPE65、PEDF、CRALBP、以及卵黄状黄斑病蛋白的表达来从分子上鉴别。例如，如果观察到期望的染色图案，例如，PAX6局部化在核内、卵黄状黄斑病蛋白局部化在质膜内、处于多边形图案(示出卵黄状黄斑病蛋白在细胞外周的鲜明的线处的局部化染色)，ZO-1染色存在于描绘出细胞轮廓的紧密连接部中、处于多边形图案，并且检测到的MITF染色限制在核内，那么细胞针对一种给定标记物可以计数为阳性。除非另外指明，如在此所使用的RPE细胞是指从多能干细胞体外分化的RPE细胞。
如在此所使用的“成熟RPE细胞”和“成熟分化的RPE细胞”全文可以互换使用来在广义上指RPE细胞初始分化之后发生的变化。确切地说，虽然可以至少部分地基于初始色素出现识别RPE细胞，但在分化之后成熟RPE细胞可以基于增强的色素沉着来识别。
如在此所使用的“接种效率”是指解冻之后仍然存活并且可以附着到培养基底上的回收的细胞的分率。例如，接种效率可以通过解冻、洗涤细胞以及将细胞铺板(优选地铺在明胶上)来测量；其中在铺板之前确定总细胞计数并且在铺板之后确定活细胞计数；接种效率然后可以计算成在铺板之前存活并且在铺板之后附着到基底上的总细胞的分率。作为一个更具体的实例，接种效率通过在37℃水浴中进行恒定搅拌情况下(如持续一到两分钟或足够的时间来使细胞解冻)来解冻细胞，之后用磷酸盐缓冲生理食盐水(或另一种合适的洗涤溶液)将细胞洗涤三次，确定包括活和非活细胞的总细胞计数(如使用血细胞计数器)并且将细胞铺在具有生长培养基(例如RPE-GM)的明胶上，孵育细胞(优选在37℃下)并且允许细胞附着到明胶上持续约24小时，然后确定活细胞计数(例如，使用血细胞计数器并且其中使用台盼蓝排除来确定活力)来确定；接种效率然后通过将铺板之后的活细胞计数除以铺板之前的总细胞计数来确定。
如在此所使用的“着色”广义上是指任何水平的色素沉着，例如，在RPE细胞从ES细胞分化时最初发生的色素沉着。色素沉着可以随着分化的RPE细胞的细胞密度和成熟度而变化。RPE细胞的色素沉着可能与RPE细胞的终末分化之后的平均RPE细胞相同。RPE细胞的色素沉着可能比RPE细胞的终末分化之后的平均RPE细胞着色更多。RPE细胞的色素沉着可能比终末分化之后的平均RPE细胞着色更少。
如在此所使用的疾病的“体征”广义上是指指示疾病的、患者检查时可发现的任何异常；与疾病的主观指示的症状相比是疾病的客观指示。
如在此所使用的疾病的“症状”广义上是指患者经历且指示疾病的，相对于正常结构、功能或感觉的任何病理现象或偏离。
如在此所使用的“治疗(Therapy)”、“治疗性(therapeutic)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”广义上是指治疗疾病，遏制或减少疾病或其临床症状的发展，和/或缓解疾病，使疾病或其临床症状消退。治疗涵盖防御(prophylaxis)、预防(prevention)、治疗、治愈、补救、减少、减轻、和/或使疾病、疾病的体征和/或症状缓解。治疗涵盖具有发展中的疾病体征和/或症状(例如，失明、视网膜劣化)的患者的体征和/或症状的减轻。治疗还涵盖“防御(prophylaxis)”和“预防(prevention)”。防御(Prophylaxis)包括在治疗患者体内疾病之后预防疾病发生或减少患者体内疾病的发生或严重程度。出于治疗目的，术语“减少”广义上是指体征和/或症状的临床显著减少。治疗包括治疗反复性或复发性体征和/或症状(例如，视网膜变性、失去视力)。治疗涵盖但不限于排除任何时候体征和/或症状的出现以及减少现有体征和/或症状并且消除现有体征和/或症状。治疗包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或预防体征和/或症状(例如，失明、视网膜变性)的反复或复发。
在此所使用的术语“皮质类固醇”是指结合到糖皮质激素受体的一类类固醇激素，包括天然和人工皮质类固醇、类似物等。示例性皮质类固醇包括但不限于泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、甲泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙，倍氯米松、醋酸氟氢可的松、氟替卡松(包括丙酸氟替卡松(FP))、布地奈德、环索奈德、莫米松、以及氟尼缩松。
RPE细胞制剂和组合疗法
本披露提供包括RPE细胞、基本上纯化的RPE细胞群体的RPE细胞的制剂，包含RPE细胞的药物制剂以及冷冻保存的RPE细胞制剂。在此描述的RPE细胞可基本上不含至少一种蛋白质、分子或在天然环境(例如，“分离的”)中发现的其他杂质。这些RPE细胞可以是哺乳动物、包括人RPE细胞。本披露还提供人RPE细胞、基本上纯化的人RPE细胞群体、包含人RPE细胞的药物制剂、以及冷冻保存的人RPE细胞制剂。制剂可以是包含人胚胎干细胞衍化的RPE细胞、人iPS细胞衍化的RPE细胞的一种制剂，以及包含分化的ES衍化的RPE细胞的基本上纯化的(相对于非RPE细胞来说)制剂。
该制剂的RPE细胞可以具有比从其他来源(例如，从捐赠人组织如胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人组织来源的培养物)获得的RPE细胞的复制寿命更大的复制寿命。复制寿命可以通过在复制衰老之前测定培养的群体倍增的数量来评定。例如，制剂的RPE细胞可以具有比从捐赠人组织来源的一个RPE群体至少大10％，并且优选地比从捐赠人组织来源的一个RPE群体至少大20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或甚至更大的一个复制寿命。
制剂的RPE细胞可以具有至少是hESC和/或人iPS细胞的端粒长度(或hESC和/或人iPS细胞群体的平均值)的30％，并且优选地至少是hESC和/或人iPS细胞的端粒长度(或hESC和/或人iPS细胞群体的平均值)的40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％的平均端粒长度。例如，所述hESC和/或人iPS细胞(或所述hESC和/或人iPS细胞群体)可以是分化了所述RPE细胞的细胞或细胞群体。
制剂的RPE细胞可以具有长于4kb，并且优选地长于5、6、7、8、9、10、11、12或甚至13kb的平均末端限制性片段长度(TRF)。在一个示例性实施例中，制剂的RPE细胞可以具有10kb或更长的TRF。
制剂的RPE细胞可以具有以下平均脂褐质含量：为从成人眼睛(即，年龄是25至80岁的成人患者，更优选地是年龄是50至80岁的成人)分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的50％以下，并且更优选地为从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的40％、30％、20％或甚至10％以下。
制剂的RPE细胞可以具有以下平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量：为从成人眼睛(即，年龄是25至80岁的成人患者，更优选地是年龄是50至80岁的成人)分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的50％以下，并且更优选地为从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的40％、30％、20％或甚至10％以下。
制剂的RPE细胞可以具有以下平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量：每105(100,000)个细胞小于50ng，这可以从积分峰强度确定(如在斯派罗(Sparrow)等人，眼科研究与视力科学(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.)1999年11月，第40卷，第12期，第2988-2995页中所描述)，并且更优选地每105个细胞小于40ng、30ng、20ng、10ng或甚至5ng。
制剂的RPE细胞可以具有以下感光细胞外部片段(POS)吞噬率：比从成人眼睛(即，年龄是25至80岁的成人患者，更优选地是年龄是50至80岁的成人)分离的等量RPE细胞的POS吞噬率至少大50％，并且更优选地至少75％、100％、150％或甚至200％更大。作为一个说明性和非限制性实例，POS吞噬作用可以使用贝格曼(Bergmann)等人，美国实验生物学联合会会刊(FASEB Journal)2004年3月，第18卷，第562-564页中所描述的方案来测量。
制剂的RPE细胞可以具有以下感光细胞外部片段(POS)吞噬率：至少是24小时之后的POS的总浓度的20％，并且更优选地至少是24小时之后的POS的总浓度的25％、30％、25％、40％或甚至50％。作为一个说明性和非限制性实例，POS吞噬作用可以使用贝格曼等人，美国实验生物学联合会会刊(FASEB Journal)2004年3月，第18卷，第562-564页中所描述的方案来测量。
这些RPE细胞可以展现出与从成人宿主分离的RPE细胞相比较降低的水平的累积氧化应力和/或DNA损伤。
制剂的RPE细胞可以具有以下平均蛋白酶体活性：比从成人眼睛(即，年龄是25至80岁的成人患者，更优选地是年龄是50至80岁的成人)分离的等量RPE细胞的平均蛋白酶体活性大至少50％，并且更优选地至少是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均蛋白酶体活性的60％、70％、80％、90％或甚至100％。作为一个说明性和非限制性实例，蛋白酶体活性可以使用以下各项来测量：丁二酰基-Leu-Leu-Val-Tyr-酰胺基甲基香豆素(LLVY-AMC)，针对胰凝乳蛋白酶样活性；N-叔丁氧基羰基-Leu-Ser-Thr-Arg-酰胺基甲基香豆素(LSTR-AMC)，针对胰蛋白酶样活性；以及苄氧基羰基-Leu-Leu-Glu-酰胺基甲基香豆素(LLE-AMC)，针对肽基谷酰基-肽水解酶活性。
制剂的RPE细胞可以具有以下平均泛素轭合物累积：为从成人眼睛(即，年龄是25至80岁的成人患者，更优选地是年龄是50至80岁的成人)分离的等量RPE细胞的平均泛素轭合物累积的50％以下，并且更优选地为从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均泛素轭合物累积的40％、30％、20％或甚至10％以下。作为一个说明性和非限制性实例，泛素轭合物累积可以使用张(Zhang)等，眼科研究与视力科学，2008年8月，第49卷，第8期，3622-3630中所描述的方案来测量。
一种或多种血管生成抑制剂可以与RPE细胞的制剂组合投与，优选地按用于预防或治疗眼部疾病如血管生成相关联的眼部疾病的治疗有效量。示例性眼部疾病包括黄斑变性(例如，湿性AMD或干性AMD)、糖尿病性视网膜病、以及脉络膜新血管生成。示例性血管生成抑制剂包括VEGF拮抗剂，如VEGF和/或VEGF受体(VEGFR，例如VEGFR1(FLT1、FLT)，VEGFR2(KDR、FLK1、VEGFR、CD309)，VEGFR3(FLT4、PCL))的抑制剂，如，肽、肽模拟物、小分子、化学品、或核酸，例如，哌加他尼钠、阿柏西普、贝伐西尼、雷怕霉素、AGN-745、维他兰尼、帕唑帕尼、NT-502、NT-503、或PLG101、CPD791(抑制VEGFR-2的二-Fab’聚乙二醇(PEG)轭合物)、抗-VEGF抗体或其功能性片段(如贝伐单抗
Figure BDA0003183443810000371
或兰尼单抗
Figure BDA0003183443810000372
)、或抗-VEGF受体抗体(如IMC-1121(B)(VEGFR-2的单克隆抗体)，或IMC-18F1(VEGFR-1的胞外结合域的抗体))。VEGF活性的另外的示例性抑制剂包括VEGFR受体的片段或结构域，它的一个实例是VEGF-Trap(阿柏西普)，VEGFR-1的结构域2和VEGFR-2的结构域3与IgG1的Fc片段的融合蛋白。另一个示例性VEGFR抑制剂是AZD-2171(赛地兰尼)，它抑制VEGF受体1和2。另外的示例性VEGF拮抗剂包括酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，包括据报导抑制VEGFR-1和/或VEGFR-2的TKI，如索拉非尼(多吉美)、SU5416(司马沙尼)、SU11248/舒尼替尼(索坦)、以及凡德他尼(ZD 6474)。另外的示例性VEGF拮抗剂包括Ly317615(恩扎妥林)，它被认为靶向VEGFR信号传递中涉及的一个下游激酶(蛋白激酶C)。另外的示例性血管生成抑制剂包括α5β1整合蛋白活性的抑制剂，包括抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段(如伏洛昔单抗)，肽，肽模拟物，小分子，化学品或核酸，如3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基氨基)-甲基]-吡咯烷-3-基氧基}-乙酰基氨基)-2-(烷基-氨基)-丙酸、(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺酰基]氨基-3-[7-卞氧羰基-8-(2--吡啶基氨基甲基)-1-氧杂-2,7-二氮杂螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基氨基丙酸、EMD478761或RC*D(硫代P)C*(Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys；星号表示通过半胱氨酸残基以二硫键环化)。另外的示例性血管生成抑制剂包括2-甲氧基雌二醇、αVβ3抑制剂、血管生成素2、血管抑制性类固醇和肝素、血管抑制素、血管抑制素相关分子、抗-α5β1整合蛋白抗体、抗-组织蛋白酶S抗体、抗凝血酶III片段、贝伐单抗、钙网蛋白、卡斯达丁、羧基酰胺基三唑、软骨衍化血管生成抑制因子、CDAI、CM101、CXCL10、内皮生长抑制素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12、IL-18、IL-4、利诺胺、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、Meth-1、Meth-2、骨桥蛋白、哌加他尼、血小板因子-4、促乳素、增殖素相关蛋白、凝血酶原(kringle结构域-2)、兰尼单抗、静息蛋白、可溶NRP-1、可溶VEGFR-1、SPARC、SU5416、苏拉明、替可加兰、四硫钼酸盐、萨力多胺、雷利度胺、血栓粘合素、TIMP、TNP-470、TSP-1、TSP-2、血管形成抑制素、VEGFR拮抗剂、VEGI、伏洛昔单抗(又称为M200)、纤连蛋白片段如阿纳特林(参见易(Yi)&罗斯拉赫蒂(Ruoslahti)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U SA)，2001年1月16；98(2):620-4)或其任何组合。所述血管生成抑制剂的量优选地是足以预防或治疗增生性(新生血管性)眼睛疾病如与湿性AMD相关联的脉络膜新血管膜(CNV)和视网膜的其他疾病。另外的示例性血管生成抑制剂包括：乐伐替尼(E7080)、莫特塞尼(AMG706)、帕唑帕尼(福退癌)、以及IL-6拮抗剂如抗-IL-6抗体。另外的示例性血管生成抑制剂包括任何上述各项的片段、模拟物、嵌合体、融合体、类似物和/或结构域。另外的示例性血管生成抑制剂包括任何上述各项的组合。在一个示例性实施中，在每次眼睛注射中，RPE细胞的制剂包含抗-VEGF抗体，例如贝伐单抗，如介于约0.1mg与约6.0mg之间，例如介于约1.25mg与约2.5mg之间的贝伐单抗。在另一个示例性实施例中，RPE细胞的制剂包含一种或多种VEGF活性抑制剂和一种或多种α5β1整合蛋白活性抑制剂。
一种或多种消炎剂可以与RPE细胞的制剂组合投与。示例性消炎剂包括：糖皮质激素、非非类固醇消炎药、阿司匹林、布洛芬、萘普生、环加氧酶(COX)抑制剂、醛固酮、倍氯米松、倍他米松、皮质类固醇、皮质醇、醋酸可的松、醋酸脱氧皮质酮、地塞米松、醋酸氟氢可的松、肤轻松(例如，
Figure BDA0003183443810000391
)、糖皮质激素、氢化可的松、甲泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松、类固醇、以及曲安西龙。任选地，消炎剂可能不是皮质类固醇。例如，消炎剂可以是非类固醇消炎药。
另外，患者在投与RPE细胞制剂之前、同时、和/或之后可能未接受皮质类固醇。无意受限于理论，申请人假设皮质类固醇的投与可干扰RPE细胞沉降和/或植入。在某些优选实施例中，患者在投与RPE细胞制剂之前、同时、和/或之后不用泼尼松龙或甲泼尼松龙治疗。在更优选的实施例中，患者在投与RPE细胞制剂之前、同时、和/或之后不用泼尼松龙治疗。例如，患者在投与RPE细胞制剂之前至少3、6、12、24、48、72、96或120小时或更长时间内可不投与泼尼松龙或甲泼尼松龙或另一皮质类固醇。此外，患者在投与RPE细胞制剂之后至少3、6、12、24、48、72、96或120小时或更长时间内可不投与泼尼松龙或甲泼尼松龙或另一皮质类固醇。
患者在投与RPE细胞制剂之前和/或之后可投与非皮质类固醇免疫抑制剂。示例性非皮质类固醇免疫抑制剂包括他克莫司(FK-506大环内脂)和MMF(麦考酚酸前药)。
一种或多种抗氧化剂、抗氧化剂辅助因子、和/或促使抗氧化活性增加的其他因子可以与RPE细胞制剂组合投与，它们的实例可以包括OT-551(Othera公司)、维生素C、维生素E、β胡萝卜素、锌(例如，氧化锌)和/或铜(例如，氧化铜)。
一种或多种黄斑叶黄素(如叶黄素和/或玉米黄质)可以与RPE细胞制剂组合投与。
一种或多种长链Ω-3脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)和/或二十碳五烯酸(EPA)可以与RPE细胞制剂组合投与。
一种或多种淀粉样蛋白抑制剂如芬维A胺、Arc-1905、克帕松(醋酸格拉替雷，梯瓦公司(Teva))、RN6G(PF-4382923，辉瑞公司(Pfizer)(针对Aβ40和Aβ42的人源化单克隆抗体))、GSK933776((葛兰素史克)(GlaxoSmithKline))(抗-淀粉样蛋白抗体)可以与RPE细胞制剂组合投与。
一种或多种睫状神经营养因子(CNTF)激动剂(例如，能够以一个眼内装置如NT-501(神经科技(Neurotech))递送的CNTF)可以与RPE细胞制剂组合投与。
一种或多种RPE65的抑制剂如ACU-4429(Aculea公司)可以与RPE细胞制剂组合投与。
靶向A2E和/或脂褐质累积的一种或多种因子如芬维A胺和ACU-4429可以与RPE细胞制剂组合投与。
感光细胞功能和/或代谢的一种或多种下调剂或抑制剂如芬维A胺和ACU-4429可以与RPE细胞制剂组合投与。
一种或多种α2-肾上腺素能受体激动剂如酒石酸溴莫尼定可以与RPE细胞制剂组合投与。
一种或多种选择性血清素1A激动剂如坦度螺酮(AL-8309B)可以与RPE细胞制剂组合投与。
与RPE细胞制剂组合时，可以投与靶向C-5的一种或多种因子、膜攻击复合物(C5b-9)和/或任何其它玻璃疣组分，它们的实例包括补体因子D、C-3、C-3a、C5、以及C5a的抑制剂，和/或因子H的激动剂，如ARC1905(Ophthotec公司)(选择性抑制C5的抗-C5适体)、POT-4(Potentia公司)(抑制C3的补体抑制素衍生物)、补体因子H、依库丽单抗(Soliris，美国亚力兄公司(Alexion))(抑制C5的人源化IgG抗体)、和/或FCFD4514S(基因泰克(Genentech)公司，旧金山)(针对补体因子D的单克隆抗体)。
一种或多种免疫抑制剂如西罗莫司(雷帕霉素)可以与RPE细胞制剂组合投与。
预防或治疗脂褐质累积的一种或多种试剂如吡拉西坦、盐酸甲氯酚酯、乙酰基-L-肉碱、银杏或其提取物或制剂、和/或DMAE(二甲基乙醇胺)可以与RPE细胞制剂组合投与。
在一种或多种试剂(例如血管生成抑制剂、抗氧化剂、抗氧化剂辅助因子、促使抗氧化活性增加的其他因子、黄斑叶黄素、长链Ω-3脂肪酸、淀粉样蛋白抑制剂、CNTF激动剂、RPE65的抑制剂、靶向A2E和/或脂褐质累积的因子、感光细胞功能和/或代谢的下调剂或抑制剂、α2-肾上腺素能受体激动剂、选择性血清素1A激动剂、靶向C-5的因子、膜攻击复合物(C5b-9)和/或任何其它玻璃疣组分、免疫抑制剂、预防或治疗脂褐质累积的试剂等)与RPE细胞制剂组合投与时，所述试剂可以在所述RPE细胞制剂的同时、之前和/或之后投与。例如，所述试剂可以在将所述RPE细胞制剂引入所述患者的眼睛中的过程中投与患者的眼睛。所述试剂的投与可以在将所述RPE细胞投与患者的眼睛之前开始和/或在之后继续开始。例如，所述试剂可以提供在溶液、悬浮液中、作为持续释放方式提供，和/或提供在持续递送系统(例如，艾尔建(Allergan)NovadurTM递送系统，NT-501或另一眼内装置或持续释放系统)中。
RPE细胞群体可以包括不同成熟度水平的分化的RPE细胞，或者可以相对于具有具体成熟度水平的分化的RPE细胞来说基本上是纯的。这些RPE细胞可以是包含不同成熟度/色素沉着水平的RPE细胞的基本上纯化的制剂。例如，RPE细胞的基本上纯化的培养物可以含有分化的RPE细胞和成熟的分化的RPE细胞两者。在成熟的RPE细胞之中，色素水平可以变化。然而，可以基于增加的色素沉着水平和更为柱状的形状来视觉区分成熟的RPE细胞与RPE细胞。基本上纯化的RPE细胞制剂包含不同成熟度水平的RPE细胞(例如，分化的RPE细胞和成熟的分化的RPE细胞)。在这类情况下，相对于指示色素沉着的标记物的表达来说，整个制剂中可能存在可变性。细胞培养物中RPE细胞的色素沉着可能是均匀的。另外，细胞培养物中RPE细胞的色素沉着可能是不均匀的，并且RPE细胞的培养物可以包含分化的RPE细胞和成熟的RPE细胞两者。包含RPE细胞的制剂包括相对于非RPE细胞类型来说基本上是纯的、但含有分化的RPE细胞与成熟的分化的RPE细胞的混合物的制剂。包含RPE细胞的制剂还包括相对于非RPE细胞类型并且相对于具有其他成熟度水平的RPE细胞来说基本上是纯的制剂。
成熟的分化的RPE细胞在培养物中的百分比可以通过减小培养物的密度来减少。因此，在此描述的方法可以进一步包括继代培养成熟的RPE细胞群体以便产生含有较小百分比的成熟RPE细胞的培养物。制剂中RPE细胞的数量包括分化的RPE细胞，而不管成熟度水平如何，并且不管分化的RPE细胞和成熟的分化的RPE细胞的相对百分比如何。制剂中RPE细胞的数量是指分化的RPE细胞或成熟的RPE细胞的数量。该制剂可以包含至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的分化的RPE细胞。该制剂可以包含至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的成熟的RPE细胞。该RPE细胞制剂可以包含分化的RPE细胞与成熟的RPE细胞的混合群体。
本披露提供一种包含人RPE细胞的细胞培养物，这些细胞是着色的并且表达非人RPE的细胞中不表达的至少一个基因。例如，但是这类RPE细胞可以具有与一个天然人RPE细胞基本上相同的RPE65、PEDF、CRALBP、以及卵黄状黄斑病蛋白的表达。取决于成熟度水平，这些RPE细胞相对于PAX2、Pax 6、MITF和/或酪氨酸酶中的一个或多个的表达来说可以变化。应注意到，分化后色素沉着的变化还与PAX2表达的变化相关。可以通过色素沉着的水平，PAX2、Pax 6、和/或酪氨酸酶的表达水平将成熟的RPE细胞与RPE细胞区分开来。例如，与RPE细胞相比较，成熟的RPE细胞可以具有更高的色素沉着水平或更高的PAX2、Pax 6、和/或酪氨酸酶的表达水平。
制剂相对于非RPE细胞来说可以基本上是纯化的，包含至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的RPE细胞。该RPE细胞制剂可基本上不含非RPE细胞或由RPE细胞组成。例如，基本上纯化的RPE细胞的制剂可以包含小于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的非RPE细胞类型。例如，该RPE细胞制剂可以包含小于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的非RPE细胞。
这些RPE细胞制剂相对于非RPE细胞来说并且相对于具有其他成熟度水平的RPE细胞来说可以基本上是纯的。这些制剂相对于非RPE细胞来说可以是基本上纯化的，并且对于成熟的RPE细胞来说是富集的。例如，在对于成熟的RPE细胞来说富集的RPE细胞制剂中，至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99％或100％的RPE细胞是成熟的RPE细胞。这些制剂相对于非RPE细胞来说可以基本上是纯化的，并且对于分化的RPE细胞而非成熟的RPE细胞来说是富集的。例如，至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99％或100％的RPE细胞可以是分化的RPE细胞而非成熟的RPE细胞。
这些RPE细胞制剂可以包含至少约1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010个RPE细胞。这些RPE细胞制剂可以包含至少约5,000至10,000、50,000至100,000、100,000至200,000、200,000至500,000、300,000至500,000或400,000至500,000个RPE细胞。这些RPE细胞制剂可以包含至少约20,000至50,000个RPE细胞。而且，这些RPE细胞制剂可以包含至少约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、75,000、80,000、100,000或500,000个RPE细胞。
这些RPE细胞制剂可以包含至少约1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010个RPE细胞/mL。这些RPE细胞制剂可以包含至少约5,000至10,000、50,000至100,000、100,000至200,000、200,000至500,000、300,000至500,000或400,000至500,000个RPE细胞/mL。这些RPE细胞制剂可以包含至少约20,000至50,000个RPE细胞/mL。而且，这些RPE细胞制剂可以包含至少约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000、100,000或500,000个RPE细胞/mL。
在此描述的这些制剂可以基本上不含细菌、病毒或真菌污染或感染，包括但不限于HIV 1、HIV 2、HBV、HCV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、细小病毒B19、艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)或孢疹病毒6的存在。在此描述的这些制剂可以基本上不含支原体污染或感染。
在此描述的这些RPE细胞在移植之后还可以用作功能性RPE细胞，其中这些RPE细胞在接受移植细胞的患者体内的感觉神经视网膜与脉络膜之间形成一个单层。这些RPE细胞还可以将营养供应到感光细胞附近并且通过吞噬作用处置脱落的感光细胞外部片段。此外，在此描述的这些RPE细胞可以具有比来源于眼睛捐赠者的细胞(例如，这些RPE细胞要比眼睛捐赠者的那些“更年幼”)更大的增殖潜力。这允许在此描述RPE细胞具有比来源于眼睛捐赠者的细胞更长的使用寿命。
包含RPE细胞的这些制剂可以根据良好制造规范(GMP)(例如，这些制剂是符合GMP的)和/或现行良好组织规范(GTP)(例如，这些制剂可以是符合GTP的)来制备。
RPE细胞培养物
本披露还提供RPE细胞(包括人RPE细胞)的基本上纯化的培养物。在此描述的这些RPE培养物可以包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000或9,000个RPE细胞。该培养物可以包含至少约1×104、2×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、10×103、1×105、2×105、3×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×104、10×104、1×106、2×106、3×106、4×106、6×106、7×106、8×105、9×105、10×105、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、7×106、8×106、9×106、10×106、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×107、7×107、9×107、10×107、1×109、2×109、3×109、4×109、5×108、6×108、7×108、8×108、10×108、1×1010、2×1010、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010个RPE细胞。
这些RPE细胞可以进一步被培养来产生成熟的RPE细胞的培养物。这些RPE细胞可以是成熟的，并且这些RPE细胞可以进一步在例如RPE-GM/MM或MDBK MM培养基中进一步培养直到获得所希望的成熟水平。这可以通过监测成熟过程中的色素沉着水平的提高来测定。作为RPE-GM/MM或MDBK MM培养基的一种替代物，可以使用功能上相同或相似的培养基。不管用于使RPE细胞成熟的具体培养基，可以任选地给培养基补充生长因子或试剂。RPE细胞和成熟的RPE细胞两者均是分化的RPE细胞。然而，成熟的RPE细胞的特征在于与分化的RPE细胞相比较增加的色素水平。成熟度和色素沉着水平可以通过增大或减小分化的RPE细胞的培养物的密度来调节。因此，RPE细胞的培养物可以进一步被培养来产生成熟的RPE细胞。可替代地，含有成熟的RPE细胞的培养物的密度可以被减少来降低成熟的分化的RPE细胞的百分比并且提高分化的RPE细胞的百分比。
这些RPE细胞可以通过将这类细胞的信使RNA转录物与体内来源的细胞相比较来鉴别。在胚胎干细胞向RPE细胞的分化过程中的不同时间间隔内取得等份细胞并且测定上述标记物中任一个的表达。这些特征使分化的RPE细胞区分开来。
RPE细胞培养物可以是基本上纯化的培养物，该培养物包含至少约30％、35％、40％或45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的分化的RPE细胞。基本上纯化的培养物可以包含至少约30％、35％、40％或45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的成熟的分化的RPE细胞。
这些RPE细胞培养物可以根据良好制造规范(GMP)(例如，这些培养物是符合GMP的)和/或现行良好组织规范(GTP)(例如，这些培养物可以是符合GTP的)来制备。
冷冻保存的RPE细胞制剂
这些RPE细胞可以通过本领域中已知的任何合适的方法(例如，低温冷冻)来储存并且可以在适于储存细胞的任何温度下冷冻。例如，这些细胞可以在约-20℃、-80℃、-120℃、-130℃、-135℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃、-196℃，或适于储存细胞的任何其他温度下冷冻。低温冷冻的细胞可以储存在合适的容器中并且准备来储存以便降低细胞损伤的风险并且最大化细胞将在解冻时存活的可能性。RPE细胞可以在分化之后、在体外成熟之后、或在培养一段时间之后立即冷冻保存。这些RPE细胞还可以维持在室温，或在例如约4℃下冷藏。
类似地还提供了冷冻保存RPE细胞的方法。可以对这些RPE细胞进行收获，在缓冲液或培养基中洗涤，计数、浓缩(经由离心)，在冷冻培养基(例如，90％FBS/10％DMSO)中配制或这些步骤的任何组合。例如，这些RPE细胞可以在若干培养器皿中接种并且连续扩增。在RPE细胞被收获并且在约4℃下在FBS中维持时，将若干RPE细胞的烧瓶组合成单批。也可以用生理食盐水溶液(例如，DPBS)将这些RPE细胞洗涤至少1、2、3、4或5次。另外，可以在抗肌萎缩蛋白组织在细胞膜上并且PAX6表达低之后将这些RPE细胞冷冻保存。此外，可以用一级和/或二级标签来标记小瓶。标签上的信息可以包括细胞类型(例如，hRPE细胞)、批号和日期、细胞数量(例如，1×106细胞/mL)、到期日期(例如，使用小瓶的推荐日期)、制造信息(例如，名称和地址)、警告、以及存储方法(例如，储存在液氮中)。
在此描述的冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约50,000至100,000个RPE细胞。这些冷冻保存的RPE细胞制剂也可以包含至少约20,000至500,000个RPE细胞。而且，这些冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000或100,000个RPE细胞。这些冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000、100,000或500,000个RPE细胞。这些冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、1×104、2×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、10×103、1×105、2×105、3×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×104、10×104、1×106、2×106、3×106、4×106、6×106、7×106、8×105、9×105、10×105、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、7×106、8×106、9×106、10×106、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×107、7×107、9×107、10×107、1×109、2×109、3×109、4×109、5×108、6×108、7×108、8×108、10×108、1×1010、2×1010、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010个RPE细胞。冷冻保存的RPE细胞制剂的RPE细胞可以是哺乳动物RPE细胞，包括人RPE细胞。
另外，在此描述的冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约50,000至100,000个RPE细胞/mL。这些冷冻保存的RPE细胞制剂也可以包含至少约20,000至500,000个RPE细胞/mL。而且，这些冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000以及100,000个RPE细胞/mL。这些冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000、100,000或500,000个RPE细胞/mL。这些冷冻保存的RPE细胞制剂可以包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、1×104、2×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、10×103、1×105、2×105、3×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×104、10×104、1×106、2×106、3×106、4×106、6×106、7×106、8×105、9×105、10×105、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、7×106、8×106、9×106、10×106、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×107、7×107、9×107、10×107、1×109、2×109、3×109、4×109、5×108、6×108、7×108、8×108、10×108、1×1010、2×1010、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010个RPE细胞/mL。冷冻保存的RPE细胞制剂的RPE细胞可以是哺乳动物RPE细胞，包括人RPE细胞。
本披露的RPE细胞可以在冷冻保存之后从存储中回收。从冷冻保存回收的这些RPE细胞还将维持它们的活力和分化状态。例如，至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的RPE细胞在冷冻保存之后可以保持活力和分化。另外，本披露的RPE细胞可以冷冻保存并且在储存至少约1、2、3、4、5、6或7天后维持它们的活力。本披露的RPE细胞也可以冷冻保存并且在储存至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月后维持它们的活力。本披露的RPE细胞可以冷冻保存并且在储存至少约1、2、3、4、5、6或7年后维持它们的活力。例如，本披露的RPE细胞可以冷冻保存至少约4年并且显示出至少约80％的活力。包含RPE细胞的冷冻保存制剂可以基本上不含DMSO。
产生RPE细胞的方法
可以从多能干细胞产生主题方法分析的细胞群体。可以产生的细胞类型包括但不限于RPE细胞、RPE祖细胞、虹膜着色上皮(IPE)细胞和其他视力相关神经细胞，如中间神经元(例如，内核层(INL)的“转接”神经元)以及无长突细胞。此外，可以产生视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、以及角膜细胞。提供眼睛脉管系统的细胞也可以通过在此描述的方法来产生。
无意受限于具体理论，发明人发现在此描述的方法可以通过FGF、EGF、WNT4、TGF-β、和/或氧化应力发挥作用以便传递MAP-激酶和潜在CJun末端激酶路径的信号以诱导配对盒6(PAX6)转录因子的表达。PAX6与PAX2协同作用来经由MITF和Otx2的协作最终使成熟的RPE分化以便转录RPE-特异性基因如酪氨酸酶(Tyr)，以及下游靶标如RPE65、卵黄状黄斑病蛋白、CRALBP、以及PEDF。参见WO 2009/051671，图1。
在此描述的RPE细胞可以从多能干细胞如人胚胎干细胞分化，并且可以在分子上相异于胚胎干细胞、成人来源RPE细胞以及胎儿来源RPE细胞。例如，在此描述的制造过程步骤可以将相异的结构和功能特征赋予最终RPE细胞产物，这样使得这些细胞非常类似天然RPE细胞并且相异于胎儿来源RPE细胞或RPE细胞系(例如，ARPE19)。
申请人先前披露了用于从多能细胞产生RPE的方法。参见美国专利号7736896、7795025以及7794704，以及公开的国际申请WO/2012/012803和WO 2011/063005，每个申请通过引用以其全部内容结合在此。RPE可以从培养作为多层群体或胚状体的多能细胞产生。例如，胚状体可以通过在非附着条件下例如在一种低附着基底上或在一种“悬滴”中培养多能细胞来形成。在这些培养物中，ES细胞可以形成名为胚状体的细胞块或细胞簇。参见Itskovitz-Eldor等人，分子医学杂志(Molecular Medicine)2000年2月；6(2):88-95，该文献通过引用方式以其全部内容结合在此。典型地，胚状体最初形成为多能细胞的固体块或簇，并且随着时间的推移，一些胚状体变得包括流体填充的空腔，前者在文献中称为“简单”EB并且后者称为“囊状”胚状体。同上。由于申请人先前已报导，所以这些EB(固体形式和囊状形式两者)中的细胞可以分化并且随着时间的推移产生数量增加的RPE细胞。任选地，EB然后可以培养作为附着培养物并且被允许形成长出物。类似地，申请人先前已报导了被允许过度生长并且形成一个多层细胞群体的多能细胞可以分化并且随着时间的推移形成RPE细胞。一旦形成RPE，就基于它们的形态特征(包括色素沉着和卵石外观)来容易地对它们进行鉴别，并且可以进行分离来用于进一步使用。
在使用本领域中已知的任何培养方法来形成RPE细胞之前，可以繁殖和维持这些多能细胞。例如，这些多能细胞可以在饲养细胞如鼠细胞(例如，鼠胚胎成纤维细胞(MEF))、人饲养细胞(例如，成人皮肤细胞、新生儿真皮成纤维细胞(HNDF)等等)存在下进行培养。多能细胞可以在无异源物质的培养物中，和/或在无饲养条件下进行培养。参见克利曼斯基(Klimanskaya)等人，柳叶刀(Lancet.)，2005年5月7-13；365(9471):1636-41；理查德(Richards)等人，干细胞学杂志(Stem Cells.)2003；21(5):546-56；美国专利号7,410,798；伊利克(Ilic)等人，干细胞发育(Stem Cells Dev.)，2009年11月；18(9):1343-5；徐(Xu)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol.)2001年10月；19(10):971-4，每个参考文献通过引用以其全部内容结合在此。例如，多能细胞可以在一种基质上培养。该基质可以选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)、CellStart、人基底膜提取物、以及其任何组合。该基质可以具有人或非人动物来源，如牛、小鼠或大鼠来源。这些多能细胞可以在一个条件培养基中进行培养。例如，该条件培养基可以通过多能干细胞如ES细胞、iPS细胞、饲养细胞、胎儿细胞等等来调节，这些细胞中的任一种可能是或不是人的。
在RPE形成过程中，这些多能细胞可以在rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂存在下进行培养。ROCK抑制剂是指抑制或减弱rho相关激酶或其信号传递路径在一个细胞中的功能的任何物质，如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等。如在此所使用的“ROCK信号传递路径”可以包括ROCK相关信号传递路径(如，在一个细胞中的Rho-ROCK-肌球蛋白II信号传递路径、其上游信号传递路径或其下游信号传递路径)中涉及的任何信号处理器(processor)。可以使用的一个示例性ROCK抑制剂是斯泰姆特(Stemgent)的Stemolecule Y-27632，即一种rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(参见渡边(Watanabe)等人，自然生物技术，2007年6月；25(6):681-6)。其他ROCK抑制剂包括例如H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A以及SB-772077-B。多伊(Doe)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，32:89-98,2007；石崎(Ishizaki)等人，分子药物学(Mol.Pharmacol.)，57:976-983,2000；中岛(Nakajima)等人，肿瘤化疗与药理学(CancerChemother.Pharmacol.)，52:319-324,2003；以及佐佐木(Sasaki)等人，药理治疗(Pharmacol.Ther.)，93:225-232,2002，每个参考文献都通过引用结合在此，就如阐述全文一样。ROCK抑制剂可以按本领域中已知的浓度和/或培养条件使用，例如如在美国预授权公开号2012/0276063中所描述，该公开案通过引用以其全部内容结合在此。例如，ROCK抑制剂可以具有约0.05至约50μM的浓度，例如至少或约0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50μM，包括在此可衍化的任何范围，或有效促进细胞生长或存活的任何浓度。
例如，多能细胞活力可以通过包括一种ROCK抑制剂来改善。在一个示例性实施例中，这些多能细胞可以在无饲养条件下如在Matrigel(TM)或另一基质上维持。因此，胚状体可以由多能细胞形成，这些多能细胞在不使用胰蛋白酶的情况下如使用EDTA、胶原酶或机械地解离。这些胚状体可以形成在包含Y-27632或另一ROCK抑制剂的培养基中。例如，ROCK抑制剂可以促进由Matrigel(TM)或另一基质上培养的多能细胞形成的胚状体的细胞活力。因此可以改善RPE细胞产量。
一种用于产生RPE细胞的示例性方法包括：(a)提供多能干细胞；(b)在富营养、低蛋白的培养基中将这些多能干细胞培养为胚状体，其中该培养基任选地包含无血清的B 27补充物；(c)在富营养、低蛋白的培养基中将这些胚状体培养为一种附着培养物，其中该培养基任选地包含无血清的B 27补充物；(d)在富营养、低蛋白的培养基中培养(c)的细胞的附着培养物，其中该培养基不包含无血清的B 27补充物；(e)在能够支持高密度体细胞培养物的生长的培养基中培养(d)的细胞，借此RPE细胞出现在细胞的培养物中；(f)从(e)的培养物中解离细胞或细胞块，优选机械地或化学地解离(例如，使用一种蛋白酶或其他酶，或另一解离培养基)；(g)从该培养物中选择RPE细胞并且将这些RPE细胞转移到含有补充有生长因子的培养基的一种单独的培养物中以便产生一种富集的RPE细胞培养物；以及(g)繁殖该富集的RPE细胞培养物以便产生RPE细胞。可以将这些方法步骤进行至少一次以便产生一种基本上纯化的RPE细胞培养物。另外，可以将这些方法步骤重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次以便产生更多的RPE细胞。
此外，本披露还提供一种用于产生成熟的视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：(a)提供多能干细胞；(b)在富营养、低蛋白的培养基中将这些多能干细胞培养为胚状体，其中该培养基任选地包含无血清的B 27补充物；(c)在富营养、低蛋白的培养基中将这些胚状体培养为一种附着培养物，其中该培养基任选地包含无血清的B 27补充物；(d)在富营养、低蛋白的培养基中培养步骤(c)的细胞的附着培养物，其中该培养基不包含无血清的B27补充物；(e)在能够支持高密度体细胞培养物的生长的培养基中培养(d)的细胞，借此RPE细胞出现在细胞的培养物中；(f)从(e)的培养物中解离细胞或细胞块，优选机械地或化学地解离(例如，使用一种蛋白酶或其他酶，或另一解离培养基)；(g)从该培养物中选择RPE细胞并且将这些RPE细胞转移到含有补充有生长因子的培养基的一种单独的培养物中以便产生一种富集的RPE细胞培养物；(h)繁殖该富集的RPE细胞培养物；以及(i)培养该富集的RPE细胞培养物以便产生一种成熟的RPE细胞。可以将这些方法步骤进行至少一次以便产生一种基本上纯化的成熟RPE细胞培养物。另外，可以将这些方法步骤重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次以便产生更多的成熟的RPE细胞。
对于任何所表述的步骤来说，可以将这些细胞培养至少约1至10周。例如，可以将这些细胞培养至少约3至6周。对于任何所表述的步骤来说，可以将这些细胞培养介于约1天与50天之间，例如持续至少约1至3、3至4、7、4至9、7至10、7至12、8至11、9至12、7至14、14至21、以及3至45天。可以将这些细胞培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天。可以将这些细胞培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。例如，可以将这些细胞培养2至4小时和3至6小时。对于以上所表述的方法步骤中的每一个来说，在每个步骤可以将这些细胞培养相同的时间段或在一个或多个步骤可以将这些细胞培养不同的时间段。此外，可以重复任何以上所表述的方法步骤以便产生更多的RPE细胞(例如，扩大规模以便产生大量RPE细胞)。
在在此描述的方法中，这些RPE细胞可以从EB的附着培养物中的细胞当中开始分化。RPE细胞可以基于它们的卵石形态以及初始的色素沉着出现来视觉识别。随着RPE细胞继续分化，可以观察到RPE细胞簇。
机械或酶促方法可以用于从一种胚状体培养物中的非RPE细胞簇当中选择RPE细胞，或促进附着细胞的继代培养。示例性机械方法包括但不限于用一个移液管磨碎或用一个拉动的针头切割。示例性酶促方法包括但不限于适于解离细胞的任何酶(例如，胰蛋白酶(例如，胰蛋白酶/EDTA)、胶原酶(例如，胶原酶B、胶原酶IV)、分散酶、木瓜蛋白酶、胶原酶和分散酶的混合物、胶原酶和胰蛋白酶的混合物)。非酶溶液可以用于解离细胞，如含较多EDTA的溶液，例如基于汉克斯(Hanks)的细胞解离缓冲液。
这些RPE细胞可以从胚状体分化。从EB分离RPE细胞允许这些RPE细胞在体外在一种富集的培养物中扩增。对于人细胞来说，RPE细胞可以从生长持续不到90天的EB获得。另外，RPE细胞可在生长持续至少约7至14天、14至28天、28至45天或45至90天的人EB中出现。用于培养多能干细胞、胚状体以及RPE细胞的培养基可以在任何时间间隔去除和/或用相同的或不同的培养基替换。例如，可以在至少约0至7天、7至10天、10至14天、14至28天或28至90天之后去除和/或替换该培养基。另外，可以至少每天、每隔一天或至少每3天替换该培养基。
为了富集RPE细胞并且建立基本上纯化的RPE细胞培养物，可以使用机械和/或化学(包括酶促)方法使RPE细胞彼此解离并且与非RPE细胞解离。然后可以将一种RPE细胞悬浮液转移到新鲜培养基中和一个新培养器皿中以便提供一个富集的RPE细胞群体。
RPE细胞可以从解离细胞中选择并且单独培养来提供一个基本上纯化的RPE细胞培养物。基于与RPE细胞相关联的特征来选择RPE细胞。例如，RPE细胞可以通过卵石细胞形态和色素沉着来识别。此外，存在若干已知的RPE的标记物，包括细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)(还在顶端微绒毛中发现的一种细胞质蛋白)；RPE65(类视黄醇代谢中涉及的一种细胞质蛋白)；卵黄状黄斑病蛋白(贝斯特卵黄状黄斑萎缩基因(VMD2)的产物)，以及色素上皮衍化因子(PEDF)(具有血管生成抑制特性的一种48kD分泌蛋白)。这些标记物的信使RNA转录物可以使用PCR(例如，RT-PCR)或RNA印迹来测定。而且，这些标记物的蛋白水平可以使用免疫印迹技术或蛋白质印迹来测定。
这些RPE细胞还可以基于细胞功能，如通过脱落的视杆细胞和视锥细胞外部片段的吞噬作用(或另一基底如聚苯乙烯珠粒的吞噬作用)、杂散光的吸收、维生素A代谢、类视黄醇再生以及组织修复来选择。评价还可以在RPE细胞植入到一个合适的宿主动物(如患有天然发生的或诱导的视网膜变性病状的人或非人动物)体内之后通过测试体内功能来进行，例如，使用行为测试，荧光血管造影术、组织学、紧密连接部传导性或使用电子显微术进行评价。
这些富集的RPE细胞培养物可以在合适的培养基例如EGM 2培养基中进行培养。可以给这种培养基或功能上相同或相似的培养基补充一种生长因子或试剂(例如，bFGF、肝素、氢化可的松、血管内皮生长因子、重组胰岛素样生长因子、抗坏血酸或人表皮生长因子)。这些RPE细胞在培养时在一个长时间段(例如，>6周)上在表型上可以是稳定的。
任选地，RPE可以在rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂如斯泰姆特的Stemolecule Y-27632存在下进行培养。例如，RPE在冷冻保存之前可以在一种ROCK抑制剂存在下进行培养。
多能干细胞
在此描述的方法可以使用从多能干细胞产生的分化细胞(如RPE细胞)。合适的多能干细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎来源的干细胞、以及诱导的多能干细胞，而不管获得这些多能干细胞的方法。多能干细胞可以使用例如本领域中已知的方法来产生。示例性多能干细胞包括来源于胚泡期胚胎的内细胞团(ICM)的胚胎干细胞以及来源于分裂期或桑椹胚期胚胎的一个或多个卵裂球的胚胎干细胞(任选地不破坏胚胎的剩余部分)。这类胚胎干细胞可以从通过受精或通过无性手段(包括体细胞核转移(SCNT)、单性生殖、细胞重编程、以及单雄生殖)产生的胚胎材料产生。另外，合适的多能干细胞包括但不限于人胚胎干细胞、人胚胎来源干细胞、以及人诱导的多能干细胞，而不管获得这些多能干细胞的方法如何。
这些多能干细胞(例如hES细胞)可以培养为一种悬浮培养物以便产生胚状体(EB)。可以悬浮培养这些胚状体约7至14天。然而，在某些实施例中，可以悬浮培养这些EB不到7天(小于7、6、5、4、3、2或小于1天)或超过14天。可以在补充有B 27补充物的培养基中培养这些EB。
在悬浮培养物中培养这些EB之后，可以转移这些EB以便产生一种附着培养物。例如，可以将培养基中的这些EB铺在涂有明胶的板上。在培养为一种附着培养物时，这些EB可以在与悬浮生长相同类型的培养基中进行培养。在将这些细胞培养为一种附着培养物时，可能未给该培养基补充B 27补充物。而且，最初(例如，小于或等于约7天)给该培养基补充B27，但随后接着在B 27不存在下作为一种附着培养物培养持续该时期的剩余时间。可以将作为一种附着培养物的EB培养至少约14至28。然而，在某些实施例中，可以将作为一种附着培养物的这些EB培养不到约14天(小于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或小于1天)或超过约28天。
人胚胎干细胞
人胚胎干(hES)细胞在在此描述的方法中可以用作一种多能干细胞。人胚胎干细胞(hES)包括来源于另一来源的胚泡的内细胞团(ICM)或细胞的子代，并且在实际上仍然可以无限期地保持多能。这些hES细胞可以来源于一个早期分裂期胚胎的一个或多个卵裂球，任选地不破坏或不伤害该胚胎。这些hES细胞可以使用核转移来产生。这些hES细胞还可以是下文进一步详细描述的诱导的多能细胞(iPS细胞)。而且，可以使用冷冻保存的hES细胞。这些hES细胞可以按本领域中已知的任何方法来培养，如在饲养细胞存在下或不存在下。例如，这些hES细胞可以在EB-DM、MDBK GM、hESC培养基、
Figure BDA0003183443810000591
干细胞培养基、OptiPro SFM、VP SFM、EGM 2或MDBK MM中进行培养。参见干细胞信息(人胚胎干细胞(hESC)的培养)[NIH网站，2010]。这些hES细胞可以根据GMP标准来使用和维持。
当在限定条件下在一个饲养层上培养生长时，hES细胞维持特定的形态，从而形成包含小且紧密堆叠的细胞的扁平集落，这些细胞具有高的核与细胞质之比，清楚的细胞间边界以及鲜明的可折射的边沿。hES细胞表达一组分子标记物如八聚体结合蛋白4(Oct-4，也称作Pou5f1)、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和SSEA 4、肿瘤排斥抗原(TRA)1 60、TRA 180、碱性磷酸酶、NANOG、以及Rex 1。与分化成预定谱系的ICM的细胞类似，培养中的hES细胞可以被诱导来分化。例如，hES细胞可以在在此描述的限定条件下分化成人RPE。
可以使用的人胚胎干细胞包括但不限于MA01、MA04、MA09、ACT4、MA03、H1、H7、H9、以及H14。另外的示例性细胞系包括NED1、NED2、NED3、NED4、以及NED5。还参见NIH人胚胎干细胞登记表。可以使用的一个示例性人胚胎干细胞系是MA09细胞。MA09细胞的分离和制备先前已在克利曼斯基等人(2006)“来源于单个卵裂球的人胚胎干细胞系(Human EmbryonicStem Cell lines Derived from Single Blastomeres)”自然444:481–485中描述。
这些hES细胞最初可以与鼠胚胎饲养细胞(MEF)共培养。这些MEF细胞可以在共培养物中接种hES细胞之前通过暴露在丝裂霉素C下来有丝分裂式灭活，并且因此MEF不再培养中繁殖。此外，hES细胞培养物可以用显微镜检查并且含有非hES细胞形态的集落可以例如使用一个干细胞切割工具，通过激光消融或其他手段来挑取和丢弃。典型地，在针对胚状体形成而接种的hES细胞的收获点之后，过程中不使用另外的MEF细胞。MEF去除与在此描述的RPE细胞收获之间的时间可以是至少一个、两个、三个、四个或五个传代并且在无MEF的细胞培养物中至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100天的最小值。MEF去除与收获RPE细胞之间的时间还可以是至少约3个传代并且在无MEF的细胞培养物中至少约80至90天的最小值。归因于在此描述的产生方法，在此描述的这些RPE细胞培养物和制剂可以基本上不含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和人胚胎干细胞(hES)。
诱导的多能干细胞(iPS细胞)
另外的示例性多能干细胞包括通过表达或诱导因子组合(“重编程因子”)的表达而对体细胞重编程产生的诱导的多能干细胞(iPS细胞)。iPS细胞可以使用胎儿、产后、新生儿、青少年或成人体细胞来产生。iPS细胞可以从一个细胞库获得。可替代地，可以在开始分化成RPE细胞或另一细胞类型之前新产生(通过本领域中已知的方法)iPS细胞。iPS细胞的制作可以是分化细胞的产生中的一个最初步骤。确切地说，iPS细胞可以使用来自具体患者或匹配捐赠者的材料来产生，其中目的是产生匹配组织的RPE细胞。iPS细胞可以从在目标接受者中基本上不具有免疫原性的细胞产生，例如，从自体细胞或从与目标接受者组织相容的细胞产生。
诱导的多能干细胞可以通过表达或诱导体细胞中的一种或多种重编程因子的表达来产生。体细胞是成纤维细胞(如真皮成纤维细胞、滑膜成纤维细胞或肺成纤维细胞)或非成纤维细胞的体细胞。体细胞通过表达至少1、2、3、4、5来重编程。这些重编程因子可以选自Oct 3/4、Sox2、NANOG、Lin28、c Myc、以及Klf4。这些重编程因子的表达可以通过使这些体细胞与诱导重编程因子的表达的至少一种试剂(如小有机分子试剂)接触来诱导。
体细胞还可以使用一种组合方法来重编程，其中表达了重编程因子(例如，使用病毒载体、质粒等)并且诱导了重编程因子的表达(例如，使用小有机分子)。例如，重编程因子可以通过使用病毒载体(如，逆转录病毒载体或慢病毒载体)感染来表达在体细胞中。而且，重编程因子可以使用非整合载体(例如，附加体质粒)来表达在体细胞中。参见例如余(Yu)等人，科学(Science)，2009年5月8；324(5928):797-801，该文献通过引用方式以其全部内容结合在此。在重编程因子使用非整合载体来表达时，这些因子可以使用体细胞用载体的电穿孔、转染或转化来表达在细胞中。例如，在小鼠细胞中，四种因子(Oct3/4、Sox2、c myc、以及Klf4)使用整合病毒载体的表达足以对体细胞重编程。在人细胞中，四种因子(Oct3/4、Sox2、NANOG、以及Lin28)使用整合病毒载体的表达足以对体细胞重编程。
一旦这些重编程因子被表达在细胞中，就可以培养这些细胞。随着时间的推移，具有ES特征的细胞出现在培养皿中。可以基于例如ES形态或基于一种可选择的或可检测的标记物的表达来选择和继代培养这些细胞。这些细胞可以被培养来产生与ES细胞(这些是假定的iPS细胞)相似的细胞培养物。
为了证实这些iPS细胞的多能性，可以在一个或多个多能性测定中测试这些细胞。例如，可以测试这些细胞的ES细胞标记物的表达；可以评价这些细胞在移植到SCID小鼠时产生畸胎瘤的能力；可以评价这些细胞分化产生所有三个胚胎层的细胞类型的能力。一旦获得多能iPS细胞，它可以用于产生RPE细胞。
视网膜色素上皮(RPE)细胞
本披露提供可以从多能干细胞如人胚胎干细胞分化，并且可以在分子上相异于胚胎干细胞、成人来源RPE细胞以及胎儿来源RPE细胞的RPE细胞。根据在此披露的方法的示例性实施例产生的、和在上文鉴别的相关申请中产生的RPE可能与通过先前方法和从其他RPE细胞来源可获得的那些不同。例如，在此描述的制造工艺步骤可以将相异的结构和功能特征赋予最终RPE细胞产品，这样使得这些细胞相异于来自从其他来源获得的分离的RPE细胞如胎儿来源的RPE细胞或RPE细胞系(例如，ARPE19)。
另外，产生在此描述的RPE细胞的方法的示例性实施例不容许ES细胞，这样使得ES细胞无法继存并且不会造成RPE细胞培养物和制剂中的不可接受的污染风险。
本披露提供的细胞类型包括但不限于RPE细胞、RPE祖细胞、虹膜着色上皮(IPE)细胞和其他视力相关联的神经细胞，如中间神经元(例如，内核层(INL)的“转接”神经元)以及无长突细胞。本披露的实施例还可以提供视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞和角膜细胞以及提供眼睛脉管系统的细胞。
这些RPE细胞可以用于治疗视网膜变性疾病，这些视网膜变性疾病因视网膜脱离、视网膜发育异常、血管样纹症、近视性黄斑变性或视网膜萎缩所致，或与导致感光细胞损伤和失明的许多视力改变的微症(如，无脉络膜、糖尿病性视网膜病、黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、以及斯图加特氏疾病(眼底黄色斑点病))相关联。
这些RPE细胞可以是未去分化成一种非RPE细胞类型的稳定的最终分化的RPE细胞。在此描述的这些RPE细胞可以是功能性RPE细胞，特征在于能够在角膜、视网膜下或其他方式投与到一个人或一个非人动物后整合到视网膜中。
这些RPE细胞可以表达RPE细胞标记物。例如，标记物如RPE65、PAX2、PAX6、酪氨酸酶、卵黄状黄斑病蛋白、PEDF、CRALBP、Otx2以及MITF的表达水平可以等同于天然发生的RPE细胞中的表达水平。这些RPE细胞的成熟度水平可以通过测量PAX2、PAX6以及酪氨酸酶中的至少一个的表达或它们的相对应的表达水平来评定。
相比之下，这些RPE细胞可能不表达ES细胞标记物。例如，ES细胞基因Oct-4、NANOG和/或Rex-1的表达水平在RPE细胞中可能比在ES细胞中低约100至1000倍。例如，这些RPE细胞可能实质上缺乏ES细胞标记物的表达，这些细胞标记物包括但不限于八聚体结合蛋白4(Oct-4，也称作Pou5f1)，阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4，肿瘤排斥抗原(TRA)-1-60，TRA-1-80，碱性磷酸酶，NANOG，Rex-1，Sox2，TDGF-1，DPPA2，DPPA3(STELLA)，DPPA4和/或DPPA5。因此，与ES细胞相比较，RPE细胞优选地实质上缺乏Oct-4、NANOG和/或Rex-1的表达。
与未培养的RPE细胞或其他RPE细胞制剂相比较，在此描述的RPE细胞还可以示出α整合蛋白亚单位1至6或9的提高的表达水平。在此描述的RPE细胞还可以示出α整合蛋白亚单位1、2、3、4、5或9的提高的表达水平。在此描述的RPE细胞可以在促进α整合蛋白亚单位1至6的表达的条件下进行培养。例如，这些RPE细胞可以用包括但不限于锰的整合蛋白激活剂和激活单克隆抗体(mAb)TS2/16来培养。参见阿夫沙尔(Afshari)等人，大脑(Brain)(2010)133(2):448–464。这些RPE细胞可以铺在层粘连蛋白(1μg/mL)上并且在Mn2+(500μM)下暴露至少约8、12、24、36或48小时。而且，这些RPE细胞可以培养可增加α整合蛋白亚单位表达的若干代(例如，至少约4、5、6、7或8代)。
这些RPE细胞可以展现出一个正常的核型，表达RPE标记物，并且不表达hES标记物。
在此描述的RPE细胞还可以基于细胞的色素沉着程度来鉴别和表征。色素变化可以通过培养和维持这些RPE细胞的密度以及维持培养RPE的持续时间来控制。快速分裂的分化的RPE细胞的着色更轻。相比之下，较缓慢分裂或未分裂的RPE采用它们的特征性多边形或六边形形状并且通过累积黑色素和脂褐质来提高色素沉着水平。例如，休眠RPE培养物(例如，归因于汇合)典型地随着时间的推移而提高它们的色素沉着水平。因此，色素沉着的累积用作RPE分化的一个指标并且与细胞密度相关联的增加的色素沉着用作RPE成熟度的一个指标。例如，成熟的RPE细胞可以在一个较低密度下继代培养，这样使得色素沉着减少。在此上下文中，成熟的RPE细胞可以被培养来产生不太成熟的RPE细胞。这类RPE细胞仍然是表达RPE分化的标记物的分化的RPE细胞。
在此描述的RPE细胞可以在一个长时间段内体外维持它们的表型。例如，这些RPE细胞可以将它们的表型维持至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20代。这些RPE细胞可以将它们的表型维持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。这些RPE细胞可以将它们的表型维持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。
此外，在此描述的RPE细胞在移植后可以维持它们的表型。这些RPE细胞在移植后可以将它们的表型维持持续接受者的寿命。例如，这些RPE细胞在移植后可以将它们的表型维持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。另外，这些RPE细胞在移植后可以将它们的表型维持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。这些RPE细胞在移植后可以将它们的表型维持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些RPE细胞在移植后可以将它们的表型维持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年或更多年。
RPE细胞群体的黑色素含量
本披露的示例性实施例提供一种具有低或中等平均色素沉着水平的RPE细胞群体、以及一种包含具有低或中等平均色素沉着水平的RPE细胞的药物制剂。如在以下实例中进一步描述，申请人已示出具有相对较低色素沉着水平的RPE细胞在测量细胞的附着和存活能力的测定中表现得更好。无意受限于理论，相信随着RPE细胞变得更成熟，它们在冷冻保存之后可能变得更无法形成细胞附着、存活和增殖，这可能归因于更成熟的RPE细胞中含有的色素沉着(黑色素)水平增大、和/或一般倾向于与增加的色素沉着相关的成熟RPE的其他表型(其他表型可以包括例如细胞骨架、膜组成、细胞表面受体表达、附着强度、核架构、基因表达或其他表型或表型组合的变化)。而且无意受限于理论，相信随着RPE细胞变得更成熟，当甚至是在未冷冻保存的情况下传代和/或维持时它们可能变得更无法形成细胞附着、存活和繁殖；再次，这可能归因于更成熟的RPE细胞中含有的色素沉着(黑色素)水平增大、和/或一般倾向于与增加的色素沉着相关的成熟RPE的其他表型。
色素沉着水平可以测量为一个群体的每个细胞的平均黑色素，例如表示为皮克/细胞(pg/细胞)，如应理解一个群体中的细胞的黑色素水平一般可能存在一些变化。例如，平均黑色素含量可以小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞或小于5pg/细胞，例如，介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与8pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于1与6pg/细胞之间、介于1与5pg/细胞之间、介于1与4pg/细胞之间、介于1与3pg/细胞之间、介于1与2pg/细胞之间、介于2与6pg/细胞之间、介于3与5pg/细胞之间或介于4与5pg/细胞之间，如介于4.2与4.8pg/细胞之间，或介于0.1与5pg/细胞之间。在另一个实例中，平均黑色素含量可以小于5pg/细胞，例如，介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.2与5pg/细胞之间、介于0.5与5pg/细胞之间、介于1与5pg/细胞之间、介于2与5pg/细胞之间、介于3与5pg/细胞之间、介于4与5pg/细胞之间或介于4.5与5pg/细胞之间。
黑色素含量可以使用多种方法(包括利用细胞提取物的方法、基于FACS的方法以及其他方法)来测量。参见，例如布瓦西(Boissy)等人，细胞检测学杂志(Cytometry.)1989年11月；10(6):779-87；斯沃普(Swope)等人，皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol.)1997年9月；109(3):289-95；瓦特(Watts)等人，癌症研究杂志(Cancer Res.)1981；41:467-472；罗森塔尔(Rosenthal)等人，分析生物学杂志(Anal Biochem.)1973年11月；56(1):91-9，各文献通过引用以其全部内容结合在此。例如，为了确定平均黑色素含量，可以确定代表性样品中的细胞数量，可以溶解代表性样品中的细胞，并且确定(例如，通过分光光度计)细胞溶解产物(例如，来自NaOH提取的细胞沉淀物)的总黑色素含量并且将该总黑色素含量除以代表性样品中的细胞数量来产生每个细胞的平均黑色素含量。任选地，代表性样品中的细胞数量可以通过忽略培养物中除RPE之外的细胞来确定(例如，将对RPE的一种或多种标记物呈阳性的和/或展现出特征性RPE细胞形态的细胞计数)，从而得到代表性样品中的每个RPE细胞的平均黑色素含量。
该平均黑色素含量可以针对排除了5％着色最多和5％着色最少的收获的RPE细胞的细胞群体来确定。
可以容易地获得具有所希望的平均黑色素含量的RPE群体。例如，非分裂代谢活性的RPE(例如，在汇合培养物中)的黑色素含量因合成黑色素的累积而倾向于随着时间的推移而增加，而累积的黑色素被细胞分裂稀释以使得黑色素含量在分裂细胞中相对较低。参见例如，唐恩(Dunn)等人，实验眼科研究杂志(Exp Eye Res.)1996年2月；62(2):155-69。因此，具有所希望的平均黑色素含量的RPE群体可以通过选择合适的生长历史来获得，例如作为休眠群体维持产生所希望的平均黑色素含量的持续时间，例如作为休眠培养物持续1、2、3、4、5或6天，或持续1、2、3、4、5、6、7、8周或更多周。也可以用于控制平均黑色素含量的另外的生长历史包括作为休眠群体维持一段时间，之后允许这些细胞再次分裂一段指定时间或分裂次数(从而降低休眠群体中获得的平均黑色素含量)。黑色素含量还可以通过使用不同的培养基和/或培养基补充物来控制，例如，已报告培养的RPE中的黑色素累积在蛋白激酶抑制剂(例如，H-7、W-7、H-8、以及星形孢菌素)存在下会减少(岸(Kishi)等人，国际细胞生物学杂志(Cell Biol Int.)2000；24(2):79-83)，并且在全反式视黄酸(10(-5)至10(-7)M)或TGF-β1(1至100U/ml)存在下会增加(岸等人，当代眼科研究杂志(Curr Eye Res.)1998年5月；17(5):483-6)。黑色素含量还可以通过用锌α-2-糖蛋白(ZAG)(参见美国专利7,803,750)和/或以下各项处理细胞而增加：腺苷-1受体拮抗剂、腺苷-2受体激动剂、腺苷-1受体激动剂、腺苷-2受体拮抗剂以及腺苷-1受体拮抗剂与腺苷-2受体激动剂的组合或其组合(参见美国专利5,998,423)。以上文献中的每一个均通过引用以其全部内容结合在此。
替代上述方法或除了上述方法之外，具有所希望的平均黑色素含量的RPE细胞还可以通过细胞分拣例如使用流式细胞术来获得。例如，含有黑色素的细胞通过它们的光散射特征(包括提高的侧向散射和减少的前向散射)是可检测的；这些特征可以用于根据色素沉着水平来对一个群体进行分拣，从而纯化具有所希望的平均黑色素含量的一个群体。布瓦西等人，细胞检测学杂志，1989年11月；10(6):779-87；斯沃普等人，皮肤病学研究杂志1997年9月；109(3):289-95，每个文献均通过引用以其全部内容结合在此。
对人胚胎干细胞中的MHC基因工程化来获得复杂性降低的RPE细胞
人胚胎干(hES)细胞(例如，如在此所描述可以从它们衍化RPE)可以来源于人胚胎干细胞库。人胚胎干细胞库可以包括干细胞，每个干细胞对于人群体中存在的至少一个MHC等位基因来说是半合的、纯合的或零合的，其中所述干细胞库的每个成员相对于该库的其余成员对于不同组的MHC等位基因来说是半合的、纯合的或零合的。人胚胎干细胞库可以包括对于人群体中存在的所有MHC等位基因来说是半合的、纯合的或零合的干细胞。在本披露的上下文中，对于一个或多个组织相容性抗原基因来说是纯合的干细胞包括对于一个或多个(并且在一些实施例中是所有)这类基因来说零合的细胞。对遗传基因座来说零合意指在那个基因座上基因是空位的(即，那个基因的等位基因均缺失或失活)。
hES细胞可以包括对细胞的MHC复合体中的姐妹染色体的等位基因中的一个的修饰。用于产生基因修饰如基因靶向的多种方法可以用于修饰MHC复合体中的基因。另外，细胞中MHC复合体的修饰的等位基因随后可以被工程化为纯合的以使得相同的等位基因存在于姐妹染色体上。如杂合子丢失(LOH)的方法可以用于对细胞工程化以便在MHC复合体中具有纯合等位基因。例如，可以靶向来自一个亲本等位基因的一组MHC基因中的一个或多个基因来产生半合细胞。其他组MHC基因可以通过基因靶向或LOH来去除以便形成一个空位系。这个空位系可以进一步用作胚胎细胞系，HLA基因阵列或单独基因落在该胚胎细胞系中，以便制作具有另外一致的遗传背景的半合库或纯合库。对所有MHC基因来说零合的干细胞可以通过本领域中已知的标准方法例如像基因靶向和/或杂合子丢失(LOH)来产生。参见例如，美国专利申请公开案2004/0091936、2003/0217374和2003/0232430，以及美国临时专利申请号60/729,173。
因此，本披露涉及获得具有降低的MHC复杂性的RPE细胞(包括RPE细胞库)的方法。具有降低的MHC复杂性的RPE细胞可以用于增加可用于治疗应用的细胞的供应，因为它可以消除与患者匹配相关联的难题。这类细胞可以从被工程化为对MHC复合体的基因来说半合或纯合的干细胞衍化。
本披露还提供一种RPE细胞(和/或RPE谱系细胞)的库，其中若干ES细胞系被选择并且被分化成RPE细胞。这些RPE细胞和/或RPE谱系细胞可以用于需要基于细胞的治疗的患者。本披露还提供一种RPE细胞库，每个RPE细胞对于人群体中存在的至少一个MHC等位基因来说是半合的、纯合的或零合的，其中所述RPE细胞库的每个成员相对于该库的其余成员对于不同组的MHC等位基因来说是半合的、纯合的或零合的。本披露提供一种人RPE细胞库，这些细胞对于人群体中存在的所有MHC等位基因来说是半合的、纯合的或零合的。
培养基
在此描述的方法中可以使用能够支持细胞培养物的任何培养基，如用于病毒、细菌或真核细胞培养物的培养基。例如，该培养基可以是EB-DM或RPE-GM/MM。作为另一个实例，该培养基可以是高营养无蛋白培养基或高营养低蛋白培养基。另外，该培养基还可以包含营养组分如白蛋白、B-27补充物、乙醇胺、胎球蛋白、谷氨酰胺、胰岛素、蛋白胨、纯化的脂蛋白材料、亚硒酸钠、转铁蛋白、维生素A、维生素C或维生素E。例如，富营养低蛋白培养基可以是支持培养的细胞生长并且具有低蛋白含量的任何培养基。例如，富营养低蛋白培养基包括但不限于MDBK-GM、OptiPro SFM、VP-SFM、DMEM、RPMI培养基1640、IDMEM、MEM、F-12营养混合物、F-10营养混合物、EGM-2、DMEM/F-12培养基、培养基1999或MDBK-MM。还参见表1。另外，富营养低蛋白培养基可以是不支持胚胎干细胞的生长或维持的培养基。
在使用低蛋白培养基时，该培养基可以含有至少约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.20％、0.10％、0.05％、0.02％、0.016％、0.015％或0.010％的含有动物来源蛋白的组分(例如，10％FBS)。应注意，对低蛋白培养基中存在的蛋白质的百分比的提及是指培养基单独并且不考虑例如B-27补充物中存在的蛋白。因此，应理解当在低蛋白培养基和B-27补充物中培养细胞时，该培养基中存在的蛋白的百分比可能更高。
低蛋白或无蛋白培养基补充有无血清B-27补充物。B27补充物的营养组分可以包括生物素、L-肉碱、皮质酮、乙醇胺、D+-半乳糖、还原型谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、乙酸视黄酯、硒、三碘-1-甲腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、乙酸DL-α-生育酚、牛血清白蛋白、过氧化氢酶、胰岛素、超氧化物歧化酶、以及转铁蛋白。当在补充有B-27的无蛋白培养基中培养细胞时，无蛋白是指在添加B-27之前的培养基。
在此描述的生长因子、试剂以及其他补充物可以单独使用或与培养中包括的其他因子、试剂或补充物组合使用。可以立即或在细胞培养期间或之后的任何时间将因子、试剂以及补充物添加到该培养基中。
该培养基还可以含有补充物如肝素、氢化可的松、抗坏血酸、血清(例如，胎牛血清)或生长基质(例如，来自牛角膜上皮的胞外基质、Matrigel(TM)(基础膜基质)，或明胶)、纤连蛋白、纤连蛋白的蛋白水解片段、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、聚集蛋白聚糖、以及共结合蛋白聚糖。
可以给培养基补充一种或多种因子或试剂。
可以使用的生长因子包括例如EGF、FGF、VEGF、以及重组胰岛素样生长因子。本披露中可以使用的生长因子还包括6Ckine(重组型)、激活素A、α-干扰素、α-干扰素、双调蛋白、血管生成素、β内皮细胞生长因子、β动物纤维素、β干扰素、脑源性神经营养性因子、心肌营养素-1、捷状神经营养性因子、细胞激素诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1、内皮细胞生长补充物、嗜酸性粒细胞激活趋化因子、上皮生长因子、上皮嗜中性粒细胞激活肽-78、促红细胞生成素、雌激素受体-α、雌激素受体-β、成纤维细胞生长因子(酸性/碱性，肝素稳定化、重组型)、FLT-3/FLK-2配体(FLT-3配体)、γ-干扰素、胶质细胞系来源神经营养性因子、Gly-His-Lys、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、GRO-α/MGSA、GRO-B、GRO-γ、HCC-1、肝素结合上皮生长因子样生长因子、肝细胞生长因子、调蛋白-α(EGF结构域)、胰岛素生长因子结合蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白-1/IGF-1复合体、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子II、2.5S神经生长因子(NGF)、7S-NGF、巨噬细胞炎性蛋白-1β、巨噬细胞炎性蛋白-2、巨噬细胞炎性蛋白-3α、巨噬细胞炎性蛋白-3β、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、NGF-β(人或大鼠重组型)、制瘤素M(人或小鼠重组型)、垂体提取物、胎盘生长因子、血小板衍化内皮细胞生长因子、血小板衍化生长因子、多效营养因子、rantes、干细胞因子、基质细胞衍化因子1B/前B细胞生长刺激因子、血小板生成素、转化生长因子α、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、转化生长因子-β3、转化生长因子-β5、肿瘤坏死因子(α和β)、以及血管内皮生长因子。
根据本披露可以使用的试剂包括细胞因子如干扰素-α、干扰素-αA/D、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-γ可诱导的蛋白-10、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-15、白细胞介素-17、角化细胞生长因子、来普汀、白血病抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子、以及巨噬细胞炎性蛋白-1α。
培养基可以补充有激素和激素拮抗剂，包括但不限于17B-雌二醇、促肾上腺皮质激素、肾上腺髓质素、α-促黑素细胞激素、绒毛膜促性腺激素、皮质类固醇结合球蛋白、皮质固酮、地塞米松、雌三醇、促卵泡激素、促胃液素1、胰高血糖素、促性腺激素、氢化可的松、胰岛素、胰岛素样生长因子结合蛋白、L-3,3’,5’-三碘甲腺原氨酸、L-3,3’,5’-三碘甲腺原氨酸、来普汀、促黄体激素、L-甲状腺素、褪黑素、MZ-4、催产素、甲状旁腺激素、PEC-60、垂体生长激素、孕酮、促乳素、分泌素、性激素结合球蛋白、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放因子、甲状腺素结合球蛋白、以及血管加压素。培养基可以补充有不同因子的抗体，包括但不限于抗低密度脂蛋白受体抗体、抗孕酮受体、内部抗体、抗α干扰素受体链2抗体、抗-c-c趋化因子受体1抗体、抗-CD 118抗体、抗-CD 119抗体、抗集落刺激因子-1抗体、抗-CSF-1受体/c-fins抗体、抗上皮生长因子(AB-3)抗体、抗上皮生长因子受体抗体、抗上皮生长因子受体、磷酸特异性抗体、抗上皮生长因子(AB-1)抗体、抗红血球生成素受体抗体、抗雌激素受体抗体、抗雌激素受体、C-末端抗体、抗雌激素受体-B抗体、抗成纤维细胞生长因子受体抗体、抗成纤维细胞生长因子、碱性抗体、抗γ-干扰素受体链抗体、抗γ-干扰素人重组抗体、抗GFR-α-1C-末端抗体、抗-GFR α-2C末端抗体、抗粒细胞集落刺激因子(AB-1)抗体、抗粒细胞集落刺激因子受体抗体、抗胰岛素受体抗体、抗胰岛素样生长因子-1受体抗体、抗介白素-6人重组抗体、抗介白素-1人重组抗体、抗介白素-2人重组抗体、抗来普汀小鼠重组抗体、抗神经生长因子受体抗体、抗-p60、鸡抗体、抗甲状旁腺激素样蛋白抗体、抗血小板衍化生长因子受体抗体、抗血小板衍化生长因子受体-B抗体、抗血小板衍化生长因子-α抗体、抗孕酮受体抗体、抗视黄酸受体-α抗体、抗甲状腺激素核受体抗体、抗甲状腺激素核受体-α1/Bi抗体、抗转铁蛋白受体/CD71抗体、抗转化生长因子-α抗体、抗转化生长因子-B3抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体、以及抗血管内皮生长因子抗体。
表1中列出了潜在适用于在此描述的方法中的示例性生长培养基。
表1.生长培养基配制品
Figure BDA0003183443810000741
Figure BDA0003183443810000751
治疗方法
这些RPE细胞和包含通过在此描述的方法产生的RPE细胞的药物制剂可以用于基于细胞的处理。本披露提供用于治疗涉及视网膜变性的病状的方法，这些方法包括投与有效量的包含RPE细胞的药物制剂，其中这些RPE细胞从多能干细胞体外衍化。涉及视网膜变性的病状包括例如无脉络膜、糖尿病性视网膜病、视网膜萎缩、视网膜脱离、视网膜发育异常、色素性视网膜炎、血管样纹症(又称为纳普氏样纹(Knapp streaks)或纳普氏惹纹(Knapp striae)，特征在于布鲁赫氏膜中的可以变得钙化和破裂的小裂缝)、以及近视性黄斑变性(又称为变性近视)。在此描述的RPE细胞还可以用于治疗黄斑变性的方法中，黄斑变性包括但不限于年龄相关性黄斑变性(干性或湿性)、北卡罗莱纳黄斑萎缩、索斯比眼底萎缩、斯图加特氏疾病、图形样萎缩、贝斯特疾病、malattia leventinese、多因蜂窝状脉络膜炎、显性玻璃疣、以及辐射状玻璃疣。在此描述的RPE细胞还可以用于治疗帕金森疾病(PD)的方法中。
在先公开中描述的细胞移植的普遍特征是低移植物存活，例如，在许多细胞移植研究中，紧接着在移植之后(例如，在第一周内)往往存在细胞损失。这种细胞损失表现出不应归因于移植细胞的排斥反应，而应归因于一定百分比的细胞无法被保持在移植部位上。这种细胞保持的缺乏最可能归因于大量因素如这些细胞无法附着到一个下伏结构上、缺乏充足的营养、或移植部位处存在物理应力。在这最初的细胞数量下降之后，在移植后不同时间的细胞存活可能随着研究的不同而显著地变化。因此，尽管一些研究示出了数量的稳定下降，但其他研究示出了移植细胞可以达到稳定数量的结果。然而，考虑移植成功的一个重要因素是细胞移植之后具有存活移植物的接受者的百分比。
与先前的制剂相比较，在此描述的药物制剂中的这些RPE细胞在移植后可以长期存活。例如，这些RPE细胞可以存活至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。此外，这些RPE细胞可以存活至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周；至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个月；或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。另外，这些RPE细胞在移植的接受者的整个寿命期间都可以存活。此外，在此描述的RPE细胞的接受者的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或100％可以显示出移植的RPE细胞的存活。另外，在此描述的RPE细胞可以成功地整合到移植接受者的RPE层中，从而形成一个半连续的细胞系并且保持重要RPE分子标记物(例如，RPE65和卵黄状黄斑病蛋白)的表达。在此描述的RPE细胞还可以附着到布鲁赫氏膜上，从而在移植接受者中形成一个稳定RPE层。而且，在此描述的RPE细胞基本上不含ES细胞并且移植接受者在移植部位处并未显示出异常生长或肿瘤形成。
治疗患有与视网膜变性相关联的病状的患者的方法可以包括局部地投与本披露的组合物(例如，通过眼内注射或插入包含本披露的药物制剂的基质)。本披露的药物制剂的眼内投与包括例如递送到眼睛的玻璃体、角膜背部、结膜下部分、视网膜下部分、黄斑下部分(例如，通过跨窝黄斑下注射)、近巩膜部分、后巩膜部分、以及筋膜囊下部分中。参见，例如，美国专利号7,794,704；7,795,025；6,943,145；以及6,943,153。
本披露还提供一种将从复杂性降低的胚胎干细胞衍化的人RPE细胞投与患者的方法。这种方法可以包括：(a)鉴别需要涉及将人RPE细胞投与他或她的治疗的患者；(b)鉴别患者细胞表面上表达的MHC蛋白；(c)提供具有降低的MHC复杂性的，通过用于产生本披露的RPE细胞的方法制作的人RPE细胞的库；(d)从与他的或她的细胞上的这种患者的MHC蛋白匹配的库中选择RPE细胞；(e)将来自步骤(d)的任何细胞投与所述患者。这种方法可以在一个地区中心例如像一个医院、一个诊所、一个医师办公室、以及其他卫生保健设施中进行。另外，选择作为患者的匹配的RPE细胞如果以小细胞数量储存，则可以在患者治疗之前扩增。
与未培养的RPE细胞或其他RPE细胞制剂相比较，这些RPE细胞在移植之前可以在提高α整合蛋白亚单位1至6或9的表达的条件下进行培养。在此描述的RPE细胞可以被培养来提高α整合蛋白亚单位1、2、3、4、5、6或9的表达水平。在此描述的RPE细胞可以在促进α整合蛋白亚单位1至6的表达的条件下进行培养。例如，这些RPE细胞可以用包括但不限于锰的整合蛋白激活剂和激活单克隆抗体(mAb)TS2/16来培养。参见阿夫沙尔等人，大脑，(2010)133(2):448–464。
具体治疗方案、投与途径以及辅助治疗可以基于具体病状、病状的严重程度以及患者的总体健康来定制。包含RPE细胞的药物制剂的投与可以有效减少症状的严重程度和/或预防患者的病状的进一步变性。例如，包含RPE细胞的药物制剂的投与可以改善患者的视敏度。另外，在某些实施例中，RPE细胞的投与可以有效用于完全恢复任何视力丧失或其他症状。另外，RPE细胞投与可以治疗内生性RPE层的损伤症状。
RPE细胞的药物制剂
这些RPE细胞可以用药学上可接受的载体来配制。例如，RPE细胞可以单独投与或作为药物制剂的一种组分投与。主题化合物可以配制供任何方便在医学中使用的方式投与。适于投与的药物制剂可以包含与以下各物组合的RPE细胞：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液(BSS))、分散液、悬浮液或乳液，或恰好在使用之前可以重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质或悬浮或增稠剂。示例性药物制剂包含与以下各物组合的RPE细胞：
Figure BDA0003183443810000781
BSS
Figure BDA0003183443810000782
(一种平衡盐溶液，在每mL在水中含有氯化钠7.14mg、氯化钾0.38mg、氯化钙二水合物0.154mg、氯化镁六水合物0.2mg、磷酸氢二钠0.42mg、碳酸氢钠2.1mg、葡萄糖0.92mg、谷胱甘肽二硫化物(氧化谷胱甘肽)0.184mg、盐酸和/或氢氧化钠(将pH调节至约7.4))。
本披露的示例性组合物可以是适用于治疗人患者的配制品如无热原或基本上无热原，且无病原体。在投与时，本披露中使用的药物制剂可以处于无热原、无病原体、生理学上可接受的形式。包含在此描述的方法中使用的RPE细胞的制剂能够以悬浮液、凝胶、胶体、浆料或混合物移植。另外，该制剂可以希望地以粘性形式封装或注射到玻璃体液中以用于递送到视网膜或脉络膜损伤的部位。而且，在注射时，冷冻保存的RPE细胞可以用可商购的平衡盐溶液来重新悬浮以实现所希望的渗透压和浓度以用于通过视网膜下注射来投与。可以将该制剂投与中心黄斑周围未完全被疾病席卷的区域，这可以促进所投与细胞的附着和/或存活。
本披露的组合物可以包括rho相关蛋白激酶(ROCK)的抑制剂如斯泰姆特的Stemolecule Y-27632。例如，示例性组合物可以包含RPE和一种ROCK抑制剂，该ROCK抑制剂可以按在投与患者之后足以促进RPE存活和/或移入的量存在。
本披露的RPE细胞可以按药学上可接受的眼用配制品通过眼内注射来递送。在通过玻璃体内注射来投与配制品时，例如，可以将溶液浓缩以使得能够递送最小体积。取决于在此描述的因素，注射浓度可以处于有效且无毒的任何数量。用于治疗患者的RPE细胞的药物制剂可以按至少约104细胞/mL的剂量配制。用于处理患者的RPE细胞制剂按至少约103、104、105、106、107、108、109或1010个RPE细胞/mL的剂量配制。例如，这些RPE细胞可以配制在药学上可接受的载体或赋形剂中。
在此描述的RPE细胞的药物制剂可以包含至少约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000或9,000个RPE细胞。RPE细胞的药物制剂可以包含至少约1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010个RPE细胞。RPE细胞的药物制剂可以包含至少约1×102至1×103、1×102至1×104、1×104至1×105或1×103至1×106个RPE细胞。RPE细胞的药物制剂可以包含至少约10,000、20,000、25,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000或200,000个RPE细胞。例如，RPE细胞的药物制剂在至少约50至200μL的体积中可以包含至少约20,000至200,000个RPE细胞。另外，RPE细胞的药物制剂可以包括：150μL体积中约50,000个RPE细胞，150μL体积中约200,000个RPE细胞或至少约150μL体积中至少约180,000个RPE细胞。
在上述药物制剂和组合物中，RPE细胞的数量或RPE细胞的浓度可以通过计数活细胞和排除非活细胞来确定。例如，非活RPE可以通过排除活体染料(例如台盼蓝)失败，或使用一个功能性测定(如附着到培养基底的能力、吞噬作用等等)来检测。此外，RPE细胞的数量或RPE细胞的浓度可以通过计数表达一种或多种RPE细胞标记物的细胞和/或排除表达指示除RPE之外的一个细胞类型的一种或多种标记物的细胞来确定。
这些RPE细胞可以配制在药学上可接受的眼用媒介物中用于递送，这样使得该制剂保持与眼表接触，持续足够的时间段以允许这些细胞渗入到眼睛的受影响区域，例如像前房、后房、玻璃体、水状体、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体、晶状体、脉络膜、视网膜、巩膜、脉络膜周隙、结膜、结膜下隙、巩膜上隙、角膜内隙、角膜上隙、平坦部、手术诱导的无血管区或黄斑。
RPE细胞可以含在细胞片层之中。例如，包含RPE细胞的细胞片层可以通过在可以释放完整细胞片层的基底上培养RPE细胞来制备，该基底例如热响应性聚合物如热响应性聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)接枝的表面，细胞附着到基底上并且在培养温度下增殖，并且然后在温度移动之后，表面特征被改变，从而导致释放培养的细胞片层(例如，通过冷却到低临界溶解温度(LCST)以下)(参见，达席尔瓦(da Silva)等人，生物技术趋势杂志(Trends Biotechnol.)2007年12月；25(12):577-83；Hsiue等人，移植杂志(Transplantation.)2006年2月15；81(3):473-6；Ide,T.等人(2006)，生物材料杂志(Biomaterials)27,607–614；Sumide,T.等人(2005)，美国实验生物学联合会会刊20,392–394；Nishida,K.等人(2004)，移植杂志77,379–385；以及Nishida,K.等人(2004)，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)351,1187–1196，每个文献都通过引用以其全部内容结合在此)。细胞片层可以附着到适于移植的基底(如在片层移植到一个宿主生物体内时可以体内溶解的一个基底)上，这些细胞片层例如通过在适于移植的一个基底上培养细胞或将来自另一基底(如一种热响应性聚合物)的细胞释放在适于移植的一个基底上来制备。潜在地适于移植的一个示例性基底可以包含明胶(参见Hsiue等人)。可能适于移植的替代基底包括基于纤维蛋白的基质以及其他基质。这些细胞片层可以用于制造用于预防或治疗视网膜变性疾病的一种药剂。RPE细胞片层可以配制用于引入到有需要的受试者的眼睛中。例如，这些细胞片层可以通过窝下膜切除术与RPE细胞片层移植来引入到有需要的眼睛中，或可以用于制造用于窝下膜切除术之后移植的一种药剂。
根据在此描述的方法投与的制剂的体积可以取决于多种因素如投与模式、RPE细胞数量、患者的年龄和体重、以及所治疗的疾病的类型和严重程度。如果注射投与，那么本披露的RPE细胞的药物制剂的体积可以是从至少约1、1.5、2、2.5、3、4或5mL。该体积可以是至少约1至2mL。例如，如果注射投与，那么本披露的RPE细胞的药物制剂的体积可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、100、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200μL(微升)。例如，本披露的制剂的体积可以是从至少约10至50、20至50、25至50或1至200μL。本披露的制剂的体积可以是至少约10、20、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μL或更高。
例如，该制剂每μL可以包含至少约1×103、2×103、3×103、4×103,5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104或9×104个RPE细胞。该制剂可以包含2000RPE细胞/μL，例如，100,000RPE细胞/50μL或180,000RPE细胞/90μL。
治疗视网膜变性的方法可以进一步包括免疫抑制剂的投与。可以使用的免疫抑制剂包括但不限于抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、
Figure BDA0003183443810000821
(抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、
Figure BDA0003183443810000822
(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、
Figure BDA0003183443810000823
(抗-CD20抗体)、西罗莫司、以及他克莫司。这些免疫抑制剂的剂量可以是至少约1、2、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。在使用免疫抑制剂时，它们可以是全身或局部地投与，并且它们可以在投与RPE细胞之前、同时或之后投与。免疫压制治疗可以在投与RPE细胞之后持续数周、数月、数年或无限期。例如，在投与RPE细胞之后，可以将5mg/kg环孢菌素投与患者，持续6周。
治疗视网膜变性的方法可以包括单剂量RPE细胞的投与。而且，在此描述的治疗方法可以包括在某一时期内多次投与RPE细胞的一个治疗过程。示例性治疗过程可以包括每周、每两周、每月、每季度、每半年或每年治疗。可替代地，治疗可按多期进行，借此最初投与多个剂量(例如，第一周是日剂量)，并且随后需要更少和更不频繁的剂量。
如果眼内注射投与，那么在患者的整个生命过程中，这些RPE细胞可以周期性地递送一次或多次。例如，这些RPE细胞可以每年递送一次，每6至12个月递送一次，每3至6个月递送一次，每1至3个月递送一次或每1至4周递送一次。可替代地，对于某些病状或病症来说，更频繁的投与可能是希望的。如果通过植入物或装置投与，那么在患者的整个生命过程中，根据所治疗的具体患者和病症或病状的需要，这些RPE细胞可以被投与一次，或周期性地投与一次或多次。类似地涵盖随着时间变化的治疗方案。例如，在开始时可能需要更频繁的治疗(例如，每日或每周治疗)。随着时间的推移，由于患者的病状得到改善，所以可能需要更不频繁的治疗或甚至不需要进一步的治疗。
在此描述的方法可以进一步包括通过测量受试者的视网膜电图应答、视动视敏度阈值或亮度阈值来监测治疗或预防的功效的步骤。该方法还可包括通过监测眼睛内细胞的免疫原性或细胞迁移来监测治疗或预防的功效。
这些RPE细胞可以用于制造治疗视网膜变性的药剂。本披露还涵盖包含RPE细胞的制剂在失明治疗中的用途。例如，包含人RPE细胞的制剂可以用于治疗与导致感光细胞损伤和失明的许多改变视力的微症相关联的视网膜变性，这些微症如糖尿病性视网膜病、黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性，例如，湿性年龄相关性黄斑变性和干性年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、以及斯图加特氏疾病(眼底黄色斑点病))。该制剂可以包含至少约5,000至500,000个RPE细胞(例如，100,00个RPE细胞)，这些RPE细胞可以被投与视网膜以治疗与导致感光细胞损伤和失明的许多改变视力的微症相关联的视网膜变性，这些微症如糖尿病性视网膜病、黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、以及斯图加特氏疾病(眼底黄色斑点病))。
在此提供的RPE细胞可以是人RPE细胞。然而，应注意，人细胞可以用于人患者以及动物模型或动物患者中。例如，这些人细胞可以在具有视网膜变性的小鼠、大鼠、猫、狗或非人灵长类动物模型中进行测试。此外，如在兽医学中，这些人细胞可以在治疗上用于治疗有需要的动物。
投与模式
根据投与途径，药物制剂可以被配制在一种药学上可接受的载体中。例如，该制剂可以被配制来投与到眼睛的视网膜下腔中。包含RPE细胞的制剂可以被投与同一患者的一只眼睛或两只眼睛之中。对两只眼睛的投与可以是顺序的或同时的。例如，包含RPE细胞的制剂可以被配制成悬浮液、溶液、浆料、凝胶或胶体。
本披露的RPE细胞可以通过注射(例如，玻璃体内注射)局部地投与或作为装置或植入物(例如，植入物)的一部分投与。如上所述，这些RPE细胞可以具有不同的可能的安排如单个细胞、块、簇、片层、或其任何组合，它们可以包含于水性载体、凝胶、基质、聚合物等中。例如，该制剂可以通过注射到眼睛的视网膜下腔中来投与。而且，该制剂可以跨角膜投与。例如，本披露的细胞可以通过使用玻璃体切除手术来移植到视网膜下腔中。此外，在注射时，RPE细胞可以用可商购的平衡盐溶液(例如，Alcon BSS
Figure BDA0003183443810000851
)来重新悬浮以实现所希望的渗透压和浓度以用于通过视网膜下注射来投与。
任选地，这些RPE细胞可以通过包括平坦部玻璃体切除手术如3-口平坦部玻璃体切除术的方法来投与。该方法可以包括小型视网膜切除术。在细胞投与之前，视网膜下水泡可以例如通过注射生理食盐水或另一种合适的流体来形成(“预水泡”)，该水泡然后可以在细胞投与之前去除。然而，这些细胞还可以在没有预水泡形成的情况下投与。可以将这些细胞投与到颞窝下位置中的水泡中。例如，该水泡可以任选地在弓形血管内延伸。该水泡可以被定位成使得它不会脱中央离黄斑窝。
取决于投与方法，可以将这些RPE细胞添加到缓冲和电解质平衡的水溶液、具有润滑性聚合物的缓冲溶液和电解质平衡的水溶液、基于矿物油或矿脂的软膏、其他油、脂质体、环糊精或持续释放的聚合物或凝胶。
与RPE细胞一起使用的基质
在此描述的方法可以包括作为植入物或装置将本披露的RPE细胞投与的步骤。在某些实施例中，该装置是用于治疗眼睛的医学病状的生物可蚀的植入物，该植入物包含分散在可生物降解的聚合物基质中的激活剂，其中该激活剂的至少约75％的颗粒具有小于约10μm的直径。该生物可蚀的植入物可以被设定大小用于植入到一个眼部区域中。该眼部区域可以是以下各项中的一个或多个：前房、后房、玻璃体腔、脉络膜、脉络膜周隙、结膜、结膜下隙、巩膜上隙、角膜内隙、角膜上隙、巩膜、平坦部、手术诱导的无血管区、黄斑、以及视网膜。该可生物降解的聚合物可以是例如聚(乳酸-共-乙醇)酸(PLGA)共聚物、可生物降解的聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)薄膜或PLLA/PLGA聚合物基底。聚合物中乳酸与乙醇酸单体之比是约25/75、40/60、50/50、60/40、75/25重量百分比，更优选地是约50/50。该PLGA共聚物按重量计可以是生物可蚀的植入物的约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％至约90％。该PLGA共聚物按重量计可以是生物可蚀的植入物的从约30％至约50％，优选地是按重量计约40％。这些RPE细胞可以与一种生物相容性聚合物结合移植，该生物相容性聚合物如聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、50:50PDLGA、85:15PDLGA、以及INION
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可生物降解膜(生物相容性聚合物的混合物)。参见美国专利号6,331,313、7,462,471、以及7,625,582。还参见Hutala等人，(2007)“可降解生物聚合物在不同眼组织的细胞系培养中的体外生物相容性：直接接触研究(In vitro biocompatibility of degradable biopolymers in cell linecultures from various ocular tissues:Direct contact studies.)”，生物医学材料研 究杂志(Journal of Biomedical Materials Research)83A(2):407–413；陆等人(1998)生物材料科学聚合物版本杂志(J Biomater Sci Polym Ed)9:1187–205；以及富田(Tomita)等人，(2005)干细胞(Stem Cells)23:1579–88。
在另一方面，本披露提供一种包含位于膜上的RPE的组合物，以及一种将该组合物用于预防或治疗视网膜的疾病、病症或病状的方法。例如，该膜可以是如在美国预授权公开号20110236464中描述的一种膜，该公开通过引用以其全部内容结合在此。该膜实质上可能是不可生物降解的和多孔的，孔的直径介于约0.2μm与0.5μm之间。例如，孔径可以是介于0.3μm至0.45μm之间。不可生物降解的膜的使用可以确保它一旦移植到眼睛中就保持支撑细胞，例如在插入体内之后持续至少5年，至少10年，或至少15年。
孔密度可以介于约1×107与3×108孔/cm2之间，如介于5×107与1×108孔/cm2之间。这个密度可以允许希望的渗透水平并且还可以允许血管化。具体地说，这些孔的大小和密度可以允许营养物从膜的一侧移动到另一侧并且还允许例如移植后通过膜的血管化。聚合物主体可以从富脉络膜床接收血管化。这已显示在眼睛外部的富血管床中(卡塞尔(Cassell)等人，2002；帕特里克(Patrick)等人，1999；萨克塞纳(Saxena)等人，1999；皮特(Peter)等人，1998)，但仅可以在孔隙率足够的情况下发生(门格尔(Menger)等人，1990)。
例如，膜导水率可能超过50×10-10m sec-1Pa-1。确切地说，该膜的膜导水率可以是约33mL/min/cm2。这等于＝801.21×10-10m sec-1Pa-1，这是年轻黄斑尸体布鲁赫氏膜的导水率的八倍。这个过剩的导水率潜在地是有用的，因为人造膜可能完全依赖于被动过程。因为在营养物扩散方面能够满足上伏细胞的需求，所以优选地它不会成为流体从RPE层的基础侧传输的障碍，否则RPE可能从聚合物表面脱离。与本期望一致，已假设老年人中布鲁赫氏膜的降低的导水率会引起AMD内的色素上皮脱离(博德(Bird)&马歇尔(Marshall)，1986)。
优选地，在不降解的情况下，该膜可以通过γ辐射、环氧乙烷或高压灭菌或UV灭菌来进行灭菌。
优选地，该膜可以通过超声波密封、射频密封或夹物模压来密封。这允许其他层附接到该膜上，例如，将药物层或涂覆层附接到该膜上。例如，可能希望附接一个更刚性的可生物降解层如PLGA来将刚性提供给该膜以便帮助递送。可替代地，可以附接含有药物或生物试剂的层或支持其他细胞的层。
该膜优选地具有约11μm的最大厚度。更优选地，膜厚度介于9μm与11μm之间。可以选择该膜的厚度以便于允许营养物的扩散，允许血管化并且还允许该膜容易地插入到眼睛中。
因此，RPE可以提供到用于支持细胞生长一个膜上的或在该膜上培养，该膜大体是不可生物降解的和多孔的并且具有约11μm的最大厚度。该膜优选地是大体平坦的并且它的最小尺寸优选地小于约11μm。在所述尺寸内厚度可以变化，但优选地是介于9μm与11μm厚之间。
该膜可以具有约1.5mg/cm2的最大重量。更优选地，该膜的重量是介于1.0mg/cm2与1.4mg/cm2之间。该膜的最小拉伸强度优选地是至少100巴，以便提供足够的强度以允许在手术期间适当地拉伸。最大拉伸强度优选地是300巴，以便再次使该膜在手术期间易于处理。该膜的破裂强度优选地是至少10psi。
优选地，该膜是亲水的。这可以将良好的润湿能力给予该膜并且允许容易地附着细胞和其他希望的涂覆层。
该膜优选地具有生理上可接受的pH，例如4至8的pH。
该膜优选地包含在至少一侧上的涂覆层。该涂覆层优选地是一种蛋白或一种糖蛋白，如层粘连蛋白、Matrigel(TM)、胶原蛋白、纤连蛋白和/或PLGA聚(乳酸-共-乙醇酸)。该涂覆层还可以包含结合至涂覆组分上的药物或生物试剂。例如，该涂覆层可以包括神经营养剂、消炎剂或抗血管生成剂。
具体地说，该涂覆层优选地含有层粘连蛋白，尤其是层粘连蛋白-1或其片段如IgVAV。具体地说，该涂覆层可以含有比其他蛋白或糖蛋白更多的层粘连蛋白-1。优选地，该涂覆层可以包含至少30％或至少40％层粘连蛋白如层粘连蛋白-1。可以涂覆该涂覆层来在该膜上产生约40至45μg/cm2的层粘连蛋白-1浓度。
因此，RPE可以提供到支持细胞生长的一个膜上或在该膜上培养，该膜包含在至少一侧上涂覆有包含层粘连蛋白-1的一个涂覆层的一个基本不可生物降解且多孔的支持层。
该膜可以由一种亲水聚合物制成。而且，可以使用通过使UV光照射到聚合物上而变得亲水的疏水聚合物。示例性聚合物包括聚酯如聚对苯二甲酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯；聚氨酯和聚脲-聚氨酯，特别是含有聚碳酸酯和聚硅氧烷的那些，以及基于聚酯或基于聚醚的那些；聚酰胺如尼龙；聚醚酯如新保适(Sympatex)；聚碳酸酯如模克隆(Makrolon)；聚丙烯酸酯如有机玻璃(Perspex)；聚(四氟乙烯)(PTFE)；聚硅氧烷；聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯；以及在杜邦(DuPont)的商标迭尔林(Delrin)下普遍为人所知的聚甲醛(POM)。特别优选的是该膜由聚对苯二甲酸乙二酯或聚对苯二甲酸丁二酯制成。在另一个优选实施例中，该膜由聚酯制成。
该膜可以用于生长本披露的一个RPE细胞层。该膜可以优选地包括在该膜上的一个细胞层。这些细胞可以是根据膜和细胞的目标用途而选择的任何细胞。
该膜和细胞层的长和宽优选地是至少3mm x 5mm。优选地，该膜和细胞层是至少4mm x 6mm。
例如，在治疗年龄相关性黄斑变性、视网膜裂孔、黄斑萎缩、无脉络膜、莱伯先天性黑朦(Leber Congenital Amarosis)、斯图加特氏疾病、以及视网膜的其他疾病或病状中，该膜和细胞层可以移植到有需要的患者的眼睛中。
筛选测试
本披露提供一种用于筛选鉴别调节RPE细胞成熟度的试剂的方法。例如，从人ES细胞分化的RPE细胞可以用于筛选促进RPE成熟的试剂。可以单独使用鉴别出的试剂或与RPE细胞组合使用作为治疗方案的一部分。可替代地，鉴别出的试剂可以用作培养方法的一部分来改善体外分化的RPE细胞的存活。
这些RPE细胞可以用作多个环境如医药、化学或生物技术公司、医院或学术或研究机构中的一个研究工具。这类用途包括将从胚胎干细胞分化的RPE细胞用于筛选测定以鉴别例如可以用于促进RPE体外或体内存活或可以用于促进RPE成熟、存活、和/或移入的试剂。可以体外或在动物模型中研究所鉴别的试剂以评价例如它们单独的或与RPE细胞的组合的潜在用途。
本披露提供一种用于鉴别促进RPE成熟的试剂的方法，该方法包括提供一种RPE细胞，使所述RPE细胞与一种试剂接触，评定所述RPE细胞的成熟的迹象，并且然后在所述试剂使RPE细胞显示出成熟迹象时鉴别出促进RPE成熟的一种试剂。成熟迹象可以是如在此讨论的色素沉着水平、基因表达水平、以及形态。
商业应用和方法
本披露的某些方面涉及达到商业数量的RPE细胞的产生。这些RPE细胞可以大规模产生，储存(如果需要)并且供应给医院、临床医生或其他卫生保健机构。
因此，本披露的某些方面涉及产生、储存以及分布通过在此披露的方法产生的RPE细胞的方法。在RPE产生之后，可以在患者治疗之前收获、纯化、并且任选地储存RPE细胞。RPE细胞可以任选地是患者特异性的或基于HLA或其他免疫轮廓来具体选择的。例如，一旦患者呈现出一种适应症例如像糖尿病性视网膜病、黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性)、色素性视网膜炎、视网膜萎缩、视网膜脱离、视网膜发育异常、以及斯图加特氏疾病(眼底黄色斑点病)、血管样纹症、或近视性黄斑变性，就可以及时地订购和提供RPE细胞。因此，本披露涉及产生RPE细胞以获得商业规模的细胞的方法、包含来源于所述方法的RPE细胞的细胞制剂以及将RPE细胞提供给(即，产生、任选地储存以及销售)医院和临床医生的方法。未分化的RPE细胞或成熟的未分化的RPE细胞的产生可以规模放大用于商业用途。
本披露还提供了经营医药生意的方法，该方法包括建立一个分布系统以用于分布待售的制剂或可以包括建立一个销售组以用于开拓药物制剂市场。
本披露提供了将RPE细胞供应到医院、卫生保健中心以及临床医生的方法，借此通过在此披露的方法产生的RPE细胞由医院、卫生保健中心或临床医生根据需要来储存、订购，并且投与需要RPE细胞治疗的患者。医院、卫生保健中心或临床医生基于患者特定数据来订购RPE细胞，RPE细胞根据患者的说明产生并且随后供应到下订单的医院或临床医生。例如，在选择了适于患者的一种具体RPE细胞制剂之后，之后将该细胞制剂扩增达到用于患者治疗的适当数量。
本披露的另外方面涉及可以将匹配的细胞提供给潜在的患者接受者的一个RPE细胞库。因此，本披露提供一种经由医药生意的方法，该方法包括提供对于至少一个组织相容性抗原来说是纯合的RPE细胞制剂的步骤，其中细胞选自包括通过在此披露的方法可以扩增的一个RPE细胞库的一个这类细胞文库，其中每个RPE细胞制剂对于人群体中存在的至少一个MHC等位基因来说是半合的或纯合的，并且其中所述RPE细胞文库包括相对于细胞文库中的其他成员对于不同组的MHC等位基因来说各自是半合或纯合的细胞。如上所述，基因靶向或杂合丢失可以用于产生用于衍化RPE细胞的半合或纯合的MHC等位基因干细胞。
本披露还包括从患者或组织相容性供体获得或产生人ES细胞(例如，诱导的多能(iPS)细胞、或通过体细胞核转移产生的ES细胞、或通过其他重编程方法产生的ES细胞)并且然后产生和扩增自ES细胞衍化的RPE细胞。可以储存这些RPE细胞。此外，这些RPE细胞可以用于治疗自其获得ES的患者或该患者的一个亲戚或一个组织相容性个人。
本披露证明了在良好限定且可复制的条件下可以从人ES细胞可靠地分化和扩增人RPE细胞—这代表了用于患有视网膜变性病症的患者的一个用之不竭的细胞来源。这些细胞的浓度将不受限于可用性，相反可以滴定到个人的精确的临床需求。如果医师认为有必要的话，那么在患者的寿命期内重复输注或移植相同的细胞群体也将是可能的。另外，产生可以产生RPE细胞的匹配的或复杂性降低的HLA hES系的文库的能力可以潜在地减少或消除对免疫压制药物和/或免疫调节方案整体的需求。
实例
现已总体上描述本发明，参考以下实例将更容易理解本发明，这些实例被包括仅出于说明本发明的某些方面和实施例的目的并且不意图限制本发明。
与呈现结果的实例和/或另外的实验结果相关的另外的信息被包括在随附稿件中，包括的另外的信息就在本申请的权利要求书前面。
实例1
方法
hESC主细胞文库的产生
这些研究中使用的hESC系是先前描述的MA09(22)，它来源于在完全知情同意情况下获得的一个未使用的体外受精(IVF)胚胎，并且遵照先进细胞技术道德规范顾问部(Advanced Cell Technology’s Ethics Advisory Board)和机构审查委员会(Institutional Review Board)来使用。将MA09种储备液解冻并且在有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上使用现行良好制造规范来通过四个连续传代扩增。临床hESC主细胞文库(hESC-MCB)被冷冻保存，并且被证实具有正常雌性(46，XX)核型并且不含细菌和支原体污染物以及人、牛、猪以及鼠病毒。PCR分析示出与黄斑变性相关联的基因中不存在变化或突变，这些基因包括CTRP5、EVLV4、RPE-65、VMD2、以及ABCA4(下表3)。
视网膜色素上皮的制造
将hESC-MCB的小瓶解冻并且在经过丝裂霉素C处理的MEF上扩增三代。由于hESC与动物细胞共培养，所以分化衍化物被分类成一种异种移植产物并且对于动物供体来说应遵循FDA准则并且经受产物处理、测试、和归档以及患者监测和登记(在以下实例2中进一步描述)。在hESC扩增之后，顺序地诱导这些细胞以便形成胚状体，之后产生细胞长出物并且局部分化成着色RPE斑点。以下实例4中进一步描述了这个实例中使用的RPE的产生。用胶原酶分离这些着色斑点，并且纯化并胰蛋白酶消化之后，将解离细胞接种，生长至汇合，并且对它们进行再次诱导以再分化总共三个连续代。将第2代RPE冷冻保存并且用作配制临床使用的细胞的起始材料。
临床前研究
如上所述(8)，将人ESC衍化的RPE细胞视网膜下注射到NIH III免疫裸小鼠(肿瘤发生和生物分布研究)和萎缩RCS大鼠以及ELOV4小鼠(功效研究)中。注射的眼睛和其他器官中人细胞的监测通过设计来放大人Alu Y DNA序列的DNA Q-PCR并且通过对人线粒体和人卵黄状黄斑病蛋白的石蜡切片免疫染色来进行(在实例2中进一步描述)。
细胞表征和安全性测试
在不同时间评定这些RPE细胞的安全性并且表征这些细胞的多种RPE特异性属性，包括过程中测试和解冻后进行的测试、最终产物配制，并且培养至成熟以便模拟体外移植细胞的归趋。根据明尼苏达州圣保罗市的无锡药明康德公司(WuXi Apptec,Inc.St.Paul,MN)的标准方案进行对潜在细菌、支原体、鼠病毒以及残余鼠DNA进行安全性评定。由威斯康辛州麦迪逊市的细胞系遗传中心(Cell Lines Genetics,Madison,WI)进行细胞遗传核型分析、针对细胞系认证的DNA指纹图谱、以及荧光原位杂交(FISH)。由迈阿密东福茅斯市科德角国际生物医学科技公司(Cape Cod Associates,Inc,East Falmouth,MA.)在配制成用于临床注射的最终产物的冷冻保存的RPE上进行内毒素测试。使用标准方法来进行定量免疫组织化学染色，其中针对所检察的DAPI染色的核的数量，将阳性染色细胞的百分比标准化。RPE纯度和分化程度的评定是基于卵黄状黄斑病蛋白、Pax6、ZO-1和/或MITF染色的细胞的百分比。通过针对OCT-4和碱性磷酸酶进行染色来进行证实多能性标记物的不存在的筛选。通过暴露在PhRodoTM(英杰(Invitrogen))荧光生物颗粒下的RPE培养物的定量荧光激活细胞分拣(FACS)分析来评定吞噬作用(功效测定)。进行定量逆转录(q-RT)PCR测定来证实RPE特异性基因(RPE-65、PAX-6、MITF、卵黄状黄斑病蛋白)的上调和hESC特异性基因(OCT-4、NANOG、SOX-2)的下调。在细胞数量已知的NaOH提取的沉淀物中用分光光度法测量每个细胞的黑色素含量(在实例2中进一步描述)。
细胞配制和注射
将冷冻保存的MA09-RPE的小瓶解冻，通过离心作用洗涤3次，并且在密度为2×103个活细胞/μL的BSS
Figure BDA0003183443810000941
(爱尔康(Alcon))下重新悬浮。将含有适当体积的配制RPE的一个小瓶和含有适当体积的BSS
Figure BDA0003183443810000942
的一个成对小瓶在2至8C下递送至OR。在注射之前不久，将两个小瓶重构在一个1mL注射器中以便获得将使所希望数量的RPE得以递送(将50,000个活RPE细胞递送到每位患者眼睛的视网膜下腔中)的一个装填细胞密度。为了确保预定剂量的准确递送，增大装填细胞密度以抵消混合、装填、以及通过套管的递送过程中遇到的活RPE的期望的损失。这种活细胞损失如在以下实例3中描述般进行测量并且被示出取决于所使用的套管。在这些实例中，使用了MEDONE
Figure BDA0003183443810000943
套管25/38(具有0.12mm(38g)x5mm尖端的一个0.50mm(25g)x28mm套管)，并且装填细胞密度是444个活细胞/μL以便产生336+/-40个活细胞/μL的期望的递送(N＝6)，从而在150μL体积中产生进入到每个患者眼睛的视网膜下腔中的50,400个活RPE的期望的递送。
患者选择
患者是基于多个入选和排除标准(下文的表7和表8)来选择的，这些入选和排除标准包括末期疾病、中心视力丧失、其他显著眼科病理的缺乏、无癌病史、当前癌症筛选、对系统免疫压制无禁忌、在监测的麻醉护理下进行玻璃体视网膜外科手术程序的能力、以及首次参与涉及hESC衍化的移植组织的人临床试验的心理适应能力。
移植和基本原理
进行平坦部玻璃体切除术，包括手术地诱导后部玻璃体与玻璃体基部后部边沿之前的视神经分离。将150μl体积，5×104个hESC-RPES细胞黄斑下注射递送到未完全被疾病席卷的中心黄斑周围的一个预选择区域中。基于天然、但受损的RPF和上伏感光细胞的存在来仔细地选择移植部位以便优化移植整合的机会以及感光细胞挽救的可能性。一个完全萎缩中心黄斑病理解剖复合体(pathoanotomic complex)内的移植附着是不可能的并且无法模拟变性早期的中心黄斑状态(这可以是基于干细胞的再生移植策略的最终治疗目标)。
免疫压制方案包括外科手术程序之前一周的低剂量的他克莫司(目标血管水平3至7ng/mL)和麦考酚酸酯(MMF范围是0.25g至2g口服/天)并且持续6周的一段时间。在第6周，该方案要求中断他克莫司并且继续MMF持续另外六周。
结果
RPE的表征
受控的hESC分化产生近似100％纯的RPE(图1)。具有着色斑点的单个(9.6cm2)6孔板(图1A)产生了约1.5×108个RPE细胞(例如，足以按每个患者高达3×106个细胞的剂量治疗50名患者)。这些细胞在增殖过程中(在胰蛋白酶消化之后)显示出典型的RPE行为，失去它们的着色鹅卵石形态；一旦重新建立汇合，它们就再分化成一个多边形立方着色上皮单层。Q-PCR示出多能性标记物(Oct-4、NANOG、以及SOX2)被显著下调，而RPE标记物RPE65、卵黄状黄斑病蛋白、Pax6、MITF被以高水平表达(图1B至图1F和表5)。成熟培养物的免疫染色示出卵黄状黄斑病蛋白(分化RPE的晚期标记物)在收获之前以一种膜形式组织在大多数细胞中；所有细胞(>99％)对于卵黄状黄斑病蛋白和/或PAX6(PAX6在更成熟的细胞中变得更弱或消失)以及ZO-1(紧密连接部的一个组分(未示出))呈阳性。在冷冻保存之后，将具有细胞的小瓶解冻并且配制用于移植。针对视网膜标记物Pax6和/或MITF(着色细胞的一种标记物)的染色证实了100％的RPE纯度(图1C)。为了进一步测试配制的细胞，将它们培养2至3周以允许生长和成熟直到建立RPE形态。Pax6/卵黄状黄斑病蛋白(图1E)和ZO-1(图1G)免疫染色与预收获培养物类似，并且一个功效测定示出>85％的细胞吞噬生物颗粒片段(图1J)。
安全性研究
由于hESC暴露在动物细胞和产品下，所以广泛测试了MCB和RPE的动物病原体和人病原体。这些细胞被证实在所有阶段都不含微生物污染物，包括动物和人病毒病原体(下表3)。最终RPE产物具有正常的雌性(46，XX)核型(图1K)和与hESC系MA09匹配的一个DNA指纹图谱。虽然RPE制造过程是在不支持多能细胞的条件下进行的，但将进行一个高灵敏度测定来排除最终RPE产物中任何污染hESC的存在。针对Oct-4和碱性磷酸酶染色的2/9百万细胞RPE样品(在P1/P2下)的检查未示出多能细胞的存在。NIH-III小鼠体内进行的肿瘤发生、生物分布以及加强(spiking)研究在任何动物中均未示出不利问题或安全性问题。此外，在注射了用0.01％、0.1％或1％未分化的hES细胞加强的50,000至100,000个RPE细胞的动物中未观察到肿瘤。经证实在注射后人RPE细胞在100％动物的眼睛中存活多达3个月，并且在92％动物中存活至9个月(下表6)。人RPE存活持续动物寿命并且整合到小鼠RPE层中；虽然在形态上几乎无法与宿主RPE细胞区分(图2)，但它们可以通过免疫染色来鉴别，并且以一种典型的基底侧面方式表达卵黄状黄斑病蛋白(图2B)。Ki-67染色示出移植后1至3个月的低水平增殖，但在九个月时未发现Ki-67-阳性细胞，从而指示hESC衍化的RPE已形成成熟的休眠单层。
分化阶段影响细胞附着和存活
移植细胞至布鲁赫氏膜的附着和它们随后的存活以及整合进入宿主RPE层被认为是这种治疗策略成功的关键。hESC技术的一个区别特征在于可以体外控制分化程度。RPE分化的程度显现在包括色素沉着水平的调节基因型和表型表达的阵列中。在相似条件下维持而在不同时间点收获和冷冻保存的细胞展现出不同的色素沉着水平。图3示出了在明显不同的色素沉着水平下收获的冷冻保存的RPE的两个代表性批次(着色更轻和着色更重的批次的黑色素含量分别是4.8±0.3SD pg/细胞和10.4±0.9SD pg/细胞)。使用用于临床移植的方案来处理和配制来自两个RPE批次的细胞。在通过注射套管挤出之后，将这些细胞接种在涂覆明胶的组织培养板中并且监测这些细胞的附着和随后的生长。来自着色更轻批次的RPE细胞示出了在过夜培养物中有最小数量的漂浮细胞；大多数细胞已附着和扩散，显示出针对这个生长阶段生长的典型的RPE行为以及形态(图3A)。在培养三天之后，RPE细胞的数量从接种的4.0×104个增加到10.6×104个细胞(图3C和图1G)。与之完全相反，着色更重的RPE示出大量漂浮细胞；仅一小百分比的细胞附着和存活，其中在培养三天后细胞数量显著减少(小于更轻批次中所观察[9.0×103]的十分之一)(图3F和图3G)。这些结果表明了RPE分化阶段与体外附着和成长的能力之间的强相关性。当前临床研究中使用的RPE批次具有4.1pg/细胞的黑色素含量并且示出了与着色更轻批次可比的附着和生长。与冷冻-解冻循环、解冻后洗涤、离心作用和配制以及通过注射套管的挤出相关联的应力可以部分说明着色轻和着色重细胞之间观察到的差别。
临床结果
SMD患者是具有手运动(HM)的基线最佳矫正视敏度(BCVA)的26岁龄白人女性并且无法读取早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)视敏度图表上的任何字母。在移植后的时间点均未检测到眼内炎症或过度增殖的任何迹象。用裂隙灯生物显微照相术、眼底照相术、IVFA以及SD-OCT确证不存在临床可检测的炎症(在实例2和图8以及图9中进一步描述)。在手术后第1周开始观察到在RPE水平上的临床增加的色素沉着，该色素沉着显现出已扩展到手术移植部位之外(图4)。戈德曼视野从基线到移植后两个月得到改善(手术前和手术后视野示出在图10和图11中)。在第2周，BCVA数手指(CF)(1个ETDRS字母)，它在研究期过程中继续改善(在第1个月和第2个月是5个ETDRS字母[BCVA 20/800])(表2)。患者是非常可靠的并且持续多年作为图形设计师工作。她主观地报导了手术后的眼睛的改善的彩色视觉以及改善的对比度和暗适应，而对侧眼睛未发生变化。
表2.在手术后的眼睛中移植hESC-RPE之后的视敏度变化
Figure BDA0003183443810000981
Figure BDA0003183443810000991
*BCVA＝最佳矫正视敏度
**ETDRS＝早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)视敏图表
AMD患者是基线BCVA是21个ETDRS字母(20/500)的77岁龄白人女性。尽管适度地不符合免疫压制方案，但在移植后的时间点均未检测到眼内炎症或过度增殖的任何迹象。用裂隙灯生物显微照相术、眼底照相术、IVFA以及SD-OCT确证不存在临床可检测的炎症(在实例2和图8以及图9中进一步描述)。图4和图7中示出了OCT图像。在第2周，ETDRS BCVA是33个字母(20/200)。截止第6周，BCVA是28个ETDRS字母(20/320)，并且直到第8周都保持稳定。通过戈德曼视野测量的中心性暗点在第八周与基线相比较在大小上略微减小。
讨论
人胚胎干细胞的治疗用途引起了令人生畏的转化挑战。本报告提供了第一临床证据，建议hESC衍化的细胞可以安全地移植到人患者中。在当前研究中，将从hESC产生的低剂量(5×104个细胞)的RPE细胞移植到患有不同形式黄斑变性-干性AMD和SMD(它们分别是发达国家中成人和青少年失明的主要原因)的两名患者的眼睛中。
为了提高细胞将附着到布鲁赫氏膜上的机会，选择黄斑复合体(感光细胞、布鲁赫氏膜以及RPE)仍然存在并且潜在可行的一个黄斑下注射部位，从而提高移植细胞将与天然RPE整合并且潜在地挽救受损的黄斑周围组织的期望的可能性。两名患者耐受移植体良好并且本报告时不存在手术后炎症、排斥反应或肿瘤发生的迹象。临床和实验发现结果表明移植的RPE细胞可能已附着、整合并且开始影响受损的天然RPE。
对患者的进行性监测和评定可以确定移植的hESC-RPE是否已降低免疫原性，从长远来看它们在缺乏免疫压制下是否可能经受排斥反应，以及观察到的视力增益是否将持续。期望的是，免疫反应(如果存在)可以通过本领域中已知的包括免疫压制和/或耐受方案的方法来管理。还期望的是，通过投与大量RPE细胞，可获得更大的视力增益。此外，期望的是，投与RPE细胞将减缓或遏制与包括AMD、SMD、以及其他的视网膜变性的病状相关联的视力丧失。
虽然先前已尝试了具有原代RPE细胞的完整片层和悬浮液的移植(11-19)，但来源于成人器官供体的RPE受限于它们增殖的能力(23)和它们体外分化的能力两者，包括无法使用标准的培养条件表达黑色素生物合成所需的基因(24)。临床上，移入AMD患者的视网膜下腔的成人RPE的片层未能改善视力功能(25)。虽然源于产前和产后组织的RPE已成功解离并且经诱导来体外生长和成熟，具有提示完全分化的RPE的属性(26至28)，但这类来源相对于质量和扩增能力来说是极度有限和可变的。与成人和胎儿组织相比，hESC的一个特征在于它们具有无限增殖的能力而不需经历老化，从而将实际上无限的“年轻”细胞来源提供作为用于分化的起始材料。使用获自hESC的子代的另一期望优点在于体外分化阶段可以被控制来最大化移植后的存活和功能性。事实上，此处呈现的数据显示RPE成熟度和色素沉着的程度会显著影响体外细胞随后的附着和生长。
本研究中使用的RPE的起始材料是一个良好表征的hESC主细胞文库，该主细胞文库使用优化来在受控条件下可靠地产生大量多能干细胞的程序来产生。虽然RPE分化程序不允许支持hESC存活，但大量临床前安全性研究证实移植的hESC-RPE在动物的寿命期间并未引起异位组织形成或肿瘤。能够在一百万以上的细胞中检查到至多一个未分化的hES细胞的一种基于免疫荧光的测定证实本研究中使用的RPE的临床批次不具有可检测的多能细胞，从而表示检测水平比体内加强研究中引起肿瘤所示的hESC的剂量低五个数量级。hESC-MCB的产生和每个批次RPE细胞的制造涉及在原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的繁殖。因此，hESC-RPE被分类成一种异种移植产物并且经受由FDA异种移植准则强制规定的所有测试和监测以便确保这些细胞不含鼠病原体。RPE还将进行广泛的成套安全性测试以便证实不存在微生物污染物和病毒，并且通过多种RPE特异性属性来表征，包括吞噬能力、基因表达、形态评价、以及对RPE特异性标记物的免疫组织化学染色。在开始这些临床试验之前，将hESC-RPE移植到萎缩动物中示出这些细胞能够以一种剂量依赖方式挽救感光细胞和视功能。
当前研究被设计来测试患有晚期SMD和干性AMD的患者体内hESC-RPE的安全性和耐受性。迄今为止，这些细胞表现出已移植到两名患者中，而不存在异常增殖、畸胎瘤形成、移植物排斥或其他不良病理反应。指示了继续的跟踪期和进一步的研究。然而，最终治疗目标将是在疾病过程中更早治疗患者，从而潜在地提高挽救感光细胞和中心视力的可能性。
实例2
本实例提供了与实例1相关的补充信息和方法。
表3中示出了临床hESC主细胞文库(hESC-MCB)(自其产生了实例1中使用的RPE细胞)的特征。
表3 MA09 hESC主细胞文库的表征
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小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)主细胞文库
根据2003年4月的工业指南“与异种移植产物在人体中使用相关的源动物、产品、临床前以及临床问题(Source Animal,Product,Preclinical,and Clinical IssuesConcerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans)”和“考虑异种细胞治疗医药产品的要点(Points to Consider on Xenogeneic Cell Therapy MedicinalProducts)”(EMEA/CHMP/CPWP/83508/2009)，MA09-hRPE细胞被定义为一种异种移植产品，因为这些人细胞已与非人(鼠)细胞离体接触。查尔斯河实验室(美国纽约市金士顿设施，斯通里奇公司(Kingston Facility,Stoneridge,NY,USA))的繁殖菌落用作MEF细胞的来源。这种AAALAC认可的设施(国际实验动物养护评价认定协会(Association for Assessmentand Accreditation of Laboratory Care International))在大量健康监测下将CD-1、无特定病原体(SPF)小鼠的一个封闭群落关养在一个隔离室(barrier room)中。使供体动物同时受孕并且在怀孕期间将它们隔离。在处死前受孕后的第十二天，由兽医对所有小鼠进行身体健康检查；使动物安乐死，并且从每个供体小鼠收集血液：由马萨诸塞州威明顿市的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)将白细胞和血浆制剂归档并且针对鼠病原体进行血清测试。委员会认证的兽医病理学家在每个供体动物的尸体和子宫上以及在来自每个仔畜的一个胚胎上进行尸体剖检。来自每个动物的器官与血浆和冷冻保存的白细胞一起存档至少30年(如EMEA/CHMP/CPWP/83508/2009所要求)。如先前所述分离和培养MEF(基利曼斯卡亚(Klimanskaya)和麦克马洪(McMahon)，2005)，在丝裂霉素C灭活之后在P1下冷冻并且在P2下使用。为了最小化引入鼠病毒和其他病原体的风险，由无锡药明康德公司测试和表征MEF。表4中呈现了制备hESC-MCB和hRPE临床批次中使用的批次MEF-08的测试的规格和结果。
表4 MEF主细胞文库的表征
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1鼠细胞系固有地能够产生感染性鼠逆转录病毒并且已呈现的证据表明由MEF产生的鼠白血病(MuLV)病毒粒子是非感染性的并且无法复制到人细胞(阿米特(Amit)等人，2004)。
人DNA的DNA Q-PCR
由加利福尼亚州圣地亚哥市的AltheaDX公司使用Taqman测定针对Alu Y序列按照1个人细胞/150,000个小鼠细胞的灵敏度来进行小鼠组织内人DNA含量的检测。
表5 RPE细胞表征和安全性测试
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细胞的免疫染色
将4孔或6孔板中的细胞用于PBS中的2％多聚甲醛(电子显微镜科学公司(Electron Microscopy Sciences))固定10分钟，在于PBS中的0.1％NP-40替代品(西格玛(Sigma))中透化十分钟，用于PBS中的10％山羊血清阻断1小时或更长，并且4℃下用一级抗体孵育过夜。然后在0.1％吐温/PBS中将细胞洗涤3×15分钟，在室温下用二级抗体孵育1小时，如上所述洗涤并且使用具有DAPI的Vectashield(加利福尼亚州伯灵格姆市的载体实验室(Vector laboratories,Burlingame,CA))安装。在一个倒置荧光显微镜(尼康(Nikon))下检查染色细胞。所使用的抗体是：卵黄状黄斑病蛋白(诺维斯生物公司(NovusBiologicals))、Pax6(科文斯公司(Covance))、MITF(艾博抗公司(Abcam))、ZO-1-FITC(英杰)、Oct-4(桑塔科鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnologies))、抗-小鼠-Alexa594(英杰)、抗-兔-FITC(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))、抗-小鼠-Alexa-488(英杰)、抗-兔-Alexa-594(英杰)。使用载体蓝色试剂盒(载体实验室)检测碱性磷酸酶活性。
小鼠组织切片的免疫染色
在0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中在一个蒸化器(steamer)中将脱石蜡切片孵育40分钟以用于抗原修复(卵黄状黄斑病蛋白和人线粒体)，或在一个压力釜中孵育30分钟以用于Ki67修复。如上所述进行抗体染色，但在一些情况中在使用来自载体(加利福尼亚州伯灵格姆市)的一个试剂盒阻断内源生物素之后使用生物素轭合的二级抗体。所使用的抗体是抗-卵黄状黄斑病蛋白(艾博抗，兔)、抗-人线粒体(小鼠，斯普林生物科学公司(SpringBioscience))、抗-ki67(兔，艾博抗)。二级抗体是抗-小鼠-生物素、抗-小鼠-Cy3(杰克逊免疫研究)、抗-兔-Alexa488(英杰)、以及来自杰克逊免疫研究的链霉亲和素-Cy3。通过hESC形成的小鼠畸胎瘤的切片用作抗-人线粒体和Ki67的一个阳性对照，并且固定和包埋在石蜡中的一种hRPE沉淀物的切片用作卵黄状黄斑病蛋白的一个阳性对照。阴性对照是小鼠兔和鼠IgG(诺维斯生物公司)。
q-RT-PCR
来自凯杰(Qiagen)的RNeasy RNA分离试剂盒用于从细胞混合物提取RNA，从而产生每个样品30μL RNA的最终体积。然后用来自凯杰的Quantitect cDNA合成试剂盒从10μLRNA合成cDNA，从而产生20μLcDNA的最终体积。然后以三个重复方式测试1μL cDNA的相对基因表达，该相对基因表达针对每个样品中存在的β肌动蛋白信号进行标准化。使用软件版本2.1的应用生物系统StepOne Plus和来自生命技术公司(Life Technologies)的TaqMan基因表达测定、遵循制造商推荐的用于比较性Ct相对定量的循环条件来来进行基因表达轮廓描绘。用于hES标记物：Nanog、OCT4和SOX2以及hRPE标记物：RPE-65、PAX-6、MITF以及卵黄状黄斑病蛋白的qRT-PCR测定针对100％hES细胞样品中观察到的表达水平(RQ＝相对定量)标准化，该表达水平用作零设定点。以三个重复方式评定相对基因表达，该相对基因表达针对每个样品中存在的β肌动蛋白信号标准化。数据表示为三个重复的平均值+/-SD。
吞噬作用测定
使用pHrodoTM大肠杆菌荧光生物颗粒(英杰)通过一个基于FACS的测定评定吞噬作用，当荧光生物颗粒内化在胞内吞噬体的降低的pH环境中时发出荧光。生物颗粒根据生产商的指示制备。在37℃下，在一个4孔板中在CO2依赖性培养基(英杰)中以50至200μL生物颗粒/孔将汇合RPE孵育16至20小时。在4℃下孵育阴性对照板。在显微镜下检查细胞，通过胰蛋白酶收获细胞并且通过在一个C6流动细胞分析仪上FACS计数10,000个事件来分析细胞。
黑色素测定
在室温下，使RPE细胞悬浮液在160X G下离心5分钟并且将样品去除用于进行细胞计数器细胞计数。将沉淀物重新悬浮在1N NaOH中并且加热至80℃，持续10分钟，进行涡旋振荡，并且相对于范围是5至180μg/mL的合成黑色素(西格玛目录号8631)标准曲线在475nm处测量吸光度。重复三次评定样品并且将数据针对提取的总细胞数量进行标准化。
表6 NIH-III小鼠的视网膜下腔中RPE的存活
从以下三项研究中收集到下表6中的数据：1)一项肿瘤发生研究，其中将100,000个hES-RPE注射到眼睛中，并且在第4、12、40周将这些动物终结；2)一项加强研究，其中将用0.01％、0.1％以及1％多能hES细胞加强的100,000个hES-RPE注射到眼睛中并且在第2个月和第9个月将这些动物终结；以及3)一项组织分布研究，其中将50,000和100,000个hES-RPE注射到眼睛中，并且在第1个月、第3个月以及第9个月将这些动物终结。下表包括通过针对人DNA的全眼Q-PCR和针对人线粒体的石蜡切片的免疫染色两者获得的数据。
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表7.AMD研究的入选/排除标准
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表8.SMD研究的入选/排除标准
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实例3
调整细胞密度来确保准确剂量的递送
本研究描述了装填和注射过程中的步骤对活RPE的递送的影响的确定。确切地说，在本实例中，示出了装填和注射过程导致了活细胞的某种损失，这种损失可以容易地测量(并且可能随着递送方案而变化，例如，取决于所使用的特定的注射套管)，并且这种损失可以解释通过增加细胞的浓度，允许递送期望的细胞数量。此外，示出了在装填和通过两个套管挤出之后并未显著不利地影响细胞接种和生长。
这些研究整合了整个装填和注射过程，包括：(1)将冷BSS-Plus最终添加至2000个活细胞/μL的浓缩的最终产物RPE细胞以便获得有待注射的所希望密度的细胞。(2)使用附接至1ml注射器(BD LUER-LOK(TM))的一个18g钝的填充针(BD)轻轻混合RPE细胞和BSS-Plus。(3)通过注射套管从填充的注射器挤出150μL配制的RPE细胞。
将RPE细胞维持在爱尔康BSS BSS-Plus(R)中、在冰上被证实在4小时内是恒定的，前提是这些细胞被配制成1000个细胞/μL或更大的浓度。在这些条件下，不存在活细胞数量的可检测的损失。为了确保细胞完整性，将一个精确体积的RPE最终产物细胞以2000个活细胞/μL递送至手术室。每管的RPE细胞将伴随有一个第二管，该第二管含有有待添加至细胞的精确体积的冷BSS-Plus并且恰好在注射前混合。在2℃至8℃下，在无菌微量离心管中将预分配的RPE细胞和BSS-Plus递送至OR。
研究1-MEDONE POLYTIP(R)套管23/38
如实例1中所描述，将在特征上与预定临床RPE批次相似的RPE细胞解冻、处理并且在冷BSS-Plus中配制。在解冻和配制后总共回收了410万活细胞。起始活力是91％并且解冻和配制后回收的细胞数量对于这一批次是典型的。在冷BSS-Plus中将细胞稀释至指示的起始浓度并且将细胞储存在冰上。然后使用附接至一个1mL注射器(BD LUER-LOKTM)的一个18g钝的填充针(BD)轻轻研磨细胞。通过填充针将约200μL细胞转移到注射器中。去除填充针并且将一个MEDONE POLYTIP(R)套管23/38附接至含有细胞的注射器。轻轻敲打注射器的活塞以便通过注射套管投与150L细胞。总注射时间是2至3分钟。将细胞收集在一个无菌管中并且评定活细胞数量。
研究1证明装填并通过MedOne套管挤出的RPE细胞导致在测试细胞密度范围内(295至1144个活细胞/μL)递送的细胞密度的一个可预测的损失。活细胞密度的平均损失是22.8+/-7.0％(N＝6)。结果示出在下表9中。
表9.通过MEDONE POLYTIP(R)套管23/38递送之后的活细胞损失。递送细胞的平均减少百分比是22.8+/-7.0％活细胞/L(N＝6)。
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在范围是从295至1144个活细胞/μL的所有测试细胞密度上观察到了通过注射套管递送的细胞数量的减少。细胞密度的减少百分比在测试范围上表现出是恒定的。在测试的两个最低密度(199和296)上观察到的减少百分比是更可变的并且可以反映细胞计数精确度是这些较低细胞密度。
将通过MedOne套管挤出的细胞，配制的、但不通过套管挤出对照细胞离心，重新悬浮在RPE生长培养基中并且在涂覆明胶的整个区域96孔板中以10,000个细胞/孔接种。出于比较，相同细胞制剂的多个部分进行装填并且通过Synergetics套管(39g成角度的刚性微量注射套管)并且如上所述进行处理和接种。在接种后四天，胰蛋白酶消化细胞并且计数细胞。下表10示出三次细胞计数的平均细胞数量+/-SD。
表10.在装填和通过一个套管挤出之后的细胞接种和生长。
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将通过任一套管挤出的细胞的随后接种和生长与未通过套管挤出的对照细胞进行比较。
研究2-Synergetics公司的成角度的注射套管，39g
如实例1中所描述，将来自在特征上与目标临床RPE批次相似的一个批次的RPE细胞解冻、处理并且在冷BSS-Plus中配制。在解冻和配制后总共回收了260万活细胞。起始活力是97％并且解冻和配制后回收的细胞数量对于这一批次是典型的。在冷BSS-Plus中将细胞稀释至起始浓度375个活细胞/μL并且将细胞储存在冰上。然后使用附接至一个1ml注射器(BD LUER-LOKTM)的一个18g钝的填充针(BD)轻轻研磨细胞。通过填充针将约200L细胞转移到注射器中。去除填充针并且将一个Synergetics公司39g成角度的刚性微量注射套管附接至含有细胞的注射器。轻轻敲打注射器的活塞以便通过注射套管投与150L细胞。总注射时间是2至3分钟。将细胞收集在一个无菌管中并且评定活细胞数量。在一系列八次注射内，递送的平均活细胞是238+/-25个活细胞/μL或比本研究中最低细胞剂量的预定递送(50,000个细胞/眼睛)少约100个活细胞。
因此，研究2证明装填并通过Synergetics套管挤出的RPE细胞导致在最低预定细胞剂量范围内的细胞密度的一个可预测的损失(测试的装填密度是375个活细胞/μL)。活细胞密度的平均损失是38.4+/-6.8％。(N＝8)。可以相应地增加装填细胞密度以补偿预期的损失，因此确保预定活RPE数量的准确递送(如在本研究中是50,000个细胞/眼睛)。
研究3-MedOne POLYTIP(R)套管23/38和Synergetics 39g的成角度的刚性微量注射套管
用以上实例1中投与患者所使用的RPE批次进行研究3。在本研究中，装填的RPE细胞比递送剂量的细胞密度高25％，以便补偿装填注射器和通过MedOne套管注射过程中的预期的损失。相同的补偿25％的装填密度用于测试Synergetics套管。
在装填配制成比低目标剂量高25％的细胞时(444个活细胞/μL来递送333个细胞/μL)，MedOne套管递送336+/-40个活细胞/μL。类似地，在装填配制成比目标剂量高25％的细胞时(1776个活细胞/μL来递送1,333个细胞/μL)，MedOne套管递送1433+/-187个活细胞/μL。使用Synergetics套管针对最低细胞剂量注射的结果证实了装填细胞密度另外增加100个活细胞/μL将在低密度下实现目标剂量。
将八个小瓶(共1600万细胞)解冻并且如上所述进行处理(3次离心)，所有处理均在室温下进行。产量是378万细胞(23.6％回收率，与先前解冻相似)，活力95％。将细胞重新悬浮以储存在冷BSS-Plus中并且传输2百万活细胞/ml(2,000个活细胞/μL)的密度并且之后将细胞保留在冰上。在BSS-Plus中冷存储期间，大于1百万细胞/mL的细胞密度被选择来促进细胞存活。将89μL含有177,600个总活细胞的二十一个等分试样分配至最终产物封闭微量离心管中。
将细胞等分试样储存在冰上直到在装填注射器和通过套管挤出时进行最终稀释。对于低剂量递送来说(50,000个活RPE/眼睛)，将311μL冷BSS-Plus分配至含有细胞的一个试管中以便在444个细胞/μL下使最终体积是400μL。这个密度比预定递送密度333个细胞/μL高25％，以补偿在与填充针混合，装填注射器以及通过MedOne套管递送时发生的预期的损失。
对于高剂量递送来说(200,000个活RPE/眼睛)，将两个89μL细胞等分试样汇集到一个试管(356,000个细胞)中并且将22μL冷BSS-Plus分配至含有细胞的该试管中以在1,776个细胞/μL下使最终体积是200μL。这个密度比预定递送密度1,333个细胞/L高25％，以补偿在用填充针混合，装填注射器以及通过MedOne套管递送时发生的预期的损失。
将含有稀释细胞的微量离心管封盖并且用一个手指轻敲该微量离心管以便促进混合。将钝的填充针(孔隙体积是90μL)附接至1mL BD注射器并且在钝的填充针内将细胞轻轻小心研磨1至2次，以最小化与注射器的接触。将注射器填充约200μL细胞。去除钝的填充针并且附接注射套管(MedOne 38g或Synergenic 39g)。将约150μL细胞分配至一个微量离心管。评定每个分配的等分试样的细胞密度并且通过台盼蓝排除评定活力。这些结果总结在下表11和表12中。
表11.重构和通过MedOne套管递送对RPE细胞数量和活力的影响。
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表12.重构和通过Synergetics套管递送对RPE细胞数量和活力的影响。
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使初始装填密度增加比目标剂量高25％有效补偿了装填和通过MedOne套管挤出过程中遇到的细胞密度的损失。在有待投与的最低剂量下，MedOne套管递送336+/-40个活细胞/μL(N＝6)的平均细胞密度，而目标递送是333个存活细胞/μL。在有待递送的最高细胞密度(1333个活细胞/μL)下，MedOne套管递送1433+/-187个活细胞/μL(N＝3)。
在通过MedOne或Synergetics套管的最低剂量递送下，将细胞稀释在RPE生长培养基中，离心，并且在涂覆明胶的整个区域96孔板中在40,000个细胞/孔下接种。以相同的方式对从与通过套管挤出的细胞相同的试管获取的非套管注射的对照细胞进行处理和接种。在接种后二十四小时，所有细胞均已附着并且在任何测试条件下都未观察到指示细胞死亡或接种效率受损的漂浮细胞。
将通过MedOne套管、Synergetics套管挤出的细胞，以及配制的但不通过任一套管挤出的对照细胞离心，重新悬浮在RPE生长培养基中并且在涂覆明胶的整个区域96孔板中在40,000个细胞/孔下接种。在接种后三天，胰蛋白酶消化细胞并且计数细胞。下表13示出平均细胞数量+/-SD。这些结果证明了通过任一套管的挤出并未不利地影响随后的接种和生长。在接种后两天，通过显微镜检查培养的对照细胞和MedOne套管注射的细胞并且这些细胞示出具有活跃分裂的细胞的典型RPE形态。未观察到对照细胞与套管注射细胞之间的差异。
表13.在装填和通过一个套管挤出之后的细胞接种和生长。
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总之，由于冷BSS-Plus中的RPE细胞在浓度大于1000个细胞/μL下更稳定，所以可以将最终产物重新悬浮在最终产物封闭微量离心管的冷BSS-Plus中(2000个细胞/μL)，从而允许套管装填有150μL体积的多达300,000个细胞的剂量。在GMP洁净室处理之后，可以将处于2℃至8℃的两个微量离心管递送至手术室：一个小瓶含有2000个活细胞/μL的精确体积的RPE细胞，并且一个小瓶含有精确体积的、待添加至细胞中以使细胞密度处于有待注射的密度的冷BSS-Plus(即，考虑了装填和通过套管的挤出过程中活细胞的损失的密度，例如，比最终目标剂量高25％，以考虑用MedOne套管所致的活细胞的损失的密度)。在欲将高于1,000个细胞/μL或高于2,000个细胞/μL的浓度装入套管时，可以省略稀释步骤并且改为可以将处于所希望浓度的细胞在冷BSS-Plus中递送至手术室。
表14中示出了针对MedOne定制的配制装填密度和相应剂量。针对Synergetics套管或另一套管或递送系统，可以容易地确定类似的定制。
表14.用于递送目标剂量的活RPE、考虑了混合、装填以及用MedOne套管递送过程中活细胞的损失的装填细胞密度。
Figure BDA0003183443810001231
实例4
从ES细胞分化RPE
本实例描述了RPE从hESC的分化。所得RPE用于实例1中所描述的研究中。
胚状体分化培养基(EB-DM)由以下各项构成：补充有Glutamax的KnockoutTM DMEM、非必需氨基酸、2-巯基乙醇以及KnockoutTM血清替补物，并且在胚状体开始形成直至收获和解离着色斑点时(即，贯穿胚状体形成、长出以及随后的着色斑点形成的整个过程中)使用。每批EB-DM由250mL KnockoutTM DMEM、3mL Glutamax-I、3ml非必需氨基酸、0.3mL 2-巯基乙醇以及38mL KnockoutTM血清替补物构成。
RPE生长/维持培养基(RPE-GM/MM)由一部分EB-DM(如前述段落中所描述)和一部分DMEM(高葡萄糖)、FBS以及Glutamax构成。在从着色斑点得到RPE细胞之后以及在随后的RPE生长和维持过程中(从0代到2代直至最终本体产物收获点)使用这种培养基。每批RPT-GM/MM由100mL EB-DM、90mL DMEM高葡萄糖、10ML胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)、以及1mLGlutamax-I构成。
在这些培养基中得到并培养的RPE细胞表达RPE卵黄状黄斑病蛋白、CRALBP、RPE65的分子标记物。PEDF能够发挥吞噬作用，并且挽救RCS大鼠的视力功能。
使用以上培养基产生的RPE批次通过了所有过程中质量测试，包括形态评价、免疫组织化学染色以及用于上调RPE基因和下调hES细胞基因表达的q-RT-PCR。产量和细胞纯度与先前使用MDBK-GM和MDBK-MM培养基(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、OptiPRO-SFM或VP-SFM制备的RPE细胞相当。
从胚状体形成之时直至收获着色斑点的点使用EB-DM(代替MDBK-GM或OptiPRO-SFM)制备RPE批次。在收获并胰蛋白酶消化着色斑点之后，随后在如上文所定义的RPE-GM(EGM-2培养基)中对0代RPE细胞接种并且然后切换到RPE生长/维持培养基，而非MDBK-MM或VP-SFM。可替代地，RPE可以在RPE-GM/MM中直接接种并且允许在传代的整个持续时间内生长和分化。在观察到适当的分化水平之后，在这些培养基中另外进行两次0代RPE细胞的收获和分裂直到2代的最终收获和本体产物的冷冻保存。
以下数据示出了针对五个RPE子批次的过程中测试的总结，这些RPE子批次在从胚状体形成之时直至收获着色斑点的点被维持在EB-DM中。在这时，在不同的天数从不同的孔收获着色斑点，胰蛋白酶消化并且接种作为0代RPE。将批次B1A、B2A以及B2B接种在EGM-2培养基中直到汇合，之后切换到RPE生长/维持培养基以便促进0代、1代以及2代的分化。在将批次B3B和B3A仅维持在RPE-GM/MM中传代的整个持续时间时，以相同的方式分别处理它们，除了1代或2代之外。因此在达到汇合时所有批次都被维持在RPE-GM/MM中，直到观察到适当的分化水平。在2代结束之后，将RPE细胞冷冻保存作为本体产物。在EGM-2中维持初始生长阶段之后切换到RPE-GM/MM或保持在RPE生长/维持培养基中持续若干传代的整个持续时间的批次是相似的，除了在EGM-2培养基中观察到略微更快的生长速度以外。所有批次在0代、1代以及2代时通过形态评价，其中通过规格包括典型的上皮、鹅卵石形态和中等色素沉着。RPE标记物表达通过间接免疫荧光使用以下一级抗体来检测(稀释度是介于约1:100与1:1000之间并且针对每个抗体批次从经验上确定)：卵黄状黄斑病蛋白—小鼠单克隆，诺维斯生物公司(#NB 300-164)；PAX6—科文斯，兔多克隆(PRB-278P)；ZO-1—英杰，小鼠单克隆(339100)；ZO-1—英杰，兔多克隆(61-7300)；ZO-1-FITC—英杰；小鼠单克隆(339111)；MITF—小鼠单克隆，艾博抗(ab3201)。
在1:500稀释度(或如指示的其他稀释度)下，在阻断溶液中使用二级抗体并且二级抗体如下：Alexa Fluor 488抗-小鼠，英杰#A11001；Alexa Fluor 488抗-兔，英杰#A11008；Alexa Fluor 594抗-小鼠，英杰#A11032；Alexa Fluor 594抗-兔，英杰#A11012；在1:200下使用山羊抗-小鼠Cy3-轭合(杰克逊免疫研究，目录号115-165-146)。
进行RPE标记物的免疫染色以便通过PAX6与MITF、卵黄状黄斑病蛋白与PAX6的组合以及ZO-1单独评定纯度。RPE成熟通过确定卵黄状黄斑病蛋白阳性染色RPE的百分比来评定。在制造RPE细胞过程中的4个点处进行免疫染色：(1)在1代收获和接种2代之前，针对卵黄状黄斑病蛋白、PAX6以及ZO-1对RPE染色；(2)在2代收获和冷冻保存之前，针对卵黄状黄斑病蛋白、PAX6以及ZO-1对RPE染色；(3)如实例1中所描述将RPE本体产物解冻并且配制，并且以1,000个活细胞/μL重新悬浮BSS-PLUS中。然后将细胞稀释在RPE-GM中，在1000RPM下离心，重新悬浮并且在涂覆明胶的四孔板中以100,000至300,000个细胞/孔接种，并且在针对MITF和PAX6染色之前孵育一至两天；(4)如实例1中所描述将RPE本体产物解冻并且配制，并且以1,000个活细胞/μL重新悬浮BSS-PLUS中。然后将细胞稀释在RPE-GM中，在1000RPM下离心，重新悬浮并且在涂覆明胶的四孔板中按50,000至200,000个细胞/孔接种，并且维持直到汇合，之后进行染色。在这时，将培养物切换到RPE-MM并且维持直到在针对PAX6、卵黄状黄斑病蛋白以及ZO-1对培养物染色时观察到中等色素沉着和鹅卵石形态。简而言之，用不含Ca2+、Mg2+的PBS(吉伯克#14190)将细胞清洗2至3次，用2％多聚甲醛固定10分钟，用2XPBS清洗，用在PBS中的0.1％NP-40取代溶液(西格玛#74388)孵育15分钟，用2X PBS清洗，用阻断溶液(10％正常山羊血清(杰克逊免疫研究#005-000-121)、16％多聚甲醛(电子显微镜科学公司#15710)，以工作浓度2％在PBS中制备(新鲜制备或冷冻等分试样))孵育介于30分钟与过夜之间。然后用一级抗体(使用来自不同种类的一级抗体，每孔多达两个抗体)在阻断溶液中孵育细胞并且在室温下孵育1至2小时或在4℃下孵育过夜，用PBS清洗，在PBS-吐温溶液(PBS不含Ca2+、Mg2+(吉伯克#14190)，含有0.5％Tween-20(西格玛#P7949))中洗涤三次，同时伴随着搅拌(每次洗涤搅拌10至15分钟)。然后用二级抗体孵育样品，并且如同一级抗体一样进行洗涤。在去除最后一次的洗涤液之后，添加1至2滴具有DAPI的Vectashield并且在一个倒置荧光显微镜下检查并计数细胞。在20倍放大倍数下，在所有通道中，对三至六个随机视野拍摄照片，含有最少1000个核。合并照片并且根据需要调节图像以便允许对卵黄状黄斑病蛋白和PAX6呈阴性，或对PAX6和MITF呈阴性或对ZO-1呈阴性的细胞的可视化。如果观察到期望的染色图案，例如，PAX6局部化在核内，卵黄状黄斑病蛋白局部化在质膜内、处于多边形图案(示出卵黄状黄斑病蛋白在细胞外周的清晰的线处的局部化染色)，ZO-1染色存在于描绘出细胞轮廓的紧密连接部中、处于多边形图案，并且检测到的MITF染色限制在核内，那么细胞的一个给定标记物被计数为阳性。对每个标记物或标记物组合呈阳性的细胞的百分比通过以下来确定：计数合并图像中的阳性细胞并且通过计数未合并的DAPI染色的图像中的细胞核来确定总细胞数量。
表15.由从hES细胞分化的RPE细胞表达的RPE标记物。RPE标记物通过间接免疫荧光染色来检测。
Figure BDA0003183443810001271
此外，mRNA表达通过q-RT-PCR来检测，如实例1中所描述。从每个批次获得的结果示出在表16中并且证明如所预期般RPE基因被上调并且ES细胞基因被下调。
表16.从hES细胞分化的RPE细胞中RPE基因上调和ES细胞基因下调。
Figure BDA0003183443810001272
Figure BDA0003183443810001281
测试使用上述培养基配制品(RPE-GM/MM和EB-DM)制造的RPE以及先前使用其他培养基(MDBK-GM和MDBK-MM)制造的冷冻保存的RPE细胞的吞噬能力。在本研究中，将冷冻保存的RPE解冻并且在RPE生长/维持培养基中接种。来自在胚状体形成和着色斑点形成过程中使用EB-DM和在RPE成熟过程中使用RPE-GM/MM产生的当前批次的RPE细胞被胰蛋白酶消化并且类似地接种在RPE-GM/MM中。使两种培养物生长至汇合并且维持这些培养物直到在RPE-GM/MM中发生分化，之后测试它们吞噬荧光生物颗粒(英杰目录号P35361)的能力，当荧光生物颗粒内化在RPE细胞的吞噬体的酸性环境中时发出荧光。在37℃下，用荧光生物颗粒孵育细胞以便允许发生吞噬作用，或在4℃下作为一个阴性对照。通过FACS检测在37℃下孵育的细胞的荧光强度的移动(图12)，从而指示生物颗粒的吞噬作用。峰的统计积分产生了针对每个批次和孵育温度来说吞噬呈阳性的细胞的百分比。
表17.使用MDBK培养基(MDBK-GM和MDBK-MM)或EB-DM和RPE-GM/MM产生的RPE细胞的吞噬作用。吞噬作用通过用在酸性吞噬体环境中变得具有荧光的颗粒孵育细胞来检测。示出了针对在37℃下或在4℃下(阴性对照)孵育的细胞来说吞噬呈阳性的细胞的百分比，如由FACS所检测。在EB-DM和RPE-GM/MM中产生的细胞与在MDBK培养基中产生的细胞相当，从而进一步证实了这些培养基配制品的适应性。
MDBK培养基 EB-DM和RPE-GM/MM
4℃ 8％ 18％
37℃ 64％ 77％
这些结果示出了RPE-GM/MM中维持的两个RPE细胞批次中的高百分比细胞的吞噬作用并且进一步证明了将RPE-GM/MM用于RPE细胞生长和成熟的适应性。
实例5
用于RPE衍化的另外的示例性方法
本实例中的方法用于产生从另一hESC系分化的RPE，另一hESC系是在胚胎未破坏的情况下产生，确切地说，iPS细胞(确切地说，iPS细胞使用非整合附加刑载体来产生)和NED(“胚胎未破坏”)hES细胞从活检卵裂球产生，其中自其获得卵裂球的胚胎仍然保持存活并且随后被冷冻保存。如钟(Chung)等人(细胞干细胞杂志(Cell Stem Cell.)2008年2月7；2(2):113-7)中所描述产生NED细胞，该文献通过引用以其全部内容结合在此。
根据生产商的指示在稀释在mTESR-1培养基(干细胞技术公司(Stem CellTechnologies,Inc.))上的Matrigel(TM)上繁殖hESC。如先前所述(基利曼斯卡亚(Klimanskaya)等人，干细胞细胞杂志(Cell Stem Cells)6:217-245(2004)，该文献通过引用以其全部内容结合在此)从胚状体(“EB”)或多层hESC培养物产生RPE；在悬浮培养之后，在RPE收获之前将EB铺板用于长出。然而，观察到来自Matrigel(TM)上培养的hESC的EB形成不太有效，其中细胞展现出较低的成功聚集率和降低的活力。以下方案修改用于提高EB形成效率：
hESC被允许过度生长超出它们正常传代的时间，因此集落变得“更厚”，即，凸出一些和/或多层的。对于EB形成，在未被允许解离到单细胞悬浮液中的情况下，使用机械刮擦、胶原酶I、accutase、胶原酶与accutase或接着accutase、基于EDTA的解离缓冲液来解离hESC。这些方法允许hESC集落在不解离成单细胞的情况下上升。未使用胰蛋白酶(它在一般使用条件下往往容易产生单细胞悬浮液)。
然后在超低附着板上培养解离的hESC以便允许EB形成。任选地，其他方法如悬滴法可以用于EB形成。典型地，将来自6孔培养皿的1至3个孔的hESC培养在含有2至7ml培养基的低附着板的1至2个孔中。将这些细胞培养在EB培养基中(敲除高葡萄糖DMEM、1％非必需氨基酸溶液、2mM GlutaMAX I、0.1mMβ-巯基乙醇、以及13％血清替补物(SR，英杰))。在形成EB时在EB培养基中培养的前2天至3天期间，给EB培养基补充10微摩尔/升的斯泰姆特的Stemolecule Y-27632、rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(参见瓦坦那(Watanabe)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol.)2007年6月；25(6):681-6，该文献通过引用以其全部内容结合在此)。ROCK抑制剂的使用提高了细胞活力，对于使用EDTA或酶促解离获得的hES细胞来说尤其如此。ROCK抑制剂的使用对机械刮擦的hESC来说是任选的，机械刮擦的hESC甚至在该抑制剂不存在的情况下都能很好地存活。
在EB形成之后的7与12天之间，将EB铺在涂覆明胶的板上以用于长出。RPE通过它们的上皮形态(鹅卵石外观)和色素沉着来容易地鉴别。
RPE还从Matrigel(TM)上生长的hESC的多层培养物产生，这基本如先前所述(以上基利曼斯卡亚等人，2004)，除了这些细胞培养在Matrigel(TM)上而非饲养细胞上之外。简而言之，hESC被允许在Matrigel(TM)上在mTESR-1培养基中过度生长直到hESC集落变成多层(约10至14天的培养)，在这时用EB培养基替换培养基(如上所述)。ROCK抑制剂任选地被包括在培养基中但对有效的RPE形成和回收来说不是必须的。RPE通过它们的上皮形态(鹅卵石外观)和色素沉着来容易地鉴别。每1至2天更换培养基直到观察到着色RPE细胞(典型是在4至5周内)。
所得EB或多层培养物展现出含有肉眼可见的较暗区域的一个“有斑点”外观。显微镜检查证实这些较暗区域由通过它们的特征性色素沉着和鹅卵石上皮形态可鉴别的RPE细胞构成。图19中示出了所得RPE细胞培养物。在从hESC分化之后，通过机械解离或酶促解离来分离这些RPE细胞。
实例6
RPE移植方法
以下方法用于将细胞移植到干性年龄相关性黄斑变性(AMD)和斯图加特氏黄斑萎缩(SMD)患者体内。
在手术之前不久，皮质类固醇不投与患者。根据外科医生的判断，在全身或局部麻醉下，在使用或不使用苏醒镇定下进行手术。
用于移植的细胞被提供为储存在液氮储存系统的蒸汽相中的冷冻悬浮液(约-140℃)。为了配制用于投与的细胞，从液氮冷冻器上去除小瓶，然后将小瓶放置在37℃的水浴中，并且持续搅拌1至2分钟直到解冻。然后用70％异丙醇对小瓶喷雾并且进行干燥。将每个小瓶的内容物(冷冻时含有1百万细胞的1mL冷冻保存培养基)转移到一个50mL锥形管中并且用40mL无血清的DMEM清洗。将这些细胞离心并且将每种沉淀物重新悬浮在40mL BSS-PLUS中。再次将细胞悬浮液离心并且如果已解冻一个以上冷冻小瓶，那么将一种或多种沉淀物汇集在一起。使体积达到最终体积于BSS PLUS中10mL的并且进行第三次离心。完全吸出上清液并且针对每1mL解冻细胞使这些细胞达到最终体积约150μL BSS PLUS(如果希望一种更浓缩的悬浮液，那么可以使用更低的体积)。去除样品并且进行活细胞计数。确定总活细胞数量并且添加适当体积的BSS-PLUS来获得目标活细胞浓度如2,000个活细胞/μL。将适当体积的配制产物转移到一个0.5mL无菌微量离心管中并且去除样品来进行归档、活力测定、革兰氏染色以及无菌性测试。还制备成对的含有精确体积的BSS-Plus的0.5mL无菌微量离心管并且对其进行标记。成对小瓶被允许在2℃至8℃下储存不超过4小时，等待在手术室中最终混合和移植。
在患者身上进行标准3口平坦部玻璃体切除术。进行小型视网膜切除术并且然后使用流体注射系统通过玻璃体切除机器来将BSS Plus输注到视网膜下腔直到产生小的感觉神经性视网膜脱离。外科医生确保水泡产生在一个颞窝位置中。该水泡任选地可以在弓形血管内延伸但不脱离中心黄斑/中心窝。如果观察到该水泡朝向中心黄斑延伸，那么外科医生具有停止和产生另一视网膜切口的选择权，关于它的位置观察到相同的规则。然后去除视网膜下注射的BSS Plus。
然后引入一个预装填套管并且在约一分钟内将处于150μL体积中的细胞注入到所产生的间隙中。通过直接查看来监测以确保正确的套管定位。该水泡的精确位置通过摄影术或(优选地)影像，通过手术显微镜来记录，以便可以将手术后的发现结果与水泡位置精确地关联起来。
植入在150μL BSS Plus中含有希望数量的hESC衍化的RPE细胞(例如，50,000、100,000、150,000或200,000个)的一种悬浮液。在约一分钟内输注这些细胞。使套管在适当位置保持另外一分钟以便避免回流。根据外科医生的判断，例如，如果视网膜切口变大，那么任选地进行空气-流体交换。然后使用标准程序来封闭切口。患者然后从麻醉中恢复，但应保持仰卧位6小时。
该程序之后48小时不允许投与皮质类固醇。局部或全身性非类固醇消炎剂被允许用于管理手术后不适，如果需要的话。
实例7
冷冻保存的RPE细胞制剂的稳定性
本实例证明冷冻保存的RPE细胞通过了释放标准并且在冷冻后6个月和12个月的时间点测试时仍然适用。在此基础上，示出了冷冻保存的RPE在冷冻保存后12个月仍保持它们的功能以及产物属性。预期的是，在冷冻后数年(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年)，冷冻保存的RPE细胞将仍适用于移植。
如以上实例4中所描述产生冷冻保存的RPE样品，并且冷冻在液氮在冷冻保存培养基(90％FBS和10％DMSO)中并且储存在液氮储存系统(约-140℃)的蒸汽相中。在储存6个月或12个月之后，如实例6中所述将冷冻保存的细胞解冻并且洗涤(简而言之，在37℃水浴中解冻，用70％乙醇洗涤容器的外侧，并且洗涤这些细胞以去除冷冻保存培养基)。在解冻之后，使这些细胞经受测试以便证实产物稳定性。如下表18中所示，通过了每个释放标准。
表18.冷冻保存的RPE的稳定性。细胞冷冻保存6或12个月
Figure BDA0003183443810001331
Figure BDA0003183443810001341
实例8
配制的RPE细胞的稳定性
本实例证明RPE细胞在解冻后至少4小时仍然适于适用并且在维持在2℃与6℃之间时适于制备投与。
如以上实例6中所描述将冷冻保存的细胞解冻并且配制，并且在2℃至8℃下储存在最终产物容器(具有垫圈的0.5mL无菌微量离心管)中。表19示出了针对配制时和冷冻保存四小时之后测试的这两个批次(3个最终配制品/批次)通过台盼蓝排除评定的平均百分比活力±SD。
表19.临床产品中RPE细胞的初始活力和4小时活力
0小时活力(％) 4小时活力(％)
批次A(N＝3) 82.7±6.7 82.3±1.5
批次B(N＝3) 84.3±1.5 85.3±4.1
这些数据示出了配制的RPE细胞直到制备后4小时仍维持细胞活力。
在另外的实验中，RPE细胞最终产物配制成2,000个活细胞/μL并且冷储存不同时间，之后通过MedOne REF 3233POLYTIPR套管23/38挤出。在本研究(表20中示出数据)中，将一个RPE细胞批次(它通过了针对临床使用的本体产物释放测试)解冻并且进行处理如上。将细胞重新悬浮并且在BSS-Plus中以2,000个活细胞/μL的密度储存，并且之后将细胞保留在冰上。在BSS-Plus中冷储存期间，大于1,000个活细胞/μL的细胞密度被选择来促进细胞存活。在这时，将含有177,600个总活细胞的二十一份89μL的细胞等分试样分配至最终产物封闭微量离心管。将细胞等分试样储存在冰上直到在装填注射器和通过套管挤出时进行最终稀释。对于低剂量递送来说，将311μL冷BSS-Plus分配至含有细胞的一个试管中以便在444个细胞/μL下使最终体积是400μL。这个密度比预定递送密度333个细胞/μL高25％，以补偿在用填充针混合，装填注射器以及通过MedOne套管递送时发生的预期的损失。
对于高剂量递送来说，将两个89μL的细胞汇集到一个试管(356,000)中并且将22μL冷BSS-Plus分配至含有细胞的试管中以在1,776个细胞/μL下使最终体积是400μL。这个密度比预定递送密度1,333个细胞/μL高25％，以补偿在用填充针混合，装填注射器以及通过MedOne套管递送时发生的预期的损失。
将含有稀释细胞的微量离心管封盖并且用一个手指轻敲该微量离心管以便促进混合。将钝的填充针(孔隙体积是90μL)附接至1mL BD注射器并且在钝的填充针内将细胞轻轻小心研磨1至2次，以最小化与注射器的接触。将注射器填充约200μL细胞。去除钝针并且附接MedOne 38g注射套管。将约150μL细胞分配至一个微量离心管中。评定每个分配的等分试样的细胞密度并且通过台盼蓝排除评定活力。配制后时间是从将细胞在2,000个活细胞/μL下重新悬浮在冷BSS-Plus中之后流逝的分钟数。表20中示出了在指示浓度下递送的细胞的这些数据。
表20.配制之后储存的套管递送的RPE细胞的活力
Figure BDA0003183443810001351
Figure BDA0003183443810001361
数据显示在测试时间内冷储存时，通过注射套管挤出的最终产品RPE细胞的活细胞数量并未下降。在配制后超过240分钟(4小时)时观察到的活细胞密度支持至少4小时的到期时间。在这个研究中，BSS-Plus中的RPE细胞在冰上储存在最终产品封闭包(closure)中。冰上储存的微量离心管中BSS-Plus的温度随后使用一个校准探针测量并且发现是3℃。
另外的实验测试配制的RPE细胞的活力，测试持续多达六小时。在配制(0小时)时和冷储存4小时和6小时(2℃至8℃)之后评定活力。这个研究中使用的RPE批使用针对GMP制造所描述的程序、方法以及材料来制造和冷冻保存。冷冻保存的RPE细胞小瓶按照如以上实例6中所描述的程序进行解冻和配制。在配制(0小时)时和在冷储存4小时和6小时(2℃至8℃)之后评定细胞的活细胞数量。此外，对0小时、4小时以及6小时细胞进行接种和培养以用于随后的纯度和效力评定。对于接种的每个时间点(0、4以及6小时)，纯度通过MITF和PAX6免疫染色来评定并且通过FACS分析来评定荧光颗粒的吞噬作用。
活细胞密度通过计数血细胞计数器内的排除台盼蓝的细胞来确定。数据是在4个血细胞计数室上进行的计数的平均值+/-SD。结果显示于下表21中。
表21.配制后储存在2℃至8℃之间的细胞的活力
Figure BDA0003183443810001371
储存配制细胞的GMP储存冰箱的温度读数证实整个实验过程中温度保持在6℃。
0小时起始活细胞密度2,590/μL和1,700/μL归为靶向一些临床配制品的2,000个活细胞/μL。在冷冻储存直到六小时下，在测试的起始细胞密度范围内并未观察到活细胞数量的损失。
实例9
本实例提供针对另两个斯图加特氏疾病患者的最初处理结果。这两名患者各自使用以上实例6中所描述的RPE移植方法用从一个hESC来源衍化的50,000个RPE细胞来处理(如实例1中所描述)。两名斯图加特氏疾病患者的包括视网膜、视盘、黄斑以及后极的眼底照片指示注射部位和溶液注射时产生的水泡区域含有RPE细胞(图15)。
另外的眼底照片示出了针对两位SMD患者注射水泡内具有着色RPE细胞的增加的斑点的区域的建立(图16和图17)。这些结果建议用一个新RPE层移入视网膜区域并且使该视网膜区域表面重修。
还测量了图16中所示患者的处理眼睛的视敏度。竖直轴线指示早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS评分)并且水平轴线示出手术后的天数。
这些结果指示了RPE细胞的稳定移入在处理之后持续了至少3个月。处理眼睛的视敏度在处理后14天恢复到基线水平并且直到所示最终时间点84天仍然保持在基线以上。
实例10
一年患者评价
在以上实例1中所描述的RPE处理之后的一年期内评价AMD患者和SMD患者。
SMD患者眼睛的眼底照片证明了处理后一年处理眼睛中着色细胞的存在(图20B)。相比之下，在处理之前基线处，着色细胞是不可检测的(图20A)。这些结果指示了在处理之后持续至少一年的长期RPE移入。
对于AMD患者，外周如何？图21中图解示出了ETDRS/BVCA评分。从最初基线值21开始，患者外周ERTDS-BVCA评分在手术后第1天和第3天下降至零但在手术后七天恢复到至少基线水平并且之后保持在基线以上。在处理后一年，患者外周ERTDS-BVCA评分是34。
对于SMD患者，处理后一年中心ETDRS/BVCA评分是15。图22中图解示出了外周评分。从最初基线值0开始，手术后两周患者外周ERTDS-BVCA评分上升至1并且之后在处理后一年继续上升至值15。
这些结果表明了AMD和SMD患者两者因处理后持续至少一年的RPE细胞的投与所致的视敏度的改善。
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所有公开、专利和专利申请通过引用以其全部内容结合在此，程度如同每个单独的公开、专利或专利申请具体地和单独地指明要通过引用以其全部内容结合一般。2007年10月12日提交的美国临时专利申请号60/998,766，2007年10月12日提交的60/998,668，2008年1月2日提交的61/009,908以及2008年1月2日提交的61/009,911，以上申请中每个申请的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。此外，WO 2009/051671的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。
利用不超出常规的实验，本领域技术人员将认识到，或将能够确定在此所描述的本发明具体实施例的许多等同物。此类等同物意在由所附权利要求书涵盖。
本发明还包括以下实施方案：
1.一种药物组合物，该药物组合物包含：
多个视网膜色素上皮(RPE)细胞；以及
一种药学上可接受的载体；
其中所述多个RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞。
2.根据项目1所述的药物组合物，其中所述RPE细胞包含于一种悬浮液、凝胶、胶体、基质、基底、支架或移植物中。
3.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含具有介于约290mOsm/kg与约320mOsm/kg之间、或介于约300mOsm/kg与310mOsm/kg之间或约305mOsm/kg的渗透压的一种无菌溶液。
4.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含一种平衡盐溶液。
5.根据项目4所述的药物组合物，其中所述平衡盐溶液包含，由以下成分组成，或基本上由以下成分组成：在每mL的水中，氯化钠7.14mg、氯化钾0.38mg、氯化钙二水合物0.154mg、氯化镁六水合物0.2mg、磷酸氢二钠0.42mg、碳酸氢钠2.1mg、葡萄糖0.92mg、谷胱甘肽二硫化物(氧化谷胱甘肽)0.184mg、以及盐酸和/或氢氧化钠(将pH调整至约7.4)。
6.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的体积是介于约100μL与1000μL之间或是至少约150μL。
7.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含介于约1,000与约1×109之间的活RPE细胞之间。
8.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含介于约333个活RPE细胞/μL与约2,000个活RPE细胞/μL之间、介于约444个活RPE细胞/μL与约1766个活RPE细胞/μL之间、约333个活RPE细胞/μL、约444个活RPE细胞/μL、约666个活RPE细胞/μL、约888个活RPE细胞/μL、约999个活RPE细胞/μL、或约1,333个活RPE细胞/μL。
9.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中RPE细胞的浓度足够高以使得至多约30％的所述RPE细胞在60分钟内失去活力，并且任选地至多约10％的所述RPE细胞在4小时内失去活力。
10.根据项目9所述的药物组合物，其中RPE细胞的所述浓度是至少约1,000个细胞/μL、至少约2,000个细胞/μL、介于约1,000与10,000个细胞/μL之间，或介于约2,000与5,000个细胞/μL之间。
11.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中该药物制剂包含少于约25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的不是RPE细胞的细胞。
12.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞，且至少0.1pg/细胞，和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间或介于1与5pg/细胞之间。
13.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在所述药物组合物中至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的这些细胞是卵黄状黄斑病蛋白+。
14.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在所述药物组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是PAX6+和/或MITF+。
15.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在所述药物组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是PAX6+和/或卵黄状黄斑病蛋白+。
16.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在所述药物组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是ZO-1+。
17.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在该药物组合物中至少50％、至少60％或至少70％的这些细胞是PAX6+和卵黄状黄斑病蛋白+。
18.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在所述药物组合物中至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是PAX6+。
19.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中在所述药物组合物中至多约一个细胞/百万细胞和任选地至多两个细胞/九百万细胞对于OCT-4和碱性磷酸酶(AP)两者表达呈阳性。
20.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中一个针或一个注射套管含有所述RPE细胞的至少一部分。
21.根据项目20所述的药物组合物，其中所述RPE细胞在装入所述针或注射套管时的浓度是介于约400个活细胞/μL与约2,000个活细胞/μL之间。
22.根据项目20或21所述的药物组合物，其中有待从所述针或注射套管递送的活RPE细胞的浓度是介于约333个活细胞/μL与约1,333个活细胞/μL之间、或介于约444个活细胞/μL与约1,766个活细胞/μL之间。
23.根据项目20至22中任一项所述的药物组合物，其中所述针或注射套管的直径是介于约0.3mm与约0.9mm之间。
24.根据项目20至22中任一项所述的药物组合物，其中所述针或注射套管的该直径是介于约0.5mm与约0.6mm之间。
25.根据项目20至24中任一项所述的药物组合物，其中所述针或注射套管包括具有介于约0.09mm与约0.15mm之间的直径的一个尖端。
26.根据项目20至25中任一项所述的药物组合物，其中所述套管是一个MEDONE
Figure BDA0003183443810001471
25/38g套管(具有0.12mm(38g)×5mm尖端的一个0.50mm(25g)×28mm套管)或一个Synergetics成角度的39g注射套管。
27.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞包含已冷冻保存且解冻的RPE细胞。
28.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞是人的。
29.如以上项目中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种血管生成抑制剂，该至少一种血管生成抑制剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
30.如项目29所述的药物组合物，其中所述一种或多种血管生成抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：哌加他尼钠；阿柏西普；贝伐西尼；雷怕霉素；AGN-745；维他兰尼；帕唑帕尼；NT-502；NT-503；PLG101；CPD791；抗-VEGF抗体或其功能性片段；贝伐单抗；兰尼单抗；抗-VEGFR1抗体；抗-VEGFR2抗体；抗-VEGFR3抗体；IMC-1121(B)；IMC-18F1；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap(阿柏西普)；AZD-2171(西地尼布)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；抑制VEGFR-1和/或VEGFR-2的TKI；索拉非尼(多吉美)；SU5416(司马沙尼)；SU11248/舒尼替尼(索坦)；凡德他尼(ZD 6474)；Ly317615(恩扎妥林)；抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段；伏洛昔单抗；3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基氨基)-甲基]-吡咯烷-3-基氧基}-乙酰基氨基)-2-(烷基-氨基)-丙酸；(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺酰基]氨基-3-[7-卞氧羰基-8-(2--吡啶基氨基甲基)-1-氧杂-2,7-二氮杂螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基氨基丙酸；EMD478761；或RC*D(硫代P)C*(Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys)(星号表示通过半胱氨酸残基以二硫键环化)；2-甲氧基雌二醇；αVβ3抑制剂；血管生成素2；血管抑制性类固醇和肝素；血管抑制素；血管抑制素相关分子；抗-组织蛋白酶S抗体；抗凝血酶III片段；钙网蛋白；卡斯达丁；羧基酰胺基三唑；软骨衍化血管生成抑制因子；CDAI；CM101；CXCL10；内皮生长抑制素；IFN-α；IFN-β；IFN-γ；IL-12；IL-18；IL-4；利诺胺；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；Meth-1；Meth-2；骨桥蛋白；哌加他尼；血小板因子-4；促乳素；增殖素相关蛋白；凝血酶原(kringle结构域-2)；静息蛋白；可溶NRP-1；可溶VEGFR-1；SPARC；SU5416；苏拉明；替可加兰；四硫钼酸盐；萨力多胺；雷利度胺；血栓粘合素；TIMP；TNP-470；TSP-1；TSP-2；血管形成抑制素；VEGFR抗拮剂；VEGI；伏洛昔单抗(M200)；纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；乐伐替尼(E7080)；莫特塞尼(AMG 706)；帕唑帕尼(福退癌)；VEGF的抑制剂；VEGFR1的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；α5β1整合蛋白的抑制剂；VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、和/或α5β1整合蛋白的肽、肽模拟物、小分子、化学品、和/或核酸抑制剂；IL-6抗拮剂；抗-IL-6抗体；及其任何组合；任选地以足以预防或治疗增生性(新生血管性)眼睛疾病的量。
31.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞是基因工程化的。
32.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞是从一种多能细胞产生的。
33.根据以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞是从基因工程化的一种多能细胞产生的。
34.根据项目31或33所述的药物组合物，其中所述基因工程化导致由所述RPE细胞产生抑制血管生成的一种或多种因子。
35.根据项目34所述的药物组合物，其中抑制血管生成的所述一种或多种因子包括选自下组的至少一种因子，该组由以下各项组成：纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；特异性抗-VEGF抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-VEGF受体抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段或结构域；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap；及其任何组合。
36.根据项目34至35中任一项所述的药物组合物，其中抑制血管生成的所述因子的产生通过一种RPE特异性启动子来调控。
37.根据项目36所述的药物组合物，其中所述RPE特异性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RPE65启动子、组织蛋白酶D近侧启动子、以及VMD2启动子。
38.根据项目32至37中任一项所述的药物组合物，其中所述多能干细胞对于一种或多种标记物呈阳性，这些标记物包括OCT-4、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。
39.根据项目32至38中任一项所述的药物组合物，其中所述多能细胞是人多能细胞，这些人多能细胞在一个多层群体或胚状体中培养，持续足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的一段时间。
40.根据项目39所述的药物组合物，其中足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的所述时间包括至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、或至少约7周、至少约8周。
41.根据项目39或40中任一项所述的药物组合物，其中所述多层群体或胚状体在包含DMEM的一种培养基中进行培养。
42.根据项目41所述的药物组合物，其中所述培养基包含，基本上由或由EB-DM组成。
43.根据项目39至42中任一项所述的药物组合物，其中对所述着色上皮细胞进行分离和培养，从而产生RPE细胞的群体。
44.根据项目43所述的药物组合物，其中所述分离包括使细胞或细胞块酶促地、化学地或物理地从该培养物解离，并且选择着色上皮细胞或包含着色上皮细胞的细胞块。
45.根据项目39至44中任一项所述的药物组合物，其中所述胚状体被悬浮培养。
46.根据项目39至45中任一项所述的药物组合物，其中所述胚状体作为一种附着培养物而培养。
47.根据项目46所述的药物组合物，其中作为一种附着培养物而培养的所述胚状体产生包含着色上皮细胞的一种或多种长出物。
48.根据项目32至47中任一项所述的药物组合物，其中所述多能干细胞具有降低的HLA抗原复杂性。
49.如项目32至48中任一项所述的药物组合物，其中在RPE形成之前，所述多能细胞在一种基质上进行培养。
50.如项目49所述的药物组合物，其中所述基质选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)、CellStart、人基底膜提取物、及其任何组合。
51.如项目49所述的药物组合物，其中所述基质包含Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)。
52.如以上项目中任一项所述的药物组合物，该药物组合物包含缺乏实质性表达一种或多种胚胎干细胞标记物的细胞。
53.根据项目52所述的药物组合物，其中所述一种或多种胚胎干细胞标记物包括OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。
54.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞对于一种或多种RPE细胞标记物呈阳性。
55.根据项目54所述的药物组合物，其中所述一种或多种RPE细胞标记物包括RPE65、CRALBP、PEDF、卵黄状黄斑病蛋白、MITF、Otx2、PAX2、PAX6、ZO-1、和/或酪氨酸酶。
56.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞通过一种方法来产生，该方法包括将RPE细胞维持作为休眠细胞，持续足以达到所述平均黑色素含量的一段时间。
57.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞通过一种方法来产生，该方法包括将RPE细胞维持作为休眠细胞，持续足以在所述RPE细胞的至少50％中建立卵黄状黄斑病蛋白表达的一段时间。
58.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含小鼠胚胎饲养细胞(MEF)和人胚胎干细胞(hES)。
59.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞通过一种方法来产生，该方法包括在增加一种或多种α整合蛋白亚单位的表达的条件下培养所述RPE细胞。
60.根据项目59所述的药物组合物，其中所述一种或多种α整合蛋白亚单位包括以下各项中的一种或多种：α整合蛋白亚单位1、α整合蛋白亚单位2、α整合蛋白亚单位3、α整合蛋白亚单位4、α整合蛋白亚单位5、α整合蛋白亚单位6、或α整合蛋白亚单位9。
61.根据项目59或60中任一项所述的药物组合物，其中所述条件包括暴露在锰下、暴露在一种抗-CD29抗体下、暴露在单克隆抗体HUTS-21下、暴露在单克隆抗体mAb TS2/16下、和/或对所述RPE细胞传代至少约4代。
62.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞满足表5中所列的至少一个标准。
63.如以上项目中任一项所述的药物组合物，其中所述RPE细胞是根据良好制造规范(GMP)来制造。
64.如以上项目中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂，该至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
65.如项目64所述的药物组合物，其中所述免疫抑制剂或免疫耐受剂包括以下各项中的一种或多种：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、
Figure BDA0003183443810001531
(抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、
Figure BDA0003183443810001532
(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、
Figure BDA0003183443810001533
(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、以及麦考酚酸酯。
66.一种试剂盒，该试剂盒包含如以上项目中任一项所述的药物组合物和一个单独的容器，该单独的容器包含体积足以将所述多个RPE细胞稀释到一个所希望的目标浓度的一种药学上可接受的稀释剂。
67.根据项目66所述的试剂盒，其中所述药学上可接受的稀释剂的该体积是以下这样的：使得将所述药学上可接受的稀释剂的整个体积与所述多个RPE细胞整体组合导致所述多个RPE细胞具有所述所希望的目标浓度。
68.根据项目66至67中任一项所述的试剂盒，其中所述药学上可接受的稀释剂的温度是介于约0℃与10℃之间，任选地介于约2℃与8℃之间。
69.根据项目66至68中任一项所述的试剂盒，其中所述多个RPE细胞或含有所述多个RPE细胞的药学上可接受的载体的温度是介于约0℃与10℃之间，任选地介于约2℃与8℃之间。
70.如项目66至69中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂，该至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
71.如项目70所述的试剂盒，其中所述免疫抑制剂或免疫耐受剂包括以下各项中的一种或多种：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、
Figure BDA0003183443810001541
(抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、
Figure BDA0003183443810001542
(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、
Figure BDA0003183443810001543
(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、以及麦考酚酸酯。
72.如项目66至71中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含一种或多种血管生成抑制剂，该一种或多种血管生成抑制剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
73.如项目72所述的试剂盒，其中所述一种或多种血管生成抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：哌加他尼钠；阿柏西普；贝伐西尼；雷怕霉素；AGN-745；维他兰尼；帕唑帕尼；NT-502；NT-503；PLG101；CPD791；抗-VEGF抗体或其功能性片段；贝伐单抗；兰尼单抗；抗-VEGFR1抗体；抗-VEGFR2抗体；抗-VEGFR3抗体；IMC-1121(B)；IMC-18F1；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap(阿柏西普)；AZD-2171(西地尼布)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；抑制VEGFR-1和/或VEGFR-2的TKI；索拉非尼(多吉美)；SU5416(司马沙尼)；SU11248/舒尼替尼(索坦)；凡德他尼(ZD 6474)；Ly317615(恩扎妥林)；抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段；伏洛昔单抗；3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基氨基)-甲基]-吡咯烷-3-基氧基}-乙酰基氨基)-2-(烷基-氨基)-丙酸；(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺酰基]氨基-3-[7-卞氧羰基-8-(2--吡啶基氨基甲基)-1-氧杂-2,7-二氮杂螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基氨基丙酸；EMD478761；或RC*D(硫代P)C*(Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys)(星号表示通过半胱氨酸残基以二硫键环化)；2-甲氧基雌二醇；αVβ3抑制剂；血管生成素2；血管抑制性类固醇和肝素；血管抑制素；血管抑制素相关分子；抗-组织蛋白酶S抗体；抗凝血酶III片段；钙网蛋白；卡斯达丁；羧基酰胺基三唑；软骨衍化血管生成抑制因子；CDAI；CM101；CXCL10；内皮生长抑制素；IFN-α；IFN-β；IFN-γ；IL-12；IL-18；IL-4；利诺胺；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；Meth-1；Meth-2；骨桥蛋白；哌加他尼；血小板因子-4；促乳素；增殖素相关蛋白；凝血酶原(kringle结构域-2)；静息蛋白；可溶NRP-1；可溶VEGFR-1；SPARC；SU5416；苏拉明；替可加兰；四硫钼酸盐；萨力多胺；雷利度胺；血栓粘合素；TIMP；TNP-470；TSP-1；TSP-2；血管形成抑制素；VEGFR抗拮剂；VEGI；伏洛昔单抗(M200)；纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；乐伐替尼(E7080)；莫特塞尼(AMG 706)；帕唑帕尼(福退癌)；VEGF的抑制剂；VEGFR1的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；α5β1整合蛋白的抑制剂；VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、和/或α5β1整合蛋白的肽、肽模拟物、小分子、化学品、和/或核酸抑制剂；IL-6抗拮剂；抗-IL-6抗体；及其任何组合；任选地以足以预防或治疗增生性(新生血管性)眼睛疾病的量。
74.一种冷冻保存的组合物，该冷冻保存的组合物包含：
多个冷冻保存的视网膜色素上皮(RPE)细胞，这些视网膜色素上皮细胞在冷冻时具有以下这样一个平均成熟度水平：使得在解冻后恢复的这些RPE细胞具有至少约60％的一个接种效率。
75.如项目74所述的冷冻保存的组合物，其中所述接种效率是至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。
76.如项目74或75所述的冷冻保存的组合物，其中所述平均成熟度水平通过测量代表所述多个冷冻保存的RPE细胞的一个细胞群体的平均黑色素含量来确定。
77.如项目74至76中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述多个冷冻保存的RPE细胞的该平均黑色素含量小于8pg/细胞。
78.一种冷冻保存的组合物，该冷冻保存的组合物包含：
多个冷冻保存的视网膜色素上皮(RPE)细胞；
其中所述多个冷冻保存的RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞。
79.根据项目74至78中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述细胞包含于一种冷冻保存培养基中。
80.根据项目79所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存培养基包含以下各项中的一种或多种：DMSO(二甲亚砜)、乙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、丙二醇、以及蔗糖。
81.根据项目79至80中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存培养基包含介于约5％与约50％之间的DMSO和介于约30％与约95％之间的血清，其中所述血清任选地是胎牛血清(FBS)。
82.根据项目79所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存培养基包含约90％FBS和约10％DMSO。
83.如项目78至82中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中在解冻后恢复的这些RPE细胞具有至少约60％的接种效率。
84.如项目83所述的冷冻保存的组合物，其中所述接种效率是至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。
85.根据项目74至84中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物在冷冻时包含介于约5,000与约1×108个之间的活RPE细胞。
86.根据项目74至85中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物在冷冻时包含介于约200,000与约10,000,000个之间、介于约20,000与约50,000,000个之间、介于约250,000与约5,000,000个之间、介于约500,000与约4,000,000个之间、或介于约1,000,000与约4,000,000个之间的活RPE细胞。
87.如项目74至86中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中在解冻后恢复的这些RPE细胞在冷冻后至少约3、6、9或12个月的某一时间具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的接种效率。
88.如项目74至87中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中在解冻后存活的这些细胞的至少85％在解冻后，在2℃与8℃之间储存时仍保持存活多达1小时、多达2小时、多达3小时、多达4小时、多达5小时或多达6小时。
89.如项目74至88中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中该冷冻保存的组合物包含少于约25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的不是RPE细胞的细胞。
90.如项目74至89中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞，且至少0.1pg/细胞，和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间、或介于1与5pg/细胞之间。
91.如项目74至90中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物中至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的这些细胞是卵黄状黄斑病蛋白+。
92.如项目74至91中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是PAX6+和/或MITF+。
93.如项目74至92中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是PAX6+和/或卵黄状黄斑病蛋白+。
94.如项目74至93中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的这些细胞是ZO-1+。
95.如项目74至94中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中该冷冻保存的组合物中至少50％、至少60％、或至少70％的这些细胞是PAX6+和卵黄状黄斑病蛋白+。
96.如项目74至95中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述冷冻保存的组合物中至少90％、至少95％、或至少99％的这些细胞是PAX6+。
97.如项目74至96中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中在所述冷冻保存的组合物中至多约一个细胞/百万细胞和任选地至多两个细胞/九百万细胞对于OCT-4和碱性磷酸酶(AP)两者表达呈阳性。
98.如项目74至97中任一项所述的冷冻保存的组合物，该冷冻保存的组合物进一步包含至少一种血管生成抑制剂，该至少一种血管生成抑制剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
99.如项目98所述的冷冻保存的组合物，其中所述一种或多种血管生成抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：哌加他尼钠；阿柏西普；贝伐西尼；雷怕霉素；AGN-745；维他兰尼；帕唑帕尼；NT-502；NT-503；PLG101；CPD791；抗-VEGF抗体或其功能性片段；贝伐单抗；兰尼单抗；抗-VEGFR1抗体；抗-VEGFR2抗体；抗-VEGFR3抗体；IMC-1121(B)；IMC-18F1；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap(阿柏西普)；AZD-2171(西地尼布)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；抑制VEGFR-1和/或VEGFR-2的TKI；索拉非尼(多吉美)；SU5416(司马沙尼)；SU11248/舒尼替尼(索坦)；凡德他尼(ZD 6474)；Ly317615(恩扎妥林)；抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段；伏洛昔单抗；3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基氨基)-甲基]-吡咯烷-3-基氧基}-乙酰基氨基)-2-(烷基-氨基)-丙酸；(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺酰基]氨基-3-[7-卞氧羰基-8-(2--吡啶基氨基甲基)-1-氧杂-2,7-二氮杂螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基氨基丙酸；EMD478761；或RC*D(硫代P)C*(Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys)(星号表示通过半胱氨酸残基以二硫键环化)；2-甲氧基雌二醇；αVβ3抑制剂；血管生成素2；血管抑制性类固醇和肝素；血管抑制素；血管抑制素相关分子；抗-组织蛋白酶S抗体；抗凝血酶III片段；钙网蛋白；卡斯达丁；羧基酰胺基三唑；软骨衍化血管生成抑制因子；CDAI；CM101；CXCL10；内皮生长抑制素；IFN-α；IFN-β；IFN-γ；IL-12；IL-18；IL-4；利诺胺；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；Meth-1；Meth-2；骨桥蛋白；哌加他尼；血小板因子-4；促乳素；增殖素相关蛋白；凝血酶原(kringle结构域-2)；静息蛋白；可溶NRP-1；可溶VEGFR-1；SPARC；SU5416；苏拉明；替可加兰；四硫钼酸盐；萨力多胺；雷利度胺；血栓粘合素；TIMP；TNP-470；TSP-1；TSP-2；血管形成抑制素；VEGFR抗拮剂；VEGI；伏洛昔单抗(M200)；纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；乐伐替尼(E7080)；莫特塞尼(AMG 706)；帕唑帕尼(福退癌)；VEGF的抑制剂；VEGFR1的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；α5β1整合蛋白的抑制剂；VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、和/或α5β1整合蛋白的肽、肽模拟物、小分子、化学品、和/或核酸抑制剂；IL-6抗拮剂；抗-IL-6抗体；以及其任何组合；任选地量足以预防或治疗增生性(新生血管性)眼睛疾病。
100.如项目74至99中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述RPE细胞是基因工程化的。
101.如项目74至100中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述RPE细胞是从一种多能细胞产生的。
102.如项目74至101中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述RPE细胞是从基因工程化的一种多能细胞产生的。
103.根据项目101或102所述的冷冻保存的组合物，其中所述基因工程化导致由所述RPE细胞产生抑制血管生成的一种或多种因子。
104.根据项目103所述的冷冻保存的组合物，其中抑制血管生成的所述一种或多种因子包括选自下组的至少一种因子，该组由以下各项组成：纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；特异性抗-VEGF抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-VEGF受体抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段或结构域；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap；及其任何组合。
105.根据项目103至104中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中抑制血管生成的所述因子的产生通过一种RPE特异性启动子来调控。
106.根据项目105所述的冷冻保存的组合物，其中所述RPE特异性启动子选自下组，该组由以下各项组成：RPE65启动子、组织蛋白酶D近侧启动子、以及VMD2启动子。
107.根据项目101至106中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述多能干细胞对于一种或多种标记物呈阳性，这些标记物包括OCT-4、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。
108.根据项目101至107中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述多能细胞是人多能细胞，这些人多能细胞在一个多层群体或胚状体中培养，持续足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的一段时间。
109.根据项目108所述的冷冻保存的组合物，其中足以使着色上皮细胞出现在所述培养物中的所述时间包括至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、或至少约7周、至少约8周。
110.根据项目108或109中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述多层群体或胚状体在包含DMEM的一种培养基中进行培养。
111.根据项目110所述的冷冻保存的组合物，其中所述培养基包含，基本上由或由EB-DM组成。
112.根据项目108至111中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中对所述着色上皮细胞进行分离和培养，从而产生RPE细胞的群体。
113.根据项目112所述的冷冻保存的组合物，其中所述分离包括使细胞或细胞块酶促地、化学地或物理地从该培养物解离，并且选择着色上皮细胞或包含着色上皮细胞的细胞块。
114.根据项目108至113中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述胚状体被悬浮培养。
115.根据项目108至114中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述胚状体作为一种附着培养物而培养。
116.根据项目115所述的冷冻保存的组合物，其中作为一种附着培养物而培养的所述胚状体产生包含着色上皮细胞的一种或多种长出物。
117.根据项目108至116中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中所述多能干细胞具有降低的HLA抗原复杂性。
118.如项目108至117中任一项所述的冷冻保存的组合物，其中在RPE形成之前，所述多能细胞在一种基质上进行培养。
119.如项目118所述的冷冻保存的组合物，其中所述基质选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)、CellStart、人基底膜提取物、及其任何组合。
120.如项目118所述的冷冻保存的组合物，其中所述基质包含Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)。
121.如项目74至120中任一项所述的冷冻保存的组合物，该冷冻保存的组合物包含缺乏实质性表达一种或多种胚胎干细胞标记物的细胞。
122.根据项目121所述的组合物，其中所述一种或多种胚胎干细胞标记物包括OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-80。
123.如项目74至122中任一项所述的组合物，其中所述RPE细胞对于一种或多种RPE细胞标记物呈阳性。
124.根据项目123所述的组合物，其中所述一种或多种RPE细胞标记物包括RPE65、CRALBP、PEDF、卵黄状黄斑病蛋白、MITF、Otx2、PAX2、PAX6、ZO-1、和/或酪氨酸酶。
125.如项目74至124中任一项所述的组合物，其中所述RPE细胞通过一种方法来产生，该方法包括将RPE细胞维持作为休眠细胞，持续足以达到所述平均黑色素含量的一段时间。
126.如项目74至125中任一项所述的组合物，其中所述RPE细胞通过一种方法来产生，该方法包括将RPE细胞维持作为休眠细胞，持续足以在所述RPE细胞的至少50％中建立卵黄状黄斑病蛋白表达的一段时间。
127.如项目74至126中任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上不含小鼠胚胎饲养细胞(MEF)和人胚胎干细胞(hES)。
128.如项目74至127中任一项所述的组合物，其中所述RPE通过一种方法来产生，该方法包括在增加一种或多种α整合蛋白亚单位的表达的条件下培养所述RPE细胞。
129.根据项目128所述的组合物，其中所述一种或多种α整合蛋白亚单位包括以下各项中的一种或多种：α整合蛋白亚单位1、α整合蛋白亚单位2、α整合蛋白亚单位3、α整合蛋白亚单位4、α整合蛋白亚单位5、α整合蛋白亚单位6、或α整合蛋白亚单位9。
130.根据项目128或129中任一项所述的组合物，其中所述条件包括暴露在锰下、暴露在一种抗-CD29抗体下、暴露在单克隆抗体HUTS-21下、暴露在单克隆抗体mAb TS2/16下、和/或对所述RPE细胞传代至少约4代。
131.如项目74至130中任一项所述的组合物，其中所述RPE细胞满足表5中所列的至少一个标准。
132.如项目74至131中任一项所述的组合物，其中所述RPE细胞根据优质生产规范(GMP)来生产。
133.如项目74至132中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂，该至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些RPE细胞一起给与有需要的受试者。
134.如项目133所述的组合物，其中所述免疫抑制剂或免疫耐受剂包括以下各项中的一种或多种：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、
Figure BDA0003183443810001631
(抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、
Figure BDA0003183443810001632
(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、
Figure BDA0003183443810001641
(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、以及麦考酚酸酯。
135.一种试剂盒，该试剂盒包含如项目74至134中任一项所述的组合物和一个单独的容器，该单独的容器包括体积足以将所述多个RPE细胞稀释到一个所希望的目标浓度的一种药学上可接受的稀释剂。
136.根据项目135所述的试剂盒，其中所述药学上可接受的稀释剂的该体积是以下这样的：使得将所述药学上可接受的稀释剂的整个体积与所述多个RPE细胞整体组合导致所述多个RPE细胞具有所述所希望的目标浓度。
137.如项目135至136中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包括至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂，该至少一种免疫抑制剂或免疫耐受剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
138.如项目137所述的试剂盒，其中所述免疫抑制剂或免疫耐受剂包括以下各项中的一种或多种：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、
Figure BDA0003183443810001642
(抗-IL-2Rα受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、
Figure BDA0003183443810001643
(抗-IL-2Rα受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、
Figure BDA0003183443810001644
(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、以及麦考酚酸酯。
139.如项目135至138中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包括一种或多种血管生成抑制剂，该一种或多种血管生成抑制剂在所述RPE细胞之前、同时、之后和/或与这些细胞一起给与有需要的受试者。
140.如项目139所述的试剂盒，其中所述一种或多种血管生成抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：哌加他尼钠；阿柏西普；贝伐西尼；雷怕霉素；AGN-745；维他兰尼；帕唑帕尼；NT-502；NT-503；PLG101；CPD791；抗-VEGF抗体或其功能性片段；贝伐单抗；兰尼单抗；抗-VEGFR1抗体；抗-VEGFR2抗体；抗-VEGFR3抗体；IMC-1121(B)；IMC-18F1；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap(阿柏西普)；AZD-2171(西地尼布)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)；抑制VEGFR-1和/或VEGFR-2的TKI；索拉非尼(多吉美)；SU5416(司马沙尼)；SU11248/舒尼替尼(索坦)；凡德他尼(ZD 6474)；Ly317615(恩扎妥林)；抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段；伏洛昔单抗；3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基氨基)-甲基]-吡咯烷-3-基氧基}-乙酰基氨基)-2-(烷基-氨基)-丙酸；(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺酰基]氨基-3-[7-卞氧羰基-8-(2--吡啶基氨基甲基)-1-氧杂-2,7-二氮杂螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基氨基丙酸；EMD478761；或RC*D(硫代P)C*(Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys)(星号表示通过半胱氨酸残基以二硫键环化)；2-甲氧基雌二醇；αVβ3抑制剂；血管生成素2；血管抑制性类固醇和肝素；血管抑制素；血管抑制素相关分子；抗-组织蛋白酶S抗体；抗凝血酶III片段；钙网蛋白；卡斯达丁；羧基酰胺基三唑；软骨衍化血管生成抑制因子；CDAI；CM101；CXCL10；内皮生长抑制素；IFN-α；IFN-β；IFN-γ；IL-12；IL-18；IL-4；利诺胺；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；Meth-1；Meth-2；骨桥蛋白；哌加他尼；血小板因子-4；促乳素；增殖素相关蛋白；凝血酶原(kringle结构域-2)；静息蛋白；可溶NRP-1；可溶VEGFR-1；SPARC；SU5416；苏拉明；替可加兰；四硫钼酸盐；萨力多胺；雷利度胺；血栓粘合素；TIMP；TNP-470；TSP-1；TSP-2；血管形成抑制素；VEGFR抗拮剂；VEGI；伏洛昔单抗(M200)；纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；乐伐替尼(E7080)；莫特塞尼(AMG 706)；帕唑帕尼(福退癌)；VEGF的抑制剂；VEGFR1的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；VEGFR2的抑制剂；α5β1整合蛋白的抑制剂；VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、和/或α5β1整合蛋白的肽、肽模拟物、小分子、化学品、和/或核酸抑制剂；IL-6抗拮剂；抗-IL-6抗体；及其任何组合；任选地以足以预防或治疗增生性(新生血管性)眼睛疾病的量。
141.一种生产用于在药物制剂中使用的视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：
(a)在附着条件下培养PPE细胞以便形成具有一种鹅卵石形态的着色RPE细胞的一个实质上单层的培养物；并且
(b)从该培养物选择并分离RPE细胞以用于冷冻保存或药物配制，其中在分离时所分离的着色RPE细胞群体具有小于8pg/细胞的平均黑色素含量。
142.如项目141所述的方法，其中分离至少106个RPE细胞用于冷冻保存或药物配制。
143.如项目141或142所述的方法，其中所述RPE细胞是从多能干细胞产生的，其中所述多能干细胞任选地是人胚胎干细胞或人iPS细胞。
144.如项目141至143中任一项所述的方法，其中平均黑色素含量是针对排除了5％着色最多和5％着色最少的所分离的RPE细胞的细胞群体来进行确定。
145.如项目141至155中任一项所述的方法，其中所述平均黑色素含量小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞，且至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间、或介于1与5pg/细胞之间。
146.一种生产用于在药物制剂中使用的视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：
(a)在附着条件下培养PPE细胞以便形成具有一种鹅卵石形态的着色RPE细胞的一个实质上单层的培养物；
(b)在这些RPE细胞达到大于8pg/细胞的平均黑色素含量之前的某一时刻对这些RPE细胞传代至少一次；并且
(c)任选地，在该一次或多次传代之后，收获RPE细胞用于冷冻保存或药物配制，其中在收获时，所述RPE细胞具有小于8pg/细胞的平均黑色素含量。
147.一种生产视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，该方法包括：
(a)培养多能干细胞以便形成胚状体(EB)或培养多能干细胞以便形成一个多层群体，其中所述多能干细胞任选地是人胚胎干细胞或人iPS细胞；
(b)将该多层细胞群体或EB培养持续足以使着色细胞出现的一段时间，这些细胞包含分散在它们的细胞质中的褐色色素；并且
(c)分离并培养(b)的这些着色细胞以便产生含有RPE细胞的一个培养的群体，这些细胞具有小于8pg/细胞的一个平均色素沉着水平。
148.如项目147所述的方法，其中步骤(b)包括培养所述胚状体以便形成一种附着培养物。
149.如项目147所述的方法，其中步骤(a)包括允许多能细胞的一个培养物过度生长，从而形成一个多层群体。
150.如项目147至149中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在一个低附着基底上培养所述多能细胞或使用一种悬滴方法培养所述多能细胞，从而从所述多能细胞形成胚状体。
151.如项目147至150中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是诱导的多能干(iPS)细胞、胚胎干(ES)细胞、成人干细胞、造血干细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞、多能干细胞、或胚胎生殖细胞。
152.如项目147至150中任一项所述的方法，其中这些多能干细胞是人ES细胞或人iPS细胞。
153.如项目147至152中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是基因工程化的。
154.如项目153所述的方法，其中所述基因工程化导致由所述RPE细胞产生抑制血管生成的一种因子。
155.如项目154所述的方法，其中抑制血管生成的所述一种或多种因子包括选自下组的至少一种因子，该组由以下各项组成：纤连蛋白片段或结构域；阿纳特林；特异性抗-VEGF抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-VEGF受体抗体或其功能性片段或结构域；特异性抗-α5β1整合蛋白抗体或其功能性片段或结构域；VEGF的片段或结构域；VEGFR受体的片段或结构域；VEGF-Trap；及其任何组合。
156.如项目147至155中任一项所述的方法，其中步骤(a)中形成的这些胚状体和/或步骤(c)中培养的这些着色细胞的培养基包含DMEM。
157.如项目147至155所述的方法，其中步骤(a)中形成的这些胚状体和/或步骤(c)中培养的这些着色细胞的所述培养基包含，基本上由，或由EB-DM组成。
158.如项目147至156中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中培养的所述着色细胞的该培养基包含EB-DM。
159.如项目147至155中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中培养的所述着色上皮细胞的所述培养基包含，基本上由或由RPE-GM/MM组成。
160.如项目147至159中任一项所述的方法，其中步骤(b)中培养的持续时间是至少约1、2、3、4、5、6、7或8周，或至少约1、2、3、4、5或6个月。
161.如项目147至160中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(b)或(c)中使用的该培养基是EB-DM、RPE-GM/MM、MDBK-GM、OptiPro SFM、VP-SFM、EGM-2或MDBK-MM。
162.如项目147至161中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括使该培养物与选自下组的一种酶相接触，该组由以下成分组成：胰蛋白酶、胶原酶、分散酶、木瓜蛋白酶、胶原酶与分散酶的混合物、以及胶原酶与胰蛋白酶的混合物，或包括该培养物的机械破坏或分离，或包括使该培养物与EDTA或EGTA相接触，从而破坏所述着色细胞与该培养基底的附着。
163.如项目147至162中任一项所述的方法，其中这些多能干细胞具有降低的HLA抗原复杂性。
164.如项目147至163中任一项所述的方法，其中这些RPE细胞缺乏一种或多种胚胎干细胞标记物的实质性表达。
165.如项目164所述的方法，其中所述一种或多种胚胎干细胞标记物是OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、DPPA-2、和/或DPPA-4。
166.如项目147至165中任一项所述的方法，其中这些RPE细胞对于至少一种RPE细胞标记物呈阳性。
167.如项目166所述的方法，其中所述至少一种RPE细胞标记物包括以下各项中的一种或多种：RPE65、CRALBP、PEDF、卵黄状黄斑病蛋白、MITF、Otx2、PAX2、PAX6或酪氨酸酶或任选地PAX6和卵黄状黄斑病蛋白。
168.如项目147至167中任一项所述的方法，进一步包括在增加α整合蛋白亚单位表达的条件下培养所述RPE细胞。
169.如项目168所述的方法，其中所述α整合蛋白亚单位是1至6或9。
170.如项目168或169所述的方法，其中所述条件包括暴露在锰下、暴露在针对CD29的一种抗体下、或对所述RPE细胞传代至少约4代。
171.如项目170所述的方法，其中所述针对CD29的抗体是一种单克隆抗体，任选地是HUTS-21或TS2/16。
172.如项目147至171中任一项所述的方法，其中用于繁殖富集的RPE细胞培养物的培养基不支持未分化的多能干细胞的生长或维持。
173.如项目147至172中任一项所述的方法，其中这些RPE细胞满足表5中所列举的至少一个标准。
174.如项目147至173中任一项所述的方法，其中所述方法根据优质生产规范(GMP)来进行。
175.如项目147至174中任一项所述的方法，其中所述EB在一种rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂存在下形成。
176.如项目175所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。
177.如项目175或176所述的方法，其中在所述RPE形成之前，所述多能细胞在Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)上培养。
178.一种用于产生富集的人视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法，该方法包括：
(a)提供一个人胚胎干(hES)细胞多层群体；
(b)在不维持所述hES细胞的未分化状态的条件下，将所述hES细胞多层群体培养足以允许推定的人RPE细胞出现的一段时间，其中所述推定的人RPE细胞包含分散在它们的细胞质中的褐色色素；
(c)从步骤(b)的该培养物中选择一个或多个所述推定的人RPE细胞；并且
(d)培养步骤(c)中获得的所述人RPE细胞以便形成含有细胞的培养物，这些细胞是卵黄状黄斑病蛋白+，并且展现出特征性的鹅卵石、多边形、上皮样外观，并且包含分散在它们的细胞质中的褐色色素，从而产生富集的人RPE细胞群体。
179.一种用于产生富集的人视网膜色素上皮(RPE)细胞群体的方法，该方法包括：
(a)提供一种人ES(hES)细胞培养物；
(b)培养这些hES细胞以便产生一个或多个胚状体；
(c)将所述一个或多个胚状体培养足以使推定的人RPE细胞出现在所述一个或多个胚状体中的至少一个中的一段时间，其中所述推定的人RPE细胞包含分散在它们的细胞质中的褐色色素，借此形成含有推定的人RPE细胞的一个或多个胚状体；
(d)从步骤(c)的该培养物中选择并解离含有推定的人RPE细胞的所述胚状体中的一个或多个以便获得人RPE细胞；并且
(e)培养步骤(d)中获得的所述人RPE细胞以便形成含有细胞的培养物，这些细胞是卵黄状黄斑病蛋白+，并且展现出特征性的鹅卵石、多边形、上皮样外观，并且包含分散在它们的细胞质中的褐色色素，从而产生富集的人RPE细胞群体。
180.项目178或179所述的方法，其中步骤(b)中的所述培养包括在缺乏外源添加的FGF的培养基中培养。
181.项目180所述的方法，其中步骤(b)中的所述培养包括在缺乏外源添加的LIF的培养基中培养。
182.项目181所述的方法，其中步骤(b)中的所述培养包括在缺乏外源添加的
Figure BDA0003183443810001711
(一种含有5g血浆蛋白/100mL，用碳酸钠缓冲并且用0.005M辛酸钠和0.004M乙酰色氨酸稳定，所述血浆蛋白包含约88％正常人白蛋白、12％α和β球蛋白、以及至多1％γ球蛋白，并且含有145mEq/L钠、0.25mEq/L钾以及100mEq/L氯的水溶液)的培养基中培养。
183.项目178至183中任一项所述的方法，其中步骤(b)中培养的该持续时间是约6周。
184.项目178至183中任一项所述的方法，其中步骤(b)中培养的该持续时间是介于约4周与约5个月之间，介于约7周与约4个月之间，介于约3个月与约5个月之间，或介于约6周与约8周之间。
185.项目178至183中任一项所述的方法，其中步骤(b)中培养的该持续时间是介于约3个月与约5个月之间。
186.项目178至185中任一项所述的方法，其中所得的RPE细胞培养物含有RPE细胞，这些细胞是卵黄状黄斑病蛋白+、CRALBP+、PEDF+、以及RPE65+。
187.项目186中任一项所述的方法，其中所得到的RPE细胞培养物缺乏选自下组的至少一种ES细胞标记物，该组由以下各项组成：Oct4和Sox2。
188.项目178至187中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，所述hES细胞在外源添加的FGF的存在下进行培养。
189.项目178至188中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，所述hES细胞在外源添加的FGF和LIF的存在下进行培养。
190.项目178至188中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，所述hES细胞在外源添加的FGF、
Figure BDA0003183443810001721
(一种含有5g血浆蛋白/100mL，用碳酸钠缓冲并且用0.005M辛酸钠和0.004M乙酰色氨酸稳定，所述血浆蛋白包含约88％正常人白蛋白、12％α和β球蛋白、以及至多1％γ球蛋白，并且含有145mEq/L钠、0.25mEq/L钾以及100mEq/L氯的水溶液)以及一个成纤维细胞饲养层的存在下进行培养。
191.项目178至190中任一项所述的方法，该方法产生含有小于8pg/细胞的平均黑色素含量的一个RPE细胞群体。
192.项目191所述的方法，其中所述平均黑色素含量小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞，且至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间、或介于1与5pg/细胞之间。
193.项目191或192中任一项所述的方法，进一步包括将所述RPE细胞维持作为休眠细胞持续足以达到所述黑色素含量的一段时间。
194.项目179至193中任一项所述的方法，其中在RPE形成之前，所述多能细胞在一种基质上进行培养。
195.项目194所述的方法，其中所述基质选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)、CellStart、人基底膜提取物、及其任何组合。
196.项目194所述的方法，其中所述基质包含Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)。
197.项目179至196中任一项所述的方法，其中所述EB在一种rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂存在下形成。
198.项目197所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。
199.项目197或198所述的方法，其中在所述RPE形成之前，所述多能细胞在Matrigel(TM)(来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的一种可溶制剂)上培养。
200.项目178至199中任一项所述的方法，其中所得的RPE细胞培养物含有作为Pax6+的RPE细胞。
201.项目178至200中任一项所述的方法，其中所得的RPE细胞培养物含有作为Pax6-的RPE细胞。
202.一种药物制剂，该药物制剂包含通过如项目178至201中任一项所述的方法产生的RPE细胞。
203.一种包含适于治疗视网膜变性的RPE细胞的药物制剂，其中所述RPE细胞含有小于8pg/细胞的平均黑色素含量，并且其中所述RPE细胞具有以下特性中的至少一个：
在移植后维持它们的表型持续至少约一个月，
在培养中维持它们的表型持续至少约一个月，
在移植后整合到宿主中，
在移植之后基本上不增殖，
是噬菌性的，
递送、代谢或储存维生素A，
在移植后在视网膜与脉络膜之间传输铁，
在移植后附着到布鲁赫氏膜上，
在移植后吸收杂散光，
具有提高的α整合蛋白亚单位的表达，
具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更长的平均端粒长度，
在培养中具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大的复制寿命，
具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更高的一种或多种α整合蛋白亚单位的表达，
具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的A2E含量，
具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的脂褐质含量，
展现出比来源于捐赠人组织的RPE细胞更少的累积的紫外线损伤，或
含有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大数量的吞噬体。
204.一种包含适于治疗视网膜变性的RPE细胞的药物制剂，其中所述RPE细胞含有小于8pg/细胞的平均黑色素含量，并且其中所述RPE细胞可以具有以下特性中的至少一个：
在移植后附着到布鲁赫氏膜上，
在移植后吸收杂散光，
具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更长的平均端粒长度，
在培养中具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更长的复制寿命，具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的A2E含量，
具有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更低的脂褐质含量，
展现出比来源于捐赠人组织的RPE细胞更少的累积的紫外线损伤，或
含有比来源于捐赠人组织的RPE细胞更大数量的吞噬体。
205.项目202至204中任一项所述的药物制剂，其中所述平均黑色素含量小于8pg/细胞、小于7pg/细胞、小于6pg/细胞、小于5pg/细胞、小于4pg/细胞、小于3pg/细胞、小于2pg/细胞，且至少0.1pg/细胞和任选地至少0.5pg/细胞或1pg/细胞；介于0.1与8pg/细胞之间、介于0.1与7pg/细胞之间、介于0.1与6pg/细胞之间、介于0.1与5pg/细胞之间、介于0.1与4pg/细胞之间、介于0.1与3pg/细胞之间、介于0.1与2pg/细胞之间、介于0.1与1pg/细胞之间、介于1与7pg/细胞之间、介于0.5与6pg/细胞之间或介于1与5pg/细胞之间。
206.一种药物制剂，该药物制剂包含已解冻的根据项目74至134中任一项所述的冷冻保存的RPE细胞或根据项目135至140中任一项所述的试剂盒中所含有的冷冻保存的RPE细胞，其中所述RPE细胞在一种药学上可接受的载体中构成。
207.一种药物制剂，该药物制剂包含根据项目1至73中任一项所述的组合物或试剂盒的RPE细胞。
208.根据项目202至207中任一项所述的药物制剂，其用于在治疗视网膜变性中使用。
209.根据项目202至208中任一项所述的药物制剂，该药物制剂包含对于预防或治疗有此需求的患者中的视网膜变性有效量的RPE细胞，该视网膜变性是由于以下各项所致：斯图加特氏疾病、干性或湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、无脉络膜、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜发育异常、视网膜萎缩、血管样纹症、或近视性黄斑变性。
210.根据项目202至209中任一项所述的药物制剂，其中该制剂被配制用于以可注射的形式如悬浮液、凝胶或胶体来移植。
211.根据项目202至210中任一项所述的药物制剂，其中该制剂被配制用于与基质、基底、支架或移植物一起进行移植。
212.根据项目202至211中任一项所述的药物制剂，其中该制剂被配制用于对眼睛的视网膜下腔给药。
213.根据项目202至212中任一项所述的药物制剂，其中该制剂包含至少约103至109个RPE细胞，介于约10,000与约106个RPE细胞，介于约25,000与约400,000个RPE细胞，或介于约50,000与约200,000个RPE细胞。
214.根据项目202至213中任一项所述的药物制剂，其中这些RPE细胞缺乏一种或多种胚胎干细胞标记物的实质性表达。
215.项目214所述的药物制剂，其中所述一种或多种胚胎干细胞标记物是OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-1、DPPA-2、和/或DPPA-4。
216.根据项目202至215中任一项所述的药物制剂，其中这些RPE细胞对于该至少一种RPE细胞标记物呈阳性。
217.项目216所述的药物制剂，其中所述至少一种RPE细胞标记物包括以下各项中的至少一种：RPE65、CRALBP、PEDF、卵黄状黄斑病蛋白、MITF、Otx2、PAX2、PAX6或酪氨酸酶。
218.根据项目202至217中任一项所述的药物制剂，其中这些RPE细胞展现出提高的α整合蛋白亚单位表达。
219.项目208所述的药物制剂，其中所述α整合蛋白亚单位是α1、2、3、4、5、6或9。
220.根据项目202至219中任一项所述的药物制剂，其中这些RPE细胞满足表5中所列的至少一个标准。
221.根据项目202至220任一项所述的药物制剂，其中该制剂包含至少约75％的RPE细胞。
222.根据项目202至221中任一项所述的药物制剂，其中该制剂基本上不含病毒、细菌或真菌污染。
223.根据项目202至222中任一项所述的药物制剂，其中该制剂被配制在一种药学上可接受的载体中。
224.根据项目202至223中任一项所述的药物制剂，其中该制剂被配制用于对眼睛给药。
225.项目224所述的药物制剂，其中该制剂被配制用于对视网膜下腔给药。
226.根据项目202至225中任一项所述的药物制剂，其中这些RPE细胞是能够在移植后整合到视网膜中的功能性RPE细胞。
227.根据项目202至226中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂基本上不含小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和人胚胎干细胞(hES)。
228.根据项目202至227中任一项所述的药物制剂，其中该制剂符合良好制造规范(GMP)。
229.一种治疗视网膜变性病症或其中RPE细胞移植在治疗上是希望的其他病症的方法，该方法包括将有效治疗所述视网膜变性病症或其中RPE细胞移植在治疗上是希望的其他病症的量的以下物质施用于有此需求的受试者的眼睛：包含根据项目1至140中任一项所述的组合物或试剂盒的这些RPE细胞的药物制剂，根据项目202至228中任一项所述的药物制剂，或根据项目147至201中任一项所述的方法生产的RPE细胞。
230.项目229所述的方法，其中该视网膜变性病症包括无脉络膜、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性(干性或湿性)、视网膜脱离、色素性视网膜炎、斯图加特氏疾病、血管样纹症、或近视性黄斑变性。
231.项目229或230所述的方法，其中所述施用步骤包括将所述RPE细胞眼内施用于有此需求的眼睛中。
232.项目231所述的方法，其中所述眼内施用包括将所述RPE细胞注射到视网膜下腔中。
233.项目232所述的方法，其中所述眼内施用包括将一种水溶液、任选地是一种等渗溶液和/或一种生理食盐水溶液注射到该视网膜下腔中，从而形成一个预水泡，并且去除所述水溶液，之后将所述RPE细胞施用于与所述水溶液相同的视网膜下腔中。
234.项目232或232所述的方法，其中所述注射是通过一个针或注射套管。
235.项目234所述的方法，其中所述针或注射套管的直径是介于约0.3mm与0.9mm之间、或介于约0.5mm与约0.6mm之间。
236.项目234至235中任一项所述的方法，其中所述针或注射套管包括具有介于约0.09mm与约0.15mm之间的直径的一个尖端。
237.项目234至236中任一项所述的方法，其中所述套管是一个MEDONE
Figure BDA0003183443810001791
25/38g套管(具有0.12mm(38g)×5mm尖端的一个0.50mm(25g)×28mm套管)。
238.项目229至237中任一项所述的方法，其中治疗的有效性通过用以下各项中的一种或多种测定视力结果来评定：裂隙灯生物显微照相术、眼底照相术、IVFA和SD-OCT、以及最佳矫正视敏度(BCVA)。
239.项目229至238中任一项所述的方法，该方法使矫正视敏度(BCVA)改善和/或使早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)视敏度图表上可读取的字母增加。
240.项目239所述的方法，其中视网膜变性的所述病症是干性AMD或斯图加特氏疾病。
241.项目229至240中任一项所述的方法，其中所述有效治疗所述视网膜变性病症的量是介于约20,000与200,000个RPE细胞之间，介于约20,000与500,000个RPE细胞之间，介于约20,000与2,000,000个RPE细胞之间，或至少约20,000个RPE细胞。
242.项目241所述的方法，其中所述有效治疗所述视网膜变性病症的量是至少约20,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000、200,000或500,000个RPE细胞。
243.项目229至242中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述RPE细胞的所述施用之前或同时不被施用一种皮质类固醇。
244.项目229至242中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述RPE细胞的所述给与之前的至少3、6、12、24、48、72或96小时内或在所述RPE细胞的所述施用的同时不被施用一种皮质类固醇。
245.项目229至244中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述RPE细胞的所述施用之前的至少1小时内或在所述RPE细胞的所述施用之前不久或在所述RPE细胞的所述施用的同时不被施用一种皮质类固醇。
246.项目229至245中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述RPE细胞的所述施用之后的至少12、24、48、72或96小时内不被施用一种皮质类固醇。
247.如项目229至245中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述RPE细胞的所述施用之后的至少48小时内不被施用一种皮质类固醇。
248.如项目229至247中任一项所述的方法，其中所述RPE细胞与选自下组的一种或多种试剂组合施用于患者，该组由以下物质组成：血管生成抑制剂、抗氧化剂、抗氧化剂辅助因子、促使抗氧化活性增加的其他因子、黄斑叶黄素、长链Ω-3脂肪酸、淀粉样蛋白抑制剂、CNTF激动剂、RPE65的抑制剂、靶向A2E和/或脂褐质累积的因子、感光细胞功能和/或代谢的下调剂或抑制剂、α2-肾上腺素能受体激动剂、选择性血清素1A激动剂、靶向C-5的因子、膜攻击复合物(C5b-9)和任何其它玻璃疣组分、免疫抑制剂、以及预防或治疗脂褐质累积的试剂。
249.根据项目248所述的方法，其中所述一种或多种试剂在所述RPE细胞制剂同时、之前和/或之后施用于所述患者。
250.根据项目1至140或202至228中任一项所述的组合物、试剂盒或药物制剂在生产用于治疗视网膜变性病症或其中RPE细胞移植在治疗上是希望的其他病症的药物中的用途。
251.如项目250所述的用途，其中该视网膜变性病症包括无脉络膜、糖尿病性视网膜病、干性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、视网膜脱离、色素性视网膜炎、斯图加特氏疾病、血管样纹症、或近视性黄斑变性。
252.如项目147至201中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞表达选自下组的一种或多种标记物，该组由以下各项组成：OCT-4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、以及TRA-1-80。
253.如项目1至140或202至228中任一项所述的组合物、试剂盒或药物制剂，其中所述RPE细胞展现出以下特征中的一种或多种：
复制寿命比从其他来源获得的RPE细胞的复制寿命更长；
平均端粒长度是hESC和/或人iPS细胞的端粒长度(或hESC和/或人iPS细胞的群体的平均值)的至少30％，或是hESC和/或人iPS细胞的端粒长度的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％；
平均末端限制性片段长度(TRF)长于4kb，或长于5、6、7、8、9、10、11、12或甚至13kb，或10kb或更长；
平均脂褐质含量是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的50％以下，或是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的40％、30％、20％或10％以下；
平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的50％以下，或从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的40％、30％、20％或10％以下；
平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量小于50ng/105(100,000)细胞；
感光细胞外部片段(POS)的吞噬率比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的POS的吞噬率至少大50％，或比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的POS的吞噬率至少大75％、100％、150％或200％；
感光细胞外部片段(POS)的吞噬率是24小时之后POS的总浓度的至少20％，或是24小时之后POS的总浓度的至少25％、30％、25％、40％或50％；
与从成人宿主分离的RPE细胞相比较降低水平的累积氧化应力和/或DNA损伤；
平均蛋白酶体活性比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均蛋白酶体活性至少大50％，或比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均蛋白酶体活性至少大60％、70％、80％、90％或100％；
平均泛素蛋白缀合物累积是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均泛素蛋白缀合物累积的50％以下，或是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均泛素蛋白缀合物累积的40％、30％、20％或甚至10％以下。
254.项目1至140或202至228中任一项所述的组合物、试剂盒或药物制剂，其中所述RPE细胞展现出以下特征中的一种或多种：
复制寿命比从其他来源获得的RPE细胞的复制寿命更长；
平均脂褐质含量是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均脂褐质含量的50％以下，或是从成人眼睛分离的这些等量RPE细胞的平均脂褐质含量的40％、30％、20％或10％以下；
平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的50％以下，或是从成人眼睛分离的等量RPE细胞的平均A2E含量的40％、30％、20％或10％以下；
平均N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)含量小于50ng/105(100,000)细胞；
感光细胞外部片段(POS)的吞噬率比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的POS的吞噬率至少大50％，或比从成人眼睛分离的等量RPE细胞的POS的吞噬率至少大75％、100％、150％或200％；或
与从成人宿主分离的RPE细胞相比较降低水平的累积氧化应力和/或DNA损伤。

Claims (10)

1.一种药物组合物，该药物组合物包含：
多个视网膜色素上皮(RPE)细胞；以及
一种药学上可接受的载体；
其中所述多个RPE细胞的平均黑色素含量小于8pg/细胞。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述RPE细胞包含于一种悬浮液、凝胶、胶体、基质、基底、支架或移植物中。
3.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含具有介于约290mOsm/kg与约320mOsm/kg之间、或介于约300mOsm/kg与310mOsm/kg之间或约305mOsm/kg的渗透压的一种无菌溶液。
4.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含一种平衡盐溶液。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述平衡盐溶液包含，由以下成分组成，或基本上由以下成分组成：在每mL的水中，氯化钠7.14mg、氯化钾0.38mg、氯化钙二水合物0.154mg、氯化镁六水合物0.2mg、磷酸氢二钠0.42mg、碳酸氢钠2.1mg、葡萄糖0.92mg、谷胱甘肽二硫化物(氧化谷胱甘肽)0.184mg、以及盐酸和/或氢氧化钠(将pH调整至约7.4)。
6.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的体积是介于约100μL与1000μL之间或是至少约150μL。
7.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含介于约1,000与约1×109之间的活RPE细胞之间。
8.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含介于约333个活RPE细胞/μL与约2,000个活RPE细胞/μL之间、介于约444个活RPE细胞/μL与约1766个活RPE细胞/μL之间、约333个活RPE细胞/μL、约444个活RPE细胞/μL、约666个活RPE细胞/μL、约888个活RPE细胞/μL、约999个活RPE细胞/μL、或约1,333个活RPE细胞/μL。
9.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中RPE细胞的浓度足够高以使得至多约30％的所述RPE细胞在60分钟内失去活力，并且任选地至多约10％的所述RPE细胞在4小时内失去活力。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中RPE细胞的所述浓度是至少约1,000个细胞/μL、至少约2,000个细胞/μL、介于约1,000与10,000个细胞/μL之间，或介于约2,000与5,000个细胞/μL之间。
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