TWI655286B - 人類ｒｐｅ細胞之醫藥組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供移植至人類患者中之hESC來源細胞之第一描述。報導各患有斯特格氏(Stargardt's)黃斑營養不良(SMD)及乾性年齡相關黃斑變性(AMD)之患者之結果。經控制之hESC分化產生接近100%純RPE群體。手術後在兩患者之移植部位立即可見色素沉著過度，且後續證據表明細胞已附著及整合至天然RPE層中。未觀察到發炎或過度增殖之跡象。在此報告之時，hESC來源之RPE細胞未展示排斥或致腫瘤性之跡象。目測表明在兩患者中有改良。

Description

人類RPE細胞之醫藥組合物及其用途 相關申請案之交叉參考

本專利申請案主張2011年11月14日申請之美國臨時申請案第61/559,521號、2012年11月8日申請之美國臨時申請案第61/724,047號及2012年1月23日申請之美國臨時申請案第61/589,741號之權利，其各自以全文引用之方式併入本文中。

人類胚胎幹細胞(hESC)被視為用於再生性藥物之替代細胞之有前景的來源(1)。儘管有巨大的科學進步，但hESC仍屬於迄今為止針對臨床用途提出之最複雜的生物學治療實體(2)。除其生物學之動態複雜性以外，許多監管問題阻礙臨床轉化，包括畸胎瘤形成之風險及與組織不相容性有關之挑戰。直至進一步發展細胞重新編程(reprogramming)技術，諸如體細胞核移置(3)或誘導型多能幹細胞(4、5)，影響眼睛及其他免疫豁免部位之疾病可能為患者中最先基於多能幹細胞之療法。已明確視網膜下腔由血-眼障壁保護，且特徵在於細胞及體液免疫反應之抗原特異性抑制(6)。

在視網膜中，視網膜色素上皮(RPE)變性在多種視力威脅性疾病中引起感光器損失，該等疾病包括乾性年齡相關之黃斑部變性(AMD)及斯特格氏黃斑營養不良(Stargardt's macular dystrophy，SMD)，其分別為世界上成人及少年失明之兩種主要原因。儘管兩者目前均不可治療，但在黃斑 變性之臨床前模型中有證據表明移植hESC來源之RPE可救治感光器並防止視覺損失(7、8)。在其功能之中，RPE藉由以下方式維持感光器之健康狀態：再循環感光色素；傳遞、代謝及儲存維生素A；吞噬感光器外段；在視網膜與脈絡膜之間輸送鐵及小分子；及吸收雜散光以允許較好的影像解析度(9、10)。在皇家外科學院(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠(一種因RPE功能障礙而視覺退化之動物模型)中，視網膜下移植hESC來源之RPE引起廣泛感光器救治及視覺效能之改良(100%優於未經治療之對照)，且無不良病變之跡象(7)。

視網膜色素上皮(RPE)為色素沉著細胞層，其在感覺神經性視網膜之外側，在下方脈絡膜(視網膜後方之血管層)與上方視網膜視細胞(例如感光器-視桿(rod)及視錐(cone))之間。RPE對感光器及視網膜之功能及健康狀態至關重要。RPE藉由以下方式維持感光器功能：再循環感光色素；傳遞、代謝及儲存維生素A；吞噬桿狀感光器外段；在視網膜與脈絡膜之間輸送鐵及小分子；維持布魯赫膜(Bruch's membrane)及吸收雜散光以允許較好的影像解析度。Engelmann及Valtink(2004)「RPE Cell Cultivation.」Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1)：65-67；亦參見Irina Klimanskaya,Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells於STEM CELL ANTHOLOGY 335-346(Bruce Carlson編，2009)中。RPE變性可引起與許多視覺改變性疾病有關之視網膜脫 離、視網膜發育不良或視網膜萎縮，該等視覺改變性疾病引起感光器損傷及失明，諸如為無脈絡脈畸型、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性(包括年齡相關之黃斑部變性)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(Stargardt's Disease)(眼底黃色斑點症)。參見例如WO 2009/051671。

包括製造RPE細胞之方法、RPE細胞之組合物及其用途之特定主題揭示於包括下列之共有之美國申請案及專利中：2005年7月20日申請之美國第11/186720號，現為美國專利第7736896號；2006年7月21日申請之美國第11/490953號，現為美國專利第7795025號；2005年1月24日申請之美國第11/041382號，現為美國專利第7794704號；2004年1月23日申請之美國臨時申請案第60/538964號；2010年10月10日申請之美國第12/682,712號；2007年10月12日申請之美國臨時申請案第60/998668號；2007年10月12日申請之美國臨時申請案第60/998766號；2008年1月2日申請之美國臨時申請案第61/009908號；2008年1月2日申請之美國臨時申請案第61/009911號；2010年7月23日申請之美國臨時申請案第61/367038號；2010年11月17日申請之美國臨時申請案第61/414770號；2011年7月25日申請之國際專利申請案第PCT/US11/45232號；2010年12月14日申請之美國第12/682712號；2005年1月24日申請之國際專利申請案第PCT/US05/02273號；2010年11月17日申請之國際專利申請案第PCT/US2010/57056號(作為WO 2011/063005公開)；及2009年11月17日申請之美國臨時專 利申請案第61/262,002號，其各自以全文引用之方式併入本文中。

儘管先前已試圖在人類個體中移植原代RPE細胞之完整層片及懸浮液，但結果喜憂參半(兩者均就移植存活率及視覺改良而言)(11-19)。迄今為止，尚未報導始終有效的使用原代RPE細胞之人類治療。

本發明報導1/2期臨床資料，其有助於展示人類胚胎幹細胞(hESC)來源之視網膜色素上皮(RPE)細胞之安全性，該等細胞用於治療斯特格氏黃斑營養不良(SMD)及乾性年齡相關之黃斑部變性(乾性AMD)。結果針對兩名患者(1/2期臨床試驗各自中之第一者)報導。除展示無不良安全性問題以外，結構性證據證實hESC來源之細胞在所報導之研究期間存活並繼續存留。兩名患者在其視力方面均具有持續至少一年之可量測之改良。

在治療後一年，未在任何時候在任一患者中觀察到過度增殖、致瘤性、異位組織形成或明顯排斥反應。在多次移植後評估時進行詳細的臨床及診斷實驗室評估。異常生長(或腫瘤形成)將被視為基於幹細胞之療法(尤其源自hESC之療法)因其多能性所致的重大安全性問題；因此，控制hESC之分化至關重要。所報導之結果表明幹細胞分化在此等患者中得到較好地控制。未偵測到不良安全信號。

在患有SMD之患者中，在臨床上及用高解析度成像技術觀察到成功的幹細胞來源之RPE移植之解剖證據。此證據 包括自移植後一週開始及在整個隨訪期(follow-up period)中在移植區域內在RPE層面增強之色素沉著。所移植之幹細胞來源之RPE似乎移入適當位置中且呈現正常RPE形態。在乾性AMD患者中未偵測移入及增強之色素沉著。然而，兩名患者在四個月隨訪期時均展示一定的視覺改良，該改良至少持續至一年隨訪期。

如下文進一步描述，斯特格氏患者之視力(visual acuity)由僅手動(hand motion)改良至20/800視力。在治療之前，患者不能閱讀ETDRS視力表上之任意字母。然而，到移植後兩週時，她能夠開始閱讀字母，經治療之眼睛在1至3個月時改良至5個字母且在1年時改良至15個字母(20/500視力)。

儘管數種新穎藥物可供治療濕性型AMD使用，但目前尚不存在用於乾性AMD或斯特格氏病之經證實有效的治療。不論此等病況之進行性本質如何，兩名患者之視力在細胞移植(即使在最低劑量下)之後似乎均得以改良。申請人預期在疾病進程之較早期(在該時期潛在可期望較顯著結果)治療患者時會有甚至更顯著的改良。細胞劑量增加亦可引起較顯著改良。

人類胚胎幹細胞可藉由製造無限數目之免疫原性潛在降低之健康「年輕」細胞來提供替代組織之優異來源。眼睛因血-眼障壁對視網膜下腔之保護而成為免疫特權部位，且因此僅使用較低及短暫劑量之免疫抑制。未在任一患者中觀察到排斥反應或發炎之跡象，且醫師繼續監測兩名患 者。

本文中呈現之結果強調幹細胞療法及再生性藥物實現修復或替代由疾病損傷之組織之可能性的潛能。

hESC來源之RPE細胞在移植之前經歷廣泛的安全性研究。證實該等細胞不含動物及人類病原體，且在最終產品中進行高敏感性分析以排除存在任何未分化之hESC(腫瘤形成之風險因子)。經控制之hESC分化產生接近100%純的RPE。hESC之重要特徵在於活體外分化階段可經控制以使存活率及功能性達至最大。本文資料展示RPE成熟及色素沉著之程度可顯著影響該等細胞在移植之後的後續附著及生長。

兩項試驗均為前瞻性開放標記(open-label)研究，其經設計以測定hESC來源之RPE細胞在視網膜下移植至患有SMD及乾性AMD之患者中之後12個月下的安全性及耐受性(研究之主要終點)。各項試驗將各自編入12名患者，具有呈上升劑量形式之世代(cohort)，各世代具有3名患者。SMD及乾性AMD患者均接受源自hESC之經完全分化之RPE細胞之最低劑量(50,000個細胞)的視網膜下移植。

本發明描述兩項前瞻性臨床試驗中之兩名患者之初步結果，該等前瞻性臨床試驗在患有乾性AMD及斯特格氏病之患者中探索此等hESC來源之RPE之安全性及耐受性。在此報告之時，hESC來源之RPE細胞並未展示排斥反應或致腫瘤性之跡象。目測提示兩名患者中之改良。此等結果指示 hESC可充當RPE之潛在安全且不竭之來源，用於一系列視網膜變性疾病之有效治療。

亦描述製造具備有利特徵之hESC來源之RPE細胞群體的方法。控制分化路徑(包括基因及色素表現程度)展示明顯增強注射後細胞之存活、附著及生長。特定言之，本文呈現之資料展示RPE成熟及色素沉著程度顯著影響活體外該等細胞之後續附著及生長。此等結果說明與使用原代細胞相比，使用自hESC分化之細胞用於治療用途可獲得之優點。此等結果展示除製造無限數目之免疫原性潛在降低之健康「年輕」細胞(20、21)以外，可在移植至患者中之前在細胞及分子層面控制活體外分化階段，以確保安全性、一致性、純度及效能。

吾人啟動兩項前瞻性臨床研究，以測定在患有斯特格氏黃斑營養不良(SMD)及乾性年齡相關之黃斑部變性(AMD)(已開發世界中失明之主要原因)之患者中，視網膜下移植hESC來源之視網膜色素上皮(RPE)的安全性及耐受性。對各試驗中之第一名患者進行手術前及手術後眼科檢查，包括視力、螢光素血管造影術、光學同調斷層攝影(optical coherence tomography，OCT)及視場測試。

經控制之hESC分化產生接近100%純的RPE群體。手術後在兩名患者之移植部位處立即可見色素沉著過度，且後續證據表明細胞已附著及整合至天然RPE層中。觀察到無發炎或過度增殖之跡象。目測表明在前兩個月期間有改良之跡象。在2週時，AMD患者之研究眼睛之最佳矯正視力 (BCVA)已自治療前20/500改良至20/200，且繼續展示改良(20/200至20/320)及早期治療糖尿病性視網膜病變研究(ETDRS)視力表上字母之增加。在同一期間SMD患者自手動改良至數手指；到第1月及第2月時，BCVA改良至20/800。在RPE移植之前，患者無法閱讀ETDRS表上之任何字母，但在2週時開始閱讀字母，其在研究期間持續改良(在1個月及2個月時5個字母)。

在此報告之時，hESC來源之RPE細胞並未展示排斥反應或致腫瘤性之跡象。目測展示兩名患者中之改良。

定義

為了能夠充分理解本文中所述之本發明，闡述以下詳細描述。詳細描述本發明之各種實施例且可藉由所提供之實例來進一步說明。

除非另作定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般技術(本發明所屬)者通常所理解之含義相同的含義。儘管可將類似或等同於本文所述之方法及材料之方法及材料用於本發明或用於測試本發明，但下文描述適合之方法及材料。該等材料、方法及實例僅為說明性的，且並非意欲具有限制性。本文提供以下術語及定義。

除非上下文另外明確規定，否則如本文描述中及貫穿隨附申請專利範圍中所用之「一個(種)(a、an)」及「該」之含義包括多數參考物。此外，除非上下文另外明確規定，否則如本文中描述中所用之「之中」之含義包括「之中」及「之上」。

在整個說明書中，詞語「包含」或其變化形式，諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」應理解為意指包括所述整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。

如本文所用之「有效量」廣泛地指化合物或細胞在投與患者用於治療疾病時足以對該疾病實現該治療之量。有效量可為有效防治之量及/或有效預防之量。有效量可為有效減輕跡象/症狀之量、有效預防跡象/症狀出現、降低出現跡象/症狀之嚴重度、消除跡象/症狀出現、減緩跡象/症狀出現之進展、預防跡象/症狀出現之進展，及/或實現防治跡象/症狀出現的量。「有效量」可視以下而變化：疾病及其嚴重度以及待治療之患者之年齡、體重、病史、敏感性及先存病況。出於本發明之目的，術語「有效量」與「治療有效量」同義。

如本文所用之「胚胎」或「胚胎的」廣泛地指未植入母體宿主之子宮膜中之發育細胞群。「胚胎細胞」為自胚胎分離或胚胎中所含有之細胞。此胚胎細胞亦包括早至兩細胞期所獲得的卵裂球(blastomere)及聚集之卵裂球。

如本文所用之「胚胎幹細胞」(ES細胞)廣泛地指自胚泡或桑椹胚(morulae)之內細胞群獲得之細胞，該等細胞已作為細胞株連續繼代。ES細胞可自以下獲得：用精子或DNA使卵細胞受精、核移置、孤雌生殖、或藉由在HLA區域中產生具有同種接合性之ES細胞之方式。ES細胞亦可指代自藉由以下方式製造之合子、卵裂球或胚泡期哺乳動物胚 胎獲得之細胞：精子與卵細胞之融合；核移置；孤雌生殖；或染色質重新編程，且隨後將經重新編程之染色質併入質膜中以製造細胞。無論胚胎幹細胞之來源或用於製造其之特定方法如何，其均可基於以下來鑑別：(i)分化成所有三個胚層之細胞的能力；(ii)至少Oct-4及鹼性磷酸酶之表現；及(iii)當移植至免疫功能不全之動物中時產生畸胎瘤的能力。術語亦包括自胚胎之一或多個卵裂球分離之細胞，較佳不破壞剩餘胚胎(參見例如Chung等人，Cell Stem Cell.2008年2月7日；2(2)：113-7；美國預授權公開案第20060206953號；美國預授權公開案第2008/0057041號，其各自以全文引用之方式併入本文中)。術語亦包括藉由體細胞核移置製造之細胞，即使該製程中使用非胚胎細胞。ES細胞可自以下獲得：用精子或DNA使卵細胞受精、核移置、孤雌生殖、或藉由在HLA區域中產生具有同種接合性之ES細胞之方式。ES細胞亦為自藉由以下方式製造之合子、卵裂球或胚泡期哺乳動物胚胎獲得之細胞：精子與卵細胞之融合；核移置；孤雌生殖；或染色質重新編程，且隨後將經重新編程之染色質併入質膜中以製造細胞。本發明之人類胚胎幹細胞可包括(但不限於)MA01、MA09、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14及ACT30胚胎幹細胞。在某些實施例中，用於製造RPE細胞之人類ES細胞根據GMP標準獲得及維持。

如本文所用之「胚胎來源之細胞」(EDC)廣泛地指桑葚胚來源之細胞；胚泡來源之細胞，包括內細胞群、胚盾或 外胚層之細胞；或早期胚胎之其他多能幹細胞，包括原始內胚層、外胚層及中胚層及其衍生物。「EDC」亦包括卵裂球及來自聚集之單個卵裂球之細胞群或來自不同發育階段之胚胎，但不包括作為細胞株而經繼代之人類胚胎幹細胞。

如本文所用之「黃斑變性」廣泛地指特徵在於與布魯赫膜、神經視網膜及視網膜色素上皮異常有關之中心視覺進行性損失之疾病。黃斑變性疾病包括(但不限於)年齡相關之黃斑部變性、北卡羅來納黃斑營養不良(North Carolina macular dystrophy)、索爾斯比氏眼底營養不良(Sorsby's fundus dystrophy)、斯特格氏病、圖形樣營養不良(pattern dystrophy)、貝斯特氏症(Best disease)、蜂窩狀視網膜萎縮(malattia leventinese)、多英氏蜂窩狀脈絡膜炎(Doyne's honeycomb choroiditis)、顯性玻璃膜疣(dominant drusen)及放射狀玻璃膜疣(radial drusen)。

如本文所用之「多能幹細胞」廣泛地指在保留未分化狀態之同時能夠活體外延長或實際上無限增殖之細胞，其展現穩定(較佳正常)核型，且具有在適當條件下分化成所有三個胚層(亦即外胚層、中胚層及內胚層)之能力。

如本文所用之「多能胚胎幹細胞」廣泛地指以下細胞：(a)在移植至免疫缺陷(SCID)小鼠中時能夠誘導畸胎瘤；(b)能夠分化成所有三個胚層之細胞類型(例如外胚層、中胚層及內胚層細胞類型)；及(c)表現至少一種分子胚胎幹細胞標記(例如表現Oct-4、鹼性磷酸酶、SSEA 3表面抗 原、SSEA 4表面抗原、NANOG、TRA 1 60、TRA 1 81、SOX2、REX1)。例示性多能幹細胞可使用例如此項技術中已知之方法產生。例示性多能幹細胞包括自胚泡期胚胎之ICM獲得之胚胎幹細胞、以及自卵裂期或桑椹期胚胎之一或多個卵裂球獲得(視情況不破壞剩餘胚胎)之胚胎幹細胞。該等胚胎幹細胞可自藉由受精或藉由無性方式製造之胚胎材料產生，該等無性方式包括體細胞核移置(SCNT)、孤雌生殖及單雄生殖。其他例示性多能幹細胞包括誘導型多能幹細胞(iPS細胞)，該等誘導型多能幹細胞藉由因子(本文中稱為重新編程因子)之組合之表現或誘導表現使體細胞重新編程而產生。iPS細胞可使用胎兒、出生後、新生兒、少年或成人體細胞產生。在某些實施例中，可用於將體細胞重新編程成多能幹細胞之因子包括例如Oct4(有時稱為Oct 3/4)、Sox2、c-Myc及Klf4之組合。在其他實施例中，可用於將體細胞重新編程成多能幹細胞之因子包括例如Oct-4、Sox2、Nanog及Lin28之組合。在其他實施例中，藉由表現至少2種重新編程因子、至少3種重新編程因子或4種重新編程因子來使體細胞重新編程。在其他實施例中，鑑別其他重新編程因子，且將其單獨或與一或多種已知重新編程因子組合使用來將體細胞重新編程成多能幹細胞。iPS細胞通常可藉由表現與胚胎幹細胞相同的標記而得以鑑別，不過特定iPS細胞株可能在其表現概況方面不同。

如本文所用之「RPE細胞」、「經分化之RPE細胞」、 「ES來源之RPE細胞」可全文互換使用，廣泛地指例如使用本文所揭示之方法自多能幹細胞分化之RPE細胞。該術語一般用於指代經分化之RPE細胞，而與細胞成熟程度無關，且因此可涵蓋各種成熟程度之RPE細胞。RPE細胞可藉由其鵝卵石形態及開始出現色素而在視覺上鑑別。RPE細胞亦可在分子上鑑別，此基於實質上缺乏胚胎幹細胞標記(諸如Oct-4及NANOG)之表現以及基於RPE標記(諸如RPE 65、PEDF、CRALBP及斑萎蛋白(bestrophin))之表現而進行。因此，除非另有說明，否則如本文所用之RPE細胞係指活體外自多能幹細胞分化之RPE細胞。

如本文所用之「成熟RPE細胞」及「成熟經分化之RPE細胞」可全文互換使用，廣泛地指在RPE細胞開始分化之後發生之改變。特定言之，儘管可部分基於色素之開始出現來識別RPE細胞，但在分化之後，成熟RPE細胞可基於增強之色素沉著來識別。

如本文所用之「色素沉著」廣泛地指任何程度之色素沉著，例如在RPE細胞自ES細胞分化時開始發生之色素沉著。色素沉著可隨經分化之RPE細胞之細胞密度及成熟度而變化。RPE細胞之色素沉著可與RPE細胞終末分化之後的一般RPE細胞相同。RPE細胞之色素沉著與RPE細胞終末分化之後的一般RPE細胞相比可具有較多的色素沉著。RPE細胞之色素沉著與終末分化之後的一般RPE細胞相比可具有較少的色素沉著。

如本文所用之疾病之「跡象」廣泛地指可在檢查患者時 發現的任何指示疾病之異常；疾病之客觀指示，其與症狀相反，症狀為疾病之主觀指示。

如本文所用之疾病之「症狀」廣泛地指由患者所遭受且指示疾病之相對於正常結構、功能或感覺的任何病態現象或偏差。

如本文所用之「療法」、「治療性」或「治療(treating或treatment)」廣泛地指治療疾病、阻止或減少疾病或其臨床症狀之產生，及/或減輕疾病、使得疾病或其臨床症狀消退。療法涵蓋防治、預防、治療、治癒、救治、減少、減輕疾病之跡象及/或症狀、及/或提供對疾病之緩解。療法涵蓋減輕具有進行中之疾病跡象及/或症狀(例如失明、視網膜退化)之患者的跡象及/或症狀。療法亦涵蓋「防治」及「預防」。防治包括預防在治療患者之疾病之後出現的疾病或降低患者之疾病的發病率或嚴重度。術語「減少」出於療法之目的廣泛地指跡象及/或症狀之臨床上明顯減少。療法包括治療復發或反覆性跡象及/或症狀(例如視網膜變性、視力損失)。療法涵蓋(但不限於)在任何時候阻止跡象及/或症狀之出現，以及減少現有跡象及/或症狀及消除現有跡象及/或症狀。療法包括治療慢性疾病(「維持」)及急性疾病。舉例而言，治療包括治療或預防復發或跡象及/或症狀(例如失明、視網膜變性)之再現。

術語「皮質類固醇」在本文中用於指代結合至糖皮質激素受體之類固醇激素種類，包括天然及人造皮質類固醇、類似物等。例示性皮質類固醇包括(但不限於)潑尼龍 (prednisolone)、氫皮質酮、潑尼松(prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氫可的松(fludrocortisone acetate)、氟替卡松(fluticasone)(包括丙酸氟替卡松(FP))、布地奈德(budesonide)、環索奈德(ciclesonide)、莫米松(mometasone)及氟尼縮松(flunisolide)。

RPE細胞之製劑及組合療法

本發明提供RPE細胞之製劑，包括RPE細胞、實質上經純化之RPE細胞群體、包含RPE細胞之醫藥製劑及經極冷保藏之RPE細胞之製劑。本文中所述之RPE細胞可實質上不含可見於其自然環境中之至少一種蛋白質、分子或其他雜質(例如「經分離」)。RPE細胞可為哺乳動物(包括人類)RPE細胞。本發明亦提供人類RPE細胞、實質上經純化之人類RPE細胞群體、包含人類RPE細胞之醫藥製劑及經極冷保藏之人類RPE細胞之製劑。製劑可為包含人類胚胎幹細胞來源之RPE細胞、人類iPS細胞來源之RPE細胞之製劑、及實質上經純化(相對於非RPE細胞)之包含經分化之ES來源之RPE細胞的製劑。

製劑之RPE細胞的複製壽命可長於自其他來源(例如來源於捐獻之人類組織之培養物，該人類組織諸如為胎兒、嬰兒、兒童、青少年或成人組織)獲得之RPE細胞之複製壽命。複製壽命可藉由測定在複製性衰老之前培養的群體倍增次數來評估。舉例而言，製劑之RPE細胞的複製壽命可 比自捐獻之人類組織獲得之RPE群體的複製壽命長至少10%，且較佳比自捐獻之人類組織獲得之RPE群體的複製壽命長至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或甚至100%以上。

製劑之RPE細胞之平均端粒長度可為hESC及/或人類iPS細胞之端粒長度(或hESC及/或人類iPS細胞群體之平均值)的至少30%，且較佳為hESC及/或人類iPS細胞之端粒長度(或hESC及/或人類iPS細胞群體之平均值)的至少40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。舉例而言，該hESC及/或人類iPS細胞(或該hESC及/或人類iPS細胞群體)可為該等RPE細胞自其分化之細胞或細胞群體。

製劑之RPE細胞之平均末端限制性片斷長度(TRF)可長於4kb，且較佳地長於5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb或甚至13kb。在一例示性實施例中，製劑之RPE細胞之TRF可為10kb或10kb以上。

製劑之RPE細胞之平均脂褐質含量可低於自成人眼睛(亦即25歲至80歲之人類成年患者，更佳為50歲至80歲之成人)分離之相等數目RPE細胞的平均脂褐質含量的50%，且更佳低於自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞之平均脂褐質含量的40%、30%、20%或甚至10%。

製劑之RPE細胞之平均N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)含量可低於自成人眼睛(例如25歲至80歲之人類成年患者，更佳為50歲至80歲之成人)分離之相等數目RPE細胞的平均A2E含量的50%，且更佳低於自成人眼睛分離之相 等數目RPE細胞之平均A2E含量的40%、30%、20%或甚至10%。

製劑之RPE細胞之平均N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)含量可低於每10⁵(100,000)個細胞50ng，其可由積分之峰強度測定(諸如描述於Sparrow等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1999年11月第40卷第12期，第2988頁至第2995頁中)，且更佳低於每10⁵個細胞40ng、30ng、20ng、10ng或甚至5ng。

製劑之RPE細胞之感光器外段(POS)吞噬速率可比自成人眼睛(亦即25歲至80歲之人類成年患者，更佳為50歲至80歲之成人)分離之相等數目RPE細胞的POS吞噬速率大至少50%，且更佳大至少75%、100%、150%或甚至200%。如一個例示性且非限制性實例，POS吞噬可使用Bergmann等人FASEB Journal 2004年3月第18卷第562頁至第564頁中所述之方案進行量測。

製劑之RPE細胞之感光器外段(POS)吞噬速率可為24小時後POS總濃度之至少20%，且更佳為24小時後POS總濃度之至少25%、30%、35%、40%或甚至50%。如一個例示性且非限制性實例，POS吞噬可使用Bergmann等人FASEB Journal 2004年3月第18卷第562頁至第564頁中所述之方案進行量測。

與自成人宿主分離之RPE細胞相比，該等RPE細胞可展現較低程度之累積氧化應力及/或DNA損傷。

製劑之RPE細胞之平均蛋白酶體活性可比自成人眼睛(亦 即25歲至80歲之人類成年患者，更佳為50歲至80歲之成人)分離之相等數目RPE細胞的平均蛋白體活性大至少50%，且更佳比自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞之平均蛋白體活性大至少60%、70%、80%、90%或甚至100%。如一個例示性且非限制性實例，蛋白體活性可使用以下量測：丁二醯基-Leu-Leu-Val-Tyr-胺基甲基香豆素(LLVY-AMC)用於胰凝乳蛋白酶樣活性；N-第三丁氧基羰基-Leu-Ser-Thr-Arg-胺基甲基香豆素(LSTR-AMC)用於胰蛋白酶樣活性；及苯甲氧基羰基-Leu-Leu-Glu-胺基甲基香豆素(LLE-AMC)用於肽基麩胺醯基-肽水解酶活性。

製劑之RPE細胞之平均泛素結合物積聚率低於自成人眼睛(亦即25歲至80歲之人類成年患者，更佳為50歲至80歲之成人)分離之相等數目RPE細胞的平均泛素結合物積聚率的50%，且更佳低於自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞的平均泛素結合物積聚率的40%、30%、20%或甚至10%。如一個例示性且非限制性實例，泛素結合物積聚率可使用Zhang等人Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2008年8月第49卷第8期3622-3630中所述之方案進行量測。

一或多種血管生成抑制劑可與RPE細胞之製劑組合投與，較佳呈用於預防或治療眼睛疾病(諸如血管生成相關之眼睛疾病)之治療有效量。例示性眼睛疾病包括黃斑變性(例如濕性AMD或乾性AMD)、糖尿病性視網膜病變及脈絡膜新生血管。例示性血管生成抑制劑包括：VEGF拮抗劑，諸如VEGF及/或VEGF受體(VEGFR，例如 VEGFR1(FLT1、FLT)、VEGFR2(KDR、FLK1、VEGFR、CD309)、VEGFR3(FLT4、PCL))之抑制劑，諸如肽、肽模擬物、小分子、化學物或核酸，例如哌加他尼鈉(pegaptanib sodium)、阿柏西普(aflibercept)、貝伐西尼(bevasiranib)、雷帕黴素(rapamycin)、AGN-745、瓦他拉尼(vitalanib)、帕唑盤尼(pazopanib)、NT-502、NT-503、或PLG101、CPD791(二-Fab'聚乙二醇(PEG)結合物，其抑制VEGFR-2)、抗VEGF抗體或其功能片段(諸如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN®)或蘭尼單抗(ranibizumab)(LUCENTIS®))、或抗VEGF受體抗體(諸如IMC-1121(B)(VEGFR-2之單株抗體)或IMC-18F1(VEGFR-1之細胞外結合域之抗體))。VEGF活性之其他例示性抑制劑包括VEGFR受體之片段或域，其中一個實例為VEGF阱(阿柏西普)，一種VEGFR-1之域2及VEGFR-2之域3與IgG1之Fc片段的融合蛋白質。其他例示性VEGFR抑制劑為AZD-2171(西地尼布(Cediranib))，其抑制VEGF受體1及2。其他例示性VEGF拮抗劑包括酪胺酸激酶抑制劑(TKI)，包括據報導抑制VEGFR-1及/或VEGFR-2之TKI，諸如索拉非尼(sorafenib)(蕾莎瓦(Nexavar))、SU5416(塞馬昔尼(Semaxinib))、SU11248/舒尼替尼(Sunitinib)(紓癌特(Sutent))及範得他尼(Vandetanib)(ZD 6474)。其他例示性VEGF拮抗劑包括Ly317615(恩紮妥林(Enzastaurin))，其被認為靶向參與VEGFR信號傳導之下游激酶(蛋白激酶C)。其他例示性血管生成抑制劑包括α5β1整合素活性之抑制劑，包括抗α5β1 整合素抗體或其功能片段(諸如沃洛昔單抗(volociximab))、肽、肽模擬物、小分子、化學物或核酸，諸如3-(2-{1-烷基-5-[(吡啶-2-基胺基)-甲基]-吡咯啶-3-基氧基}-乙醯胺基)-2-(烷基-胺基)-丙酸、(S)-2-[(2,4,6-三甲基苯基)磺醯基]胺基-3-[7-苯甲氧基羰基-8-(2-吡啶基胺基甲基)-1-氧雜-2,7-二氮雜螺-(4,4)-壬-2-烯-3-基]羰基胺基丙酸、EMD478761或RC*D(ThioP)C*(Arg-Cys-Asp-硫脯胺酸-Cys；星號表示利用二硫鍵經由半胱胺酸殘基環化)。其他例示性血管生成抑制劑包括2-甲氧基雌二醇、αVβ3抑制劑、血管生成素2、血管生長抑制性類固醇及肝素、血管生長抑素、血管生長抑素相關分子、抗α5β1整合素抗體、抗組織蛋白酶S抗體、抗凝血酶III片段、貝伐單抗、鈣網蛋白(calreticulin)、血管能抑制素(canstatin)、羧胺三唑、軟骨來源之血管生成抑制因子、CDAI、CM101、CXCL10、內皮生長抑素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12、IL-18、IL-4、利諾胺(linomide)、馬司非(maspin)、基質金屬蛋白酶抑制劑、Meth-1、Meth-2、骨橋蛋白、哌加他尼、血小板因子-4、催乳激素、增殖蛋白相關蛋白、凝血酶原(丹麥餅結構-2(kringle domain-2))、蘭尼單抗、休眠蛋白(restin)、可溶性NRP-1、可溶性VEGFR-1、SPARC、SU5416、舒拉明(suramin)、替可加蘭(tecogalan)、四硫鉬酸鹽、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、血小板反應蛋白、TIMP、TNP-470、TSP-1、TSP-2、血管新生抑制素、VEGFR拮抗劑、VEGI、沃洛昔單抗(亦稱為 M200)、纖維結合蛋白片段(諸如阿那斯特林(anastellin))(參見Yi及Ruoslahti,Proc Natl Acad Sci USA.2001年1月16日；98(2)：620-4)或其任何組合。該血管生成抑制劑較佳呈足以預防或治療增生性(新生血管性)眼病(諸如與濕性AMD及其他視網膜疾病有關之脈絡膜新生血管膜(CNV))之量。其他例示性血管生成抑制劑包括：萊瓦替尼(Lenvatinib)(E7080)、莫特塞尼(Motesanib)(AMG 706)、帕唑盤尼(福退癌(Votrient))及IL-6拮抗劑(諸如抗IL-6抗體)。其他例示性血管生成抑制劑包括上述任一者之片段、模擬物、嵌合體、融合體、類似物及/或域。其他例示性血管生成抑制劑包括上述任一者之組合。在一例示性實施例中，RPE細胞之製劑包含抗VEGF抗體，例如貝伐單抗，諸如每次注射至眼睛中在約0.1mg至約6.0mg之間、例如約1.25mg及約2.5mg之貝伐單抗。在其他例示性實施例中，RPE細胞之製劑包含VEGF活性之一或多種抑制劑及α5β1整合素活性之一或多種抑制劑。

一或多種消炎劑可與RPE細胞之製劑組合投與。例示性消炎劑包括：糖皮質激素、非類固醇消炎藥、阿司匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、環加氧酶(COX)酶抑制劑、醛固酮、倍氯米松、倍他米松、皮質類固醇、皮質醇、醋酸可的松(cortisone acetate)、醋酸去氧皮質酮、地塞米松、醋酸氟氫可的松、氟輕鬆(fluocinolone acetonide)(例如ILUVIEN®)、糖皮質激素、氫皮質酮、甲潑尼龍、潑尼龍、潑尼松、類固醇及曲安西 龍。消炎劑視情況可不為皮質類固醇。舉例而言，消炎劑可為非類固醇消炎劑。

另外，在RPE細胞之製劑投與之前、同時及/或之後，患者可能不接受皮質類固醇。在不意欲受理論限制下，申請人猜測投與皮質類固醇可干擾RPE細胞RPE定著及/或移入。舉例而言，在RPE細胞之製劑投與之前至少3、6、12、24、48、72、96或120小時或120小時以上內，可能不投與患者皮質類固醇。另外，在RPE細胞之製劑投與之後至少3、6、12、24、48、72、96或120小時或120小時以上內，可能不投與患者皮質類固醇。

另外，在RPE細胞之製劑投與之前及/或之後，可投與患者非皮質類固醇免疫抑制劑。例示性非皮質類固醇免疫抑制劑包括他克莫司(tacrolimus)(FK-506巨環內酯)及MMF(黴酶酸前藥)。

有助於增強抗氧化劑活性之一或多種抗氧化劑、抗氧化劑輔因子及/或其他因子可與RPE細胞之製劑組合投與，其實例可包括OT-551(Othera)、維生素C、維生素E、β胡蘿蔔素、鋅(例如氧化鋅)及/或銅(例如氧化銅)。

一或多種黃斑葉黃素(macular xanthophyll)(諸如葉黃素(lutein)及/或玉米黃素(zeaxanthin))可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種長鏈ω-3脂肪酸，諸如二十二碳六烯酸(DHA)及/或二十碳五烯酸(EPA)，可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種澱粉樣抑制劑，諸如芬維A胺(fenretinide)、Arc-1905、克帕松(Copaxone)(醋酸格拉替美(glatiramer acetate)，Teva)、RN6G(PF-4382923，Pfizer)(相對於Aβ40及Aβ42之人類化單株抗體)、GSK933776(GlaxoSmithKline)(抗澱粉樣抗體)，可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種睫狀神經營養因子(CNTF)促效劑(例如CNTF，其可在眼內裝置(諸如NT-501(Neurotech))中傳遞)可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種RPE65之抑制劑(諸如ACU-4429(Aculea,Inc.))可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種靶向A2E及/或脂褐質積聚之因子(諸如芬維A胺及ACU-4429)可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種感光器功能及/或代謝之下調劑或抑制劑(諸如芬維A胺及ACU-4429)可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種α2-腎上腺素激導性受體促效劑(諸如酒石酸溴莫尼定(Brimonidine tartrate))可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種選擇性血清素1A促效劑(諸如坦度螺酮(Tandospirone)(AL-8309B))可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種靶向C-5、膜攻擊複合體(C5b-9)及/或任何其他玻璃膜疣組分之因子可與RPE細胞之製劑組合投與，其實例包括補體因子D、C-3、C-3a、C5及C5a之抑制劑及/或因子H之促效劑，諸如ARC1905(Ophthotec)(選擇性抑制C5之 抗C5適體)、POT-4(Potentia)(抑制C3之坎普他汀(compstatin)衍生物)、補體因子H、依庫珠單抗(Eculizumab)(索拉瑞斯(Soliris),Alexion)(抑制C5之人類化IgG抗體)及/或FCFD4514S(Genentech,San Francisco)(針對補體因子D之單株抗體)。

一或多種免疫抑制劑(諸如西羅莫司(Sirolimus)(雷帕黴素))可與RPE細胞之製劑組合投與。

一或多種預防或治療脂褐質積聚之藥劑，諸如吡拉西坦(piracetam)、氯酯醒(centrophenoxine)、乙醯基-L-肉鹼、銀杏(Ginko Biloba)或其提取物或製備物及/或DMAE(二甲基乙醇胺)，可與RPE細胞之製劑組合投與。

當一或多種藥劑(諸如血管生成抑制劑；抗氧化劑；抗氧化劑輔因子；有助於增強抗氧化劑活性之其他因子；黃斑葉黃素；長鏈ω-3脂肪酸；澱粉樣抑制劑；CNTF促效劑；RPE65之抑制劑；靶向A2E及/或脂褐質積聚之因子；感光器功能及/或代謝之下調劑或抑制劑；α2-腎上腺素激導性受體促效劑；選擇性血清素1A促效劑；靶向C-5、膜攻擊複合體(C5b-9)及/或任何其他玻璃膜疣組分之因子；免疫抑制劑；預防或治療脂褐質積聚之藥劑等)與RPE細胞之製劑組合投與時，該藥劑可在該RPE細胞之製劑同時、之前及/或之後投與。舉例而言，該藥劑可在將該RPE細胞之製劑引入患者眼睛中之程序期間投與該患者眼睛。可在向患者眼睛中投與該等RPE細胞之前開始及/或之後繼續投與該藥劑。舉例而言，該藥劑可在溶液、懸浮液中以持續 釋放形式及/或在持續傳遞系統(例如Allergan Novadur^TM傳遞系統、NT-501或其他眼內裝置或持續釋放系統)中提供。

RPE細胞群體可包括不同成熟程度之經分化之RPE細胞，或就特定成熟程度之經分化之RPE細胞而言可為實質上純的。RPE細胞可為包含不同成熟/色素沉著程度之RPE細胞之實質上經純化之製劑。舉例而言，實質上經純化之RPE細胞培養物可含有經分化之RPE細胞及成熟經分化之RPE細胞兩者。在成熟RPE細胞中，色素含量可變化。然而，基於增強之色素沉著程度及較多柱狀形狀，可以將成熟RPE細胞與RPE細胞在視覺上區別開。實質上經純化之RPE細胞之製劑包含不同成熟程度之RPE細胞(例如經分化之RPE細胞及成熟經分化之RPE細胞)。在該等情況下，就指示色素沉著之標記之表現而言，在製劑中可存在變異性。細胞培養物中之RPE細胞之色素沉著可為均質的。另外，細胞培養物中之RPE細胞之色素沉著可為異質的，且RPE細胞培養物可包含經分化之RPE細胞及成熟RPE細胞兩者。就非RPE細胞類型而言，包含RPE細胞之製劑包括實質上純的製劑，但其含有經分化之RPE細胞及成熟經分化之RPE細胞的混合物。就非RPE細胞類型而言及就其他成熟程度之RPE細胞而言，包含RPE細胞之製劑亦包括實質上純的製劑。

培養物中成熟經分化之RPE細胞之百分比可藉由降低培養物之密度而降低。因此，本文中所述之方法可另外包含 將成熟RPE細胞群體繼代培養以製造含有較小百分比之成熟RPE細胞的培養物。製劑中RPE細胞之數目包括經分化之RPE細胞，與成熟程度無關且與經分化之RPE細胞與成熟經分化之RPE細胞的相對百分比無關。製劑中RPE細胞之數目係指經分化之RPE細胞或成熟RPE細胞之數目。製劑可包含至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%經分化之RPE細胞。製劑可包含至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%成熟RPE細胞。RPE細胞製劑可包含經分化之RPE細胞與成熟RPE細胞之混合群體。

本發明提供一種細胞培養物，其包含人類RPE細胞，該等細胞有色素沉著且表現至少一種不表現於非人類RPE之細胞中的基因。舉例而言，儘管該等RPE細胞與天然人類RPE細胞可具有實質上相同之RPE65、PEDF、CRALBP及斑萎蛋白之表現。但就PAX2、Pax 6、MITF及/或酪胺酸酶中之一或多者之表現而言，該等RPE細胞可視成熟程度而不同。應注意分化後色素沉著之變化亦與PAX2表現之變化有關。成熟RPE細胞可藉由色素沉著程度、PAX2、Pax 6及/或酪胺酸酶之表現程度而不同於RPE細胞。舉例而言，與RPE細胞相比，成熟RPE細胞可具有較高程度之色素沉著或較高程度之PAX2、Pax 6及/或酪胺酸酶表現。

相對於非RPE細胞，製劑可實質上經純化，包含至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100% RPE細胞。RPE細胞製劑可基本上不含非RPE細胞或由RPE細胞組成。舉例而言，實質上經純化之RPE細胞之製劑可包含低於約25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%非RPE細胞類型。舉例而言，RPE細胞製劑可包含低於約25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001%非RPE細胞。

就非RPE細胞而言及就其他成熟程度之RPE細胞而言，RPE細胞製劑可為實質上純的。相對於非RPE細胞，製劑可實質上經純化，且針對成熟RPE細胞富集。舉例而言，在針對成熟RPE細胞富集之RPE細胞製劑中，至少約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99%或100% RPE細胞為成熟RPE細胞。相對於非RPE細胞，製劑可實質上經純化，且針對經分化之RPE細胞而非成熟RPE細胞富集。舉例而言，至少約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%RPE細胞可為經分化之RPE細胞而非成熟RPE細胞。

RPE細胞製劑可包含至少約1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰個RPE細胞。RPE細胞製劑可包含至少約5,000至10,000個、50,000至100,000個、100,000至200,000個、200,000至500,000個、300,000至500,000個或400,000至500,000個RPE細胞。RPE細胞製劑可包含至少約20,000至50,000個RPE細胞。此外，RPE細胞製劑可包含至少約5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、75,000、80,000、100,000或500,000個RPE細胞。

RPE細胞製劑可包含每毫升至少約1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、 6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰個RPE細胞。RPE細胞製劑可包含每毫升至少約5,000至10,000個、50,000至100,000個、100,000至200,000個、200,000至500,000個、300,000至500,000個或400,000至500,000個RPE細胞。RPE細胞製劑可包含每毫升至少約20,000至50,000個RPE細胞。此外，RPE細胞製劑可包含每毫升至少約5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、75,000、80,000、100,000或500,000個RPE細胞。

本文中所述之製劑可實質上不含細菌、病毒或真菌污染或感染，包括(但不限於)存在HIV 1、HIV 2、HBV、HCV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、小病毒B19、EB病毒(Epstein-Barr virus)或疱疹病毒6。本文中所述之製劑可實質上不含支原體污染或感染。

本文中所述之RPE細胞在移植之後亦可充當功能性RPE細胞，其中RPE細胞在接受所移植之細胞之患者中在感覺神經性視網膜與脈絡膜之間形成單層。RPE細胞亦可為相鄰感光器提供營養素，且藉由吞噬除去脫落之感光器外 段。另外，本文中所述之RPE細胞與來源於眼睛供體之細胞相比可具有較大增生性潛力(例如，該等RPE細胞與眼睛供體之RPE細胞相比「較年輕」)。由此允許本文中所述之RPE細胞與來源於眼睛供體之細胞相比具有較長有效壽命。

包含RPE細胞之製劑可根據良好作業規範(GMP)(例如製劑符合GMP)及/或現行良好組織規範(GTP)(例如製劑可符合GTP)製備。

RPE細胞培養物

本發明亦提供實質上經純化之RPE細胞(包括人類RPE細胞)之培養物。本文中所述之RPE培養物可包含至少約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000或9,000個RPE細胞。培養物可包含至少約1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰個RPE細胞。

RPE細胞可經進一步培養以製造成熟RPE細胞之培養 物。RPE細胞可為成熟的，且RPE細胞可進一步培養於例如RPE-GM/MM或MDBK MM培養基中直至獲得所需成熟程度為止。此成熟程度可藉由監測成熟期間色素沉著程度之增加來測定。作為RPE-GM/MM或MDBK MM培養基之替代物，可使用功能上等同或類似之培養基。在不考慮用於使RPE細胞成熟之特定培養基之情況下，培養基可視情況補充以生長因子或藥劑。RPE細胞及成熟RPE細胞均為經分化之RPE細胞。然而，成熟RPE細胞特徵在於與經分化之RPE細胞相比色素含量增加。成熟及色素沉著之程度可藉由增加或降低經分化之RPE細胞之培養物的密度來調節。因此，RPE細胞之培養物可經進一步培養以製造成熟RPE細胞。或者，可降低含有成熟RPE細胞之培養物之密度，以降低成熟經分化之RPE細胞之百分比並增加經分化之RPE細胞的百分比。

RPE細胞可藉由比較該等細胞與活體內獲得之細胞之信使RNA轉錄物來鑑別。在胚胎幹細胞分化至RPE細胞期間在不同時間間隔下採集細胞之等分試樣，且針對上述標記中之任一者之表現進行分析。此等特徵顯示經分化之RPE細胞之特色。

RPE細胞培養物可為實質上經純化之培養物，其包含至少約30%、35%、40%、或45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%經分化之RPE細胞。實質上經純化之培養物可包含至少約30%、35%、40%、 或45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%成熟經分化之RPE細胞。

RPE細胞培養物可根據良好作業規範(GMP)(例如培養物符合GMP)及/或現行良好組織規範(GTP)(例如培養物可符合GTP)製備。

經極冷保藏之RPE細胞之製劑

RPE細胞可藉由此項技術中已知之任何適當方法(例如低溫冷凍)進行儲存，且可在適於儲存細胞之任何溫度下進行冷凍。舉例而言，細胞可冷凍於約-20℃、-80℃、-120℃、-130℃、-135℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃、-196℃、適於儲存細胞之任何其他溫度下。經低溫冷凍之細胞可儲存於適當容器中，且針對儲存製備以降低細胞損傷之風險並使細胞將在解凍後存活之可能性達至最大。RPE細胞可在分化之後、在活體外成熟之後或在培養一定時間之後立即經極冷保藏。RPE細胞亦可維持在室溫下，或冷藏在例如約4℃下。

類似地，提供極冷保藏RPE細胞之方法。可收集RPE細胞，在緩衝液或培養基中洗滌，計數，濃縮(經由離心)，調配於冷凍培養基(例如90% FBS/10% DMSO)中，或此等步驟之任何組合。舉例而言，可將RPE細胞接種於若干培養容器中且連續擴增。當RPE細胞經收集且在約4℃下維持於FBS中時，同時將若干燒瓶之RPE細胞合併成單個批次。RPE細胞亦可用鹽水溶液(例如DPBS)洗滌至少1、2、 3、4或5次。另外，在肌縮蛋白組織於細胞膜處且PAX6表現較低之後可極冷保藏RPE細胞。此外，小瓶可用原代及/或次代標籤進行標記。標籤上之資訊可包括細胞類型(例如hRPE細胞)、批號及日期、細胞數目(例如1×10⁶個細胞/毫升)、失效日期(例如應小瓶使用之推薦日期)、製造資訊(例如姓名及地址)、警告及儲存方式(例如儲存於液氮中)。

本文中所述之經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含至少約50,000至100,000個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑亦可包含至少約20,000至500,000個RPE細胞。此外，經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含至少約5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000或100,000個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含至少約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000、100,000或500,000個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含至少約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、 8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑之RPE細胞可為哺乳動物RPE細胞，包括人類RPE細胞。

另外，本文中所述之經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含每毫升至少約50,000至100,000個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑亦可包含每毫升至少約20,000至500,000個RPE細胞。此外，經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含每毫升至少約5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000及100,000個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含每毫升至少約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、75,000、80,000、100,000或500,000個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑可包含每毫升至少約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、 9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰個RPE細胞。經極冷保藏之RPE細胞製劑之RPE細胞可為哺乳動物RPE細胞，包括人類RPE細胞。

本發明之RPE細胞可在極冷保藏之後自儲存回收。自極冷保藏回收之RPE細胞亦維持其生存力及分化狀態。舉例而言，至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100% RPE細胞可在極冷保藏之後保留生存力及分化。另外，本發明之RPE細胞可經極冷保藏且在儲存至少約1、2、3、4、5、6或7天之後維持其生存力。本發明之RPE細胞亦可經極冷保藏且在儲存至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月之後維持其生存力。本發明之RPE細胞可經極冷保藏且在儲存至少約1、2、3、4、5、6或7年之後維持其生存力。舉例而言，本發明之RPE細胞可極冷保藏至少約4年且展示至少約80%生存力。包含RPE細胞之極冷保藏製劑可實質上不含DMSO。

製造RPE細胞之方法

利用主題方法分析之細胞群體可自多能幹細胞製造。可製造之細胞類型包括(但不限於)RPE細胞、RPE祖細胞、虹膜色素沉著上皮(IPE)細胞及其他視覺相關神經細胞，諸如中間神經元(例如內核層(INL)之「轉接(relay)」神經元) 及無軸索細胞。另外，可製造視網膜細胞、視桿、視錐及角膜細胞。提供眼睛之血管結構之細胞亦可利用本文中所述之方法製造。

在不受特定理論束縛之情況下，本發明者發現本文中所述之方法可經由FGF、EGF、WNT4、TGF-β及/或氧化應力作用於信號MAP-激酶及可能的C Jun末端激酶路徑，以誘導成對盒6(PAX6)轉錄因子之表現。PAX6與PAX2協同作用以經由MITF及Otx2之協調來轉錄RPE特異性基因(諸如酪胺酸酶(Tyr))及下游標靶(RPE 65、斑萎蛋白、CRALBP及PEDF)而使成熟RPE終末分化。參見WO 2009/051671，圖1。

本文中所述之RPE細胞可自多能幹細胞(諸如人類胚胎幹細胞)分化，且可在分子上不同於胚胎幹細胞、成人來源之RPE細胞及胎兒來源之RPE細胞。舉例而言，本文中所述之製造製程步驟可賦予最終RPE細胞產品獨特的結構及功能特徵，使得此等細胞酷似天然RPE細胞且不同於胎兒來源之RPE細胞或RPE細胞株(例如ARPE19)。

申請人先前已揭示用於自多能細胞製造RPE之方法。參見美國專利第7736896號、第7795025號及第7794704號及公開之國際申請案WO/2012/012803及WO 2011/063005，其各自以全文引用之方式併入本文中。RPE可自以多層群體或胚樣體形式培養之多能細胞製造。舉例而言，胚樣體可藉由在非附著條件下(例如在低附著性基底(substrate)上或以「懸滴」形式)培養多能細胞來形成。在此等培養物 中，ES細胞可形成命名為胚樣體之細胞之團塊或叢集。參見Itskovitz-Eldor等人，Mol Med.2000年2月；6(2)：88-95，其以全文引用之方式併入本文中。胚樣體通常最初以多能細胞之固體團塊或叢集形式形成，且隨時間推移一些胚樣體開始包括充液腔，前者在文獻中稱為「簡單」EB且後者稱為「囊性」胚樣體。同上。如申請人先前所報導，此等EB(固體及囊性形式兩者)中之細胞可分化且隨時間推移製造較多數目之RPE細胞。隨後可視情況將EB培養為附著性培養物且允許形成向外生長物。同樣地，申請人先前已報導允許過度生長並形成多層細胞群體之多能細胞可分化且隨時間推移形成RPE細胞。一旦形成RPE，其即易於基於其形態特徵(包括色素沉著及鵝卵石外觀)鑑別，且可經分離用於另一用途。

在RPE細胞形成之前，多能細胞可使用此項技術中已知之任何培養方法進行增殖及維持。舉例而言，多能細胞可在餵養細胞存在下培養，該等餵養細胞諸如為鼠類細胞(例如鼠類胚胎纖維母細胞(MEF))、人類餵養細胞(例如人類成人皮膚細胞、新生兒皮膚纖維母細胞(HNDF)等)。多能細胞可以無異物培養物之形式培養及/或在無餵養物之條件下培養。參見Klimanskaya等人，Lancet.2005年5月7日至13日；365(9471)：1636-41；Richards等人，Stem Cells.2003；21(5)：546-56；美國專利第7,410,798號；Ilic等人，Stem Cells Dev.2009年11月；18(9)：1343-5；Xu等人，Nat Biotechnol.2001年10月；19(10)：971-4，其各自以全文引用 之方式併入本文中。舉例而言，多能細胞可培養於基質(matrix)上。基質可選自由以下組成之群：層黏連蛋白、纖維結合蛋白、玻璃連結蛋白、蛋白聚糖、內動蛋白、膠原蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、膠原蛋白VIII、硫酸乙醯肝素、基質膠(來自恩格爾布雷特-霍爾姆-斯沃姆(Engelbreth-Holm-Swarm，EHS)小鼠肉瘤細胞之可溶性製備物)、CellStart、人類基膜提取物及其任何組合。基質可屬於人類或非人類動物來源，諸如牛、小鼠、或大鼠來源。多能細胞可培養於條件培養基中。舉例而言，條件培養基可以多能細胞為條件，該等多能細胞諸如為ES細胞、iPS細胞、餵養細胞、胎兒細胞等，其中任一者可為或可不為人類的。

在RPE形成期間，多能細胞可在ρ相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑存在下培養。可使用之例示性ROCK抑制劑為Stemgent之Stemolecule Y-27632，一種ρ相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑(參見Watanabe等人，Nat Biotechnol.2007年6月；25(6)：681-6)。

舉例而言，多能細胞生存力可藉由包括ROCK抑制劑來改良。在一例示性實施例中，多能細胞可在無餵養物條件下維持，諸如維持在基質膠或其他基質上。此後，胚樣體可由多能細胞形成，該等多能細胞在不使用胰蛋白酶、諸如使用EDTA、膠原酶或機械方式之情況下解離。胚樣體可在包含Y-27632其他ROCK抑制劑之培養基中形成。舉例而言，ROCK抑制劑可在由在基質膠或其他基質上培養之 多能細胞形成之胚樣體中促進細胞生存力。藉此可改良RPE細胞產率。

一種用於製造RPE細胞之例示性方法包含：(a)提供多能幹細胞；(b)在營養素豐富的低蛋白培養基中將多能幹細胞培養為胚樣體，其中該培養基視情況包含無血清B 27補充物；(c)在營養素豐富的低蛋白培養基中將胚樣體培養為附著性培養物，其中該培養基視情況包含無血清B 27補充物；(d)在營養素豐富的低蛋白培養基中培養(c)之細胞之附著性培養物，其中該培養基不包含無血清B 27補充物；(e)在能夠支持高密度體細胞培養物生長之培養基中培養(d)之細胞，藉此細胞培養物中出現RPE細胞；(f)自(e)之培養物中解離細胞或細胞團塊，較佳以機械方式或以化學方式(例如使用蛋白酶或其他酶、或其他解離培養基)；(g)自培養物中選擇RPE細胞，且將RPE細胞轉移至含有補充以生長因子之培養基之單獨培養物中，以製造經富集之RPE細胞培養物；及(h)使經富集之RPE細胞培養物增殖以製造RPE細胞。此等方法步驟可進行至少一次以製造實質上經純化之RPE細胞培養物。另外，此等方法步驟可重複至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上以製造較多RPE細胞。

另外，本發明亦提供一種用於製造成熟視網膜色素上皮(RPE)細胞之方法，該方法包含：(a)提供多能幹細胞；(b)在營養素豐富的低蛋白培養基中將多能幹細胞培養為胚樣體，其中該培養基視情況包含無血清B 27補充物；(c)在營 養素豐富的低蛋白培養基中將胚樣體培養為附著性培養物，其中該培養基視情況包含無血清B 27補充物；(d)在營養素豐富的低蛋白培養基中培養步驟(c)之細胞之附著性培養物，其中該培養基不包含無血清B 27補充物；(e)在能夠支持高密度體細胞培養物生長之培養基中培養(d)之細胞，藉此細胞培養物中出現RPE細胞；(f)自(e)之培養物中解離細胞或細胞團塊，較佳以機械方式或以化學方式(例如使用蛋白酶或其他酶、或其他解離培養基)；(g)自培養物中選擇RPE細胞，且將RPE細胞轉移至含有補充以生長因子之培養基之單獨培養物中，以製造經富集之RPE細胞培養物；(h)使經富集之RPE細胞培養物增殖；及(i)培養經富集之RPE細胞培養物以製造成熟RPE細胞。此等方法步驟可進行至少一次以製造實質上經純化之成熟RPE細胞培養物。另外，此等方法步驟可重複至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上以製造較多成熟RPE細胞。

對於相關步驟中之任一者而言，細胞可培養至少約1至10週。舉例而言，細胞可培養至少約3至6週。對於相關步驟中之任一者而言，細胞可培養在約1天與50天之間，例如至少約1至3天、3至4天、7天、4至9天、7至10天、7至12天、8至11天、9至12天、7至14天、14至21天及3至45天。細胞可培養約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50天。細胞可培養約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時。舉例而言，細胞可培養2至4小時及3至6小時。對於上述相關方法步驟中之各者而言，可將細胞在各步驟中培養相同時間段或在一或多個步驟中培養不同時間段。另外，可重複上述相關方法步驟中之任一者以製造更多的RPE細胞(例如規模放大以製造大量RPE細胞)。

在本文中所述之方法中，RPE細胞可自EB之附著性培養物中之細胞中開始分化。RPE細胞可基於其鵝卵石形態及開始出現色素沉著而在視覺上識別。隨著RPE細胞繼續分化，可觀察到RPE細胞叢集。

機械或酶促方法可用於自胚樣體培養物中之非RPE細胞叢集中選擇RPE細胞，或促進附著性細胞之繼代培養。例示性機械方法包括(但不限於)用吸液管研磨或用拔針切割。例示性酶促方法包括(但不限於)適於解離細胞之任何酶(例如胰蛋白酶(例如胰蛋白酶/EDTA)、膠原酶(例如膠原酶B、膠原酶IV)、分散酶、番木瓜蛋白酶、膠原酶與分散酶之混合物、膠原酶與胰蛋白酶之混合物)。非酶促溶液可用於解離細胞，諸如含有較高EDTA之溶液，例如基於漢克斯(Hanks)之細胞解離緩衝液。

RPE細胞可自胚樣體分化。自EB分離RPE細胞允許活體外在經富集之培養物中擴增RPE細胞。對於人類細胞而言，RPE細胞可自生長少於90天之EB獲得。另外，RPE細 胞可自生長至少約7至14天、14至28天、28至45天或45至90天之人類EB產生。可在任何時間間隔下將用於培養多能幹細胞、胚樣體及RPE細胞之培養基移除及/或替換成相同或不同的培養基。舉例而言，培養基在至少約0至7天、7至10天、10至14天、14至28天或28至90天之後移除及/或替換。另外，可至少每天、每兩天、或至少每三天替換培養基。

為了富集RPE細胞並建立實質上經純化之RPE細胞培養物，使用機械及/或化學(包括酶促)方法使RPE細胞可彼此解離並與非RPE細胞解離。隨後可將RPE細胞之懸浮液轉移至新鮮培養基及新培養容器中以提供經富集之RPE細胞群體。

RPE細胞可選自經解離之細胞且分別培養以製造實質上經純化之RPE細胞培養物。RPE細胞基於與RPE細胞有關之特徵選擇。舉例而言，可藉由鵝卵石細胞形態及色素沉著來識別RPE細胞。此外，存在若干已知RPE標記，包括：細胞視黃醛結合蛋白(CRALBP)，一種亦可見於頂微絨毛中之胞質蛋白；RPE65，一種參與類視黃素代謝之胞質蛋白；斑萎蛋白，貝斯特卵黃樣黃斑營養不良基因(Best vitelliform macular dystrophy gene，VMD2)之產物；及色素上皮來源之因子(PEDF)，一種具有血管生成抑制性質之48kD分泌型蛋白質。此等標記之信使RNA轉錄物可使用PCR(例如RT-PCR)或北方墨點(Northern blot)分析。此外，此等標記之蛋白質含量可使用免疫墨點技術 (immunoblot technology)或西方墨點(Western blot)分析。

RPE細胞亦可基於細胞功能選擇，諸如利用對脫落視桿及視錐外段之吞噬作用(或對其他受質(諸如聚苯乙烯珠粒)之吞噬作用)、吸收雜散光、維生素A代謝、類視黃素再生及組織修復來選擇。在RPE細胞植入適合之宿主動物(罹患天然產生之或經誘導之視網膜變性病況的人類或非人類動物)中之後，藉由測試活體內功能，例如使用行為測試、螢光血管攝影術、組織學、緊密接合傳導性亦可進行評估，或使用電子顯微術評估。

經富集之RPE細胞培養物可在適當培養基(例如EGM 2培養基)中培養。此培養基或功能上等同或類似培養基可補充以生長因子或試劑(例如bFGF、肝素、氫皮質酮、血管內皮生長因子、重組胰島素樣生長因子、抗壞血酸或人類表皮生長因子)。RPE細胞可在一段較長的培養時期(例如大於6週)內表型穩定。

視情況，RPE可在ρ相關蛋白激酶(ROCK)之抑制劑(諸如Stemgent之Stemolecule Y-27632)存在下培養。舉例而言，RPE可在ROCK抑制劑存在下培養，隨後極冷保藏。

多能幹細胞

本文中所述之方法可使用自多能幹細胞製造之經分化之細胞(諸如RPE細胞)。適合之多能幹細胞包括(但不限於)胚胎幹細胞，胚胎來源之幹細胞及誘導型多能幹細胞，不考慮獲得多能幹細胞之方法。多能幹細胞可使用例如此項技術中已知之方法產生。例示性多能幹細胞包括自胚泡期胚 胎之內細胞群(ICM)獲得之胚胎幹細胞、以及自卵裂期或桑椹期胚胎之一或多個卵裂球獲得(視情況不破壞剩餘胚胎)之胚胎幹細胞。該等胚胎幹細胞可自藉由受精或藉由無性方式製造之胚胎材料產生，該等無性方式包括體細胞核移置(SCNT)、孤雌生殖、細胞重新編程及單雄生殖。另外，適合之多能幹細胞包括(但不限於)人類胚胎幹細胞、人類胚胎來源之幹細胞及人類誘導型多能幹細胞，不考慮獲得多能幹細胞之方法。

多能幹細胞(例如hES細胞)可以懸浮培養物形式培養以製造胚樣體(EB)。胚樣體可以懸浮形式培養約7至14天。然而，在某些實施例中，EB可以懸浮形式培養少於7天(少於7、6、5、4、3、2天或少於1天)或多於14天。EB可在補充以B 27補充物之培養基中培養。

在於懸浮培養物中培養EB之後，可轉移EB以製造附著性培養物。舉例而言，EB可在培養基中接種至經明膠塗佈之盤上。當以附著性培養物形式培養時，EB可在與懸浮生長時相同的培養基類型中培養。當細胞以附著性培養物形式培養時，培養基可不補充以B 27補充物。此外，雖然培養基最初補充以B 27(例如持續少於或等於約7天)，但隨後在不存在B-27之情況下培養持續作為附著性培養物之剩餘時期。EB可以附著性培養物形式培養至少約14至28天。然而，在某些實施例中，EB可以附著性培養物形式培養少於約14天(少於14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天或少於1天)或多於約28天。

人類胚胎幹細胞

人類胚胎幹(hES)細胞可在本文中所述之方法中用作多能幹細胞。人類胚胎幹細胞(hES)包括胚泡之內細胞群(ICM)或自其他來源獲得之細胞之子代，且可保持實際上無限的多能性。hES細胞可自早期卵裂期胚胎之一或多個卵裂球獲得，視情況不破壞或不損傷胚胎。hES細胞可使用核移置進行製造。hES細胞亦可為誘導型多能細胞(iPS細胞)，其進一步詳細描述於下文。此外，可使用經極冷保藏之hES細胞。hES細胞可以此項技術中已知之任何方式培養，諸如在餵養細胞存在或不存在之情況下。舉例而言，hES細胞可培養於EB-DM、MDBK GM、hESC培養基、INVITROGEN®幹細胞培養基、OptiPro SFM、VP SFM、EGM 2或MDBK MM中。參見Stem Cell Information(Culture of Human Embryonic Stem Cells(hESC))[NIH網站，2010]。hES細胞可根據GMP標準使用及維持。

當在定義之條件中在餵養層上在培養物中生長時，hES細胞維持特定形態，形成扁平群落，該等群落包含少量緊密排列之細胞，該等細胞具有較高核與細胞質之比率、細胞之間的透明界限及明確可折射的群落邊界。hES細胞表現一組分子標記，諸如八聚體結合蛋白4(Oct-4，亦稱為Pou5f1)、階段特異性胚胎抗原(SSEA)3及SSEA 4、腫瘤排斥抗原(TRA)1 60、TRA 1 80、鹼性磷酸酶、NANOG及Rex 1。與分化至預定譜系之ICM之細胞相似，培養物中之hES細胞可經誘導分化。舉例而言，hES細胞可在本文中 所述之所定義之條件下分化成人類RPE。

可使用之人類胚胎幹細胞包括(但不限於)MA01、MA04、MA09、ACT 4、MA03、H1、H7、H9及H14。其他例示性細胞株包括NED1、NED2、NED3、NED4及NED5。亦參見NIH人類胚胎幹細胞登記(NIH Human Embryonic Stem Cell Registry)。一種可使用之例示性人類胚胎幹細胞為MA09細胞。MA09細胞之分離及製備先前描述在Klimanskaya等人.(2006)「Human Embryonic Stem Cell lines Derived from Single Blastomeres.」Nature 444：481-485中。

hES細胞最初可與鼠類胚胎餵養細胞(MEF)細胞共培養。MEF細胞可藉由曝露於絲裂黴素C而在有絲分裂上不活化，隨後將hES細胞接種於共培養物中，且因此MEF並不在培養物中增殖。另外，可在顯微鏡下檢查hES細胞培養物，且可挑選並丟棄含有非hES細胞形態之群落，例如使用幹細胞切割工具、藉由雷射切除或其他方式。通常，在收集hES細胞用於接種以用於胚樣體形成之點後，在製程中不使用其他MEF細胞。在無MEF之細胞培養物中在MEF移除與本文中所述之RPE細胞收集之間的時間可為至少1、2、3、4或5個繼代及至少約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100天之最小值。在無MEF之細胞培養物中在MEF移除與收集RPE細胞之間的時間亦可為至少約3個繼代及至少約80至90天之最小值。歸因於本文中所述之製造方法，本文中所述之RPE細胞培養物及製劑可 實質上不含小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)及人類胚胎幹細胞(hES)。

誘導型多能幹細胞(iPS細胞)

其他例示性多能幹細胞包括誘導型多能幹細胞(iPS細胞)，其係由因子(「重新編程因子」)組合表現或誘導表現使體細胞重新編程而產生。iPS細胞可使用胎兒、出生後、新生兒、少年或成人體細胞產生。iPS細胞可自細胞庫獲得。或者，iPS細胞可在開始分化成RPE細胞或其他細胞類型之前新生成(藉由此項技術中已知之方法)。iPS細胞之製造可為製造分化細胞之初始步驟。可使用來自特定患者或匹配供體之材料特異性產生iPS細胞，目標為產生組織匹配之RPE細胞。iPS細胞可由在欲接受者中實質上無免疫原性之細胞製造，例如由自體細胞或由與欲接受者組織相容之細胞製造。

誘導型多能幹細胞可由體細胞中一或多個重新編程因子表現或誘導表現來製造。體細胞為纖維母細胞，諸如皮膚纖維母細胞、滑膜纖維母細胞、或肺纖維母細胞，或非纖維母細胞之體細胞。體細胞係由表現至少1、2、3、4、5重新編程。重新編程因子可選自Oct 3/4、Sox2、NANOG、Lin28、c Myc及Klf4。重新編程因子之表現可由體細胞與至少一種誘導重新編程因子表現之劑(諸如小有機分子劑)接觸而誘導。

體細胞亦可使用表現重新編程因子(例如使用病毒載體、質體及其類似物)及誘導重新編程因子表現(例如使用 小有機分子)之組合方法重新編程。舉例而言，重新編程因子可表現於使用病毒載體(諸如反轉錄病毒載體或慢病毒載體)感染之體細胞中。此外，重新編程因子可使用非整合性載體(諸如游離型(episomal)質體)表現於體細胞中。參見例如Yu等人，Science.2009年5月8日；324(5928)：797-801，其以全文引用之方式併入本文中。當使用非整合性載體表現重新編程因子時，該等因子可表現於使用電穿孔、以該等載體進行體細胞之轉染或轉化之細胞中。舉例而言，在小鼠細胞中，使用整合性病毒載體之四種因子(Oct3/4、Sox2、c myc及Klf4)之表現足以使體細胞重新編程。在人類細胞中，使用整合性病毒載體之四種因子(Oct3/4、Sox2、NANOG及Lin28)之表現足以使體細胞重新編程。

重新編程因子一旦表現於細胞中，即可培養細胞。隨時間推移，具有ES特徵之細胞出現於盤中。可基於例如ES形態或基於可選擇或可偵測標記之表現來選擇並繼代培養細胞。可培養細胞以製造類似ES細胞之細胞(此等細胞為推定的iPS細胞)的培養物。

為了證實iPS細胞之多能性，可在一或多種多能性分析中測試細胞。舉例而言，可針對ES細胞標記之表現測試細胞；可在移植至SCID小鼠中時針對產生畸胎瘤之能力評估細胞；可針對分化產生所有三個胚層之細胞類型之能力評估細胞。一旦獲得多能iPS細胞，其即可用於製造RPE細胞。

視網膜色素上皮(RPE)細胞

本發明提供可自多能幹細胞(諸如人類胚胎幹細胞)分化之RPE細胞，且其可在分子上不同於胚胎幹細胞、成人來源之RPE細胞及胎兒來源之RPE細胞。根據本文及上文鑑別之相關申請案中所揭示之方法之例示性實施例製造的RPE可不同於可由先前方法及自其他RPE細胞來源得到的RPE。舉例而言，本文中所述之製造製程步驟可賦予最終RPE細胞產品獨特的結構及功能特徵，使得此等細胞不同於自其他來源(諸如胎兒來源之RPE細胞或RPE細胞株(例如ARPE19))獲得之經分離之RPE細胞。

另外，製造本文中所述之RPE細胞之方法之例示性實施例並不容許ES細胞，使得ES細胞不能存留且並不在RPE細胞培養物及製劑中造成不可接受之污染風險。

由本發明提供之細胞類型包括(但不限於)RPE細胞、RPE祖細胞、虹膜色素沉著上皮(IPE)細胞及其他視覺相關神經細胞，諸如中間神經元(例如內核層(INL)之「轉接」神經元)及無軸索細胞。本發明之實施例亦可提供視網膜細胞、視桿、視錐及角膜細胞以及提供眼睛血管結構之細胞。

RPE細胞可用於治療視網膜變性疾病，該等視網膜變性疾病歸因於視網膜脫離、視網膜發育不良、血管樣紋、近視性黃斑變性或視網膜萎縮或與許多視覺改變性疾病有關，該等視覺改變性疾病引起感光器損傷及失明，諸如為無脈絡脈畸型、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性(例如年 齡相關之黃斑部變性)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)。

RPE細胞可為穩定終末分化之RPE細胞，其並不去分化成非RPE細胞類型。本文中所述之RPE細胞可為功能性RPE細胞，其特徵在於整合至角膜後視網膜、視網膜下，或另外投與至人類或非人類動物中之能力。

RPE細胞可表現RPE細胞標記。舉例而言，諸如RPE65、PAX2、PAX6、酪胺酸酶、斑萎蛋白、PEDF、CRALBP、Otx2及MitF之標記之表現程度可相當於天然產生之RPE細胞中的表現程度。RPE細胞之成熟程度可藉由量測PAX2、PAX6及酪胺酸酶中之至少一者之表現或其各自表現程度來評估。

與此相反，RPE細胞可能不表現ES細胞標記。舉例而言，與在ES細胞中相比，ES細胞基因Oct-4、NANOG及/或Rex-1之表現程度在RPE細胞中可低約100至1000倍。舉例而言，RPE細胞可能實質上缺乏ES細胞標記之表現，該等ES細胞標記包括(但不限於)八聚體結合蛋白4(Oct-4，亦稱為Pou5f1)、階段特異性胚胎抗原(SSEA)-3及SSEA-4、腫瘤排斥抗原(TRA)-1-60、TRA-1-80、鹼性磷酸酶、NANOG、Rex-1、Sox2、TDGF-1、DPPA2、DPPA3(STELLA)、DPPA4及/或DPPA5。因此，與ES細胞相比，RPE細胞較佳實質上缺乏Oct-4、NANOG及/或Rex-1之表現。

與未經培養之RPE細胞或其他RPE細胞製劑相比，本文 中所述之RPE細胞亦可展示α整合素亞單元1至6或9之升高之表現程度。本文中所述之RPE細胞亦可展示α整合素亞單元1、2、3、4、5或9之升高之表現程度。本文中所述之RPE細胞可在促進α整合素亞單元1至6之表現之條件下培養。舉例而言，RPE細胞可用整合素活化劑(包括(但不限於)錳及活化單株抗體(單抗)TS2/16)培養。參見Afshari等人Brain(2010)133(2)：448-464。RPE細胞可塗於層黏連蛋白(1μg/mL)上且曝露於Mn²⁺(500μM)至少約8、12、24、36或48小時。此外，RPE細胞可培養若干繼代(例如至少約4、5、6、7或8個繼代)，此可增強α整合素亞單元表現。

RPE細胞可展現正常核型，表現RPE標記且不表現hES標記。

本文中所述之RPE細胞亦可基於細胞之色素沉著程度來鑑別及表徵。色素之變化可藉由RPE細胞培養及維持之密度及RPE在培養物中維持之持續時間來控制。快速分裂之經分化之RPE細胞色素沉著較少。相反，較緩慢分裂或非分裂RPE承襲其特徵性多角或六角形狀且藉由積聚黑色素及脂褐質來增強色素沉著程度。舉例而言，靜息RPE培養物(例如歸因於匯合)通常隨時間增強其色素沉著程度。因此，色素沉著之積聚充當RPE分化之指示，且與細胞密度有關之增強之色素沉著充當RPE成熟之指示。舉例而言，成熟RPE細胞可以較低密度繼代培養，使得色素沉著降低。在此情況下，可培養成熟RPE細胞以製造較不成熟之 RPE細胞。該等RPE細胞仍為表現RPE分化標記之經分化之RPE細胞。

本文中所述之RPE細胞可活體外維持其表型持續一段較長時期。舉例而言，RPE細胞可維持其表型持續至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個繼代。RPE細胞可維持其表型持續至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。RPE細胞可維持其表型持續至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週。

此外，本文中所述之RPE細胞可在移植之後維持其表型。RPE細胞可在移植之後維持其表型持續接受者之壽命。舉例而言，RPE細胞可在移植之後維持其表型持續至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。另外，RPE細胞可在移植之後維持其表型持續至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週。RPE細胞可在移植之後維持其表型持續至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。RPE細胞可在移植之後維持其表型持續至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年或20年以上。

RPE細胞群體之黑色素含量

本發明之例示性實施例提供一種RPE細胞群體，其具有較低或中等平均色素沉著程度；及一種醫藥製劑，其包含具有較低或中等平均色素沉著程度之RPE細胞。如以下實 例中進一步描述，申請人已展示具有相對較低色素沉著程度之RPE細胞在量測細胞附著及存活能力之分析中表現較好。在不意欲受理論限制下，咸信隨著RPE細胞變得較成熟，其在極冷保藏之後可變得較不能夠形成細胞附著物、存活及增殖，其可能歸因於較成熟RPE細胞中所含之較強色素沉著(黑色素)程度及/或一般趨向於與較強色素沉著有關之成熟RPE之其他表型(該等表型可包括例如細胞骨架變化，膜組合物、細胞表面受體表現、附著強度、核架構、基因表現或其他表型或表型之組合)。色素沉著程度可以針對群體之每細胞平均黑色素之形式量測，例如表示為每細胞皮克(皮克/細胞)，如應理解通常在群體中之細胞中之黑色素程度方面可存在一定變化。舉例而言，平均黑色素含量可低於8皮克/細胞、低於7皮克/細胞、低於6皮克/細胞或低於5皮克/細胞，例如在0.1皮克/細胞至8皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至7皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至6皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至5皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至4皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至3皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至2皮克/細胞之間、在0.1皮克/細胞至1皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至8皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至7皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至6皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至5皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至4皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至3皮克/細胞之間、在1皮克/細胞至2皮克/細胞之間、在2皮克/細胞至6皮克/細胞之間、在3皮克/細胞至5皮克/細胞之間、或在4皮 克/細胞至5皮克/細胞之間(諸如4.2皮克/細胞至4.8皮克/細胞)或在0.1皮克/細胞至5皮克/細胞之間。在另一實例中，平均黑色素含量可低於5皮克/細胞，例如在0.1皮克/細胞至5皮克/細胞之間、在0.2皮克/細胞至5皮克/細胞之間、0.5皮克/細胞至5皮克/細胞、1皮克/細胞至5皮克/細胞、2皮克/細胞至5皮克/細胞、3皮克/細胞至5皮克/細胞、4皮克/細胞至5皮克/細胞或4.5皮克/細胞至5皮克/細胞。

黑色素含量可使用多種方法(包括利用細胞提取物之方法、基於FACS之方法及其他方法)量測。參見例如Boissy等人，Cytometry.1989年11月；10(6)：779-87；Swope等人，J Invest Dermatol.1997年9月；109(3)：289-95；Watts等人，Cancer Res 1981；41：467-472；Rosenthal等人，Anal Biochem.1973年11月；56(1)：91-9，其各自以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，為了測定平均黑色素含量，可測定代表性樣品中之細胞數目，可溶解代表性樣品中之細胞，且測定(例如利用分光光度法)之細胞溶解物(例如來自NaOH提取之細胞集結粒)之總黑色素含量，且將其除以代表性樣品中之細胞數目，得到平均的每細胞黑色素含量。視情況，代表性樣品中之細胞數目可藉由將培養物中除RPE以外之細胞忽略不計來測定(例如將對一或多種RPE標記呈陽性及/或展現特徵性RPE細胞形態之細胞計數)，藉此得到代表性樣品中平均的每RPE細胞黑色素含量。

可易於獲得具有所需平均黑色素含量之RPE群體。舉例而言，非分裂性代謝活性RPE(例如在匯合培養物中)之黑 色素含量趨向於隨時間推移因合成之黑色素積聚而增加，然而所積聚之黑色素藉由細胞分裂而稀釋，使得黑色素含量在分裂性細胞中相對較低。參見例如Dunn等人，Exp Eye Res.1996年2月；62(2)：155-69。因此，藉由選擇適當生長歷史，例如以靜息群體形式維持產生所需平均黑色素含量之持續時間，例如作為靜息培養物持續1、2、3、4、5或6天、或1、2、3、4、5、6、7、8週或8週以上，可獲得具有所需平均黑色素含量之RPE群體。亦可用於控制平均黑色素含量之其他生長歷史包括以靜息群體形式維持一定時間，隨後允許細胞再分裂特定時間或分裂次數(藉此使自靜息群體中獲得之細胞之平均黑色素含量降低)。黑色素含量亦可藉由使用不同培養基及/或培養基補充物來控制，例如已報導經培養之RPE中之黑色素積聚在蛋白激酶抑制劑(例如H-7、W-7、H-8及星形孢菌素)存在下降低(Kishi等人，Cell Biol Int.2000；24(2)：79-83)，並在全反式視黃酸(10^-5M至10^-7M)或TGF-β1(1U/ml至100U/ml)存在下增高(Kishi等人，Curr Eye Res.1998年5月；17(5)：483-6)。黑色素含量亦可藉由用以下各者處理細胞來增強：鋅α-2-醣蛋白(ZAG)(參見美國專利7,803,750)及/或腺苷-1受體拮抗劑、腺苷-2受體促效劑、腺苷-1受體促效劑、腺苷-2受體拮抗劑、以及腺苷-1受體拮抗劑、腺苷-2受體促效劑之組合、或其組合(參見美國專利5,998,423)。上述文件各自以全文引用之方式併入本文中。

或者或除上述方法以外，亦可經由細胞分選(例如使用 流式細胞儀)獲得具有所需平均黑色素含量之RPE細胞。舉例而言，含有黑色素之細胞可藉由其光散射特徵(包括升高之側散射及降低之前散射)偵測；此等特徵可用於藉由色素沉著程度分選群體，藉此純化具有所需平均黑色素含量之群體。Boissy等人，Cytometry.1989年11月；10(6)：779-87；Swope等人，J Invest Dermatol.1997年9月；109(3)：289-95，其各自以全文引用之方式併入本文中。

工程化人類胚胎幹細胞中之MHC基因以獲得複雜性降低之RPE細胞。

人類胚胎幹(hES)細胞(例如可如本文所述獲得RPE之人類胚胎幹(hES)細胞)可自人類胚胎幹細胞文庫獲得。人類胚胎幹細胞文庫可包含幹細胞，其各自對於人群中存在之至少一個MHC等位基因為半合子、同種接合子或無效合子，其中該幹細胞文庫之各成員相對於該文庫之剩餘成員對於不同組之MHC等位基因為半合子、同種接合子或無效合子。人類胚胎幹細胞文庫可包含對於人群中存在之所有MHC等位基因為半合子、同種接合子或無效合子之幹細胞。在本發明之情形下，對於一或多種組織相容性抗原基因為同種接合子之幹細胞包括對於一或多種(且在一些實施例中，所有)該等基因為無效合子之細胞。基因座之無效合子意謂該基因在該座為無效的(亦即該基因之兩個等位基因均缺失或不活化)。

hES細胞可包含對細胞MHC複合物中之姐妹染色體等位基因之一的修飾。多種用於產生基因修飾之方法(諸如基 因打靶)可用於修飾MHC複合物中之基因。另外，可隨後將細胞中經修飾之MHC複合體等位基因工程化為同種接合子以便使姐妹染色體上存在相同等位基因。可利用諸如雜合性丟失(LOH)之方法來將細胞工程化以在MHC複合體上具有同種接合子等位基因。舉例而言，可靶向來自親本等位基因之一組MHC基因中之一或多個基因來產生半合子細胞。可藉由基因打靶或LOH移除另一組MHC基因以製備無效株。此無效株可進一步用作丟掉HLA基因陣列或個別基因之胚胎細胞株以製備半合子或同種接合子庫，該庫具有除此外一致的遺傳背景。對所有MHC基因為無效合子之幹細胞可藉由此項技術中已知之標準方法(諸如基因打靶及/或雜合性丟失(LOH))來製造。參見，例如美國專利申請公開案2004/0091936、2003/0217374及2003/0232430及美國臨時專利申請案第60/729,173號。

因此，本發明係關於獲得具有較低MHC複雜性之RPE細胞(包括RPE細胞文庫)之方法。具有較低MHC複雜性之RPE細胞可用於增加用於治療應用之可獲得之細胞的供應，因為其可消除與患者匹配有關之困難。該等細胞可自經工程化對於MHC複合物基因為半合子或同種接合子之幹細胞獲得。

本發明亦提供RPE細胞(及/或RPE譜系細胞)之文庫，其中選擇數種ES細胞株並使其分化成RPE細胞。此等RPE細胞及/或RPE譜系細胞可用於需要基於細胞之療法之患者。本發明亦提供RPE細胞之文庫，該等RPE細胞各自對於人 群中存在之至少一個MHC等位基因為半合子、同種接合子或無效合子，其中該RPE細胞文庫之各成員相對於該文庫之剩餘成員對於不同組之MHC等位基因為半合子、同種接合子或無效合子。本發明提供一種人類RPE細胞之文庫，該等人類RPE細胞對人群中存在之所有MHC等位基因為半合子、同種接合子或無效合子。

培養基

能夠支持細胞培養物之任何培養基均可用於本文中所述之方法，諸如用於病毒、細菌或真核細胞培養物之培養基。舉例而言，培養基可為EB-DM或RPE-GM/MM。如另一實例，培養基可為高營養素無蛋白之培養基或高營養素低蛋白培養基。另外，培養基亦可包括諸如以下各者之營養素組分：白蛋白、B-27補充物、乙醇胺、胎球蛋白、麩醯胺酸、胰島素、蛋白腖、經純化之脂蛋白材料、亞硒酸鈉、運鐵蛋白、維生素A、維生素C或維生素E。舉例而言，營養素豐富的低蛋白培養基可為支持培養物中細胞生長且具有低蛋白含量之任何培養基。舉例而言，營養素豐富的低蛋白培養基包括(但不限於)MDBK-GM、OptiPro SFM、VP-SFM、DMEM RPMI培養基1640、IDMEM、MEM、F-12營養素混合物、F-10營養素混合物EGM-2、DMEM/F-12培養基、培養基1999或MDBK-MM。亦參見表1。另外，營養素豐富的低蛋白培養基可為不支持胚胎幹細胞生長或維持之培養基。

當使用低蛋白培養基時，培養基可含有至少約20%、 19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.20%、0.10%、0.05%、0.02%、0.016%、0.015%或0.010%之含有動物來源之蛋白質(例如10% FBS)的組分。應注意提及低蛋白培養基中存在之蛋白質百分比係指單獨培養基且不考慮例如B-27補充物中存在之蛋白質。因此，應理解當細胞培養於低蛋白培養基及B-27補充物中時，培養基中存在之蛋白質百分比可能較高。

用無血清B-27補充物補充低蛋白或無蛋白培養基。B27補充物之營養素組分可包含生物素、L-肉鹼、皮質酮、乙醇胺、D+-半乳糖、還原型麩胱甘肽、亞麻油酸、次亞麻油酸、孕酮、腐肉鹼、乙酸視黃酯、硒、三碘-1-甲狀腺胺酸(T3)、DL-α-生育酚(維生素E)、DL-α-生育酚乙酸酯、牛血清白蛋白、過氧化氫酶、胰島素、超氧化歧化酶及運鐵蛋白。當細胞培養於補充以B-27之無蛋白培養基中時，無蛋白係指添加B-27之前的培養基。

本文中所述之生長因子、試劑及其他補充物可單獨或與其他因子、試劑或補充物組合使用以用於納入培養基中。可在細胞培養期間或之後即刻或任何時候向培養基中添加因子、試劑及補充物。

培養基亦可含有諸如以下之補充物：肝素、氫皮質酮、抗壞血酸、血清(例如胎牛血清)、或生長基質(例如來自牛角膜上皮之細胞外基質、MATRIGEL®(基膜基質)或明 膠)、纖維結合蛋白、纖維結合蛋白之蛋白水解片段、層黏連蛋白、血小板反應蛋白、聚蛋白聚糖(aggrecan)及共結合蛋白聚糖(syndezan)。

培養基可補充以一或多種因子或試劑。

可使用之生長因子包括例如EGF、FGF、VEGF及重組胰島素樣生長因子。可用於本發明之生長因子亦包括6Ckine(重組)、活化素A、α-干擾素、α-干擾素、雙調蛋白、血管生成素、β-內皮細胞生長因子、β動物纖維素、B-干擾素、腦源神經營養因子、心營養素-1、睫狀神經營養因子、細胞因子誘導之嗜中性白血球趨化物-1、內皮細胞生長補充物、嗜酸性粒細胞趨化因子、表皮生長因子、上皮嗜中性白血球活化肽-78、促紅細胞生成素原、雌激素受體-α、雌激素受體-β、纖維母細胞生長因子(酸性/鹼性，經肝素穩定，重組)、FLT-3/FLK-2配位體(FLT-3配位體)、γ-干擾素、膠質細胞株來源之神經營養因子、Gly-His-Lys、粒細胞群落刺激因子、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子、GRO-α/MGSA、GRO-B、GRO-γ、HCC-1、肝素結合性表皮生長因子樣生長因子、肝細胞生長因子、調蛋白-α(EGF域)、胰島素生長因子結合蛋白-1、胰島素樣生長因子結合蛋白-1/IGF-1複合體、胰島素樣生長因子、胰島素樣生長因子II、2.5S神經生長因子(NGF)、7S-NGF、巨噬細胞發炎性蛋白-1β、巨噬細胞發炎性蛋白-2、巨噬細胞發炎性蛋白-3α、巨噬細胞發炎性蛋白-3β、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、 神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、NGF-β(人類或大鼠重組)、製瘤素M(人類或小鼠重組)、垂體提取物、胎盤生長因子、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、多效蛋白、rantes、幹細胞因子、基質細胞來源之因子1B/前B細胞生長刺激因子、血小板生成素、轉型生長因子α、轉型生長因子-β1、轉型生長因子-β2、轉型生長因子-β3、轉型生長因子-β5、腫瘤壞死因子(α及B)及血管內皮生長因子。

可根據本發明使用之試劑包括細胞因子，諸如干擾素-α、干擾素-α A/D、干擾素-β、干擾素-γ、干擾素-γ誘導蛋白-10、介白素-1、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素-5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-15、介白素-17、角質細胞生長因子、瘦素、白血病抑制因子、巨噬細胞群落刺激因子及巨噬細胞發炎性蛋白-1α。

培養基可補充以激素及激素拮抗劑，包括(但不限於)17B-雌二醇、促腎上腺皮質激素、腎上腺髓質素(adrenomedullin)、α-黑素細胞刺激素、絨毛膜促性腺激素、皮質類固醇結合球蛋白、皮質酮、地塞米松、雌三醇、促濾泡素、胃泌素1、升糖素、促性腺激素、氫皮質酮、胰島素、胰島素樣生長因子結合蛋白、L-3,3',5'-三碘甲狀腺胺酸、L-3,3',5-三碘甲狀腺胺酸、瘦素、黃體化激素、L-甲狀腺素、褪黑激素、MZ-4、催產素、副甲狀腺素、PEC-60、垂體生長激素、孕酮、催乳激素、胰泌素、 性激素結合球蛋白、促甲狀腺激素、促甲狀腺激素釋放因子、甲狀腺素結合球蛋白及加壓素。培養基可補充以各種因子之抗體，包括(但不限於)抗低密度脂蛋白受體抗體、抗孕酮受體、內部抗體、抗α干擾素受體鏈2抗體、抗c-c趨化因子受體1抗體、抗CD 118抗體、抗CD 119抗體、抗群落刺激因子-1抗體、抗CSF-1受體/c-fins抗體、抗表皮生長因子(AB-3)抗體、抗表皮生長因子受體抗體、抗表皮生長因子受體、磷酸化特異性抗體、抗表皮生長因子(AB-1)抗體、抗促紅細胞生成素受體抗體、抗雌激素受體抗體、抗雌激素受體、C端抗體、抗雌激素受體-B抗體、抗纖維母細胞生長因子受體抗體、抗纖維母細胞生長因子、鹼性抗體、抗γ-干擾素受體鏈抗體、抗γ-干擾素人類重組抗體、抗GFR α-1 C端抗體、抗GFR α-2 C端抗體、抗粒細胞群落刺激因子(AB-1)抗體、抗粒細胞群落刺激因子受體抗體、抗胰島素受體抗體、抗胰島素樣生長因子-1受體抗體、抗介白素-6人類重組抗體、抗介白素-1人類重組抗體、抗介白素-2人類重組抗體、抗瘦素小鼠重組抗體、抗神經生長因子受體抗體、抗-p60、雞抗體、抗副甲狀腺素樣蛋白抗體、抗血小板衍生生長因子受體抗體、抗血小板衍生生長因子受體-B抗體、抗血小板衍生生長因子-α抗體、抗孕酮受體抗體、抗視黃酸受體-α抗體、抗甲狀腺激素核受體抗體、抗甲狀腺激素核受體-α1/Bi抗體、抗運鐵蛋白受體/CD71抗體、抗轉型生長因子-α抗體、抗轉型生長因子-B3抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體及抗血管內皮生 長因子抗體。

潛在適用於本文中所述之方法之例示性生長培養基列於表1中。

治療方法

藉由本文中所述之方法製造之RPE細胞及包含RPE細胞之醫藥製劑可用於基於細胞之治療。本發明提供用於治療涉及視網膜變性之病況之方法，該方法包含投與有效量之包含RPE細胞之醫藥製劑，其中該等RPE細胞活體外自多能幹細胞獲得。涉及視網膜變性之病況包括例如無脈絡脈畸型、糖尿病性視網膜病變、視網膜萎縮、視網膜脫離、視網膜發育不良、色素性視網膜炎、血管樣紋(亦稱為Knapp紋或Knapp帶，特徵在於可變得鈣化及開裂之布魯赫膜中之較小裂口)及近視性黃斑變性(亦稱為變性近視)。本文中所述之RPE細胞亦可用於治療黃斑變性之方法，該黃斑變性包括(但不限於)年齡相關之黃斑部變性(乾性或濕性)、北卡羅來納黃斑營養不良、索爾斯比氏眼底營養不良、斯特格氏病、圖形樣營養不良、貝斯特氏症、蜂窩狀視網膜萎縮、多英氏蜂窩狀脈絡膜炎、顯性玻璃膜疣及放射狀玻璃膜疣。本文中所述之RPE細胞亦可用於治療帕金森氏症(Parkinson's disease，PD)之方法。

描述於先前公開案中之細胞移植之常見特徵為較低移植物存活率，例如在許多細胞移植研究中，往往在移植之後立即存在細胞損失(例如在第一週內)。此細胞損失並非因經移植之細胞之排斥反應而出現，而是因一定百分比之細胞不能保留在移植部位而出現。此細胞保留之缺乏很可能歸因於許多因素，諸如細胞未能附著於下層結構，缺乏充足營養素或在移植部位之物理應力。在此最初細胞數目下降之後，研究與研究之間在移植之後不同時間下之細胞存活率可大大不同。因此，雖然一些研究展示數目上持續降低，但其他研究展示經移植之細胞可達至穩定數目之結果。然而，將移植視為成功之一重要因素為在細胞移植之後具有存活移植物之接受者之百分比。

與先前製劑對比，本文中所述之醫藥製劑中之RPE細胞可在移植之後長期存活。舉例而言，RPE細胞可存活至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。另外，RPE細胞可存活至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週；至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個月；或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。另外，RPE細胞可在移植接受者之整個壽命中存活。另外，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%本文中所述之RPE細胞之接受者可展示經移植之RPE細胞存活。另外，本文中所述之RPE細胞可成功結合至移植接受者之RPE層中，形成細胞之半連續株，且保留關鍵RPE分子標記(例如RPE65及斑萎蛋 白)之表現。本文中所述之RPE細胞亦可附著於布魯赫膜，在移植接受者中形成穩定RPE層。此外，本文中所述之RPE細胞實質上不含ES細胞，且移植接受者並不在移植部位展示異常生長或腫瘤形成。

治療罹患與視網膜變性有關之病況之患者的方法可包含局部投與本發明之組合物(例如藉由眼內注射或插入包含本發明醫藥製劑之基質)。本發明醫藥製劑之眼內投與包括例如傳遞至玻璃體中、經角膜、結膜下、視網膜下、黃斑下(例如藉由經小窩黃斑下注射)、近鞏膜(juxtascleral)、鞏膜後、及眼筋膜囊下(sub-tenon)部分。參見例如美國專利第7,794,704號、第7,795,025號、第6,943,145號及第6,943,153號。

本發明亦提供一種向患者中投與已自複雜性降低之胚胎幹細胞獲得之人類RPE細胞的方法。此方法可包含：(a)鑑別需要涉及向他或她投與人類RPE細胞之治療的患者；(b)鑑別患者細胞表面上表現之MHC蛋白質；(c)提供藉由本發明製造RPE細胞之方法製備之MHC複雜性降低之人類RPE細胞的文庫；(d)自該文庫中選擇與此患者細胞上之MHC蛋白質匹配的RPE細胞；(e)將來自步驟(d)之任何細胞投與該患者。此方法可在區域性中心進行，諸如醫院、診所、醫師辦公室及其他健康照護機構。另外，選擇作為與患者匹配之RPE細胞，若以較小細胞數目儲存，則可在患者治療之前擴增。

在移植之前，與未經培養之RPE細胞或其他RPE細胞製 劑相比，RPE細胞可在增強α整合素亞單元1至6或9之表現之條件下培養。本文中所述之RPE細胞可經培養以提高α整合素亞單元1、2、3、4、5、6或9之表現程度。本文中所述之RPE細胞可在促進α整合素亞單元1至6之表現之條件下培養。舉例而言，RPE細胞可用整合素活化劑(包括(但不限於)錳及活化單株抗體(單抗)TS2/16)培養。參見Afshari等人Brain(2010)133(2)：448-464。

特定治療療法、投藥途徑及佐劑療法可基於特定病況、病況之嚴重度及患者之整體健康狀態特製。投與包含RPE細胞之醫藥製劑可有效減輕症狀之嚴重度及/或預防患者病況之進一步退化。舉例而言，投與包含RPE細胞之醫藥製劑可改良患者之視力。另外，在某些實施例中，投與RPE細胞可有效充分恢復任何視覺損失或其他症狀。另外，RPE細胞投與可治療損傷內源性RPE層之症狀。

RPE細胞之醫藥製劑

RPE細胞可用醫藥學上可接受之載劑調配。舉例而言，RPE細胞可單獨投與或作為醫藥調配物之組分投與。主題化合物可經調配以用於以任何便利方式投與以用於藥物中。適於投與之醫藥製劑可包含RPE細胞，其與以下各者組合：一或多種醫藥學上可接受之無菌等張水溶液或非水溶液(例如平衡鹽溶液(BSS))、分散液、懸浮液或乳液、或在即將使用前復原成無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末，其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑細菌劑、溶質或懸浮劑或增稠劑。例示性醫藥製劑包含與ALCON^® BSS PLUS^®(一種平衡鹽溶液，其在各毫升水中含有7.14mg氯化鈉、0.38mg氯化鉀、0.154mg氯化鈣二水合物、0.2mg氯化鎂六水合物、0.42mg磷酸氫二鈉、2.1mg碳酸氫鈉、0.92mg葡萄糖、0.184mg二硫化麩胱甘肽(氧化型麩胱甘肽)、鹽酸及/或氫氧化鈉(將pH值調節至約7.4))組合之RPE細胞。

本發明之例示性組合物可為適用於治療人類患者之調配物，諸如無熱原質或基本上無熱原質且無病原體。在投藥時，用於本發明之醫藥製劑可呈無熱原質、無病原體之生理上可接受之形式。用於本文中所述之方法之包含RPE細胞之製劑可以懸浮液、凝膠、膠體、漿液或混合物形式移植。另外，製劑可理想地囊封或以黏性形式注射至玻璃體液中以用於傳遞至視網膜或脈絡膜損傷部位。此外，在注射時，經極冷保藏之RPE細胞可用市售平衡鹽溶液再懸浮以獲得所需重量莫耳滲透濃度及濃度以用於藉由視網膜下注射投與。製劑可投與不因疾病完全損失之周心黃斑區域，該區域可促進所投與之細胞之附著及/或存活。

本發明之組合物可包括ρ相關蛋白激酶(ROCK)之抑制劑，諸如Stemgent之Stemolecule Y-27632。舉例而言，例示性組合物可包括RPE及ROCK抑制劑，其可以足以促進在投與患者之後RPE存活及/或移入的量存在。

本發明之RPE細胞可藉由眼內注射以醫藥學上可接受之眼科調配物形式傳遞。舉例而言，當藉由玻璃體內注射投與調配物時，可濃縮溶液以便可傳遞最小化之體積。注射 劑之濃度可為有效且無毒之任何量，此取決於本文中所述之因素。用於治療患者之RPE細胞之醫藥製劑以至少約10⁴個細胞/毫升之劑量調配。用於治療患者之RPE細胞製劑以下列劑量調配：至少約10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰個RPE細胞/毫升。舉例而言，RPE細胞可調配於醫藥學上可接受之載劑或賦形劑中。

本文中所述之RPE細胞之醫藥製劑可包含至少約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000或9,000個RPE細胞。RPE細胞之醫藥製劑可包含至少約1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰個RPE細胞。RPE細胞之醫藥製劑可包含至少約1×10²至1×10³個、1×10²至1×10⁴個、1×10⁴至1×10⁵個或1×10³至1×10⁶個RPE細胞。RPE細胞之醫藥製劑可包含至少約10,000、20,000、25,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000或200,000個RPE細胞。舉例而言，RPE細胞之醫藥製劑可 在至少約50μL至200μL之體積中包含至少約20,000至200,000個RPE細胞。另外，RPE細胞之醫藥製劑可在150μL之體積中包含約50,000個RPE細胞，在150μL之體積中包含約200,000個RPE細胞，或在至少約150μL之體積中包含至少約180,000個RPE細胞。

在上述醫藥製劑及組合物中，RPE細胞之數目或RPE細胞之濃度可藉由計數活細胞及排除非活細胞來測定。舉例而言，非活RPE可藉由不能排斥活體染料(諸如錐蟲藍(Trypan Blue))、或使用功能分析(諸如附著於培養基底之能力、吞噬作用等)來偵測。另外，RPE細胞之數目或RPE細胞之濃度可藉由計數表現一或多種RPE細胞標記之細胞及/或排除表現一或多種指示除RPE以外之細胞類型之標記的細胞來測定。

可調配RPE細胞以用於在醫藥學上可接受之眼科媒劑中傳遞，以便使製劑保持與眼表面接觸持續允許細胞滲透入受影響之眼睛區域的充足時間段，該等受影響之眼睛區域例如為前房、後房、玻璃體、房水、玻璃體液、角膜、虹膜/睫毛、晶狀體、脈絡膜、視網膜、鞏膜、脈絡膜上腔、結膜、結膜下腔、鞏膜外腔、角膜內腔、角膜外腔、平坦部(pars plana)、手術誘導之無血管區或黃斑。

RPE細胞可含於細胞層片中。舉例而言，包含RPE細胞之細胞層片可藉由在可剝離完整細胞層片之基底上培養RPE細胞來製備，該基底例如為熱反應性聚合物，諸如熱反應性聚(N-異丙基丙烯醯胺)(PNIPAAm)接枝之表面，在 其上細胞在培養溫度下附著並增殖，且隨後在溫度變化後，表面特徵經改變，引起經培養之細胞層片之剝離(例如藉由冷卻至下限臨界溶解溫度(LCST)以下)(參見da Silva等人，Trends Biotechnol.2007年12月；25(12)：577-83；Hsiue等人，Transplantation.2006年2月15日；81(3)：473-6；Ide,T.等人(2006)；Biomaterials 27,607-614；Sumide,T.等人(2005),FASEB J.20,392-394；Nishida,K.等人(2004),Transplantation 77,379-385；及Nishida,K.等人(2004),N.Engl.J.Med.351,1187-1196，其各自以全文引用之方式併入本文中)。細胞層片可附著於適於移植之基底，諸如當將層片移植宿主生物體中時可活體內溶解之基底，例如藉由以下方式製備：在適於移植之基底上培養細胞，或將來自另一基底(諸如熱反應性聚合物)之細胞剝離至適於移植之基底上。潛在適於移植之例示性基底可包含明膠(參見Hsiue等人，上文)。可適於移植之替代性基底包括基於血纖維蛋白之基質及其他基質。細胞層片可用於製造供預防或治療視網膜變性疾病用之藥物。RPE細胞層片可經調配以用於引入有需要之個體之眼睛中。舉例而言，細胞層片可在移植RPE細胞層片之情況下藉由窩下膜切開術引入有需要之眼睛中，或可用於製造供在窩下膜切開術之後用於移植用之藥物。

根據本文中所述之方法投與之製劑體積可視以下因素而定：諸如投藥模式、RPE細胞數目、患者之年齡及體重以及所治療之疾病之類型及嚴重度。若藉由注射投與，則本 發明之RPE細胞之醫藥製劑之體積可為至少約1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、4mL或5mL。體積可為至少約1mL至2mL。舉例而言，若藉由注射投與，則本發明之RPE細胞之醫藥製劑之體積可為至少約1μL(微升)、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL、26μL、27μL、28μL、29μL、30μL、31μL、32μL、33μL、34μL、35μL、36μL、37μL、38μL、39μL、40μL、41μL、42μL、43μL、44μL、45μL、46μL、47μL、48μL、49μL、50μL、51μL、52μL、53μL、54μL、55μL、56μL、57μL、58μL、59μL、60μL、61μL、62μL、63μL、64μL、65μL、66μL、67μL、68μL、69μL、70μL、71μL、72μL、73μL、74μL、75μL、76μL、77μL、78μL、79μL、80μL、81μL、82μL、83μL、84μL、85μL、86μL、87μL、88μL、89μL、90μL、91μL、92μL、93μL、94μL、95μL、96μL、97μL、98μL、99μL、100μL、101μL、102μL、103μL、104μL、105μL、106μL、107μL、108μL、109μL、100μL、111μL、112μL、113μL、114μL、115μL、116μL、117μL、118μL、119μL、120μL、121μL、122μL、123μL、124μL、125μL、126μL、127μL、128μL、129μL、130μL、131uL、132μL、133μL、134μL、135μL、136μL、137 μL、138μL、139μL、140μL、141μL、142μL、143μL、144μL、145μL、146μL、147μL、148μL、149μL、150μL、151μL、152μL、153μL、154μL、155μL、156μL、157μL、158μL、159μL、160μL、161μL、162μL、163μL、164μL、165μL、166μL、167μL、168μL、169μL、170μL、171μL、172μL、173μL、174μL、175μL、176μL、177μL、178μL、179μL、180μL、181μL、182μL、183μL、184μL、185μL、186μL、187μL、188μL、189μL、190μL、191μL、192μL、193μL、194μL、195μL、196μL、197μL、198μL、199μL或200μL。舉例而言，本發明之製劑之體積可為至少約10μL至50μL、20μL至50μL、25μL至50μL或1μL至200μL。本發明之製劑之體積可為至少約10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL或200μL或200μL以上。

舉例而言，製劑可包含每微升至少約1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴或9×10⁴個RPE細胞。製劑可包含每微升2000個RPE細胞，例如每50微升100,000個RPE細胞或每90微升180,000個RPE細胞。

治療視網膜變性之方法可另外包含投與免疫抑制劑。可使用之免疫抑制劑包括(但不限於)抗淋巴細胞球蛋白 (ALG)多株抗體、抗胸腺細胞球蛋白(ATG)多株抗體、硫唑嘌呤、BASILIXIMAB®(抗IL-2Rα受體抗體)、環孢素(環孢素A)、DACLIZUMAB®(抗IL-2Rα受體抗體)、依維莫司、黴酚酸、RITUXIMAB®(抗CD20抗體)、西羅莫司及他克莫司。免疫抑制劑可給藥至少約1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg。當使用免疫抑制劑時，其可全身或局部投與，且其可在投與RPE細胞之前、同時或之後投與。免疫抑制療法可在投與RPE細胞之後持續數週、數月、數年或無限期。舉例而言，患者可在投與RPE細胞之後投與5mg/kg環孢素持續6週。

治療視網膜變性之方法可包含投與單次劑量之RPE細胞。此外，本文中所述之治療方法可包含RPE細胞在一定週期內多次投與之治療療程。治療之例示性療程可包含每週一次、每兩週一次、每月一次、每季一次、每半年一次或每年一次的治療。或者，治療可以階段形式進行，藉此最初投與多次劑量(例如第一週之每日劑量)，且隨後需要較少且較不頻繁之劑量。

若藉由眼內注射投與，則RPE細胞可在患者之整個壽命中週期性傳遞一或多次。舉例而言，RPE細胞可傳遞每年一次、每6至12個月一次、每3至6個月一次、每1至3個月一次或每1至4週一次。或者，對於特定病況或病症可能需要較頻繁投藥。若利用植入物或裝置投與，則如特定患者及所治療之病症或病況所需，RPE細胞可投與一次，或在 患者之整個壽命中週期性投與一或多次。類似地，涵蓋一種隨時間改變之治療方案。舉例而言，在最初可能需要較頻繁治療(例如每日一次或每週一次之治療)。隨時間推移，隨著患者病況改良，可能需要較不頻繁之治療或甚至無需進一步治療。

本文中所述之方法可另外包含藉由量測個體內之視網膜電圖反應、視動敏銳度閾值或亮度閾值來監測治療或預防功效之步驟。方法亦可包含藉由監測細胞之免疫原性或細胞在眼睛中之遷移來監測治療或預防之功效。

RPE細胞可用於製造治療視網膜變性之藥物。本發明亦涵蓋包含RPE細胞之製劑在治療失明中之用途。舉例而言，包含人類RPE細胞之製劑可用於治療與許多視覺改變性疾病有關的視網膜變性，該等視覺改變性疾病引起感光器損傷及失明，諸如為糖尿病性視網膜病變、黃斑變性(包括年齡相關之黃斑部變性，例如濕性年齡相關之黃斑部變性及乾性年齡相關之黃斑部變性)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)。製劑可包含至少約5,000至500,000個RPE細胞(例如100,00個RPE細胞)，該等細胞可投與視網膜以治療與許多視覺改變性疾病有關的視網膜變性，該等視覺改變性疾病引起感光器損傷及失明，諸如為糖尿病性視網膜病變、黃斑變性(包括年齡相關之黃斑部變性)、色素性視網膜炎及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)。

本文提供之RPE細胞可為人類RPE細胞。然而，應注 意，人類細胞可用於人類患者以及動物模型或動物患者。舉例而言，人類細胞可在視網膜變性之小鼠、大鼠、貓、犬或非人類靈長類動物模型中進行測試。另外，人類細胞可用於治療性地治療有需要之動物，諸如在獸醫學中。

投藥模式

醫藥製劑可根據投藥途徑調配於醫藥學上可接受之載劑中。舉例而言，製劑可經調配以投與眼睛之視網膜下腔。包含RPE細胞之製劑可投與同一患者之一隻眼睛或兩隻眼睛。可相繼或同時投與兩隻眼睛。舉例而言，包含RPE細胞之製劑可以懸浮液、溶液、漿液、凝膠或膠體之形式調配。

本發明之RPE細胞可藉由注射(例如玻璃體內注射)或作為裝置或植入物(例如植入物)之一部分局部投與。如上指出，RPE細胞可具有各種可能的配置，諸如個別細胞、團塊、叢集、層片或其任何組合，其可含於水性載劑、凝膠、基質、聚合物或其類似物中。舉例而言，製劑可藉由注射至眼睛之視網膜下腔中來投與。此外，製劑可經角膜投與。舉例而言，本發明之細胞可藉由使用玻璃體切除手術來移植至視網膜下腔中。另外，在注射時，RPE細胞可用市售平衡鹽溶液(例如Alcon BSS PLUS^®)再懸浮以獲得所需重量莫耳滲透濃度及濃度以用於藉由視網膜下注射投與。

RPE細胞視情況可利用包含平坦部玻璃體切除手術(諸如3切口平坦部玻璃體切開術)之方法投與。方法可包括小型 視網膜切開術。在細胞投與之前，可例如藉由注射鹽水或其他適合之流體來形成視網膜下泡(「預泡(pre-bleb)」)，該鹽水或其他適合之流體隨後可在細胞投與之前移除。然而，細胞亦可在無預泡形成之情況下投與。細胞可在顳窩位置投與泡中。舉例而言，泡可視情況在拱形血管內擴大。泡可經定位使得其並不脫離中心黃斑窩。

視投藥方法而定，可將RPE細胞添加至經緩衝及電解質平衡之水溶液、具有以下之經緩衝及電解質平衡之水溶液中：潤滑聚合物、基於礦物油或石蠟油之軟膏、其他油、脂質體、環糊精、持續釋放聚合物或凝膠。

與RPE細胞一起使用之基質

本文中所述之方法可包含以植入物或裝置之形式投與本發明之RPE細胞的步驟。在某些實施例中，裝置為用於治療眼睛之醫學病況之生物可侵蝕性植入物，該植入物包含分散在生物可降解聚合物基質中之活性藥劑，其中至少約75%之活性藥劑粒子之直徑小於約10μm。將生物可侵蝕性植入物製成適於植入眼睛區域之大小。眼睛區域可為以下各者中之任何一或多者：前房、後房、玻璃體腔、脈絡膜、脈絡膜上腔、結膜、結膜下腔、鞏膜外腔、角膜內腔、角膜外腔、鞏膜、平坦部、手術誘導之無血管區、黃斑及視網膜。生物可降解聚合物可為例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)共聚物、可生物降解聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)膜或PLLA/PLGA聚合物基底。聚合物中乳酸與乙醇酸單體之比率為約25/75、40/60、50/50、60/40、75/25重量百分 比，更佳為約50/50。PLGA共聚物可為生物可侵蝕性植入物之約20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%至約90重量%。PLGA共聚物可為生物可侵蝕性植入物之約30重量%至約50重量%，較佳為約40重量%。RPE細胞可與生物相容性聚合物一起移植，該生物相容性聚合物諸如為聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、50：50 PDLGA、85：15 PDLGA及INION GTR®可生物降解膜(生物相容性聚合物之混合物)。參見美國專利第6,331,313號、第7,462,471號及第7,625,582號。亦參見Hutala等人(2007)「In vitro biocompatibility of degradable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues：Direct contact studies.」Journal of Biomedical Materials Research 83A(2)：407-413；Lu等人(1998)J Biomater Sci Polym Ed 9：1187-205；及Tomita等人(2005)Stem Cells 23：1579-88。

在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含定位於膜上之RPE；及一種使用其預防或治療視網膜之疾病、病症或病況之方法。舉例而言，膜可為如美國預授權公開案第20110236464號中所述之膜，其以全文引用之方式併入本文中。膜可為實質上非可生物降解及多孔的，孔隙直徑在約0.2μm與0.5μm之間。舉例而言，孔隙直徑可在0.3μm至0.45μm之間。使用非可生物降解膜可確保其在插入體內之後依然支持曾移植至眼睛中之細胞持續例如至少5年、至少10年或至少15年。

孔隙密度可在每平方公分約1×10⁷與3×10⁸個孔隙之間，諸如在每平方公分5×10⁷與1×10⁸個孔隙之間。此密度可允許所需滲透性程度，且亦可允許血管形成。具體而言，孔隙之尺寸及密度可允許營養素自膜之一側運動至另一側，且亦允許血管經由膜形成，例如植入後。聚合物體可接收到自富脈絡膜床形成之血管。此現象已展示於眼睛外部之富血管床中(Cassell等人，2002；Patrick等人，1999；Saxena等人1999；Peter等人1998)，但僅可在孔隙率足夠時發生(Menger等人，1990)。

舉例而言，膜導水率可大於50×10^-10公尺˙秒^-1˙帕^-1。特定言之，膜之膜導水率可為約33毫升/分鐘/平方公分。此膜導水率等於801.21×10^-10公尺˙秒^-1˙帕^-1，其為年輕黃斑屍體布魯赫膜之導水率之8倍。此過剩傳導性潛在有效，因為人工膜可完全依賴於被動過程。除在營養擴散方面能夠滿足疊加細胞之需要，其較佳不阻礙流體自RPE層之基側的傳輸，否則RPE可自聚合物表面脫離。與此預期一致，已猜測老年人中布魯赫膜之較低導水率引起AMD中之色素上皮脫離(Bird及Marshall，1986)。

膜較佳可在不降解之情況下藉由γ輻射、環氧乙烷、高壓蒸氣滅菌或UV滅菌來滅菌。

膜較佳可藉由超聲熱合密封、射頻密封或嵌入成型來密封。此舉允許其他層附著至膜，例如使藥層或塗層附著至膜。舉例而言，吾人可能需要附著較剛性的可生物降解層(諸如PLGA)，以提供膜以剛性來輔助傳遞。或者，可附著 含有藥理學或生物學藥劑之層、或支持其他細胞之層。

膜之最大厚度較佳為約11μm。膜厚度更佳在9μm與11μm之間。可選擇膜之厚度，以允許營養素之擴散、允許血管形成，且亦允許膜易於插入眼內。

因此，RPE可提供或培養於支持細胞生長之膜上，該膜為實質上非可生物降解且多孔的，且最大厚度為約11μm。膜較佳為實質上平面的，且其最小尺寸較佳低於約11μm。其在該尺寸下厚度可不同，但厚度較佳在9μm與11μm之間。

膜最大重量可為約1.5mg/cm²。膜之重量更佳在1.0mg/cm²與1.4mg/cm²之間。膜之最小拉伸強度較佳為至少100巴，以提供足夠強度以允許在手術期間之適當性。最大拉伸強度較佳為300巴，同樣允許膜在手術期間方便操作。膜之爆破強度較佳為至少10磅/平方吋。

膜較佳為親水性的。此親水性可賦予膜良好的濕潤能力，且使細胞及其他所需塗層較容易的附著。

膜生理上可接受之pH值較佳為例如pH 4至pH 8。

膜較佳在至少一側上包含塗層。塗層較佳為蛋白質或醣蛋白，諸如層黏連蛋白、基質膠、膠原蛋白、纖維結合蛋白及/或PLGA聚(乳酸-共-乙醇酸)。塗層亦可包含結合至塗層組分之藥理學或生物學藥劑。舉例而言，塗層可包括神經營養劑、消炎劑或抗血管生成劑。

具體而言，塗層較佳含有層黏連蛋白，尤其層黏連蛋白-1或其片段，諸如IgVAV。具體而言，與其他蛋白質或醣 蛋白相比，塗層可含有較多層黏連蛋白-1。塗層較佳可包含至少30%或至少40%層黏連蛋白，諸如層黏連蛋白-1。塗層可經塗覆以在膜上產生約40μg/cm²至45μg/cm²之層黏連蛋白-1濃度。

因此，RPE可提供或培養於支持細胞生長之膜上，該膜包含實質上非可生物降解且多孔之支撐層，該支撐層之至少一側經包含層黏連蛋白-1之塗層塗佈。

膜可由親水性聚合物製成。此外，可使用已藉由將UV光照射於聚合物上而產生親水性之疏水性聚合物。例示性聚合物包括聚酯，諸如聚對苯二甲酸伸乙酯、聚對苯二甲酸伸丁酯；聚胺基甲酸酯及聚脲胺基甲酸酯，尤其為含有聚碳酸脂及聚矽氧烷者及基於聚酯或基於聚醚者；聚醯胺，諸如耐綸(nylon)；聚醚酯，諸如Sympatex；聚碳酸酯，諸如Makrolon；聚丙烯酸酯，諸如Perspex；聚(四氟乙烯)(PTFE)；聚矽氧烷；聚烯烴，諸如聚乙烯及聚丙烯；及通常以DuPont之商標名稱Delrin已知之聚甲醛(POM)。膜尤其較佳由聚對苯二甲酸伸乙酯或聚對苯二甲酸伸丁酯製成。在另一較佳實施例中，膜由聚酯製成。

膜可用於使本發明之RPE細胞層生長。膜可較佳在膜上包含細胞層。細胞可為根據膜及細胞之所需用途而選擇之任何細胞。

膜及細胞層之長度及寬度較佳為至少3mm×5mm。膜及細胞層較佳為至少4mm×6mm。

膜及細胞層可移植至有需要之患者之眼睛中，例如治療 年齡相關之黃斑部變性、視網膜撕裂、黃斑萎縮、無脈絡脈畸型、萊伯氏先天性黑蒙症(Leber Congenital Amarosis)、斯特格病及其他視網膜疾病或病況。

篩檢分析

本發明提供用於一種用於篩檢鑑別調節RPE細胞成熟度之藥劑的方法。舉例而言，自人類ES細胞分化之RPE細胞可用於篩檢促進RPE成熟之藥劑。作為治療療法之一部分，經鑑別之藥劑可單獨或與RPE細胞組合使用。或者，經鑑別之藥劑可用作培養方法之一部分以改良活體外分化之RPE細胞的存活。

RPE細胞可在諸如藥物、化學或生物技術公司、醫院、或大學或研究機構之環境中用作研究工具。該等用途包括自胚胎幹細胞分化之RPE細胞在鑑別例如以下之藥劑之篩檢分析中的用途：可用於促進活體外或活體內RPE存活或可用於促進RPE成熟、存活及/或移入之藥劑。可在活體外或動物模型中研究經鑑別之藥劑來評估例如其單獨或與RPE細胞組合的可能用途。

本發明提供一種用於鑑別促進RPE成熟之藥劑的方法，該方法包含提供RPE細胞；使該RPE細胞與藥劑接觸；評估該RPE細胞之成熟徵象；及隨後在該藥劑引起RPE細胞展示成熟徵象時鑑別促進RPE成熟之藥劑。如本文所論述，成熟徵象可為色素沉著程度、基因表現程度及形態。

商業應用及方法

本發明之特定態樣係關於達至商業數量之RPE細胞之製 造。RPE細胞可大規模製造，必要時儲存，並提供給醫院、臨床醫師或其他健康照護機構。

因此，本發明之某些態樣係關於製造、儲存及分銷藉由本文所揭示之方法製造之RPE細胞的方法。在RPE製造之後患者治療之前，RPE細胞可經收集，純化及視情況儲存。RPE細胞可視情況為患者特異性的或基於HLA或其他免疫學概況特定選擇。舉例而言，一旦患者呈現以下適應症：諸如糖尿病性視網膜病變、黃斑變性(包括年齡相關之黃斑部變性)、色素性視網膜炎、視網膜萎縮、視網膜脫離、視網膜發育不良及斯特格氏病(眼底黃色斑點症)、血管樣紋或近視性黃斑變性，即可及時定製及提供RPE細胞。因此，本發明係關於製造RPE細胞以獲得商業規模之細胞之方法，包含自該等方法獲得之RPE細胞之細胞製劑，以及為醫院及臨床醫師提供(亦即製造、視情況儲存及銷售)RPE細胞之方法。經分化之RPE細胞或成熟經分化之RPE細胞之製造可經規模放大以用於商業用途。

本發明亦提供管理醫藥商業之方法，其包含建立用於分銷要出售之製劑的分銷系統，或可包括建立營銷醫藥製劑之銷售團隊。

本發明提供為醫院、健康照護中心及臨床醫師提供RPE細胞之方法，藉此將藉由本文所揭示之方法製造之RPE細胞儲存，由醫院、健康照護中心或臨床醫師按需定製，及投與需要RPE細胞療法之患者。醫院、健康照護中心或臨床醫師基於患者具體資料定製RPE細胞，RPE細胞根據患 者之指標(specification)製造，且隨後將其提供給提出定製之醫院或臨床醫師。舉例而言，在選擇適於患者之特定RPE細胞製劑之後，此後將其擴增以達至適當數量以用於患者治療。

本發明之其他態樣係關於RPE細胞文庫，其可向潛在患者接受者提供匹配之細胞。因此，本發明提供一種管理醫藥商業之方法，其包含以下步驟：提供對於至少一個組織相容性抗原為同種接合子之RPE細胞製劑，其中細胞自包含可藉由本文所揭示之方法擴增之RPE細胞文庫的該等細胞庫中選擇，其中各RPE細胞製劑對於人群中存在之至少一個MHC等位基因為半合子或同種接合子，且其中RPE細胞之該庫包含與該細胞庫中之其他成員相比對於不同組之MHC等位基因各自為半合子或同種接合子的細胞。如上所述，可使用基因打靶或雜合性丟失來產生用於獲得RPE細胞之半合子或同種接合子之MHC等位基因幹細胞。

本發明亦包括自患者或組織相容性供體獲得或製造人類ES細胞(例如誘導型多能(iPS)細胞、藉由體細胞核移置製造之ES細胞、或藉由其他重新編程方法製造之ES細胞)且隨後產生及擴增自ES細胞獲得之RPE細胞的方法。可儲存此等RPE細胞。此外，此等RPE細胞可用於治療自其中獲得ES之患者或該患者之親屬或組織相容性個體。

本發明展示人類RPE細胞可在良好定義且可再現之條件下自人類ES細胞可靠地分化並擴增--代表用於視網膜變性病症患者之細胞之無盡來源。此等細胞之濃度將不受可 用性限制，而是可滴定至個體之精確臨床需要。若醫師認為必要，則同一細胞群體在患者之壽命內重複輸注或移植將亦為可能的。此外，建立可自其中製造RPE細胞之匹配的或複雜性降低之HLA hES株之庫的能力可能降低或消除對一起施用免疫抑制藥物及/或免疫調節方案的需要。

實例

現大致描述本發明，參考以下實例將更容易理解，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例之目的而包括在內，且不意欲限制本發明。

與呈現實例之結果及/或附加實驗結果有關的其他資訊包括於隨附文稿中，該文稿緊接申請專利範圍之前包括於本申請案中。

實例1

方法

hESC主細胞庫之產生

此等研究中所用之hESC株為先前描述之MA09(22)，其來源於在完全知情同意之情況下獲得之未經使用之活體外受精(IVF)胚胎，且遵照高級細胞技術倫理諮詢委員會(Advanced Cell Technology's Ethics Advisory Board)及機構審查委員會(Institutional Review Board)使用。將MA09種子儲備液解凍，且使用現行良好作業規範經由在有絲分裂不活化之小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)上連續繼代四次來擴增。臨床hESC主細胞庫(hESC-MCB)經極冷保藏，且證實具有正常女性(46，XX)核型並不含細菌及支原體污染物 以及人類、牛、豬及鼠類病毒。PCR分析展示在與黃斑變性有關之基因中無變化或突變，該等基因包括CTRP5、EVLV4、RPE-65、VMD2及ABCA4(下表3)。

視網膜色素上皮之製造

解凍hESC-MCB之小瓶，且在經絲裂黴素C處理之MEF上擴增三個繼代。由於hESC與動物細胞共培養，故經分化之衍生物被歸類為異種移植產品，且服從FDA對於供體動物及產品處理、測試及存檔以及患者、監測及登記之準則(進一步描述於以下實例2中)。在hESC擴增之後，細胞經相繼誘導以依序形成胚樣體及細胞向外生長物，且定位分化成色素沉著之RPE斑塊。此實例中所用之RPE之製造進一步描述於以下實例4中。用膠原酶分離色素沉著之斑塊，且在純化及胰蛋白酶處理後，接種經解離之細胞，使其生長至匯合，且誘導再分化持續總共三個連續繼代。將第2代RPE極冷保藏，且使其充當調配細胞之起始物質以用於臨床用途。

臨床前研究

如先前所述(8)，將人類ESC來源之RPE細胞經視網膜下注射至NIH III免疫裸小鼠(致腫瘤性及生物分佈研究)及營養不良RCS大鼠及ELOV4小鼠(功效研究)中。藉由經設計以擴增人類Alu Y DNA序列之DNA Q-PCR，及藉由人類粒線體及人類斑萎蛋白之石蠟切片之免疫染色，來進行對經注射之眼睛及其他器官中之人類細胞的偵測(進一步描述於實例2中)。

細胞表徵及安全性測試

評估RPE細胞之安全性，且在不同時間下針對若干RPE特異性屬性進行表徵，包括處理中(in-process)測試及在解凍、最終產品調配之後進行之測試、以及培養至成熟以活體外模擬經移植之細胞之歸宿。由WuXi Apptec,Inc.St.Paul,MN根據標準方案進行潛在細菌、支原體、鼠類病毒及殘留鼠類DNA之安全性評估。由Cell Lines Genetics,Madison WI進行針對核型之細胞遺傳分析、針對細胞株鑑定之DNA指紋以及螢光原位雜交(FISH)。由Cape Cod Associates,Inc,East Falmouth,MA在調配為最終產品用於臨床注射之經極冷保藏之RPE上進行內毒素測試。使用標準方法進行定量免疫組織化學染色，其中將陽性染色之細胞的百分比標準化為所檢測之經DAPI染色之核的數目。RPE純度及分化程度之評估基於斑萎蛋白、Pax6、ZO-1及/或MITF染色之細胞的百分比。證實多能性標記不存在之篩檢藉由針對OCT-4及鹼性磷酸酶染色來進行。藉由定量螢光活化細胞分選(FACS)分析曝露於PhRodo^TM(Invitrogen)螢光生物粒子之RPE培養物來評估吞噬作用(效能分析)。進行定量反轉錄(q-RT)PCR分析來證實RPE特異性基因(RPE-65、PAX-6、MITF、斑萎蛋白)之上調及hESC特異性基因(OCT-4、NANOG、SOX-2)之下調。以分光光度計方式在具有已知細胞數目之NaOH提取之集結粒中量測每細胞黑色素含量(進一步描述於實例2中)。

細胞調配及注射

解凍經極冷保藏之MA09-RPE之小瓶，藉由離心洗滌3次，且以2×10³個活細胞/微升BSS PLUS^®(Alcon)之密度再懸浮。將含有適當體積經調配之RPE之小瓶及含有適當體積BSS PLUS^®之配對小瓶在2℃至8℃下傳遞至OR。在注射即刻開始之前，在1mL注射器中將兩個小瓶復原以獲得將引起傳遞所需數目RPE(50,000個活RPE細胞至各患者眼睛之視網膜下腔中)之裝載細胞密度。為了確保所需劑量之精確傳遞，增加裝載細胞密度以補償活RPE在混合、裝載及經由套管傳遞期間遭遇之預期損失。此活細胞損失如以下實例3中所述進行量測且展示對所用套管之依賴性。在此等實例中，使用MEDONE POLYTIP^®套管25/38(具有0.12mm(38g)×5mm尖端之0.50mm(25g)×28mm套管)，且裝載細胞密度為444個活細胞/微升以得到預期336 +/- 40個活細胞/微升之傳遞(N=6)，得到預期50,400個活RPE於150μL體積中傳遞至各患者眼睛之視網膜下腔中。

患者選擇

基於大量納入及排除準則(以下表7及表8)選擇患者，該等準則包括終末期疾病、中心視覺損失、不存在其他顯著眼科病變、無癌症病史、當前癌症篩檢、不存在全身性免疫抑制之禁忌症、在有監測之麻醉看護下經歷玻璃體視網膜手術程序之能力以及參與涉及hESC來源之移植組織之首次人類臨床試驗的心理學適應性。

移植及基本原理

進行平坦部玻璃體切開術，其包括手術誘導玻璃體後部 與在玻璃體基底部後界前方之視神經分離。將5×10⁴個hESC-RPE細胞於150μl體積中之黃斑下注射劑傳遞至預選的不因疾病完全損失之周心黃斑區域中。基於存在天然(但受損)RPE及上層感光器來小心選擇移植部位，以使移植整合之機率及感光細胞救治之潛力最優化。完全萎縮的中心黃斑病理解剖複合物內之移植附著不太可能，且並不模擬變性較早期之中心黃斑狀態，該等變性較早期可能為基於幹細胞之再生性移植策略之最終治療目標。

免疫抑制方案包括在手術程序前一週之低劑量他克莫司(目標血液含量3ng/mL至7ng/mL)及黴酚酸嗎啉乙酯(mycophemolate mofetil，MMF，在0.25公克經口/天至2公克經口/天範圍內)且持續6週時間。在第6週，方案要求停止他克莫司及再延續六週MMF。

結果

RPE之表徵

經控制之hESC分化產生接近100%純的RPE(圖1)。單塊(9.6cm²)6孔盤之色素沉著之斑塊(圖1A)產生約1.5×10⁸個RPE細胞(例如足以依每患者至多3×10⁶個細胞之劑量治療50名患者)。細胞展示典型RPE特性，在增殖期間(在胰蛋白酶處理後)丟失其色素沉著之鵝卵石形態；一旦重建匯合，其即再分化成單層多角形立方的色素沉著之上皮細胞。Q-PCR展示多能性之標記(Oct-4、NANOG及SOX2)明顯下調，而RPE標記RPE65、斑萎蛋白、Pax6、MITF以較高含量表現(圖1B至圖1F及表5)。成熟培養物之免疫染色 展示斑萎蛋白(經分化之RPE之晚期標記)在收集之前以膜方式組織於大部分細胞中；所有(>99%)細胞對斑萎蛋白及/或PAX6(PAX6在較成熟細胞中變得較弱或消失)及對ZO-1(緊密接合之組分)均呈陽性(未圖示)。在極冷保藏之後，將細胞小瓶解凍並調配以用於移植。對視網膜標記Pax6及/或MITF(色素沉著之細胞之標記)之染色證實100% RPE純度(圖1C)。為了進一步測試經調配之細胞，將其培養2至3週以允許生長及成熟直至建立RPE形態為止。Pax6/斑萎蛋白(圖1E)及ZO-1(圖1G)免疫染色與收集前培養物類似，且效能分析展示大於85%之細胞吞噬生物粒子片段(圖1J)。

安全性研究

由於hESC曝露於動物細胞及產品，故廣泛測試MCB及RPE之動物及人類病原體。證實細胞在所有階段下均不含微生物污染物，包括動物及人類病毒病原體(下表3)。最終RPE產品具有正常女性(46，XX)核型(圖1K)及匹配hESC株MA09之DNA指紋概況。儘管在不支持多能細胞之條件下進行RPE製造製程，但進行高敏感性分析以排除在最終RPE產品中存在任何污染性hESC。對針對Oct-4及鹼性磷酸酶染色之2/9百萬個細胞RPE樣品(在P1/P2下)之檢查展示不存在多能細胞。在NIH-III小鼠中進行之致腫瘤性、生物分佈及外加研究(spiking study)展示在任何動物中均無不良或安全性問題。另外，在以外加有0.01%、0.1%或1%未分化之hES細胞之50,000至100,000個RPE細胞注射的動物中觀察到無腫瘤。在注射後至多3個月之100%動物之眼睛 中及在9個月時92%動物中證實人類RPE細胞之存活(下表6)。人類RPE存活持續動物之壽命且整合至小鼠RPE層中；儘管形態上與宿主RPE細胞幾乎無法辨別(圖2)，但其可藉由免疫染色鑑別且以典型基側方式表現斑萎蛋白(圖2B)。雖然在移植後1至3個月，Ki-67染色展示較低程度之增殖，但在九個月時發現無Ki-67陽性細胞，指示hESC來源之RPE已形成成熟靜息單層。

分化階段影響細胞附著及存活

經移植之細胞附著至布魯赫膜，且其隨後存活且整合至宿主RPE層中被認為對此治療策略之成功至關重要。hESC技術之區別特徵在於可活體外控制分化程度。在一系列經調節之遺傳型及表型表現(包括色素沉著程度)方面證明RPE分化之程度。細胞在類似條件下維持，但在展示不同色素沉著程度之不同時間點下收集並極冷保藏。圖3展示在明顯不同之色素沉著程度下收集之經極冷保藏之RPE的兩個代表性批次(色素沉著較輕及較重之批次的黑色素含量分別為4.8±0.3 SD皮克/細胞及10.4±0.9 SD皮克/細胞)。處理來自兩個RPE批次之細胞，且使用用於臨床移植之方案調配。經由注射套管擠出後，將細胞接種於經明膠塗佈之組織培養盤中且監測附著及後續生長。來自色素沉著較輕之批次之RPE細胞展示在隔夜培養物中漂浮細胞數目最少；大部分細胞已附著且展開，展示此生長階段之典型RPE特性及形態(圖3A)。在培養三天後，RPE細胞之數目已自所接種之4.0×10⁴個增加至10.6×10⁴個細胞(圖3C及圖 1G)。與此呈鮮明對比，色素沉著較重之RPE展示大量漂浮細胞；僅較小百分比之細胞附著並存活，且培養三天後，細胞數目明顯降低(低於較輕批次中可見之細胞數目的十分之一[9.0×10³個])。此等結果表明在RPE分化階段與活體外附著及茂盛生長之能力之間存在較強相關性。當前臨床研究中使用之RPE批次之黑色素含量為4.1皮克/細胞，且展示與色素沉著較輕之批次的附著及生長相當的附著及生長。與凍融循環、解凍後洗滌、離心及調配以及經由注射套管擠出有關之應力可在一定程度上引起所觀察到的在輕度色素沉著之細胞與重度色素沉著之細胞之間的差異。

臨床結果

SMD患者為26歲高加索女性，其基線最佳矯正視力(BCVA)為手動(HM)且不能閱讀早期治療糖尿病性視網膜病變研究(ETDRS)視力表上之任何字母。在移植後任何時候均偵測不到任何眼內發炎或過度增殖之跡象。用狹縫燈生物顯微攝影術、眼底攝影術、IVFA及SD-OCT證實不存在臨床上可偵測之發炎(進一步描述於實例2及圖8及圖9中)。自手術後第1週開始觀察到在RPE層面臨床上增加之色素沉著，該色素沉著似乎已伸展至手術移植部位以外(圖4)。古德曼視場(Goldmann visual field)自基線改良至移植後兩個月(手術前及手術後視場展示於圖10及圖11中)。在第2週時，BCVA為數手指(CF)(1個ETDRS字母)，其在研究期間繼續改良(在1及2個月5個ETDRS字母[BCVA 20/800])(表2)。患者非常可靠且長年作為圖像藝術家工作。她主觀報導經手術之眼睛之色視覺改良且對比度及暗適應改良，且對側眼無變化。

AMD患者為77歲高加索女性，其基線BCVA為21個ETDRS字母(20/500)。儘管中度不遵從免疫抑制方案，但在移植後任何時候均偵測不到任何眼內發炎或過度增殖之跡象。用狹縫燈生物顯微攝影術、眼底攝影術、IVFA及SD-OCT證實不存在臨床上可偵測之發炎(進一步描述於實例2及圖8及圖9中)。OCT影像展示於圖4及圖7中。在第2週時，ETDRS BCVA為33個字母(20/200)。到第6週時，BCVA為28個ETDRS字母(20/320)，且保持穩定至第8週。藉由古德曼視場量測之中心暗點與基線相比在第8週時尺寸略微減小。

討論

人類胚胎幹細胞之治療用途提出艱巨的轉化挑戰。此報導提供首個臨床證據，表明hESC來源之細胞可安全地移植至人類患者中。在當前研究中，將較低劑量(5×10⁴個細胞)自hESC產生之RPE細胞移植至患有不同形式黃斑變性(乾性AMD及SMD，分別為已開發世界中成人及少年失明之主要原因)之兩名患者之眼睛中。

為改良細胞附著於布魯赫膜之機率，選擇黃斑下注射部位，其中黃斑複合物(感光器、布魯赫膜及RPE)仍存在且潛在有活力，由此提高移植細胞與天然RPE整合且潛在救治受損黃斑周圍組織的預期可能性。兩名患者對移植均耐受良好，且在此報導時均無手術後發炎、排斥或致腫瘤性之跡象。臨床及實驗室發現表明經移植之RPE細胞可能已附著，整合，且開始影響受損之天然RPE。

對患者之跟蹤監測及評估可測定移植之hESC-RPE是否具有降低之免疫原性、是否可能在長期不存在免疫抑制之情況下經歷排斥，以及所觀察到之視力增加是否將持久。預期免疫反應(若存在)可經由此項技術中已知之方法(包括免疫抑制及/或耐受方案)管理。亦預期經由投與較多數目之RPE細胞可獲得較多視力增加。此外，預期投與RPE細胞將減緩或遏止與視網膜變性病況(包括AMD、SMD及其他)有關之視力損失。

儘管先前已嘗試原代RPE細胞之完整片及懸浮液之移植(11-19)，但自成人器官供體獲得之RPE之增殖能力(23)及活體外分化能力受限，包括不能使用標準培養條件表現黑 色素生物合成所需之基因(24)。臨床上，移植入AMD患者之視網膜下腔中之成人RPE片未能改良視力功能(25)。儘管自出生前及出生後組織獲得之RPE已成功解離且經誘導於活體外生長及成熟，且具有完全分化之RPE之屬性提示(26-28)，但該等來源極有限且在品質及擴增能力方面易變。與成人與胎兒組織相比，hESCs之特徵在於具有無限增殖之能力，且不經歷老化，提供實際上無限的「年輕」細胞來源作為分化之起始材料。使用獲自hESCs之子代之另一預期優點在於活體外分化階段可經控制以使移植後存活率及功能性最大。實際上，本文呈現之資料顯示RPE成熟及色素沉著之程度顯著影響活體外該等細胞之後續附著及生長。

本研究中所用之用於RPE之起始材料為經充分表徵之hESC主細胞庫，該hESC主細胞庫使用經最優化以在控制條件下可靠地製造大量多能幹細胞之程序產生。儘管RPE分化程序不容許支持hESC存活，但廣泛的臨床前安全性研究證實經移植之hESC-RPE在動物壽命期間並不引起異位組織形成或腫瘤。基於免疫螢光之分析能夠在超過一百萬個細胞中偵測少於一個未分化之hES細胞，證實此研究中所用之RPE之臨床批次不具有可偵測之多能細胞，表現比顯示在活體內外加研究中引起腫瘤之hESC劑量低五個數量級之偵測水準。hESC-MCB之產生及各批次RPE細胞之製造涉及在原代小鼠胚胎纖維母細胞餵養層上增殖。因此，hESC-RPE被歸類為異種移植產品且經歷由FDA異種 移植準則所要求之所有測試及監測以確保細胞不含鼠類病原體。RPE亦經歷廣泛的一系列安全性測試以證實不存在微生物污染物及病毒，且特徵在於多種RPE特異性屬性，該等屬性包括吞噬能力、基因表現、形態學評估及對RPE特異性標記之免疫組織化學染色。在啟動此等臨床試驗之前，hESC-RPE在營養不良動物中之移植展示細胞能夠以劑量依賴性方式救治感光器及視覺功能。

當前研究經設計以在患有晚期SMD及乾性AMD之患者中測試hESC-RPE之安全性及耐受性。迄今為止，細胞似乎已在無異常增殖、畸胎瘤形成、移植物排斥或其他不良病理反應之情況下移植至兩名患者中。指示持續之隨訪及進一步研究。然而，最終治療目標將為在疾病進程較早期治療患者，潛在增強感光器及中心視覺救治之可能性。

實例2

此實例提供與實例1有關之補充資訊及方法。

臨床hESC主細胞庫(hESC-MCB)(自其製造實例1中所用之RPE細胞)之特徵展示於表3中。

小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)主細胞庫

根據2003年4月行業指南「Source Animal,Product,Preclinical,and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans」及「Points to Consider on Xenogeneic Cell Therapy Medicinal Products」(EMEA/CHMP/CPWP/83508/2009)]，MA09-hRPE細胞被定義為異種移植產品，因為此等人類細胞已與非人類(鼠類)細胞離體接觸。將Charles River Laboratories(Kingston Facility,Stoneridge,NY,USA)之繁殖群用作MEF細胞之來 源。此AAALAC(國際實驗室管理評鑒及認證協會，Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Care International)認可之機構在全面健康狀態監測下在屏障房間中容納CD-1無特定病原體(SPF)小鼠。供體動物經定時交配且在妊娠期間隔離。交配後12天，在處死之前，由獸醫對所有小鼠進行身體健康檢查；將動物安樂死，且自各供體小鼠中收集血液：用於待存檔之白血球及血漿製備物及由Charles River Laboratories,Wilmington,MA針對鼠類病原體進行之血清學測試。經委員會認證之獸醫病理學家對各供體動物之屍體及子宮以及對各窩中之一個胚胎進行屍體剖檢。將來自各動物之器官與血漿及經極冷保藏之白血球一起存檔至少30年(如EMEA/CHMP/CPWP/83508/2009所要求)。分離MEF，且如先前所述(Klimanskaya及McMahon，2005)培養，在P1時冷凍且在P2時在絲裂黴素C不活化之後使用。為了使引入鼠類病毒及其他病原體之風險降至最低，由WuXi AppTec,Inc.測試並表徵MEF。對製備hESC-MCB及hRPE臨床批次中所用之批次MEF-08之測試的說明及結果呈現於表4中。

¹鼠類細胞株固有地能夠製造感染性鼠類反轉錄病毒，且已呈現證據，指示由MEF製造之鼠類白血病(MuLV)病毒粒子為非感染性的且無法在人類細胞中複製(Amit等人2004)。

人類DNA之DNA Q-PCR

使用針對Alu Y序列之Taqman分析，以每150,000個小鼠細胞1個人類細胞之敏感性，由AltheaDX,Inc.,San Diego,CA進行小鼠組織中人類DNA含量之偵測。

細胞之免疫染色

用含2%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)之PBS將4孔或6孔盤中之細胞固定10分鐘，在含0.1% NP-40替代物(Sigma)之PBS中透化10分鐘，用含10%山羊血清之PBS阻斷1小時或1小時以上，且在4℃下用初級抗體培育隔夜。隨後，將細胞在0.1% Tween/PBS中洗滌3×15分鐘，在室溫下用二級抗體培育1小時，如上洗滌，且使用具有DAPI之Vectashield(Vector laboratories,Burlingame,CA)固定。在倒置螢光顯微鏡(Nikon)下檢查經染色之細胞。使用以下抗體：斑萎蛋白(Novus Biologicals)、Pax6(Covance)、MITF(Abcam)、ZO-1-FITC(Invitrogen)、Oct-4(Santa Cruz Biotechnologies)、抗小鼠Alexa594(Invitrogen)、抗兔FITC(Jackson Immunoresearch)、抗小鼠Alexa-488(Invitrogen)、抗兔Alexa-594(Invitrogen)。使用Vector藍色套組(Vector Laboratories)偵測鹼性磷酸酶活性。

小鼠組織切片之免疫染色

將經脫石蠟之切片在蒸鍋中在0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中培育40分鐘以達成抗原修復(斑萎蛋白及人類粒線體)，或針對Ki67在高壓鍋中培育30分鐘。如上所述進行抗體染色，但在一些情況下在使用來自Vector(Burlingame,CA)之套組阻斷內源性生物素之後，使用結合生物素之二級抗體。所用抗體為抗斑萎蛋白(Abcam，兔)、抗人類粒線體(小鼠，Spring Bioscience)、抗ki67(兔，Abcam)。二級抗體為抗小鼠生物素、抗小鼠Cy3(Jackson Immunoresearch)、抗兔Alexa488(Invitrogen)，且抗生蛋白鏈菌素-Cy3係來自Jackson Immunoresearch。將由hESC形成之小鼠畸胎瘤之切片用作抗人類粒線體及Ki67之陽性對照，且將固定並嵌埋於石蠟中之hRPE集結粒之切片用作斑萎蛋白之陽性對照。陰性對照為小鼠兔及小鼠IgG(Novus Biologicals)。

q-RT-PCR

使用來自Qiagen之RNeasy RNA分離套組來自細胞混合物中提取RNA，產生每樣本30μL RNA之最終體積。隨後，用來自Qiagen之Quantitect cDNA合成套組自10μL RNA中合成cDNA，產生20μL cDNA之最終體積。隨後以一式三份複製品形式測試1μL cDNA之相對基因表現，該相對基因表現已標準化至各樣本中存在之β肌動蛋白信號。針對比較Ct相對定量，根據製造商推薦之循環條件，使用來自Life Technologies之具有2.1版軟體及TaqMan基因表現分析之Applied Biosystems StepOne Plus進行基因表現 譜分析。將針對hES標記(Nanog、OCT4及SOX2)及hRPE標記(RPE-65、PAX-6、MITF及斑萎蛋白)之qRT-PCR分析標準化至在充當置零點之100% hES細胞樣本中觀察到之表現程度(RQ=相對定量)。以一式三份複製品形式分析相對基因表現，該相對基因表現已標準化至各樣本中存在之β肌動蛋白信號。數據以三個複製品之平均值+/- SD之形式表示。

吞噬作用分析

使用pHrodo^TM大腸桿菌(e coli)螢光生物粒子(Invitrogen)藉由基於FACS之分析評估吞噬作用，該等生物粒子在內化於細胞內吞噬體之較低pH值環境中時發螢光。根據製造商之說明書製備生物粒子。在37℃下在CO₂非依賴性培養基(Invitrogen)中，將匯合RPE與4孔盤之每一個孔50μL至200μL生物粒子一起培育16至20小時。在4℃下培育陰性對照盤。在顯微鏡下檢查細胞，藉由胰蛋白酶收集且藉由FACS分析，在C6流式細胞儀上計數10,000個事件(event)。

黑色素測定

在室溫下將RPE細胞懸浮液以160×G離心5分鐘，且移出樣本以用於血細胞計細胞計數。將集結粒再懸浮於1N NaOH中且加熱至80℃後持續10分鐘，渦旋，且參考在5μg/mL至180μg/mL範圍內之合成黑色素(Sigma目錄號8631)標準曲線來量測在475nm下之吸光度。以一式三份形式評估樣本，且將數據標準化至所提取之總細胞數目。

表6 RPE在NIH-III小鼠之視網膜下腔中之存活

下表6中之數據彙集自三項研究：1)致腫瘤性研究，其中將100,000個hES-RPE注射至眼睛中，且在第4週、第12週及第40週終結動物；2)外加研究，其中將外加有0.01%、0.1%及1%多能hES細胞之100,000個hES-RPE注射至眼睛中，且在第2月及第9月終結動物；及3)組織分佈研究，其中將50,000及100,000個hES-RPE注射至眼睛中，且在第1月、第3月及第9月終結動物。該表包括藉由針對人類DNA之全眼Q-PCR以及針對人類粒線體之石蠟切片免疫染色而獲得之數據。

實例3

調整細胞密度以確保精確的劑量傳遞

此研究描述裝載及注射過程中之步驟對傳遞活RPE之影響的測定。特定言之，在此實例中，展示裝載及注射過程引起一定的活細胞損失，此損失可易於量測(且可能隨傳遞方案而變化，例如視所用特定注射套管而定)，且可藉由提高細胞濃度、允許傳遞預期數目之細胞來顧及此損失。另外，展示細胞接種及生長在裝載及經由兩種套管擠出之後並未受到明顯不利的影響。

此等研究併有整個裝載及注射過程，包括：(1)向2000個活細胞/微升之經濃縮之最終產品RPE細胞中最後添加冷BSS-Plus以獲得所需欲注射之細胞密度。(2)使用連接至1ml注射器(BD LUER-LOK(TM))之18g鈍填充針(BD)溫和混合RPE細胞與BSS-Plus。(3)經由注射套管自經填充之注射器擠出150μL經調配之RPE細胞。

RPE細胞在冰上在Alcon BSS BSS-Plus(R)中之維持展示在4小時內不變，其限制條件為細胞被調配成1000個細胞/微升或1000個細胞/微升以上之濃度。在此等條件下，在 活細胞數目方面不存在可偵測之損失。為了確保細胞完整性，精確體積RPE最終產品細胞將以2000個活細胞/微升傳遞至手術室。各管RPE細胞將伴隨有含有精確體積冷BSS-Plus之第二個管，該冷BSS-Plus欲在注射即將開始之前添加至細胞中並混合。預分散之RPE細胞及BSS-Plus將在2℃至8℃下在無菌微量離心管中傳遞至OR。

研究1-MEDONE POLYTIP(R)套管23/38

如實例1中所述，將特徵與所需臨床RPE批次相似之RPE細胞解凍，處理並在冷BSS-Plus中調配。解凍及調配後回收總共4.1百萬個活細胞。起始生存力為91%，且解凍及調配後回收之細胞數目對此批次而言為典型的。將細胞在冷BSS-Plus中稀釋至所指示之起始濃度並儲存於冰上。隨後，使用連接至1mL注射器(BD LUER-LOK TM)之18g鈍填充針(BD)溫和濕磨細胞。將約200μL細胞經由填充針轉移至注射器中。移除填充針，且將MEDONE POLYTIP(R)套管23/38連接至含有細胞之注射器上。輕輕拍打注射器之柱塞以經由注射套管投與150μL細胞。注射總時間為2至3分鐘。將細胞收集於無菌管中且評估活細胞數目。

研究1展示RPE細胞經裝載並經由MedOne套管擠出，在所測試之細胞密度範圍(295個活細胞/微升至1144個活細胞/微升)內引起所傳遞之細胞密度之可預測的損失。活細胞密度之平均損失為22.8 +/- 7.0%(N=6)。結果展示於以下表9中。

在於295個活細胞/微升至1144個活細胞/微升範圍內測試之所有細胞密度下均觀察到經由注射套管傳遞之細胞數目的降低。細胞密度之降低百分比在所測試之範圍內似乎大體不變。在所測試之兩種最低密度(199及296)下觀察到之降低百分比較易變，且此等較低細胞密度可能反映細胞計數之精確性。

將經由MedOne套管擠出之細胞、經調配但未經由套管擠出之對照細胞離心，在RPE生長培養基中再懸浮，且以10,000個細胞/孔接種於經明膠塗佈之全部區域96孔盤中。出於比較，裝載同一細胞製備物之部分，且使其通過Synergetics套管(39g剛性微注射套管，有角度的)且如上處理並接種。接種後四天，以胰蛋白酶處理細胞並計數。以下表10展示三次細胞計數之平均細胞數目+/- SD。

經由任一套管擠出之細胞之後續接種及生長與未經由套管擠出之對照細胞類似。

研究2-Synergetics,Inc.注射套管，有角度的，39g

如實例1中所述，將來自特徵與所需臨床RPE批次類似之批次的RPE細胞解凍，處理並在冷BSS-Plus中調配。解凍及調配後回收總共2.6百萬個活細胞。起始生存力為97%，且解凍及調配後回收之細胞數目對此批次而言為典型的。將細胞在冷BSS-Plus中稀釋至375個活細胞/微升之起始濃度並儲存在冰上。隨後，使用連接至1mL注射器(BD LUER-LOK^TM)之18g鈍填充針(BD)來溫和濕磨細胞。將約200μL細胞經由填充針轉移至注射器中。移除填充針，且將Synergetics Inc.39g剛性微注射套管(有角度的)連接至含有細胞之注射器上。輕輕拍打注射器之柱塞以經由注射套管投與150μL細胞。注射總時間為2至3分鐘。將細胞收集於無菌管中且評估活細胞數目。在一系列的八次注射內，所傳遞之平均活細胞為238 +/- 25個活細胞/微升或比此研究中最低細胞劑量所需之傳遞(50,000個細胞/眼)少約100個活細胞。

因此，研究2展示RPE細胞經裝載並經由Synergetics套管 擠出，在最低所需細胞劑量範圍內(測試375個活細胞/微升之裝載密度)引起細胞密度之可預測的損失。活細胞密度之平均損失為38.4 +/- 6.8%。(N=8)。因此，可增加裝載細胞密度以補償預期損失，由此確保精確傳遞所需數目之活RPE(諸如在本發明研究中50,000個細胞/眼)。

研究3-MEDONE POLYTIP(R)套管23/38及Synergetics 39g剛性微注射套管(有角度的)

以用於上文實例1中患者投與之RPE批次進行研究3。在此研究中，RPE細胞以高於欲傳遞劑量細胞密度25%裝載以補償裝載注射器及經由MedOne套管注射中之預期損失。將相同的25%補償裝載密度用於測試Synergetics套管。

當裝載有高於較低目標劑量25%調配之細胞(444個活細胞/微升以傳遞333個細胞/微升)時，MedOne套管傳遞336 +/- 40個活細胞/微升。類似地，當裝載有高於目標劑量25%調配之細胞(1776個活細胞/微升以傳遞1,333個細胞/微升)時，MedOne套管傳遞1433 +/- 187個活細胞/微升。使用Synergetics套管之最低細胞劑量注射之結果證實使裝載細胞密度提高100個活細胞/微升之添加將在較低密度下獲得目標劑量。

將8隻小瓶(總共16百萬個細胞)解凍且如上所述處理(3次離心)，所有處理均在室溫下進行。產率為在95%生存力下之3.78百萬個細胞(23.6%回收率，與先前解凍類似)。將細胞再懸浮以在冷BSS-Plus中儲存及運輸2百萬個活細胞/毫 升(2,000個活細胞/微升)之密度，且此後保持在冰上。選擇大於1百萬個細胞/毫升之細胞密度以在於BSS-Plus中冷藏期間促進細胞存活。將21個含有177,600個總活細胞之89μL之等分試樣分配至最終產品封閉微量離心管中。

將細胞等分試樣儲存於冰上直至在注射器裝載時進行最終稀釋並經由套管擠出。對於較低劑量傳遞(50,000個活RPE/眼)，將311μL冷BSS-Plus分配至含有細胞之管中以使最終體積在444個細胞/微升下達至400μL。此密度比333個細胞/微升之所需傳遞密度高25%，以補償在用填充針混合、注射器裝載及經由MedOne套管傳遞時出現之預期損失。

對於較高劑量傳遞(200,000個活RPE/眼)，將兩份89μL之細胞等分試樣合併至一個管中(356,000個細胞)，且將22μL冷BSS-Plus分配至含有細胞之管中以使最終體積在1,776個細胞/微升下達至200μL。此密度比1,333個細胞/微升之所需傳遞密度高25%，以補償在用填充針混合、注射器裝載及經由MedOne套管傳遞時出現之預期損失。

給含有經稀釋之細胞之微量離心管加蓋，並用一個手指輕輕拍打以促進混合。將鈍填充針(90μL空隙體積)連接至1mL BD注射器，且將細胞在鈍填充針輕輕濕磨1至2次，注意使之與注射器之接觸減至最少。用約200μL細胞填充注射器。移除鈍針，且連接注射套管(MedOne 38g或Synergenic 39g)。將約150μL細胞分配至微量離心管中。藉由錐蟲藍排斥來評估各經分配之等分試樣之細胞密度及 生存力。此等結果概述於以下表11及表12中。

使初始裝載密度提高高於目標劑量25%有效抵償在裝載及經由MedOne套管擠出期間遭遇之細胞密度損失。在欲投與之最低劑量下，MedOne套管傳遞336 +/- 40個活細胞/微升之平均細胞密度(N=6)用於333個活細胞/微升之目標傳遞。在欲傳遞之最高細胞密度(1333個活細胞/微升)下，MedOne套管傳遞1433 +/- 187個活細胞/微升(N=3)。

在經由MedOne或Synergetics套管傳遞最低劑量之後，將細胞稀釋於RPE生長培養基中，離心，且以40,000個細胞/孔接種於經明膠塗佈之全部區域96孔盤中。將採集自與經由套管擠出之細胞相同的管中之非套管注射之對照細胞以相同方式處理並接種。接種後24小時，所有細胞均已 附著，且在任何所測試之條件下均未觀察到指示細胞死亡或接種效率受損之漂浮細胞。

將經由MedOne套管、Synergetics套管擠出之細胞以及經調配但未經由任一套管擠出之對照細胞離心，再懸浮於RPE生長培養基中，且以40,000個細胞/孔接種於經明膠塗佈之全部區域96孔盤中。接種後三天，以胰蛋白酶處理細胞並計數。以下表13展示平均細胞數目+/- SD。此等結果展示後續接種及生長並未受到經由任一套管擠出之不利影響。在培養物中接種後兩天，在顯微鏡下檢查對照細胞及經MedOne套管注射之細胞，且展示具有主動分裂細胞之典型RPE形態。在對照細胞與經套管注射之細胞之間未觀察到差異。

總而言之，由於含RPE細胞之冷BSS-Plus在大於1000個細胞/微升之濃度下較穩定，故最終產品可以2000個細胞/微升再懸浮於最終產品封閉微量離心管之冷BSS-Plus中，允許套管裝載至多300,000個細胞於150μL體積中之劑量。在於GMP無塵室中處理之後，可在2℃至8℃下將兩隻微量離心管傳遞至手術室中：一個小瓶含有在2000個活細胞/微升下之精確體積之RPE細胞，且一個小瓶含有精確體積 之冷BSS-Plus，該冷BSS-Plus欲添加至細胞中以使細胞密度達至欲注射之密度(亦即，顧及在裝載及經由套管擠出期間活細胞損失之密度，例如比最終目標劑量高25%之密度以顧及在MedOne套管之情況下的活細胞損失)。當欲裝載至套管中之濃度高於1,000個細胞/微升或高於2,000個細胞/微升時，可省去稀釋步驟，且改為可將細胞以所需濃度在冷BSS-Plus中傳遞至手術室中。

對MedOne套管定製之經調配之裝載密度及相應劑量展示於表14中。類似定製可易於針對Synergetics套管或其他套管或傳遞系統測定。

實例4

自ES細胞分化RPE

此實例描述自hESC分化RPE。所得RPE用於實例1中所述之研究。

胚樣體分化培養基(EB-DM)由補充以Glutamax、非必需胺基酸、2-巰基乙醇及Knockout^TM血清替代物之Knockout^TM DMEM組成，且在胚樣體形成開始時至收集並 解離色素沉著之斑塊之時(亦即在胚樣體形成、向外生長及後續色素沉著之斑塊形成期間)使用。各批EB-DM由250mL Knockout^TM DMEM、3mL Glutamax-I、3ml非必需胺基酸、0.3mL 2-巰基乙醇及38mL Knockout^TM血清替代物組成。

RPE生長/維持培養基(RPE-GM/MM)由一份EB-DM(如前一段落中所述)及一份DMEM(高葡萄糖)、FBS及Glutamax組成。在以下情況下使用此培養基：自色素沉著之斑塊獲得RPE細胞之後，及在後續RPE生長及維持期間，在第0代至第2代直至最終散裝產品收集之點期間。各批RPT-GM/MM由100mL EB-DM、90mL DMEM高葡萄糖、10ML胎牛血清(FBS)(Hyclone)及1mL Glutamax-I組成。

在此等培養基中獲得並培養之RPE細胞表現RPE斑萎蛋白、CRALBP、RPE65、PEDF之分子標記，能夠吞噬，且救治RCS大鼠之視覺功能。

使用上述培養基產生之RPE批次已通過所有處理中品質測試，包括：形態學評估、免疫組織化學染色及針對RPE基因上調及hES細胞基因表現下調之q-RT-PCR。產率及細胞純度與先前使用MDBK-GM及MDBK-MM培養基(Sigma Aldrich)、OptiPRO-SFM或VP-SFM製備之RPE細胞類似。

自胚胎體形成之時至收集色素沉著之斑塊之點使用EB-DM製造RPE批次(代替MDBK-GM或OptiPRO-SFM)。在收集並以胰蛋白酶處理色素沉著之斑塊(第0代)之後，隨後將RPE細胞接種於如以上所定義之RPE-GM(EGM-2培養基) 中，且隨後轉換成RPE生長/維持培養基代替MDBK-MM或VP-SFM。或者，RPE可直接接種於RPE-GM/MM中，且允許生長並分化持續繼代之整個持續時間。在觀察到適當分化程度之後，收集第0代RPE細胞，且使其在此等培養基中再分裂兩次直至在第2代下收集並極冷保藏散裝產品為止。

以下資料展示五個RPE小批之處理中測試之概述，該等RPE小批自胚胎體形成之時至收集色素沉著之斑塊之點維持於EB-DM中。此時，在不同天自不同孔中收集色素沉著之斑塊，以胰蛋白酶處理且作為第0代RPE接種。將B1A、B2A及B2B批次接種於EGM-2培養基中直至匯合為止，隨後轉換成RPE生長/維持培養基以促進分化持續第0代、第1代及第2代。除分別1或2個繼代以外，以相同方式處理B3B及B3A批次，在該1或2個繼代時其專門維持於RPE-GM/MM中持續繼代之整個持續時間。因此，所有批次在達至匯合後均維持於RPE-GM/MM中直至觀察到適當分化程度為止。在第2代結束之後，以散裝產品形式極冷保藏RPE細胞。除在EGM-2培養基中觀察到稍微較快之生長速率以外，維持於EGM-2中持續初始生長期繼而轉換成RPE-GM/MM或保持於RPE生長/維持培養基中持續數個繼代之整個持續時間的批次類似。所有批次均在第0代、第1代及第2代通過形態學評估，其中通過指標包括典型上皮、鵝卵石形態及培養基色素沉著。RPE標記表現使用以下初級抗體(稀釋度在1：100與1：1000之間且針對各抗體批次憑經 驗確定)藉由間接免疫螢光偵測：斑萎蛋白-小鼠單株；Novus Biologicals(# NB 300-164)；PAX6-Covance，兔多株(PRB-278P)；ZO-1-Invitrogen；小鼠單株(339100)；ZO-1-Invitrogen；兔多株(61-7300)；ZO-1-FITC-Invitrogen；小鼠單株(339111)；MITF-小鼠單株，Abcam(ab3201)。

二級抗體以在阻斷溶液中之1：500稀釋度(或如指示之其他稀釋度)使用且為以下各者：Alexa Fluor 488抗小鼠，Invitrogen # A11001；Alexa Fluor 488抗兔，Invitrogen # A11008；Alexa Fluor 594抗小鼠，Invitrogen # A11032；Alexa Fluor 594抗兔，Invitrogen # A11012；山羊抗小鼠Cy3-結合物(Jackson Immunoresearch目錄號115-165-146)，以1：200使用。

藉由以下組合進行RPE標記之免疫染色以評估純度：PAX6及MITF；斑萎蛋白及PAX6；及單獨ZO-1。藉由測定斑萎蛋白陽性染色RPE之百分比來評估RPE成熟度。在製造RPE細胞期間在4個點下進行免疫染色：(1)在收集第1代及接種第2代之前，針對斑萎蛋白、PAX6及ZO-1染色RPE；(2)在收集第2代及極冷保藏之前，針對斑萎蛋白、PAX6及ZO-1染色RPE；(3)解凍RPE散裝產品，且如實例1中所述調配，且以1,000個活細胞/微升再懸浮於BSS-PLUS中。隨後將細胞稀釋於RPE-GM中，以1000RPM離心，再懸浮，且以100,000個細胞/孔至300,000個細胞/孔接種於經明膠塗佈之四孔盤中，且培育一至兩天，隨後針對MITF及PAX6染色；(4)解凍RPE散裝產品，且如實例1中所述調 配，且以1,000個活細胞/微升再懸浮於BSS-PLUS中。隨後將細胞稀釋於RPE-GM中，以1000RPM離心，再懸浮，且以50,000個細胞/孔至200,000個細胞/孔接種於經明膠塗佈之四孔盤中，且維持直至匯合，隨後染色。此時，將培養物轉換成RPE-MM且維持直至觀察到培養基色素沉著及鵝卵石形態，在其時針對PAX6、斑萎蛋白及ZO-1染色培養物。簡言之，細胞以不具有Ca2+、Mg2+之PBS(Gibco # 14190)中洗2至3次，用2%多聚甲醛固定10分鐘，用2×PBS沖洗，用含0.1% NP-40替代物溶液(Sigma # 74388)之PBS培育15分鐘，用PBS沖洗2×，用阻斷溶液(10%普通山羊血清(Jackson Immunoresearch # 005-000-121)、16%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences # 15710)以2%工作濃度製備於PBS(新鮮製得或冷凍的等分試樣))培育30分鐘至隔夜。隨後在阻斷溶液中用初級抗體(每孔至多兩種抗體，使用來自不同物種之初級抗體)培育細胞，且在室溫下培育1至2小時或在4℃下培育隔夜，用PBS沖洗，在PBS-Tween溶液(具有0.5% Tween-20(Sigma # P7949)之不具有Ca2+、Mg2+之PBS(Gibco # 14190))中洗滌三次，伴以攪拌(各次洗滌攪拌10至15分鐘)。隨後用二級抗體培育樣本，且如同初級抗體一樣洗滌。在移除最後一份洗滌液之後，添加1至2滴具有DAPI之Vectashield，且在倒置螢光顯微鏡上檢查並計數細胞。在所有通道中在20×放大倍數下採集三至六個隨機視場(含有最少1000個核)之相片。合併相片，且視需要調整影像以允許觀測哪些細胞對斑萎蛋白及PAX6 呈陰性、或對PAX6及MITF呈陰性或對ZO-1呈陰性。若觀察到預期染色模式，例如定位於核中之PAX6、以多角形模式定位於質膜中之斑萎蛋白(展示在細胞周緣呈清晰線條形式之經定位之斑萎蛋白染色)、以多角形模式存在於圈定細胞之緊密接合中之ZO-1染色、及限於核中偵測之MITF染色，則將細胞算作對給定標記呈陽性。對各標記或標記組合呈陽性之細胞百分比藉由以下方式測定：在合併之影像中計數陽性細胞，並藉由計數來自未合併之經DAPI染色之影像中之核來測定總細胞數目。

另外，如實例1中所述，藉由q-RT-PCR偵測mRNA表現。自各批次獲得之結果展示於表16中，且展示正如所料，RPE基因上調且ES細胞基因下調。

針對吞噬能力，測試以下各者：使用上述培養基調配物(RPE-GM/MM及EB-DM)製造之RPE、以及先前使用其他培養基(MDBK-GM及MDBK-MM)製造之經極冷保藏之RPE細胞。在此研究中，將經極冷保藏之RPE解凍，且接種於RPE生長/維持培養基中。將來自在胚樣體形成及色素沉著斑塊形成期間使用EB-DM以及在RPE期間使用RPE-GM/MM產生之當前批次的RPE細胞以胰蛋白酶處理且同樣接種於RPE-GM/MM中。使兩種培養物生長至匯合且在RPE-GM/MM中維持至分化為止，隨後測試其吞噬螢光生物粒子(Invitrogen目錄號P35361)之能力，該等螢光生物粒子在內化於RPE細胞吞噬體之酸性環境中時發螢光。將細胞與螢光生物粒子在37℃下培育以允許吞噬，或在4℃下培育作為陰性對照。藉由FACS偵測在37℃下培育之細胞之螢光強度偏移(圖12)，指示生物粒子之吞噬。對峰進行統計學積分，得到各批次及培育溫度之吞噬陽性細胞之百分比。

此等結果展示在維持於RPE-GM/MM中之兩個批次之RPE細胞中之較高比例細胞中的吞噬作用，且進一步展示針對RPE細胞生長及成熟使用RPE-GM/MM之適用性。

實例5

獲得RPE之其他例示性方法

此實例中之方法用於製造自其他hESC株分化之RPE，該等hESC株在無胚胎破壞之情況下製造，特定言之為iPS細胞(特定言之，使用非整合性游離型載體製造之iPS細胞)及自經活檢之卵裂球製造之NED(「無胚胎破壞」)hES細胞，其中獲得卵裂球之胚胎保持有活力且隨後經極冷保藏。NED細胞如Chung等人(Cell Stem Cell.2008年2月7日；2(2)：113-7，其以全文引用之方式併入本文中)中所述製造。

在mTESR-1(Stem Cell Technologies,Inc.)上按照製造商 之說明書於基質膠稀釋物上增殖hESC。如先前所述，自胚樣體(「EB)」)或多層hESC培養物製造RPE(Klimanskaya等人，Cell Stem Cells 6：217-245(2004)，其以全文引用之方式併入本文中)。然而，觀察到自於基質膠上培養之hESC形成EB之效率較低，且細胞展現較低成功聚集速率及較低生存力。以下方案修改用於改良EB形成效率：使hESC過度生長超過其通常將繼代之時，如此使得群落「較厚」，亦即稍微增高及/或多層。為了EB形成，使用機械刮擦、膠原酶I、accutase、膠原酶與accutase或膠原酶繼而accutase、基於EDTA之解離緩衝液，在不允許解離成單細胞懸浮液之情況下解離hESC。此等方法允許hESC群落在不解離成單細胞之情況下被提起。未使用胰蛋白酶(其趨向於易於在常規使用條件下產生單細胞懸浮液)。

隨後，在低附著性盤上培養經解離之hESC以允許EB形成。其他方法(諸如懸滴)視情況可用於EB形成。通常，將來自6孔盤之1至3個孔之hESC培養於低附著性盤之1至2個孔的2ml至7ml培養基中。將細胞培養於EB培養基(knockout高葡萄糖DMEM、1%非必需胺基酸溶液、2mM GlutaMAX I、0.1mM β-巰基乙醇及13%血清替代物(SR,Invitrogen))中。在於EB培養基中培養之前2至3天同時形成EB期間，EB培養基補充以10微莫耳Stemgent之Stemolecule Y-27632、ρ相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑(參見Watanabe等人，Nat Biotechnol.2007年6月；25(6)：681-6， 其以全文引用之方式併入本文中)。ROCK抑制劑之使用改良細胞生存力，尤其對於使用EDTA或酶促解離獲得之hES細胞而言。視情況針對以機械方式刮落之hESC使用ROCK抑制劑，該以機械方式刮落之hESC即使在無ROCK抑制劑之情況下亦存活良好。

在EB形成後之7至12天之間，將EB塗於經明膠塗佈之盤上以用於向外生長。RPE易於藉由其上皮形態(鵝卵石外觀)及色素沉著來鑑別。

除了將細胞培養於基質膠而非餵養細胞上以外，基本上如先前所述，亦自於基質膠上生長之hESC之多層培養物製造RPE(Klimanskaya等人，2004，上文)。簡言之，允許附著物在mTESR-1培養基中在基質膠上過度生長直至hES群落失去其緊密邊界且變為多層為止(培養約10至14天)，在其時以EB培養基(如上所述)置換培養基。ROCK抑制劑視情況包括於培養基中，但並非有效RPE形成及回收所必需。RPE易於藉由其上皮形態(鵝卵石外觀)及色素沉著來鑑別。每1至2天更換培養基，直至觀察到色素沉著之RPE細胞為止(通常在4至5週內)。

所得EB或多層培養物展現含有肉眼可見暗區之「雀斑狀」外觀。顯微鏡檢查證實此等暗區由RPE細胞組成，該等RPE細胞可藉由其特徵性色素沉著及鵝卵石上皮形態來鑑別。所得RPE細胞培養物展示於圖19中。在自hESC分化之後，RPE細胞藉由機械或酶促解離來分離。

實例6

RPE移植方法

以下方法用於將細胞移植至乾性年齡相關之黃斑部變性(AMD)及斯特格氏黃斑營養不良(SMD)患者中。

在手術即將開始之前，不投與患者皮質類固醇。在外科醫師判斷下，在全身麻醉或者伴以或不伴以清醒鎮靜之局部麻醉下進行手術。

以儲存於液氮儲存系統之氣相(約-140℃)中之冷凍懸浮液形式提供用於移植之細胞。為了調配細胞以用於投藥，將小瓶自液氮冷凍器中移出，隨後置放於37℃水浴中，且不停地攪拌1至2分鐘直至解凍為止。隨後用70%異丙醇噴霧小瓶且乾燥。將各小瓶之內含物(在冷凍時含有1百萬個細胞之1mL極冷保藏培養基)轉移至50mL錐形管中且用40mL無血清DMEM沖洗。離心細胞，且將各集結粒再懸浮於40mL BSS-PLUS中。再次離心細胞懸浮液，且若已解凍一個以上冷凍小瓶，則將集結粒合併在一起。使體積在BSS PLUS中達至10mL之最終體積，且離心第三次。將上清液全部吸出，且對於所解凍之各1mL細胞，使細胞達至約150μL BSS PLUS之最終體積(若需要較濃懸浮液，則可使用較少體積)。移出樣本，且進行活細胞計數。測定總活細胞數目，且添加適當體積之BSS-PLUS以獲得目標活細胞濃度，諸如2,000個活細胞/微升。將適當體積之經調配之產品轉移至0.5mL無菌微量離心管中，且移出樣本以用於存檔、生存力測定、革蘭氏染色(Gram staining)及無菌測試。亦製備並標記配對之含有精確體積BSS-Plus之0.5 mL無菌微量離心管。允許成對之小瓶在2℃至8℃下儲存不多於4小時，以待在手術室中最終混合並移植。

對患者進行標準3切口平坦部玻璃體切開術。進行小型視網膜切開術，且隨後經由玻璃體切開術機器使用流體注射系統進行BSS Plus進入視網膜下腔之輸注，直至產生較小感覺神經性視網膜脫離為止。外科醫師確保泡產生於顳窩位置中。泡視情況可在拱形血管內擴大，但並不脫離中心黃斑/窩。若觀察到泡朝中心黃斑擴大，則外科醫師可選擇停止並建立另一視網膜切開術，遵守與其位置相同的規則。隨後移除視網膜下注射之BSS Plus。

隨後引入預裝載之套管，且在約1分鐘內以150μL之體積將細胞輸注所建立之空間中。藉由直接觀察進行監控以確保套管定位正確。藉由攝影術或(較佳)視訊經由手術顯微鏡記錄泡之精確位置，以便可使手術後發現與泡之位置精確相關。

植入含有所需數目hESC來源之RPE細胞(例如50,000、100,000、150,000或200,000個)於150μL BSS Plus中之懸浮液。在約1分鐘內輸注細胞。使套管在位置上再保持1分鐘以避免回流。在外科醫師之判斷下，例如若視網膜切開擴大，則視情況進行空氣-流體交換。隨後使用標準程序來閉合切口。隨後使患者自麻醉恢復，但保持仰臥位6小時。

在該程序後48小時不允許投與皮質類固醇。若需要，則允許使用局部或全身非類固醇消炎劑來管理術後不適。

實例7

經極冷保藏之RPE細胞製劑之穩定性

此實例展示經極冷保藏之RPE細胞通過放行準則且在於冷凍後6及12個月時間點下測試時保持適用。在其基礎上，預期經極冷保藏之RPE應在冷凍後保持適於移植至少12個月或12個月以上。

如以上實例4中所述製造經極冷保藏之RPE樣品，且在極冷保藏培養基(90% FBS及10% DMSO)中冷凍於液氮中，且儲存於液氮儲存系統之氣相(約-140℃)中。在儲存6或12個月之後，解凍經極冷保藏之細胞，且如實例6中所述洗滌(簡言之，在37℃水浴中解凍，用70%乙醇洗滌容器外部，且洗滌細胞以移除極冷保藏培養基)。在解凍之後，使細胞經受測試以證實產品穩定性。如以下表18中所示，通過各項放行準則。

實例8

經調配之RPE細胞之穩定性

此實例展示在解凍及製備用於投藥之後在維持於2℃至6℃之間時，RPE細胞保持適用至少4小時。

解凍經極冷保藏之細胞，且如以上實例6中所述調配，且在2℃至8℃下儲存於最終產品容器(具有密封墊之0.5mL無菌微量離心管)中。表19展示在調配時及在冷藏四小時後，如由錐蟲藍排斥評估之所測試之此等兩個批次的平均生存力百分比±SD(每批次3個最終調配物)。

此等數據展示經調配之RPE細胞維持細胞生存力至製備後4小時。

在其他實驗中，以2,000個活細胞/微升調配RPE細胞最終產品，且儲存於低溫下持續不同時間，隨後經由MedOne REF 3233 PolyTip^R套管23/38擠出。在此研究中(資料展示於表20中)，如上解凍並處理RPE細胞批次(其已 通過針對臨床用途之散裝產品放行測試)。細胞以2,000個活細胞/微升之密度再懸浮並儲存於BSS-Plus中，且此後保持於冰上。選擇大於1,000個活細胞/微升之細胞密度以在於BSS-Plus中冷藏期間促進細胞存活。此時，將21份含有177,600個總活細胞之89μL等分試樣分配至最終產品封閉微量離心管中。將細胞等分試樣儲存於冰上直至在注射器裝載及經由套管擠出時進行最終稀釋為止。對於較低劑量傳遞，將311μL冷BSS-Plus分配至含有細胞之管中以使最終體積在444個細胞/微升下達至400μL。此密度比333個細胞/微升之所需傳遞密度高25%以補償在用填充針混合、注射器裝載及經由MedOne套管傳遞時出現之預期損失。

對於較高劑量傳遞，將兩份89μL細胞合併至一個管中(356,000)，且將22μL冷BSS-Plus分配至含有細胞之管中以使最終體積在1,776個細胞/微升下達至400μL。此密度比1,333個細胞/微升之所需傳遞密度高25%以補償在用填充針混合、注射器裝載及經由MedOne套管傳遞時出現之預期損失。

給含有經稀釋之細胞之微量離心管加蓋，且用一個手指輕輕拍打以促進混合。將鈍填充針(90μL空隙體積)連接至1mL BD注射器，且將細胞在鈍填充針中輕輕濕磨1至2次，注意使與注射器之接觸減至最少。用約200μL細胞填充注射器。移除鈍針，且連接MedOne 38g注射套管。將約150μL細胞分配至微量離心管中。藉由錐蟲藍排斥來評估各經分配之等分試樣之細胞密度及生存力。調配後時間為 自將細胞以2,000個活細胞/微升再懸浮於冷BSS-Plus中起經過的分鐘數。對於以所指示之濃度傳遞之細胞，此等資料展示於表20中。

資料展示經由注射套管擠出之最終產品RPE細胞之活細胞數目在於所測試之時間內儲存於低溫中時並不降低。在超過調配後240分鐘(4小時)之時觀察之活細胞密度支持至少4小時之到期時間。在此研究中，在冰上將含RPE細胞之BSS-Plus儲存於最終產品密封物中。儲存於冰上之微量 離心管中之BSS-Plus的溫度隨後使用經校準之探針量測且發現為3℃。

其他實驗測試經調配之RPE細胞之生存力持續至多六小時。在調配(0小時)時及在冷藏(2℃至8℃)4及6小時後評估生存力。製造用於此研究之RPE批次，且使用如針對GMP製造描述之程序、方法及材料進行極冷保藏。解凍RPE細胞之經極冷保藏之小瓶，且根據描述於以上實例6中之程序調配。在調配(0小時)時及在冷藏(2℃至8℃)4及6小時後評估細胞之活細胞數目。此外，將0、4及6小時細胞接種並培養以用於後續純度及效能評估。針對接種之各時間點(0、4及6小時)，藉由MITF及PAX6免疫染色來評估純度，且藉由FACS分析來評估螢光粒子之吞噬。

活細胞密度藉由在血細胞計數器中計數排斥錐蟲藍之細胞來測定。資料為在4個血球計小室上進行之計數之平均值+/- SD。結果展示於下表21中。

儲存經調配之細胞之GMP儲存冰箱之溫度讀數證實溫度在整個實驗中保持在6℃下。

2,590個/微升及1,700個/微升之0小時起始活細胞密度包括以某些臨床調配物為目標之2,000個活細胞/微升。直至冷藏六小時，在所測試之起始細胞密度範圍內未觀察到活細胞數目損失。

實例9

此實例提供附加斯特格氏病患者之兩種治療之初步治療結果。兩名患者各自使用以上實例6中所述之RPE移植方法以自hESC來源中獲得之50,000個RPE細胞治療(如實例1中所述)。兩名斯特格氏患者之包括視網膜、視盤、黃斑及後極之眼底相片指示注射部位及在注射含有RPE細胞之溶液後產生之泡的區域(圖15)。

其他眼底相片展示兩名SMD患者之注射泡內區域之建立，該等區域具有漸增之色素沉著之RPE細胞斑塊(圖16及圖17)。此等結果提示移入及視網膜區域經新RPE層重換新面。

亦在圖16中所示之患者之經治療之眼睛中量測視力。縱軸指示早期治療糖尿病性視網膜病變研究(ETDRS)分數且水平軸展示手術後天數。

此等結果指示治療後RPE細胞之穩定移入持續至少3個月。經治療之眼睛中之視力在治療後14天時已回至基線水準，且保持在基線以上直至所示最終時間點84天。

實例10

一年患者評估

在以上實例1中所述之RPE治療之後在一年時間內評估AMD患者及SMD患者。

AMD患者眼睛之眼底攝影術展示在治療後一年在經治療之眼睛中存在色素沉著之細胞(圖20B)。與此對比，色素沉著之細胞在治療前基線下不可偵測(圖20A)。此等結果指示治療後持續至少一年之RPE細胞之長期移入。

對於AMD患者，治療後一年中心ETDRS/BVCA分數為20。周邊分數以圖解形式說明於圖21中。患者之周邊ERTDS-BVCA分數在手術後第1天及第3天自初始基線值21降低至0，但在手術後第7天回至至少基線水準且此後保持在基線以上。在治療後一年，患者之周邊ERTDS-BVCA分數為34。

對於SMD患者，治療後一年中心ETDRS/BVCA分數為15。周邊分數以圖解形式說明於圖22中。手術後兩週患者之周邊ERTDS-BVCA分數自初始基線值0提高至1，且此後持續提高，在治療後一年時達至值15。

此等結果指示由投與RPE細胞產生之治療後持續至少一年之AMD及SMD患者之視力改良。

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所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中，其引用程度就如同特定且個別地指示各個別公開案、專利或專利申請案以全文引用之方式併入一般。美國臨時專利申請案第60/998,766號(2007年10月12日申請)、第60/998,668號(2007年10月12日申請)、第61/009,908號(2008年1月2日申請)及第61/009,911號(2008年1月2日申請)，上述申請案各自之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。此外，WO 2009/051671之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

僅僅使用常規實驗，熟習此項技術者將認識到或能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的多個等效物。該等等效物意欲為所附申請專利範圍所涵蓋。

圖1.由hESC MA09產生之RPE之表徵。A，六孔盤，其展示在胚樣體之分化培養物中形成之RPE之色素沉著之斑塊；B至H，評估經解凍及調配之RPE中之分子標記。在新鮮調配之細胞之隔夜培養物中評估MITF及PAX6(C至D)，且在3週大培養物上進行斑萎蛋白/PAX6及ZO-1免疫染色。B-調配後3週大RPE之HMC顯微攝影展示已建立培養基色素沉著之匯合之鵝卵石單層。C-MITF/PAX6(MITF-原始呈紅色，PAX6-原始呈綠色)合併；D-對應於MITF/PAX6之DAPI；E-斑萎蛋白/PAX6合併；F-對應DAPI；G-ZO- 1；H-對應DAPI。應注意在C至H中接近100%細胞對所評估之標記呈陽性。放大倍數，×400(B至H)。I-q-PCR展示與參考RPE批次(各組中之左圖，原始呈藍色)相比，在經解凍之臨床RPE(各組中之右圖，原始呈綠色)中RPE標記上調且hESC標記下調。所展示之基因(自左至右依序)為：斑萎蛋白、Pax-6、MITF、RPE-65、NANOG、OCT-4及SOX-2。J，FACS展示在37℃下及在4℃下(對照)hES-RPE對PhRodo生物粒子之吞噬作用。展示未經處理之細胞(原始為黑線；最左曲線)及4℃對照細胞(原始為紅線；曲線左部向未經處理之細胞曲線的右部略微提昇，且曲線之右部與未經處理之細胞曲線的右部重疊)及37℃處理之細胞(原始為藍線；最右曲線)。K-臨床RPE批次之正常女性(46 XX)核型。

圖2.九個月後NIH III小鼠眼睛中自hESC-MA09產生之RPE之存活及整合。以抗人類粒線體(A，原始呈紅色)及抗人類斑萎蛋白(B，原始呈綠色)染色之切片。注意相同細胞中人類粒線體及斑萎蛋白染色之精確共定位(C：A及B合併)以及小鼠RPE中不存在染色(F：A、B、C、E合併)。亮視場影像(E)上之框在「D」中擴大以展示人類RPE之形態。放大倍數200×(A至C、E、F)，D額外放大×4.5。

圖3.具有不同色素沉著程度之RPE之附著及生長之差異。顯微圖展示較淡(A至C)及較深(D至F)色素沉著批次之附著及特性。G說明較深批次(各組中之左圖)及較輕批次(各組中之右圖)之RPE的生長速率，展示塗盤後三個連續 日每孔總細胞數目。A及D展示接種後21小時下之總細胞群體，B及E展示移除漂浮細胞後與A及D中相同的培養物，C及F展示接種後三天之相同培養物。應注意較輕色素沉著批次中之大部分細胞在解凍後21小時下已附著(A、B、C)，而較深色素沉著批次僅少數細胞已附著(D、E、G箭頭)，且大部分細胞漂浮。在培養三天之後，較輕色素沉著批次(C)具有較多數目細胞，且建立匯合單層，而較深色素沉著批次仍然未匯合。放大倍數，×200。

圖4. hESC來源之RPE移植部位之影像。手術前及手術後SMD患者左側黃斑之彩色眼底相片(a至c)。矩形內部之區域對分手術移植部位之邊界且對應於不包括於手術注射內之黃斑萎縮。a-具有廣佈之RPE及感覺神經黃斑萎縮之基線黃斑彩色影像。b-hESC-RPE移植後一週之彩色黃斑影像。注意在基線RPE萎縮之區域中最明顯之輕度色素沉著。此色素沉著在第6週時增加(c)。圖d及圖e展示譜域眼部同調斷層攝影術(SD-OCT)及登記黑白相片(Hiedelberg Engineering)。圖e中展示之橫截面圖對應於由圖d中之箭頭指示之水平線(原始呈鮮綠色)。圖e中之虛線圓圈(原始呈紅色)突出呈現為定著於受損天然RPE層上或附著於受損天然RPE層之hESC-RPE細胞之物。

圖5. AMD患者之螢光素血管造影術影像。在不同時間間隔下注意到無滲漏之跡象。A：基線早期，B：基線晚期，C：4週早期，D：4週晚期，E：8週早期，F：8週晚期。(所選影像向下偏離中心以表現移植區域)。

圖6.斯特格氏患者之螢光素血管造影術影像。在不同時間間隔下注意到無滲漏之跡象。A：基線早期，B：基線晚期，C：4週早期，D：4週晚期，E：8週早期，F：8週晚期。(所選影像向下偏離中心以表現移植區域)。

圖7：在不同時間間隔下斯特格氏患者之OCT影像。在不同時期在任何影像中注意到無水腫或視網膜下流體之跡象。(所選OCT表現移植區域)。圖A：基線，B：1週，C：4週，D：8週。

圖8. AMD患者之狹縫燈影像。圖A及圖B：手術後1週。注意到無前段發炎或角膜水腫之跡象。

圖9.斯特格氏患者之狹縫燈影像。圖A及圖B：手術後1週。注意到無前段發炎或角膜水腫之跡象。

圖10.對AMD患者進行之古德曼視場：圖A：基線，圖B：6週。觀察到少許較小中心暗點。

圖11.對斯特格氏患者進行之古德曼視場：圖A：基線，圖B：6週。觀察到暗點之最小減值。

圖12.使用不同培養基製造之兩個批次RPE細胞之吞噬分析結果。RPE使用MDBK培養基(圖A)或EB-DM及RPE-GM/MM(圖B)製造。以下各者之結果以來自FACS分析之直方圖形式呈現：在無螢光生物粒子情況下培育之細胞(「未經處理」)、在4℃下與螢光生物粒子一起培育之陰性對照細胞(「4℃」)、及在37℃下與螢光生物粒子一起培育之細胞(「37℃」)。

圖13.患有斯特格氏黃斑營養不良之患者中hESC-RPE移 植部位之影像。手術前及手術後患者左側黃斑之彩色眼底相片(A至C)。矩形內部之區域對分手術移植部位之邊界且對應於不包括於手術注射內之黃斑萎縮。(A)具有廣佈之RPE及感覺神經黃斑萎縮之基線黃斑彩色影像。(B)hESC-RPE移植後1週之彩色黃斑影像。注意在基線RPE萎縮之區域中最明顯之輕度色素沉著。此色素沉著在第6週時增加(C)。(D至G)在基線(D)及移植後第3月(F)之彩色眼底相片及SD-OCT影像。彩色影像展示自基線至第3月在RPE層面下色素沉著增強。登記之SD-OCT影像(E、G)展示鄰接缺乏天然RPE之裸露布魯赫膜區域在第3月下，在RPE層面下色素沉著增強、正常單層RPE移入及存活(箭頭)。hESC=人類胚胎幹細胞。RPE=視網膜色素上皮。SD-OCT=譜域眼部同調斷層攝影術。

圖14.在患有斯特格氏黃斑營養不良之患者中移植hESC-RPE後，在SMD患者之未經治療眼睛(「對側眼」)及注射RPE細胞之眼睛(「經手術之眼睛」)中視力之變化的表格式概述。經手術之眼睛展示可藉由ETDRS及BCVA偵測之改良，而在未經治療眼睛中不存在偵測之視力變化。hESC=人類胚胎幹細胞。RPE=視網膜色素上皮。BCVA=最佳矯正視力。ETDRS=早期治療糖尿病性視網膜病變研究視力表。

圖15A及15B展示兩名附加斯特格氏患者之兩張眼底相片，該等相片包括視網膜、視盤、黃斑及後極，該等患者各自以50,000個自hESC來源獲得之RPE細胞治療。各相片指示注 射部位及在注射含有RPE細胞之溶液後產生之泡的區域。

圖16及圖17(兩名不同的附加SMD患者各自展示三張眼底相片，該等相片針對各患者在所指示之時間點下(亦即在基線、1個月及2或3個月下)採集，展示注射泡內區域之建立，該等區域具有漸增之色素沉著之RPE細胞斑塊，提示移入及視網膜區域經新RPE層重換新面。

圖18展示圖16上圖及圖17中展示之患者之經治療(「經注射」)及未經治療(「未經注射」)之眼睛中所量測的視力。縱軸指示早期治療糖尿病性視網膜病變研究(ETDRS)分數且水平軸展示手術後天數。

圖19.可見光顯微圖說明自在無胚胎破壞情況下產生之hESC製造之RPE培養物之預期色素沉著及形態。上部三個圖(A、B、C)展示自三種不同人類iPS(hiPS)細胞株製造之RPE。下部三個圖(D、E、F)展示自由經活檢之卵裂球產生之hES細胞(細胞株稱為D30469及NED7)製造之RPE，其中剩餘胚胎保持有活力且經極冷保藏。

圖20.圖4中較早時間點下展示之同一SMD患者中的長期RPE移入。在(A)基線及(B)RPE注射後一年採集之眼底相片展示存在色素沉著之細胞，指示在注射之後RPE細胞之長期移入持續至少一年。

圖21.持續至自治療起一年之時間點的AMD患者ETDRS/BCVA分數-周邊。

圖22.持續至自治療起一年之時間點的SMD患者ETDRS/BCVA分數-中心。

Claims (27)

1. 一種醫藥組合物，其包含：治療有效量之視網膜色素上皮(RPE)細胞；及醫藥學上可接受之載劑；其中該治療有效量之RPE細胞之平均黑色素含量低於5皮克/細胞。
2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該RPE細胞之濃度為444個或以上之細胞/微升。
3. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該RPE細胞濃度為2,000至5,000個細胞/微升之間。
4. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該醫藥組合物中至少50%之該等RPE細胞為斑萎蛋白+(bestrophin+)。
5. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該醫藥組合物中至少80%之該等RPE細胞為PAX6+及/或MITF+。
6. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該醫藥組合物中每百萬個細胞不多於約一個細胞對八聚體結合蛋白4(OCT-4)及鹼性磷酸酶(AP)兩者表現為陽性。
7. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該醫藥組合物中每九百萬個細胞不多於兩個細胞對OCT-4及AP兩者表現為陽性。
8. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該等RPE細胞為人類RPE細胞。
9. 如請求項1或2之醫藥組合物，其另外包含至少一種血管生成抑制劑或係與之併用，其中該至少一種血管生成抑制劑係在該醫藥組合物之前、同時及/或之後投與至有需要之個體。
10. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該等RPE細胞經遺傳工程化。
11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該遺傳工程化使該等RPE細胞製造一或多種抑制血管生成之因子。
12. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該等RPE細胞係自多能幹細胞製造。
13. 一種套組，其包含如請求項1至12中任一項之醫藥組合物及分開之容器，該分開之容器包含體積足以將該治療有效量之RPE細胞稀釋至所需目標濃度之醫藥學上可接受之稀釋劑。
14. 一種組合物，其包含：治療有效量之經極冷保藏之視網膜色素上皮(RPE)細胞，其具有低於5皮克(pg)/細胞之平均黑色素含量，且其冷凍時之平均成熟程度乃RPE細胞在極冷保藏前有活力，而解凍後回收的RPE細胞至少約85%在解凍後保持有活力。
15. 如請求項14之組合物，其中該等RPE細胞之平均黑色素含量在0.1皮克/細胞至5皮克/細胞之間。
16. 一種製造富含人類視網膜色素上皮(RPE)細胞群體之方法，該等細胞含有平均黑色素含量低於5皮克/細胞，該方法包含：(a)提供人類胚胎幹(hES)細胞之多層群體；(b)該hES細胞之多層群體在不維持未分化狀態之該等hES細胞之條件下培養足以允許推定人類RPE細胞出現之時間，其中該等推定人類RPE細胞包含褐色素分散於細胞質內；(c)自步驟(b)之培養物中選擇該等推定人類RPE細胞中之一或多者；(d)培養步驟(c)中獲得之該等人類RPE細胞，以形成含有斑萎蛋白+且展現特徵性鵝卵石、多角形、上皮樣外觀且包含褐色素分散於細胞質內之細胞的培養物；及(e)當該等培養之RPE細胞之平均黑色素含量低於5皮克/細胞時，收集該等培養之RPE細胞，藉此製造富含人類RPE細胞之群體，該人類RPE細胞之群體之平均黑色素含量低於5皮克/細胞。
17. 一種製造富含人類視網膜色素上皮(RPE)細胞群體之方法，該等細胞含有平均黑色素含量低於5皮克/細胞，該方法包含：(a)提供人類ES(hES)細胞之培養物；(b)培養該等hES細胞以製造一或多個胚樣體；(c)將該一或多個胚樣體培養足以在該一或多個胚樣體中之至少一者內出現推定人類RPE細胞之時間，其中該等推定人類RPE細胞包含褐色素分散於細胞質內，藉此形成含有推定人類RPE細胞之一或多個胚樣體；(d)自步驟(c)之培養物中選擇並解離含有推定人類RPE細胞之該等胚樣體中之一或多者以獲得人類RPE細胞；(e)培養步驟(d)中獲得之該等人類RPE細胞，以形成含有斑萎蛋白+且展現特徵性鵝卵石、多角形、上皮樣外觀且包含褐色素分散於細胞質內之細胞的培養物；及(f)當該等培養之RPE細胞之平均黑色素含量低於5皮克/細胞時，收集該等培養之RPE細胞，藉此製造富含人類RPE細胞之群體，該人類RPE細胞之群體之平均黑色素含量低於5皮克/細胞。
18. 如請求項16或17之方法，其中該等RPE細胞之平均黑色素含量在0.1皮克/細胞至5皮克/細胞之間。
19. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之適於治療視網膜退化之RPE細胞，其中該等RPE細胞(a)係自多能幹細胞分化，(b)含有低於5皮克/細胞之平均黑色素含量，且(c)其中該等RPE細胞具有以下性質中之至少一者：在移植之後附著於布魯赫膜，在移植之後吸收雜散光，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較大平均端粒長度，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比在培養中具有較長複製壽命，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較低N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)含量，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較低脂褐質含量，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比展現較少累積之紫外線損傷，或與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比含有較多數目之吞噬體。
20. 如請求項1、2及19中任一項之醫藥組合物，其用於治療視網膜變性，包括：黃斑變性、斯特格氏病(Stargardt's disease)、血管樣紋或近視性黃斑變性。
21. 如請求項20之醫藥組合物，其中該黃斑變性為年齡相關之黃斑變性。
22. 如請求項1、2及19中任一項之醫藥組合物，其中該組合物經調配用於與基質(matrix)、基底(substrate)、支架或移植物一起移植。
23. 如請求項1、2及19中任一項之醫藥組合物，其中該等RPE細胞展現以下特徵中之一或多者：複製壽命，大於自成人或胎兒眼睛獲得之RPE細胞之複製壽命；平均端粒長度，為人類胚胎幹細胞(hESC)及/或人類誘導型多能幹細胞(iPS細胞)之端粒長度的至少30%；平均末端限制性片斷長度(TRF)，長於4kb；平均脂褐質含量，低於自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞之平均脂褐質含量的50%；平均N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)含量，低於自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞之平均A2E含量的50%；平均N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)含量，低於每10⁵(100,000)個細胞50ng；感光器外段(POS)吞噬速率，比自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞的POS吞噬速率大至少50%；感光器外段(POS)吞噬速率，為24小時後POS總濃度之至少20%；與自成人宿主分離之RPE細胞相比，較低程度之累積氧化壓力及/或DNA損傷；平均蛋白酶體活性，比自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞之平均蛋白體活性大至少50%；平均泛素結合物積聚率，低於自成人眼睛分離之相等數目RPE細胞之平均泛素結合物積聚率的50%。
24. 如請求項1、2及19中任一項之醫藥組合物，其中該等RPE細胞之平均黑色素含量在0.1皮克/細胞至5皮克/細胞之間。
25. 一種醫藥製劑，其包含治療有效量之適於治療視網膜退化之RPE細胞，其中該等RPE細胞含有低於5皮克/細胞之平均黑色素含量，且其中該等RPE細胞具有以下性質中之至少一者：在移植之後維持其表型至少約一個月，在培養物中維持其表型至少約一個月，在移植之後整合至宿主中，在移植之後實質上不增殖，具吞噬性，傳遞、代謝或儲存維生素A，在移植之後在視網膜與脈絡膜之間輸送鐵，在移植之後附著於布魯赫膜(Bruch's membrane)，在移植之後吸收雜散光，具有較高之α整合素亞單元表現，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較大平均端粒(telomere)長度，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比在培養中具有較長複製壽命，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較多一或多種α整合素亞單元之表現，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較低A2E含量，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比具有較低脂褐質含量，與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比展現較少累積之紫外線損傷，或與獲自捐獻之人類組織之RPE細胞相比含有較多數目之吞噬體。
26. 一種如請求項1至12及19中任一項之醫藥組合物之用途，其用於製造供治療視網膜變性之藥物，該視網膜變性包含黃斑變性、斯特格氏病(Stargardt's disease)、血管樣紋或近視性黃斑變性。
27. 如請求項26之用途，其中該黃斑變性為年齡相關之黃斑變性。