KR20170095365A

KR20170095365A - 망막 변성의 치료를 위한 otx2를 과발현하는 형질전환 rpe 세포

Info

Publication number: KR20170095365A
Application number: KR1020177019783A
Authority: KR
Inventors: 띠에리 르베이야르; 크리스또 꼴르; 조제-알랭 사헬
Original assignee: 유니베르시테 피에르 에 마리에 쿠리에 (파리 6); 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔); 상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2017-08-22
Also published as: IL252789A0; CA2970748C; EP3233093A1; CA2970748A1; WO2016097183A1; JP6734853B2; EP3233093B1; US11865189B2; US20170348434A1; JP2018500906A; IL252789B

Abstract

본 발명은 망막 변성, 특히 망막 색소 내피 기능장애로 인한 망막 변성의 치료에 사용하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

망막 변성의 치료를 위한 OTX2를 과발현하는 형질전환 RPE 세포{TRANSGENIC RPE CELLS OVEREXPRESSING OTX2 FOR THE TREATMENT OF RETINAL DEGENERATION}

본 발명은 의약 분야, 특히 망막 변성의 치료에 관한 것이다.

색소성 망막염은 2개의 연속된 상에 의해 임상적으로 특성화되는 유전된 망막 변성이다. 첫번째 증상을 구성하는, 야맹증 또는 거의 맹인(nigh blindness)은 총체적인 맹인으로 흔히 유도하는 시야 감소의 제2의 상과 비교하여 환자에 대한 중간의 장애에 상응한다. 이들 2개 상은 저 휘도에서 시력에 관여하는 간상체, 및 낮 동안에 시력에 의지하는 추상체인, 광수용기의 2개의 파동(wave)으로부터 생성된다.

색소성 망막염은 유전된 망막 변성의 가장 흔한 형태이다. 이들 질환은 이들의 극도의 이질성에 의해 유전적으로 특성화된다. 열성의 유전된 망막 변성의 심각한 형태인, 레베르 선천성 흑암시(leber congenital amaurosis)는 당해 질환이 RPE65 유전자 내 돌연변이로부터 생성되는 경우 정확한 유전자 치료요법에 의해 성공적으로 치료될 수 있지만, 당해 질환에 있어서 전체적인 충격은 이들 환자에 한정된다(Bennett et al., 2012).

개별화된 치료요법의 비용은 원인 유전자에 의존한 치료(접근법)의 발달을 유도해왔다. rd1 마우스와 같은, 섬모 신경영양성 인자(CNTF)로서 영양성 인자(trophic factor)가 망막증의 수개의 모델에서 광수용체 변성을 예방하는데 성공적으로 사용되어 왔다(LaVail et al., 1998). 그럼에도 불구하고, 피포성 세포 안구내 이식(encapsulated cell intraocular implant)에 의해 전달된 CNTF를 사용한 임상 시험은 색소성 망막염 환자를 위한 시각적 이점을 입증하는데 실패하여 왔다(Birch et al., 2013).

이식(transplantation)에 의한 광수용체 손실의 대체가 고려되어 왔지만, 망막 내부에서 이식된 광수용체와 두극 세포의 재연결 문제가 이러한 전략의 임상적 발달에 대한 장벽으로 장기간 동안 남아있었다(Litchfield et al., 1997). 당해 문제는 rd1 마우스의 경우 rd1 마우스의 매우 특이한 분화 단계에 광수용체 전구체를 이식함으로써 해결되었다(MacLaren et al., 2006). 불행하게도, 사람에 있어서 광수용체 분화의 당해 기간은 임상으로의 이의 전달을 현저하게 제한한다(Leveillard et al., 2007).

한편, 시각을 위한 추상체의 필수적인 역활로 인하여, 색소성 망막염에서 제2의 추상체 손실을 예방하는데 있어서의 노력이 집중되어 왔다. 간상체-기원한 추상체 생존능 인자(rod-derived cone viability factor: RdCVF)의 확인은 이러한 신규한 영양 요소의 투여를 기반으로 한 치료학적 발달을 개시하여 색소성 망막염으로 고생하는 환자에서 추상체 변성 및 시각 손실을 예방한다(Leveillard et al. 2004, Byrne et al. 2015). 상기 전략은 간상체와 추상체 사이의 생리학적 상호작용에 의존한다. RdCVF를 암호화하는 유전자인, 뉴클레오레독신 유사(nucleoredoxin like) 1(NXNL1)은 간상체 의존적 방식으로 발현되며 질환의 제1 상 동안 간상체 손실을 수반하며 후속적으로 스위치 오프(switch off)된다(Reichman et al. 2010). 로돕신 유전자(rhodopsin gene) RHO와 같은, 색소성 망막염을 유발하는 유전자의 유의적인 비율이 추상체가 아닌, 간상체에 의해 특이적으로 발현되므로, RdCVF는 아마도 원인 유전자와는 거의 독립적으로 적용될 수 있는 치료가 된다(Byrne et al. 2015, Yang et al. 2009).

그러나, 오히려 RdCVF가 망막 색소 상피(RPE)에서 유전자 결함으로부터 생성되는 색소성 망막염을 치료하는데 효율적일 수 있는 가능성은 없다. 당해 구성에서 앞서 나타낸 바와 같이, 건강한 RPE 세포의 이식은 보다 우수한 전략이다(Gouras et al. 1989). 이러한 시도는, 비록 비례적이지만, 동물 모델에서 관찰된 광수용체 생존과 엄격하게 비교한 것으로서 시각 기능을 고려하여 지금까지 단지 제한된 성공만을 가져왔다(Da Cruz et al. 2007).

따라서, 망막 색소 상피의 변성 또는 기능장애로부터 생성되는 망막 질환을 치료하기 위한 개선된 전략에 대한 유의적인 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본원에서 본 발명자들은, RPE 세포에서 OTX2 단백질의 증가된 세포내 수준이 광수용체 생존에 있어서 이들 세포 이식의 이점을 개선시킴을 입증하였다.

따라서, 제1 국면에서, 본 발명은 망막 변성의 치료에 사용하기 위한 OTX2 단백질의 세포내 수준을 증가시키도록 조작된 망막 색소 상피(retinal pigment epithelial :RPE) 세포에 관한 것이다.

OTX2 단백질은 천연의 포유동물 OTX2 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편일 수 있다. 특히, 당해 단백질은 서열 번호: 15, 또는 서열 번호: 16에 설정된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편을 포함하거나, 이로서 이루어질 수 있다. 바람직하게는, OTX2 단백질은 서열 번호: 15, 또는 서열 번호: 16에 설정된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

변형될 RPE 세포는 줄기 세포의 분화, 바람직하게는 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포의 RPE 세포로의 분화로부터 수득될 수 있다.

바람직한 구현예에서, RPE 세포는 OTX2 단백질을 과-발현하도록 유전적으로 조작된다. 이들 세포는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 OTX2 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 도입함으로써 유전적으로 조작된다. 특히, 이들은 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 OTX2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 도입함으로써 유전적으로 조작될 수 있다.

바람직하게는, 조작된 RPE 세포내 OTX2 단백질의 수준은, 정상화 후 조작되지 않은 RPE 세포에서의 OTX2 단백질의 수준보다 적어도 1.5-배 더 높다.

바람직하게는, RPE 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 안구내(intraocular) 주사에 의해, 바람직하게는 눈의 망막하 공간내로의 주사에 의해 투여된다.

다른 국면에서, 본 발명은 또한 OTX2 단백질의 수준을 증가시키도록 조작된, 바람직하게는 OTX2 단백질을 과-발현하도록 조작된 RPE 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 안구내 주사용으로 제형화된다.

이들 국면에서, 망막 변성은 바람직하게는 RPE 기능장애와 관련되어 있다. 특히, 망막 변성은 색소성 망막염, 노화-관련 황반 변성, 망막 박리, 레베르 선천성 흑암시, 당뇨병성 망막증, 베스트병(Best's disease), 스타르가르트병(Stargardt's disease) 및 맥락막결여(choroideremia)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환에 기인할 수 있다. 바람직하게는, 망막 변성은 색소성 망막염에 기인한다.

도 1. 배양된 망막 색소 상피 세포는 상피-간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition)을 겪는다. (A) 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 배양된 RPE 세포에 의한 2개의 간엽 마커, 알파 평활근 액틴(ACTA2) 및 비멘틴(VIM)의 발현. (B) 배양된 RPE 세포와 천연의 RPE 세포 사이에서 37개의 선택된 유전자들 중 정량적 RT-PCR에 의해 측정된 차등적 발현. 데이타를 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) GAPDH 및 천연의 RPE 세포에서 이들 자체의 발현 수준에 대해 표준화한다. 평균 및 표준 편차(SD)(n=3, ANOVA 시험). (C) 천연의 및 배양된 RPE 세포에서 OTX2의 발현의 웨스턴 블롯팅 분석(Western blotting analysis). (D) 신장 박리(RD) 후 및 사후 분석 정상 표본(post-mortem normal specimen) 후 환자에서 OTX2, KCNJ13 및 VIM의 발현. 개개의 데이타 점을 평균의 표준 오차(SEM)를 지닌 평균, 분산 분석(n=19, t-시험, 웰치 수정(Welch correction))으로 처리하였다. (E) r=0.46, P=0.003를 갖는 피어슨 상관관계(Pearson correlation), 및 P<0.0001의 선형 회귀(linear regression). (F) RD 및 대조군 표본에 있어서 풍부한 다중-배열 평균(robust multi-array average: RMA)을 사용하여 표준화시킨 아피메트릭스 데이타(Affymetrix data)를 사용한 발현 역학. 조기 RD: 1주 미만. 중간 RD: 1주 내지 3개월. 말기 RD: 3개월 이상(던네트(Dunnett) ANOVA 시험).
도 2. 망막 색소 상피에서 신규한 OTX2 표적 유전자의 확인. (A) 나타낸 바와 같은 재조합 AAV 벡터로 감염된 RPE 세포내에서 정량적 RT-PCR에 의한 OTX2 유전자 발현 분석. (B) GFP 및 OTX2로 감염된 RPE 세포에서 VIM의 발현, n=4. (C) GFP 및 OTX2 형질도입된 배양된 RPE 세포(n=3)에서 VIM의 웨스턴 블롯 분석. (D) OTX2 및 OTX2L 형질도입된 RPE 세포에서 상대적인 정량적 RT-PCR. 데이타는 하우스키핑 유전자 GAPDH 및 천연의 RPE 세포에서 이들 자체의 발현 수준에 대해 정규화한다. 평균과 SD(n=3, ANOVA 시험). (E) 분석된 프로모터에서 예측된 OTX2 결합 성분의 위치. (F) 감염되지 않은 RPE 세포에서 크로마틴 면역침전. -IgG: 면역글로불린 없음(no immunoglobulins). +IgG: 비 면역성 면역글로불린(non immune immunoglobulin).
도 3a 및 도 3b. OTX2는 사람 RPE 세포에서 KCNJ13, RDH10 및 SLC16A8의 발현을 유도한다. (A) 나타낸 바와 같이 재조합 AAV 벡터로 감염된 iPS-RPE 세포에서 정량적 RT-PCR에 의한 OTX2의 발현. 데이타는 하우스키핑 유전자 GAPDH 및 천연의 RPE 세포에서 이들 자체의 발현 수준에 대해 정규화한다. 평균과 SD(n=3, ANOVA 시험). (B) 나타낸 바와 같이 재조합 AAV 벡터로 감염된 iPS-RPE 세포내에서 정량적 RT-PCR에 의한 후보물 유전자의 발현. 데이타는 하우스키핑 유전자 GAPDH 및 천연의 RPE 세포에서 이들 자체의 발현 수준에 대해 정규화한다. 평균과 SD(n=3, ANOVA 시험).
도 4. RCS 래트(rat)에서 OTX2를 과발현하는 유전적으로 변형된 RPE 세포의 이식은 광수용체 기능을 증진시킨다. (A) 치료되지 않은 눈과 RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식편으로 이식된 눈 사이의 망막 전위도(ERG) 비교. (B) RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식된 눈 사이에서 b-파동 반응에 대한 대기 시간의 비교. 개개의 점은 평균과 SEM(n=7, 본페로니(Bonferroni) ANOVA)으로 나타낸다. (C) 치료되지 않은(흰색 바아) 및 RPE-GFP(담회색) 및 RPE-OTX2(암회색) 이식된 눈에 대한 주간시 ERG. (D) 치료되지 않은(백색 bar) 및 RPE-GFP(담회색) 및 RPE-OTX2(암 회색) 이식된 눈에 대한 플리커(Flicker) ERG. 점은 SEM, 통계적 시험 이식되고-주사되지 않은 눈(n=7, 윌콕슨 매치된 쌍(Wilcoxon matched-pair)), RPE-GFP 및 RPE-OTX2(n=7, 쌍을 이루지 않은 콜모고로브-스미르노브 시험(unpaired Kolmogorov-Smirnov test))을 사용한 평균으로 나타낸다.
도 5. 이식 후 RCS 랫트의 시각적 거동에 있어서의 개선. (A) 시선운동성 체임버(Optokinetic chamber). (B)Optomotory^TM 설정. CW(시계방향 회전: 좌측 눈은 반응을 구동한다), CCW(역시계방향 회전: 우측 눈은 반응을 구동한다). (C) 시력. (D) 대비 민감도. 점은 SEM(n=7, 윌콕슨 매치된 쌍을 이룬 t-시험)을 사용한 평균으로 나타낸다.
도 6. 광 간섭성 단층촬영술(OCT)을 사용한 이영양증 랫트의 RPE-OTX2 치료된 눈에서 외부 핵층 구조(rescue). (A) 야생형(rdy +/+), 이영양증의 치료되지 않은, RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식된 눈에서 OCT 단면. (B) 이영양증의 주사되지 않은, RPE-GFP 및 RPE-OTX23D 이식된 눈에서 평균 외부 핵 층(ONL) 두께의 3D 표시. (C) 주사되지 않은, RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식된 눈 사이에서 ONL 두께 비교, 최소 및 최대를 사용한 평균(만 휘트니 시험((Mann Whitney test)). (D) 주사되지 않은, RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식된 눈에서 ONL 두께 빈도 분포. (E) 눈의 중간 단면에서 비례적인 ONL 두께(야생형에 대한 %) 측두골 및 후면-배면(dorsal-ventral) ONL 두께의 비교. 측정은 SEM을 사용하여 눈의 각각의 그룹의 평균으로 나타내었다. (윌콕슨 매치된-쌍 t-시험). T: 일시적, N: 비강, D: 후면, V: 배면
도 7. 헤마톡실린 및 에오신 단면은 RPE-OTX2으로 이식된 눈에서 ONL 두께에 있어서의 개선이 더 높음을 나타낸다.
도 8. RPE-GFP 및 RPE-OTX2 세포의 생존 활성. (A) GFP 및 OTX2 형질도입된 돼지 원시 RPE 세포로부터의 상층액의 생존 활성. 대조군은 조건화된 비-세포 항온처리된 배지를 나타낸다. 결과는 4개의 독립된 실험의 합을 나타낸다. #: 대조군에 대해서만 유의적임. 점은 SEM을 사용한 평균으로 나타낸다(n=6, 홀름-시닥 다중 비교(Holm-Sidac multiple comparison ANOVA)). (B) 나타낸 바와 같은 재조합 AAV 벡터로 감염된 RPE 세포에서 CNTF 및 BDNF의 발현. GAPDH는 하우스키핑 유전자로서 사용되었다. 데이타는 대조군 AAV-GFP 형질도입된 세포에서 발현의 수준으로 정규화한다. 평균과 SD; (n=3, ANOVA 시험).
도 9. 분화되지 않은 iPS, 차등화된 사람 iPs-기원한 RPE 세포 및 사람 성체 RPE 세포에서 RPE 특이적인 유전자 마커의 상대적인 발현. 데이타는 평균 및 SD로 나타낸다.
도 10. 주사되지 않은 및 이식된 rdy -/- 랫트에서 ERG 진폭 비교. (A) 야생형(rdy+/+) RCS 랫트의 특성인 ERG 트레이스(trace). (B) 주사되지 않은 이영양증 랫트, RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식된 동물에서 주사 후 42일째에 기록한 특성인 ERG 진폭. (C) 야생형, 이영양증의 주사되지 않은, RPE-GFP 및 RPE-OTX2 이식된 동물 사이에서 ERG 기록 비교.
도 11. 외과 수술(Surgical procedure).
도 12. 배양된 RPE 세포 대 천연의 RPE 세포에서 상대적인 발현. 배양된 RPE 세포에서 상대적인 발현(2 ^-△△Ct )은 천연의 RPE 세포에서의 발현으로 정규화하였다. GAPDH를 하우스키핑 유전자로 사용하였다. 통계적 분석(그래프패드 프리즘(GraphPad Prism), 다중 t-시험, 홀름-시닥법(Holm-Sidak method), 알파=1.000% 사용, n=3 생물학적 3견본(triplicate)).
도 13. AAV-Otx2, Otx2L로 형질도입된 RPE 세포 대 대조군 형질도입된 RPE 세포에서 상대적인 발현. AAV-Otx2 및 AAV-Otx2L로 형질도입된 배양된 RPE 세포에서 유전자의 상대적인 발현(2^-△△Ct)을 대조군 세포(AAV-GFP 형질도입된 RPE)에서 발현으로 정규화하였다. GAPDH를 하우스키핑 유전자로 사용하였다. 통계적 분석(그래프패드 프리즘, 이원 변량 분석(Two-way ANOVA), 던넷 시험(Dunnett test), 알파=1.000% 사용, n=3 생물학적 3견본).

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 본원에서 RPE 세포에 의한 OTX2의 과발현이, 광수용체 생존에 있어서의 이들 세포의 이식의 이점을 개선시킴을 입증하였다. 실제로 본 발명자들은, 색소성 망막염의 시험관내(in vivo) 모델을 사용하여, OTX2를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터로 감염된 RPE 세포의 이식이 과발현되지 않은 OTX2 RPE 세포의 이식과의 비교에 의해, 당해 모델에서 외부 핵 층(ONL)의 두께 및 개선된 광수용체 반응 및 생존을 현저히 증가시켰음을 입증하였다. 이들 결과를 기준으로, OXT2를 과발현하는 RPE 세포의 이식은 망막 변성 질환, 특히 예를 들면, 노화-관련 황반 변성, 레베르 선천성 흑암시 또는 색소성 망막염과 같은 RPE 층 기능장애에 의해 필수적으로 유발된 질환에 대해 효과적인 치료요법일 수 있는 것으로 여겨진다.

따라서, 제1 국면에서, 본 발명은 망막 변성의 치료시 사용하기 위한 OTX2 단백질의 세포내 수준을 증가시키기 위해 조작된(engineered) 망막 색소 내피(RPE) 세포에 관한 것이다.

오르토덴티클 호메오박스(orthodenticle homeobox) 2 단백질 또는 호메오박스(homeobox) 단백질 OTX2로도 공지된, OTX2 단백질은, 전사 인자(transcription factor)이다. 당해 단백질은 뇌, 두개안면, 및 감각 기관 발달에 중요한 역할을 한다. 망막 발달 동안에, OTX2는 RPE 세분화, 및 광수용체 및 이극성 세포 분화 및 성숙을 조절한다. OTX2 발현은 생애 전체에서 이들 3개의 세포유형 내에서 유지된다(Fossat et al., 2007).

사람, 돼지, 침팬지, 개, 소, 마우스, 토끼 또는 랫트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 포유동물 OTX2 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있으며 서열 데이타베이스에서 용이하게 발견할 수 있다.

본원에서, 용어 "펩타이드", "올리고펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며 상기 쇄를 형성하는 아미노산의 수와 상관없이, 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산의 쇄를 말한다.

본 발명에 따른 RPE 세포에서 세포내 수준이 증가된 OTX2 단백질은 천연의 포유동물 OTX2 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능적 단편일 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "천연의 포유동물 OTX2 단백질"은 포유동물 OTX2 단백질, 특히 사람, 돼지, 침팬지, 개, 고양이, 소, 마우스, 토끼 또는 랫트 OTX2 단백질의 어떠한 천연적으로 존재하는 대체 스플라이스 동형 또는 어떠한 천연적으로 존재하는 대립형질 형태를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "OTX2 단백질 변이체"는 천연의 OTX2 단백질로부터 기원한 폴리펩타이드 서열을 말하며 하나 이상(예를 들면, 수개의) 위치에서 변형, 즉, 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하나 OTX2 활성을 보유한다. 상기 변이체는 당해 분야에 잘 공지된 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다. 특히, 천연의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 변형시키기 위한 기술의 예는 부위-지시된 돌연변이유발, 무작위적 돌연변이유발 및 합성 올리고뉴클레오타이드 작제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "변이체"는 천연 서열에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 서열 동질성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "서열 동질성" 또는 "동질성"은 2개의 폴리펩타이드 서열의 정렬로부터의 위치들에서 매치(match)(동일한 아미노산 잔기)의 수(%)를 말한다. 서열 동질성은 서열 갭(gap)을 유지하면서 오버랩(overlap) 및 동질성을 극대화하기 위해 정렬된 경우 서열을 비교함으로써 측정된다. 특히, 서열 동질성은 2개의 서열의 길이에 따라서 다수의 수학적인 전반적 또는 국소 정렬 알고리즘 중 어느 것을 사용하여서도 측정할 수 있다. 유사한 길이의 서열을 바람직하게는 전반적인 정렬 알고리즘(예를 들면, Needleman and Wunsch algorithm; Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 정렬하며, 이는 서열을 전체 길이에 걸쳐 최적으로 정렬하지만, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예를 들면, 스미쓰 앤드 워터맨 알고리즘(Smith and Waterman algorithm)(Smith and Waterman, 1981) 또는 알트첼 알고리즘(Altschul algorithm)(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)을 사용하여 정렬한다. 아미노산 서열 동질성 퍼센트를 측정할 목적을 위한 정렬은 예를 들면, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/와 같은 인터넷 웹 사이트 상에서 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 비교되는 서열 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 어떠한 알고리즘도 포함하는, 정렬을 측정하기에 적절한 매개변수를 측정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동질성 값 %는 니들만-운슈 알고리즘(Needleman-Wunsch algorithm)을 사용하여 2개의 서열의 최적의 전반적인 정렬을 생성하는 쌍식 서열 정렬 프로그램 EMBOSS 니들(pair wise sequence alignment program EMBOSS Needle)을 사용하여 생성한 값을 말하며, 여기서 모든 조사 매개변수는 디폴트 값(default value), 즉, 점수매김 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 오픈 = 10, 갭 연장 = 0.5, 말기 갭 패널티(End gap penalty) = 거짓(false), 말기 갭 오픈 = 10 및 말기 갭 연장 = 0.5으로 설정된다.

보다 바람직하게는, 용어 "변이체"는 30, 25, 20, 15, 10 또는 5개 미만까지의 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해 천연 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 하나 이상의 보존적 치환, 바람직하게는 15, 10 또는 5개 미만의 보존적 치환에 의해 천연 서열과는 상이하다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(메티오닌, 루이신, 이소루이신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 그룹 내에 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "기능적 단편"은 상기 단백질 또는 변이체의 적어도 100, 150, 200 또는 250개의 연속된 아미노산을 포함하고, OTX2 활성을 나타내는, 위에서 정의한 바와 같은 천연의 OTX2 단백질 또는 변이체의 단편을 말한다. 바람직하게는, OTX2 단백질의 N-말단의 적어도 100개의 연속된 아미노산을 포함하는 단편, 즉, 전사 조절 활성에 포함된 DNA 결합 도메인을 포함한다.

변이체 또는 단편의 OTX2 활성은 숙련가에게 공지된 어떠한 방법으로도 평가할 수 있다. 예를 들면, OTX2 활성은 하기 실험 단락 및 Reichman et al., 2010, Dorval et al., 2006, and Pattenden et al., 2002에서 앞서 기술된 바와 같이 크로마틴 면역침전(ChIP)을 사용하여 평가할 수 있다. TYRP1 프로모터는 OTX2 단백질에 결합하여 이의 전사 인자 활성을 촉진하는 OTX2 조절 성분을 포함하는 것으로 보고되어 있다(Martinez-Morales et al., 2003). 따라서, TYRP1 프로모터 DNA 및 변이체 또는 단편의 동시-면역침전은, 이러한 변이체 또는 단편이 OTX2 조절 성분에 결합하여 전사를 촉진시키는 이의 능력을 보유함을 나타낸다. OTX2 활성은 Martinez-Morales et al., 2003의 논문에 기술된 바와 같이 유전자 리포터 검정을 사용하여 평가할 수 있다.

특수한 구현예에서, 본 발명에 따라 RPE 세포내에서 증가된 세포내 수준을 갖는 OTX2 단백질은 사람 OTX2 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편이다.

사람 OTX2 단백질은 또한 CPHD6 또는 MCOPS5로 공지된 유전자 OTX2(유전자 확인번호: 5015)에 의해 암호화된다. 대안적인 스플라이싱은 진뱅크 수탁번호NP_001257452.1(동형 b, 289개 아미노산 길이, 서열 번호: 15) 및 NP_001257454.1(동형 a, 297개 아미노산 길이, 서열 번호: 16)에 의해 확인된 OTX2 단백질의 2개의 명확한 동형을 암호화하는 다중 전사 변이체를 생성한다.

OTX2 단백질은 서열 번호: 15, 또는 서열 번호: 16에 설정된 아미노산 서열, 또는 이의 어떠한 변이체 또는 단편을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, OTX2 단백질은 서열 번호: 15, 또는 서열 번호: 16에 설정된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

색소성 망막 상피(RPE)는 안쪽 맥락막(즉, 망막 뒤쪽의 혈관의 층)과 바깥쪽 망막 시세포(즉, 광수용체) 사이의 신경감각성 망막 외부의 색소를 띈 세포층이다.

RPE 세포는 흑색 색소의 세포의 옥석 세포 형태학에 의해 특성화된다. 이들은 RPE65를 포함하는 수개의 RPE 마커, 전사 인자 MITF, 강력한 연결 단백질(tight junction protein) ZO-1 (TJP1), 베스트로핀(BEST1), MERTK, RDH10 및 색소 니피 기원 인자(PEDF)를 포함하는 수개의 RPE 마커를 발현한다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용된 RPE 세포는 포유동물 RPE 세포, 보다 바람직하게는 사람 RPE 세포이다.

일 구현예에서, RPE 세포는 공여체(예를 들면, 사체 눈 공여체) 또는 치료될 대상체로부터 수득된다. 바람직하게는, RPE 세포는 치료될 대상체로부터 수득된다. 이 경우, RPE 세포는 OTX2 단백질의 세포내 수준을 증가시키고 동일한 대상체로 재-주사(자가 이식)되도록 조작되기 전에 대상체로부터 수집된다.

다른 구현예에서, RPE 세포는 줄기 세포, 바람직하게는 사람 줄기 세포의 RPE 세포로의 분화로부터 수득된다. RPE 세포로 분화되기에 적합한 줄기 세포의 예는 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포, 성체 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 간엽성 줄기 세포, 산후 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 줄기 세포는 다능성 줄기 세포, 즉, 배아외 조직을 포함하지 않는, 사람 또는 동물체의 모든 세포형으로 분화될 가능성을 가진 줄기 세포이다. 이들 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도된 다능성 줄기(iPS)세포 둘 다를 포함한다.

사람 배아 줄기 세포로부터 RPE 세포를 생산하는 것은 윤리적 과제를 충족할 수 있다. 일 구현예에 따라서, 배아 줄기 세포는 비-사람 배아 줄기 세포이다. 다른 구현예에 따라서, 사람 배아 줄기 세포는 방법 자체 또는 어떠한 관련된 작용이 사람 배아의 파괴를 포함하지 않는 한 사용될 수 있다.

유도된 다능성 줄기 세포는 비 다능성 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 특정 유전자(예를 들면, 사람 세포내에서 OCT4 , SOX2 , NANOG 및 LIN28)의 강요된 발현을 유도함으로써 인공적으로 유도된 줄기 세포이다. iPS 세포를 사용하는 한가지 이점은 배아 세포를 함께 포함하는 것을 피함으로써 이의 어떠한 윤리적 문제도 피하는 것이다.

따라서, 바람직한 구현예에 따라서, RPE 세포는 iPS 세포 기원한 RPE 세포이다. iPS 세포는 치료될 대상체 또는 다른 대상체로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, iPS 세포는 치료될 대상체, 특히 당해 대상체의 섬유아세포로부터 기원한다.

RPE 세포는 숙련가에게 공지된 어떠한 분화 방법을 사용하여 iPS로부터 수득할 수 있다. 특히, 이러한 RPE 세포는 Reichman et al., 2014에 기술된 프로토콜을 사용하여 사람 iPS 세포로부터 수득할 수 있다. 요약하면, 섬유아세포는 OCT4, SOX2, NANOG , LIN28 , c- MYC 및 KLF4 유전자를 발현하는 에피좀 벡터(episomal vector)로 형질감염되며 RPE 세포는 합치성 iPS 세포의 분화에 의해 수득된다.

RPE 세포는 사용된 줄기 세포의 유형에 따라서, 예를 들면, Reichman et al., 2014 또는 WO 2011/063005에 기술된 방법과 같은, 숙련가게에 공지된 어떠한 방법을 사용하여 줄기 세포로부터 생산할 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 RPE 세포는 OTX2 단백질의 세포내 수준을 증가시키도록 조작된다. OTX2 단백질의 세포내 수준은 조작되지 않은 RPE 세포내에서의 수준과 비교함으로써 증가된다. 이들 RPE 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 조작된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "조작된 RPE 세포"는 OTX2 단백질의 세포내 수준을 증가시키도록 유전적으로 또는 화학적으로 변형된 RPE 세포를 말한다.

일 구현예에서, OTX2 단백질의 세포내 수준은 당해 단백질의 세포내로의 직접적인 도입에 의해 증가된다. 세포내로 도입된 단백질은 위에서 기술된 바와 같은 어떠한 OTX2 단백질, 바람직하게는 사람, OTX2 단백질, 또는 이의 변이체, 또는 기능성 단편일 수 있다.

바람직하게는, 조작된 RPE 세포내에서 OTX2 단백질의 세포내 수준은 조작되지 않은 RPE 세포내 수준보다 적어도 1.5-배 더 높거나, 2, 3, 4, 5-배 더 높다.

많은 동종 단백질과 같이, OTX2는 세포를 천연적으로 형질도입할 수 있다. 그러나, 임의로, 세포막을 통해서 및 세포내로 OTX2 단백질의 도입을 촉진시키기 위해, 위에서 정의한 바와 같은 단백질을 세포-침투 펩타이드에 융합시킬 수 있다. 다수의 세포-침투 펩타이드가 당해 분야에 공지되어 있으며(참고: 예를 들면, Deshayes et al., Cell. Mol. Life Set, 2005, 62: 1839-1849; El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Design, 2005, 11: 3597-3611; Mae and Langel, Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6: 509-514) 본 발명에서 사용될 수 있다.

또한, OTX2 단백질을 또한 천연적으로 도입하는 단백질(예를 들면, 프로타민, 히스톤, 항체), 바이러스 성분(예를 들면, 헤르페스 VP22), 단백질 형질감염 시약(예를 들면, Chariot™, Pro-Ject™, TransPass™ P, ProteoJuice™, PULSin™), 양이온성 지질, 리포좀, 나노입자(예를 들면, 폴리(락틱-코-글리콜산), 덴트리머, 다가양이온 또는 소-분자 담체와 같은 내재화 담체와 함께 RPE 세포내로 도입할 수 있다(예를 들면, Okuyama et al. Nat Methods. 2007 Feb;4(2): 153-9). OTX2 단백질은 또한 세포내로 향하여 주입될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 RPE 세포는 유전적으로 조작되어 OTX2 단백질을 과발현시킨다.

위에서 정의한 바와 같은 OTX2 단백질의 발현 수준은 숙련가에게 공지된 어떠한 방법도 사용하여, RPE 세포내에서 생상된 OTX2 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 세포 샘플, 바람직하게는 세포 분해물을 샘플 속에 존재하는 OTX2 단백질과 선택적으로 상호작용시킬 수 있는 결합 파트너와 접촉시킴을 포함한다. 결합 파트너는 일반적으로 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 바람직하게는 모노클로날이다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체 항-OTX2는 시판된다(예를 들면, 항-OTX2 항체 ab9566, Millipore). 단백질의 양은 예를 들면, 반-정량적 웨스턴 블롯, 효소-표지된 및 매개된 면역검정, 예를 들면, ELISA, 바이오틴/아비딘 유형 검정, 방사면역검정, 면역전기영동 또는 면역침전에 의해, 또는단백질 또는 항체 배열에 의해 측정할 수 있다. 반응은 일반적으로 형광성, 화학발광성, 방사활성, 효소적 표지 또는 염료 분자와 같은 노출형 표지(revealing label), 또는 항원과 이와 반응한 항체 또는 항체들 사이에 복합체의 형성을 검출하기 위한 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.

OTX2의 발현 수준은 또한 OTX2 mRNA의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. mRNA의 양을 측정하기 위한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 샘플 속에 함유된 핵산은 표준 방법에 따라, 예를 들면, 분해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 우선 추출되거나 제조업자의 지시에 따라 핵산-결합 수지에 의해 추출된다. 추출된 mRNA는 이후에 하이브리드화(예를 들면, 노던 블롯 분석) 및/또는 증폭(예를 들면, RT-PCR)에 의해 검출된다. 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR이 바람직하다. 사람 OTX2 mRNA를 정량화하는데 사용될 수 있는 프라이머 쌍의 예는 다음의 프라이머에 의해 구성된다: 전방 프라이머 5'-CTTCCTACTTTGGGGGCATGGACTGTG-3'(서열 번호: 17) 및 역 프라이머 5'-GCATTGGTACCCATGGGACTGAGTGTG-3'(서열 번호: 18). 다른 적합한 프라이머는 숙련가에 의해 용이하게 설계될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "과발현하다" 또는 "과발현"은 정규화 후에, 비유전적으로 변형된 RPE 세포에서의 발현 수준 보다 적어도 1.5-배 더 높거나, 2, 3, 4, 5-배 더 높은 발현 수준을 말한다. 발현 수준은 RPLPO(산성 리보소옴 인단백질 PO), TBP(TATA 박스 결합 단백질), GAPDH(글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제) 또는 b-액틴과 같은 안정한 발현을 갖는 것으로 알려져 있는 발현 수준의 단백질을 사용하여 표준화시킬 수 있다.

RPE 세포내에서 OTX2 단백질의 과발현은 OTX2를 암호화하는 내인성 유전자의 전사를 증가시키고, OTX2 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 도입하고, OTX2를 암호화하는 mRNA의 해독을 증가시키고/시키거나 OTX2를 암호화하는 mRNA의 분해를 감소시키는 것과 같은 숙련가에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 수득될 수 있다.

일 구현예에서, RPE 세포는 유전적으로 조작되어 OTX2를 암호화하는 내인성 유전자의 전사를 증가시킨다. 특히, OTX2를 암호화하는 내인성 유전자의 전사는 이의 프로모터를 변형시키거나 대체함으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 유전자의 프로모터를 SV40 프로모터, CMV 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터 또는 포스포글리세롤 키나제 프로모터와 같은 강력한 구성적 프로모터로 대체시킬 수 있다.

다른 구현예에서, RPE 세포는 OTX2를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 발현 벡터를 상기 세포내로 도입함으로써 유전적으로 조작된다.

핵산 서열은 위에서 기술한 바와 같은 OTX2 단백질, 특히 천연의 포유동물, 바람직하게는 사람, OTX2 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편을 암호화하는 어떠한 핵산 서열일 수 있다.

사람, 돼지, 침팬지, 개, 소, 마우스, 토끼 또는 랫트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 포유동물 OTX2 단백질의 암호화 서열이 공지되어 있으며, 서열 데이타베이스에서 용이하게 찾을 수 있다. 또한, 암호화 서열은 폴리펩타이드 서열을 기준으로 숙련가에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

바람직하게는, 핵산 서열은 RPE 세포내에서 상기 핵산의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된다.

조절 서열은 RPE 세포에 의해 인식되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 OTX2 단백질의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 트렁케이트된(truncated), 및 하이브리드 프로모터를 포함하여, RPE 세포내에서 전사 활성을 나타내는 어떠한 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 구성적 프로모터, 및 보다 바람직하게는 강력한 구성적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직-특이적, 특히 RPE 세포에 대해 특이적일 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, RPE65 프로모터, 메탈로프로테이나제 3의 조직 억제제(Timp3) 프로모터 및 타이로시나제 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 프로모터는 CMV 프로모터이다.

조절 서열은 또한 적절한 전사 개시, 종결, 및 인핸서 서열(enhancer sequence); 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 시그날과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 시그날; 세포질성 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효능을 향상시키는 서열(즉, 코작 콘센수스 서열(Kozak consensus sequence)); 및/또는 단백질 안정성을 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 다수의 발현 조절 서열, 예를 들면, 천연의, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 서열이 당해 분야에 공지되어 있고 OTX2를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 구동시키는데 이용될 수 있다.

전형적으로, 발현 카세트는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동적으로 연결된 OTX2를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

핵산 서열 또는 발현 카세트는 발현 벡터 속에 함유될 수 있다. 벡터는 자가 복제하는 벡터, 즉, 염색체외적 실체로서 존재하고, 이의 복제가 염색체 복제와는 독립적인 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 염색체외 성분, 미니-염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보증하는 어떠한 수단도 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 숙주 세포내로 도입되는 경우, 게놈내로 통합되어 이것이 통합되는 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다.

적절한 벡터의 예는 재조합 통합 또는 비-통합 바이러스 벡터 및 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로부터 기원한 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 벡터는 재조합 통합 또는 비-통합 바이러스 벡터이다. 재조합 바이러스 벡터의 예는 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 박시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 소 파필로마 바이러스로부터 기원한 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, RPE 세포는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 즉, 상기 세포내로 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 OTX2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터내로 도입함으로써 유전적으로 조작된다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 아데노-관련 바이러스 2로부터 기원한 벡터이다. 비-천연 조작된 변이체 및 키메라 AAV가 사용될 수 있다. 특히, 캡시드 단백질은 형질도입 효능을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체일 수 있다. AAV 입자는 동일한 혈청형 또는 혼합된 혈청형(즉, 슈도타입(pseudotyped) AAV)의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 AAV 벡터는 AAV2 게놈 및 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 혈청형 2/1 하이브리드 재조합 유전자 전달 시스템일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 벡터 및 이들의 작제 및 사용 방법에 친숙하다(예를 들면, WO 01/83692).

핵산 작제물, 발현 카세트 또는 벡터는 인산칼슘-DNA 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 전기천공(electroporation), 미세주사, 바이오리스틱(biolistic), 지질감염, 또는 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 공지된 기술을 사용하여서도 RPE 세포내로 형질감염시킬 수 있다.

위에서 기술된 핵산 작제물, 발현 카세트 또는 벡터는 이소성 형태(ectopic form)로 변형된 RPE 세포내에서 유지되거나 게놈내로 통합될 수 있다.

위에서 기술한 바와 같은 조작된 RPE 세포는 망막 변성의 치료에 사용된다.

바람직한 구현예에서, 망막 변성은 RPE 기능장애와 관련된다.

RPE 세포는 혈액-망막 장벽의 주요 성분이며 RPE에서 강력한 연결부 및 부착 연결부의 통합성의 손실은 광수용체 항상성을 파괴할 수 있다. RPE 세포는 광수용체에 의해 일반적으로 차폐된 외부 분절의 끝을 식세포작용하여 광 및 열 싱크(heat sink)로서 작용하는 멜라닌소체를 생성하며, 영양 인자를 제공하고, 시각 색소를 재순환시킨다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "RPE 기능장애"는 이들 기능들 중 어느 것의 파괴를 말하므로 멜라닌소체의 광퇴색, 리포푸신 과립의 축적, 외부 분절 식세포작용의 손상, 드루젠(drusen)의 형성, 및/또는 혈액-망막 장벽의 파괴를 유도할 수 있다. RPE 기능장애는 색소성 망막염, 노화-관련 황반 변성, 망막 박리, 레베르 선천성 흑암시, 당뇨병성 망막증, 베스트병, 스타르가르트병 또는 맥락막결여와 같은 다양한 변성 망막 질환의 당면한 원인인 것으로 알려져 있다. RPE 기능장애는 RPE65, MERKT,BEST1, CRB1, KCNJ13, LRAT, MAK, RP1L1, RGR, RDH12 또는 OTX2와 같은 RPE 세포 특이적인 유전자내 돌연변이, 또는 RPE 세포 세포자멸사의 증가에 기인할 수 있다. 이들 돌연변이 또는 세포자멸사의 정도는 숙련가에게 잘 공지된 어떠한 방법으로도 평가할 수 있다.

일 구현예에서, 망막 변성은 색소성 망막염, 노화-관련 황반 변성, 망막 박리, 레베르 선천성 흑암시, 당뇨병성 망막증, 베스트병, 스타르가르트병 및 맥락막결여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환에 기인한다. 바람직하게는, 망막 변성은 색소성 망막염에 기인한다.

추가의 국면에서, 본 발명은 또한 위에서 기술한 바와 같은 조작된 RPE 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

약제학적 조성물은 투여 경로에 따른 약제학적으로 허용되는 담체 속에 제형화된다.

바람직하게는, 조성물은 안내 주사, 특히 눈의 망막하 공간으로 투여되도록 제형화된다. 이러한 투여에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균의 등장성 수성 또는 비수성 용액(예를 들면, 균형된 염 용액(BSS)), 분산액, 현탁액 또는 유액, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 RPE 세포를 포함할 수 있으며, 이는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제, 용질 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다.

임의로, 조작된 RPE 세포를 포함하는 조성물은 세포의 저장에 적절한 어떠한 온도에서도 저장을 위해 동결시킬 수 있다. 예를 들면, 세포는 약 -20℃ 내지 -80℃ 또는 어떠한 다른 적절한 온도에서 동결시킬 수 있다. 극저온적으로 동결된 세포는 적절한 용기 속에 저장하여 세포 손상 위험을 감소시키고 세포가 해동에 견디는 경향성을 극대화하기 위한 저장을 위해 제조할 수 있다. 또한, 세포는 또한 냉장된 실온, 예를 들면, 약 4℃에서 유지될 수 있다.

투여될 조작된 RPE 세포의 양은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된 표준 과정으로 측정할 수 있다. 환자의 생리학적 데이타(예를 들면, 연령, 체격, 및 체중) 및 치료되는 질환의 유형 및 중증도는 적절한 용량을 측정하기 위해 고려되어야만 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 각각의 단위 용량은 예를 들면, μl당 10,000 내지 50,000개의 조작된 RPE 세포를 함유할 수 있다.

약제학적 조성물은 코르티코스테로이드, 항생제, 진통제, 면역억제제, 영양 인자, 또는 이의 어떠한 조합과 같은 1개 또는 수개의 추가의 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 RPE 세포의 모든 구현예는 또한 본 국면에서 고려된다.

다른 국면에서, 본 발명은 또한 OTX2의 세포내 수준을 증가시키도록 조작된, 바람직하게는 OTX2를 과발현하도록 유전적으로 조작된 RPE 세포, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 망막 변성을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는, 사람, 돼지, 침팬지, 개, 고양이, 소, 마우스, 토끼 또는 랫트를 포함하는 포유동물을 말한다. 보다 바람직하게는, 대상체는 성인, 어린이 및 임신 상태의 사람을 포함하는 사람이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 치료요법, 질환의 방지, 예방 및 지연과 같이 환자의 건강 상태를 완화시키도록 의도된 어떠한 작용을 말한다. 특정의 구현예에서, 이러한 용어는 질환 또는 질환과 관련된 증상의 완화 또는 근절을 말한다. 다른 구현예에서, 당해 용어는 하나 이상의 치료제의 이러한 질환을 가진 대상체로의 투여로부터 생성되는 질환의 확산 또는 악화를 최소화시키는 것을 말한다.

특히, 용어 "망막 변성의 치료"는 특히 망막전도 기록시 증가된 간상체 반응(rod response)과 함께 광수용체의 광-검출능의 보존 또는 개선을 말할 수 있다. 당해 용어는 또한 외부 핵 층의 두께의 증가를 말할 수 있다.

"치료학적 유효량"은 망막 변성의 상기 정의한 치료를 구성하는데 충분한 대상체에게 투여된 조작된 RPE 세포의 양을 의미한다.

본 발명의 망막 변성을 치료하는 방법에서, 약제학적 조성물 또는 RPE 세포는 바람직하게는 안내, 보다 바람직하게는 눈의 망막하 공간내에 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 방법은 또한 적어도 하나의 추가의 치료제를 대상체에게 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 치료제는 코르티코스테로이드, 항생제, 진통제, 면역억제제, 또는 영양 인자, 또는 이의 어떠한 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 RPE 세포 및 약제학적 조성물의 모든 구현예가 또한 본 국면에서 고려된다.

다른 국면에서, 본 발명은 또한 RPE 세포를 제공하고 상기 세포를 변형시켜 OTX2 단백질의 수준을 증가시킴을 포함하여, 이를 필요로 하는 환자에게 이식시 사용하기 위한 위에서 기술된 바와 같은 조작된 RPE 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, RPE 세포는 치료될 대상체의 줄기 세포의 분화, 보다 바람직하게는 체세포, 예를 들면, 섬유아세포로부터 수득한 유도된 다능성 줄기 세포의 분화로부터 수득된다.

바람직하게는, RPE 세포는 OTX2 단백질를 과발현하도록 유전적으로 조작된다.

본 발명의 망막 변성을 치료하기 위한 RPE 세포, 약제학적 조성물 및 방법의 모든 구현예가 또한 본 방법에서 고려된다.

본 발명자는, 본 발명의 RPE 세포가 광수용체 생존을 개선시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 추가의 국면에서, 본 발명은 또한 시험관내 또는 생체내 망막 세포 생존을 개선시키기 위한 위에서 기술한 바와 같은 조작된 RPE 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 망막 세포를 위에서 기술한 바와 같은 조작된 RPE 세포의 존재하에서 배양함을 포함하여, 망막 세포를 시험관내 또는 생체외 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 위에서 기술한 바와 같은 망막 세포 및 조작된 RPE 세포를 포함하는 동시-배양물에 관한 것이다.

조작된 RPE 세포에 대해 개시된 모든 구현예가 또한 본 국면에서 고려된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "망막 세포"는 광수용체, 아마크린 세포, 쌍극 세포, 수평 세포 및 신경절 세포(ganglion cell)를 말한다. 바람직한 구현예에서, 당해 용어는 광수용체 세포를 말한다.

망막 세포의 시험관내 또는 생체외 배양은 예를 들면, Leveillard et al., 2004에 기술된 바와 같이, 기술자에 의해 잘 공지된 어떠한 방법을 사용하여서도 수행될 수 있다.

본 발명의 동시-배양물은 어떠한 응용을 위해서도 사용될 수 있다. 이러한 응용의 예는 약물 스크리닝, 독성 검정, 또는 세포 치료요법을 위한 세포의 생산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허원, 개개 출원, 및 공보는, 이들이 본 명세서의 분명한 교시내용과 불일치하지 않는 정도로, 모든 도면 및 표들을 포함하는, 이들의 전문이 참고로 포함된다.

다음의 실시예는 예증의 목적으로 제공되며 제한하지 않는다.

실시예

물질 및 방법

동물

유색의 이영양증 RCS(rdy -/-, p+) 랫트를 파리에 소재하는 Institute de la Vision에서의 동물 시설에 유지시켰다. 성체(수컷 및 암컷) 수용체 동물은 이식 시기에 PN18의 연령이었다. 모든 실험을 신경과학 연구에서 동물 및 사람의 사용 정책에 따라 수행하고, 안과 및 시각 연구에서 동물의 사용을 위한 동물 실험 찰스 다윈(Charles Darwin)의 윤리 위원회에 의해 정정되고 승인되었다. 동물을 표준 12/12시간 명-암 주기로 유지시키고 시각 기능의 모든 평가는 광 상(light phase)의 처음 8시간에 수행하였다. 모든 동물을 이식 2일 전으로부터 이들을 희생시키는 날까지 투여된 경구 210mg/l 사이클로스포린 A(Merck Millipore 239835)을 유지시켰다.

RNA 정제

천연 또는 배양된, 망막 박리된 또는 박리되지 않은 사후 사람 망막 샘플, 대조군 샘플, 및 돼지 원시 망막 색소 상피 세포를 구아니딘 하이드로클로라이드 용액 속에 두고 총 RNA를 염화세슘(CsCl₂) 방법을 사용하여 정제하였다(Delyfer et al., 2013). 요약하면, 조직/세포 샘플을 6M 구아니딘 HCl 속에서 폴리트론(Kimematica PT2100)을 사용하여 균질화하였다. 균질화 후 샘플을 10분 동안 실온(RT)에서 2M 아세트산칼륨 pH 5.0과 함께 항온처리한 후 5,000rpm으로 20℃에서 10분 원심분리하였다. 상층액을 5.3ml의 100mM 트리스-HCl pH 8, 1% N-라우릴사르코신, 3.2g의 CsCl₂와 혼합하고 폴리알로머 초원심분리 튜브(Rotor SW 41 TI, Beckman) 속에서 1.8ml의 CsCl/ EDTA의 상부에 이전시켜 CsCl 구배를 생성시켰다. 샘플을 (Optima LE80k, Beckman)를 사용하여 24시간 동안 35,000rpm에서 20℃에서 24시간 동안 원심분리하였다. 펠렛(pellet)을 150μl의 10mM 트리스-HCl pH 7.5; 1mM EDTA; 150μl의 10mM 트리스-HCl pH 7.5 속의 0.1% SDS; 1mM EDTA 속에 현탁시켰다. 총 RNA를 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 정제하고 디에틸프로카보네이트(DEPC) 물 속에 재현탁시켰다. 변성 겔 전기영동으로 RNA 온전성을 평가하였다.

역 전사 및 실시간 PCR

제1의 cDNA 쇄를 1μg의 총 RNA로부터 무작위 프라이머(Promega) 및 슈퍼스크립트(Superscript) II 리버스 트랜스크립타제(Invitrogen)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 합성하였다. 요약하면, DNAse I(Life technologies, 18068-015) 처리 및 65℃에서 5분 동안 불활성화 후 1μg의 총 RNA를 5 단위(U)의 RNasin^® Plus(Promega), 100ng의 무작위 프라이머(Promega), 10mM dNTP(Invitrogen), 0.1M DTT 및 4U 리버스 트랜스크립타제 효소와 혼합하였다. 샘플을 42℃에서 50분 동안 항온처리하고 효소 반응을 72℃에서 15분 동안 항온처리하여 불활성화시켰다. 사람 샘플, 사람 유도된 다능성 줄기 세포(iPS)-기원한 RPE 세포 및 원시 돼지 RPE 세포 속에서 유전자의 내인성 발현을 실시간 RT-PCR에 의해 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 정량화하였다. 프라이머 효능을 분석 전에 측정하고 효능이 90% 내지 110%의 순위이고 R²이 대략 1인 프라이머 만을 정량적 분석에 사용하였다. 10ng의 cDNA를 0.1mM 전방-역 프라이머 혼합물 및 1x 분말 SYBR Green(Invitrogen, 4367659)과 혼합하였다. 증폭 및 진폭 분석(역치 주기(cycle threshold), Ct)를 (7500 실시간 PCR 시스템, Applied Biosystems) 및 요약하면 다은 단락을 사용하여 수행하였다, 제1, 95℃에서 1주기를 함유; 제2, 40 주기: 95℃에서 15초에 이어서 60℃에서 20초; 제3 단락, 1 주기, 95℃에서 1분; 55℃에서 30초; 95℃에서 30초. 각각의 유전자의 발현은 제조업자의 지시에 따라서 ΔCt 제형을 사용하여 하우스키핑 유전자의 발현으로 정규화하였다. 사람 망막 박리에 있어서의 분석 및 hiPS-RPE 및 돼지 원시 RPE 세포에서의 유전자 스크리닝을 위해, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 사람 iPS-RPE의 특성화를 위하여, 18S rRNA를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 비교 분석을 위해, 결과를 제조업자의 지시에 따라 △△Ct 제형을 사용하여 계산하고 발현된 배율을 2^- ^ΔCt　및/또는 2^- ^ΔΔCt로 나타내었다.

플라스미드 작제

벡터 플라스미드 pAAV2-CMV-eGFP는 아데노-관련 바이러스 2(AAV2) 게놈 및 eGFP를 암호화하는 전이유전자 카세트를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에 수반하였다. 플라스미드 pAAV2-CMV-Otx2v(스플라이싱 변이체)는 pAAV2-CMV-eGFP 플라스미드 속의 eGFP를 Otx2 스플라이싱 변이체의 CDS에 의해 NotI(5') 및 BamHI(3') 제한 효소 부위내로 교체함으로써 작제하였다. 랫트 Otx2 및 Otx2L 단편을 플라스미드 LA0ACA144YK13CM1 및 LA0ACA6YL17.CONTIG 각각(http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/)으로부터 전방 프라이머 5' GTGTCCAGGCGGCCGCAAAAATGATGTCTTATCTAAA(서열 번호: 1) 및 역방 프라이머 5' AATCGGATCCCGATATCTCACAAAACCTGGAATTTCCA(서열 번호: 2)를 사용하여 높은 정확도 PCR을 통해 작제하였다. 헬퍼 플라스미드(pHelper)는 3개의 아데노바이러스 헬퍼 유전자 VA, E4 및 E2A, 및 또한 AAV1 캡시드의 단백질을 암호화하는 플라스미드 pLT-RC02를 제공한다(Acland et al., 2005).

AAV2.1 바이러스의 생산

녹색 형광성 단백질(GFP) 또는 Otx2 , 및 Otx2L 스플라이싱 변이체를 암호화하는 전이유전자 카세트를 CMV 프로모터의 조절 하에 지닌 AAV2 벡터를 AAV1 캡시드내로 패키징하였다. 요약하면, 15 x 10⁶개의 HEK 293 세포를 12μg의 pHelper 플라스미드, 10μg의 pLT-RC02, 및 6μg의 pAAV2-CMV-eGFP, pAAV2-CMV-Otx2 또는 pAAV2-CMV-Otx2L 플라스미드로 삼중 형질감염시켰다. 이들 작제물을 120μl의, 1μg/μl 폴리에틸렌이민(PEI) 및 500μl의 DMEM과 혼합하였다. 48시간 형질감염 후, 세포를 수거하였다. 상층액을 2시간 동안 4℃에서 1x 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액(8% PEG, 5M NaCl)과 혼합하였다. 세포를 분해 완충액(0.15 M NaCl, 50 mM 트리스-Cl pH 8.5) 속에 현탁된 3주기의 동결/해동에 의해 분해하였다. 세포 분해물을 PEG 펠렛과 합하고 바이러스 입자를 요오딕산올 구배(15%, 25%, 40% 및 60%)에 의해 수집하고 기술된 바와 같이 원심분리하였다(Dalkara et al., 2009). AAV 바이러스를 함유하는 40% 분획을 수집하고 1x PBS, 0.001% 플루로닉으로 정제하였다. 바이러스 입자를 PBS, 0.001% 플루로닉 속에 저장하였다. 역가(titer)를 ITR 서열을 표적하는 다음의 프라이머 5' GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(서열 번호: 3) 및 3' CGGCCTCAGTGAGCGA(서열 번호: 4)를 사용하는 실시간 PCR에 의해 절대적 정량화로 측정하고 μl(vg/μl)당 바이러스 게놈으로 나타내었다.

사람 유도된 다능성 줄기 세포-기원한 망막 색소 내피 세포

통합-유리된 사람 iPS 세포주, hiPSC-2를 8세 소년으로부터 성인 사람 피부 섬유아세포로부터 생성시켰다. 섬유아세포 세포를 OCT4 , SOX2 , NANOG , LIN28 , c- MYC , 및 KLF4를 발현하는 에피솜 벡터로 형질감염시키고 Reichman et al, (Reichman et al., 2014)에 의해 완전히 특성화하였다. HiPSC-2를 10 ng/ml의 사람 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)(Preprotech)가 들어있는 ReproStem 배지(ReproCELL) 속에서 미토마이신 C 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포 배양보조세포층(Zenith Biotech) 위에 유지시켰다. 세포를 37℃에서 표준 5% CO₂/95% 공기 속에서 항온처리하고 1주당 1회 기계적으로 계대배양하였다. RPE 세포를 기술된 바와 같이 합치성 hiPSC-2의 분화에 의해 수득하였다(Reichman et al., 2014). 색소 세포의 패치를 기계적으로 나누고 계대배양 0으로 나타낸, 젤라틴-피복된 배양물 디쉬(dish)에 증식시켜, 합치(confluence)에 이르도록 하였다. RPE 세포는 RPE 특이적인 단백질 발현(MITF 및 ZO-1)에 대한 형태학, 색소 발현 및 면역세포화학 검출에 의해 특성화하였다. RPE 유전자 마커의 발현은 정량적 RT-PCR 및 특이적인 프라이머를 사용하여 검출하였다. 사람 iPS 세포-기원한 RPE 세포를 이들의 RPE 형태를 유지시키면서, 계대배양 4까지 증식시킬 수 있다(Singh et al., 2013). 유전자 발현 연구를 계대배양 1에서의 세포에서 수행하였다.

돼지 망막 색소 내피 원시 배양

돼지 눈을 3개의 사육으로부터 수집하였다: 피에트레인(Pietrain), 라지 화이트(Large white) 및 랜드레이스(Landrace)를 주문한 도축장(프랑스 호우단 소재의 Abattoir Guy Harang)으로부터 수득하였다. 돼지 눈을 95% 에탄올 속에 3분 동안 소독하고 CO₂ 독립 배지(Invitrogen) 속에 이전하였다. 작은 절개를 거상연(ora serrata)(망막의 3mm)에서 침(needle)을 사용하여 수행하고 돼지 눈을 각막 주변에서 절단하고, 이를 이후 제거하였다. 안구를 전방 수정체(lens vitreous) 및 신경 망막으로부터 제거하였다. RPE/맥락막, 안배(eyecup)를 PBS로 2회 세척하고 트립신-EDTA 0.25%를 안배의 2/3까지 충전시키고 37℃에서 1시간 40분 동안 항온처리하였다. RPE 세포를 온화하게 상하로 피펫팅함으로써 수집하고 20% FBS 및 10μg/ml 젠타마이신을 함유하는 DMEM 배지내로 이전하였다. 11개의 눈으로부터의 RPE 세포를 함께 혼주(pooling)시키고 동일한 배지 속에서 5개의 10 cm² 디쉬내로 플레이팅(plating)하였다. 배양 배지를 1일 및 4일째에 교환하였다. 5 내지 6일째에, 배양물은 합치에 이르렀으며 RPE 세포의 대표적인 외형과 같은 옥석을 나타내었다.

닭 추상체-광수용체(cone-photoreceptor)가 풍부한 배양물

29일 단계의 닭 배아로부터의 눈을 절개하여 1x PBS 속에서 세정하고 CO₂ 독립 배지 속에 눈을 이전시켰다. 절개 장치를 사용하여, 신경 망막을 분리하고 각막, 유리질, 렌즈 및 어떠한 다른 나머지 조직으로부터 조심스럽게 세척하였다. 신경 망막을 신선한 CO₂ 독립 배지로 이전시키고 절개 도구의 도움으로 작은 조각으로 분리시켰다. 조각들을 새로운 튜브로 이전시켰다. 37℃에서 20분 동안 트립신-EDTA 0.25% 분리 후 원심분리하였다. 37℃에서 20분 동안 트립신-EDTA 0.25% 분해 이후에 원심분리시켰다. 트립신 반응은 10% FBS를 함유하는 배지 M199를 첨가한 후 원심분리하여 정지시켰다. 광수용체 후대세포를 CDM 배지(50% M199(Life Tec. 11150-059); 50% DMEM, 보충물: 5μg/ml 인슐린, 5μg/ml 나트륨 셀레나이트; 16.1μg/ml 푸트레신; 0.63μg/ml 프로게스테론; 100μg/m 프로스타글란딘; 375μg/ml 타우린; 2.56μg/ml 사이티딘-5'-디포스포콜린; 1.28μg/ml 사이티딘-5'-디포스페이트 에탄올아민; 0.2μg/ml 하이드로코르티손; 0.02μg/ml 트리-요오도타이로신; 110μg/ml 나트륨 피루베이트; 100μg/ml 리놀레산과 함께 항온처리하였다.

시험관내 형질도입

시험관내 형질도입을 위해, 원시 RPE 세포 및/또는 iPS-기원한 RPE 세포를 12-웰 플레이트(well plate) 속에, 10% FBS를 함유하는 DMEM 속에 12 x 10⁶개 세포/웰로 씨딩(seeding)하였다. 다음 날, 세포를 1x PBS로 세척하고 5시간 동안 6 x 10¹⁰개의 바이러스 입자(AAV2.1-GFP 또는 AAV2.1-Otx2v 슬라이스 변이체)를 함유하는 300μl의 DMEM과 함께 항온처리하였다. 5시간 항온처리 후, 배지를 10% FBS 및 10μg/ml 젠타마이신으로 조정하였다. 세포를 10일 동안 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다. 배지를 5일에 1회씩 교환하였다. 이식 연구를 위해, 원시 RPE 세포를 형질도입용으로 사용된 바이러스와 함께 7일 동안 항온처리하였다.

웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학

웨스턴 블롯팅 프로토콜을 Leveillard et al., 2004에 기술된 바와 같이 수행한다. 요약하면, 형질도입된 돼지 원시 RPE 세포를 분해 완충액[50mM 트리스-HCl-pH7.5, 1 mMEDTA, 1 mMDTT, 50mg/mlTLCK (Sigma), 1x 프로테아제 억제제(Sigma), 10μg/ml 트리톤 X-100] 속에 가용화하고 초음파처리하였다. 사용된 항체는 다음과 같다: 항-OTX2(R&D systems AF1979, 1/1,500), 항-ACTB (1/500). 45일 동안 항온처리 후 hiPS-RPE 단층의 면역표지화를 ZO-1 및 MITF에 대해 수행하였다. 요약하면, 세포를 10분 동안 4% 포름알데하이드 속에 고정시킨 후 1x PBS로 3회 세척하였다. 차단을 실온에서 (PBS, 0.2% 젤라틴, 및 0.25% 트리톤 X-100)을 사용하여 1시간 동안 수행하고 4℃에서 주요 항체와 함께 밤새 항온처리하였다. 사용된 항체는 다음과 같다: 항-ZO-1(61-7300, Life technology 1/250) 및 항-MITF (clone D5, M3621, DACO 1/200). 슬라이드를 0.1% 트윈-20이 들어있는 PBS 속에서 3회 세척한 후 1시간 동안 실온에서 Alex-aFluor 488 또는 594(Life Technologies, 1/600) 및 DAPI(1/1000)과 접합된 적절한 제2 항체와 함께 항온처리하였다. 형광성 염색 시그날을 CCD CoolSNAP-HQ 카메라(Roper Scientific)가 장착된 DM6000 현미경(Leica microsystems) 또는 405-, 488-, 및 543-nm 레이저가 장착된 Olympus FV1000 공촛점 현미경을 사용하여 포획하였다. 공촛점 영상은 1.55- 또는 0.46-μm 단계별 크기를 사용하여 획득하고 4 내지 8개의 광학 단면의 투사에 상응하였다.

크로마틴 면역침전

크로마틴 면역침전(ChIP)을 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다(Reichman et al., 2010; Dorval et al., 2006; Pattenden et al., 2002). 요약하면, 신선한 RPE 세포를 6마리의 돼지 눈으로부터 절개하여 함께 혼주시켰다. RPE를 PBS 중 빙냉 4% 포름알데하이드와 교차-결합시키고, PBS 속에서 세정하고, 분해 완충액[1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM 트리스-HCl pH 8.0] 및 프로테아제 억제제(Sigma) 속에서 800bp의 평균 DNA 크기로 초음파처리(Vibra Cell)하였다. 초음파처리된 샘플을 15,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고 상층액을 G-세파로즈 비드(PI-20399, Ficher)로 1시간 동안 실온(RT)에서 예비-세정하였다. 100μl의 분취량을 희석 완충액(1% 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl pH 8.0)을 사용하여 1.5ml로 희석시키고 1시간 동안 실온체서 1) 항체 없음 2) 2.5μg의 항-토끼 항체(111-035-045, Jackson lab) 항체 3) 항-OTX2 항체(ab9566, Millipore)와 함께 항온처리한 3개의 반응물로 아분리(subdividing)하였다. 샘플을 15,000 rpm에서 10분 동안 20℃에서 원심분리하고 상층액을 15μl의 단백질 G-세파로즈 비드, 150μg 울트라퓨어 연어 정자 DNA(15632-011,Invitrogen) 및 150μg 효모 tRNA, (15401-011, Invitrogen)와 혼합하고 1시간 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. 침전물을 10분 동안 실온에서 TSEI(0.1% SDS; 1% 트리톤 X-100; 2 mM EDTA; 20 mM 트리스-HCl pH 8.0; 150 mM NaCl)으로, TSEII(0.1% SDS; 1% 트리톤 X-100; 2 mM EDTA; 20 mM 트리스-HCl pH 8.0; 500 mM NaCl)으로 4회, 완충액 III(0.25 M LiCl pH 8.0; 1% 노니데트 P-40; 1% 데옥시콜레이트; 1 mM EDTA; 10 mM 트리스-HCl pH 8.0)으로 1회, 및 최종적으로 TE 완충액(10 mM 트리스-HCl pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0)으로 연속적으로 3회 세척하였다. 샘플을 용출시키고 교차-결합물을 65℃에서 100μl의 용출 완충액(1% SDS; 0.1 M NaHCO₃) 속에서 밤새 항온처리하여 투명하게 하였다. DNA 단편을 페놀-크롤로포름 추출로 정제하고 70μl의 TE 완충액 속에 재현탁시켰다. 반 정량적 PCR을 사용하여 2μl의 면역침전된 물질을 증폭시켰다. PCR 반응을 25μl 속에서 94℃에 대해 3분 동안, 40주기(94℃/15초/60℃ 15초/72℃ 30초), 72℃에서 3분 수행하였다. 사용된 프라이머를 설계하여 단편을 프로모터 유전자내로 증폭시켰다: KCNJ13, 전방 5'-GCAGGCCTTCCATGATTTTA (서열 번호: 5) 및 역방 5'-TGAGCTGTCAGATGGCTTTG (서열 번호: 6); SLC16A12, 전방 5'-TGCCTGTCCCACTAGGAAGT (서열 번호: 7) 및 역방 5'-GCATCATTTGCCATGTGACT (서열 번호: 8); RDH10 , 전방 5'-GGCAACAAGTCCCACCTAAA (서열 번호: 9) 및 역방 5'-GTTTACTTGGTGGGGGAGGT (서열 번호: 10); TYRP1, 전방 5'- CCAATTTGCAGGGAACAAAT (서열 번호: 11) 및 역방 5'- TGCCTTAAATTGCCTTCTCAA (서열 번호: 12); HGB, 전방 5'-GAACGTCAGGATTCCCTTGA (서열 번호: 13) 및 역방 5'-CCATTGGGAGCTTCCTTGTA (서열 번호: 14).

망막 색소 세포 제조 및 이식

형질도입된 원시 돼지 RPE 세포와 AAV2.1-GFP 또는 AAV2.1-OTX2를 앞서 기술된 바와 같이 이식 전에 1주 동안 항온처리하였다. 세포를 HBSS(행크스 균형된 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드는 부재함)(Invitrogen)으로 2회 세척하고 트립신-EDTA 0.05%로 분리하였다. RPE 세포를 온화한 피펫팅(gentle pipetting)으로 수집하고 20% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 HBSS로 이전시켰다. 세포의 수득되는 펠렛을 HBSS 속에서 25,000개 세포/μl로 재-현탁시켰다. 수술을 수술 현미경을 통해 직접적인 검안 하에 수행하였다(도 11). 보조자에게 각각의 랫트에게 주사된 동일성(RPE-GFP 또는 RPE-OTX2) 세포를 통지하지 않는 블라인드 프로토콜(blind protocol)을 사용하였다. 수용체 랫트를 케타민(1000 mg/kg) 및 크실라진(10 mg/kg)의 혼합물을 수술 전 최소 10분 동안 1회 복강내 주사하여 마취시켰다. 해밀톤 주사기(10μl, 모델 1701 RN SYR, NDL Sold)에 부착된 평활말단(blunt-end)의 30 게이지 해밀톤(Hamilton) 침을 공막 및 RPE를 통해 망막하 공간에 접선으로 삽입하였다. 세포 현탁액을 눈당 50000개 세포로 서서히 주사하였다. 모든 과정 동안에 눈 탈수를 염화나트륨 점적(drop)의 규칙적인 적하(instillation)로 방지하였다. 수술 후, 처리된 및 처리되지 않은 눈 둘 다를 탈수 및 각막의파괴를 위해 킵 밀폐(kipped closed)시켰다. 랫트를 체임버 속에 35℃에서 마취에서 회복될 때까지 유지시켰다.

시운동 반응

처리된 및 처리되지 않은 눈의 대비 민감도 및 시력을 검안(optomotry) Cerebral Mechanics Inc(캐나다), 및 OptoMotry^TM,1.77 시스템을 사용하여 회전하는 사인파 격자(sinusoidal grating)(Alexander et al., 2007; Prusky et al., 2004; Pearson et al., 2012)에 대한 랫트의 시운동 반응(optomotor response)을 관찰함으로써 측정하였다. 요약하면, 랫트는 격자 회전의 방향으로 이들의 머리를 이동시킴으로써 회전하는 수직 격자에 대해 반사적으로 반응한다. 사용된 프로토콜은 회전 양식에 대해 2개의 눈의 동일하지 않은 민감성을 기준으로 하여 우측 및 좌측 눈의 예민함의 독립된 척도를 생성한다: 우측 및 좌측 눈은 각각 시계 반대 방향 및 시계 방향으로 거의 민감성이다. 이중-블라인드 과정을 사용하였으며, 여기서 관찰자는 한쪽 눈이 치료를 제공받고 한쪽 눈이 RPE-GFP 또는 RPE-OTX2 세포를 제공받은 회전 양식의 방향 둘 다에 대해 "차폐"되었다. 요약하면, PN50에서 각각의 랫트를 4개의 안쪽으로 대면하는 LCD 컴퓨터 모니터 스크린의 중심 위치한 받침대에 위치시키고 적외선 광원을 사용하는 머리위 적외선 비디오 카메라로 관찰하였다. 일단 랫트가 받침대에 익숙해지면, 랫트를 OptoMotry^TM 소프트웨어로 무작위 측정한 것으로서, 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하는 사인곡선의 줄무늬 양식을 사용하여 랫트를 나타냄으로써 7s 시험을 개시하였다. 의도치않은 반사 머리 트래킹 반응(reflex head tracking response)이 좌측(시계 방향) 및 우측(시계 반대 방향) 눈에서 각각 유도된다. 대비 민감성을 0.042 주기/도의 공간 주파수 및 0.5 hz의 회전 속도에서 측정하였다. 시력을 평가하기 위하여, 격자는 100%의 고정 대비를 가졌으며 초기 자극은 0.042 주기/도이었다. 계단 패러다임(staircase paradigm)을 사용하여 프로그램을 집중시켜 ≥ 70%의 정확한 관찰자 반응을 생성하는 공간 주파수 또는 대비 %로 정의된 양쪽 눈의 시력 또는 대비 민감성을 측정하였다. 시력은 역치 반응(threshold response)을 생성하는 최대 공간 빈도수로 정의되었다. 유사하게, 대비 민감성은 100을 역치 반응을 생성하는 최저 대비 퍼센트로 나눈 것으로 정의되었다. 당해 프로토콜은 우측 및 좌측 눈 민감성의 분리를 헝용하지만, 대측성 눈은 자극에 대해 '블라인드' 처리되지 않는다.

망막전위도 ( Electroretinograms )

ERG를 PN60령 랫트 또는 이식 후 42일째에 SEIM Biomedical system을 사용하여 기록하였다. 이식 실험을 위해, 시험 눈에게 50,000개의 형질도입된 RPE 세포의 초 망막하 주사를 제공하였다. 이중 차폐된 프로토콜을 사용하여 ERG를 수행하는 개인이 어느 눈이 이식되었는지 및 어느 눈이 치료되지 않고 남았는지 및 어느 눈이 RPE-GFP 및 RPE-OTX2를 제공받았는지 알지 못하도록 하였다. 밤새 암실 적응시킨 후, 동물을 희미한 적색광 하에서 기록하기 위해 제조하였다. 동물을 케타민(100 mg/kg) 및 크실라진(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시키고 37℃에서 자동 온도 조절 장치로 조절된 가열 플랫포옴으로 따뜻하게 유지하였다. 동공을 0.5% 미다리아티쿰을 사용하여 확장시키고, 각막을 옥시부프로카인의 클로로하이드레이트 1.6 mg/0. 4ml를 적용시켜 국소 마취하였다. 상부 및 하부 입술을 집어넣어 눈을 뜬채 유지시켜 안구를 돌출시켰다. 비스코티어 액체 겔(viscotears liquid gel)을 각각의 각막에 놓아 각막이 금 전극에 접촉 후 습윤상태로 유지되도록 하였다. 스테인레스-강 참조 전극을 랫트의 머리에 피하 삽입하고 제2의 침 전극을 시그날을 생산하도록 제공된 랫트의 등에 피하 삽입하였다. 동물은 기록하기 전에 완전한 암실 속에 추가로 5분 동안 두었다. Ganzfeld ERG를 양쪽 눈으로부터 동시 수득하여 내부 조절하였다. 암소시 기록(scotopic recording)을 위해, 단일의 섬광 기록을 3μcds/m², 30mcds/m², 0.3, 3 및 10 cds/m²의 광 강도에서 5 kHz의 샘플링 주파수, 4 ms의 섬광 지속기간, 및 0.5 Hz의 빈도수 자극을 사용하여 수득하였다. 데이타를 자극 시작 전 50ms로부터 450ms의 후-자극까지 기록하였다. 명소시 추상체(Photopic cone) ERG를 광 적응 5분 후 봉-진압 배경(rod-suppressing background)에서 수행하고, 10cds/m²의 광 강도에서 기록물을 수득하였다. 대역 필터(bandpass filter)를 0 내지 1kHz에서 설정하였다. 각각의 암소시 반응은 10개의 반응의 평균을 나타내고 각각의 암소시 ERG 반응은 5회의 섬광 자극의 설정으로부터 5회 반응의 평균을 나타낸다. 각각의 그룹(n=7)에 대한 b 파동 피크까지의 평균 시간을 각각의 기록에서 측정하였다. 플리커 추상체(Flickers cone) ERG 반응을 10 Hz에서의 섬광 및 0.3 cds/m²의 강도로 수행하였다.

광 간섭성 단층촬영술(OCT)

PN60령의 치료된 랫트를 마취시키고 동공을 상기 기술한 바와 같이 확장시켰다. 눈 탈수는 염화나트륨 점적물의 일정한 점적주사로 방지하였다. OCT 영상을 양쪽 눈에 대해 스펙트럼 도메인 안과 영상 시스템(spectral domain ophthalmic imaging system)(Spectral domain Optical coherence tomography, OCT, Bioptigen 840nm HHP; Bioptigen; 미국 노쓰 캐롤라이나 소재)을 사용하여 기록하였다. 본 발명자들은 B-스캔 당 1000 A-스캔으로 100의 총 B-스캔량을 사용하는 2mm x 2mm 둘레로 이루어진 직사각형 스캔을 수행하였다. 스캔은 우선 시신경을 중심으로 한 후, 측두/비강 또는 상부/하부에 위치한 신경으로 수득하였다. OCT 스캔을 AVI 파일로서 InVivoVue로부터 배출하였다. 이들 파일을 ImageJ(version 1.47; National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 로딩(loading)하였으며, 여기서 이들을 Stackreg plug-in을 사용하여 등록하였다. 영상 규모는 픽셀(pixel)의 수를 3.11 픽셀/μ m로 전환시켜 수행하였다. 회부 핵 층(ONL) 두께를 중심(시신경)으로부터 시작하여 ImageJ에 대해 집에서 만든 plugin을 사용하여 OCT 스캔으로 제공된 전체 눈 부위를 덮도록, 배면-등 및 측두-비강으로 100μm마다 측정하였다. 각각의 지점의 두께의 평균을 그룹, 치료되지 않은 눈(n = 6), RPE-GFP 이식된 눈(n = 6) 및 RPE-OTX2 (n = 7)에 대해 계산하였다. ONL 두께는 3D 밀도 맵(dencity map)으로 나타내었다.

시험관내 스캐닝 레이저 검안경(SLO)

고-해상도 적외선 반사 영상 및 플루오레세인 혈관조영법을 개질된 레이저 스캐닝 검안경(SLO; Heidelberg Retina Angiograph, 독일 하이델베르크 엔지니어링 소재)으로 앞서 기술한 바와 같이(Weismann et al., 1893) 사용하여 수행하였다.

생 사 검정(live dead assay)

생 사 검정을 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다(Leveillard et al., 2004). 요약하면, GFP, OTX2(서열 번호: 15) 및 OTX2L (서열 번호: 16)로 형질도입된 RPE 세포를 1주 동안 CDM 배지와 함께 항온처리하였다. RPE-형질도입된 세포로부터 조건화된 배지를 수집하고 96웰 블랙 조직-배양 플레이트(Corning) 속에서 앞서 기술한 바와 같이(Adler et al., 1989) 제조된 닭 배아(29일령)으로부터의 원시 망막 배양물에 가하고 7일 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 항온처리하였다. 14개의 음성 대조군 웰(조건화된 배지)를 또한 포함시켰다. 본 발명자들은 생/사 검정(Molecular Probes)을 사용하여 세포 생존능을 모니터하였다. 차폐된 프로토콜을 사용함으로써 생 사 검정을 수행하는 개인이 어느 상층액이 RPE-GFP 또는 RPE-OTX2 형질도입된 세포로부터 왔는지를 알지 못하도록 하였다. 획득 및 세포 계수를 위해, 본 발명자들은 Metamorph 소프트웨어(Universal Imaging Corporation)를 기반으로 한 알고리즘을 개발하였다. 이들은 수은 에피플루오레슨트 램프와 2개의 여기 필터(485 및 520 nm), 2개의 방출 필터(520 및 635 nm), 10x 대물렌즈, 컴퓨터-구동된 전동 스캐닝 단계(Marzhauser) 및 CCD 카메라가 장착된 역전된 형광 현미경(TE 200, Nikon) 하에서 플레이트를 판독하였다. 스크리닝을 위해, 이들은 다수의 생 세포와 평균 수의 생 세포를 음성 대조군에서 비교하였다. 각각의 검정을 각각의 조건에 대해 4회 반복물과 함께 3회의 별도의 시점에서 반복하였다.

헤마톡실린 및 에오신 매립(embedding)

동물을 케타민 및 크실라진으로 앞서와 같이 마취시키고 즉시 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중 2.5% 글루타르알데하이드 및 2% 포름알데하이드로 관류시켰다. 눈을 적출하고 고정상태(2% 포름알데하이드)에서 밤새 항온처리하였다. 렌즈를 제거하고 안배를 5% 슈크로즈로 5회 세척하였다. 안배를 1시간 동안 2% 사산화오스뮴(Sigma Aldrich, 201030) 속에 고정시켰다. 당해 단계를 구배 에탄올(50%, 70%, 95%)로 탈수시키고 프로필렌 옥사이드 속에 10분 동안 항온처리하였다. 이후에 눈을 실온에서 1/1(아랄디트-에폭시 수지/프로필렌 옥사이드) 혼합물과 함께 밤새 항온처리하였다. 매립을 65℃로 가온한 아랄디트-에폭시 수지 혼합물을 사용하여 밤새 수행하였다. 두께가 1μm인 플라스틱 단면을 시상축을 따라 Leica EM UC6 초 마이크로톰(ultra microtome)을 사용하여 제조하고 톨루이딘 블루(1% 보락스, 1% 톨루이딘 블루)로 염색하였다.

통계

모든 데이타를 달리 나타내지 않는 한, 평균 ± 표준 오차로 나타낸다. 적절하게는 n은 시험한 동물, 눈, 또는 세포의 수이다. 통계적 유의성은 Graphpad Prism 6 소프트웨어를 사용하고, 경우에 따라, 쌍을 이루지 않은 비 모수 t-시험(unpaired non parametric t-test), 다중 비교를 위한 본페로니 또는 던네트 수정(Bonferroni or Dunnett's correction)을 사용한 ANOVA, 웰치 수정(Welch correction), 콜모고로브-스미르노브(Kolmogorov-Smirnov), 윌콕슨 일치된-쌍(Wilcoxon matched-pair), (2-테일드)를 사용하여 평가하였다.

결과

배양된 망막 색소 내피 세포는 내피-간엽성 전이를 겪는다.

본 발명자들은 1주 동안 원시 돼지 RPE 세포를 배양하는 것이 2개의 간엽성 마커, 알파 평활근 액틴(ACTA2) 및 비멘틴(VIM)의 발현을 유도함을 발견하였다(도 1의 A).

이러한 전이를 겪는 매카니즘을 설명하기 위하여, 아마도 RPE 기능 또는 광수용체 생존과 관련된, RPE 세포에 의해 특이적으로 발현되기 위해 선택된 37개의 유전자의 소세트의 발현을 측정하였다. 이들 유전자 중 27개(73%)가 배양된 원시 RPE 세포를 햐향-조절하지만, 3개의 유전자는 상향-조절되었음이 밝혀졌다: SLC16A3, SLC16A12 및 TYRP1(도 1B 및 도 12).

하향-조절된 그룹 중에서, 본 발명자들은 2개의 전사 인자, CRX 및 OTX2의 존재를 인식하였다. CRX의 발현은 매우 심각하게 감소한 반면, OTX2의 발현은 1/2로 감소하였다. OTX2는 CRX의 발현을 조절하고 결과적으로 CRX는 OTX2의 하부에 위치하는 것으로 보고되었으므로, OTX2 발현은 웨스턴 블롯팅으로 시험하였다. 따라서, OTX2 단백질 발현은 배양시 1주 후에 감소됨이 확인되었다(도 1C). OTX2 슬라이스 변이체 OTX2L에 상응한 시그날을 당해 공정 동안에 유도시켰다. OTX2L는 호메오도메인의 상부의 5개 아미노산인, 추가의 옥타펩타이드 GPWASCPA를 암호화하지만, 추가의 기능은 당해 변이체에 전혀 기여하지 않았다.

내피에서 간엽성 전이는 또한 망막 박리 후 생체내에서 발생하며, 여기서 이는 이의 합병증인, 증식성 유리체망막병증에 관여한다. VIM의 발현은 정량적 RT-PCR에 의해 신경 망막의 19개 사후-검토 표본과 비교하여 망막 박리의 19개 사람 수술 표본에서 시험하였다. VIM 발현의 2.37배 상승이 망막 박리와 관련되었다(도 1D). 동일한 표본에서, OTX2 발현은 2.17배까지 감소하였다. 흥미롭게도, 이의 강력한 표적들 중 하나인, KCNJ13 유전자에 의해 암호화된, 안쪽으로 정류하는 칼륨 채널 KIR7.1은 또한 하향-조절되었다. KCNJ13 내에서의 돌연변이는 상염색체 우성 망막 질환인, 눈송이형 유리체망막 변성(snowflake vetreoretinal degeneration)을 유발하였으며, 다른 결손 중에서 망막 박리를 이끌었다. OTX2와 KCNJ13의 발현 사이의 직접적인 연관성은 이들 표본내 이들의 발현의 상관관계(피어슨 r-상관관계(Pearson r-correlation), r= 0.46, P<0.003 및 P<0.0001를 사용한 선형 회귀)에 의해 지지되었다(도 1E). 망막 박리의 발생과 수술 사이의 지연에 따라 분류하는 경우, KCNJ13의 발현이 1주 내지 3개월 사이에 감소하는 것으로 밝혀졌다(도 1F).

망막 색소 내피에서 신규한 (novel) Otx2 표적 유전자의 확인

OTX2가 27개의 하향-조절된 유전자의 발현을 조절하는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들을 랫트 OTX2, 및 독립적으로 OTX2L을 돼지 원시 RPE 세포내에서 과발현시켰다. OTX2 및 OTX2L cDNA를 아데노-관련된 바이러스 벡터내로 클로닝하고 RPE 세포를 AAV2.1-GFP, AAV2.1-OTX2 또는 AAV2.1-OTX2L로 감염시켰다. 형질도입 7일 후에, OTX2의 발현을 랫트 OTX2 mRNA로부터 돼지를 식별하지 않는 프라이머를 사용하여 정량적 RT-PCR로 입증하였다(도 2A).

OTX2의 이소성 발현은 VIM의 발현을 4배까지 감소시킨 것으로 나타났다(도 2B). 웨스턴 블롯팅 분석은 사용된 항체가 내인성 돼지 OTX2로부터 이소성 랫트를 구별하지 않으므로 발명자가 당해 시스템에서 OTX2 과-발현의 수준을 평가하도록 하였다(도 2C). 당해 분석은 VIM 단백질의 발현이 이소성 OTX2에 의해 감소됨을 보여준다. 37개의 선택된 유전자들 중에서, CRX 발현은 OTX2 및 OTX2L 둘 다에 의해서 거의 20배 유도되었음이 밝혀졌으며, 이는 OTX2가 RPE 세포에서 CRX의 발현을 조절함이 밝혀졌다(도 2D). 유사하게, 타이로시나제 유전자 TYR는 15배 유도되었다. 타이로시나제-관련 단백질 유전자 DCT 및 KCNJ13은 OTX2(~9배) 및 OTX2L(5 내지 6배)에 의해 유도되었다. 최종적으로, 케라틴 유전자 KRT18, 레티놀 데하이드로게나제 유전자 RDH10, TYPR1 및 모노카복실산 수송 유전자(transporter gene) SLC16A8 및 SLC16A12는 2 내지 5배 유도되었다(도 13). 흥미롭게도, SLC16A8 유전자내 위험성 대립형질(risk allele)은 RPE의 기능장애를 포함하는 질환인, 노화-관련 황반변성에 대해 취약하도록 한다(Fritsche et al., 2013).

전사 수준에서 이들 유전자의 발현을 조절하는데 있어서 OTX2의 역할을 추가로 확립하기 위하여, 염색체 면역침전을 감염되지 않은 원시 돼지 RPE 세포에서 수행하였다. OTX2는 당해 프로모터내에서 OTX2 조절 성분에 결합하는 것으로 보고되었으므로 TYRP1을 양성 대조군으로 사용하였다(Martinez-Morales et al., 2003). 후보물 OTX2 조절 성분은 KCNJ13, RDH10 및 SLC16A12 프로모터에서 발견되었다(도 2E). 항-OTX2는 TYPR1 프로모터 DNA를 동시-면역침전시켰지만, 면역글로불린이 빠지거나(-IgG) 비 면역성인 것을 사용하는 경우(+IgG) 시그날은 관찰되지 않았다(도 2F). 유사한 결과가 2개의 유전자, KCNJ13 및 RDH10를 사용하여 수득되었으며, 이의 발현은 OTX2에 의해 유도된다. 제3의 것, SLC16A12는 또한 동일한 정도의 동시-면역침전을 나타내었다. β-글로빈(HGB) 프로모터를 음성 대조군으로 사용하였다.

OTX2는 사람 RPE 세포에서 KCNJ13, RDH10 및 SLC16A8의 발현을 유도한다.

이들 유전자가 사람 RPE 세포에서 OTX2에 의해 표적화되는지를 시험하기 위하여, OTX2를 사람 유도된 다능성 줄기-기원한 RPE(iPS-RPE)에서 과-발현시켰다(Reichman et al., 2014). 이들 iPS-RPE 세포는 멜라닌을 발현하며, 전형적인 조약돌 형태를 가지고, 강력한 접합 단백질 ZO-1 및 전사 인자 MITF를 발현한다(데이타는 나타내지 않음). 사람 iPS-RPE 세포는 RDH10외에, RPE65, MITF, BEST1 및 MERTK와 같은 수개의 RPE 마커를, 분화되지 않은 IPs 세포와는 반대로, 정상의 사람 사후 표본으로부터의 RPE 세포보다 유사한 수준으로 발현한다(도 9). 이는, iPS세포가 RPE 세포로 분화됨을 입증한다.

AAV 감염은 RT-PCR에 의해 나타난 바와 같이 7일 후 내인성 Otx2보다 Otx2 및 Otx2L의 발현에 있어 각각 8 및 5배 증가를 생성하였다(도 3A). 타이로신 유전자 TYR의 발현은 돼지 RPE 배양물에서 관찰된 것과 유사하게, OTX2 및 OTX2L에 의해 각각 30 및 20배 유도되었다(도 3B). CRX 발현은 18배 증가하였다. 4개의 추가의 후보물 OTX2 조절된 유전자는 OTX2 및 OTX2L의 이소성 발현에 의해 유도되었다; KCNJ13(12.4배), SLC16A12(3.3배), RDH10(2.0배) 및 SLC16A8(1.8배).

RCS 랫트에서 OTX2를 과발현하는 유전적으로 변형된 RPE 세포의 이식(grafting)은 광수용체 기능을 증진시킨다

RPE 이식의 효과를 MERTK 단백질을 암호화하는 rdy 유전자내 열성 돌연변이를 수반하는 색소성 망막증의 열성 모델인, RCS 랫트에서 연구하였다. MERTK는 광수용체의 외부 색소의 식세포작용에 필수적인 RPE에 의해 발현된 수용체 타이로신 키나제이다. 결과적으로, MERTK 돌연변이는 색소성 망막염을 유발하며 RCS의 간상체 광수용체는 출산 후(PN) 23일째에 PN60으로 변성된다. 간상체의 변성은 이후 바로 추상체의 변성을 수반한다(D'Cruz et al. 2000　; Pinilla et al. 2004　; Girman et al. 2005). PN60에 의해, 간상체 및 추상체 기능은 기록가능하지 않았으며 조직학적 시험은, 광수용체 세포의 층인, 외부 핵층(ONL)이 거의 완전히 손실되었음을 나타내었다(도 7A).

이중 블라인드 과정을 사용하여, 본 발명자는 변성이 시작하기 전에 PN17에서 RCS 랫트 눈의 망막하 공간내로 50,000개 RPE 세포를 주사하였다(n=7). 본 연구를 위한 사람 iPS-RPE 세포를 충분히 제조하는 것이 불가능하였으므로, 돼지 RPE 세포를 사용하였다. 주사는 우측 눈의 중배 부분 망막에서 수행하였지만 좌측 눈은 치료하지 않고 두었다. 이식 1주 전에, RPE 세포를 GFP 또는 OTX2를 암호화하는 재조합 AAV2.1 벡터로 감염시켰다. AAV2.1-GFP 형질도입된 RPE (RPE-GFP) 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이식된 세포의 존재는 2개 눈을 단면화한 후 리포터로서 GFP의 형광성을 사용하여 PN60에서 입증하였다(데이타는 나타내지 않음).

망막전위도(ERG)를 이식 후 43일째에 PN60에서 기록하였다. RPE-GFP 또는 RPE-OTX2 세포로 치료한 눈의 암소시 ERG(간상체 반응)의 b-파동 크기는 3 x 10^-6 내지 10 cds/cm²의 대측성의 주사되지 않은 눈에 대한 것보다 유의적으로 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 4A 및 도 10). RPE-OTX2 이식된 눈으로부터의 간상체 반응은 RPE-GFP의 것보다 더 높았다. 반응의 중앙값은 GFP의 것보다 거의 2배 더 높았으며 야생형, rdy +/+ 랫트의 것의 29.4%에 상응한다. 자극과 b-파동 반응 사이의 시간을 의미하는 잠복기를 고려할 때, RPE-OTX2 이식된 눈은 높은 광 강도에서 RPE-GFP 눈의 것보다 더 빠르게 반응하였다(도 4B). 주간시 ERG(추상체 반응)의 b-파동 크기는, 심지어 RPE-OTX2에 대한 반응이 더 높는 경우 OTX2와 GFP 사이에 유의적으로 상이하지 않았으며, 둘 다는 치료되지 않은 눈보다 더 높게 반응한다(도 4C 및 도 10). 이러한 조건에서, 시그날이 원추체 광수용체 및 이극성 세포 둘 다의 반응으로부터 발생하였다. 순수한 추상체 반응을 플리커스 ERG로 기록하였다. 이들 조건에서, 반응의 크기는 치료된 눈에서 더 높은 것으로 밝혀졌으며 RPE-GFR보다 RPE-OTX2의 경우 유의적으로 더 높았다(도 4D 및 도 10).

이식 후 RCS 랫트의 시각적 행동

처리된 랫트의 시각적 행동을 회전하는 격자에 대한 시선운동 헤드-트래킹 반응(optomotor head-tracking response)을 측정함으로써 PN50에서 이중-블라인드 프로토콜을 사용하여 평가하였다(도 5A). 시력 및 대비 민감도는 격자 회전에 대한 2개 눈의 동일하지 않은 민감성을 기준으로 우측 및 좌측 눈의 예리함의 독립된 척도를 생성한다: 우측 및 좌측 눈은 시계 반대 방향 및 시계방향 회전에 대해 각각 더 민감성이다. 시력을 위해, 고정된 대비의 흑색 및 백색 스트라이프의 두께를 각각의 동물의 시력에 대해 조정하여 시력을 측정한다. 대비 민감도를 위해, 이는 대비 민감도를 측정하도록 조절된 동일한 두께의 암/담회색 스트라이프의 대비이다(도 5B).

각각 도 당 0.492 주기 및 0.474에서 평균 시력 반응을 지닌 보다 높은 트래킹 반응을 생성한 이식된 눈, RPE-GFP 또는 RPE-OTX2를 0.335 대측의, 주사하지 않은 눈과 비교하였다(도 5C). 이식된 눈은 또한 55.75%의 치료되지 않은 눈과 비교하여 RPE-GFP 및 RPE-OTX2에 대해 76% 및 66.88%의 증진된 대비 민감도를 생성하였다(도 5D).

RPE - OTX2 세포의 이식은 RCS 세포의 간상체 광수용체를 보호한다

이식에 의한 간상체(rod)의 보호를 시험하기 위해, 대부분의 설치류에서 95 내지 97%의 간상체로 구성된 외부 핵층(ONL)의 두께를 PN60에서 측정하였다. 측정은 100μm까지 이격된 광 단면내 전체 망막(9.5 mm²)에서 수행하였다. 측정은 광 간섭성 단층촬영술(OCT)(망막당 평균 1,005 척도)에 의해 각각의 단면에서 100μm 마다 수행하였다. 광 단면에서, ONL은 야생형 망막을 당해 층이 부재하는 주사되지 않은 RCS 랫트의 망막과 비교함으로써 명확하게 확인하였다(도 6A). 망막의 3차원 맵(map)을 전체 망막 표면에 걸쳐 각각의 지점에서 평균 ONL 두께를 사용하여 재구성하였다. ONL은 영상의 표면에 걸쳐 백색의 우위로 관찰되는 바와 같이 이식된 눈에서 전체적으로 더 두꺼웠다(도 6B). 당해 맵은 세포가 주사되었던 측두 후면 1/4을 향해 ONL 두께에서 점진적인 증가를 나타낸다. 전체 망막에 걸쳐 ONL은 RPE-GFP 눈과 비교하여 RPE-OTX2에서 더 두꺼웠다(도 6C). 망막 표면의 95%에서, ONL은 주사되지 않은 눈에 대해 평균 두께가 6.69μm였던 반면, RPE-GFP 및 RPE-OTX2의 경우 각각 17.59 및 25.39μm이었다. ONL 두께는 RPE-GFP 눈의 경우 6 내지 32μm 사이에 분포하였으며 RPE-OTX2 눈에서는 13 내지 42μm로 이동하였다(도 6의 D). 곡선 둘 다의 이정점(bimodal) 국면은 주사 부위에서 간상체의 보호를 생성하지만 측정시 이식된 세포 자체의 존재로부터는 보호하지 않았다. 데이타를 2개의 중심 단면, 측두에서 비강(TN) 및 후면에서 배면(DV)에 걸쳐 야생형(rdy +/+) 눈의 ONL 두께로 정규화하였다(도 6E). 본 발명자들은, ONL이 주사 부위, 망막의 측두 후면 1/4 에서 RPE-GRP 이식된 눈보다 RPE-OTX2에서 2배 더 높음을 발견하였다. 이는 야생형 눈에서 ONL의 두께의 ~40%, GFP의 경우 ~20% 및 치료되지 않는 RCS 눈의 경우 ~10%에 상응한다. 이식된 RCS 눈의 ONL의 두께는 또한 망막의 반대쪽 부분인, 비강-배측 1/4에서 더 두꺼웠다.

동물을 PN75에서 희생시키고 눈을 절단하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 치료되지 않은 RCS 눈에서 ONL의 얇아짐(thinning)외에 내부 망막층의 분열을 나타내었다(도 7A). 흥미롭게도 OTX2로 유전적으로 변형된 RPE 세포의 이식은 RPE-GFP 세포보다 더 큰 정도까지 이러한 제2 현상을 방지하였다(도 7B 및 7C). 내부 망막층의 조직화는 야생형(rdy+/+) 눈의 것과 유사하였다(도 7D).

RPE - OTX2 변형된 세포는 추상체 광수용체를 보호하는 신경영양 인자를 분비한다.

RPE-GFP 및 RPE-OTX2를 사용한 주사 부위로부터 떨어진 광수용체 구조(rescue)는 이식된 RPE 세포로부터 기원하는 측분비 효과(paracrine effect)의 지표이었다. 본 발명자들은 닭 배아로부터 추상체가 농축된 원시 배양물을 사용하여 형질도입된 RPE 세포의 조건화된 배지 속에서 신경영양 인자의 존재를 시험하였다(Leveillard et al. 2004). AAV 벡터로 감염된 돼지 원시 RPE 세포로부터 수거된 조건화 배지를 닭 망막 배양물에 가하였다. 배양 7일 후, 세포의 생존능을 생/사 검정을 사용하여 점수매겼다(Leveillard et al. 2004). RPE 세포는 천연적으로 보호 분자를 분비하였다. 그럼에도 불구하고, RPE-GFP와 비교하여, RPE-OTX2는 보다 더 큰 정도로 세포 생존을 유도하였다(도 8A). OTX2 형질도입된 돼지 RPE 세포로부터의 조건화된 배지는 세포 생존을 음성 대조군(배지만)보다 3배 더 및 GFP 형질도입된 RPE 세포로부터의 배지와 비교하는 경우 2배 더 증가시킨다. OTX2로 형질도입된 RPE 세포로부터 분리된 RNA의 정량적 RT-PCR 분석은, 섬모 신경영양 인자(CNTF)의 발현이 OTX2에 의해 유도된 반면 뇌-기원한 신경영양 인자(BDNF)는 변하지 않고 남았음을 나타내었다(도 8D).

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SEQUENCE LISTING <110> Universite Pierre et Marie Curie (Paris 6) Centre Nationale de la Recherche Scientifique INSERM (Institut National de la Sant?et de la Recherche Medicale) <120> TRANSGENIC RPE CELLS OVEREXPRESSING OTX2 FOR THE TREATMENT OF RETINAL DEGENERATION <130> IP20173207FR <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2 forward primer <400> 1 gtgtccaggc ggccgcaaaa atgatgtctt atctaaa 37 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2 reverse primer <400> 2 aatcggatcc cgatatctca caaaacctgg aatttcca 38 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR sequence forward primer <400> 3 ggaaccccta gtgatggagt t 21 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITR sequence reverse primer <400> 4 cggcctcagt gagcga 16 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNJ13 forward primer <400> 5 gcaggccttc catgatttta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 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180 185 190 Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met 195 200 205 His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr 210 215 220 Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr 225 230 235 240 Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gly Phe Asn Ser Thr Thr Asp Cys 245 250 255 Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala 260 265 270 Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val 275 280 285 Leu <210> 16 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Met Ser Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Tyr Ala Val Asn Gly Leu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Leu His Pro Ser Val Gly Tyr Pro 20 25 30 Gly Pro Trp Ala Ser Cys Pro Ala Ala Thr Pro Arg Lys Gln Arg Arg 35 40 45 Glu Arg Thr Thr Phe Thr Arg Ala Gln Leu Asp Val Leu Glu Ala Leu 50 55 60 Phe Ala Lys Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Phe Met Arg Glu Glu Val Ala 65 70 75 80 Leu Lys Ile Asn Leu Pro Glu Ser Arg Val Gln Val Trp Phe Lys Asn 85 90 95 Arg Arg Ala Lys Cys Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Asn Gly Gly 100 105 110 Gln Asn Lys Val Arg Pro Ala Lys Lys Lys Thr Ser Pro Ala Arg Glu 115 120 125 Val Ser Ser Glu Ser Gly Thr Ser Gly Gln Phe Thr Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Thr Ser Val Pro Thr Ile Ala Ser Ser Ser Ala Pro Val Ser Ile Trp 145 150 155 160 Ser Pro Ala Ser Ile Ser Pro Leu Ser Asp Pro Leu Ser Thr Ser Ser 165 170 175 Ser Cys Met Gln Arg Ser Tyr Pro Met Thr Tyr Thr Gln Ala Ser Gly 180 185 190 Tyr Ser Gln Gly Tyr Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Phe Gly Gly Met Asp 195 200 205 Cys Gly Ser Tyr Leu Thr Pro Met His His Gln Leu Pro Gly Pro Gly 210 215 220 Ala Thr Leu Ser Pro Met Gly Thr Asn Ala Val Thr Ser His Leu Asn 225 230 235 240 Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Gln Gly Tyr Gly Ala Ser Ser Leu 245 250 255 Gly Phe Asn Ser Thr Thr Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln Thr Ala 260 265 270 Ser Trp Lys Leu Asn Phe Asn Ala Asp Cys Leu Asp Tyr Lys Asp Gln 275 280 285 Thr Ser Ser Trp Lys Phe Gln Val Leu 290 295 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2 forward primer <400> 17 cttcctactt tgggggcatg gactgtg 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTX2 reverse primer <400> 18 gcattggtac ccatgggact gagtgtg 27

Claims

망막 변성(retinal degeneration)의 치료에 사용하기 위한 OTX2 단백질의 세포내 수준(level)을 증가시키도록 조작된(engineered) 망막 색소 내피(Retinal pigment epithelial:RPE) 세포.
청구항 1에 있어서,
상기 세포가 OTX2 단백질을 과-발현하도록 유전적으로 조작된 망막 색소 내피(RPE) 세포.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 OTX2 단백질이 천연의 포유동물의 OTX2 단백질, 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편인 RPE 세포.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 OTX2 단백질이 서열 번호: 15, 또는 서열 번호: 16에서 설정된 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하거나, 이로 이루어진, RPE 세포.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 OTX2 단백질이 서열 번호: 15, 또는 서열 번호: 16에서 설정된 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진, RPE 세포.
청구항 1 내지 청구항 5 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 RPE 세포가 줄기 세포, 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포의 RPE 세포로의 분화로부터 수득되는, RPE 세포.
청구항 2 내지 청구항 5 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 OTX2 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 서열(recombinant nucleic acid sequence)을 도입함으로써 유전적으로 조작되는, RPE 세포.
청구항 2 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 Otx2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 도입함으로써 유전적으로 조작되는, RPE 세포.
청구항 1 내지 청구항 8 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포내 OTX2 단백질의 수준이, 정규화(normalization) 후, 조작되지 않은 RPE 세포내 OTX2 단백질의 수준보다 적어도 1.5배 더 높은, RPE 세포.
청구항 1 내지 청구항 9 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 안내(intraocular) 주사, 바람직하게는 눈의 망막하 공간 내로의 주사에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는, RPE 세포.
OTX2 단백질의 수준을 증가시키도록 조작된, 바람직하게는 OTX2 단백질을 과-발현시키도록 유전적으로 조작된, RPE 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
청구항 11에 있어서,
안내 주사용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
망막 변성이 RPE 기능장애와 관련되는, 청구항 1 내지 청구항 10 중의 어느 한 항에 따르는 RPE 세포, 또는 청구항 11 또는 청구항 12 에 따르는 약제학적 조성물.
망막 변성이 색소성 망막염, 노화-관련 황반 변성, 망막 박리, 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 당뇨병성 망막증, 베스트병(Best's disease), 스타르가르트병(Stargardt's disease) 또는 맥락막결여(choroideremia)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환에 기인하는, 청구항 1 내지 청구항 10 및 청구항 13 중의 어느 한 항에 따르는 RPE 세포, 또는 청구항 11 내지 청구항 13 중의 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물.
망막 변성이 색소성 망막염에 기인하는, 청구항 1 내지 청구항 10 및 청구항 13 중의 어느 한 항에 따르는 RPE 세포, 또는 청구항 11 내지 청구항 13 중의 어느 한 항에 따르는 약제학적 조성물.