CN110520165A - 纤维软骨组织损伤治疗用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供新的纤维软骨组织损伤治疗用组合物。本发明提供应用于对象的纤维软骨组织损伤部的、含有褐藻酸的一价金属盐、更优选低内毒素褐藻酸的一价金属盐的纤维软骨组织损伤治疗用组合物。

Description

纤维软骨组织损伤治疗用组合物

技术领域

本发明涉及半月板等纤维软骨组织的损伤治疗用组合物。本发明还涉及纤维软骨组织损伤治疗用试剂盒和纤维软骨组织损伤的治疗方法。

背景技术

膝关节、手关节等以填补相对的关节软骨面间隔的形式具有被称作半月板(meniscus)或关节盘的组织。其中，膝关节中的半月板是位于股骨与胫骨之间的纤维组织丰富的纤维软骨。半月板具有：分散体重对关节施加的负荷的缓冲(cushion)作用；以及使关节的位置稳定，使股骨与胫骨的关节运动滑润地进行，以保护关节软骨的功能。正常的半月板是白色且均匀的半透明纤维软骨。半月板的大部分由细胞外的纤维性基质构成，混杂存在少数的软骨样细胞、纤维软骨样细胞，维持其生理功能。虽然生物化学构成与关节软骨类似，但其组成比例或分子水平的组成大不相同。在成人的正常膝半月板中，水分占湿重的70%以上。水分以外的主要成分为胶原蛋白，其占干重的60～90%，略高于关节软骨中的组成比例。胶原蛋白的90%为I型胶原蛋白。另一方面，与关节软骨相比，蛋白多糖量非常少，为关节软骨含量的1/10左右，仅为湿重的1%。即使在组成方面，半月板中存在着作为蛋白多糖单体的粘多糖侧链的硫酸皮肤素，这方面也与关节软骨不同(非专利文献1)。半月板分为外侧半月板和内侧半月板，在成人的正常膝半月板中，仅在大致边缘侧的10～30%可见血管，这部分通过血液循环汲取营养。除此以外的大部分通过关节液汲取营养。已知边缘部以外的内缘部是不存在血管的无血管区，因此几乎没有自身修复能力，特别是在形成了较大的半月板损伤的情况下，损伤部不会得到修复。另外，由于通常中老年的半月板发生变性，因此更加难以修复。

半月板损伤的形态是各种各样的，例如有水平撕裂、纵向撕裂、横向撕裂、桶柄撕裂、皮瓣撕裂等。作为针对这些损伤的治疗方法，往往采用半月板切除术或者半月板缝合术。半月板切除术或缝合术是通常经常采用的治疗方法，但预期会再生的区域限于半月板外缘部的血管区，如上所述，半月板内缘部的无血管区缺乏自身修复能力，几乎不会再生。另外，通常关于高龄者(老年人)的半月板损伤，由于半月板治愈能力低，且往往伴有变性，因此认为再生能力低，且缝合术的适应减少。在变形性关节炎所并发的半月板损伤或发生了交锁(locking)的例子中，即使施行缝合术，引起再撕裂的可能性也高，因此适合进行切除整形术。另外，已撕裂的半月板有时还伴有变性，认为再生能力更低。因此，在施行切除术后，由于形成一部分半月板完全缺损的状态，所以该部位的膝关节软骨会直接接触，若经过10年～20年，则关节变性进展、在许多情况下导致关节软骨的损伤。另外，据说若采用缝合术则在血管区半月板会相对再生，但再生的部分与正常半月板相比往往力学特性差，根据陈旧例或撕裂的形态，不能缝合的情况也较多。而且，在无血管区即使通过缝合物理性地使半月板的损伤部连接，间隙也不会由于再生而填满，所以若直接施加载荷，则周围的半月板会进一步损伤。因此，对于无血管区的撕裂等，几乎不采用缝合术。另外，有时还因年龄增加或关节的过度使用导致发生软骨变性而开始磨损关节表面，从所致的变形性关节炎的初期阶段起病情进展，结果也会导致在广泛区域的软骨缺损。

如此，由于关节半月板的自身修复能力不充分，所以还尝试了组合细胞或生物体组织等、或者生物适应性材料等这些物质的治疗方法等。例如可以列举：将自身半月板小薄片(細片)移植到半月板损伤部、并用筋膜包覆的治疗方法(非专利文献2)；含有约10～50重量%的平均粒径为约10～500μm的同种半月板粒子移植片和透明质酸钠、明胶、褐藻酸盐(アルギン酸塩，藻酸盐)等载体和交联剂的半月板修复组合物(专利文献1)；以使用了带有电荷的不饱和单体和电中性的不饱和单体的网眼结构的水凝胶作为基材的人工半月板(专利文献2)等。另外，还存在以下技术：对于兔半月板缺损，局部给予结合有辛伐他汀的明胶水凝胶的技术(非专利文献3)；对于山羊半月板的全层缺损，以(1)hIGF-1基因修饰的骨髓间质细胞和褐藻酸钙凝胶、(2)骨髓间质细胞和褐藻酸钙凝胶、(3)单独的褐藻酸钙凝胶、(4)对照形式进行处置看到了效果的技术(非专利文献4)等。在非专利文献4中，细胞-褐藻酸钙凝胶是通过将细胞-褐藻酸钠溶液和氯化钙同时注入到缺损而形成的。另外，所使用的褐藻酸钙凝胶的详情还不清楚，但表1中显示了：褐藻酸钙凝胶单独组没有检测到I型胶原蛋白染色的吸光度、每单位面积的纤维软骨细胞数和软骨样组织的百分比。非专利文献5中显示了：使用直径为2mm的冲头在由人得到的半月板中制作缺损，移植含有半月板纤维软骨细胞的BioMVM的海藻酸盐球体(Sphere)，在37℃、5% CO₂条件下培养3天。然而，像这样使用细胞或人组织的治疗方法存在着由生物体采集细胞或正常组织的患者方面的缺点或操作繁杂的课题。另外，再生具备了损伤前的组织组成或机械强度的半月板的技术还不充分。

另一方面，尝试着在软骨损伤部的透明软骨的再生中使用含有褐藻酸钠的组合物(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2011/031637；

专利文献2：日本专利第4709956号；

专利文献3：WO2008/102855。

非专利文献

非专利文献1：标准整形外科学第12版，株式会社医学书院(2015) 第62页；

非专利文献2：The American Journal of Sports Medicine, (2010) 第38卷, No.4,第740页-第748页；

非专利文献3：The American Journal of Sports Medicine, (2016) 第44卷, No.7,第1735-1743页；

非专利文献4：Clin Orthop Relat Res (2009) 467: 第3165-3174页；

非专利文献5：SCIENTIFIC REPORTS 6: 28170 DOI: 10.1038/srep28170 2016年6月。

发明内容

发明所要解决的课题

在上述状况下，本发明的课题在于提供：用于治疗半月板等纤维软骨组织的损伤的新的组合物。另外，还提供纤维软骨组织损伤治疗用试剂盒和纤维软骨组织损伤的治疗方法。

本发明的又一课题在于提供：即使不使用获取及操作繁杂的细胞或组织也能够以比较简便的手法进行治疗、同时能够再生与损伤前的纤维软骨组织的组成或机械强度接近的纤维软骨组织的组合物及其治疗方法。

用于解决课题的手段

作为半月板损伤的治疗方法，本发明人研究了利用生物适应性材料来填补半月板损伤部的可能性。以往，在该治疗领域中，研究了在体外制作人工半月板、再将其埋入关节内的方法，但半月板也是经常承受载荷的部位，在耐久性、功能性方面应该满足的原材料还未开发。另外，在使用这样的人工半月板的情况下，还存在着生物适应性的问题。另外，以往主要尝试了使用细胞或组织的治疗方法。本发明人发现了：通过将含有低内毒素褐藻酸钠的组合物应用于半月板损伤部，会促进半月板的再生。即，组织学评价、机械强度评价等结果，发现了与正常的半月板组织接近的半月板组织再生。出乎意料的是，在该治疗领域中，不使用细胞或人组织，也得到了如本发明的实施例中所示的显著的再生效果。本发明人基于这样的见解进一步反复研究，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[0] 纤维软骨组织损伤治疗用组合物，该组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部，含有褐藻酸的一价金属盐。

[1] 纤维软骨组织损伤治疗用组合物，该组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部，含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐。

[1-1] [0]～[1]中任一项所述的组合物，其中，上述组合物在应用于纤维软骨组织损伤部时具有流动性、或者为片状或粉末状。

[2] [0]～[1-1]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物以应用后将至少一部分固化的方式使用，在应用于纤维软骨组织损伤部时具有流动性。

[2-1] [1-1]～[2]中任一项所述的组合物，其中，上述组合物应用于纤维软骨组织损伤部时是指组合物与纤维软骨组织损伤部接触时。

[2-2] [0]～[2-1]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物以应用于纤维软骨组织后将至少一部分固化的方式使用。

[3] [1-1]～[2-2]中任一项所述的组合物，其中，通过使交联剂与上述组合物表面的至少一部分接触来进行上述具有流动性的组合物的固化。

[3-1] 纤维软骨组织损伤治疗用组合物，其是应用于对象的纤维软骨组织损伤部的纤维软骨组织损伤治疗用组合物，该组合物含有褐藻酸的一价金属盐，在与对象的纤维软骨组织损伤部接触时具有流动性，通过使交联剂与该组合物表面的至少一部分接触来进行该组合物的固化。

[4] [1-1]～[3]所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物的表观粘度通过使用锥板式粘度计在20℃的条件下测定为100mPa·s～30000mPa·s。

[5-0] [0]～[4]中任一项所述的组合物，其中，上述褐藻酸的一价金属盐通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)为3万以上。

[5] [1]～[4]中任一项所述的组合物，其中，上述低内毒素褐藻酸的一价金属盐通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)为3万以上。

[6-0] [1-1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物中的褐藻酸的一价金属盐的浓度为0.1w/w%～5w/w%。

[6] [1-1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物中的低内毒素褐藻酸的一价金属盐的浓度为0.1w/w%～5w/w%。

[7] [1-1]～[6]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物在应用于上述对象的纤维软骨组织损伤部之前不含使上述组合物固化的量的交联剂。

[7-1] [2-1]～[6]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物在与上述对象的纤维软骨组织损伤部接触时不含使上述组合物固化的量的交联剂。

[8] [3]～[7]中任一项所述的组合物，其中，与上述交联剂的接触是在上述组合物应用于上述对象的纤维软骨组织损伤部之后进行的。

[8-1] [3]～[7-1]中任一项所述的组合物，其中，用于使上述具有流动性的组合物固化的、该组合物与交联剂的接触是在该组合物与对象的纤维软骨组织损伤部接触后进行。

[9] [1-1]～[8-1]中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物在将组合物于20℃下静置1小时后具有能够使用21G的注射针进行注入的流动性。

[10] [0]～[9]中任一项所述的组合物，其中，上述组合物不含细胞。

[11] [3]～[10]中任一项所述的组合物，其中，上述交联剂为二价以上的金属离子化合物。

[12] [0]～[11]中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织损伤部发生在纤维软骨组织的至少一部分。

[13] [0]～[12]中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织为选自半月板、三角纤维软骨、关节盘和椎间盘的纤维环的至少一种。

[14] [0]～[13]中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织损伤为选自半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板、分离性骨软骨炎、软骨变性、关节内韧带损伤、运动外伤、变形性关节炎、以及三角纤维软骨复合体损伤和/或变性的至少一种状态或疾病。

[15] [0]～[14]中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织损伤部为所缝合的纤维软骨组织损伤部。

[15-1] [0]～[15]中任一项所述的组合物，其中，上述组合物与缝合术并用，应用于纤维软骨组织损伤部。

[16] [0]～[15-1]中任一项所述的组合物，其中，上述组合物在应用于纤维软骨组织损伤部之前为干燥状态或溶液状态。

[17] [16]所述的组合物，其中，干燥状态的上述组合物为冷冻干燥体。

[18] [0]～[17]中任一项所述的组合物，其特征在于：该组合物在包括下述工序的纤维软骨组织损伤部的治疗方法中使用，

工序(a)：通过切开、关节镜或内窥镜形成可看清上述纤维软骨组织损伤部的状态；

工序(b)：根据需要除去上述纤维软骨组织损伤部及其边缘部的不需要的组织；

工序(c)：根据需要缝合上述纤维软骨组织损伤部；

工序(d)：将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于上述纤维软骨组织损伤部；

工序(e)：根据需要在所应用的上述组合物的表面添加交联剂，静置一定时间使上述组合物与上述交联剂接触；

工序(f)：根据需要清洗添加了上述交联剂的部位；以及

工序(g)：根据需要封闭因切开、或者插入关节镜、内窥镜或其他器具而产生的开口部。

[19-0] 纤维软骨组织损伤部治疗用试剂盒，该试剂盒至少包括[0]～[18]中任一项所述的组合物。

[19] 纤维软骨组织损伤部治疗用试剂盒，该试剂盒至少包括[2]～[18]中任一项所述的组合物和交联剂。

[20-0] 纤维软骨组织损伤的治疗方法，该治疗方法至少包括：将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部的工序。

[20] 纤维软骨组织损伤部的治疗方法，该治疗方法包括下述工序：

工序(a)：通过切开、关节镜或内窥镜形成可看清上述纤维软骨组织损伤部的状态；

工序(b)：根据需要除去上述纤维软骨组织损伤部及其边缘部的不需要的组织；

工序(c)：根据需要缝合上述纤维软骨组织损伤部；

工序(d)：将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于上述纤维软骨组织损伤部；

工序(e)：根据需要在所应用的上述组合物的表面添加交联剂，静置一定时间使上述组合物与上述交联剂接触；

工序(f)：根据需要清洗添加了上述交联剂的部位；以及

工序(g)：根据需要封闭因切开、或者插入关节镜、内窥镜或其他器具而产生的开口部。

[21] 褐藻酸的一价金属盐，其用于在将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部的纤维软骨组织损伤的治疗中使用。

[22] [0]～[21]中任一项所述的组合物，其中，上述褐藻酸的一价金属盐为低内毒素褐藻酸的一价金属盐。

发明效果

本发明提供新的纤维软骨组织损伤治疗用组合物。根据本发明的优选方案的组合物，可实现半月板损伤部中的半月板组织的再生/修复，特别是以富含纤维软骨的方式进行再生/修复，并且可恢复机械强度。另外，在本发明的几个方案中，本发明的组合物能够在以半月板为代表的纤维软骨组织的损伤治疗中伴有纤维软骨的显著再生而使用。而且，该治疗效果可应用于较大缺损的修复，对无血管区的损伤修复也能够起效。另外，根据本发明，能够提供纤维软骨组织损伤部治疗用试剂盒和纤维软骨组织损伤的治疗方法。

在本发明的优选方案之一中，本发明的组合物还可用于：选自半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板、分离性骨软骨炎、软骨变性、关节内韧带损伤、运动外伤、变形性关节炎、以及三角纤维软骨复合体损伤和/或变性的至少一种状态或疾病的预防、治疗或复发抑制。另外，本发明的优选方案的组合物在应用于损伤部时具有适度的流动性、或者为片状或粉末状，因此对于形状复杂的损伤部或撕裂部也能够以良好的密合性进行填充，不存在组合物与损伤部的间隙。另外，即使在利用交联剂使组合物的表面固化之前也难以从应用/填充部位流出，即使手术时的患处(损伤部/缺损部)不是水平的也可使用。而且，根据需要可与缝合术组合使用，促进损伤部的再生。

本发明的组合物满足上述的任意一种以上的效果。

附图说明

[图1] 图1A)是半月板损伤模型的示意图，图1B)是半月板损伤的照片，图1C)是低内毒素褐藻酸凝胶的照片。

[图2] 图2显示肉眼下的观察结果。图2A)是实施例1中从做手术起3、6和12周时回收的半月板的照片，图2B)是以评分显示从做手术起3、6和12周时回收的半月板的损伤部修复程度的图。

[图3] 图3显示组织学评价结果。图3A)是将实施例1中从做手术起3、6和12周时回收的半月板用H＆E、番红-O、甲苯胺蓝进行了染色的半月板的照片、以及进行了相同染色处理的正常半月板的照片，图3B)是以组织学评分显示从做手术起3、6和12周时回收的半月板的损伤部修复程度的图。

[图4] 图4是显示在实施例1中对做手术后6周时的组I (对照组)、组II (治疗组)、做手术后12周时的组II (治疗组)和正常组这4组的半月板以n=6进行机械强度评价的结果的图。

[图5] 图5是显示在实施例1中对做手术后6周时的组I (对照组)、组II (治疗组)、做手术后12周时的组II (治疗组)和正常组这4组的半月板以n=6进行机械强度评价的结果的图。

具体实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

1. 本发明的组合物

本发明涉及在纤维软骨组织的损伤部、更优选半月板损伤部的治疗中优选使用的组合物。

本发明的组合物是应用于对象的纤维软骨组织损伤部、更优选半月板损伤部的、含有褐藻酸的一价金属盐的纤维软骨组织损伤治疗用组合物(在本说明书中，有时称作“本发明的组合物”)。本发明的组合物进一步优选为含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐的纤维软骨组织损伤治疗用组合物。

“低内毒素”、“褐藻酸的一价金属盐”如后所述。

本发明中，“纤维软骨组织”是指含有较多的纤维软骨的组织，例如可以列举半月板、三角纤维软骨、关节盘、椎间盘的纤维环等。

“半月板”是位于膝关节部的纤维性软骨，分为内侧半月板和外侧半月板，起到分散胫骨与股骨之间的压力、使膝关节的滑动良好进行的作用。半月板进一步分为外缘部和内缘部。另外，内侧半月板可以分为前角、前段、中段、后段和后角，外侧半月板可以分为前段、体部和后段。半月板由少数细胞、含有胶原蛋白及蛋白多糖的细胞外基质和水构成，内缘部几乎没有血管分布。半月板富含I型胶原蛋白和II型胶原蛋白，具有被抗I型胶原蛋白抗体和抗II型胶原蛋白抗体染色、被可染色蛋白多糖的番红-O染色成红色等特征。半月板也称为“关节半月”、“关节半月板”等。

本发明中，“纤维软骨组织损伤”是指因年龄增加或外伤、其他各种因素导致半月板等纤维软骨组织受到伤害的状态，包括纤维软骨组织发生变性的状态、或者组织功能下降的状态。在变形性关节炎等疾病中有时也可见半月板损伤。另外，本发明中将具有纤维软骨组织损伤的部位称为“纤维软骨组织损伤部”，例如将具有半月板损伤的部位称为“半月板损伤部”。在本发明的几个方案中，纤维软骨组织损伤部发生在纤维软骨组织的至少一部分。在本发明的几个方案中，本发明涉及用于治疗该半月板损伤部的半月板损伤治疗用组合物。

在本发明中，“纤维软骨组织缺损部”是指在纤维软骨组织损伤部中、其一部分缺失的部分，是指纤维软骨组织的空洞部以及形成该空洞部的周围的组织。在本发明的几个方案中，本发明的治疗方法优选用于“纤维软骨组织缺损部”、特别是“半月板缺损部”的治疗。在本发明中，“纤维软骨组织缺损”是“纤维软骨组织损伤”的一个方案，“纤维软骨组织缺损”包含在“纤维软骨组织损伤”的术语内。

在本发明中，“纤维软骨组织损伤”包括：纤维软骨组织和/或其周边组织(滑膜、关节囊、半月板下骨等)受到机械刺激或炎症反应的伤害而发生的疾病(在本说明书中，还称为“纤维软骨组织相关疾病”)。具体而言，“纤维软骨组织相关疾病”例如可以列举半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板、分离性骨软骨炎、软骨变性、关节内韧带损伤、运动外伤、变形性关节炎 、以及三角纤维软骨复合体损伤和/或变性等，但并不限于这些。在本发明的几个方案中，本发明的治疗方法即使在纤维软骨组织相关疾病中、特别是与半月板相关的疾病中也优选使用。“与半月板相关的疾病”例如可以列举半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板等，但并不限于此。在本发明中，因纤维软骨组织相关疾病而发生的纤维软骨组织的损伤部是“纤维软骨组织损伤部”的一个方案。

“半月板损伤”是指因外伤或半月板的变性等使半月板的至少一部分受到损伤的疾病。在本说明书中，“损伤”还包括“缺损”及“撕裂”。“撕裂”包括“水平撕裂”、“纵向撕裂”、“横向撕裂”、“变性撕裂”等各种形式的撕裂。

“外伤性半月板损伤”是“半月板损伤”之一，是因运动中的接触或事故等来自外界的强烈冲击使半月板的至少一部分受到损伤的疾病。

“半月板变性”是指因年龄增加等导致半月板的细胞数、含水量、细胞外基质(I型和II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖等)等下降，发生形态的变化，导致功能下降的疾病，若病态进展则无法发挥半月板的作为减震体的功能。

半月板通常形成月牙形，但“盘状半月板”是指半月板先天性地为半月型、且半月板介于软骨与软骨之间的状态。在本说明书中，“盘状半月板”还包括盘状半月所伴随的半月板的损伤或疼痛、交锁等症状。

“分离性骨软骨炎”是指关节中软骨剥落的伤害，有时还合并盘状半月。

“软骨变性”是指因年龄增加等原因导致软骨发生变性的疾病。

“关节内韧带损伤”是指，因运动外伤或事故等对关节施加较大的力时，根据其外力的方向发生韧带损伤的疾病。

“运动外伤”是指在运动等活动中跌倒或碰撞等对身体施加剧烈的大力而导致组织损伤的疾病。

“变形性关节炎”是指因年龄增加或关节的过度使用导致关节软骨磨损、减少的退行性疾病，有时还以半月板损伤等作为原因。

“三角纤维软骨复合体损伤和/或变性”是指存在于手关节部(手腕)的小指侧(尺骨与腕骨之间)的软部组织的损伤和/或变性。三角纤维软骨复合体(TFCC：TriangularFibrocartilage Complex)由关节盘和几个韧带构成。

纤维软骨组织的损伤有时会根据损伤部的状态或病变程度进行分类、分级表示。在本说明书的病期分类中，等级(grade)、阶段(stage)的术语以相同的含义使用。

“无血管区”是指纤维软骨组织中几乎没有血管分布的部分。虽然在内侧和外侧半月板的外缘部有血管分布，但半月板内缘部为无血管区，认为缺乏自身修复能力/组织再生。在本发明的一个方案中，对于半月板的无血管区发生的半月板损伤优选使用本发明的组合物。

“对象”是指人或人以外的生物、例如鸟和非人哺乳动物(例如牛、猴、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、狗、兔、绵羊和马)。

“应用”是指将本发明的组合物以足以填补纤维软骨组织的损伤部的变性部分、缩小部分、除去部分、缺损部等的量填充在纤维软骨组织损伤部。

“将至少一部分固化”如后所述。

“含有褐藻酸的一价金属盐”是指，本发明的组合物含有在所应用的纤维软骨组织损伤中足以使纤维软骨组织损伤再生的量的褐藻酸的一价金属盐。另外，“含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐”是指，本发明的组合物含有在所应用的纤维软骨组织损伤中足以使纤维软骨组织损伤再生的量的低内毒素褐藻酸的一价金属盐。

“具有流动性”如“8.本发明的组合物的应用”中所述。

本发明的组合物可以使用溶剂以溶液状态提供，也可以以冷冻干燥体(特别是冷冻干燥粉末)等干燥状态提供，或者可以以片状、粉末状等提供。在以冷冻干燥体的形式提供的情况下，本发明的组合物在应用时可以使用溶剂以溶液状等具有流动性的状态使用。溶剂只要是可应用于生物体的溶剂，则没有特别限定，例如可以列举注射用水、纯净水、蒸馏水、离子交换水(或去离子水)、MilliQ水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。优选为可用于治疗人和动物的注射用水、蒸馏水、生理盐水等。

在将本发明的组合物以溶液状态应用于纤维软骨组织损伤部的情况下，能够以良好的密合性填充至损伤部的内部。另外，在缝合损伤部时，通过以溶液状态应用于所缝合的损伤部，可以填补缝合部位的间隙、或者高效率地使表面凝固。本发明的组合物通过以溶液状态进行应用，在半月板的修复手术时会促进基于撕裂部位缝合的组织修复，可以期待预防因载荷或运动等引起的再损伤的效果。另外，在将本发明的组合物以溶液状态(包括溶胶状态)进行应用的情况下，即使在关节镜下也能够以溶胶状态注入关节腔内，保持适度的粘性、密合性和弹性，发挥作为半月板等纤维软骨组织的损伤部的填补材料的功能。如此，本发明的优选方案的组合物为在应用于纤维软骨组织损伤部时、更详细而言在与纤维软骨组织损伤部接触时具有流动性的形态。在本说明书中，“与纤维软骨组织损伤部接触时具有流动性”是指，在向纤维软骨组织损伤部填充本发明的组合物时该组合物在最初接触该损伤部时具有流动性。因此，不包括通过将本发明的组合物和交联剂同时注入到损伤部等而导致该组合物在与该损伤部接触时失去流动性这样的情形。另外，在本发明的几个方案中，如下所述，由于本发明的组合物不使用细胞即可进行半月板修复，因此在临床现场可以简便地使用。另外，本发明的组合物还可与普通的半月板损伤的手术手法或其他治疗方法并用来进行应用。

还可以使用喷雾器等将粉末状或片状的本发明组合物应用于纤维软骨组织损伤部。粉末状或片状的组合物因与损伤部的粘接性好而容易操作，具有与溶液状组合物同样对于像撕裂部位这样的损伤部也容易应用的优点。

2. 褐藻酸的一价金属盐

“褐藻酸的一价金属盐”是通过将褐藻酸的6位羧酸的氢原子与Na⁺或K⁺等一价金属离子进行离子交换而制得的水溶性盐。作为褐藻酸的一价金属盐，具体而言，可以列举褐藻酸钠、褐藻酸钾等，特别是优选可通过市售品获取的褐藻酸钠。褐藻酸的一价金属盐的溶液在与交联剂混合时形成凝胶。

本发明中使用的“褐藻酸”是生物降解性的高分子多糖类，是D-甘露糖醛酸(M)与L-古罗糖醛酸(G)这两种糖醛酸聚合成直链状的聚合物。更具体而言，褐藻酸是D-甘露糖醛酸的均聚物组份(MM组份)、L-古罗糖醛酸的均聚物组份(GG组份)和D-甘露糖醛酸与L-古罗糖醛酸无规排列而成的组份(MG组份)任意结合而得到的嵌段共聚物。褐藻酸的D-甘露糖醛酸与L-古罗糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等来源生物的种类而不同，另外还受到其生物的生长发育场所或季节的影响，遍布从M/G比为约0.1的高G型到M/G比为约5的高M型的较广范围。

褐藻酸的一价金属盐为高分子多糖类，难以准确地确定分子量，但若分子量过低则粘度降低，与应用部位的周边组织的密合性有可能减弱，另外，分子量过高的褐藻酸难以制备，同时会产生溶解性降低、在形成溶液状时粘度过高而操作性变差、在长期保存中难以维持物理性质等问题，因此通常以重均分子量计为1万～1000万、优选为2万～800万、更优选为5万～500万的范围。在本说明书中，关于使用“～”显示的数值范围，显示分别包括“～”前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。

另一方面，在来自天然物的高分子物质的分子量测定中，已知利用测定方法能使值产生差异。例如，根据本发明的实施例中显示的效果，通过凝胶渗透层析(GPC)或凝胶过滤层析(还将它们统称为尺寸排阻层析)测定的重均分子量优选为10万以上、更优选为50万以上，另外，优选为500万以下、更优选为300万以下。其优选范围是10万～500万，更优选为50万～350万。

另外，例如根据凝胶渗透层析(GPC)与多角度光散射检测器(Multi Angle LightScattering：MALS)组合而成的GPC-MALS法，可以测定绝对重均分子量。根据本发明的实施例中显示的效果，通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)优选为1万以上，更优选3万以上，进一步优选为9万以上，另外，优选为100万以下、更优选为80万以下、进一步优选为70万以下、尤其优选为50万以下。其优选范围是1万～100万、更优选为8万～80万、更进一步优选为9万～70万、尤其优选为9万～50万。

通常，在按照如上所述的方法算出高分子多糖类的分子量的情况下，能够产生10～20%以上的测定误差。例如，如果是40万则能够在32～48万、如果是50万则能够在40～60万、如果是100万则能够在80～120万左右的范围内发生值的变动。

褐藻酸的一价金属盐的分子量测定可以按照常规方法来进行。

在分子量测定中采用凝胶渗透层析的情况下，代表性的条件如本说明书的实施例所述。柱例如可以使用GMPW-XL×2+G2500PW-XL (7.8mm I.D.×300mm)，洗脱液例如可以是200mM的硝酸钠水溶液，可以使用普鲁兰多糖作为分子量标准。

在分子量测定中采用GPC-MALS的情况下，代表性的条件如本说明书的实施例所述。作为检测器，例如可以使用RI检测器和光散射检测器(MALS)。

褐藻酸的一价金属盐在由褐藻类提取的初期其分子量大、粘度高，但在热干燥、纯化等过程中分子量变小、粘度降低。通过制备工序的温度等条件管理、作为原料的褐藻类的选择、制备工序中的分子量的分馏等方法，可以制备分子量不同的褐藻酸的一价金属盐。而且，通过与具有不同的分子量或粘度的其他批次的褐藻酸的一价金属盐混合，也可以形成具有目标分子量的褐藻酸的一价金属盐。

本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐，优选将褐藻酸的一价金属盐溶解于MilliQ水形成1w/w%浓度的溶液，使用锥板式粘度计在20℃的条件下进行粘度测定时的表观粘度优选为10mPa·s～800mPa·s，更优选为30mPa·s～800mPa·s，进一步优选为50mPa·s～600mPa·s。表观粘度的测定条件优选按照后述的条件。需要说明的是，在本说明书中“表观粘度”有时仅称为“粘度”。

本发明中使用的褐藻酸可以来自天然也可以是合成物，但优选来自天然。作为来自天然的褐藻酸，例如可以列举由褐藻类提取的褐藻酸。含有褐藻酸的褐藻类在世界各地的沿海地区茂密生长，但实际上可用作褐藻酸原料的海藻是有限定的，以南美的雷松藻(Lessonia)、北美的巨藻(Macrocystis)、欧州的海带(Laminaria)及泡叶藻(Ascophyllum)、澳大利亚的公牛藻(Durvillaea)等为代表。作为褐藻酸原料的褐藻类例如可以列举：雷松藻(Lessonia)属、巨藻(Macrocystis)属、海带(Laminaria)属(昆布属)、泡叶藻(Ascophyllum)属、公牛藻(Durvillea)属、爱氏藻(Eisenia)属、昆布(Ecklonia)属等。

3. 低内毒素处理

本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐优选为低内毒素的褐藻酸的一价金属盐。低内毒素是指内毒素水平低至实质上不会引起炎症或发热的程度。更优选为进行了低内毒素处理的褐藻酸的一价金属盐。

低内毒素处理可以通过公知方法或者基于此的方法来进行。例如可以通过菅等人的纯化透明质酸钠的方法(例如参照日本特开平9-324001号公报等)；吉田等人的纯化β1,3-葡聚糖的方法(例如参照日本特开平8-269102号公报等)；William等人的纯化褐藻酸盐、结冷胶等生物高分子盐的方法(例如参照日本特表2002-530440号公报等)；James等人的纯化多糖的方法(例如参照国际公开第93/13136号小册子等)；Lewis等人的方法(例如参照美国专利第5589591号说明书等)；Herman Frank等人的纯化褐藻酸盐的方法(例如参照ApplMicrobiol Biotechnol (1994)40：638-643等)等或者基于这些方法的方法来实施。本发明的低内毒素处理并不限于这些，可以通过清洗、滤器(去除内毒素的滤器或带电的滤器等)过滤、超滤、使用柱(内毒素吸附亲和柱、凝胶过滤柱、利用离子交换树脂的柱等)的纯化、吸附于疏水性物质、树脂或活性炭等、有机溶剂处理(利用有机溶剂的提取、利用添加有机溶剂的析出/沉淀等)、表面活性剂处理(例如参照日本特开2005-036036号公报等)等公知方法或者适当组合这些方法来实施。在这些处理工序中可以适当组合离心分离等公知的方法。期望结合褐藻酸的种类等适当选择。

内毒素水平可通过公知的方法来确认，例如可以通过利用鲎试剂(LAL)的方法、使用Endospecy(注册商标)ES-24S套件(生物化学工业株式会社)的方法等进行测定。

对本发明组合物中所含的褐藻酸的一价金属盐的内毒素处理方法没有特别限定，作为其结果，在利用鲎试剂(LAL)进行内毒素测定的情况下，褐藻酸的一价金属盐的内毒素含量优选为500内毒素单位(EU)/g以下，进一步优选为100EU/g以下，尤其优选为50EU/g以下、特别是30EU/g以下。进行了低内毒素处理的褐藻酸钠可以通过例如Sea Matrix (注册商标)(持田制药株式会社)、PRONOVA^TMUP LVG (FMC BioPolymer)等市售品来获取。

4. 褐藻酸的一价金属盐溶液的调制

本发明的组合物可以使用褐藻酸的一价金属盐的溶液来调制。褐藻酸的一价金属盐的溶液可以通过公知方法或者基于此的方法进行调制。即，本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐可以使用上述褐藻类，通过酸法、钙法等公知方法来制备。具体而言，例如，通过使用碳酸钠水溶液等碱性水溶液由这些褐藻类进行提取后，添加酸(例如盐酸、硫酸等)可以得到褐藻酸，再通过褐藻酸的离子交换即可得到褐藻酸的盐。如上所述，进行低内毒素处理。褐藻酸的一价金属盐的溶剂只要是可适用于生物体的溶剂，则没有特别限定，例如可以列举纯净水、蒸馏水、离子交换水、MilliQ水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。这些溶剂优选进行灭菌，优选进行了低内毒素处理的溶剂。例如，可以对MilliQ水进行过滤灭菌而使用。

本发明的组合物在以冷冻干燥体等干燥状态提供的情况下，也可以使用上述溶剂调制成具有流动性的溶液。

另外，用于得到本发明组合物的操作均优选在内毒素水平和细菌水平低的环境下进行。例如，操作优选在净化台上使用灭菌器具来进行，可以将所用器具用市售的内毒素除去剂进行处理。

5. 本发明的组合物的表观粘度

本发明的几个方案的组合物为具有流动性的液体状、即溶液状。本发明的优选方案的组合物在应用于纤维软骨组织损伤部位时具有流动性。在更优选的方案中，本发明的组合物在与纤维软骨组织损伤部接触时具有流动性。在本发明的方案之一中，优选本发明的组合物具有将组合物在20℃下静置1小时后可以用21G的注射针注入的流动性。该方案的本发明组合物的表观粘度只要能够得到本发明的效果，则没有特别限定，若粘度过低，则与应用部位的周边组织的密合性有可能减弱，因此优选为10mPa·s以上、更优选为100mPa·s以上、进一步优选为200mPa·s以上、尤其优选为400mPa·s以上。若表观粘度过高，则操作性有可能变差，因此优选为50000mPa·s以下、更优选为20000mPa·s以下、进一步优选为10000mPa·s以下。表观粘度为20000mPa·s以下时，通过注射器等的应用更容易进行。然而，即使表观粘度为20000mPa·s以上，也能够采用加压型或电动型的填充器具或其他手段进行应用。本发明组合物的优选范围是10mPa·s～50000mPa·s、更优选为100mPa·s～30000mPa·s、进一步优选为200mPa·s～20000mPa·s，更进一步为优选400mPa·s～20000mPa·s、尤其优选为700mPa·s～20000mPa·s。在另一优选方案中，可以是500mPa·s～10000mPa·s或者2000mPa·s～10000mPa·s。本发明的几个方案的组合物具有还能够通过注射器等应用于对象的粘度。

含有褐藻酸类的水溶液等褐藻酸的一价金属盐的溶液状态的、或者具有流动性的组合物的表观粘度的测定可以按照常规方法来进行。例如，可以使用旋转粘度计法的同轴双重圆筒形旋转粘度计、单一圆筒形旋转粘度计(Brookfield型粘度计)、圆锥-平板形旋转粘度计(锥板式粘度计)等进行测定。优选期望按照日本药典(第16版)的粘度测定法。在本发明中，粘度测定期望在20℃的条件下进行。如后所述，在本发明的组合物含有细胞等不溶解于溶剂的物质的情况下，为了准确进行粘度测定，组合物的表观粘度优选为不含细胞等的状态的表观粘度。

在本发明中，关于含有褐藻酸的一价金属盐的溶液状态的、或者具有流动性的组合物的表观粘度的测定，特别是，更期望使用锥板式粘度计进行测定。例如，期望在如下所述的测定条件下进行测定。样品溶液的调制使用MilliQ水来进行。测定温度设为20℃。锥板式粘度计的转速在测定褐藻酸的一价金属盐的1%溶液时设为1rpm、测定2%溶液时设为0.5rpm，以此为标准进行确定。关于读取时间，在测定褐藻酸的一价金属盐的1%溶液的情况下测定2分钟，设为开始1分钟～2分钟的平均值。在测定2%溶液的情况下测定2.5分钟，设为开始0.5分钟～2.5分钟的平均值。试验值设为3次测定的平均值。

本发明的溶液状态的、或者具有流动性的组合物的表观粘度例如可以通过控制褐藻酸的一价金属盐的浓度、分子量或M/G比等进行调整。

关于褐藻酸的一价金属盐溶液的表观粘度，在溶液中的褐藻酸一价金属盐浓度高的情况下粘度高、而在浓度低的情况下粘度降低。另外，在褐藻酸一价金属盐的分子量大的情况下粘度高、而在分子量小的情况下粘度降低。

由于褐藻酸的一价金属盐溶液的表观粘度会受到M/G比的影响，因此例如可以根据溶液的粘度等适当选择具有优选的M/G比的褐藻酸。本发明中使用的褐藻酸的M/G比为约0.1～约5.0，优选为约0.1～约4.0，更优选为约0.2～约3.5。

如上所述，由于M/G比主要由海藻的种类来决定等，所以用作原料的褐藻类的种类会给褐藻酸的一价金属盐溶液的粘度带来影响。作为本发明中使用的褐藻酸，优选来自雷松藻属、巨藻属、海带属、泡叶藻属、公牛藻属的褐藻，更优选来自雷松藻属的褐藻，特别优选来自淡黑巨海藻(Lessonia nigrescens)。

6. 本发明组合物的调制

本发明的组合物以含有褐藻酸的一价金属盐为特征，更优选以含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐为特征。本发明人首次发现了：在将低内毒素褐藻酸的一价金属盐填充在对象的半月板损伤部的情况下，褐藻酸的一价金属盐本身发挥半月板损伤部的再生和/或治疗效果。含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐的组合物只要以在应用于患处时能够发挥纤维软骨组织损伤部的再生和/或治疗效果的量含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐即可。本发明的组合物例如可以是溶液状、片状、粉末状等。

本发明的溶液状的、或者具有流动性的组合物例如可以使用上述的褐藻酸的一价金属盐溶液来调制。本发明的溶液状组合物在本说明书中也称作“具有流动性的组合物”。在该方案中，优选褐藻酸的一价金属盐的浓度至少为组合物整体的0.1w/v%以上、更优选为0.5w/v%以上、进一步优选为1w/v%以上，另外，优选为0.1w/v%～5w/v%、更优选为0.5w/v%～5w/v%、进一步优选为1w/v%～5w/v%、更进一步优选1w/v%～3w/v%、尤其优选为1.5w/v%～2.5w/v%。另外，在另一方案中，本发明组合物中的褐藻酸的一价金属盐浓度优选为0.1w/w%以上、更优选0.5w/w%以上、进一步优选为1w/w%以上，另外，优选为0.1w/w%～5w/w%、更优选为0.5w/w%～5w/w%、进一步优选为1w/w%～5w/w%、更进一步优选为1w/w%～3w/w%、尤其优选为1.5w/w%～2.5w/w%。

对本发明的片(薄片)状的组合物没有特别限定，例如可以将含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐的溶胶状或凝胶状的组合物通过冷冻干燥等处理形成干燥体，通过削刮或者粉碎该干燥体等的处理来进行调制。含有褐藻酸的一价金属盐的溶胶状的组合物例如可以使用如上所述的褐藻酸的一价金属盐的溶液，对溶液的浓度没有特别限定，例如可以是0.5w/w%～5w/w%。关于含有褐藻酸一价金属盐的凝胶状的组合物，例如可以在褐藻酸一价金属盐的溶液中加入后述的交联剂进行均匀混合，形成凝胶状。片的尺寸可以根据损伤部位的形状或性状等适当调节。例如，在与形状复杂的人撕裂部密合的情况下，片状的组合物的最大尺寸可以设为5mm以下。

另外，对本发明的粉末状的组合物没有特别限定，例如可以通过将上述的含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐的干燥体进行微细地粉碎等处理来调制。这些调制可以按照常规方法来进行。

本发明的几个方案的组合物可以使用细胞。

作为细胞，只要是对半月板等纤维软骨组织再生有效的细胞，则没有特别限定，例如可以列举半月板细胞、半月板前体细胞、纤维软骨细胞、纤维软骨样细胞、软骨细胞、软骨样细胞、软骨前体细胞、滑膜细胞、滑膜干细胞、干细胞、间质细胞、间充质干细胞、骨髓间质细胞、间充质细胞、ES细胞、iPS细胞等。更优选为选自骨髓间充质干细胞、骨髓间质细胞、半月板细胞、半月板前体细胞、纤维软骨细胞、纤维软骨样细胞、软骨细胞、软骨样细胞、软骨前体细胞、滑膜细胞和滑膜干细胞的至少一种细胞。需要说明的是，这些细胞可以是自体、异体、同种、异种。另外，这些细胞可以是如后所述的导入了促进细胞生长的因子的基因等的细胞。

“使用细胞”是指，根据需要由半月板、软骨、滑膜、骨髓、脂肪组织、脐带血等回收目标细胞，进行浓缩处理或者进行培养而增量的处理，将所调制的细胞添加在本发明的组合物中。具体而言，例如是指使本发明的组合物含有1×10⁴个/ml以上、或1×10⁵个/ml以上、优选1×10⁴个/ml～1×10⁸个/ml的细胞。细胞可由市场获取而使用。需要说明的是，在本发明的另几个方案中，本发明的组合物还优选不含细胞的方案。在另几个方案中，本发明的组合物还优选不含骨髓间质细胞的方案，另外，还优选不含导入了IGF-1基因的骨髓间质细胞的方案。在另一方案中，本发明的组合物还优选不含纤维软骨细胞和/或纤维软骨样细胞的方案。即使在本发明的组合物不含这些细胞的情况下，纤维软骨组织损伤部的再生也充分良好，不存在获取困难或操作的问题，安全性也高。

本发明的几个方案的组合物可以含有包含半月板等纤维软骨组织的小薄片、纤维蛋白凝块、富含血小板血浆(PRP：Platelet Rich Plasma)等生物体成分的物质。在本说明书中，“半月板等纤维软骨组织的小薄片”是指通过粉碎等处理将半月板等纤维软骨组织的尺寸变小而得到的物质，对处理方法或其尺寸没有特别限定。“纤维蛋白凝块”是指可由患者的外周血制作的凝血块。“富含血小板血浆”是指含有较普通血液多的血小板的血浆。需要说明的是，本发明的几个方案的组合物不含包含这些生物体成分的物质。本发明的几个方案的组合物不含半月板等纤维软骨组织的小薄片。即使在这样的情况下，纤维软骨组织损伤部的再生也充分良好。这些物质可以利用常规方法进行调制、使用。

本发明的组合物还可以包含促进细胞生长的因子。作为这样的因子，例如可以列举BMP、FGF、VEGF (血管内皮生长因子，Vascular Endothelial Growth Factor)、HGF、TGF-β、IGF-1、PDGF (血小板衍生生长因子，Platelet-Derived Growth Factor)、CDMP (软骨衍生形态发生蛋白，cartilage-derived-morphogenetic protein)、KGF (角质细胞生长因子，Keratinocyte Growth Factor)、CSF、EPO、IL、PRP(富含血小板血浆，Platelet RichPlasma)、SOX和IF等。这些因子可以通过重组法来制备，或者可由蛋白组合物纯化。尚需说明的是，本发明的几个方案的组合物不含这些生长因子。在本发明的另几个方案中，本发明的组合物还期望不含IGF-1的方案。即使在不含生长因子的情况下，纤维软骨组织损伤部的再生也充分良好，与积极促进细胞生长的情形相比安全性也更高。

本发明的组合物还可以包含抑制细胞凋亡的因子。作为引起细胞凋亡的因子，例如可以列举Caspase(半胱天冬酶)、TNFα等，作为抑制这些因子的因子，可以列举抗体或siRNA等。这些抑制细胞凋亡的因子可以通过重组法来制备、或者可由蛋白组合物纯化。尚需说明的是，本发明的几个方案的组合物不含这些抑制细胞凋亡的因子。即使在不含抑制细胞凋亡的因子的情况下，纤维软骨组织损伤部的再生也充分良好，与积极抑制细胞凋亡的情形相比安全性也更高。

尚需说明的是，在本发明的1个方案中，本发明的组合物除了含有褐藻酸的一价金属盐以外，不含对纤维软骨组织发挥药理作用的成分。即使是含有褐藻酸的一价金属盐、而不含对纤维软骨组织发挥药理作用的成分的组合物，对于纤维软骨组织损伤部、特别是半月板损伤部也能够发挥充分的再生或治疗效果。

另外，在本发明的另一方案中，本发明的组合物除了含有褐藻酸的一价金属盐以外，不含高分子成分。

在本发明的几个方案中，根据需要还可以在本发明的组合物中含有其他的药物活性成分、或惯用的稳定化剂、乳化剂、渗透压调节剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、无痛化剂、着色剂等在常规药物或医疗器械中使用的成分。

7. 本发明组合物的固化

在本发明的一个方案中，本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物以应用于纤维软骨组织损伤部后将至少一部分固化的方式使用。

“将至少一部分固化”是指，使交联剂与具有流动性的本发明组合物的至少一部分接触，将与交联剂接触的组合物的至少一部分凝胶化进行凝固。优选通过使交联剂与具有流动性的本发明组合物表面的至少一部分接触而将本发明组合物的至少一部分固化。在本发明的一个方案中，“将至少一部分固化”可以是组合物整体未被凝胶化、组合物整体的至少10%或者至少30%没有发生凝胶化的方案。关于没有发生凝胶化的组合物的比例，例如在“至少10%没有发生凝胶化的方案”的情况下，采用与向半月板损伤部填充的情形同样的交联剂的使用方法和使用比例，在体外向规定容器内填充低内毒素褐藻酸钠和交联剂，静置规定时间后，该容器内的组合物的容量的至少10%没有发生凝胶化，未凝胶化的部分可以通过该容器内的组合物的容量的至少50%可用带有21G注射针的注射器吸引来显示。“组合物表面的至少一部分”例如是纤维软骨组织损伤部表面的开口部，优选为应用于纤维软骨组织损伤部的本发明组合物的表面部分。通过将组合物的表面的至少一部分凝胶化进行凝固，可以有效防止组合物从纤维软骨组织损伤部漏出。

本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物优选在应用于对象的纤维软骨组织损伤部之前不含使组合物固化的量的交联剂。更优选本发明的具有流动性的组合物在与对象的纤维软骨组织损伤部接触时不含使组合物固化的量的交联剂。因此，本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物可以含有经过一定时间后也不会使组合物固化的量的交联剂。这里的一定时间没有特别限定，优选为30分钟～24小时左右。“不含使组合物固化的量的交联剂”例如可以通过将组合物于20℃下静置12小时后可用带有21G注射针的注射器进行注入来显示。在本发明的几个方案的组合物中不含交联剂。

在本发明的一个优选方案中，在使用本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物的情况下，本发明的组合物与交联剂的接触是在组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部之后进行。这里，“与交联剂的接触是在组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部之后进行”是指，交联剂与本发明组合物的接触、和组合物应用于对象的半月板损伤部在各自的时机进行，并且，交联剂与本发明组合物的接触较组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部要晚。在更优选的方案中，用于使本发明的具有流动性的组合物固化的、交联剂与本发明组合物的接触要较组合物与对象的纤维软骨组织损伤部接触之后进行。因此，这些方案中不包括下述情形：将本发明的组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部时，在混合本发明组合物和交联剂之后进行应用的情形；或者将本发明组合物和交联剂装入各自的管、套管或注射器等中，同时应用于对象的纤维软骨组织损伤部这样的情形。

在本发明的一个优选方案中，在使用本发明的具有流动性的组合物的情况下，组合物的固化通过使交联剂与组合物表面的至少一部分接触来进行。更优选，在将本发明的具有流动性的组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部之后，通过使交联剂与组合物表面的至少一部分接触来进行组合物的固化。如上所述，在本发明的具有流动性的组合物中，期望在应用于对象的纤维软骨组织损伤部之前、更详细而言是在与纤维软骨组织损伤部接触前不含使组合物固化的量的交联剂。

作为本发明中使用的交联剂，只要是能够将褐藻酸的一价金属盐溶液交联的物质，则没有特别限定。作为交联剂，例如可以列举：Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺等二价以上的金属离子化合物、分子内具有2～4个氨基的交联性试剂等。更具体而言，作为二价以上的金属离子化合物，包括CaCl₂、MgCl₂、CaSO₄、BaCl₂等，作为分子内具有2～4个氨基的交联性试剂，包括氮原子上有时还具有赖氨酰(lysyl)基(-COCH(NH₂)-(CH₂)₄-NH₂)的二氨基烷烃、即二氨基烷烃及其氨基被赖氨酰基取代形成赖氨酰基氨基的衍生物，具体而言，可以列举二氨基乙烷、二氨基丙烷、N-(赖氨酰)-二氨基乙烷等，出于容易获取、凝胶强度等理由，特别是，优选二价以上的金属离子化合物，更优选制成CaCl₂溶液。

在本发明的几个方案之一中，使交联剂与本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物的表面接触的时机优选为将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部之后。作为使交联剂(例如二价以上的金属离子)与本发明组合物的至少一部分接触的方法，没有特别限定，例如可以列举使用管、套管、注射器、喷射器(喷雾器)等在组合物表面施加二价以上的金属离子的溶液的方法等。例如，可以缓慢地用几秒～几十秒将交联剂持续施加在应用于纤维软骨组织损伤部的组合物的表面。之后，根据需要可以增加除去残留在添加有交联剂的部位附近的交联剂的处理。交联剂的去除例如可以是使用生理盐水等清洗应用部位。

在使用本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物的情况下，交联剂的使用量期望考虑本发明组合物的应用量、应用于纤维软骨组织损伤部的组合物表面的大小、纤维软骨组织损伤部的应用部位尺寸等适当调节。为了使交联剂不对应用了组合物的部位的周围组织产生较强影响，调节交联剂的使用量使其不过剩。作为二价以上的金属离子的使用量，只要是可以将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物表面凝固的量，则没有特别限定。然而，例如在使用100mM的CaCl₂溶液的情况下，在应用于纤维软骨组织的组合物的表面大小为直径1mm左右的情况下，CaCl₂溶液的使用量优选为0.3ml～5.0ml左右、更优选为0.5ml～3.0ml左右。在应用于纤维软骨组织的组合物的表面大小为直径1cm左右的情况下，100mM的CaCl₂溶液的使用量优选为0.3ml～10ml左右、更优选为0.5ml～6.0ml左右。可以边观察应用部位的本发明组合物的状态边适当增减。

在交联剂中含有钙的情况下，已知钙浓度高者凝胶化迅速，而且可以形成更硬的凝胶。然而，由于钙具有细胞毒性，所以若浓度过高，则还有可能对本发明组合物的纤维软骨组织损伤部再生作用产生不良影响。因此，在为了使含有褐藻酸的一价金属盐的组合物表面凝固而使用例如CaCl₂溶液的情况下，优选设为25mM～200mM、更优选设为50mM～150mM的浓度。

在本发明的一个优选方案中，在使用本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物的情况下，优选在组合物中添加交联剂后静置一定时间，之后通过使用生理盐水等进行清洗等除去添加部位所残留的交联剂。对静置的一定时间没有特别限定，期望静置约30秒以上、约1分钟以上、更优选约4分钟以上，使组合物表面凝胶化。或者，优选静置约1分钟～约10分钟、更优选约4分钟～约10分钟、约4分钟～约7分钟、进一步优选约5分钟。在该一定时间的期间期望形成本发明的组合物与交联剂接触的状态，可适当追加交联剂使组合物的液面不会干燥。

8. 本发明组合物的应用

本发明的组合物应用于人或人以外的生物、例如鸟和非人哺乳动物(例如牛、猴、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、狗、兔、绵羊、山羊和马)的纤维软骨组织损伤部。

关于本发明的几个方案的组合物的形态，在应用于纤维软骨组织时优选为具有流动性的液体状、即溶液状。在本发明中，“具有流动性”是指具有使其形态不定形地变化的性质，可以是粘稠的溶胶状的形态。优选期望具有例如可以将组合物封入注射器等中、并注入纤维软骨组织损伤部这样的流动性。另一方面，优选期望具有在应用的组织中难以流出的程度的粘度。本发明中，“溶液状”或“具有流动性”还包括溶胶状态。另外，在本发明的几个方案之一中，期望具有在将组合物于20℃下静置1小时后可通过带有14G～26G注射针的注射器、套管或在关节镜下使用的注入器具等注入到纤维软骨组织损伤部这样的流动性，进一步优选期望可使用21G的注射针进行注入。在本发明的组合物以冷冻干燥体等干燥状态提供的情况下，可以在应用时使用溶剂等制成具有上述这样的流动性的组合物。

溶液状的或者具有流动性的本发明的组合物可以使用管、套管、注射器、凝胶用移液管、专用注射器、专用注入器、填充器具等容易地应用于纤维软骨组织损伤部。在本发明组合物的粘度高的情况下，由于难以通过注射器进行应用，所以可以使用加压型或电动型等的注射器。也可以不使用注射器等，例如，通过刮勺(へら)、棒等应用于纤维软骨组织损伤部。在通过注射器注入的情况下，例如优选使用14G～27G或14G～26G的针。

本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物的应用量只要根据应用对象的纤维软骨组织的应用部位的容积来确定即可。对应用量没有特别限定，例如可以是0.01ml～10ml、更优选为0.1ml～5ml，进一步优选为0.2ml～5ml。在将本发明的组合物应用于半月板损伤部的情况下，优选以充分填满半月板损伤部的损伤部容积的方式注入。

如上所述，本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物在应用于纤维软骨组织损伤部之后，可以利用交联剂使组合物的至少一部分固化。例如，可以使用CaCl₂溶液等二价以上的金属离子化合物使组合物的表面固化。

在本发明的一个方案中，本发明的溶液状的或者具有流动性的组合物还可适合于各种形状的纤维软骨组织损伤部，也可优选用于已缝合的撕裂部或损伤部。通过将本发明的组合物应用于已缝合的撕裂部，与未使用本发明组合物的情形相比，能够促进损伤的再生。本发明的实施例中暗示了：本发明的组合物对于再生能力低、且以往认为即使缝合也不会再生的无血管区的损伤也显示出有效性。因此，在本发明的优选方案中，本发明的组合物根据需要可与缝合术组合，还优选用于无血管区的损伤治疗。

在本发明的另一方案中，本发明的组合物为粉末状或片状。在该方案中，虽然没有特别限定，但可以使用喷雾器等将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部。粉末状或片状的组合物通过管、套管、喷雾器等可以简易地进行应用，所以例如在损伤部较小的情况下、或者对于处于难以接触溶液的位置或角度的损伤部等可以优选使用。另外，粉末状或片状的组合物若通过管、套管、喷雾器等与损伤部接触，则与损伤部的粘接性好，粘接后组合物中含有水分可以使其凝胶化。

对本发明组合物应用于纤维软骨组织损伤部位的方法没有特别限定，但优选可以利用公知的外科手法在直视下暴露患处后、或者在关节镜下或内窥镜下使用管、套管、注射器、填充器具、喷雾器等将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部。在优选方案之一中，对于半月板损伤部，例如可以从膝的前侧、后侧或侧面侧向半月板损伤部插入注射器的针、管、套管或填充器具等来应用本发明的组合物。

本发明的组合物的应用次数、频率可以根据症状和效果而增减。例如，可以仅应用1次，也可以持续进行1个月1次～1年1次的应用。

即使是本发明的组合物不与如上所述的细胞或生长因子同时提供的情况下，将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部时，也可以并用上述的细胞或含有生物体成分的物质、生长因子、细胞凋亡抑制因子、后述的其他药剂等进行使用。

本发明的优选方案的组合物通过应用于半月板损伤部，发挥抑制半月板的变性变化、促进再生的效果。因此，在本发明的一个方案中，本发明的组合物优选用作半月板损伤治疗用组合物。

本发明组合物的优选方案之一为用于抑制半月板变性的组合物。“半月板的变性”如上述“半月板变性”的说明所述。在本说明书中，“变性抑制”只要是与未处置的情形相比变性变化得到抑制即可，并不意味着必然达到未变性的状态。

本发明组合物的方案之一为用于纤维软骨组织再生的组合物，更优选为用于半月板再生的组合物。该半月板再生的术语还包括抑制半月板的变性。本发明的优选方案之一期望应用本发明组合物而再生的纤维软骨的组成接近于本来的正常纤维软骨的组成。

另外，本发明的优选方案的组合物用于纤维软骨组织损伤的治疗、预防或复发抑制。在本说明书中，“治疗、预防或复发抑制”包括治疗、预防、复发抑制、减少、抑制、改善、除去、发病率的减少、发病时期的延迟、进展抑制、重症度的减轻、复发率的降低、复发时期的延迟、临床症状的缓解等。在本发明中，“预防”不仅是指预防状态或疾病的发病，还包括延迟发病时期和降低发病率。另外，“复发抑制”不仅是指完全抑制状态或疾病的复发，还包括延迟复发时期和降低复发率。在本说明书中，只要没有特别说明，则“治疗”以包括上述的“治疗、预防或复发抑制”在内的含义使用。

这些本发明组合物的优选方案、组合物的使用方法等按照上述的记载。

在本发明的一个方案中，本发明的组合物是以通过后述的纤维软骨组织损伤的治疗方法进行使用为特征的组合物。

9. 治疗方法

本发明提供使用上述本发明组合物的、用于纤维软骨组织损伤部、特别是半月板损伤部的治疗、预防或复发抑制的方法。更优选本发明的治疗方法为用于纤维软骨组织变性和/或纤维软骨组织损伤的治疗、预防或复发抑制的方法，包括将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物、更优选含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于需要上述治疗、预防或复发抑制的对象的纤维软骨组织损伤部。

关于半月板损伤，如上所述，半月板切除术或半月板缝合术是通常施行的方法，但难以使损伤部位完全恢复，治疗满意度谈不上充分。因此迄今为止研究了各种治疗方法，作为其一例，进行了细胞治疗的开发、即由自身滑膜采集滑膜细胞并在培养后移植到损伤部位。然而，由于该方法是采集自身细胞移植到损伤部的方法，所以需要由患者体内取出细胞的手法和埋植于损伤部的手法这两次手法，成为患者或医疗从业者的负担。因此，寻求手法简便、且患者或医疗从业者的负担小、有效性高的针对半月板损伤的新的治疗方法。本发明的治疗方法是针对这样的课题而提出的。

本发明的一个方案所涉及的治疗方法包括以下工序：

工序(a)：通过切开、关节镜或内窥镜形成可看清上述纤维软骨组织损伤部的状态；

工序(b)：根据需要除去上述纤维软骨组织损伤部及其边缘部的不需要的组织；

工序(c)：根据需要缝合上述纤维软骨组织损伤部；

工序(d)：将本发明的组合物应用于上述纤维软骨组织损伤部；

工序(e)：根据需要在应用的上述组合物的表面添加交联剂，静置一定时间以上，使上述组合物与上述交联剂接触；

工序(f)：根据需要清洗添加了上述交联剂的部位；以及

工序(g)：根据需要封闭因切开、或者插入关节镜、内窥镜或其他器具等而产生的开口部。

在本发明的治疗方法中，在将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部之前，通过切开、关节镜或内窥镜等手段，形成能够镜视或直接看清纤维软骨组织损伤部的状态。关节镜是用于观察关节状态的内窥镜的1种。

本发明的治疗方法可以包括：在将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部之前除去纤维软骨组织的至少一部分的工序。这里的“纤维软骨组织损伤部及其边缘部的不需要的组织”是指纤维软骨组织损伤部的病变组织、损伤部、撕裂部、变性部、或者它们的边缘部的异常组织部分等。在本发明的治疗方法中，期望通过切除等除去这些不需要的组织，使边缘部变得新鲜。这里的“根据需要”是指根据对象(受试者)的状态可以任意确定能否实施该工序或者除去的范围。例如，在做手术前的半月板缺损部的边缘部为正常的半月板组织的情况下，不需要该半月板损伤部除去的工序。通过该工序，可以更早期地促进正常的纤维软骨组织的再生。

本发明的治疗方法可以包括：在应用本发明组合物之前缝合纤维软骨组织损伤部的工序。例如，半月板损伤部大幅缺损的情形等，通过进行缝合以固定损伤部后应用本发明的组合物，可以抑制因载荷或运动引起的半月板的进一步损伤的扩大，有效地进行治疗。在本发明中，纤维软骨组织损伤部的缝合术可以采用常规方法来实施，没有特别限定，例如可以采用自内向外法(自内向外修复技术(Inside-Out Repair Technique))、自外向内法(自外向内修复技术(Outside-In Repair Technique))、全关节内法(全关节内修复技术(All-Inside Repair Technique))、使用多个技术的混合技术等(Knee Surg Relat Res 2014;26(2): 68-76)。

本发明的组合物在纤维软骨组织损伤部的应用期望以充分填满患处的空洞容积的方式注入。另外，例如在针对半月板损伤应用溶液状的或者具有流动性的本发明组合物的情况下，期望埋植到组合物的液面与半月板缺损部的周边半月板组织相同程度的高度。本说明书中的该“应用”的术语以包括“埋植”的术语在内的含义使用。

在本发明的组合物为溶液状或者具有流动性的情况下，期望在所应用的组合物表面添加交联剂，使组合物的至少一部分固化。在组合物中添加交联剂后静置的一定时间没有特别限定，但在本发明的几个方案中优选静置约1分钟以上、更优选约5分钟以上，使组合物的表面凝胶化。或者，优选静置约1分钟～约10分钟、更优选约3分钟～约10分钟、约4分钟～约7分钟、进一步优选约5分钟。在该一定时间的期间期望形成组合物与交联剂接触的状态，可以适当追加交联剂使组合物的液面不会干燥。

在本发明的治疗方法中优选：优选根据需要包括以下工序：在组合物中添加交联剂，静置一定时间后，例如使用生理盐水等冲洗添加了交联剂的部位。在预测交联剂会对生物体产生影响的情况下，期望包括该工序。

在本发明的治疗方法中，根据需要可以包括以下工序：对于因切开、或者插入关节镜、内窥镜或其他器具等而产生的开口部施行缝合或者基于此的处置，封闭开口部。这里，作为“其他器具”，只要是手术中通常使用的一般器具，则没有特别限定，例如作为镜视下手术用的器具，可以列举组织切除用器具、缝合用器具、钳子等。

在应用本发明的组合物之前，如果需要则可以清洗患处。“清洗患处”是指，例如使用生理盐水等去除想要应用本发明组合物的部位的血液成分、其他不需要的组织等。期望在清洗患处后，通过擦去残留的不需要的液体成分等使患处干燥，之后应用本发明的组合物。

通过在半月板损伤部应用本发明的组合物，可以期待再生与本来的半月板组织接近的组成和强度的半月板。例如，认为正常的半月板含有纤维软骨样细胞(fibrocartilagecell)、软骨样细胞(chondrocyte-like cell)等细胞，但可以期待让半月板损伤部的细胞组成或细胞数接近正常的半月板的效果。

进行半月板缝合术时，为了提高再生效果，有时会并用富含血小板血浆(PRP)或纤维蛋白凝块来进行使用。本发明的组合物可与PRP或纤维蛋白凝块并用、或者取而代之地与半月板缝合术并用来进行使用。在本发明的实施例中，本发明的组合物暗示了对半月板的无血管区的损伤部的有效性。由此，对于以往认为缝合术无效的无血管区的损伤，根据需要将本发明的组合物与缝合术并用来进行应用，也可以期待显示出再生效果。

在本发明中，“应用于纤维软骨组织损伤部”是指以使组合物等与纤维软骨组织损伤部接触的方式使用，优选以将本发明的组合物注入纤维软骨组织损伤部以填补缝合部或缺损部的方式使用。

在本发明中，纤维软骨组织损伤例如选自半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板、分离性骨软骨炎、软骨变性、关节内韧带损伤、运动外伤、变形性关节炎、以及三角纤维软骨复合体损伤和/或变性的至少一种状态或疾病。在本发明的几个方案中，作为本发明的治疗方法的治疗对象的纤维软骨组织损伤是选自半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板、以及三角纤维软骨复合体损伤和/或变性的至少一种状态或疾病，更优选为选自半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板的至少一种状态或疾病。

另外，在本发明的几个方案之一中，提供抑制半月板的变性变化的方法，该方法使用上述本发明的组合物。另外，在本发明的优选方案之一中，提供再生纤维软骨组织损伤部的方法，该方法使用上述本发明的组合物。

本发明组合物的优选方案、具体的在纤维软骨组织损伤部的应用方法、组合物的固化方法、术语的含义等如上所述。可以适当组合其他的纤维软骨组织的治疗方法或治疗药来实行本发明的治疗方法。

另外，在将本发明的组合物应用于纤维软骨组织损伤部之前、或者同时、或者之后，可以填充链霉素、青霉素、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、新霉素和两性霉素B等抗生素、阿司匹林、非类固醇性解热镇痛药(NSAIDs)、对乙酰氨基酚等抗炎药、蛋白分解酶、肾上腺皮质类固醇药、辛伐他汀、洛伐他汀等HMG-CoA还原酶抑制剂等的并用药。这些药剂可以混合在本发明的组合物中使用。或者，可以以口服或胃肠外的方式并用而给药。此外，肌肉松弛药、阿片类镇痛药、神经性疼痛缓解药等根据需要可以以口服或胃肠外的方式并用而给药。在本发明的另一方案中，本发明的组合物可以在不并用HMG-CoA还原酶抑制剂的情况下使用。

另外，在本发明的几个方案中，可以将上述的细胞与本发明组合物一同应用于纤维软骨组织损伤部。或者，在本发明的几个方案中，可以将上述含有生物体成分的物质、促进细胞生长的因子或细胞凋亡抑制因子与本发明的组合物一同应用于半月板损伤部。需要说明的是，在本发明的另一方案中，还期望本发明的组合物不并用上述细胞的方案。另外，在本发明的又一方案中，还期望本发明的组合物不并用含有生物体成分的物质、促进细胞生长的因子或细胞凋亡抑制因子的方案。在又一方案中，本发明的组合物还期望不并用半月板等纤维软骨组织的小薄片的方案。在又一方案中，本发明的组合物还期望不并用骨髓间质细胞的方案，另外，还期望不并用导入了IGF-1基因的骨髓间质细胞的方案，另外，还期望不并用IGF-1的方案。在又一方案中，本发明的组合物还期望不并用纤维软骨细胞和/或纤维软骨样细胞的方案。即使在不使用这些细胞、物质或因子的情况下，本发明的组合物也可以促进半月板等纤维软骨组织损伤部的再生。

本发明还涉及褐藻酸的一价金属盐在制备本发明组合物中的应用、更优选低内毒素褐藻酸的一价金属盐在制备本发明组合物中的应用。

本发明的应用是褐藻酸的一价金属盐在制备用于纤维软骨组织损伤的治疗、预防或复发抑制的组合物中的应用，上述组合物以应用于对象的纤维软骨组织损伤部的方式使用。

本发明提供：用于在纤维软骨组织损伤的治疗、预防或复发抑制中使用的褐藻酸的一价金属盐，其中将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部；以及用于在纤维软骨组织损伤的治疗、预防或复发抑制中使用的低内毒素褐藻酸的一价金属盐，其中将含有低内毒素褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于需要纤维软骨组织损伤的治疗、预防或复发抑制的对象的纤维软骨组织损伤部。

本发明的一个方案中，在本发明的针对半月板损伤的治疗方法中，在实施本发明的治疗方法之前可以诊断对象的半月板损伤程度，根据诊断结果选择适当的治疗方法。作为这样的诊断方法，没有特别限定，广泛实行徒手检查。关于半月板损伤的徒手检查法，存在多种检查方法，通过进行这些方法的组合，往往会提高诊断价值。例如，在回旋挤压试验(McMurray test)中可以观察是否有疼痛和诱发弹响(Click)，作为其理学之所见。

作为徒手检查法以外的检查方法，还可以采用核磁共振成像法(MRI)等。在利用MRI观察损伤部的情况下，若在T1加权图像中通常完全为低信号(低亮度)的半月板发生变性或损伤，则其部位变成高信号(高亮度)来记录。但是，由于外侧半月板后外侧具有膝窝肌腱，所以有时也难以诊断。

在MRI的半月板内异常信号程度的分类中有Mink分类，按照下述等级进行分类，将3级作为半月板损伤。

1级：未达关节面的点状/斑状信号；

2级：未达关节面的线形信号；

3级：达关节面的信号。

在本发明的一个方案中，在本发明的针对半月板损伤的治疗方法中，还期望以Mink分类的3级患者作为治疗对象。

10. 制剂、试剂盒

本发明提供纤维软骨组织损伤部治疗用试剂盒。

本发明的试剂盒中可以包含本发明的组合物。本发明的试剂盒中所含的本发明的组合物为溶液状态或干燥状态，但优选为干燥状态、更优选为冷冻干燥体、特别优选为冷冻干燥粉末。另外，当本发明的组合物为冷冻干燥体时，期望包含溶解用的溶剂(例如注射用水)。

本发明的试剂盒可以进一步包含交联剂。

本发明的试剂盒可以进一步包含交联剂、注射器、注射针、凝胶用移液管、专用填充器、操作说明书等。

适合作为试剂盒的具体例子可以是制成将下述的(1)～(3)装入一个包装中而得到的试剂盒：(1)封入了低内毒素褐藻酸钠的冷冻干燥体的小瓶、(2)封入了作为溶解液的注射用水等溶剂的安瓿、(3)封入了作为交联剂的氯化钙溶液等二价以上的金属离子化合物的安瓿等。另外，作为其他例子，制成下述的试剂盒：在一体成型、且由隔壁隔开的两个小室构成的注射器的1个室内封入褐藻酸的一价金属盐，在另一个小室内封入作为溶解液的溶剂、或者含有交联剂的溶液，以使用时可以容易地开通两个小室的隔壁的方式构成，使用时将两者混合/溶解后使用。作为其他例子，制成将褐藻酸的一价金属盐溶液封入预灌封注射器内、使用时不用调制操作即可直接填充的试剂盒。作为其他例子，制成将褐藻酸溶液和交联剂封入各自的注射器内、且捆包成一个包装的试剂盒。或者，可以制成包括填充有褐藻酸的一价金属盐溶液的小瓶和封入了交联剂的安瓿等的试剂盒。或者，可以制成封入了本发明的片状或粉末状组合物的容器与喷雾器等填充器具的套件。关于“本发明的组合物”、“交联剂”、“注射器”等如上述说明所述。

本试剂盒例如可在本发明的治疗方法中使用。

实施例

通过以下的实施例来进一步详述本发明，但本发明不该理解为受这些实施例的限定。

实施例1：低内毒素褐藻酸钠给药对兔半月板缺损的效果 对于兔半月板缺损填充低内毒素褐藻酸钠溶液，评价效果。

1-(1) 低内毒素褐藻酸钠溶液的调制

使用褐藻酸钠(持田制药(株))调制低内毒素褐藻酸钠溶液。内毒素含量不足50g/EU。低内毒素褐藻酸钠的表观粘度和重均分子量如表1所示。褐藻酸钠的表观粘度测定按照日本药典(第16版)的粘度测定法，采用旋转粘度计法(锥板式旋转粘度计)进行测定。具体的测定条件如下。样品溶液的调制使用MilliQ水来进行。测定仪器使用锥板式旋转粘度计(粘度粘弹性测定装置Rheostress RS600(Thermo Haake GmbH)传感器：35/1)。转速设为0.5rpm。读取时间测定2.5分钟，设为开始0.5分钟～2.5分钟的平均值。将3次测定的平均值设为测定值。测定温度设为20℃。

另外，褐藻酸钠的重均分子量通过凝胶渗透层析(GPC)和GPC-MALS这两种测定方法进行测定。测定条件如下。

[前处理(预处理)方法]

在样品中加入洗脱液进行溶解，之后通过0.45μm膜滤器进行过滤，以所得滤液作为测定溶液。

(A) 凝胶渗透层析(GPC)测定

[测定条件(相对分子量分布测定)]

柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)；

洗脱液：200mM的硝酸钠水溶液；

流量：1.0mL/分钟；

浓度：0.05%；

检测器：RI检测器；

柱温：40℃；

注入量：200μL；

分子量标准：标准普鲁兰多糖、葡萄糖。

(B) GPC-MALS测定

[折射率增量(dn/dc)测定(测定条件)]

示差折射率计：Optilab T-rEX；

测定波长：658nm；

测定温度：40℃；

溶剂：200mM的硝酸钠水溶液；

样品浓度：0.5～2.5mg/mL(5个浓度)。

[测定条件(绝对分子量分布测定)]

柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)；

洗脱液：200mM的硝酸钠水溶液；

流量：1.0mL/分钟；

浓度：0.05%；

检测器：RI检测器、光散射检测器(MALS)；

柱温：40℃；

注入量：200μL。

[表1]

表1

用生理盐水溶解低内毒素褐藻酸钠，调制了2w/w%的溶液。

1-(2) 兔半月板缺损(冲孔)模型的制作

使用活检打孔器(Biopsy Punch)在30只的体重为3.5±0.2kg的日本白兔两膝的内侧半月板的前角处制作直径2mm的圆柱状的贯穿半月板的缺损，作为半月板缺损模型。

没有对兔左膝的半月板缺损实施处置，作为未治疗的对照(组I：对照组)。

1-(3) 低内毒素褐藻酸钠溶液的填充

将上述1-(1)中调制的2w/w%的低内毒素褐藻酸钠溶液填充在兔右膝的半月板缺损处。在所填充的低内毒素褐藻酸钠溶液的上部和下部添加100mM的氯化钙溶液约10秒左右，使表面凝胶化。之后，用生理盐水冲洗施加了氯化钙溶液的部位(组II：治疗组)。通过与氯化钙溶液接触，褐藻酸钠溶液没有从缺损部脱落。

从做手术起3、6和12周时，对每10只兔实施安乐死，回收半月板，进行肉眼观察、组织学评价和机械强度测定。

1-(4) 肉眼观察(Gross Observation)

肉眼观察所回收的半月板。另外，采用“The American Journal of Sports Medicine,(2010) 第38卷 No.4 第740-748页”中记载的表1“Criteria to QuantitativelyEvaluate the Volume and Quality of Regenerated Tissues in Gross Observation(在肉眼观察中再生组织的体积和质量的定量评价标准)”进行评分、评价。具体而言，关于“轴平面上的再生组织的宽度(width of the regenerated tissue in the axialplane)”、“再生组织的自由边缘的鲜明度(sharpness of the free edge of theregenerated tissue)”、“再生组织的颜色(color of the regenerated tissue)”、“再生组织表面的平滑度(smoothness of the regenerated tissue surface)”和“再生组织的刚性(stiffness of the regenerated tissue)”这5项，分别根据0、1、2这3个等级的评分进行评价，以其总值进行比较。需要说明的是，评分2是最好的结果。评分的具体评价标准见下表。

[表2]

表2

	评分0	评分1	评分2
				轴平面上的再生组织的宽度	可(不足通常宽度的1/3)	良(通常宽度的1/3～2/3)	优(超过通常宽度的2/3)
再生组织的自由边缘的鲜明度	圆形	模糊的楔状	像通常的半月板那样清晰的楔状
				再生组织的颜色	呈红色	呈黄色	白色
再生组织表面的平滑度	圆且模糊	一部分平滑、有光泽	平滑、有光泽
				再生组织的刚性	柔软	一部分硬	通常的硬度

其结果，在组I (对照组)中，即使做手术后12周时半月板缺损部也是被薄的纤维样组织不完全地覆盖，只是纤维软骨组织很少再生。

另一方面，在组II (治疗组)中，在术后3周时和6周时除1个样本以外其余所有的缺损均被厚的纤维软骨样组织覆盖。在该纤维软骨样组织中观察到了许多软骨样细胞和成纤维细胞，用番红-O和甲苯胺蓝染色染成深色。手术后12周时，缺损部几乎都被纤维软骨样组织填充，观察到了许多软骨样细胞。

组II的肉眼观察评分如图2所示，与组I相比，在做手术后3周时、6周时和12周时评分显著地高(分别是p=0.010、p=0.026、p=0.020)。检验通过采用了有关多重比较法的Fischer PSLD测试的单因素方差分析(ANOVA)来进行。

另外，在3周时、6周时和12周时，还通过肉眼确认了半月板缺损部、周围和顶端部(先端部)是否撕裂。其结果见表3。

[表3]

表3

由该表可知：对象组在12周的时间点半月板缺损部的撕裂率升高到80%，相对于此，在治疗组中撕裂率抑制在30%。

1-(5) 组织学评价

组织学评价是按照常规方法使用苏木精-伊红(H＆E)、番红-O、甲苯胺蓝将已再生的组织染色，进行评价。另外，采用“The American Journal of Sports Medicine, (2010) 第38卷 No.4 第740-748页”中记载的表2“Criteria to Quantitatively EvaluateHistological Findings of Regenerated Tissues(再生组织的组织学所见的定量评价标准)”进行评分、评价。具体而言，对于“软骨细胞的数量(the number of chondrocytes)”和“在整个剖面区观察到的软骨组织的区域(area of the cartilage tissue observed inthe whole cross-sectional area)”这两项，分别按照0、1、2这3个等级的评分进行评价，以其总值进行比较。需要说明的是，评分2是最好的结果。评分的具体评价标准见下表。

[表4]

表4

	评分0	评分1	评分2
				软骨细胞的数量	几乎没有软骨细胞	通常的一半数量	与通常同等的数量
在整个剖面区观察到的软骨组织的区域	几乎没有观察到软骨组织	通常的半月板的一半宽度	与通常的半月板同等的宽度

其结果，在组I (对照组)中，做手术后3周时伴随着具有圆形核的许多细胞，滑膜样组织再生。在做手术后6周时和12周时，纤维组织稍有减少，细胞数逐渐减少(图3)。在组I中，没有观察到纤维软骨样细胞或被番红-O或甲苯胺蓝染色的基质。

另一方面，在组II (治疗组)中，做手术后3周时关节腔侧的表面被较厚的滑膜样组织覆盖。缺损部的内侧和外侧的正常组织通过疏松的结缔组织连接。做手术后3周时观察到了残留有褐藻酸凝胶的纤维软骨细胞。缺损部的基质为番红-O阳性。做手术后6周时，褐藻酸凝胶消失，半月板的形状均匀的组织伴随着三角形状的剖面而形成。在均匀的组织中，在蛋白多糖丰富的组织中分散着具有较大的圆形核和细胞质丰富的核的细胞。而且，其表面被薄的滑膜组织覆盖。

做手术后12周时，在半月板缺损组织的中心部分散存在着细胞质丰富、且具有圆形或卵形核的大的圆形细胞。而且，这些细胞周围的基质在番红-O染色和甲苯胺蓝染色中为阳性。

为了进行比较，还显示了正常状态的半月板的组织染色照片。组II(治疗组)的组织染色照片显示：半月板损伤部修复到了与正常状态的半月板几乎看不到差异的程度(图3)。

与组I相比，组II的组织学评分在做手术后3周时和12周时显著升高(分别是p=0.029和p=0.016)(图3)。检验通过采用了有关多重比较法的Fischer PSLD测试的单因素方差分析(ANOVA)来进行。

另一方面，在组I中做手术后12周时的组织学评分与做手术后3周时和6周时相比显著降低。

1-(6) 机械强度评价

关于做手术后6周时的组I(对照组)、组II(治疗组)、做手术后12周时的组II(治疗组)和正常组这4组的半月板，以n=6进行机械强度评价。做手术后12周时的组I(对照组)的半月板撕裂例达到80%，所以从评价中除去。

各组的半月板在-80℃下冷冻1天以上。实验中使用了花几个小时解冻后的半月板。解冻中和解冻后也使用生理盐水维持湿润。

使用自动绘图仪(自动绘图仪AG-X系列、自动绘图试验机AG-20kNX, SHIMADZU)评价修复组织的硬度。将半月板放置在自动绘图仪上，将直径0.50mm的压头尖端(Indentertip)以0.1mm/秒的速度压合于修复组织达0.5mm，持续30秒。每隔240秒反复进行5次该操作。每1个样本采用5次反复施行中的第3、4和5次，根据0.4～0.5mm压合时的载荷(Load)(N)与深度(Depth)(mm)的斜率(N/mm)测定硬度(stiffness)。结果见图4和图5。

在第6周的对象组与第6周的治疗组之间(P=0.006)、以及第6周的对象组与第12周的治疗组之间(0.015)确认到了显著差异。

1-(7) 结果

如上所述，可知通过在兔半月板缺损处填充低内毒素褐藻酸钠、并用氯化钙溶液进行凝胶化，使缺损部的纤维软骨再生，机械强度也有所提高。

迄今为止，已知为了治疗半月板的缺损部提出了几种方法，但使纤维软骨组织再生、并且恢复机械强度并不容易。此次，令人惊讶的是，低内毒素褐藻酸凝胶使其恢复了机械强度。

上述结果暗示了：本发明的组合物即使在半月板损伤部、特别是缺损部或撕裂部、以及实施了缝合的损伤部，也可以促进半月板损伤的修复。另外，由于在相对于兔的半月板尺寸而言较大的缺损(直径2mm)中确认到了半月板的再生，由此暗示了：本发明的组合物对于半月板的无血管区的损伤部的治疗也有效。即，暗示了：即使在半月板的血管区和无血管区的任一损伤部，本发明的组合物根据需要与缝合术组合使用，对半月板损伤的治疗也有效。

实施例2：与半月板缝合术组合使用

对于对象的半月板中产生的撕裂，按照常规方法进行半月板缝合术的手术。半月板缝合术没有特别限定，例如测定损伤的半月板撕裂部位的尺寸，在关节镜下将用于缝合的器具等插入膝关节内，进行缝合。缝合后，在缝合的部分应用实施例1中使用的2w/w%的低内毒素褐藻酸钠溶液。在其表面添加100mM的氯化钙溶液。几分钟后用生理盐水清洗患处。通过缝合等封闭因放入关节镜或手术器具等而产生的开口部。

经过一定期间后，通过并用缝合术和褐藻酸钠溶液来评价手术部的修复。

实施例3：对绵羊半月板缺损给予低内毒素褐藻酸钠

3-(1) 绵羊半月板缺损(冲孔)模型的制作

使用冲孔用器具(BPP-40F Plunger Type 批号16L08， Kai Industries株式会社)，在5月～7月龄绵羊(萨福克种)的左右膝关节部的内侧半月板前段的无血管区侧制作直径4.0mm的圆柱状的贯穿半月板的缺损，作为半月板缺损模型。

将所制作的半月板缺损模型(n=20)分为2组，组I作为未治疗组(n=10)没有施行处置，组II作为治疗组(n=10)在缺损部填充低内毒素褐藻酸钠溶液。

3-(2) 低内毒素褐藻酸钠溶液的填充

在3-(1)中制作的绵羊半月板缺损的下面垫上塑料制的药勺，填充实施例1的1-(1)中调制的2w/w%的低内毒素褐藻酸钠溶液使充分填满。在所填充的溶液表面添加2～5ml100mM的氯化钙溶液，保持约1分钟，将表面凝胶化。之后，用生理盐水冲洗添加了氯化钙溶液的部位(组II：治疗组)。

组I、II均在做手术起3周(各n=2)、6周(各n=2)、12周(各n=4)和24周时(各n=2)对绵羊实施安乐死，回收半月板，对所采集的组织标本进行肉眼评价和组织学评价。

3-(3) 评价

肉眼评价是通过肉眼观察形、色、光泽的有无、硬度、大小。

组织学评价是按照常规方法使用苏木精-伊红(H＆E)、番红-O、甲苯胺蓝制作染色标本，进行评价。肉眼评价与上述的实施例1-(4)同样采用“The American Journal ofSports Medicine, (2010) 第38卷 No.4 第740-748页”中记载的表1“Criteria toQuantitatively Evaluate the Volume and Quality of Regenerated Tissues inGross Observation”进行评分、评价。组织学评价与上述的实施例1-(5)同样采用该文献的表2“Criteria to Quantitatively Evaluate Histological Findings of RegeneratedTissues”进行评分、评价。免疫组织学评价是按照常规方法进行抗I型胶原蛋白染色、抗II型胶原蛋白染色、抗褐藻酸和抗α‐SMA的免疫染色，进行评价。

将组II(治疗组)和组I(未治疗组)进行比较，评价利用低内毒素褐藻酸钠的半月板的再生效果。

Claims (20)

1.纤维软骨组织损伤治疗用组合物，该组合物应用于对象的纤维软骨组织损伤部，在应用于纤维软骨组织损伤部时具有流动性、或者为片状或粉末状，含有褐藻酸的一价金属盐。

2.权利要求1所述的组合物，其中，上述褐藻酸的一价金属盐为低内毒素褐藻酸的一价金属盐。

3.权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中，上述组合物应用于纤维软骨组织损伤部时是指上述组合物与纤维软骨组织损伤部接触时。

4.权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物以应用于纤维软骨组织损伤部后将至少一部分固化的方式使用。

5.权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，通过使交联剂与上述组合物表面的至少一部分接触来进行上述具有流动性的组合物的固化。

6.权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物的表观粘度通过使用锥板式粘度计在20℃的条件下测定为100mPa·s～30000mPa·s。

7.权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，上述褐藻酸的一价金属盐通过GPC-MALS法测定的重均分子量即绝对分子量为3万以上。

8.权利要求1～7中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物中的褐藻酸的一价金属盐的浓度为0.1w/w%～5w/w%。

9.权利要求3～8中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物在与上述对象的纤维软骨组织损伤部接触时不含使上述组合物固化的量的交联剂。

10.权利要求3～9中任一项所述的组合物，其中，用于使上述具有流动性的组合物固化的、该组合物与交联剂的接触是在该组合物与对象的纤维软骨组织损伤部接触后进行的。

11.权利要求1～10中任一项所述的组合物，其中，上述具有流动性的组合物在将组合物于20℃下静置1小时后具有可通过21G的注射针注入的流动性。

12.权利要求5～11中任一项所述的组合物，其中，上述交联剂为二价以上的金属离子化合物。

13.权利要求1～12中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织为选自半月板、三角纤维软骨、关节盘和椎间盘的纤维环的至少一种。

14.权利要求1～13中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织损伤为选自半月板损伤、外伤性半月板损伤、半月板变性、盘状半月板、分离性骨软骨炎、软骨变性、关节内韧带损伤、运动外伤、变形性关节炎、以及三角纤维软骨复合体损伤和/或变性的至少一种状态或疾病。

15.权利要求1～14中任一项所述的组合物，其中，上述纤维软骨组织损伤部为所缝合的纤维软骨组织损伤部。

16.权利要求1～15中任一项所述的组合物，其中，上述组合物与缝合术并用，应用于纤维软骨组织损伤部。

17.权利要求1～16中任一项所述的组合物，其中，上述组合物在应用于纤维软骨组织损伤部之前为干燥状态或溶液状态。

18.权利要求17所述的组合物，其中，干燥状态的上述组合物为冷冻干燥体。

19.权利要求1～18中任一项所述的组合物，其特征在于：该组合物在包括下述工序的纤维软骨组织损伤部的治疗方法中使用，

工序(a)：通过切开、关节镜或内窥镜形成可看清上述纤维软骨组织损伤部的状态；

工序(b)：根据需要除去上述纤维软骨组织损伤部及其边缘部的不需要的组织；

工序(c)：根据需要缝合上述纤维软骨组织损伤部；

工序(d)：将含有褐藻酸的一价金属盐的组合物应用于上述纤维软骨组织损伤部；

工序(e)：根据需要在所应用的上述组合物的表面添加交联剂，静置一定时间使上述组合物与上述交联剂接触；

工序(f)：根据需要清洗添加了上述交联剂的部位；以及

工序(g)：根据需要封闭因切开、或者插入关节镜、内窥镜或其他器具而产生的开口部。

20.纤维软骨组织损伤部治疗用试剂盒，该试剂盒至少包含权利要求1～19中任一项所述的组合物。