BR112018070533B1 - Corantes diméricos ou poliméricos ultrabrilhantes com grupos agentes de ligação espaçadores - Google Patents

Abstract

São divulgados compostos úteis como corantes fluorescentes ou coloridos. Os compostos têm a seguinte estrutura (I) ou um estereoisômero, tautômero ou sal seus, em que R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, L4, M, m e n são tais como aqui definidos. Também são fornecidos métodos associados à preparação e uso de tais compostos.

Description

ANTECEDENTES Campo

[001] A presente invenção dirige-se, em geral, a corantes fluorescentes ou coloridos diméricos e poliméricos com grupos espaçadores rígidos e métodos para a sua preparação e uso em vários métodos analíticos.

Descrição da Técnica Relacionada

[002] Sabe-se que os corantes fluorescentes e/ou coloridos são particularmente adequados para aplicações em que é desejável um reagente de detecção altamente sensível. Os corantes que são capazes de marcar preferencialmente um ingrediente ou componente específico em uma amostra permitem ao pesquisador determinar a presença, quantidade e/ou localização desse ingrediente ou componente específico. Além disso, sistemas específicos podem ser monitorados em relação à sua distribuição espacial e temporal em diversos ambientes.

[003] Os métodos de fluorescência e colorimétricos são extremamente difundidos em química e biologia. Estes métodos fornecem informações úteis sobre a presença, estrutura, distância, orientação, complexação e/ou localização de biomoléculas. Além disso, métodos resolvidos no tempo são cada vez mais usados em medições de dinâmica e cinética. Como resultado, foram desenvolvidas muitas estratégias para a fluorescência ou marcação de biomoléculas com cores, tais como ácidos nucleicos e proteínas. Uma vez que a análise de biomoléculas ocorre tipicamente em um ambiente aquoso, o foco tem sido no desenvolvimento e uso de corantes solúveis em água.

[004] São desejáveis corantes altamente fluorescentes ou coloridos, pois o uso de tais corantes aumenta a relação sinal/ruído e fornece outros benefícios relacionados. Por conseguinte, foram feitas tentativas para aumentar o sinal proveniente dos grupamentos fluorescentes e/ou coloridos conhecidos. Por exemplo, compostos diméricos e poliméricos compreendendo dois ou mais grupamentos fluorescentes e/ou coloridas foram preparados na expectativa de que tais compostos resultariam em corantes mais brilhantes. No entanto, como resultado da supressão de fluorescência intramolecular, os corantes diméricos e poliméricos conhecidos não atingiram o aumento de brilho desejado.

[005] Assim sendo, existe uma necessidade na técnica de corantes solúveis em água que tenham um brilho molar aumentado. Idealmente, tais corantes e biomarcadores deveriam ser intensamente coloridos ou fluorescentes e deveriam estar disponíveis em uma variedade de cores e de comprimentos de onda fluorescentes. A presente invenção satisfaz esta necessidade e fornece outras vantagens relacionadas.

RESUMO BREVE

[001] Em resumo, as modalidades da presente invenção dirigem-se, em geral, a compostos úteis como corantes e/ou sondas fluorescentes e/ou coloridas, solúveis em água, que permitem a detecção visual de moléculas de analitos, tais como biomoléculas, bem como reagentes para a sua preparação. Também são descritos métodos para detectar visualmente moléculas de analitos usando-se os corantes.

[002] As modalidades dos corantes ora divulgados incluem dois ou mais grupamentos fluorescentes e/ou coloridas ligadas covalentemente por um agente de ligação (“L4”). Em contraste com informações anteriores sobre corantes diméricos e/ou poliméricos, os corantes atuais são significativamente mais brilhantes do que o composto corante correspondente e monomérico. Embora se acredite, sem se pretender estar limitado pela teoria, que o grupamento ligante forneça separação espacial suficiente entre os grupamentos fluorescentes e/ou coloridos de tal modo que a supressão de fluorescência intramolecular é reduzida e/ou eliminada.

[003] Os corantes fluorescentes ou coloridos, solúveis em água, das modalidades da invenção são intensamente coloridos e/ou fluorescentes e podem ser prontamente observados por inspeção visual ou outros meios. Em algumas modalidades, os compostos podem ser observados sem iluminação ou ativação química ou enzimática prévias. Por seleção apropriada do corante, tal como aqui descrito, podem ser obtidas moléculas de analito, visualmente detectáveis, de diversas cores.

[004] Em uma modalidade, são fornecidos os compostos com a seguinte estrutura (I):ou um estereoisômero, tautômero ou sal seus, em que R1,R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, L4, M, m e n são tais como aqui definidos. Compostos de estrutura (I) encontram utilidade em diversas aplicações, incluindo o uso como corantes fluorescentes e/ou coloridos em vários métodos analíticos.

[005] Em uma outra modalidade, é fornecido um modo para corar uma amostra, sendo que o modo compreende adicionar à dita amostra um composto de estrutura (I) em uma quantidade suficiente para produzir uma resposta óptica quando a dita amostra é iluminada a um comprimento de onda apropriado.

[006] Ainda em outras modalidades, a presente divulgação fornece um método para detectar visualmente uma molécula de analito, compreendendo: (a) fornecer um composto de (I); e (b) detectar o composto por suas propriedades visíveis. Outros métodos divulgados incluem um método para detectar visualmente uma biomolécula, compreendendo o método: (a) misturar um composto de estrutura (I) com uma ou mais biomoléculas; e (b) detectar o composto por suas propriedades visíveis.

[007] Outras modalidades fornecem um método para detectar visualmente um analito, compreendendo o método: (a) fornecer um composto tal como aqui descrito, em que R2 ou R3 compreendem um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento com especificidade para o analito; (b) misturar o composto e o analito, associando-se assim o grupamento de direcionamento e o analito; e (c) detectar o composto por suas propriedades visíveis. Outras modalidades dirigem-se a uma composição que compreende um composto de estrutura (I) e uma ou mais moléculas de analito, tal como uma biomolécula. Também é fornecido o uso de tais composições em métodos analíticos para detecção da uma ou mais biomoléculas.

[008] Em algumas outras modalidades diferentes, é fornecido um composto de estrutura (II):ou um estereoisômero, sal ou tautômero seus, em que R1, R2, R3, R4, R5, L1a, L2, L3, L4, G, m e n são tais como aqui definidos. Compostos de estrutura (II) encontram utilidade em diversas aplicações, incluindo o uso como intermediários para a preparação de corantes fluorescentes e/ou coloridos de estrutura (I).

[009] Ainda em outras modalidades, é fornecido um método para marcar uma molécula de analito, compreendendo o método: (a) misturar um composto de estrutura (II), em queR2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com a molécula de analito; (b) formar um conjugado do composto e da molécula de analito; e (c) fazer reagir o conjugado com um composto de fórmula M_L1b_G', formando-se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G', em que R2, R3, Q, G e M_L1b_G‘ são tais como aqui definidos.

[010] Em algumas modalidades diferentes, é fornecido um outro método para marcar uma molécula de analito, compreendendo o método: (a) misturar um composto de estrutura (II), em que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com um composto de fórmula M_L1b_G', formando- se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G ‘; e (b) fazer reagir o produto da etapa (A) com a molécula de analito, formando-se, assim, um conjugado do produto da etapa (A) e a molécula de analito, em que R2, R3, Q, G e M-L1b_G‘ são como aqui definidos.

[011] Em mais modalidades diferentes, é fornecido um método para preparar um composto de estrutura (I), compreendendo o método misturar um composto de estrutura (II) com um composto de fórmula M-L1b-G‘, formando-se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G‘, em que L e M-L1b-G‘ são tais como aqui definidos.

[012] Ainda mais modalidades são dirigidas a um composto fluorescente que compreende Y grupamentos fluorescentes M, em que o composto fluorescente tem uma emissão de fluorescência máxima após excitação com um comprimento de onda predeterminado de luz ultravioleta de pelo menos 85% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M após excitação com o mesmo comprimento de onda da luz ultravioleta, e em que Y é um número inteiro igual a 2 ou maior.

[013] Estes e outros aspectos da invenção ficarão evidentes uma vez que se refira à seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[014] Nas figuras, números de referência idênticos identificam elementos similares. Os tamanhos e posições relativas dos elementos nas figuras não estão necessariamente desenhados em escala e alguns destes elementos estão arbitrariamente aumentados e posicionados de modo a melhorar a legibilidade das figuras. Além disso, não se pretende que as formas particulares dos elementos transmitam qualquer informação relativa à forma real dos elementos particulares, tendo sido selecionadas apenas para facilitar o reconhecimento nas figuras.

[015] A FIG. 1 fornece espectros de absorbância de UV para compostos representativos compreendendo um espaçador trietilenoglicol e um composto comparativo a 5 μ m e pH 9.

[016] A FIG. 2 são dados de absorbância de UV para compostos representativos compreendendo um espaçador hexa- etilenoglicol e um composto comparativo a 5 μ m e pH 9.

[017] A FIG. 3 são espectros de emissão de fluorescência para compostos representativos compreendendo um espaçador trietilenoglicol e um composto comparativo a 50 nM e pH 9.

[018] A FIG. 4 apresenta espectros de emissão de fluorescência para compostos representativos compreendendo um espaçador trietilenoglicol e um composto comparativo a 50 nM e pH 9.

[019] A FIG. 5 são dados de absorvância de UV a 5 μ m para compostos representativos compreendendo quatro espaçadores hexa-etilenoglicol e dois ou três grupamentos fluoresceína em relação a um composto comparativo com um único grupamento fluoresceína.

[020] A FIG. 6 é um gráfico de dados de emissão fluorescente em 5 μ m para compostos representativos compreendendo quatro espaçadores hexa-etilenoglicol e dois ou três grupamentos fluoresceína em relação a um composto comparativo com um único grupamento fluoresceína.

[021] A FIG. 7 mostra a resposta de emissão de fluorescência comparativa para compostos ilustrativos com vários valores de m.

[022] A FIG. 8 fornece dados que comparam a emissão de fluorescência para o composto “HEG”, em que m é 1, 2 ou 3, em relação ao Composto A.

[023] A FIG. 9 fornece dados de absorbância de UV para o composto I-32, o composto I-46 e o Composto B.

[024] A FIG. 10 mostra os resultados de um composto da reação de trimerização de I-42 analisado por PAGE.

[025] A FIG. 11 fornece dados que comparam o sinal de fluorescência de sete compostos em uma população de células mortas e necrosadas.

[026] A FIG. 12 mostra a intensidade de fluorescência de um conjugado com anticorpo de I-51 versus um conjugado com anticorpo do Composto G.

[027] A FIG. 13 mostra comparações de conjugação de I-51 e Composto G anticorpo de referência.

[028] A FIG. 14 mostra uma comparação de UCHT1-I- 51, UCHT1-BB515 e UCHT1-FITC.

[029] A FIG. 15 mostra níveis de expressão de CD3 em comparação com uma curva padrão de MEF.

[030] A FIG. 16 mostra uma comparação das frações UCHT1-I-16 com FITC.

[031] A FIG. 17 mostra uma comparação das frações UCHT1-I-16 com conjugados de I-56.

[032] A FIG. 18 mostra uma comparação do análogo semelhante a UCHT1-I-51, UCHT1 I-16, com UCHT1 I-56 (10x) e UCHT1 I-53 (6x).

[033] A FIG. 19 fornece dados comparando o análogo semelhante a UCHT1 I-51, UCHT1 I-16, foi comparado com UCHT1 I-56 (10x) e UCHT1 I-53 (6x).

[034] A FIG. 20 mostra os resultados de uma análise de regressão realizada em dados produzidos enquanto se testavam conjugados de UCHT1 I-16 e UCHT1 I-49 para se demonstrar equivalência entre conjugações.

[035] A FIG. 21A mostra correlações entre I-16 e I45 determinadas usando-se análise de regressão. A FIG. 21B mostra curvas de titulação sobrepostas e comparadas com referências. A FIG. 21C mostra exemplos de dados qualitativos que mostram FL de fundo (“background FL”) e morfologia celular comparando o Composto D e I-45.

[036] A FIG. 22 mostra curvas de afinidade, como histogramas, com emissão de compostos detectada no canal FL1-A.

[037] A FIG. 23A mostra comparações de intensidade de fluorescência ligações fora do alvo, não específicas de UCHT1-I-21B, UCHT1-I-16, e referência, UCHT1-FITC, e a FIG. 23B apresenta dados de suporte.

[038] A FIG. 24 apresenta resultados de uma análise de regressão que foi aplicada aos dados para avaliar correlações e afinidades relativas.

[039] A FIG. 25, mostra dados sinal-ruído para UCHT1-I-21B, UCHT1-I-51 e UCHT1-FITC.

[040] As FIGs. 26A e 26B fornecem dados comparando UCHT1 I-51 Composto G E UCHT1 I-51 em um estudo de interferência de plasma usando-se PBMC. A FIG. 26A mostra dados resultantes da adição de 0% de glicina e a FIG. 26B mostra dados resultantes da adição de 2,5% de glicina.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[041] Na descrição a seguir, certos detalhes específicos são apresentados de modo a fornecer uma compreensão completa de várias modalidades da invenção. Contudo, um técnico especialista na técnica entenderá que a invenção pode ser realizada sem estes detalhes.

[042] A menos que o contexto exija de outra maneira, ao longo do presente relatório descritivo e reivindicações, a palavra “compreender” e variações suas, tais como “compreende” e “compreendendo” devem ser interpretadas em um sentido aberto e inclusivo, isto é, como “incluindo, mas não se limitado a”.

[043] A referência ao longo desta especificação a “uma modalidade” significa que um aspecto, estrutura ou característica particular descrito relacionado com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, as ocorrências da frase “em uma modalidade” em vários lugares ao longo desta especificação não são necessariamente todas referentes à mesma modalidade. Além disso, os aspectos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.

[044] “Amino” refere-se ao grupo -NH2.

[045] “Carbóxi ” refere-se ao grupo -CO2H.

[046] “Ciano” refere-se ao grupo -CN.

[047] “Formila ” refere-se ao grupo -C(=O)H.

[048] “Hidróxi ” ou “hidroxila” referem-se ao grupo -OH.

[049] “Imino” refere-se ao grupo =NH.

[050] “Nitro” refere-se ao grupo -NO2.

[051] “Oxo” refere-se ao grupo substituinte =O.

[052] “Sulfidrila” refere-se ao grupo -SH.

[053] “Tioxo” refere-se ao grupo =S.

[054] “Alquila” refere-se a um grupo hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada que consiste apenas em átomos de carbono e hidrogênio, não contendo nenhuma insaturação, tendo de um a doze átomos de carbono (alquila C1-C 12), um a oito átomos de carbono (alquila C1-C8) ou um a seis átomos de carbono (alquila C1-C6), e que está ligado ao resto da molécula por uma ligação simples, por exemplo, metila, etila, n-propila, 1-metiletil(iso-propila), n-butila, n-pentila, 1,1-dimetiletil(t-butila), 3-metil-hexila, 2-metil-hexila e semelhantes. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, grupos alquila são opcionalmente substituídos.

[055] “Alquileno” ou “cadeia de alquileno” referem- se a uma cadeia de hidrocarboneto divalente linear ou ramificada ligando o restante da molécula a um grupo radical, consistindo apenas em carbono e hidrogênio, não contendo insaturação e tendo de um a doze átomos de carbono, por exemplo, metileno, etileno, propileno, n-butileno, etenileno, propenileno, n-butenileno, propinileno, n-butinileno e semelhantes. A cadeia de alquileno é ligada ao restante da molécula através de uma ligação simples e ao grupo radical através de uma ligação simples. Os pontos de junção da cadeia de alquileno ao restante da molécula e ao grupo radical podem ser através de um carbono ou de quaisquer dois carbonos dentro da cadeia. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, alquileno é opcionalmente substituído.

[056] “Alquenileno” ou “cadeia de alquenileno” referem-se a uma cadeia de hidrocarboneto divalente linear ou ramificada ligando o restante da molécula a um grupo radical, consistindo apenas em carbono e hidrogênio, contendo pelo menos uma dupla ligação carbono-carbono e tendo de dois a doze átomos de carbono, por exemplo, etenileno, propenileno, n-butenileno e semelhantes. A cadeia de alquenileno é ligada ao restante da molécula através de uma ligação simples e ao grupo radical através de uma ligação dupla ou de uma ligação simples. Os pontos de junção da cadeia de alquenileno ao restante da molécula e ao grupo radical podem ser através de um carbono ou de quaisquer dois carbonos dentro da cadeia. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, alquenileno é opcionalmente substituído.

[057] “Alquinileno” ou “cadeia de alquinileno” referem-se a uma cadeia de hidrocarboneto divalente linear ou ramificada ligando o restante da molécula a um grupo radical, consistindo apenas em carbono e hidrogênio, contendo pelo menos uma tripla ligação carbono-carbono e tendo de dois a doze átomos de carbono, por exemplo, etenileno, propenileno, n-butenileno e semelhantes. A cadeia de alquinileno é ligada ao restante da molécula através de uma ligação simples e ao grupo radical através de uma ligação dupla ou de uma ligação simples. Os pontos de junção da cadeia de alquinileno ao restante da molécula e ao grupo radical podem ser através de um carbono ou de quaisquer dois carbonos dentro da cadeia. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, alquinileno é opcionalmente substituído.

[058] “Éter alquílico” refere-se a qualquer grupo alquila tal como definido acima, em que pelo menos uma ligação carbono-carbono é substituída por uma ligação carbono-oxigênio. A ligação carbono-oxigênio pode estar na extremidade terminal (como em um grupo alcóxi) ou a ligação carbono-oxigênio pode ser interna (isto é, C-O-C). Os éteres alquílicos incluem pelo menos uma ligação carbono-oxigênio, mas podem incluir mais de uma. Por exemplo, o polietilenoglicol (PEG) está incluído no significado do éter alquílico. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo éter alquílico é opcionalmente substituído. Por exemplo, em algumas modalidades, um éter alquílico é substituído por um álcool ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, em que cada um dentre Ra, Rb e Rc é tal como definido para os compostos de estrutura (I).

[059] “Alcóxi’ refere-se a um grupo da fórmula _ORa, onde Ra é um grupo alquila tal como definido acima, contendo de um a doze átomos de carbono. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo éter alquílico é opcionalmente substituído.

[060] “Éter alcóxi-alquílico” refere-se a um grupo da fórmula _ORaRb onde Ra é um grupo alquileno, tal como definido acima, contendo de um a doze átomos de carbono, e Rb é um grupo éter alquílico, tal como definido aqui. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo éter alcóxi-alquílico é opcionalmente substituído, por exemplo é substituído por um álcool ou _OP(=Ra)(Rb)Rc, em que cada um dentre Ra, Rb e Rc é tal como definido para os compostos de estrutura (I).

[061] “Heteroalquila” refere-se a um grupo alquila, tal como definido acima, compreendendo pelo menos um heteroátomo (por exemplo, N, O, P ou S) dentro do grupo alquila ou na extremidade terminal do grupo alquila. Em algumas modalidades, o heteroátomo está dentro do grupo alquila (isto é, a heteroalquila compreende pelo menos uma ligação carbono-[heteroátomo]x-carbono, onde x é 1, 2 ou 3). Em outras modalidades, o heteroátomo está em uma extremidade terminal do grupo alquila e, assim, serve para unir o grupo alquila ao restante da molécula (por exemplo, M1-H-A), onde M1 é uma porção da molécula, H é um heteroátomo e A é um grupo alquila. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo heteroalquila é opcionalmente substituído. Exemplos de grupos heteroalquila incluem óxido de etileno (por exemplo, óxido de polietileno), opcionalmente incluindo ligações oxigênio-fósforo, tais como ligações fosfodiéster.

[062] “Heteroalcóxi’ refere-se a um grupo da fórmula _ORa, onde Ra é um grupo heteroalquila tal como definido acima, contendo de um a doze átomos de carbono. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo heteroalcóxi é opcionalmente substituído.

[063] “Heteroalquileno” refere-se a um grupo alquileno, tal como definido acima, compreendendo pelo menos um heteroátomo (por exemplo, N, O, P ou S) dentro da cadeia de alquileno ou na extremidade terminal da cadeia de alquileno. Em algumas modalidades, o heteroátomo está dentro da cadeia de alquileno (isto é, o heteroalquileno compreende pelo menos uma ligação carbono-[heteroátomo]-carbono, onde x é 1, 2 ou 3). Em outras modalidades, o heteroátomo está em uma extremidade terminal do alquileno e, assim, serve para unir o alquileno ao restante da molécula (por exemplo, M1-HA-M2, onde M1 e M2 são porções da molécula, H é um heteroátomo e A é um alquileno). Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo éter alquílico é opcionalmente substituído. Exemplos de grupos heteroalquileno incluem óxido de etileno (por exemplo, óxido de polietileno) e o grupo de ligação “C” ilustrado abaixo: “C agente de ligação”

[064] Multímeros do “C-agente de ligação” acima estão incluídos em várias modalidades de agentes de ligação heteroalquilenos.

[065] “Heteroalquenileno” é um heteroalquileno, tal como definido acima, compreendendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo heteroalquileno é opcionalmente substituído.

[066] “Heteroalquinileno” é um heteroalquileno compreendendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo heteroalquileno é opcionalmente substituído.

[067] “Heteroatômico” em referência a um “agente de ligação heteroatômico” refere-se a um grupo agente de ligação que consiste em um ou mais heteroátomos. Exemplos de agentes de ligação heteroatômicos incluem átomos individuais selecionados do grupo consistindo em O, N, P e S e heteroátomos múltiplos, por exemplo, um agente de ligação com a fórmula _P(O-)(=O)O_ ou _OP(O-)(=O)O_ e multímeros e combinações suas.

[068] “Fosfato” refere-se ao grupo -OP(=O)(Ra)Rb, em que Ra é OH, O- ou ORc; e Rb é OH, O-, ORc, um grupo tiofosfato ou ainda um grupo fosfato, em que Rc é um contra- íon (por exemplo, Na+ e semelhantes).

[069] “Fosfoalquila” refere-se ao grupo _OP(=O)(Ra)Rb, em que Ra é OH, O- ou ORc; e Rb é _Oalquila, em que Rc é um contra-íon (por exemplo, Na+ e semelhantes). Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo fosfoalquila é opcionalmente substituído. Por exemplo, em certas modalidades, o grupamento _Oalquila em um grupo fosfoalquila é opcionalmente substituído por um ou mais dentre hidroxila, amino, sulfidrila, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico, éter tiofoalquílico ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, em que cada um dentre Ra, Rb é c é tal como definido para compostos de estrutura (I).

[070] “Ét er fosfoalquílico” refere-se ao grupo _OP(=O)(Ra)Rb, em que Ra é OH, O- ou ORc; e Rb é éter — Oalquílico, em que Rc é um contra-íon (por exemplo, Na+ e semelhantes). Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo éter fosfoalquílico é opcionalmente substituído. Por exemplo, em algumas modalidades, o grupamento éter -Oalquílico em um grupo éter fosfoalquílico é opcionalmente substituído por um ou mais dentre hidroxila, amino, sulfidrila, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico, éter tiofosfoalquílico ou _OP(=Ra)(Rb)Rc, em que cada um dentre Ra, Rb e Rc é tal como definido para os compostos de estrutura (I).

[071] “Tiofosfato” refere-se ao grupo _OP(=Ra)(Rb)Rc, em que Ra é O ou S, Rb é OH, O-, S-, ORd ou SRd; e Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, SRd, um grupo fosfato ou ainda um grupo tiofosfato, em que Rd é um contra-íon (por exemplo, Na+ e semelhantes) e, desde que: i) Ra seja S; ii) Rb seja S- ou SRd; iii) Rc seja SH, S- ou SRd; ou iv) uma combinação de i), ii) e/ou iii).

[072] “Tiofosfoalquila” refere-se ao grupo _OP(=Ra)(Rb)Rc, em que Ra é O ou S, Rb é OH, O-, S-, ORd ou SRd; e Rc é _Oalquila, em que Rd é um contra-íon (por exemplo, Na+ e semelhantes) e desde que: i) Ra seja S; ii) Rb seja Sou SRd; ou iii) Ra seja S e Rb seja S- ou SRd. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo tiofosfoalquila é opcionalmente substituído. Por exemplo, em certas modalidades, o grupamento -Oalquila em um grupo tiofosfoalquila é opcionalmente substituído por um ou mais dentre hidroxila, amino, sulfidrila, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico, éter tiofosfoalquílico ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, em que cada um dentre Ra, Rb e Rc é tal como definido para compostos de estrutura (I).

[073] “Éter tiofosfoalquílico” refere-se ao grupo -OP(=Ra)(Rb)Rc, em que Ra é O ou S, Rb é OH, O-, S-, ORd ou SRd; e Rc é éter -Oalquílico, em que Rd é um contra-íon (por exemplo, Na+ e semelhantes) e desde que: i) Ra seja S; ii) Rb seja S- ou SRd; ou iii) Ra seja S e Rb seja S- ou SRd. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo éter tiofosfoalquílico é opcionalmente substituído. Por exemplo, em certas modalidades, o grupamento éter -Oalquílico em um grupo tiofosfoalquila é opcionalmente substituído por um ou mais dentre hidroxila, amino, sulfidrila, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico, éter tiofoalquílico ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, em que cada um dentre Ra, Rb é c é tal como definido para compostos de estrutura (I).

[074] “Carbocíclico” refere-se a um anel aromático estável com 3 a 18 membros ou não-aromático compreendendo 3 a 18 átomos de carbono. A menos que especificado de outro modo especificamente no relatório descritivo, um anel carbocíclico pode ser um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico, o qual pode incluir sistemas de anéis fundidos ou em ponte, e pode ser parcial ou totalmente saturado. Radicais carbociclila não aromáticos incluem cicloalquila, enquanto radicais carbociclila aromáticos incluem arila. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo carbocíclico é opcionalmente substituído.

[075] “Cicloalquila” refere-se a um anel carbocíclico aromático monocíclico ou policíclico estável, que pode incluir sistemas de anéis fundidos ou em ponte, tendo de três a quinze átomos de carbono, preferencialmente tendo de três a dez átomos de carbono, e que ser saturado ou insaturado e ligado ao restante da molécula por uma única ligação. Cicloalquilas monocíclicas incluem, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila e ciclo-octila. Cicloalquilas policíclicas incluem, por exemplo, adamantila, norbornila, decalinila, 7,7-dimetil-biciclo-[2.2.1]heptanila e semelhantes. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo cicloalquila é opcionalmente substituído.

[076] “Arila” refere-se a um sistema de anel compreendendo pelo menos um anel aromático carbocíclico. Em algumas modalidades, uma arila compreende de 6 a 18 átomos de carbono. O anel arila pode ser um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico, o qual pode incluir sistemas de anel fundidos ou em ponte. Arilas incluem, mas não estão limitadas a, arilas derivadas de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, fluoranteno, fluoreno, as- indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, fenaleno, fenantreno, pleiadeno, pireno e trifenileno. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo arila é opcionalmente substituído.

[077] “Heterocíclico” refere-se a um anel aromático ou não aromático estável com 3 a 18 membros compreendendo de um a doze átomos de carbono e de um a seis heteroátomos selecionados do grupo consistindo em nitrogênio, oxigênio e enxofre. A menos que especificado de outro modo especificamente no relatório descritivo, o anel heterocíclico pode ser um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico, o qual pode incluir sistemas de anel fundidos ou em ponte; e os átomos de nitrogênio, carbono ou enxofre no anel heterocíclico podem ser opcionalmente oxidados; o átomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado; e o anel heterocíclico pode serr parcial ou totalmente saturado. Exemplos de anéis heterocíclicos aromáticos são listados abaixo na definição de heteroarilas (isto é, heteroarila sendo um subconjunto de heterocíclico). Exemplos de anéis heterocíclicos não aromáticos incluem, mas não estão limitados a, dioxolanila, tienil[1,3]ditianila, deca-hidroisoquinolila, imidazolinila, imidazolidinila, isotiazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, octa-hidroindolila, octa- hidroisoindolila, 2-oxopiperazinila, 2-oxopiperidinila, 2- oxopirrolidinila, oxazolidinila, piperidinila, piperazinila, 4-piperidonila, pirrolidinila, pirazolidinila, pirazolopirimidinila, quinuclidinila, tiazolidinila, tetra-hidrofurila, trioxanila, tritianila, triazinanila, tetra-hidropiranila, tiomorfolinila, tiamorfolinila, 1-oxo-tiomorfolinila e 1,1-dioxo- tiomorfolinila. Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo heterocíclico é opcionalmente substituído.

[078] “Heteroarila” refere-se a um sistema de anel com 5 a 14 membros compreendendo de um a treze átomos de carbono, de um a seis heteroátomos selecionados do grupo consistindo em nitrogênio, oxigênio e enxofre, e pelo menos um anel aromático. Para fins de certas modalidades desta invenção, o radical heteroarila pode ser um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico, o qual pode incluir sistemas de anel fundidos ou ligados em ponte; e os átomos de nitrogênio, carbono ou enxofre no radical heteroarila podem ser opcionalmente oxidados; o átomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, azepinila, acridinila, benzimidazolila, benzotiazolila, benzindolila, benzodioxolila, benzofuranila, benzooxazolila, benzotiazolila, benzotiadiazolila, benzo[b][1,4]dioxepinila, 1,4-benzodioxanila, benzonaftofuranila, benzoxazolila, benzodioxolila, benzodioxinila, benzopiranila, benzopiranonila, benzofuranila, benzofuranonila, benzotienila (benzotiofenila), benzotriazolila, benzo[4,6]imidazo[1,2-a] piridinila, benzoxazolinonila, benzimidazoltionila, carbazolila, cinolinila, dibenzofuranila, dibenzotiofenila, furanila, furanonila, isotiazolila, imidazolila, indazolila, indolila, indazolila, isoindolila, indolinila, isoindolinila, isoquinolila, indolizinila, isoxazolila, naftiridinilo, oxadiazolilo, 2-oxoazepinyl, oxazolyl, oxiranila, 1-oxidopiridinila, 1-oxidopirimidinila, 1- oxidopirazinila, 1-oxidopiridazinila, 1-fenil-1-H - pirrolila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxazinila, ftalazinila, pteridinila, pteridinonila, purinila, pirrolila, pirazolila, piridinila, piridinonila, pirazinila, pirimidinila, pirimidinonila, piridazinila, pirrolila, pirido[2,3-d] pirimidinonila, quinazolinila, quinazolinonila, quinoxalinila, quinoxalinonila, quinolinila, isoquinolinila, tetra-hidroquinolinila, tiazolila, tiadiazolila, tieno[3,2-d]pirimidin-4-onila, tieno[2,3-d] pirimidin-4-onila, triazolila, tetrazolila, triazinila e tiofenila (isto é, tienila). Salvo indicação em contrário especificamente no relatório descritivo, um grupo heteroalila é opcionalmente substituído.

[079] “Fundido” refere-se a um sistema de anel compreendendo pelo menos dois anéis, em que os dois anéis compartilham pelo menos um átomo do anel em comum, por exemplo dois átomos do anel em comum. Quando o anel fundido é um anel heterociclila ou um anel heteroarila, o(s) átomo(s) do anel em comum podem ser carbono ou nitrogênio. Anéis fundidos incluem bicíclico, tricíclico, tertracíclico e semelhantes.

[080] O termo “substituído” aqui usado significa qualquer um dos grupos acima (por exemplo, alquila, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, alcóxi, éter alquílico, fosfoalquila, éter fosfoalquílico, tiofosfoalquila, éter tiofosfoalquílico, carbocíclico, cicloalquila, arila, heterocíclico e/ou heteroarila) em que pelo menos um átomo de hidrogênio (por exemplo, 1, 2, 3 ou todos os átomos de hidrogênio) é substituído por uma ligação a átomos que não o hidrogênio, tais como, mas não limitados a: um átomo de halogênio, tal como F, Cl , Br e I; um átomo de oxigênio em grupos tais como grupos hidroxila, grupos alcóxi e grupos éster; um átomo de enxofre em grupos tais como grupos tiol, grupos tioalquila, grupos sulfona, grupos sulfonila e grupos sulfóxido; um átomo de nitrogênio em grupos tais como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas e enaminas; um átomo de silício em grupos tais como grupos trialquilsilila, grupos dialquilarilsilila, grupos alquildiarilsilila e grupos triarilsilila; e outros heteroátomos em vários outros grupos. “Substituído” também significa qualquer um dos grupos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por uma ligação de ordem mais alta (por exemplo, uma ligação dupla ou tripla) a um heteroátomo, tal como oxigênio em grupos oxo, carbonila, carboxila e éster; e nitrogênio em grupos tais como iminas, oximas, hidrazonas e nitrilas. Por exemplo, “substituído” inclui qualquer um dos grupos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por -NRgRh, _NRgC(=O)Rh, -NRgC(=O)NRgRh, -NRgC(=O)ORh, _NRgSO2Rh, -OC(=O)NRgRh, _ORg, -SRg, -SORg, _SO2Rg, _OSO2Rg, _SO2ORg, =NSO2Rg, e _SO2NRgRh. “Substituído” também significa qualquer um dos grupos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por -C(=O)Rg, -C(=O)ORg, -C(=O)NRgRh, -CH2SO2Rg, -CH2SO2NRgRh. Acima, Rg e Rh são iguais ou diferentes e independentemente hidrogênio, alquila, alcóxi, alquilamina, tioalquila, arila, aralquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, haloalquila, heterociclila, N-heterociclila, heterociclilalquila, heteroarila, e N-heteroarila e/ou heteroarilalquila. “Substitutído” significa ainda qualquer um dos grupos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por uma ligação a um grupo amino, ciano, hidroxila, imino, nitro, oxo, tioxo, halo, alquila, alcóxi, alquilamino, tioalquila, arila, aralquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, haloalquila, heterociclila, N- heterociclila, heterociclilalquila, heteroarila, N-heteroarila e/ou heteroarilalquila. Em algumas modalidades, o substituinte opcional é -OP(=Ra)(Rb)Rc, em em cada um dentre Ra, Rb e Rc é tal como definido para composto de estrutura (I). Adicionalmente, cada um dos substituintes anteriores pode também ser opcionalmente substituído por um ou mais dos substituintes acima.

[081] “Conjugação” refere-se à sobreposição de um orbital p com outro orbital p através de uma ligação sigma entre os dois. Pode ocorrer conjugação em compostos cíclicos ou acíclicos. Um “grau de conjugação” refere-se à sobreposição de pelo menos um orbital p com outro orbital p através de uma ligação sigma entre os dois. Por exemplo, 1,3-butadina tem um grau de conjugação, ao passo que o benzeno e outros compostos aromáticos têm tipicamente múltiplos graus de conjugação. Compostos fluorescentes e coloridos compreendem tipicamente pelo menos um grau de conjugação.

[082] “Fluorescente” refere-se a uma molécula que é capaz de absorver luz de uma frequência particular e emitir luz de uma frequência diferente. A fluorescência é bem conhecida pelos técnicos especialistas na técnica.

[083] “Colorido” refere-se a uma molécula que absorve luz dentro do espectro colorido (isto é, vermelho, amarelo, azul e semelhantes).

[084] Um “agente de ligação” refere-se a uma cadeia contígua de pelo menos um átomo, tal como carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e suas combinações, que conecta uma porção de uma molécula a outra porção da mesma molécula ou a uma molécula diferente, grupamento ou suporte sólido (por exemplo, micropartícula). Os agentes de ligação podem conectar a molécula através de uma ligação covalente ou outros meios, tais como interações iônicas ou por ligações de hidrogênio.

[085] O termo “biomolécula” refere-se a qualquer um de uma variedade de materiais biológicos, incluindo ácidos nucleicos, carboidratos, aminoácidos, polipeptídeos, glicoproteínas, hormônios, aptâmeros e misturas suas. Mais especificamente, o termo destina-se a incluir, sem limitação, RNA, DNA, oligonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou derivatizados, enzimas, receptores, príons, ligantes de receptores (incluindo-se hormônios), anticorpos, antígenos e toxinas, bem como bactérias, vírus, células sanguíneas e células de tecidos. As biomoléculas visualmente detectáveis da invenção (por exemplo, compostos de estrutura (I) tendo uma biomolécula ligada aos mesmos) são preparadas, tal como aqui descrito adiante, colocando-se em contato uma biomolécula com um composto que tenha um grupo reativo que permita ligação da biomolécula ao composto através de qualquer átomo ou grupo funcional disponíveis, tal como um grupo amino, hidróxi, carboxila ou sulfidrila na biomolécula.

[086] Um “grupo reativo” é um grupamento capaz de reagir com um segundo grupo reativo (por exemplo, um “grupo reativo complementar”) para formar uma ou mais ligações covalentes, por exemplo, por uma reação de deslocamento, oxidação, redução, adição ou cicloadição. Exemplos de grupos reativos são fornecidos na Tabela 1 e incluem, por exemplo, nucleófilos, eletrófilos, dienos, dienófilos, aldeído, oxima, hidrazona, alcino, amina, azida, acilazida, acil- haleto, nitrila, nitrona, sulfidrila, dissulfeto, haleto de sulfonila, isotiocianato, imidoéster, éster ativado, cetona, carbonila α,β-insaturada, alceno, maleimida, α-haloimida, epóxido, aziridina, tetrazina, tetrazol, fosfina, biotina, tiirano e semelhantes.

[087] Os termos “visível” e “visualmente detectável” são aqui usados para se referirem a substâncias que são observáveis por inspeção visual, sem iluminação prévia, ou ativação química ou enzimática. Tais substâncias visualmente detectáveis absorvem e emitem luz em uma região do espectro que varia de cerca de 300 e cerca de 900 nm. Preferencialmente, tais substâncias são intensamente coloridas, preferencialmente têm um coeficiente de extinção molar de pelo menos 40.000, mais preferivelmente de pelo menos 50.000, ainda mais preferencialmente de pelo menos 60.000, ainda mais preferencialmente de pelo menos 70.000, e o mais preferencialmente de pelo menos cerca de 80.000 M- 1cm-1. Os compostos da invenção podem ser detectados por observação a olho nu, ou com o auxílio de um dispositivo de detecção de base óptica, incluindo-se, sem limitação, espectrofotômetros de absorção, microscópios de luz de transmissão, câmeras digitais e scanners. Substâncias visualmente detectáveis não estão limitadas àquelas que emitem e/ou absorvem luz no espectro visível. Substâncias que emitem e/ou absorvem luz na região do ultravioleta (UV) (cerca de 10 nm a cerca de 400 nm), na região do infravermelho (cerca de 700 nm a cerca de 1 mm) e substâncias que emitem e/ou absorvem em outras regiões do espectro eletromagnético também estão incluídas no escopo das substâncias “visualmente detectáveis”.

[088] Para fins de modalidades da invenção, o termo “corante visível fotoestável” refere-se a um grupamento químico que é visualmente detectável, como definido acima, e não é significativamente alterado ou decomposto com a exposição à luz. Preferencialmente, o corante visível fotoestável não exibe descoloração ou decomposição significativa após ser exposto à luz durante pelo menos uma hora. Mais preferencialmente, o corante visível é estável após exposição à luz durante pelo menos 12 horas, ainda mais preferencialmente durante pelo menos 24 horas, ainda mais preferencialmente pelo menos durante uma semana e o mais preferencialmente durante pelo menos um mês. Exemplos não limitativos de corantes visíveis fotoestáveis adequados para uso nos compostos e métodos da invenção incluem corantes azo, corantes tioíndigo, pigmentos quinacridona, dioxazina, ftalocianina, perinona, dicetopirrolopirrol, quinoftalona e truaricarbônio.

[089] Tal como aqui usado, o termo “derivado de perileno” destina-se a incluir qualquer perileno substituído que seja visualmente detectável. No entanto, o termo não se destina a incluir o próprio perileno. Os termos “derivado de antraceno”, “derivado de naftaleno” e “derivado de pireno” são usados de maneira análoga. Em algumas modalidades preferidas, um derivado (por exemplo, perileno, pireno, antraceno ou derivado de naftaleno) é um derivado imida, bisimida ou hidrazamimida de perileno, antraceno, naftaleno ou pireno.

[090] As moléculas visualmente detectáveis de várias modalidades da invenção são úteis para uma ampla variedade de aplicações analíticas, tais como aplicações bioquímicas e biomédicas, nas quais é necessário determinar a presença, localização ou quantidade de um analito particular (por exemplo, biomolécula). Em um outro aspecto, portanto, a invenção fornece um método para detectar visualmente uma biomolécula, compreendendo: (a) fornecer um sistema biológico com uma biomolécula visualmente detectável compreendendo o composto de estrutura (I) ligado a uma biomolécula; e (b) detectar a biomolécula por suas propriedades visíveis. Para fins da invenção, a frase “detectar a biomolécula por suas propriedades visíveis” significa que a biomolécula, sem iluminação ou ativação química ou enzimática, é observada a olho nu, ou com o auxílio de um dispositivo de detecção de base óptica, incluindo, sem limitação, espectrofotômetros de absorção, microscópios de luz de transmissão, câmeras digitais e scanners. Um densitômetro pode ser usado para quantificar a quantidade de biomolécula visualmente detectável presente.Por exemplo, a quantidade relativa da biomolécula em duas amostras pode ser determinada medindo-se a densidade óptica relativa. Se a estequiometria das moléculas de corante por biomolécula é conhecida e o coeficiente de extinção da molécula de corante é conhecido, então a concentração absoluta da biomolécula também pode ser determinada a partir de uma medição de densidade óptica. Tal como aqui usado, o termo “sistema biológico” é usado para se referir a qualquer solução ou mistura compreendendo uma ou mais biomoléculas além da biomolécula visualmente detectável. Exemplos não limitativos de tais sistemas biológicos incluem células, extratos celulares, amostras de tecidos, géis electroforéticos, misturas para ensaios e misturas para reações de hibridização.

[091] “Suporte sólido” refere-se a qualquer substrato sólido conhecido na técnica para suporte de moléculas em fase sólida, por exemplo, uma “micropartícula” refere-se a qualquer uma de várias partículas pequenas úteis para ligação a compostos da invenção, incluindo, mas não se limitando a, esferas de vidro, esferas magnéticas, esferas poliméricas, esferas não poliméricas e semelhantes. Em certas modalidades, uma micropartícula compreende esferas de poliestireno.

[092] Um “resíduo de suporte sólido” refere-se ao grupo funcional que permanece ligado a uma molécula quando a molécula é clivada do suporte sólido. Resíduos de suportes sólidos são conhecidos na técnica e podem ser facilmente derivados com base na estrutura do suporte sólido e no grupo que liga a molécula a este.

[093] Um “grupamento de direcionamento” é um grupamento que se liga seletivamente ou se associa a um alvo em particular, como uma molécula de analito. Ligar-se ou associar-se “seletivamente” significa que um grupamento de direcionamento se associa ou se liga ao alvo desejado preferencialmente em relação a outros alvos. Em algumas modalidades, os compostos aqui divulgados incluem ligações a grupamentos de direcionamento com o objetivo de ligar ou associar seletivamente o composto a um analito de interesse (isto é, o alvo do grupamentoo de direcionamento), permitindo, assim, a detecção do analito. Exemplos de grupamentos de direcionamento incluem, mas não estão limitados a, anticorpos, antígenos, sequências de ácido nucleico, enzimas, proteínas, antagonistas de receptores da superfície celular e semelhantes. Em algumas modalidades, o grupamento de direcionamento é um grupamento, tal como um anticorpo, que seletivamente se liga ou se associa a um aspecto alvo de ou em uma célula, por exemplo, um aspecto alvo de uma membrana celular ou outra estrutura celular, permitindo, assim, a detecção de células de interesse. Moléculas pequenas que se ligam ou se associam seletivamente a um analito desejado também são contempladas como grupamentos de direcionamento em certas modalidades. Um técnico especialista na técnica entenderá de outros analitos, e do grupamento de direcionamento correspondente, que serão úteis em várias modalidades.

[094] “Grupamento de emparelhamento de bases” refere-se a um grupamento heterocíclico capaz de se hibridizar com um grupamento heterocíclico complementar através de ligações de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de bases de Watson-Crick). Grupamentos de emparelhamento de bases incluem bases naturais e não naturais. Exemplos não limitativos de grupamentos de emparelhamento de bases são bases de RNA e DNA, tais como adenosina, guanosina, timidina, citosina e uridina e seus análogos.

[095] As modalidades da invenção aqui divulgadas também se destinam a abranger todos os compostos de estrutura (I) ou (II) sendo isotopicamente marcados por terem um ou mais átomos substituídos por um átomo com uma massa atômica ou número de massa diferentes. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos divulgados incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, flúor, cloro e iodo, tais como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I, e 125I, respectivamente.

[096] Compostos isotopicamente marcados de estrutura (I) ou (II) podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas dos técnicos especialistas na técnica ou por processos análogos aos descritos abaixo e nos Exemplos seguintes, usando-se um reagente isotopicamente marcado apropriado no lugar do reagente não marcado previamente empregado.

[097] “Composto estável” e “estrutura estável” destinam-se a indicar um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento até um grau útil de pureza a partir de uma mistura reacional e formulação sob a forma de um agente terapêutico eficaz.

[098] “Opcional” ou “opcionalmente” significam que o evento ou circunstâncias descritos subsequentemente podem ou não ocorrer e que a descrição inclui casos em que ocorre o dito evento ou circunstância e casos em que não ocorre. Por exemplo, “alquila opcionalmente substituída” significa que o grupo alquila pode ou não ser substituído e que a descrição inclui tanto grupos alquila substituídos como grupos alquila sem nenhuma substituição.

[099] “Sal” inclui sais de adição tanto de ácido como de base.

[100] “Sal de adição de ácido” refere-se aos sais que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, mas não limitados a, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, e ácidos orgânicos, tais como, mas não limitados a, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido 4- acetamidobenzoico, ácido canfórico, ácido cânfor-10- sulfônico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etan-1,2- dissulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2- hidroxietanossulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glico-heptônico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutâmico, ácido glutárico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiônico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido múcico, ácido naftalen-1,5- dissulfônico, ácido naftalen-2-sulfônico, ácido 1-hidróxi- 2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiônico, ácido piroglutâmico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ido tiociânico, ácido p-toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, ácido undecilênico e semelhantes.

[101] “Sal de adição de base” refere-se àqueles sais que são preparados a partir da adição de uma base inorgânica ou de uma base orgânica ao ácido livre. Sais derivados de bases inorgânicas incluem, mas não estão limitados a, sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e semelhantes. Sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não estão limitados a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas de troca iônica básicas, tais como amônia, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclo- hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliaminas e semelhantes. Bases orgânicas particularmente preferidas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclo-hexilamina, colina e cafeína.

[102] Cristalizações podem produzir um solvato dos compostos aqui descritos. Modalidades da presente invenção incluem todos os solvatos dos compostos descritos. Tal como aqui usado, o termo “solvato” refere-se a um agregado que compreende uma ou mais moléculas de um composto da invenção com uma ou mais moléculas de solvente. O solvente pode ser água, caso em que o solvato pode ser um hidrato. Alternativamente, o solvente pode ser um solvente orgânico. Assim, os compostos da presente invenção podem existir como um hidrato, incluindo um mono-hidrato, di-hidrato, hemi- hidrato, sesqui-hidrato, tri-hidrato, tetra-hidrato e semelhantes, bem como as formas solvatadas correspondentes. Os compostos da invenção podem ser solvatos verdadeiros, enquanto em outros casos, os compostos da invenção podem apenas reter água ou outro solvente adventício ou ser uma mistura de água mais algum solvente adventício.

[103] Modalidades dos compostos da invenção (por exemplo, compostos de estrutura I ou II), ou seus sais, tautômeros ou solvatos podem conter um ou mais centros assimétricos e podem assim dar origem a enantiômeros, diastereômeros e outras formas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R)- ou (S)- ou, como (D)- ou (L)- para aminoácidos. Modalidades da presente invenção destinam-se a incluir todos esses isômeros possíveis, assim como as suas formas racêmica e opticamente pura. Isômero opticamente ativos (+) e (-), (R)- e (S)- , ou (D)- e (L)- podem ser preparados usando- se síntons quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando-se técnicas convencionais, por exemplo, cromatografia e cristalização fracionada. Técnicas convencionais para a preparaição/isolamento de enantiômeros individuais incluem síntese quiral de um precursor opticamente puro adequado ou resolução do racemato (ou do racemato de um sal ou derivado) usando-se, por exemplo, cromatografia líquida de alta pressão quiral (HPLC). Quando os compostos aqui descritos contêm ligações duplas olefínicas ou outros centros de assimetria geométrica, e salvo indicação em contrário, pretende-se que os compostos incluam tanto os isômeros geométricos E como Z. Da mesma maneira, todas as formas tautoméricas também se destinam a ser incluídas.

[104] Um “estereoisômero” refere-se a um composto constituído pelos mesmos átomos ligados pelas mesmas ligações, mas que têm estruturas tridimensionais diferentes, as quais não são intercambiáveis. A presente invenção contempla vários estereoisômeros e suas misturas e inclui “enantiômeros”, o que se refere a dois estereoisômeros cujas moléculas são imagens especulares não sobreponíveis uma da outra.

[105] Um “tautômero” refere-se a um deslocamento de próton de um átomo de uma molécula para outro átomo da mesma molécula. A presente invenção inclui tautômeros de quaisquer dos ditos compostos. Várias formas tautoméricas dos compostos são facilmente deriváveis pelos técnicos especialistas na técnica.

[106] O protocolo de nomenclatura química e os diagramas de estrutura aqui usados são uma forma modificada do sistema de nomenclatura I.U.P.A.C., usando-se o software ACD/Name Versão 9.07 e/ou o software de nomenclatura ChemDraw Ultra Versão 11.0 (CambridgeSoft). Também são usados nomes comuns familiares a um técnico especialista na técnica.

[107] Como notado acima, em uma modalidade da presente invenção, são fornecidos compostos úteis como corantes fluorescentes e/ou coloridos em vários métodos analíticos. Em outras modalidades, são fornecidos compostos úteis como intermediários sintéticos para a preparação de compostos úteis como corantes fluorescentes e/ou coloridos. Em termos gerais, as modalidades da presente invenção são dirigidas a dímeros e polímeros superiores de grupamentos fluorescentes e/ou coloridos. Os grupamentos fluorescentes e/ou coloridos são ligadas por um grupamento de ligação. Sem se pretender estar limitado pela teoria, acredita-se que o agente de ligação ajuda a manter uma distância espacial suficiente entre os grupamentos fluorescentes e/ou coloridos, de modo que a supressão intramolecular seja reduzida ou eliminada, resultando assim em um composto corante com um elevado “brilho” molar (por exemplo, alta emissão de fluorescência).

[108] Por conseguinte, em algumas modalidades, os compostos têm a seguinte estrutura (A):em que L é um agente de ligação suficiente para manter a separação espacial entre um ou mais (por exemplo, cada) grupos M de modo que a supressão intramolecular seja reduzida ou eliminada, e R , R , R3, L1, L2, L3 e n são tais como definidos para a estrutura (I). Em algumas modalidades da estrutura (A), L é um agente de ligação compreendendo um ou mais grupamentos etilenoglicol ou polietilenoglicol.

[109] Em outras modalidades é fornecido um os compostos com a seguinte estrutura (I):ou um estereoisômero, sal ou tautômero seus, em que:

[110] M é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[111] L1 é, em cada ocorrência, independentemente: ou i) um alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou agente de ligação heteroatômico opcional; ou ii) um agente de ligação compreendendo um grupo funcional capaz de formação por reação de dois grupos reativos complementares;

[112] L2 and L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico;

[113] L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos, em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S;

[114] R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi;

[115] R2 e R3 são cada um independentemente H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, heteroalquila, -OP(=Ra)(Rb)Rc, Q ou L';

[116] R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[117] R5 é, em cada ocorrência, independentemente,oxo, tioxo ou está ausente;

[118] Ra é O ou S;

[119] R b é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[120] Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, OL', SRd, alquila,alcóxi, heteroalquila, heteroalcóxi, éter alquílico, éter alcoxialquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfaloalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico;

[121] Rd é um contra-íon;

[122] Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo, ou m um análogo seu protegido, capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito, um grupamento de direcionamento, um suporte sólido ou um grupo reativo complementar Q‘;

[123] L 'é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a Q, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma porção de direcionamento, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um suporte sólido , um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um resíduo de suporte sólido, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um nucleosídeo ou um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I);

[124] m é, em cada ocorrência, independentemente um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e

[125] n é um número inteiro igual a um ou maior.

[126] Em diferentes modalidades do composto de estrutura (I):

[127] M é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[128] L1 é, em cada ocorrência, independentemente: ou i) um alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou agente de ligação heteroatômico opcional; ou ii) um agente de ligação compreendendo um grupo funcional capaz de formação por reação de dois grupos reativos complementares;

[129] L2 and L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico;

[130] L4 é em cada ocorrência, independentemente,um agente de ligação opcional heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos, em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S;

[131] R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi;

[132] R2 e R3 são cada um, independentemente, H, OH,SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, -OP(=Ra)(Rb)Rc, Q, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I), em que Ra é O ou S; Rb é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd; Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, SRd, alquila, alcóxi, éter alquílico, éter alcóxi-alquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico; e Rd é um contra- íon;

[133] R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[134] R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente;

[135] Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito, um suporte sólido ou um grupo reativo complementar Q‘;

[136] m é, em cada ocorrência, independentemente um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e

[137] n é um número inteiro igual a um ou maior.

[138] Os vários agentes de ligação e substituintes (por exemplo, M, Q, R1, R2, R3, Rc L1, L2, L3 e L4) no composto de estrutura (I) são opcionalmente substituídos por mais um substituinte . Por exemplo, em algumas modalidades, o substituinte opcional é selecionado para optimizar a solubilidade em água ou outra propriedade do composto de estrutura (I). Em certas modalidades, cada alquila, alcóxi, éter alquílico, éter alcóxi-alquílico, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfofoalquílico e éter tiofosfoalquílico no composto de estrutura (I) é opcionalmente substituído por mais um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, alcóxi, éter alquílico, éter alcóxi-alquílico, sulfidrila, amino, alquilamino, carboxila, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico e éter tiofosfoalquílico. Em certas modalidades, o substituinte opcional é -OP(=Ra)(Rb)Rc, em que Ra, Rb e Rc são tais como definidos para o composto de estrutura (I).

[139] Em algumas modalidades, L1 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico; Em outras modalidades, L1 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação que compreende um grupo funcional capaz de se formar pela reação de dois grupos reativos complementares, por exemplo um grupo Q.

[140] Em algumas modalidades, L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno. Em outras modalidades mais específicas, L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação óxido de alquileno. Por exemplo, em algumas modalidades, L4 é óxido de polietileno e o composto tem a seguinte estrutura (IA):

[141] Em que z é um número inteiro de 2 a 100. Em algumas modalidades de (IA), z é um número inteiro de 2-30, por exemplo, de cerca de 20 a 25, ou cerca de 23. Em algumas modalidades, z é um número inteiro de 2 a 10, por exemplo, de 3 a 6. Em algumas modalidades, Z é 3. Em algumas modalidades, Z é 4. Em algumas modalidades, Z é 5. Em algumas modalidades, Z é 6.

[142] O agente de ligação opcional L1 pode ser usado como um ponto de ligação do grupamento M ao restante do composto. Por exemplo, em algumas modalidades, é preparado um precursor sintético para o composto de estrutura (I), e o grupamento M é ligado ao precursor sintético usando-se qualquer número de métodos fáceis conhecidos na técnica, por exemplo, métodos aos quais se refere como “química click” (“click chemistry”, em inglês). Para este fim, qualquer reação que seja rápida e substancialmente irreversível pode ser usada para ligar M ao precursor sintético a fim de se formar um composto de estrutura (I). Exemplos de reações incluem a reação catalisada por cobre de uma azida e um alcino para se formar um triazol (cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen), reação de um dieno e um dienófilo (Diels-Alder), cicloadição de alcino-nitrona promovida por tensão, reação de uma alceno tensionado com uma azida, tetrazina ou tetrazol, cicloadição de alceno e azida [3+2], Diels-Alder de demanda inversa entre alceno e tetrazina, fotorreação de alceno e tetrazol e várias reações de deslocamento, tais como deslocamento de um grupo de saída por ataque nucleofílico em um átomo eletrofílico. Exemplos de eações de deslocamento incluem reação de uma amina com: um éster ativado; um éster de N-hidroxissuccinimida; um isocianato; um isotioscianato ou semelhantes. Em algumas modalidades, a reação para se formar L1 pode ser realizada em um ambiente aquoso.

[143] Por conseguinte, em outras modalidades, L1 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação que compreende um grupo funcional capaz de se formar pela reação de dois grupos reativos complementares, por exemplo um grupo funcional que 'o produto de uma das reações “click" anteriores. Em diversas modalidades, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional pode ser formado por reação de um grupo funcional aldeído, oxima, hidrazona, alcino, amina, azida, acilazida, haleto de acila, nitrila, nitrona, sulfidrila, dissulfeto, haleto de sulfonila, isotiocianato, imidoéster, éster ativado (por exemplo, um éster de N-hidroxissuccinimida), cetona, carbonila α,β- insaturada, alceno, maleimida, α-haloimida, epóxido, aziridina, tetrazina, tetrazol, fosfina, biotina ou tiirano com um grupo reativo complementar. Por exemplo, reação de uma amina com um éster de N-hidroxissuccinimida ou isotiocianato.

[144] Em outras modalidades, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional pode ser formado por reação de um alcino e uma azida. Em outras modalidades, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional pode ser formado por reação de uma amina (por exemplo, amina primária) e um éster de N-hidroxissuccinimida ou isotiocianato.

[145] Em mais modalidades, para, pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional compreende um grupo alceno, éster, amida, tioéster, dissulfeto, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila. Em mais modalidades, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional compreende um grupo alceno, éster, amida, tioéster, tioureia, dissulfeto, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila. Em outras modalidades, o grupo funcional compreende uma amida ou tioureia. Em algumas modalidades mais específicas, para pelo menos uma ocorrência de L1 , L1 é um agente de ligação que compreende um grupo funcional triazolila. Em algumas modalidades mais específicas, para pelo menos uma ocorrência de L1 , L1 é um agente de ligação que compreende um grupo funcional amida ou tioureia.

[146] Ainda em outras modalidades, para pelo menos uma ocorrência de L1 , L1-M tem a seguinte estrutura:caracterizada pelo fato de que L1a e L1b são, cada um, independentemente, agentes de ligação opcionais.

[147] Em modalidades diferentes, para pelo menos uma ocorrência de L1 , L1-M tem a seguinte estrutura:em que L1a e L1b são, cada um, independentemente, agentes de ligação opcionais.

[148] Em várias modalidades descritas, L1a ou L1b, ou ambos, estão ausentes. Em outras modalidades, L1a ou L1b, ou ambos, estão ausentes.

[149] Em algumas modalidades, L1a ou L1b, quando presentes, são cada um, independentemente, alquileno ou heteroalquileno. Por exemplo, em algumas modalidades, L1a ou L1b, quando presentes, têm uma das seguintes estruturas:

[150] Ainda em outras modalidades diferentes de estrutura (I), L1 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno ou heteroalquileno. Em certas modalidades, L1 tem uma das seguintes estruturas:

[151] Em mais modalidades, L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6 ou alquinileno C2-C6. Por exemplo, em algumas modalidades, o composto tem a seguinte estrutura (IB): em que x1 , x2 , x3 e x4 são, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 0 a 6; e z é um número inteiro de 2 a 100, por exemplo, de 3 a 6.

[152] Em certas modalidades do composto de estrutura (IB), pelo menos uma ocorrência de x1, x2, x3 ou x4 é 1. Em outras modalidades, x1, x2, x3 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência. Em outras modalidades, x1 e x3 são, cada um, 0 em cada ocorrência. Em algumas modalidades, x2 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência. Ainda em outras modalidades, x1, x 3 são, cada um, 0 em cada ocorrência, e x2 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência.

[153] Em algumas modalidades mais específicas do composto de estrutura (IB), L1, em cada ocorrência, independentemente, compreende um grupo funcional triazolila. Em algumas outras modalidades específicas do composto de estrutura (IB), L1, em cada ocorrência, independentemente, compreende um grupo funcional amida ou tioureia. Em outras modalidades do composto de estrutura (IB), L1, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno ou heteroalquileno.

[154] Ainda em outras modalidades de qualquer um dos compostos de estrutura (I), R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, O- ou ORd. Entende-se que “OR d” e “SR d”se destinam a se referirem a O- e S- associados a um cátion. Por exemplo, o sal dissódico de um grupo fosfato pode ser representado como:onde Rd é sódio (Na+).

[155] Em outras modalidades de qualquer um dos compostos de estrutura (I), R5 é, em cada ocorrência, oxo.

[156] Em algumas modalidades diferentes de qualquer um dos compostos anteriores, R1 é H.

[157] Em várias modalidades, R2 e R3 são cada um, independentemente, OH ou _OP(=Ra)(Rb)Rc. Em algumas modalidades diferentes, R2 ou R3 é OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q.

[158] Ainda em mais modalidades diferentes dos compostos anteriores de estrutura (1), R2 e R3 são cada um, independentemente, _OP(=Ra)(Rb)Rc. Em algumas dessas modalidades, Rc é OL'.

[159] Em outras modalidades, R2 e R3 são, cada um, independentemente _OP(=Ra)(Rb)OL', e L' é um agente de ligação alquileno ou heteroalquileno para: Q, um grupamento de direcionamento, um analito (por exemplo, molécula de analito), um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I).

[160] O ligante L’ pode ser qualquer agente de ligação adequado para ligar Q, um grupamento de direcionamento, um analito (por exemplo, molécula de analito), um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I) ao composto de estrutura (I). De um modo vantajoso, certas modalidades incluem o uso de grupamentos L’ selecionados para aumentar ou otimizar a solubilidade em água do composto. Em certas modalidades, L' é um grupamento heteroalquileno. Em algumas outras modalidades, L' compreende um óxido de alquileno ou um grupamento fosfodiéster, ou combinações suas.

[161] Em certas modalidades, L' tem a seguinte estrutura:em que:

[162] m'' e n'' são, independentemente, um número inteiro de 1 a 10;

[163] Re é H, um par de elétrons ou um contra-íon;

[164] L'' é Re ou uma ligação direta ou ligação a: Q, um grupamento de direcionamento, um analito (por exemplo, molécula de analito), um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I).

[165] Em algumas modalidades, m'' um número inteiro de 4 a 10, por exemplo, 4, 6 ou 10. Em outras modalidades, n'' é um número inteiro de 3 a 6, por exemplo, 3, 4, 5 ou 6.

[166] Em algumas outras modalidades, L'' é um grupamento alquileno ou heteroalquileno. Em algumas outras certas modalidades, L'' compreende um óxido de alquileno ou um grupamento fosfodiéster, sulfidrila, dissulfeto ou maleimida ou combinações suas.

[167] Em certas das modalidades anteriores, o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

[168] Em outras modalidades compostos anteriores de estrutura (I), seguintes estruturas:

[169] Certas modalidades dos compostos de estrutura (I) podem ser preparadas de acordo com métodos sintéticos de fase sólida análogos aos conhecidos na técnica para a preparação de oligonucleotídeos. Por conseguinte, em algumas modalidades, L' é uma ligação a um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido ou um nucleosídeo. Suportes sólidos compreendendo um grupo ativado de desoxitimidina (dT) estão prontamente disponíveis e, em algumas modalidades, podem ser empregados como material de partida para a preparação de compostos de estrutura (I). Por conseguinte, em algumas modalidades, R2 ou R3 têm a seguinte estrutura:

[170] Um técnico especialista na técnica entenderá que o grupo dT descrito acima está incluído apenas para facilidade de síntese e eficiências econômicas, não sendo necessário. Podem ser usados outros suportes sólidos e resultariam na presença de um nucleosídeo ou resíduo de suporte sólido diferente em L', ou o nucleosídeo ou o resíduo de suporte nucleósido podem ser removidos ou modificados após a síntese.

[171] Ainda em outras modalidades, Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito ou com um suporte sólido. Em outras modalidades, Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com um grupo reativo complementar Q‘. Por exemplo, em algumas modalidades, Q‘ está presente em um outro composto de estrutura (I) (por exemplo, na posição R2 ou R3), e Q e Q’ compreendem grupos reativos complementares de tal modo que a reação do composto de estrutura (I) e o outro composto de estrutura (I) resulta em um dímero ligado covalentemente do composto de estrutura (I). Compostos multiméricos de estrutura (I) também podem ser preparados de uma maneira análoga e estão incluídos dentro do escopo de modalidades da invenção.

[172] O tipo de grupo Q e conectividade do grupo Q ao restante do composto de estrutura (I) não é limitado, desde que Q compreenda um grupamento com reatividade apropriada para se formar a ligação desejada.

[173] Em certas modalidades, Q é um grupamento que não é suscetível a hidrólise em condições aquosas, mas é suficientemente reativo para formar uma ligação com um grupo correspondente em uma molécula de analito ou do suporte sólido (por exemplo, uma amina, azida ou alcino).

[174] Certas modalidades de compostos de estrutura (I) compreendem grupos Q comumente empregados na área de bioconjugação. Por exemplo, em algumas modalidades, Q compreende um grupo reativo nucleofílico, um grupo reativo eletrofílico ou um grupo reativo de cicloadição. Em algumas modalidades mais específicas, Q compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, éster ativado, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida. Em algumas modalidades, o éster ativado é um éster de N-succinimida, imidoéster ou éster de polifluorofenila. Em outras modalidades, o alcino é uma alquilazida ou acilazida.

[175] Os grupos Q podem ser convenientemente fornecidos na forma protegida para aumentar a estabilidade no armazenamento ou outras propriedades desejadas, e depois o grupo protetor removido no momento apropriado para conjugação com, por exemplo, um grupamento de direcionamento ou analito. Por conseguinte, grupos Q incluem “formas protegidas” de um grupo reativo, incluindo qualquer um dos grupos reativos descritos acima e na Tabela 1 abaixo. Uma “forma protegida” de Q refere-se a um grupamento com menor reatividade sob condições de reação predeterminadas em relação a Q, mas que pode ser convertido em Q sob condições que, preferencialmente, não degradam ou reagem com outras porções do composto de estrutura (I). Um técnico especialista na técnica pode derivar formas protegidas apropriadas de Q com base no Q particular e nas condições de uso final e armazenamento desejadas. Por exemplo, quando Q é SH, uma forma protegida de Q inclui um dissulfeto, que pode ser reduzido para revelar o grupamento SH usando-se técnicas e reagentes comumente conhecidos.

[176] São fornecidos exemplos de grupamentos Q na Tabela I abaixo.

[177] Deve-se notar que, em algumas modalidades, em que Q é SH, o grupamento SH tenderá a formar ligações dissulfeto com um outro grupo sulfidrila, por exemplo em um outro composto de estrutura (I). Por conseguinte, algumas modalidades incluem compostos de estrutura (I), que estão na forma de dímeros dissulfeto, sendo a ligação dissulfeto derivada de grupos SH Q.

[178] Também estão incluídos no escopo de certas modalidades compostos de estrutura (I), em que um, ou ambos, de R2 e R3 compreende uma ligação a um outro composto de estrutura (I). Por exemplo, em que um ou ambos de R2 e R3 são -OP(=Ra)(Rb)Rc, e Rc é OL', e L’ é um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I). Tais compostos podem ser preparados preparando-se um primeiro composto de estrutura (I) que tem, por exemplo, cerca de 10 grupamentos “M” (isto é, n = 9) e que temtendo um “Q” apropriado para reação com um grupo Q' complementar em um segundo composto de estrutura (I). Desta maneira, os compostos de estrutura (I), com qualquer número de grupamentos “M”, por exemplo 100 ou mais, podem ser preparados sem a necessidade de se acoplar sequencialmente cada monômero. Exemplos de modalidades de tais compostos de estrutura (I) têm a seguinte estrutura (I')em que:

[179] cada ocorrência de R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, L4, M, m e n é, independentemente, tal como definido para um composto de estrutura (I);

[180] L'' é um agente de ligação compreendendo um grupo funcional resultante da reação de um grupamento Q com um grupamento Q' correspondente; e a é um número inteiro maior que 1, por exemplo, de 1 a 100 ou 1 a 10.

[181] Um exemplo de composto de estrutura (I') é fornecido no Exemplo 5. Outros compostos de estrutura (I') são deriváveis por técnicos especialistas na técnica, por exemplo, por dimerização ou polimerização de compostos de estrutura (I) aqui fornecidos.

[182] Em outras modalidades, o grupamento Q é convenientemente mascarado (por exemplo, protegido) como um grupamento dissulfeto, que pode ser posteriormente reduzido para fornecer um grupamento Q ativado para ligação a uma molécula de analito desejada ou grupamento de direcionamento. Por exemplo, o grupamento Q pode estar mascarado como um dissulfeto com a seguinte estrutura:em que R é um grupo alquila opcionalmente substituído. Por exemplo, em algumas modalidades, Q é fornecido como um grupamento dissulfeto com a seguinte estrutura:onde n é um número inteiro de 1 a 10, por exemplo 6.

[183] Em algumas outras modalidades, R2 ou R3 é OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de analito é um ácido nucleico, um aminoácido ou um polímero seus. Em outras modalidades, a molécula de analito é uma enzima, receptor, ligante de receptor, anticorpo, glicoproteína, aptâmero ou príon. Ainda em modalidades diferentes, o suporte sólido é uma esfera polimérica ou uma esfera não polimérica.

[184] O valor para m é uma outra variável que pode ser selecionada com base na intensidade desejada de fluorescência e/ou de cor. Em outras modalidades, m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 10. Em outras modalidades, m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 5, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5.

[185] Em outras modalidades, m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro maior que 2, e z é um número inteiro de 3 a 10, por exemplo, em alguma modalidade m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro maior que 2, como 3 , 4, 5 ou 6, ez é um número inteiro de 3 a 6.

[186] A intensidade de fluorescência também pode ser ajustada pela seleção de diferentes valores de n. Em certas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 100. Em outras modalidades, n é um número inteiro de 1 a 10. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é 2. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é 4. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é 6. Em algumas modalidades, n é 7. Em algumas modalidades, n é 8. Em algumas modalidades, n é 9. Em algumas modalidades, n é 10.

[187] M é selecionado com base nas propriedades ópticas desejadas, por exemplo, com base em uma cor e/ou comprimento de onda de emissão de fluorescência desejados. Em algumas modalidades, M é o mesmo em cada ocorrência; no entanto, é importante notar que cada ocorrência de M não precisa ser um M idêntico e certas modalidades incluem compostos em que M não é o mesmo em cada ocorrência. Por exemplo, em algumas modalidades, cada M não é o mesmo e os diferentes grupamentos M são selecionados para terem absorbância e/ou emissões para uso nos métodos de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET - fluorescence resonance energy transfer). Por exemplo, em tais modalidades, os diferentes grupamentos M são selecionados de tal modo que a absorbância da radiação em um comprimento de onda provoque a emissão de radiação a um comprimento de onda diferente por um mecanismo FRET. Exemplos de grupamentos M podem ser apropriadamente selecionadas por um técnico especialista na técnica com base no uso final desejado. Exemplos de gupamentos M para métodos FRET incluem corantes fluoresceína e 5-TAMRA (5- carboxitetrametil-rodamina, éter succinimidílico).

[188] M pode ser ligado ao restante da molécula a partir de qualquer posição (isto é, átomo) em M. Um técnico especialista na técnica reconhecerá meios para ligar M ao restante da molécula. Exemplos de métodos incluem as reações “click” aqui descritas.

[189] Em algumas modalidades, M é um grupamento fluorescente ou colorido. Pode ser usado qualquer grupamento fluorescente e/ou colorido, por exemplo, podendo ser usados aqueles conhecidos na técnica e tipicamente empregados em ensaios colorimétricos, com UV e/ou fluorescentes. Exemplos de grupamentos M que são úteis em várias modalidades da invenção incluem, mas não estão limitados a: derivados de xanteno (por exemplo, fluoresceína, rodamina, verde do Oregon - “Oregon green”; eosina; ou vermelho do Texas - “Texas red”); derivados de cianina (por exemplo, cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina ou merocianina); derivados de esquaraína e esquaraínas substituídas no anel, incluindo-se os corantes Seta, SeTau e Square; derivados de naftaleno (por exemplo, derivados de dansila e prodan); derivados de cumarina; derivados de oxadiazol (por exemplo, piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol ou benzoxadiazol); derivados de antraceno (por exemplo, antraquinonas, incluindo-se DRAQ5; DRAQ7; e Laranja CyTRAK - “CyTRAK Orange”); derivados de pireno, como o azul cascata (“Cascade blue”); derivados de oxazina (por exemplo, vermelho do Nilo - “Nile red”; azul do Nilo - “Nile blue”; cresil violeta; oxazina 170); derivados de acridina (por exemplo, proflavina, laranja de acridina, amarelo de acridina); derivados de arilmetina: auramina,violeta cristal, verde malaquita; e derivados de tetrapirrol (por exemplo, porfina, ftalocianina ou bilirrubina). Outros exemplos de grupamentos M exemplares incluem: corantes de cianina, corantes de xantato (por exemplo, Hex, Vic, Nedd, Joe ou Tet); e os corantes amarelo de Yakima (“Yakima yellow”); vermelho de Redmond (“Redmond red”); tamra; vermelho do Texas (“Texas red”) e alexa fluor®.

[190] Ainda em outras modalidades aqui descritas, M compreende três ou mais anéis arila ou heteroarila, ou combinações suas, por exemplo quatro ou mais anéis arila ou heteroarila, ou combinações suas, ou até mesmo cinco ou mais anéis arila ou heteroarila, ou combinações suas. Em algumas modalidades, M compreende seis anéis arila ou heteroarila, ou combinações suas. Em outras modalidades, os anéis são fundidos. Por exemplo, em algumas modalidades, M compreende três ou mais anéis fundidos, quatro ou mais anéis fundidos, cinco ou mais anéis fundidos, ou mesmo seis ou mais anéis fundidos.

[191] Em algumas modalidades, M é cíclico. Por exemplo, em algumas modalidades, M é carbocíclico. Em outra modalidade, M é heterocíclico. Ainda em outras modalidades aqui descritas, M, em cada ocorrência, compreende independentemente um grupamento arila. Em algumas destas modalidades, o grupamento arila é multicíclico. Em outros exemplos mais específicos, o grupamento arila é um grupamento arila multicíclico fundido, por exemplo, que pode compreender pelo menos 3, pelo menos 4, ou até mesmo mais do que 4 anéis arila.

[192] Em outras modalidades de qualquer um dos compostos anteriores de estrutura (I), (IA), (IB) ou (I'), M, em cada ocorrência, independentemente, compreende pelo menos um heteroátomo. Por exemplo, em algumas modalidades, o heteroátomo é nitrogênio, oxigênio ou enxofre.

[193] Em ainda mais modalidades aqui descritas, M, em cada ocorrência, independentemente, compreende pelo menos um substituinte. Por exemplo, em algumas modalidades, o substituinte é um grupo flúoro, cloro, bromo, iodo, amino, alquilamino, arilamino, hidróxi, sulfidrila, alcóxi, arilóxi, fenila, arila, metila, etila, propila, butila, isopropila, t-butila, carbóxi, sulfonato, amida ou formila.

[194] Em algumas modalidades ainda mais específicas aqui descritas, M, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento dimetilaminostilbeno, quinacridona, fluorofenil- dimetil-BODIPY, his-fluorofenil-BODIPY, acridina,terrileno, sexifenila, porfirina, benzopireno, (fluorofenil- dimetil- difluorobora-diaza-indaceno)fenila, (bis-fluorofenil-difluorobora-diaza-indaceno)fenila, quaterfenila, bi-benzotiazo, ter-benzotiazol, bi-naftila, bi-antracila, esquaraína, esquarílio, 9,10-etinilantraceno ou ter-naftila. Em outras modalidades, M é, em cada ocorrência, independentemente, p-terfenila, perileno, azobenzeno, fenazina, fenantrolina, acridina, tioxantreno, criseno, rubreno, coroneno, cianina, perileno imida ou perileno amida ou um derivado seu. Ainda em mais modalidades, M é, em cada ocorrência, independentemente, um corante cumarina, um corante resorufina, um corante difluoreto de dipirrometenoboro, um corante rutênio bipiridila, um corante de transferência de energia, um corante laranja de tiazol, um corante polimetina ou N-aril-1,8-naftalimida.

[195] Em ainda mais modalidades aqui descritas, M, em cada ocorrência, é o mesmo. Em outras modalidades, cada M é diferente. Em ainda mais modalidades, um ou mais M é o mesmo e um ou mais M é diferente.

[196] Em algumas modalidades, M é pireno, perileno,perileno monoimida ou 6-FAM ou um derivado seu. Em algumas outras modalidades, M tem uma das seguintes estruturas:

[197] Embora os grupamentos M compreendendo grupos de ácido carboxílico sejam representados na forma aniônica (CO2-) acima, um técnico especialista na técnica entenderá ar dependendo do pH, e da forma protonada (CO2H) está incluído em várias modalidades.

[198] Em algumas modalidades específicas, o composto é um composto selecionado da Tabela 2: Os compostos da Tabela 2 foram preparados de acordo com os procedimentos apresentados nos Exemplos e a sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Tabela 2. Exemplos de Compostos de Estrutura I

[199] Conforme usado na Tabela 2 e ao longo do pedido de patente, R2, R3, m, n e L' têm as definições fornecidas para compostos de estrutura (I), exceto quando indicado, e F, F' e F" referem-se a um grupamento fluoresceína com as seguintes estruturas, respectivamente: F′′ "dT" refere-se à seguinte estrutura: refere-se à seguinte estrutura:

[200] Algumas modalidades incluem qualquer um dos compostos anteriores, incluindo os compostos específicos fornecidos na Tabela 2, conjugados com um grupamento de direcionamento, tal como um anticorpo.

[201] A presente divulgao fornece, em geral, compostos com emissão de fluorescência aumentada em relação a compostos conhecidos prévios. Por conseguinte, certas modalidades dirigem-se a um composto fluorescente que compreende Y grupamentos fluorescentes M, em que o composto fluorescente tem uma emissão de fluorescência máxima após excitação com um comprimento de onda predeterminado de luz ultravioleta de pelo menos 85% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M após excitação com o mesmo comprimento de onda de luz ultravioleta, e em que Y é um número inteiro igual a 2 ou maior. Compostos fluorescentes incluem compostos que emitem um sinal fluorescente após excitação com luz, tal como luz ultravioleta.

[202] Em algumas modalidades, o composto fluorescente tem uma emissão de fluorescência máxima de pelo menos 90% de Y vezes maior, 95% de Y vezes maior, 97% de Y vezes maior ou 99% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M.

[203] Em algumas modalidades, Y é um número inteiro de 2 a 100, por exemplo 2 -10.

[204] Em algumas modalidades, os grupamentos Y M têm, independentemente, uma das seguintes estruturas: em que indica um ponto de ligação ao composto fluorescente.

[205] Em outras modalidades, os únicos grupamentos M têm, independentemente, uma das seguintes estruturas:

[206] Em modalidades mais específicas, o composto fluorescente compreende Y grupamentos M, que têm, independentemente, uma das seguintes estruturas:

[207] Em outras modalidades, a emissão de fluorescência máxima está a um comprimento de onda que varia de desde cerca de 500 a cerca de 550 nm.

[208] Ainda em mais modalidades, o composto fluorescente compreende pelo menos uma porção de óxido de etileno.

[209] Também são fornecidas composições compreendendo o composto fluorescente de qualquer uma das reivindicações e um analito.

[210] Os compostos corantes ora divulgados são “ajustáveis”, o que significa que, através de seleção adequada das variáveis em qualquer um dos compostos anteriores, um técnico especialista na técnica pode chegar a um composto tendo uma fluorescência molar desejada e/ou predeterminada (brilho molar). A ajustabilidade dos compostos permite que o usuário chegue facilmente a compostos com a fluorescência e/ou cor desejadas para uso em um ensaio particular ou para identificar um analito específico de interesse. Embora todas as variáveis possam ter efeito sobre a fluorescência molar dos compostos, crê-se que a seleção adequada de M, L4, m e n desempenha um papel importante na fluorescência molar dos compostos. Por conseguinte, em uma modalidade é fornecido um método para obter um composto com uma fluorescência molar desejada, compreendendo o método selecionar um grupamento M com uma fluorescência conhecida, preparar um composto de estrutura (I) que compreende o grupamento M e selecionar as variáveis apropriadas para L4, m e n a fim de se chegar à fluorescência molar desejada.

[211] A fluorescência molar em certas modalidades pode ser expressa em termos de quantas vezes aumenta ou diminui em relação à emissão de fluorescência do fluoróforo primário (por exemplo, monômero). Em algumas modalidades, a fluorescência molar dos presentes compostos é 1,1x; 1,5x; 2x; 3x; 4x; 5x; 6x; 7x; 8x; 9x; 10x ou ainda maior em relação ao fluoróforo fluoróforo primário. Várias modalidades incluem a preparação de compostos com o aumento de fluorescência desejado em relação ao fluoróforo primário pela seleção adequada de L4, m e n.

[212] Para tornar mais clara a ilustração, são representados vários compostos compreendendo grupamentos com fósforo (por exemplo, fosfato e semelhantes) no estado aniônico (por exemplo, -OPO(OH)O-, -OPO32-). Um técnico especialista na técnica entenderá prontamente que a carga depende do pH e as formas não carregadas (por exemplo, protonada ou sal, tal como sódio ou outro cátion) também estão incluídas no escopo das modalidades da invenção.

[213] Composições compreendendo qualquer um dos compostos anteriores e uma ou mais moléculas de analito (por exemplo, biomoléculas) são fornecidas em várias outras modalidades. Em algumas modalidades, também é fornecido o uso de tais composições em métodos analíticos para detecção da uma ou mais moléculas de analito.

[214] Ainda em outras modalidades, os compostos são úteis em vários métodos analíticos. Por exemplo, em certas modalidades, a divulgação fornece um método para corar uma amostra, compreendendo o método a adição à dita amostra de um composto de estrutura (I), por exemplo em que um de R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um molécula de analito (por exemplo, biomolécula) ou micropartícula, e o outro de R2 ou R3 é H, OH, alquila, alcóxi, éter alquílico ou _OP(=Ra)(Rb)Rc, em uma quantidade suficiente para produzir uma resposta óptica quando a dita amostra é iluminada a um comprimento de onda apropriado.

[215] Em algumas modalidades dos métodos anteriores, R2 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a uma molécula de analito, tal como uma biomolécula. Por exemplo, um ácido nucleico, aminoácido ou um polímero seus (por exemplo, polinucleotídeo ou polipeptídeo). Em ainda mais modalidades, a molécula de analito é uma enzima, receptor, ligante de receptor, anticorpo, glicoproteína, aptâmero ou príon.

[216] Ainda em outras modalidades do métodos anterior, R2 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido, tal como uma micropartícula. Por exemplo, em algumas modalidades, a micropartícula é uma esfera polimérica ou uma esfera não polimérica.

[217] Em ainda mais modalidades, a dita resposta óptica é uma resposta fluorescente.

[218] Em outras modalidades, a dita amostra compreende células e algumas modalidades compreendem ainda observar as ditas células por citometria de fluxo.

[219] Em ainda mais modalidades, o método compreende ainda distinguir a resposta de fluorescência daquela de um segundo fluoróforo com diferentes propriedades ópticas detectáveis.

[220] Em outras modalidades, a divulgação fornece um método para detectar visualmente uma molécula de analito, tal como uma biomolécula, compreendendo: (a) fornecer um composto de estrutura (I), por exemplo, em que um de R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a uma molécula de analito, e o outro de R2 ou R3 é H, OH, alquila, alcóxi, éter alquílico ou _OP(=Ra)(Rb)Rc;- e (b) detectar o composto por suas propriedades visíveis.

[221] Em algumas modalidades, a molécula de analito é um ácido nucleico, aminoácido ou um polímero seus (por exemplo, polinucleotídeo ou polipeptídeo). Em ainda mais modalidades, a molécula de analito é uma enzima, receptor, ligante de receptor, anticorpo, glicoproteína, aptâmero ou príon.

[222] Em outras modalidades, é fornecido um método para detectar visualmente uma molécula de analito, tal como uma biomolécula, compreendendo o método: (a) misturar qualquer um dos compostos anteriores com uma ou mais moléculas de analito; e (b) detectar o composto por suas propriedades visíveis.

[223] Em outras modalidades, é fornecido um método para detectar visualmente uma molécula de analito, compreendendo o método: (a) misturar o composto de acordo com a reivindicação 1, em que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com a molécula de analito; (b) formar um conjugado do composto e da molécula de analito; e (c) detectar o conjugado por suas propriedades visíveis.

[224] Outros exemplos de métodos incluem um método para detectar visualmente um analito, compreendendo o método: (a) fornecer um composto de estrutura (I), em que R2 ou R3 compreendem um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento com especificidade para o analito; (b) misturar o composto e o analito, associando-se assim o grupamento de direcionamento e o analito; e (c) detectar o composto, por exemplo, por suas propriedades visíveis.

[225] Em certas modalidades do método anterior, o analito é uma partícula, tal como uma célula, e o método inclui o uso de citometria de fluxo. Por exemplo, o composto pode ser fornecido com um grupamento de direcionamento, tal como um anticorpo, para se associar seletivamente com a célula desejada, tornando assim a célula detectável por qualquer número de técnicas, tais como detecção visível ou de fluorescência. Anticorpos apropriados podem ser selecionados por um técnico especialista na técnica dependendo do uso final desejado. Exemplos de anticorpos para uso em certas modalidades incluem UCHT1 e MOPC-21.

[226] Modalidades dos presentes compostos, portanto, encontram utilidade em qualquer número de métodos, incluindo-se, mas não se limitando a: contagem de células; separação de células; detecção de biomarcadores; quantificar a apoptose; determinar a viabilidade celular; identificar antígenos da superfície celular; determinação do conteúdo total de DNA e/ou RNA; identificar sequências de ácido nucleico específicas (por exemplo, como uma sonda de ácido nucleico); e diagnosticar doenças, tais como cânceres hematológicos.

[227] Além dos métodos acima, modalidades dos compostos de estrutura (I) encontram utilidade em várias disciplinas e métodos, incluindo-se mas não se limitando a: imagiologia em procedimentos endoscópicos para identificação de tecidos cancerosos e outros tecidos; métodos analíticos de célula única e/ou de molécula única, por exemplo, detecção de polinucleotídeos com pouca ou nenhuma amplificação; imagiologia oncológica, por exemplo, incluindo-se um grupamento de direcionamento, tal como um anticorpo ou açúcar ou outro grupamento que preferencialmente liga células cancerosas, em um composto de estrutura (I); imagiologia em procedimentos cirúrgicos; ligação de histonas para identificação de várias doenças; liberação de fármacos, por exemplo, substituindo-se o grupamento M em um composto de estrutura (I) por um grupamento de fármaco ativo; e/ou agentes de contraste na prática dentária e outros procedimentos, por exemplo, por ligação preferencial do composto de estrutura (I) a várias floras e/ou organismos.

[228] Entende-se que qualquer modalidade dos compostos de estrutura (I), tal como apresentado acima, e qualquer escolha específica aqui apresentada para uma variável R1, R2, R3, R4, R5, L', L1, L2, L3, L4, M, m e/our n nos compostos de estrutura (I), tal como apresentado acima, podem ser combinadas independentemente com outras modalidades e/ou variáveis dos compostos de estrutura (I) a fim de se formarem modalidades da invenção não especificamente apresentadas acima. Além disso, no caso de uma lista de opções ser listada para qualquer variável R1, R2, R3, R4, R5, L', L1, L2, L3, L4, M, m e/ou n particular em uma modalidade particular e/ou reivindicação, entende-se que cada escolha individual pode ser eliminada da modalidade e/ou reivindicação particular e que a lista restante de escolhas será considerada como estando dentro do escopo da invenção.

[229] Entende-se que, na presente descrição, combinações de substituintes e/ou variáveis das fórmulas representadas são permissíveis apenas se tais contribuições resultarem em compostos estáveis.

[230] Também será entendido pelos técnicos especialistas na técnica que, no processo aqui descrito, os grupos funcionais de compostos intermediários podem necessitar ser protegidos por grupos protetores adequados. Tais grupos funcionais incluem hidróxi, amino, mercapto e ácido carboxílico. Grupos protetores adequados para hidróxi incluem trialquilsilila ou diarilalquilsilila (por exemplo, t-butildimetilsilila, t-butildifenilsilila ou trimetilsilila), tetra-hidropiranila, benzila e semelhantes. Grupos protetores adequados para amino, amidino e guanidino incluem t- butoxicarbonilo, benziloxicarbonilo e semelhantes. Grupos protetores adequados para mercapto incluem -C(O)-R” (onde R” é alquila, arila ou arilalquila), p-metoxibenzila, tritila e semelhantes. Grupos protetores adequados para ácido carboxílico incluem ésteres de alquila, arila ou arilalquila. Grupos protetores podem ser adicionados ou removidos de acordo com técnicas padrão, as quais são conhecidas pelos técnicos especialistas na técnica e tais como aqui descrita. O uso de grupos protetores é descrito em detalhes em Green, TW e PGM. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3a Ed., Wiley. Como um técnico especialista na técnica entenderia, o grupo protetor também pode ser uma resina polimérica, tal como uma resina de Wang, uma resina de Rink ou uma resina de cloreto de 2- clorotritila.

[231] Além disso, todos os compostos da invenção que existem na forma de base ou ácido livres podem ser convertidos nos seus sais por tratamento com a base ou ácido inorgânicos ou orgânicos apropriados por métodos conhecidos pelos técnicos especialistas na técnica. Os sais dos compostos da invenção podem ser convertidos na sua forma de base ou ácido livres por técnicas padrão.

[232] Os Esquemas Reacionais que se seguem ilustram exemplos de métodos para fazer compostos desta invenção. Entende-se que um técnico especialista na técnica pode ser capaz de fazer estes compostos por métodos similares ou combinando outros métodos conhecidos por um técnico especialista na técnica. Entende-se, também, que um técnico especialista na técnica seria capaz de fazer, de uma maneira similar à descrita abaixo, outros compostos de estrutura (I) não especificamente ilustrados abaixo usando os componentes de partida apropriados e modificando os parâmetros da síntese conforme necessário. Em geral, os componentes de partida podem ser obtidos a partir de fontes tais como Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI e Fluorochem USA etc. ou sintetizados de acordo com fontes conhecidas dos técnicos especialistas na técnica (vide, para exemplo, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5a edição (Wiley, dezembro de 2000)) ou preparados tal como descrito nesta invenção.

[233] Esquema Reacional I

[234] O Esquema Reacional I ilustra um exemplo de método para preparar um intermediário útil para a preparação de compostos de estrutura (I), em que R1, L2, L3 e M são conforme definido acima, R2 e R3 são como definidos acima ou são suas variantes protegidas e L é um agente de ligação opcional. Com relação ao Esquema Reacional 1, compostos de estrutura a podem ser adquiridos ou preparados por métodos bem conhecidos dos técnicos especialistas na técnica. A reação de a com M-X, em que x um halogêneo, tal como bromo, sob condições de acoplamento de Suzuki conhecidas na técnica resulta em compostos de estrutura b. Compostos de estrutura b podem ser usado para a preparação de compostos de estrutura (I) tal como descrito abaixo.

[235] Esquema Reacional II

[236] O Esquema Reacional II ilustra um método alternativo para a preparação de intermediários úteis para a preparação de compostos de estrutura (I). Com referência ao Esquema Reacional II, em que R1, L1, L2, L3, G e M são tais como definidos acima, e R2 e R3 são tais como definidos acima ou são variantes suas protegidas, faz-se reagir um composto de estrutura c, que pode ser adquirido ou preparado por técnicas bem conhecidas, com M-G' para produzir compostos de estrutura d. Aqui, G e G’ representam grupos funcionais com reatividade complementar (isto é, grupos funcionais que reagem para formar uma ligação covalente). G' pode ser “pendurado” a M ou a uma parte do “esqueleto” (“backbone”) estrutural de M. G e G 'podem ser qualquer número de grupos funcionais aqui descritos, tais como alcino e azida, respectivamente, amina e éster ativado, respectivamente, ou amina e isotiocianato, respectivamente, e semelhantes.

[237] O composto de estrutura (I) pode ser preparado a partir de estruturas b ou d por reação em condições bem conhecidas de síntese de DNA automatizada com um composto de fosforamidito que tem a seguinte estrutura (e):em que A é tal como aqui definido e cada L é independentemente um agente de ligação opcional.

[238] Métodos de síntese de DNA são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, dois grupos álcool, por exemplo, R2 e R3 em intermediários b ou d acima, são funcionalizados com um grupo dimetoxitritila (DMT) e um grupo 2-cianoetil- N, N-diisopropilamino fosforamidito, respectivamente. O grupo fosforamidito é acoplado a um grupo álcool, tipicamente na presença de um ativador tal como tetrazol, seguido de oxidação do átomo de fósforo com iodo. O grupo dimetoxitritila pode ser removido com ácido (por exemplo, ácido cloroacético) para expor o álcool livre, o qual se pode fazer reagir com um grupo fosforamidito. O grupo 2- cianoetila pode ser removido após oligomerização por tratamento com amônia aquosa.

[239] A preparação dos fosforamiditos usados nos métodos de oligomerização também é bem conhecida na técnica. Por exemplo, um álcool primário (por exemplo, R3) pode ser protegido como um grupo DMT por reação com DMT-Cl. Um álcool secundário (por exemplo, R2) é, então, funcionalizado como um fosforamidito por reação com um reagente apropriado, tal como 2-cianoetil-N, N-dissopropilclorofosforamidito. Os métodos para a preparação de fosforamiditos e a sua oligomerização são bem conhecidos na técnica e descritos em maior detalhe nos exemplos.

[240] Os compostos de estrutura (I) são preparados por oligomerização do intermediário b ou d e e de acordo com a bem conhecida química de fosforamiditos descrita acima. O número desejado de m e n unidades de repetição é incorporado na molécula repetindo-se o acoplamento de fosforamidito o número de vezes desejado. Entender-se-á que os compostos de estrutura (II), tais como descritos abaixo, podem ser preparados por métodos análogos.

[241] Em várias outras modalidades, são fornecidos compostos úteis para a preparação do composto de estrutura (I). Os compostos podem ser preparados como descrito acima em forma monomérica, dimérica e/ou oligomérica e, então, o grupamento M ligado covalentemente ao composto através de qualquer número de metodologias sintéticas (por exemplo, das reações “click” descritas acima) para se formar um composto de estrutura (I). Por conseguinte, em várias modalidades, é fornecido um composto com a seguinte estrutura (II):ou um estereoisômero, sal ou tautômero seus, em que

[242] G é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo, ou um análogo seu protegido, capaz de formar uma ligação covalente com um grupo reativo complementar;

[243] L1a, L2 e L3 são, em cada ocorrência,independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico;

[244] L4 é em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento superior a três átomos, em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S;

[245] R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi;

[246] R2 e R3 são cada um, independentemente, H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, heteroalquila, -OP(=Ra)(Rb)Rc, Q ou L';

[247] R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[248] R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente;

[249] Ra é O ou S;

[250] R b é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[251] Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, OL', SRd, alquila, alcóxi, éter alquílico, éter alcoxialquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfaloalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico;

[252] Rd é um contra-íon;

[253] Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo, ou análogo seu protegido, capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito, um grupamento de direcionamento, um suporte sólido ou um grupo reativo complementar Q‘;

[254] L 'é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a Q, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma porção de direcionamento, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um suporte sólido , um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um resíduo de suporte sólido, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um nucleosídeo ou um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I);

[255] m é, em cada ocorrência, independentemente, um inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e

[256] n é um número inteiro igual a um ou maior.

[257] Em outras modalidades de estrutura (II):

[258] G é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com um grupo reativo complementar;

[259] L1a, L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico;

[260] L4 é em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos, em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S;

[261] R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi;

[262] R2 e R3 são cada um, independentemente, H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter de alquila, -OP(=Ra)(Rb)Rc, Q, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (II), em que Ra é O ou S; Rb é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd; Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, SRd, alquila, alcóxi, éter alquílico, éter alcóxi-alquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfoalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico; e Rd é um contra- íon;

[263] R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[264] R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente;

[265] Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito, um suporte sólido ou um grupo reativo complementar Q‘;

[266] m é, em cada ocorrência, independentemente um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e

[267] n é um número inteiro igual a um ou maior.

[268] O grupamento G no composto de estrutura (II) pode ser selecionado a partir de qualquer grupamento compreendendo um grupo que tenha o grupo reativo apropriado para formar uma ligação covalente com um grupo complementar em um grupamento M. Em exemplos de modalidades, o grupamento G pode ser selecionado a partir de qualquer um dos grupamentos Q aqui descritos, incluindo-se os exemplos específicos fornecidos na Tabela 1. Em algumas modalidades, G compreende, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento apropriado para reações que incluem a reação catalisada por cobre de uma azida e um alcino para se formar um triazol (cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen), reação de um dieno e um dienófilo (Diels-Alder), cicloadição de alcino- nitrona promovida por tensão, reação de uma alceno tensionado com uma azida, tetrazina ou tetrazol, cicloadição de alceno e azida [3+2], Diels-Alder de demanda inversa entre alceno e tetrazina, fotorreação de alceno e tetrazol e várias reações de deslocamento, tais como deslocamento de um grupo de saída por ataque nucleofílico em um átomo eletrofílico.

[269] Em algumas modalidades, G é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo funcional aldeído, oxima, hidrazona, alcino, amina, azida, acilazida, haleto de acila, nitrila, nitrona, sulfidrila, dissulfeto, haleto de sulfonila, isotiocianato, imidoéster, éster ativado, cetona, carbonila α,β- insaturada, alceno, maleimida, α-haloimida, epóxido, aziridina, tetrazina, tetrazol, fosfina, biotina ou tiirano.

[270] Em outras modalidades, G compreende, em cada ocorrência, independentemente, um grupo alcino ou azida. Em outras modalidades, G compreende, em cada ocorrência, independentemente, um grupo amino, isotiocianato ou érster ativado. Em diferentes modalidades, G compreende, em cada ocorrência, independentemente, um grupo reativo capaz de formar um grupo funcional compreendendo um grupo alceno, éster, amida, tioéster, dissulfeto, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila, após reação com o grupo reativo complementar. Por exemplo, em algumas modalidades, a heteroalila é triazolila.

[271] Em várias outras modalidades do composto de estrutura (II), L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6 ou alquinileno C2-C6.

[272] Em outras modalidades, o composto tem a seguinte estrutura (IIA): em que x1, x2, x3 e x4 são, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 0 a 6.

[273] Em outras modalidades de estrutura (II), cada L1a está ausente. Em outras modalidades, cada L1a está presente, por exemplo L1a é, em cada ocorrência, independentemente, heteroalquileno. Em certas modalidades, L1a tem a seguinte estrutura:

[274] Em outra de qualquer uma das modalidades anteriores do composto (II), G é, em cada ocorrência, independentemente

[275] Em várias modalidades do composto de estrutura (IIA), pelo menos uma ocorrência de x1, x2, x3 ou x4 é 1. Em outras modalidades, x1, x2, x3 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência. Em outras modalidades, x1 e x3 são, cada um, 0 em cada ocorrência. Em algumas modalidades, x2 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência. Ainda em outras modalidades, x1 e x 3 são, cada um, 0 em cada ocorrência, e x2 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência.

[276] Em algumas outras modalidades do composto de estrutura (II) ou (IIA), L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno. Em outras modalidades mais específicas, L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação óxido de alquileno. Por exemplo, em algumas modalidades, L4 é óxido de polietileno e o composto tem a seguinte estrutura (IIB):em que z é um número inteiro de 2 a 100, por exemplo, um número inteiro de 3 a 6.

[277] Em outras modalidades, R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, O- ou OR d, e em diferentes modalidades, R5 é, em cada ocorrência, oxo.

[278] Em algumas modalidades diferentes de qualquer um dos compostos anteriores de estrutura (II) ou (IIA), R1 é H.

[279] Em outras várias modalidades dos compostos de estrutura (II), R2 e R3 são cada um, independentemente, OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc. Em algumas modalidades diferentes, R2 ou R3 é OH ou _OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q.

[280] Ainda em mais modalidades diferentes de qualquer um dos compostos anteriores de estrutura (II), R2 e R3 sãom cada um, independentemente, _OP(=Ra)(Rb)Rc. Em algumas dessas modalidades, Rc é OL'.

[281] Em outras modalidades de estrutura (II), R2 e R3 são, cada um, independentemente _OP(=Ra)(Rb)OL', e L' é um agente de ligação heteroalquileno para: Q, um grupamento de direcionamento, um analito (por exemplo, molécula de analito), um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (II).

[282] O ligante L' pode ser qualquer agente de ligação adequado para ligar Q, um grupamento de direcionamento, um analito (por exemplo, molécula de analito), um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (II) ao composto de estrutura (II). De um modo vantajoso, certas modalidades incluem o uso de grupamentos L' selecionados para aumentar ou otimizar a solubilidade em água do composto. Em algumas certas modalidades, L' compreende um óxido de alquileno ou um grupamento fosfodiéster, ou combinações suas.

[283] Em certas modalidades, L' tem a seguinte estrutura:em que

[284] m'' e n'' são, independentemente, um número inteiro de 1 a 10;

[285] Re é H, um par de elétrons ou um contra-íon;

[286] L'' é Re ou uma ligação direta ou ligação a: Q, um grupamento de direcionamento, um analito (por exemplo, molécula de analito), um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (II).

[287] Em certas das modalidades anteriores, o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

[288] Em outras modalidades mais específicas de qualquer um dos compostos anteriores de estrutura (II), R2 ou R3 têm uma das seguintes estruturas:

[289] Certas modalidades dos compostos de estrutura (II) podem ser preparadas de acordo com métodos sintéticos de fase sólida análogos aos conhecidos na técnica para a preparação de oligonucleotídeos. Por conseguinte, em algumas modalidades, L' é uma ligação a um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido ou um nucleosídeo. Suportes sólidos compreendendo um grupo ativado de desoxitimidina (dT) estão prontamente disponíveis e, em algumas modalidades, podem ser empregados como material de partida para a preparação de compostos de estrutura (II). Por conseguinte, em algumas modalidades, R2 ou R3 têm a seguinte estrutura:

[290] Ainda em outras modalidades de compostos de estrutura (II), Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito ou com um suporte sólido. Em outras modalidades, Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo capaz de formar uma ligação covalente com um grupo reativo complementar Q‘. Por exemplo, em algumas modalidades, Q‘ está presente em um outro composto de estrutura (II) (por exemplo, na posição R2 ou R3), e Q e Q‘ compreendem grupos reativos complementares de tal modo que a reação do composto de estrutura (II) e do outro composto de estrutura (II) resulta em um dímero ligado covalentemente do composto de estrutura (II). Compostos multiméricos de estrutura (II) também podem ser preparados de uma maneira análoga e estão incluídos dentro do escopo de modalidades da invenção.

[291] O tipo de grupo Q e conectividade do grupo Q ao restante do composto de estrutura (II) não é limitado, desde que Q compreenda um grupamento com reatividade apropriada para se formar a ligação desejada.

[292] Em certas modalidades de compostos de estrutura (II), o Q é um grupamento que não é suscetível a hidrólise em condições aquosas, mas é suficientemente reativo para formar uma ligação com um grupo correspondente em uma molécula de analito ou do suporte sólido (por exemplo, uma amina, azida ou alcino).

[293] Certas modalidades de compostos de estrutura (II) compreendem grupos Q comumente empregados na área de bioconjugação. Por exemplo, em algumas modalidades, Q compreende um grupo reativo nucleofílico, um grupo reativo eletrofílico ou um grupo reativo de cicloadição. Em algumas modalidades mais específicas, Q compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, éster ativado, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida. Em algumas modalidades, o éster ativado é um éster de N-succinimida, imidoéster ou éster de polifluorofenila. Em outras modalidades, o alcino é uma alquilazida ou acilazida.

[294] São fornecidos exemplos de grupamentos Q para compostos de estrutura (II) na Tabela I acima.

[295] Assim como com compostos de estrutura (I), em algumas modalidades de compostos de estrutura (II), em que Q é SH, o grupamento SH tenderá a formar ligações dissulfeto com um outro grupo sulfidrila em um outro composto de estrutura (II). Por conseguinte, algumas modalidades incluem compostos de estrutura (II), que estão na forma de dímeros dissulfeto, sendo a ligação dissulfeto derivada de grupos SH Q.

[296] Em algumas outras modalidades de compostos de estrutura (II), um de R2 ou R3 é OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de analito é um ácido nucleico, um aminoácido ou um polímero seus. Em outras modalidades, a molécula de analito é uma enzima, receptor, ligante de receptor, anticorpo, glicoproteína, aptâmero ou príon. Em algumas modalidades, o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular. Ainda em modalidades diferentes, o suporte sólido é uma esfera polimérica ou uma esfera não polimérica.

[297] Em outras modalidades de compostos de estrutura (II), m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 10. Por exemplo, em algumas modalidades, m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, m é 2. Em algumas modalidades, m é 3. Em algumas modalidades, m é 4. Em algumas modalidades, m é 5.

[298] Ainda em diferentes modalidades de compostos de estrutura (II), n é um número inteiro de 1 a 100. Por exemplo, em algumas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 10. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é 2. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é 4. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é 6. Em algumas modalidades, n é 7. Em algumas modalidades, n é 8. Em algumas modalidades, n é 9. Em algumas modalidades, n é 10.

[299] Em outras modalidades diferentes, o composto de estrutura (II) é selecionado da Tabela 3: Tabela 3. Exemplos de Compostos de Estrutura (II)

[300] Em várias modalidades, G nos compostos da Tabela 3 é alcinila, tal como etinila. Em outras modalidades, G nos compostos da Tabela 3 é uma azida. Em outras modalidades, G nos compostos da Tabela 3 é amino (NH2). Em várias modalidades, G nos compostos da Tabela 3 é um isotiocianato. Em várias modalidades, G nos compostos da Tabela 3 é um éter ativado, tal como um éster de N- hidroxisuxxinimida.

[301] Os compostos de estrutura (II) podem ser usados em vários métodos, por exemplo em modalidades, é fornecido um método para marcar um analito, tal como uma molécula de analito, ou grupamento de direcionamento, compreendendo o método: (a) misturar qualquer um dos compostos descritos de estrutura (II), em que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com a molécula de analito; (b) formar um conjugado do composto e do analito ou grupamento de direcionamento; e (c) fazer reagir o conjugado com um composto de fórmula M-L1b-G‘, formando-se assim pelo menos uma ligação covalente por reação de pelo menos um G e pelo menos um G',

[302] em que

[303] M é um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[304] L1b é um agente de ligação alquileno, heteroalquileno ou heteroatômico opcional; e

[305] G‘ é um grupo reativo complementar a G.

[306] Uma modalidade diferente é um método para marcar um analito, tal como uma molécula de analito ou grupamento de direcionamento, compreendendo o método: (a) misturar qualquer um dos compostos de estrutura (II) aqui divulgados, em que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com um composto de fórmula M-L1b-G‘, formando-se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G ‘; e (b) fazer reagir o produto da etapa (A) com o analito ou grupamento de direcionamento, formando-se, assim, um conjugado do produto da etapa (A) e a molécula de analito,

[307] em que

[308] M é um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[309] L1b é um agente de ligação alquileno, heteroalquileno ou heteroatômico opcional; e

[310] G‘ é um grupo reativo complementar a G.

[311] Além disso, como notado acima, os compostos de estrutura (II) são úteis para a preparação de compostos de estrutura (I). Por conseguinte, em uma modalidade, é fornecido um método para preparar um composto de estrutura (I), compreendendo o método misturar um composto de estrutura (II) com um composto de fórmula M-L1b-G‘, formando-se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G‘, em que:

[312] M é um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[313] L1b é um agente de ligação alquileno, heteroalquileno ou heteroatômico opcional; e

[314] G‘ é um grupo reativo complementar a G.

[315] Os exemplos a seguir são fornecidos para fins de ilustração, não de limitação.

EXEMPLOS

[316] Métodos Gerais

[317] Foi realizada análise de espectros de de massas em um sistema Waters/Micromass Quattro micro MS/MS (no modo MS somente) utsando-se o software de aquisição MassLynx 4.1. A fase móvel usada para LC/MS de corantes foi 1,1,1,3,3,3- hexaflúoro-2-propanol (HFIP) 100 mM, trietilamina (TEA) 8,6 mM, pH 8. Fosforamiditos e moléculas precursoras também foram analisados usando-se um sistema Waters Acquity UHPLC com uma coluna Acquity BEH-C18 de 2,1 mm x 50 mm mantida a 45 °C, empregando-se um gradiente de fase móvel de acetonitrila/água. Os pesos moleculares para os intermediários monoméricos foram obtidos usando-se ionização realçada por infusão de cátions tropílio em um sistema Waters/Micromass Quattro micro MS/MS (no modo MS somente). Experimentos de perfis de excitação e emissão foram registrados em um fotômetro de espectros Cary Eclipse.

[318] Todas as reações foram realizadas em material de vidro seco em estufa sob uma atmosfera de nitrogênio, salvo indicação em contrário. Os reagentes para síntese de DNA comercialmente disponíveis foram adquiridos da Glen Research (Sterling, VA). Piridina anidra, tolueno, diclorometano, diisopropiletilamina, trietilamina, ácido acético, piridina e THF foram adquiridos da Aldrich. Todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Aldrich ou da TCI e foram usados sem qualquer purificação adicional.

[319] EXEMPLO 1

[320] SÍNTESE DE CORANTES COM ESPAÇADOR ETILENOGLICOL

[321] Os compostos com ligantes de óxido de etileno foram preparados como se segue:

[322] As construções de oligofluorosídeos (i.e., compostos de estrutura (I)) foram sintetizadas em um sintetizador de DNA/RNA Applied Biosystems 394 em uma escala de 1 μmol e possuíam um grupo 3’-fosfato ou 3’-S2-(CH2) 6—OH ou qualquer um dos outros grupos aqui descritos. A síntese foi realizada diretamente em esferas de CPG ou em suporte sólido de poliestireno, usando-seímica padrão de fosforamiditos Os oligofluorosídeos foram sintetizados na direção 3’-5’ usando-se métodos padrão de DNA em fase sólida e o acoplamento empregou química padrão de β- cianoetilfosforamiditos. Fluorosideo fosforamidito e os espaçadores (por exemplo, hexaetilóxi-glicol fosforamidito, trietilóxi-glicol fosforamidito, polietilenoglicol fosforamidito) e agente de ligação (por exemplo, 5’-amino- Modificador Fosforamidito e tiol-Modificadores S2 Fosforamidito) foram dissolvidos em acetonitrila para fazer soluções 0,1 M e foram adicionados em ordem sucessiva usando- se o seguinte ciclo de síntese: 1) remoção do grupo protetor 5’-dimetoxitritila com ácido dicloroacético em diclorometano, 2) acoplamento do fosforamidito seguinte com reagente ativador em acetonitrila, 3) oxidação de P(III) para se formar P(v) com iodo/piridina/água, e 4) proteção (“capping”) de quaisquer grupos 5’-hidroxila com anidrido acético/1-metilimidizol/acetonitrila. O ciclo de síntese foi repetido até que o construto de oligofluorosídeo de comprimento total estivesse montado. No final da montagem da cadeia, o grupo monometoxitritila (MMT) ou a grupo dimetoxitritila (DMT) foi removido com ácido dicloroacético em diclorometano.

[323] Os compostos foram fornecidos em suporte de vidro de poros controlados (CPG) a uma escala de 0,2umol e um tubo Eppendorf marcado. 400μL de 20-30% de NH4OH foram adicionados e misturados suavemente. Os tubos, abertos, foram colocados a 55 °C durante ~5 minutos ou até que o excesso de gases tivesse sido liberado e, então, foram fechados firmemente e incubados durante 2 horas (+/- 15 min.). Os tubos foram removidos do termobloco e deixados até que atingissem a temperatura ambiente, seguindo-se centrifugação a 13.400 RPM durante 30 segundos para consolidar o sobrenadante e os sólidos. O sobrenadante foi cuidadosamente removido e colocado em um tubo marcado e, então, foram adicionados 150 μL de acetonitrila para se lavar o suporte. Depois de a lavagem ter sido adicionada aos tubos, eles foram colocados em um aparelho CentriVap a 40 °C até que secassem.

[324] Os produtos foram caracterizados por ESI-MS (ver Tabela 2), absorbância de UV e espectroscopia de fluorescência.

[325] EXEMPLO 2

[326] TESTES ESPECTRAIS DE COMPOSTOS

[327] Os compostos secos foram reconstituídos em 150 μL de Na 0,1 M tampão de Na2CO3 para fazer um estoque de ~ 1 mM. O estoque concentrado foi diluído 50x em PBS 0,1x e analisado em um espectrômetro UV NanoDrop para se obter uma leitura de absorbância. As leituras de absorbância foram usadas juntamente com o coeficiente de extinção (75.000 M- 1cm-1 para cada unidade FAM) e a Lei de Beer para se determinar uma concentração real do estoque.

[328] A partir das concentrações de estoque calculadas, foram feitos ~ 4mL de uma solução 5μM em Na2CO3 0,1 M (pH 9) e analisados em uma cubeta de quartzo de 1 x 1 cm em um espectrômetro UV Cary 60, usando-se um intervalo espectral de 300 nm a 700 nm, para se medir a absorbância global em relação ao grupo. A partir destas soluções 5 μM, foi realizada uma segunda diluição ou a 50 nM ou a 25 nM (também em Na2CO3 0,1 M, pH 9) para análise espectral em um Fluorímetro Cary Eclipse. A excitação foi estabelecida em 494 nm e os espectros de emissão foram coletados de 499 a 700 nm.

[329] A FIG. 1 e FIG. 2 fornecem a absorbância UV de compostos representativos de estrutura (I) e um composto comparativo (“Composto A”). Como visto nas FIGs. 1 e 2, o coeficiente de extinção UV de compostos representativos de estrutura (I) compreendendo dois grupamentos fluoresceína é aproximadamente o dobro daquele do composto A.

[330] Também foram determinados os espectros de emissão de fluorescência de compostos representativos de estrutura (I) e comparados com o espectro de emissão do composto A. Como demonstrado pelos dados nas FIGs. 3 e 4, a emissão de fluorescência de compostos representativos de estrutura (I) é superior à do composto A, e a emissão aumenta à medida que o número de unidades de trietilenoglicol ou hexaetilenoglicol aumenta. Embora não se pretenda estar limitado pela teoria, acredita-se que este aumento inesperado na emissão de fluorescência esteja relacionado a uma diminuição da supressão interna associada à distância espacial proporcionada por L4.

[331] Os compostos I-10 e I-11 foram testados para se determinar o efeito do número de grupamentos M na absorbância UV e na emissão de fluorescência dos compostos. A FIG. 5 fornece dados que comparam a absorbância UV dos compostos I-10 e I-11 com um composto comparativo com um único grupamento M (“Composto B”) a 5 μM. A 5uM, o Composto B, que contém uma única unidade FAM, absorveu a 0,43 UA, enquanto o composto I-10 (3 unidades FAM) absorveu a 1,17 UA e o composto I-11 (5 unidades FAM) absorveu a 2,00 UA.

[332] Composto B

[333] Os espectros de emissão de fluorescência para os compostos I-10, I-11 e B a 25 nM são apresentados na FIG. 6. Em vez de supressão (tal como unidades FAM menos espaçadas fariam), os compostos I-10 e I-11 mostraram respostas de emissão que estavam aumentadas de 2,5x e 4,3x, respectivamente, em comparação com o valor do Composto B.

[334] EXEMPLO 3

[335] RESPOSTA DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA COMPARATIVA

[336] Compostos “HEG”, “TEG”, “C2”, “C3”, “C4” e “C6”, em que R2 e R3 são tais como definido para o composto I-3 e m variaram de 1 a 9, foram preparados e os seus espectros de emissão de fluorescência, determinados. Os resultados são apresentados na FIG. 7. Os dados mostram que os compostos de acordo com fmodalidades da presente invenção (isto é, HEG e TEG) têm emissão de fluorescência aumentada com menos grupamentos espaçadores se repetindo (isto é, valores mais baixos de m) em relação a outros compostos corantes.

[337] A FIG. 8 fornece dados que comparam a emissão de fluorescência para o composto “HEG”, em que m é 1, 2 ou 3, em relação ao Composto A (50nM, pH = 9). Os dados mostram um aumento na emissão de fluorescência para HEG em relação ao Composto A quando m é maior do que 2.

[338] EXEMPLO 4

[339] PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS REPRESENTATIVOS

[340] Compostos I-29, I-32 e análogos representativos foram preparados e testados para determinar se os compostos em que L4 é um ligante longo (PEG de ~ 1.000 daltons) tem propriedades similares aos compostos com agentes de ligação L4 mais curtos, mas com várias repetições (isto é, m é maior do que 1). A FIG. 9 fornece dados de absorbância UV para o composto I-60, o composto I-46 e o Composto B. Os dados mostram que compostos com ligantes agentes de ligação L4 longos têm uma absorvância UV semelhante àquelas dos compostos com múltiplas repetições de agentes de ligação mais curtos, e ambos os compostos têm uma absorbância aumentada em relação ao controle Composto B.

[341] EXEMPLO 5

[342] PREPARAÇÃO DO CORANTE 99-MÉRICO

[343] O composto I-42, com 33 grupamentos fluoresceína, foi preparado usando-se técnicas padrão de oligonucleótidos em fase sólida tal como aqui descrito. I42 (representado por “A” no esquema abaixo) foi trimerizado como ilustrado e descrito abaixo para formar um corante 99- mérico.

[344] Em um tubo de polipropileno de 200 μL, foram colocados tampão de fosfato de sódio (3,5 μL, 100mM, pH = 6,5) e uma solução de bis-dissulfeto I-42 (5,5 μL, 0,18 mM em água). A isto, foi adicionada uma solução tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP, 1,0 μL, 10mM em água). O tubo foi tampado, agitado em vórtex e incubado à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi dessalinizada através de colunas de dessalinização micro Zeba Spin (Pierce, Cat # 89877). A solução dessalinizada foi tratada com tampão fosfato de sódio (2,0 μL, 500mM, pH = 7,2) e uma solução em DMSO de bismaleimidoetano (BMOE, 1,0 μL, 0,25 mM) e incubada durante a noite à temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com água (100 μL) e analisada por PAGE (FIG. 10, Invitrogen EC6875, gel de TBE-Ureia 10%, 180V constantes, eletroforese interrompida quando a resolução das espécies de PM mais altas estava completa, visualizada por iluminação UV (365nm).

[345] Outros corantes oligoméricos com qualquer número desejada de grupamentos corantes são preparados de uma maneira análoga.

[346] EXEMPLO 6

[347] MÉTODOS GERAIS DE CITOMETRIA DE FLUXO

[348] Salvo indicação em contrário, os seguintes procedimentos gerais foram usados em todos os Exemplos a seguir.

[349] Lise do sangue total:

[350] Método de Cloreto de Amônio Tamponado. Para coloração de células vivas, sangue humano normal anticoagulado com etilenodiaminotetra-acetato (EDTA) é lisado em massa com solução de Cloreto de Amônio (ACK), 15 mL de sangue para 35 mL de lisado durante 15 min à temperatura ambiente (TA). As células foram lavadas duas vezes com 50% de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) 50% de Soro Fetal Bovino a 1% (FBS) Solução Tampão Fosfato-Salino de Dulbecco (DPBS) 1x com azida sódica 0,02%. As células foram então ressuspensas em 100 μL/teste/0,1-1x10e6 no plasma de doador. As células no plasma foram adicionadas aos anticorpos pré-diluídos para Vf de 100 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 1% e DPBS 1x com azida sódica 0,02% em placas HTS de propileno com 96 poços. Após incubação por 45 min. à TA, as células foram lavadas duas vezes com 50% de HBSS e 50% - FBS 1% e DPBS 1x com azida sódica 0,02%.

[351] Método de Lise/Fixação. O sangue foi lisado com 1,0 mL de solução de lise RBC (cloreto de amônio), 100 - 15 mL de sangue para 35 mL de lisado durante 15 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com 50% de HBSS e 50% - FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02%. As células foram então ressuspensas em 100 μL/teste/1x10e6 de plasma de doador. Os anticorpos pré- diluídos foram adicionados em 100 μL de BSA 1% e DPBS 1x com azida sódica 0,02%. Foram adicionados 100 μL de células a placas HTS de propileno com 96 poços (tamanho de teste total de 200 μL). Após incubação por 45 min. à TA, as células foram lavadas duas vezes com 50% de HBSS e 50% FBS 1% e DPBS 1x com azida sódica 0,02%.

[352] Preparação de Conjugados de Anticorpos:

[353] Conjugados de anticorpo foram preparados fazendo-se reagir um composto de estrutura (I) compreendendo uma porção Q tendo a seguinte estrutura:com o anticorpo desejado. O composto e o anticorpo são assim conjugados por reação de um S no anticorpo com o grupamento Q para se formar a seguinte estrutura de ligação:

[354] Conjugados de anticorpos são indicados pelo nome do anticorpo seguido do número do composto. Por exemplo, UCHT1-I-45 indica um conjugado formado entre o composto I-45 e o anticorpo UCHT1. Se um número de composto referenciado não inclui o grupamento Q acima na Tabela 2, entende-se que a porção Q foi instalada e o conjugado preparado a partir do composto resultante tendo a porção Q.

[355] Diluição de conjugados:

[356] Anticorpos foram trazidos à TA. Os conjugados de anticorpos foram diluídos para concentrações de um intervalo de 0,1-540 nM (8,0 microgramas ou menos por teste) em um tampão para coloraçãoo de células (DPBS 1X, BSA 1%, azida sódica 0,02%). Em alguns exemplos, as diluições em série para cada amostra começaram com o anticorpo a 269 nM no tampão de coloração de células, tendo permanecido as diluições de anticorpos protegidas da luz até seu uso. Em outros experimentos, as diluições começaram com 4,0 μg de anticorpo/tamanho de teste, tendo o tamanho de teste variado entre 100-200 μl. Foram feitas titulações em diluições de duas ou quatro vezes para se gerar curvas de ligação. Em alguns casos, 8,0 ou 2,0 μg/tamanho de teste foram usados no primeiro poço em uma série de diluições.

[357] Citometria de fluxo com conjugado:

[358] Após a caracterização física, os conjugados foram testados quanto à atividade e funcionalidade (afinidade e brilho de ligação de anticorpos de corante) e comparados com uma coloração de referência de anticorpos. Então, a qualidade da resolução foi determinada pela avaliação do brilho em comparação com controles negativos auto-fluorescentes e outros de ligação não específica usando o citômetro de fluxo. Estudos extensivos dos conjugados MOPC- 21 isotipo controle IgG1 k de camundongo não foram incluídos ao testar I-45 porque a ligação não específica de MOPC-21 foi caracterizada durante os testes de UCHT1-Composto C e UCHT1-I-45 em testes anteriores. Os conjugados I-45 foram testados em células T Jurkat, células Ramos B e em uma população heterogênea de leucócitos em sangue humano ou em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) usando-se esferas de poliestireno revestidas com Ig de cabra anti-camundongo. O rastreamento (“screening”) de sangue total foi a mais rotineira para se testar UCHT1 I-45 e seus análogos. Estudos de ponte (“bridging studies”) foram implementados à medida que novos construtos eram formados. Métodos adicionais de citometria de fluxo foram usados ao se testar conjugados (UCHT1-I-56, I-48, I-49, I-16, e I-21B) e comparados com conjugados de anticorpos de referência da Sony Biotechnology (UCHT1-FITC) e as principais referências de ponte (“bridging references”) previamente caracterizadas (por exemplo, UCHT1-I-45, UCHT1-I-49) na maioria dos estudos.

[359] Realização de citometria de fluxo com corante livre:

[360] Após a caracterização molecular e física, os corantes também foram testados quanto à afinidade potencial por células em comparação com coloração de corante de referência. Como os corantes têm o potencial de também funcionar como sondas celulares e se ligam ao material celular, os corantes podem ser geralmente rastreados (“screened”) em sangue a altas concentrações (> 100nM- 10.000nM) para se determinar características específicas. A ligação esperada ou inesperada do alvo foi então qualificada avaliando-se brilho e linearidade após diluição em comparação com controles negativos auto-fluorescentes e outros controles de corantes usando-se o citômetro de fluxo. Estudos do Composto D (um Composto C corante livre, porém não funcionalizado) foi o controle positivo para a ligação brilhante fora do alvo de corantes e foi previamente caracterizado quando na forma conjugada. Os corantes I-45 foram testados em populações heterogêneas de leucócitos no sangue humano, quando as células são tratadas com solução de lise e fixação, e quando o sangue é envelhecido, ou quando se aplica a populações de monócitos de PBMC. Estudos de ponte (“bridging studies”) classificando a afinidade (Composto D, I-45, I-49 e I-16) foram realizados para comparações de lotes de corantes, incluindo-se corantes de estudos muito iniciais, ao se caracterizar o Composto D. Composto D

[361] Fluxo de Trabalho da Citometria de Fluxo:

[362] As células foram cultivadas e observadas quanto a sinais visuais de estresse metabólico para o rastreamento (“screening”) de corantes ou para ligação fora do alvo (dados não mostrados), ou foram usadas células saudáveis frescas para rastreamento (“screening”) de conjugados. As células foram contadas periodicamente para se verificar a densidade celular (1 x 10e5 e 1 x 10e6 células viáveis/mL). Os conjugados de anticorpo foram diluídos (preferencialmente, em placa ou tubos) antes de se colherem as células em tampão de coloração (DPBS, BSA 0,1%, azida sódica 0,02%). Foram usadas células com um faixa de viabilidade de 80 a 85%. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação e lavagem das células com tampão para se remover o indicador de pH e bloquear as células com Ig e outras proteínas contidas em FBS. A densidade celular foi ajustada para o tamanho do teste em tampão de coloração. As células foram plaqueadas, um teste por poço, ou corantes (pré-diluídos) foram aplicados às células na placa. Depois, as células foram incubadas 45 min a 23 °C. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação e lavagem das células com tampão de lavagem e, então, aspiração da placa. As células foram ressuspensas no tampão de aquisição. 5000 células intactas foram adquiridas por citometria de fluxo.

[363] A fluorescência dos corantes foi detectada por uma linha de laser azul de 488 nM por citometria de fluxo com emissão máxima (521 nM) detectada usando-se um filtro passa-banda de 525/50. Pelo menos 1500 células intactas, com aquisições de alvos de 3000-5000 células intactas, foram adquiridas por citometria de fluxo e analisadas para se identificar células viáveis presentes na preparação celular.

[364] Métodos de análise de dados:

[365] Estatística descritiva. O software EC-800 permite que um usuário colete vários dados estatísticos para cada aquisição de amostras. Foi usada Intensidade de Fluorescência Média ou Mediana (MFI) no canal FL1-A para se medir o brilho de um reagente corante-anticorpo quando ele estava sendo analisado por citometria de fluxo e quando o ruído era avaliado. Outras estatísticas foram avaliadas para se determinar as características do corante e a qualidade global dos reagentes, incluindo-se mediana de Sinal-Ruído e fluorescência absoluta (mediana ou média geométrica).

[366] Histogramas. Os eventos de citometria de fluxo foram selecionados (“gated”) por tamanho no desvio frontal (“forward scatter”) versus desvio lateral (“side scatter”) (volume celular versus granularidade celular). Essas células foram então selecionadas por emissão fluorescente a 515 nm quanto à Intensidade de Fluorescência Média (MFI). Os dados coletados são apresentados como histogramas de parâmetros duplos plotados como número de eventos no eixo y versus intensidade fluorescente, que é representada em uma escala logarítmica no eixo x. Os dados podem ser resumidos por curvas de afinidade ou histogramas de intensidade de fluorescência relativa.

[367] Curvas de Ligação. Escolheu-se MFI por ser o parâmetro que melhor mede o brilho de um reagente corante- anticorpo quando ele está sendo avaliado por FCM, isto pode ser expresso como a média geométrica, mediana ou média, e representa medições absolutas de fluorescência. Para comparação, quando o ruído pode ser bem caracterizado, uma relação Sinal-Ruído é reportada como MFI, S/N. Nos Exemplos 7, 8 e 14, é mostrada a MFI do conjugado UCHT1-Composto C versus concentração para se demonstrar curvas de ligação do reagente.Histogramas de Dois Parâmetros, Bi-Variados. Em alguns casos, os eventos de FCM não foram selecionados (“gated”) para avaliar resultados qualitativos e os dados são expressos por granularidade celular (SSC) versus fluorescência do corante. Este método permite a avaliação global de todas as populações recuperadas no sangue total.

[368] EXEMPLO 7

[369] AVALIAÇÃO DE CORANTES PARA LIGAÇÃO NÃO ESPECÍFICA E FORA DO ALVO USANDO-SE POPULAÇÕES NECROSADAS E APOPTÓTICAS DE CÉLULAS T JURKAT SUBMETIDAS A ESTRESSE TÉRMICO

[370] As células Jurkat foram cultivadas de acordo com instruções fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC), colhidas vivas, submetidas a estresse térmico, lavadas 2-3x e coradas com anticorpos conjugados. A coloração foi realizada aplicando-se células a corantes pré-diluídos e anticorpos conjugados pré-diluídos, com incubação, lavagem e, então, aquisição por citometria de fluxo. A população de células mortas e necrosadas (~10% das células adquiridas) foi avaliada quanto ao sinal de fluorescência. Os resultados são mostrados na FIG. 11. Como observa-se que a fluorescência é maior D corante livre em comparação com I-47 10x , Composto E 5x, I-44 5x, Composto F 3x, e I-43 3x.

[371] EXEMPLO 8

[372] AVALIAÇÃO DE CONJUGADOS PARA INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA: UCHT1-COMPOSTO G VS. UCHT1-I-51

[373] Células Jurkat viáveis foram cultivadas de acordo com instruções fornecidas pela ATCC colhidas e, então, recuperadas a ~ 225 RCF por 6 minutos em centrífuga com temperatura controlada e ajustada a 23 oC. O sobrenadante foi removido. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em tampão de suspensão celular (DPBS 1x livre de cálcio e magnésio, FBS 1,0%, azida sódica 0,02%, pH 7,2). Após a segunda lavagem, as células foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido e as células (~ 5 x 105 células viáveis por amostra) foram ressuspensas para o tamanho do teste (volume final de 100 μL). As células foram incubadas com soluções de conjugado de corante e anticorpo durante 45 minutos à TA. Após a incubação, as amostras foram lavadas duas vezes e, então, suspensas em tampão de aquisição.

[374] Os dados foram adquiridos e avaliados no SONY EC-800 FCM e plotados nM de proteína de anticorpo versus média geométrica de fluorescência relativa, como mostrado na FIG. 12. Como pode ser visto, MOPC-21-Composto G tem ligação não específica, mas ambos os conjugados são 4-5x mais brilhantes do que a referência FITC. Este exemplo também demonstra que MOPC21-I-51 mostra ligação não específica reduzida em comparação com conjugado UCHT1-Composto G (nestes níveis de corante em marcação (“dye on label, DOL”)

[375] EXEMPLO 9

[376] AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CD3 (ESPECIFICIDADE E RESOLUÇÃO) EM AMOSTRA DE CÉLULAS HETEROGÊNEAS E CÉLULAS DO SANGUE TOTAL PERIFÉRICAS

[377] Sangue total foi retirado de um doador normal para um tubo de amostra estabilizado com EDTA para transporte e armazenamento a curto prazo. O sangue foi lisado com ACK, 15 mL de sangue para 35 mL de lisado por 15 min à TA. As células foram lavadas duas vezes com 50% de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) e 50% - FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02%. As células foram ressuspensas em 100 μL/teste/1x10e6 no plasma de doador. Os anticorpos foram pré-diluídos em 100 μL de BSA 1% e DPBS 1x com azida sódica 0,02% e foram adicionados a 100 μL de células em placas HTS de polipropileno com 96 poços (total de 200 μL de tamanho de teste). As células foram incubadas durante 45 min. à TA, lavadas duas vezes com 50% de HBSS e 50% - FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02% e ressuspensas em FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02%.

[378] A FIG. 13 mostra comparações de conjugação de I-51 e Composto G anticorpo de referência. Na FIG. 13, a morfologia celular (SSC-Lin) é mostrada em um histograma de parâmetros duplos com emissão de corante detectada no canal FL1-A. Isto mostra a ligação não específica (NSB) do conjugado de Composto G na população heterogênea de células, principalmente neutrófilos e monócitos, enquanto conjugados de I-51 não mostram NSB. A NSB de UCHTl-Composto G em sangue total lisado, efetivamente reduz o anticorpo disponível para ligação a CD3

[379] A FIG. 14 mostra uma comparação de UCHT1-I- 51, UCHT1 BB515 e UCHT1-FITC. UCHT1-I-51 é 6x mais brilhante do que UCHT1-FITC.

[380] EXEMPLO 10

[381] NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE CD3 COMPARADOS A UMA CURVA PADRÃO DE MOLÉCULAS DE FLUOROCROMO EQUIVALENTE (MEF).

[382] Usando-se sangue total lisado, a expressão de CD3 com elevada densidade antigênica foi visualizada através de resultados de intensidade de fluorescência e comparada com os resultados de fluorescência de esferas com 6 Picos (ou 8 picos) (Sony Biotech, No. Cat. AE700520) para se estimar Valores de MEF. UCHT1-FITC, usado como referência, UCHT1-Composto G e UCHT1-I-51, bem como o UCHT1-BB515, usado como um conjugado de referência adicional, foram comparados no mesmo experimento usando-se padrões. Esferas com 6 Picos consistiram em uma mistura de esferas de 3,8 mícrons com 6 intensidades de fluorescência diferentes e foram usadas para se verificar a linearidade e sensibilidade do instrumento e para se estimar MEF quando de corridas em paralelo em um dado protocolo.

[383] A FIG. 15 mostra níveis de expressão de CD3 em comparação com uma curva padrão de MEF. Como pode ser visto, I-51 é aproximadamente 6x mais brilhante do que a referência e o Composto G é cerca de 2x mais brilhante. Os intervalos de concentração mostrados são 133 nM e abaixo. Note-se que, em comparação, a FIG. 13 mostra que a ligação não específica de UCHT1-Composto G em sangue total lisado efetivamente reduziu o anticorpo disponível para ligação a CD3

[384] EXEMPLO 11

[385] COMPARAÇÃO DE FRAÇÕES UCHT1 I-16 COM CONJUGADOS DE FITC E I-56

[386] As esferas foram pré-tratadas (agitadas em vórtex e sonicadas) e lavadas e as contagens de esferas foram calibradas para uma diluição de 2x C tal como determinado em experimentos preliminares para otimizar as aquisições e visar uma curva de saturação linear. As esferas foram incubadas com conjugados de anticorpo, lavadas e, então, adquiridas por citometria de fluxo. Uma solução de BSA 0,1% em DPBS 1x foi usada para diluições, lavagem e aquisição de esferas. Os anticorpos foram pré-diluídos em Tampão de Coloração BSA 1% em placas de polipropileno com 96 poços iniciando-se com 4,0 μg em um volume de 200 μl no primeiro poço e então diluídos em série em 100 μl em cada poço subsequente durante pelo menos 8 diluições (de duas vezes). Esferas completamente agitadas em vórtex (a 2x C) foram então adicionadas e 100 μL de esferas foram adicionados a 100 μL de anticorpo em cada poço. As esferas foram incubadas durante 20 minutos à TA, lavadas e adquiridas por citometria de fluxo.

[387] Os resultados são mostrados na FIG. 16. UCHT1-I-16 em DOL ~ 3,0 aproximou-se do máximo teórico. Como mostrado na FIG. 17, um experimento semelhante foi realizado para destacar as diferenças na curva de afinidade observadas entre UCTH1-I-16 e a referência de ponte (“bridging”) com uma amarra mais longa, UCHT1-I-56.

[388] EXEMPLO 12

[389] ANÁLOGO SEMELHANTE A UCHT1 I-51, UCHT1 I-16, COMPARADO COM UCHT1 I-56 (10X) E UCHT1 I-53 (6X)

[390] Leucócitos (WBC) periféricos foram tratados com tampão de lise, tamponado com ACK, por 20 minutos a 25 °C, enquanto eram agitados lentamente e, então, foram centrifugados e o tampão de lise, removido. As células foram lavadas uma vez com HBSS, pH 7,2 e, então, HBSS 1x contendo FBS 0,5% e Azida Sódica 0,02%, pH 7,2, e ressuspensas em Tampão de Coloração (DPBS 1x, BSA 1% , Azida Sódica 0,02%, pH 7,2). As células foram, então, aplicadas a anticorpos conjugados pré-diluídos e incubadas durante 40 minutos a 2325 °C protegidos da luz.

[391] A FIG. 18 mostra uma comparação do análogo semelhante a UCHT1-I-51, UCHT1-I-16, com UCHT1-I-56 (10x) e UCHT1-I-53 (6x).

[392] EXEMPLO 13

[393] ANÁLOGO SEMELHANTE A UCHT1 I-51, UCHT1 I-16,COMPARADO COM UCHT1 I-56 (10X) E UCHT1 I-53 (6X)

[394] Os anticorpos foram avaliados quanto à ligação específica e resolução de fluorescência por citometria de fluxo. Células Jurkat foram cultivadas de acordo com instruções fornecidas pela ATCC e colhidas ao vivo. A coloração foi realizada quando as células foram aplicadas a anticorpos conjugados pré-diluídos, incubadas durante 20-40 minutos, lavadas e, então, adquiridas por citometria de fluxo. O análogo semelhante a UCHT1-I-51, UCHT1-I-16, foi comparado com UCHT1-I-56 (10x) e UCHT1-I-53 (6x). Os resultados são mostrados na FIG. 19.

[395] EXEMPLO 14

[396] COMPARAÇÃO DA RESOLUÇÃO DO CONJUGADO UCHT1 POR ANÁLISE DE REGRESSÃO

[397] As células foram isoladas a partir do sangue total periférico e congeladas em tampão de congelamento. As células foram descongeladas, repousadas, tratadas com plasma autólogo para se bloquear FcR e para mimetizar um ambiente de sangue total, lavadas duas a três vezes e, então, coradas com conjugado de forma muito semelhante a quando se utiliza sangue total. As esferas foram pré-calibradas para se otimizar as aquisições e atingir a saturação na coloração de anticorpos. As esferas foram incubadas com conjugados de anticorpo, lavadas e, então, adquiridas por citometria de fluxo.

[398] A análise de regressão foi realizada em dados produzidos durante o teste de UCHT1-I-16 e UCHT1-I-49 para se demonstrar equivalência entre conjugações. Os resultados são mostrados na FIG. 20.

[399] EXEMPLO 15

[400] TESTES DE AFINIDADE POR I-49 E I-16 DE CORANTE BRUTO NO SANGUE TOTAL

[401] O corante foi rastreado (“screened”) usando- se o método de coloração, lise, fixação e lavagem de sangue total para se avaliar o fundo (“background”) em três populações, monócitos, granulócitos e linfócitos, em um teste de equivalência na presença de excesso de corante. Os granulócitos presentes no sangue total foram escolhidos como alvo principal para as análises. Embora os linfócitos e monócitos também tenham sido estudados, os dados não são mostrados em gráficos de regressão.

[402] Foi usado um excesso do corante bruto (primeira titulação iniciando-se em 10.000 nM) sem estar presente o conjugado de anticorpo de modo a realçar, mas também qualificar, as diferenças de ligação não específicas entre os dois construtos quase idênticos. Leucócitos (WBC) periféricos foram tratados com tampão de lise, ACK tamponado, por 20 minutos a 25 °C, enquanto eram agitados lentamente e, então, foram centrifugados e o tampão de lise, removido. Um solução de lise de células vermelhas e fixação foi aplicada ao corante e às células e as células foram, então, lavadas uma vez com HBSS, pH 7,2 e, então, HBSS 1x contendo FBS 0,5% e Azida Sódica 0,02%, pH 7,2, e, então, ressuspensas em Tampão de Coloração (DPBS 1x, BSA 1% DPBS, Azida Sódica 0,02%, pH 7,2).

[403] Os dados de MFI Relativa foram combinados de acordo com a concentração e comparados por análises de regressão para se demonstrar o nível de concordância e/ou similaridade entre I-45 e I-16 brutos. Neste teste, descobriu-se que I-45 e I-16 têm níveis de fundo (“background ”) quase equivalentes. Usando-se os mesmos dados do rastreamento (“screening”) de corantes, os análogos de I45 (I-49 e I-16) sobrepõem-se um ao outro quando se examinam toda a curva de titulação e os controles. Análogos de I-45 têm MFIs ficam no meio de MFIs de controles incluídos para referência foram o Composto D (10x) e dois análogos Composto D (análogos i e ii) com grupos espaçadores de alquileno mais longos. I-49 tem um fundo (“background”) ligeiramente maior do que I-16 e a fundo (“ background ”) de I-16 é muito semelhante a I-45. Os construtos de fluoróforos 10x são mais apagados em ligação não específica do que o 6x, demonstrando a efetividade da modulação do esqueleto (“backbone”) para se acomodar fluoróforos adicionais enquanto se reduzem as propriedades de ligação não específica da molécula 10x. Os resultados são mostrados na FIG. 21A-21C. A FIG. 21A mostra correlações entre I-16 e I-45. A FIG. 21B mostra curvas de titulação sobrepostas e comparadas com referências; e a FIG. 21C mostra exemplos de dados qualitativos demonstrando FL de fundo (“background FL”) e morfologia celular comparando o Composto D e I-45.

[404] EXEMPLO 16

[405] COMPARAÇÃO DE UCHT1-I-21B E UCHT1-I-16 EM CÉLULAS DO SANGUE QUE FORAM FIXADAS E ARMAZENADAS POR 72 HORAS

[406] Foi retirado sangue total de um doador normal para um tubo de amostra estabilizado com EDTA para transporte e armazenamento a curto prazo. O sangue foi tratado com agentes de lise, ou antes ou depois de coloração com anticorpos. As células foram lisadas com ACK, 15 mL de sangue para 35 mL de lisado durante 15 min TA e depois lavadas duas vezes com 50% de HBSS e 50% de FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02%. As células foram ressuspensas em 100 μL/teste/1x10e6 no plasma de doador. Anticorpos pré-diluídos em 100 μL de BSA 1% e DPBS 1x com azida sódica 0,02% foram adicionados a 100 μL de células, que foram então adicionadas a placas HTS de polipropileno com 96 poços (total de 200 μL de tamanho de teste). Após incubar as células por 45 min. à TA, as células foram lavadas duas vezes com 50% de HBSS + 50% FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02%. As células foram, então, ressuspensas em FBS 1% DPBS 1x com azida sódica 0,02%. As células foram lavadas mais uma vez, fixadas em paraformaldeído 2% a 200 μl/poço, lavadas uma vez com DPBS 1x, armazenadas durante 72 horas a 2-8 °C, lavadas mais uma vez usando-se DPBS 1x e, então, adquiridas usando-se BSA 0,1% em DPBS 1x.

[407] A resolução dos conjugados foi comparada com a referência, UCHT1-FITC, e com o brilho teórico para um DOL de 3,0. O novo construto UCHT1-I-21B melhor se compara aos valores teóricos teóricas quando DOL é 3,0 neste método, e é sete vezes mais brilhante do que UCHT1-FITC. Como mostra a FIG. 22, são mostradas curvas de afinidade, como histogramas, com emissão de compostos detectada no canal FL1-A.

[408] Uma avaliação da ligação não específica foi completada medindo-se a fluorescência dos granulócitos. A FIG. 23 mostra comparações de intensidade de fluorescência de ligações fora do alvo, não específicas de UCHT1-I-21B, UCHT1-I-16, e referência, UCHT1-FITC. Todas as frações e réplicas de UCHT1-I-21B mostram menos fundo (“background”) do que outros construtos e a referência FITC incluída no teste. Análise de regressão foi aplicada aos dados para avaliar correlações e afinidades relativas, tal como mostrado na FIG. 24, e foi determinado que UCHT1-I-21B não tem uma relação linear com UCHT1-I-16.

[409] EXEMPLO 17

[410] UCHT1 I-21B USANDO-SE O MODELO DE CÉLULAS JURKAT E UMA TITULAÇÃO SIMPLES DE DOIS PONTOS

[411] Semelhante ao Exemplo 16, um teste de UCHT1 I-21B foi realizado em uma titulação simples de dois pontos de 2,0 e 0,125 microgramas por teste de anticorpo. As células Jurkat foram cultivadas de acordo com instruções fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC), colhidas vivas ou submetidas a estresse térmico, lavadas 2-3x e, então, coradas com anticorpos conjugados. A coloração foi realizada quando as células foram aplicadas a anticorpos conjugados pré-diluídos, incubadas, lavadas e, então, adquiridas por citometria de fluxo.

[412] Como mostra a FIG. 25, UCHT1-I-21B demonstra maior afinidade em baixa concentração em comparação a UCHT1- I-51, como esperado. O sinal-ruído real excede o valor teórico em uma subsaturação C de 0,125 microgramas por teste e supera o desempenho de UCHT1-I-51.

[413] EXEMPLO 18

[414] COMPARAÇÃO DE UCHT1 COMPOSTO G E UCHT1 I-51 EM UM ESTUDO DE INTERFERÊNCIA DE PLASMA USANDO-SE PBMC

[415] PBMC e plasma autólogo foram previamente isolados a partir de sangue total periférico e, então, congelados em meio de congelamento. As células foram descongeladas, repousadas brevemente, lavadas duas ou três vezes e, então, coradas com anticorpos conjugados como se tivessem sido recentemente isoladas a partir de sangue total, com plasma autólogo ou HBSS presentes durante a coloração do anticorpo.

[416] UCHT1-Composto G interagu com monócitos para se formar eventos fluorescentes na presença de plasma de doador ativado e desativado e de adições de glicina 2,5%. A FIG. 26A mostra dados resultantes da adição de glicina 0% e a FIG. 26B mostra dados resultantes da adição de glicina 2,5%. O aminoácido glicina zwitteriônico desempenha um papel em imunoensaios como afinidade substituta por/ ligação de amida a/ou bloqueio por poli-aminas naturais, portanto exagerando ou bloqueando, assim, os efeitos de outros reagentes no sistema de coloração de células vivas. O plasma reintroduzido em PBMC está ou (1) ativando, com complemento, plaquetas presentes em níveis normais, ou (2) desativado (tanto complemento de plasma como outros fatores) por calor, filtração e centrifugação para se remover a maioria das plaquetas. O plasma desativado funciona mais como um agente de bloqueio, enquanto se espera que o plasma ativador tenha uma alta interferência.

[417] O estudo mimetiza uma gama de efeitos possíveis no sangue total quando o sangue é mobilizado, o plasma está presente, é residual, diluído ou lavado. Composto C e I-45 mostram diferenças distintas no comportamento, conforme o esperado, sustentando uma diminuição das ligações de fundo (“background binding”) e uma melhora distinta na atividade por modificação estrutural a I-45. Geralmente, observa-se que o fundo (“background”) de UCHT1-I-51 é limitado em comparação com o Composto G, enquanto a glicina, quando presente, aumenta ligeiramente a coloração de fundo (“background”) de I-51 e suprime o fundo (“background”) de UCHT1-Composto G, particularmente no plasma desativado e no controle puro. No geral, UCHT1-Composto G tem um fundo (“background”) mais alto de monócitos.

[418] EXEMPLO 19

[419] PREPARAÇÃO DE FOSFORAMIDITOS E COMPOSTOS

[420] Foram preparados exemplos de compostos usando-se protocolos padrão de síntese de oligonucleotídeos de fase sólida e um fosforamidito contendo fluoresceína com a seguinte estrutura:que foi adquirido da ChemGenes (# Cat. CLP-9780).

[421] Exemplos de agentes de ligação (L4) foram incluídos nos compostos por acoplamento com um fosforamidito com a seguinte estrutura:que também está disponível comercialmente.

[422] Foram preparados outros exemplos de compostos usando-se um fosforamidito preparado de acordo com o seguinte esquema:

[423] Desproteção final produz o grupamento F’’ desejado. Outros reagentes de fosforamidito disponíveis comercialmente foram empregados conforme apropriado para instalar os vários grupamentos dos compostos. Grupamentos Q com a seguinte estrutura:foram instalados pela reação de:com uma sulfidrila livre. Outros grupamentos Q são instalados de uma maneira análoga de acordo com o conhecimento de um técnico especialista na técnica.

[424] Modalidades representativas incluem, mas não estão limitadas a, o seguinte:

[425] Modalidade 1. Composto com a seguinte estrutura (I): ou um estereoisômero, sal ou tautômero seus, em que

[426] M é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[427] L1 é, em cada ocorrência, independentemente:ou i) um alquileno, alquenileno, alquinileno,heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou agente de ligação heteroatômico opcional; ou ii) um agente de ligação compreendendo um grupo funcional capaz de formação por reação de dois grupos reativos complementares;

[428] L2 and L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico;

[429] L4 é em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos, em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S;

[430] R1 é, em cada ocorrência, independentemente,H, alquila ou alcóxi;

[431] R2 e R3 são cada um independentemente H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, heteroalquila, -OP(=Ra)(Rb)Rc, Q, ou uma forma protegida sua, ou L';

[432] R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[433] R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente;

[434] Ra é O ou S;

[435] R b é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[436] Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, OL', SRd, alquila, alcóxi, heteroalquila, heteroalcóxi, éter alquílico, éter alcoxialquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfaloalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico;

[437] Rd é um contra-íon;

[438] Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo, ou m um forma protegida sua, capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito, um grupamento de direcionamento, um suporte sólido ou um grupo reativo complementar Q‘;

[439] L 'é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a Q, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um suporte sólido , um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um resíduo de suporte sólido, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um nucleosídeo ou um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I);

[440] m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e

[441] n é um número inteiro igual a um ou maior.

[442] Modalidade 2. O composto da modalidade 1, em que L 4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno.

[443] Modalidade 3. Composto da modalidade 2, em que L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação óxido de alquileno.

[444] Modalidade 4. O composto da modalidade 1, sendo L4 óxido de polietileno e tendo o composto a seguinte estrutura (IA):em que z é um número inteiro de 2 a 100.

[445] Modalidade 5. O composto da modalidade 4, em que z é um número inteiro de 3 a 6.

[446] Modalidade 6. O composto de uma das reivindicações de 1 a 5, em que L1 é, em cada ocorrência, um agente de ligação que compreende um grupo funcional capaz de se formar pela reação de dois grupos reativos complementares.

[447] Modalidade 7. O composto da modalidade 6, em que, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional pode ser formado por reação de um grupo funcional aldeído, oxima, hidrazona, alcino, amina, azida, acilazida, haleto de acila, nitrila, nitrona, sulfidrila, dissulfeto, haleto de sulfonila, isotiocianato, imidoéster, éster ativado, cetona, carbonila α,β-insaturada, alceno, maleimida, α-haloimida, epóxido, aziridina, tetrazina, tetrazol, fosfina, biotina ou tiirano com um grupo reativo complementar.

[448] Modalidade 8. O composto da modalidade 6, em que, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional pode ser formado por reação de um alcino e uma azida.

[449] Modalidade 9. O composto da modalidade 6, em que, para pelo menos uma ocorrência de L1, o grupo funcional compreende um grupo alceno, éster, amida, tioéster, tioureia, dissulfeto, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila.

[450] Modalidade 10. O composto da modalidade 6, em que, para pelo menos uma ocorrência de L1, L1 é um agente de ligação que compreende um grupo funcional triazolila.

[451] Modalidade 11. O composto da modalidade 6, em que, para pelo menos uma ocorrência de L1, L1-M tem a seguinte estruturaem que L1a e L1b são, cada um, independentemente, agentes de ligação opcionais.

[452] Modalidade 12. O composto da modalidade 6, em que, para pelo menos uma ocorrência de L1, L1-M tem a seguinte estruturaem que L1a e L1b são, cada um, independentemente, agentes de ligação opcionais.

[453] Modalidade 13. O composto de qualquer uma das modalidades 11 ou 12, em que L1a ou L1b, ou ambos, estão ausentes.

[454] Modalidade 14. O composto de qualquer uma das modalidades 11 ou 12, em que L1a ou L1b, ou ambos, estão presentes.

[455] Modalidade 15. O composto da modalidade 14, em que L1a ou L1b, quando presentes, são, cada um, independentemente, alquileno ou heteroalquileno.

[456] Modalidade 16. O composto da modalidade 14, em que L1a ou L1b, quando presentes, têm independentemente,uma das seguintes estruturas:

[457] Modalidade 17. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 5, em que L1 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação alquileno ou heteroalquileno opcional.

[458] Modalidade 18. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 17, em que L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6 ou alquinileno C2-C6.

[459] Modalidade 19. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 18, em que o composto tem a seguinte estrutura (IB):em que

[460] x1, x2, x3 e x4 são, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 0 a 6; e

[461] z é um número inteiro de 2 a 100.

[462] Modalidade 20. O composto da modalidade 19, em que pelo menos uma ocorrência de x1, x2, x3 ou x4 é 1.

[463] Modalidade 21. O composto da modalidade 19 ou 20, em que x1, x2, x3 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência.

[464] Modalidade 22. O composto de qualquer uma das modalidades de 19 a 21, em que L1, em cada ocorrência, independentemente, compreende um grupo funcional triazolila.

[465] Modalidade 23. O composto de qualquer uma das modalidades de 19 a 21, em que L1 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação alquileno ou heteroalquileno opcional.

[466] Modalidade 24. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 23, em que R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, O - ou ORd.

[467] Modalidade 25. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 24, em que R5 é, em cada ocorrência, oxo.

[468] Modalidade 26. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 25, em que R1 é, em cada ocorrência, H.

[469] Modalidade 27. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 26, em que R2 e R3 são cada um, independentemente, OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc.

[470] Modalidade 28. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 26, em que R2 ou R3é OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q.

[471] Modalidade 29. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 26, em que R2 e R3 são cada um, independentemente, -OP(=Ra)(Rb)Rc.

[472] Modalidade 30. O composto da modalidade 29, em que Rc é OL'.

[473] Modalidade 31. O composto da modalidade 30, em que L' é um agente de ligação heteroalquileno a: Q, um grupamento de direcionamento, um molécula de analito, um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I).

[474] Modalidade 32. O composto da modalidade 31, em que L' compreende um óxido de alquileno ou um grupamento fosfodiéster, ou combinações suas.

[475] Modalidade 33. O composto da modalidade 32, em que L' tem a seguinte estrutura:em que

[476] m'' e n'' são, independentemente, um número inteiro de 1 a 10;

[477] Re é H, um par de elétrons ou um contra-íon;

[478] L'' é Re ou uma ligação direta ou ligação a:Q, um grupamento de direcionamento, uma molécula de analito, um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I).

[479] Modalidade 34. O composto das modalidades 2933, em que o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

[480] Modalidade 35. O composto de qualquer uma das modalidades de 29 a 34, estruturas:

[481] Modalidade 36. O composto de qualquer uma das modalidades de 29 a 35, em que R2 ou R3 têm seguintes estruturas:

[482] Modalidade 37. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 26 ou de 28 a 33, em que Q compreende um grupo reativo nucleofílico, um grupo reativo electrofílico ou um grupo reativo de cicloadição.

[483] Modalidade 38. O composto da modalidade 37, em que Q compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, éster ativado, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida.

[484] Modalidade 39. O composto da modalidade 38, em que o éster ativado é um éster de N-succinimida, imidoéster ou éster de polifluorofenila.

[485] Modalidade 40. O composto da modalidade 38, em que a azida é uma alquilazida ou acilazida.

[486] Modalidade 41. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 33, em que Q é um grupamento selecionado da Tabela 1.

[487] Modalidade 42. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 26, em que um de R2 ou R3 é OH ou - OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido.

[488] Modalidade 43. O composto da modalidade 42, em que a molécula de analito é um ácido nucleico, um aminoácido ou um polímero seus.

[489] Modalidade 44. O composto da modalidade 42, em que a molécula de analito é uma enzima, receptor, ligante de receptor, anticorpo, glicoproteína, aptâmero ou príon.

[490] Modalidade 45. O composto da modalidades 42, em que o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

[491] Modalidade 46. O composto da modalidade 42, em que o suporte sólido é uma esfera polimérica ou uma esfera não polimérica.

[492] Modalidade 47. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 46, em que m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 10.

[493] Modalidade 48. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 46, em que m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 5.

[494] Modalidade 49. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 48, em que n é um número inteiro de 1 a 100.

[495] Modalidade 50. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 48, em que n é um número inteiro de 1 a 10.

[496] Modalidade 51. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 50, em que M é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende quatro ou mais anéis arila ou heteroarila, ou combinações suas.

[497] Modalidade 52. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 51, em que M é, em cada ocorrência, independentemente, fluorescente e colorido.

[498] Modalidade 53. O composto da modalidade 52, em que M é fluorescente.

[499] Modalidade 54. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 53, em que M, em cada ocorrência, independentemente, compreende um grupamento arila fundido- multicíclico que compreende pelo menos quatro anéis fundidos.

[500] Modalidade 55. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 54, em que M é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento dimetilaminostilbeno, quinacridona, fluorofenil-dimetil-BODIPY, his-fluorofenil- BODIPY, acridina, terrileno, sexifenila, porfirina, benzopireno, (fluorofenil-dimetil- difluorobora-diaza- indaceno)fenila, (bis-fluorofenil-difluorobora-diaza- indaceno)fenila, quaterfenila, bi-benzotiazol, ter- benzotiazol, bi-naftila, bi-antracila, esquaraína, esquarílio, 9,10-etinilantraceno ou ter-naftila.

[501] Modalidade 56. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 54, em que M é, em cada ocorrência, independentemente, p-terfenila, perileno, azobenzeno, fenazina, fenantrolina, acridina, tioxantreno, criseno, rubreno, coroneno, cianina, perileno imida ou perileno amida ou derivado seu.

[502] Modalidade 57. O composto dequalquer uma das modalidades de 1 a 54, em que M é, em cada ocorrência, independentemente, um corante cumarina, um corante resorufina, um corante difluoreto de dipirrometenoboro, um corante rutênio bipiridila, um corante de transferência de energia, um corante laranja de tiazol, um corante polimetina ou N-aril-1,8-naftalimida.

[503] Modalidade 58. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 54, em que M é, em cada ocorrência, independentemente, pireno, perileno, perileno monoimida ou 6-FAM ou derivados seus.

[504] Modalidade 59. O composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 54, em de que M, em cada ocorrência, independentemente, tem uma das seguintes estruturas:

[505] Modalidade 60. Um composto selecionado da Tabela 2.

[506] Modalidade 61. Um método de coloração de uma amostra que compreende adicionar à dita amostra o composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 60 em uma quantidade suficiente para produzir uma resposta óptica quando a dita amostra é iluminada a um comprimento de onda apropriado.

[507] Modalidade 62. O método da modalidade 61, em que a dita resposta óptica é uma resposta fluorescente.

[508] Modalidade 63. O método de qualquer uma das modalidades 61 ou 62, em que a dita amostra compreende células.

[509] Modalidade 64. O método da modalidade 63, que compreende ainda observar as ditas células por citometria de fluxo.

[510] Modalidade 65. O método da modalidade 62, que compreende ainda distinguir a resposta de fluorescência daquela de um segundo fluoróforo com diferentes propriedades ópticas detectáveis.

[511] Modalidade 66. Método para detectar visualmente uma molécula de analito, sendo que o método compreende:(a) fornecer o composto da modalidade 1, em que R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente à molécula de analito; e (b) detectar o composto por suas propriedades visíveis.

[512] Modalidade 67. Método para detectar visualmente uma molécula de analito, que compreende: (c) misturar o composto da modalidade 1, em que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com a molécula de analito; (d) formar um conjugado do composto e da molécula de analito; e (e) detectar o conjugado por suas propriedades visíveis.

[513] Modalidade 68. Um método para detectar visualmente um analito, sendo que o método compreende: (f) fornecer um composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 36, em que R2 ou R3 compreendem um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento com especificidade para o analito; (g) misturar o composto e o analito, associando-se assim o grupamento de direcionamento e o analito; e (h) detectar o composto por suas propriedades visíveis.

[514] Modalidade 69. Uma composição que compreende o composto de qualquer uma das modalidades de 1 a 60 e uma ou mais moléculas de analito.

[515] Modalidade 70. O uso da composição da modalidade 69 em um método analítico para detecção da uma ou mais moléculas de analito.

[516] Modalidade 71. Um composto que tem a seguinte estrutura (II):ou um estereoisômero, sal ou tautômero seus, em que

[517] G é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo, ou um análogo seu protegido, capaz de formar uma ligação covalente com um grupo reativo complementar;

[518] L1a, L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico;

[519] L4 é em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos,em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S;

[520] R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi;

[521] R2 e R3 são cada um independentemente H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, heteroalquila, -OP(=Ra)(Rb)Rc, Q ou L';

[522] R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[523] R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente;

[524] Ra é O ou S;

[525] R b é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd;

[526] Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, OL', SRd, alquila, alcóxi, éter alquílico, éter alcoxialquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfaloalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico;

[527] Rd é um contra-íon;

[528] Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo reativo, ou análogo seu protegido, capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de analito, um grupamento de direcionamento, um suporte sólido ou um grupo reativo complementar Q‘;

[529] L 'é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a Q, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma porção de direcionamento, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um suporte sólido , um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um resíduo de suporte sólido, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um nucleosídeo ou um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (II);

[530] m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e

[531] n é um número inteiro igual a um ou maior.

[532] Modalidade 72. O composto da modalidade 71, em que G compreende, em cada ocorrência, independentemente, um grupo funcional aldeído, oxima, hidrazona, alcino, amina, azida, acilazida, haleto de acila, nitrila, nitrona, sulfidrila, dissulfeto, haleto de sulfonila, isotiocianato, imidoéster, éster ativado, cetona, carbonila α,β- insaturada, alceno, maleimida, α-haloimida, epóxido, aziridina, tetrazina, tetrazol, fosfina, biotina ou tiirano.

[533] Modalidade 73. O composto da modalidade 71, em que G compreende, em cada ocorrência, independentemente um grupo alcino ou azida.

[534] Modalidade 74. O composto da modalidade 71, em que G compreende, em cada ocorrência, independentemente, um grupo reativo capaz de formar um grupo funcional compreendendo um grupo alceno, éster, amida, tioéster, dissulfeto, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila, após reação com o grupo reativo complementar.

[535] Modalidade 75. O composto da modalidade 74, que a heteroalila é triazolila.

[536] Modalidade 76. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 75, em que L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6 ou alquinileno C2-C6.

[537] Modalidade 77. O composto da modalidade 71, em que o composto tem a seguinte estrutura (IIA):em que

[538] x1, x2, x3 e x4 são, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 0 a 6.

[539] Modalidade 78. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 77, em que cada L1a está ausente.

[540] Modalidade 79. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 77, em que cada L1a está presente.

[541] Modalidade 80. O composto da modalidade 79, em que L1a é, em cada ocorrência, independentemente heteroalquileno.

[542] Modalidade 81. O composto da modalidade 80, em que L 1a tem a seguinte estrutura:

[543] Modalidade 82. O composto da modalidade 81, em que G é, em cada ocorrência, independentemente

[544] Modalidade 83. O composto de qualquer uma das modalidades de 77 a 82, em que pelo menos uma ocorrência de x1, x2, x3 ou x4 é 1.

[545] Modalidade 84. O composto de qualquer uma das modalidades de 77 a 82, em que x1, x2, x3 ou x4, 1 são, cada um, 1 em cada ocorrência.

[546] Modalidade 85. O composto de qualquer uma das modalidade de 71 a 84, em que L4 é tal como definido em qualquer uma das modalidades de 2 a 5.

[547] Modalidade 86. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 85, em que R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, O - ou ORd.

[548] Modalidade 87. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a86, em que R5 é, em cada ocorrência, oxo.

[549] Modalidade 88. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 87, em que R1 é H.

[550] Modalidade 89. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 88, em que R2 e R3 são cada um, independentemente, OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc.

[551] Modalidade 90. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 88, em que um de R2 ou R3 é OH ou - OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q.

[552] Modalidade 91. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 88, em que R2 e R3 são cada um, independentemente, -OP(=Ra)(Rb)Rc.

[553] Modalidade 92. O composto da modalidade 91, em que Rc é OL'.

[554] Modalidade 93. O composto da modalidade 92, em que L' é um agente de ligação heteroalquileno a: Q, um grupamento de direcionamento, um molécula de analito, um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I).

[555] Modalidade 94. O composto da modalidade 93, em que L' compreende um óxido de alquileno ou um grupamento fosfodiéster, ou combinações suas.

[556] Modalidade 95. O composto da modalidade 94, em que L' tem a seguinte estrutura:em que

[557] m'' e n'' são, independentemente, um número inteiro de 1 a 10;

[558] Re é H, um par de elétrons ou um contra-íon;

[559] L'' é Re ou uma ligação direta ou ligação a: Q, um grupamento de direcionamento, um molécula de analito, um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I).

[560] Modalidade 96. O composto das modalidades 91- 95, em que o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

[561] Modalidade 97. O composto de qualquer uma das modalidades de 91 a 96, em que R2 ou R3 têm uma das seguintes estruturas:

[562] Modalidade 98. O composto de qualquer uma das modalidades de 91 a 97, em que R2 ou R3 têm seguintes estruturas:

[563] Modalidade 99. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 98, em que Q compreende um grupo reativo nucleofílico, um grupo reativo electrofílico ou um grupo reativo de cicloadição.

[564] Modalidade 100. O composto da modalidade 99, em que Q compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, éster ativado, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida.

[565] Modalidade 101. O composto da modalidade 100, em que o éster ativado é um éster de N-succinimida, imidoéster ou éster de polifluorofenila.

[566] Modalidade 102. Composto, de acordo com a modalidade 100, que o alcino é uma alquilazida ou acilazida.

[567] Modalidade 103. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 98, em que Q é um grupamento selecionado da Tabela 1.

[568] Modalidade 104. O composto de qualquer uma das modalidades de 61 a 88, em que um de R2 ou R3 é OH ou -OP(=Ra)(Rb)Rc, e o outro de R2 ou R3 é um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a um suporte sólido.

[569] Modalidade 105. O composto da modalidade 104, em que a molécula de analito é um ácido nucleico, um aminoácido ou um polímero seus.

[570] Modalidade 106. O composto da modalidade 104, em que a molécula de analito é uma enzima, receptor, ligante de receptor, anticorpo, glicoproteína, aptâmero ou príon.

[571] Modalidade 107. O composto da modalidade 104, em que o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

[572] Modalidade 108. O composto da modalidade 104, em que o suporte sólido é uma esfera polimérica ou uma esfera não polimérica.

[573] Modalidade 109. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 108, em que m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 10.

[574] Modalidade 110. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 108, em que m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 5.

[575] Modalidade 111. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 110, em que n é um número inteiro de 1 a 100.

[576] Modalidade 112. O composto de qualquer uma das modalidades de 71 a 110, em que n é um número inteiro de 1 a 10.

[577] Modalidade 113. Um composto selecionado da Tabela 3.

[578] Modalidade 114. Um método para marcar uma molécula de analito ou grupamento de direcionamento, sendo que o método compreende: (a) misturar o composto de acordo com a modalidade 71, em que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com a molécula de analito ou o grupamento de direcionamento; (b) formar um conjugado do composto e da molécula de analito ou grupamento de direcionamento; e (c) fazer reagir o conjugado com um composto de fórmula M-L1b-G‘, formando-se assim pelo menos uma ligação covalente por reação de pelo menos um G e pelo menos um G',

[579] em que

[580] M é um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[581] L1b é um agente de ligação alquileno, heteroalquileno ou heteroatômico opcional; e

[582] G‘ é um grupo reativo complementar a G.

[583] 115. Um método para marcar uma molécula de analito ou grupamento de direcionamento, sendo que o método compreende: (a) misturar o composto da reivindicação 71, caracterizados pelo fato de que R2 ou R3 é Q ou um agente de ligação que compreende uma ligação covalente a Q, com um composto de fórmula M-L1b-G‘, formando-se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G ‘; e (b) fazer reagir o produto da etapa (A) com a molécula de analito ou grupamento de direcionamento, formando-se, assim, um conjugado do produto da etapa (A) e a molécula de analito ou grupamento de direcionamento,

[584] em que

[585] M é um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[586] L1b é um agente de ligação alquileno, heteroalquileno ou heteroatômico opcional; e

[587] G‘ é um grupo reativo complementar a G.

[588] 116. Um método para preparar o composto da modalidade 1, sendo que o método compreende misturar o composto da modalidade 71 com um composto de fórmula M-L1b- G‘, formando-se, desse modo, pelo menos uma ligação covalente por reação de G e G‘, em que:

[589] M é um grupamento que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação;

[590] L1b é um agente de ligação alquileno, heteroalquileno ou heteroatômico opcional; e

[591] G‘ é um grupo reativo complementar a G.

[592] Modalidade 117. Composto fluorescente, que compreende Y grupamentos fluorescentes M, que o composto fluorescente tem uma emissão de fluorescência máxima após excitação com um comprimento de onda predeterminado de luz ultravioleta de pelo menos 85% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M após excitação com o mesmo comprimento de onda de luz ultravioleta, e que Y é um número inteiro igual a 2 ou maior.

[593] Modalidade 118. O composto fluorescente da modalidade 117, que tem uma emissão de fluorescência máxima de pelo menos 90% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M.

[594] Modalidade 119. O composto fluorescente da modalidade 117, que tem uma emissão de fluorescência máxima de pelo menos 95% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M.

[595] Modalidade 120. O composto fluorescente da modalidade 117, que tem uma emissão de fluorescência máxima de pelo menos 97% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M.

[596] Modalidade 121. O composto fluorescente da modalidade 117, que tem uma emissão de fluorescência máxima de pelo menos 99% de Y vezes maior do que a emissão de fluorescência máxima de um único grupamento M.

[597] Modalidade 122. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 121, em que Y é um número inteiro de 2 a 100.

[598] Modalidade 123. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 121, em que Y é um número inteiro de 2 a 10.

[599] Modalidade 124. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidade de 117 a 123, em que Y grupamento(s) M tem (têm), independentemente, uma das seguintes estruturas:em que indica um ponto de ligação ao composto fluorescente.

[600] Modalidade 125. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 124, em que único grupamento M tem, independentemente, uma das seguintes estruturas:

[601] Modalidade 126. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 123, em que o composto fluorescente compreende Y grupamentos M, que têm, independentemente, uma das seguintes estruturas:em que indica um ponto de ligação ao composto fluorescente, e o único grupamento M tem a seguinte estrutura:

[602] Modalidade 127. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 126, em que a emissão de fluorescência máxima está a um comprimento de onda que varia de desde cerca de 500 a cerca de 550 nm.

[603] Modalidade 128. O composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 127, em que o composto fluorescente compreende pelo menos um grupamento óxido de etileno.

[604] Modalidade 129. Uma composição que compreende o composto fluorescente de qualquer uma das modalidades de 117 a 128 e um analito.

[605] Todas as patentes dos EUA, publicações de pedidos de patentes dos EUA, pedidos de patentes dos EUA, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patenteadas referidas nesta especificação são aqui incorporadas por referência, na sua totalidade, até ao ponto não inconsistente com a presente descrição.

[606] Do que antecede, entender-se-á que, embora tenham sido aqui descritas modalidades específicas da invenção para fins de ilustração, podem ser feitas várias modificações sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Por conseguinte, a invenção não está limitada, exceto conforme as reivindicações anexas.

Claims (15)

1. Composto caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte estrutura (I): ou um estereoisômero, sal ou tautômero do mesmo, em que: M é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento fluorescente ou colorido que compreende duas ou mais ligações duplas carbono-carbono e pelo menos um grau de conjugação; L1 é, em cada ocorrência, independentemente: ou i) um agente de ligação alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico opcional; ou ii) um agente de ligação compreendendo um grupo funcional capaz de formação por reação de dois grupos reativos complementares; L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico; L4 é em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos, em que os heteroátomos no agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O e N; R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi; R2 e R3 são cada um independentemente H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, heteroalquila, _OP(=Ra)(Rb)Rc, Q, ou L'; R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O, S-, ORd ou SRd; R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente; Ra é O ou S; R b é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd; Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, OL', SRd, alquila, alcóxi, heteroalquila, heteroalcóxi, éter alquílico, éter alcoxialquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfaloalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico; Rd é um contra-íon; Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, um éster de N-succinimida, imidoéster, polifluorofenil éster, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida; L' é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a Q, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um grupamento de direcionamento, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma molécula de analito, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um suporte sólido, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um resíduo de suporte sólido, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um nucleosídeo ou um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I); m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e n é um número inteiro igual a um ou maior.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L4 é em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação óxido de alquileno.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L4 é óxido de polietileno e tendo o composto a seguinte estrutura (IA): em que A) z é um número inteiro de B) z é um número inteiro de

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L1 tem uma das seguintes estruturas:

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto tem a seguinte estrutura (IB): em que A) x1, x2, x3 e x4 são, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 0 a 6; e z é um número inteiro de 2 a 100; B) x1 e x3 são, cada um, 0 em cada ocorrência, e x2 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência; ou C) x1, x2, x3 e x4 são, cada um, 1 em cada ocorrência.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que A) R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, O- ou ORd, e R5 é, em cada ocorrência, oxo; ou B) R1 é, em cada ocorrência, H.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: A) R2 e R3 são cada um, independentemente, OP(=Ra)(Rb)Rc; ou B) R2 ou R3 tem uma das seguintes estruturas:

8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que Rc é OL'

9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: (A) L’ é um agente de ligação heteroalquileno a: Q, um grupamento de direcionamento, uma molécula de analito, um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I); (B) L' compreende um óxido de alquileno ou um grupamento fosfodiéster, ou combinações dos mesmos; ou (C) L' tem a seguinte estrutura: em que: m'' e n'' são, independentemente, um número inteiro de 1 a 10; Re é H, um par de elétrons ou um contra-íon; L'' é Re ou uma ligação direta ou ligação a: Q, um grupamento de direcionamento, uma molécula de analito, um suporte sólido, um resíduo de suporte sólido, um nucleosídeo ou um outro composto de estrutura (I), em que o grupamento de direcionamento é um anticorpo ou um antagonista de receptores da superfície celular.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (A) Q compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, éster ativado, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida; (B) Q compreende um grupo funcional maleimida; ou (C) Q tem uma das seguintes estruturas: em que: X é halo; e EWG é um grupo de retirada de elétrons.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: A) m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 10; ou B) ) m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro de 1 a 5.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que n é um número inteiro de 1 a 10.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (A) M é, em cada ocorrência, independentemente, pireno, perileno, perileno monoimida ou 6-FAM ou derivados dos mesmos; ou (B) M, em cada ocorrência, independentemente, tem uma das seguintes estruturas:

14. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o composto tem uma das seguintes estruturas: em que: z é 3, 4, 5, ou 6; m é 2, 3, 4, ou 5; e n é 1-10, em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: m" é 4 ou 10; e R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: m" é 4 ou 10; e R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: m" é 4 ou 10; e R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: m" é 4 ou 10; e R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: m" é 4 ou 10; e R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: m" é 4 ou 10; e R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 e R3 ambos têm a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R2 tem a seguinte estrutura: R3 tem a seguinte estrutura: em que: R3 tem a seguinte estrutura: em que: A é um anticorpo; F, F‘ e F" têm as seguintes estruturas: dT tem a seguinte estrutura:

15. Composto caracterizado pelo fato de que tem a seguinte estrutura (II): ou um estereoisômero, sal ou tautômero do mesmo, em que: G é, em cada ocorrência, independentemente, um aldeído, oxima, hidrazona, alcino, amina, azida, acilazida, haleto de acila, nitrila, nitrona, sulfidrila, dissulfeto, haleto de sulfonila, isotiocianato, imidoéster, éster N-succinimida, imidoéster, éster de polifluorofenil, cetona, carbonila α,β- insaturada, alqueno, maleimida, α-haloimida, epóxido, aziridina, tetrazina, tetrazol, fosfina, biotina ou grupo funcional tiirano; L1a, L2 e L3 são, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação opcional alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno ou heteroatômico; L4 é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação heteroalquileno, heteroalquenileno ou heteroalquinileno de comprimento maior do que três átomos, em que os heteroátomos no ligante heteroalquileno, heteroalquenileno e heteroalquinileno são selecionados dentre O, N e S; R1 é, em cada ocorrência, independentemente, H, alquila ou alcóxi; R2 e R3 são cada um independentemente H, OH, SH, alquila, alcóxi, éter alquílico, heteroalquila, _OP(=Ra)(Rb)Rc, Q ou L'; R4 é, em cada ocorrência, independentemente, OH, SH, O, S-, ORd ou SRd; R5 é, em cada ocorrência, independentemente, oxo, tioxo ou está ausente; Ra é O ou S; R b é OH, SH, O-, S-, ORd ou SRd; Rc é OH, SH, O-, S-, ORd, OL', SRd, alquila, alcóxi, éter alquílico, éter alcoxialquílico, fosfato, tiofosfato, fosfoalquila, tiofosfaloalquila, éter fosfoalquílico ou éter tiofosfoalquílico; Rd é um contra-íon; Q é, em cada ocorrência, independentemente, um grupamento que compreende um grupo funcional sulfidrila, dissulfeto, um éster de N-succinimida, imidoéster, polifluorofenil éster, isotiocianato, azida, alcino, alceno, dieno, dienófilo, haleto de ácido, haleto de sulfonila, fosfina, α-haloamida, biotina, amino ou maleimida; L' é, em cada ocorrência, independentemente, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a Q, um ligante compreendendo uma ligação covalente a uma porção de direcionamento, um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a uma molécula de analito, um ligante compreendendo uma ligação covalente a um suporte sólido , um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um resíduo de suporte sólido, um ligante compreendendo uma ligação covalente a um nucleosídeo ou um agente de ligação compreendendo uma ligação covalente a um outro composto de estrutura (I); m é, em cada ocorrência, independentemente, um número inteiro igual a zero ou maior, desde que pelo menos uma ocorrência de m seja um número inteiro igual a um ou maior; e n é um número inteiro igual a um ou maior.