CN112041680A - 二价金属用于增强荧光信号的应用 - Google Patents

二价金属用于增强荧光信号的应用 Download PDF

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Abstract

本文公开包含荧光或着色染料的组合物和将其与二价金属盐组合用来分析样品的方法。

Description

二价金属用于增强荧光信号的应用
背景部分
技术领域
本发明一般地涉及具有间隔基团的二聚体和聚合物荧光或着色染料，及其与二价或三价金属盐组合在各种分析方法中应用的方法。
有关技术的描述
荧光和/或着色染料已知特别适于希望高度敏感的检测试剂的应用。能够在生物学样品中优先标记特定成分或组分的染料使得研究者可以确定所述特定成分或组分的存在、量和/或位置。此外，能够监测特定体系在不同环境中的空间和时间分布。
荧光和比色方法在化学和生物学中是极度广泛的。这些方法提供关于生物分子存在，结构，距离，取向，复合和/或位置的有用信息。此外，时间分辨方法越来越多地用于动态学和动力学的测量中。作为结果，已开发出用于荧光或颜色标记生物分子比如核酸和蛋白质的许多策略。由于生物分子的分析一般在含水环境中进行，关注的焦点一直是开发和使用水可溶的染料。
高度荧光的或着色的染料是希望的，原因是使用这种染料提高信噪比且提供其它有关益处。相应地，已尝试增加来自已知荧光和/或着色部分的信号。例如，已制备包含两个或更多个荧光和/或着色部分的二聚体和聚合物化合物，预期这种化合物会引起更高亮的染料。然而，作为分子内荧光猝灭的结果，已知的二聚体和聚合物染料并未实现所希望的亮度提高。
从而，本领域需要使用具有增加的摩尔亮度的水可溶染料的方法。理想地，使用所述染料和生物标记的方法应是强着色的或荧光的并且应以各种颜色和荧光波长可获得。本发明实现该需要和提供其它有关优势。
发明概要
简言之，本发明的实施方式一般涉及荧光和/或着色染料和/或探针的化合物的组合物和使用方法，其使得分析物分子比如生物分子的视觉检测成为可能，以及用于它们的制备的试剂。也描述用染料来视觉检测分析物分子的方法。
在实施方式中，本公开提供包含下述的组合物：a)聚合物染料，其包含：i)两个或更多个荧光或着色部分；ii)至少一个带负电基团；和iii)反应性基团Q；和b)二价或三价金属盐。任何适宜的聚合物染料可以用于本公开的任何方法或组合物。
在实施方式中，本公开提供用于形成聚合物染料和靶向部分的共价缀合物的方法，所述方法包括制备包含聚合物染料、靶向部分和二价或三价金属盐的混合物，和让混合物陈化，其持续的时间和所处的温度足以形成共价缀合物，其中：a)聚合物染料包含：i)两个或更多个荧光或着色部分；ii)至少一个带负电基团；和iii)能够与靶向部分上的互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团Q；和b)靶向部分具有对靶标分析物的亲和力且包含互补反应性基团Q′。
在某些实施方式中，本公开提供检测靶标分析物的方法，所述方法包括：a)在二价或三价金属盐存在下使共价缀合物与靶标分析物结合以形成分析物-靶向部分复合物，所述共价缀合物包含：i)靶向部分，其具有对靶标分析物的亲和力和包含与聚合物染料共价键合的反应性基团Q′；ii)聚合物染料，其包含：A)两个或更多个荧光或着色部分；B)至少一个带负电基团；和C)与靶向部分互补反应性基团Q的共价键，所述Q与反应性基团Q′共价键合；和b)检测来自分析物-靶向部分复合物的荧光或着色信号。
在某些实施方式中，本公开提供检测靶标分析物的方法，所述方法包括：a)使共价缀合物与靶标分析物结合以形成分析物-靶向部分复合物，所述共价缀合物包含：i)靶向部分，其具有对靶标分析物的亲和力和包含与聚合物染料共价键合的反应性基团Q′；和ii)聚合物染料，包含：A)两个或更多个荧光或着色部分；B)至少一个带负电基团；和C)与靶向部分上的反应性基团Q′共价键合的互补反应性基团Q；b)用包含二价或三价金属盐的洗涤溶液处理分析物-靶向部分复合物；c)检测来自分析物-靶向部分复合物的荧光或着色信号。
本发明的这些和其它方面在参照下文详述之后更加明显。
附图说明
在附图中，相同的标记数字鉴定相似的要素。要素在图中的尺寸和相对位置不一定按比例画出和这些要素中的某些被人为地扩大和定位以改善图的可辨认性。此外，画出的要素具体形状并不期望传递有关该特定要素的真实形状的任何信息，而是仅仅为了便于在图中识别而选用。
图1提供包含三甘醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于5μm和pH 9的紫外吸光度谱图。
图2是包含六乙二醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于5μm和pH 9的UV吸光度数据。
图3是包含三甘醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于50nM和pH 9的荧光发射谱图。
图4代表包含六乙二醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于50nM和pH 9的荧光发射谱图。
图5是包含4个六乙二醇间隔物和2或3个荧光素部分的代表性化合物相比具有单个荧光素部分的比较化合物于5μm的UV吸光度数据。
图6是这样的图：包含4个六乙二醇间隔物和2或3个荧光素部分的代表性化合物相对具有单个荧光素部分的比较化合物于5μm的荧光发射数据。
图7显示比较具有各种m值的示例性化合物的荧光发射响应。
图8提供数据比较"HEG"化合物，其中m是1、2或3，相对化合物A的荧光发射。
图9提供化合物I-32，化合物I-46和化合物B的吸光度数据。
图10显示三聚体化化合物I-42的反应的PAGE分析结果。
图11图解免疫荧光方法中的阳离子配置。
图12图解涉及信号增强和猝灭的二价金属阳离子配置。图解用阳离子存在于试剂或方法的方法步骤(即缀合，洗脱，贮藏，温育，洗涤或可视化)编码，例如S+、I+、W+、V-。将这些方法与标准方法对比，其中二价阳离子的存在未知或已知痕量有助于猝灭。
图13显示观察概要，显微技术中的固定和可渗透化的人PBMC：通过与二价阳离子，MgCl2梯度，10x I-16UCHT1温育，细胞外和细胞内CD3荧光分辨率得到增强(然后猝灭)。显示分析概要，其使用检测表面和细胞内CD3的五个I-16UCHT1荧光显微技术实验的单向ANOVA统计学分析。数据显示为在MgCl2滴定(pH 7.4)(范围0-1000mM)存在下的代表性CD3表达的积分密度(人为指定单位)。统计学显著性通过共同或不同的字母指出，例如；250mM(a)显著不同于50mM(b)，而1000mM(a)并不显著不同于0mM(a，c)。N＝5描述在2天内对相同样本进行的单独实验，第1天2次和第2天3次。
图14显示固定和可渗透化的人PBMC的荧光显微技术的第一个实施例结果。通过与二价阳离子，MgCl2梯度，10x I-16UCHT1温育，细胞外和细胞内CD3荧光分辨率得到增强(然后猝灭)。仅在与靶向部分(10x I-16UCHT1)温育期间施用MgCl2滴定(pH 7.4)(范围0-1000mM)以检测表面和细胞内CD3，然后用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图15显示固定和可渗透化的人PBMC的荧光显微技术。通过与二价阳离子，MgCl2梯度，5x I-32UCHT1温育，细胞外和细胞内CD3荧光分辨率得到增强(然后猝灭)。仅在与靶向部分(5x I-32UCHT1)温育期间施用MgCl2滴定(pH 7.4)以检测表面和细胞内CD3，然后用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图16显示低聚甲醛固定的Jurkat T细胞(也对CD3特异性的细胞系)的荧光显微技术结果。通过与二价阳离子MgCl2梯度，10x I-16 UCHT1温育，细胞外CD3荧光分辨率得到增强(然后猝灭)。在与靶向部分(10x I-16 UCHT1)温育期间施用MgCl2滴定(pH 7.4)以检测表面和细胞内CD3，然后用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图17显示活Jurkat T细胞流式细胞术结果：在与靶向部分(10x I-51 UCHT1和10xI-56 UCHT1)温育期间施用(0-100mM)的MgCl2滴定(pH 7.4)以检测表面CD3，然后用不含阳离子的缓冲液洗涤。通过与二价阳离子，MgCl2梯度，10x I-51 UCHT1和10x I-56 UCHT1温育，细胞外CD3荧光分辨率得到增强。阳离子浓度不超过100mM以保持活细胞的完整性。
图18显示活Jurkat T细胞的流式细胞术的重复测试结果：在与靶向部分(10x I-51 UCHT1和10x I-56 UCHT1，10x I-16 UCHT1)温育期间施用(0-100mM)MgCl2滴定(pH7.4)以检测表面CD3，然后用不含阳离子的缓冲液洗涤。通过与二价阳离子MgCl2梯度，10xI-51 UCHT1和10x I-56 UCHT1，10x I-16 UCHT1温育，细胞外CD3荧光分辨率得到增强。阳离子浓度不超过100mM以保持活细胞的完整性。
图19与抗体缀合(构建靶向部分)新方法比较的阳离子配置概要图；例如表示为C-E-S-对照vs.C+E+S+。在实践中，这是将马来酰亚胺活化的部分用水+0.1M MgCl2再悬浮以包括在抗体缀合中，进行纯化和洗脱，和贮藏在0.1MgCl2中。
图20A将信号增强观察概要的实例显示为源自人全血细胞流式细胞术的滴定曲线。显示两种配置的CD3荧光分辨率。S/N通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10x I-16 UCHT1的缀合过程步骤中。显示钾缓冲的氯化铵(ACK)红细胞裂解的全血细胞(WBC)的结果，其中MgCl2包括在靶向部分(10x I-16 UCHT1)的缀合、洗脱(纯化)和贮藏中以检测表面CD3。结果与BD Horizon亮蓝515TMUCHT1和FITC UCHT1比较。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图20B将信号增强观察概要的实例显示为源自人全血细胞流式细胞术的滴定曲线。显示两种配置的CD3荧光分辨率。S/N通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10x I-21A UCHT1的缀合过程步骤中。显示钾缓冲的氯化铵(ACK)红细胞裂解全血细胞(WBC)的结果，其中MgCl2包括在靶向部分(10x I-21A UCHT1)的缀合、洗脱(纯化)和贮藏中以检测表面CD3。结果与BD Horizon亮蓝515TMUCHT1和FITC UCHT1比较。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图21将观察的额外实例显示为S/N应答对抗体浓度的直方图。显示两种配置的CD3荧光分辨率。S/N通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10x I-16 UCHT1的缀合过程步骤中。数据源自流式细胞术和钾缓冲的氯化铵(ACK)红细胞裂解WBC，其中MgCl2包括在两种配置的I-16 UCHT1的缀合中以检测表面CD3：(C+E+S+)和(C+E-S-)并与先前试验(C+E+S+)比较。结果与UCHT1 FITC比较。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图22显示流式细胞术测量当量可溶荧光团分子(MESF)相关于珠对照的荧光强度应答曲线。显示2种配置的荧光。S/N通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10xI-16 UCHT1的缀合过程步骤中。数据源自钾缓冲的氯化铵(ACK)红细胞裂解WBC的流式细胞术，其中MgCl2包括在两种配置的I-16 UCHT1的缀合中以检测表面CD3：(C+E+S+)和(C+E-S-)。结果与BD HorizonTM亮蓝515UCHT1和两批FITC UCHT1比较。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。
图23显示S/N应答对抗体浓度的直方图。数据源自活Jurkat T细胞的流式细胞术，其中MgCl2包括在两种配置的I-16 UCHT1的缀合中以检测表面CD3：将(C+E+S+)和(C+E-S-)结果与FITC UCHT1比较。在该情况中，包括其它靶向部分I-32、I-21B、I-16 UCHT1作为阴性对照(无阳离子C-E-S)。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。两种系统中的CD3荧光分辨率显示S/N通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10x I-16 UCHT1的缀合过程步骤中。
图24显示S/N应答对WBC中抗体浓度的直方图。用I-51-类(I-49和I-16 UCHT1)的三批靶向部分配置(C+E-S-)来展示洗脱和贮藏可以不是必需的。数据源自钾缓冲的氯化铵(ACK)红细胞裂解WBC的流式细胞术，其中MgCl2包括在I-16 UCHT1的缀合中以检测表面CD3。结果与I-51 UCHT1和FITC UCHT1比较。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。C+E-S系统和三个批次的细胞外CD3荧光分辨率显示荧光效率通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10x I-16 UCHT1的缀合过程中。
图25A显示用10x I-16 UCHT1检测表面CD3的3种阳离子配置的比较：(C+E+S+，C+E-S-，和对照C-E-S)。数据表示为荧光效率[真实信噪比/理论S/N]*100。数据源自钾缓冲的氯化铵(ACK)红细胞裂解WBC的流式细胞术，其中MgCl2包括在缀合过程中。测试进行温育和用不含阳离子的缓冲液洗涤。3种配置中的细胞外CD3表达显示荧光效率通过包含入二价阳离子得到增强，其中MgCl2包括在10x I-16 UCHT1的缀合过程步骤中。
图25B显示来自2个实验的2个实例分析，其使用多缀合物结果以展示与过程配置相互作用的情况下的溶液中的猝灭谱。在各种阳离子配置(I-51 UCHT1-类部分)中靶向部分用MgCl2和不用MgCl2处理，然后在可视化时与0-100mM的MgCl2滴定(pH 7.4)比较。用MgCl2处理的靶向部分被预先猝灭，而MgCl2二价阳离子滴定猝灭全部配置。在第1实例中，N＝3重复读取，和用N＝1缀合物每组作图并询问(C+E-S+)。在第2实例中，N＝3重复读取
用N＝4缀合物每组分析和将多个过程配置分组为用MgCl2的那些和不用MgCl2的那些。误差棒代表1个SDEV。
图26缀合效率(缀合时回收的聚合物-染料部分)，经观察其在MgCl2包括在用MgCl2配置C+E+S+和C+E-S-构建I-16 UCHT1过程中的情况下较高。数据表示为聚合物-染料M.当量的[测量的真实标记度/理论标记度]*100＝％回收。注意到相对基线过程的回收百分比改善。数据源自使用NanoDropTM分光光度计的荧光体外测量，从3种缀合编辑，并且应用Beer-Lambert定律来定量染料浓度。
图27A和图27B显示细胞外CD3荧光分辨率通过在10x I-51 UCHT1流式细胞术中获得(可视化)Jurkat T细胞期间排除二价阳离子而得到增强。图27A显示Jurkat T细胞通过流式细胞术染色而S/N通过在数据采集(荧光可视化)期间排除二价阳离子得到增强，与含有痕量钙和镁的缓冲溶液(pH 7.4)比较。图27B显示溶液荧光发射强度在读板(荧光可视化)期间通过排除二价阳离子得到增强或者在含有痕量钙和镁的情况下猝灭。10x I-51UCHT1用于该分析。
图28显示在使用阳离子缓冲液(pH 7.4)的情况下的猝灭谱结果。在10x I-16UCHT1的实验中使用2种MgCl2过程配置(2批C+E-S+和1批C-E-S-)。数据表示为来自流式细胞术的平均荧光强度的S/N，其使用CD Chex PlusTM稳定化的全血细胞(固定的)和用裂解固定溶液裂解的红细胞，洗涤，和在不同缓冲液中可视化。相同地处理全部样本直至测试终点，然后分为3个样品，洗涤和在不含阳离子、含痕量阳离子或含50mM阳离子的3种典型流式细胞术缓冲液中再悬浮。细胞外CD3荧光分辨率通过在获得(可视化)MgCl2和10x I-16UCHT1(3批)期间排除二价阳离子得到增强
发明详述
在下文描述中，描述某些特定细节以提供对本发明各种实施方式的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解本发明可以不用这些细节来实施。
除非上下文另有需要，在整个说明书和权利要求中，措辞"包含"及其变型比如"含有"和"包括"解释为开放内含意义，也即"包括，但不限于"。
在本说明书通篇提及"一种实施方式"或"一个实施方式"意指的是，在实施方式中描述的特定性质、结构或特征包括在至少一个本发明实施方式中。从而，短语"在一种实施方式中"或"在一个实施方式中"在本说明书通篇各种位置出现不一定全部是指同一个的实施方式。另外，特定的性质、结构或特征可以在一个或多个实施方式中以任何适宜方式组合。
"氨基"是指-NH2基团。
"羧基"是指-CO2H基团。
"氰基"是指-CN基团。
"甲酰基"是指-C(＝O)H基团。
"羟基"或"羟基"是指-OH基团。
"亚氨基"是指＝NH基团。
"硝基"是指-NO2基团。
"氧代"是指＝O取代基。
"氢硫基"是指-SH基团。
"硫代"是指＝S基团。
"烷基"是指仅由碳和氢原子组成的直链或支化的烃链基团，不含不饱和度，具有一至十二个碳原子(C1-C12烷基)、一至八个碳原子(C1-C8烷基)或一至六个碳原子(C1-C6烷基)，并且其通过单键连接至分子其余部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非特别在说明书中另有说明，烷基是任选经取代的。
"亚烷基"或"亚烷基链"是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，不含不饱和度，并且具有一至十二个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、正-亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键连接至分子其余部分并且通过单键连接至残基。亚烷基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚烷基是任选经取代的。
"亚烯基"或"亚烯基链"是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，含有至少一个碳-碳双键和具有二至十二个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基等。亚烯基链通过单键连接至分子其余部分和通过双键或单键连接至残基。亚烯基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚烯基是任选经取代的。
"亚炔基"或"亚炔基链"是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，含有至少一个碳-碳三键和具有二至十二个碳原子，例如亚乙烯基，亚丙烯基，正-亚丁烯基等。亚炔基链通过单键连接至分子其余部分和通过双键或单键连接至残基。亚炔基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚炔基是任选经取代的。
"烷基醚"是指如前文所定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端(如烷氧基)或碳氧键可以在内部(也即C-O-C)。烷基醚包括至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个。例如，聚乙二醇(PEG)包括烷基醚的含义当中。除非说明书中特别另有说明，烷基醚基团是任选经取代的。例如，在某些实施方式中烷基醚用醇或-OP(＝Ra)(Rb)Rc取代，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"烷氧基"是指式-ORa基团，其中Ra是如前文所定义的含有一至十二个碳原子的烷基。除非说明书中特别另有说明，烷氧基是任选经取代的。
"烷氧基烷基醚"是指式-ORaRb基团，其中Ra是如前文所定义的含有一至十二个碳原子的亚烷基，而Rb是如本文所定义的烷基醚基团。除非说明书中特别另有说明，烷氧基烷基醚基团是任选经取代的，例如用醇或-OP(＝Ra)(Rb)Rc取代，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"杂烷基"是指如前文所定义的烷基，在烷基中或在烷基末端包含至少一个杂原子(例如N、O、P或S)。在某些实施方式中，杂原子在烷基内(也即包含至少一个碳-[杂原子]x-碳键的杂烷基，其中x是1，2或3)。在其它实施方式中，杂原子在烷基末端和从而将烷基与分子其余部分相连(例如M1-H-A)，其中M1是分子的一部分，H是杂原子而A是烷基)。除非说明书中特别另有说明，杂烷基是任选经取代的。示范性杂烷基包括氧化乙烯(例如聚氧化乙烯)，任选包括磷-氧键，比如磷酸二酯键。
"杂烷氧基"是指式-ORa基团，其中Ra是如前文所定义的含有一至十二个碳原子的杂烷基。除非说明书中特别另有说明，杂烷氧基是任选经取代的。
"杂亚烷基"是指如前文所定义的亚烷基，在亚烷基链内或在亚烷基链末端包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)。在某些实施方式中，杂原子在亚烷基链内(也即杂亚烷基包含至少一个碳-[杂原子]-碳键，其中x是1，2或3)。在其它实施方式中，杂原子在亚烷基末端和从而将亚烷基与分子其余部分连接(例如M1-H-A-M2，其中M1和M2是分子的一部分，H是杂原子而A是亚烷基)。除非说明书中特别另有说明，杂亚烷基是任选经取代的。示范性杂亚烷基包括氧化乙烯(例如聚氧化乙烯)和说明如下的"C"联接基团：
Figure BDA0002747142950000111
"C连接体"
上述C-连接体的多聚体包括在杂亚烷基连接体的各种实施方式中。
"杂亚烯基"是如前文所定义的杂亚烷基，包含至少一个碳-碳双键。除非说明书中特别另有说明，杂亚烯基是任选经取代的。
"杂亚炔基"是包含至少一个碳-碳三键的杂亚烷基。除非说明书中特别另有说明，杂亚炔基是任选经取代的。
在提及"杂原子连接体"时"杂原子"是指由一个或多个杂原子组成的连接体基团。示范性杂原子连接体包括单个原子选自O、N、P和S，和多个杂原子例如具有式-P(O-)(＝O)O-或-OP(O-)(＝O)O-的连接体及其多聚体和组合。
"磷酸盐/酯"是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra是OH，O-或ORc；而Rb是OH，O-，ORc，硫代磷酸盐/酯基团或其它磷酸盐/酯基团，其中Rc是平衡离子(例如Na+等)。
"磷酸基烷基"是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra是OH，O-或ORc；而Rb是-O烷基，其中Rc是平衡离子(例如Na+等)。除非说明书中特别另有说明，磷酸基烷基是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，磷酸基烷基中的-O烷基部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"磷酸基烷基醚"是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra是OH，O-或ORc；而Rb是-O烷基醚，其中Rc是平衡离子(例如Na+等)。除非说明书中特别另有说明，磷酸基烷基醚基团是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，磷酸基烷基醚基团中的-O烷基醚部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"硫代磷酸盐/酯"是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra是O或S，Rb是OH，O-，S-，ORd或SRd；而Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，磷酸盐/酯基团或其它硫代磷酸盐/酯基团，其中Rd是平衡离子(例如Na+等)且条件是：i)Ra是S；ii)Rb是S-或SRd；iii)Rc是SH，S-或SRd；或iv)i)，ii)和/或iii)的组合。
"硫代磷酸基烷基"是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra是O或S，Rb是OH，O-，S-，ORd或SRd；而Rc是-O烷基，其中Rd是平衡离子(例如Na+等)且条件是：i)Ra是S；ii)Rb是S-或SRd；或iii)Ra是S而Rb是S-或SRd。除非说明书中特别另有说明，硫代磷酸基烷基是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，硫代磷酸基烷基中的-O烷基部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"硫代磷酸基烷基醚"是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra是O或S，Rb是OH，O-，S-，ORd或SRd；而Rc是-O烷基醚，其中Rd是平衡离子(例如Na+等)且条件是：i)Ra是S；ii)Rb是S-或SRd；或iii)Ra是S而Rb是S-或SRd。除非说明书中特别另有说明，硫代磷酸基烷基醚基团是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，硫代磷酸基烷基中的-O烷基醚部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"碳环"是指稳定的3-至18-元芳族或非芳族环，其包含3至18个碳原子。除非说明书中特别另有说明，碳环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系，和可以是部分或完全饱和的。非芳族碳环基残基包括环烷基，而芳族碳环基残基包括芳基。除非说明书中特别另有说明，碳环基团是任选经取代的。
"环烷基"是指稳定的非芳族单环或多环碳环，其可以包括稠合的或桥连的环系，具有三至十五个碳原子，优选具有三至十个碳原子，并且其是饱和的或不饱和的和通过单键连接至分子其余部分。单环环烷基包括例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基，降莰烷基，十氢萘基，7,7-二甲基-二环-[2.2.1]庚烷基等。除非说明书中特别另有说明，环烷基是任选经取代的。
"芳基"是指环系包含至少一个碳环芳族环。在某些实施方式中，芳基包含6至18个碳原子。芳基环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系。芳基包括衍生自下述的芳基：醋蒽，苊，醋菲烯，蒽，薁，苯，
Figure BDA0002747142950000131
荧蒽，芴，不对称引达省，对称引达省，茚满，茚，萘，非那烯，菲，七曜烯，芘和三亚苯。除非说明书中特别另有说明，芳基是任选经取代的。
"杂环"是指稳定的3-至18-元芳族或非芳族环，包含一至十二个碳原子和一至六个选自氮、氧和硫的杂原子。除非说明书中特别另有说明，杂环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系；和杂环中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化；和杂环可以是部分或完全饱和的。芳族杂环的实例是在下文中列于杂芳基的定义中(也即杂芳基是杂环的子集)。非芳族杂环的实例包括二氧杂环戊烷基，噻吩基[1,3]二噻烷基，十氢异喹啉基，咪唑啉基，咪唑烷基，异噻唑烷基，异噁唑烷基，吗啉基，八氢吲哚基，八氢异吲哚基，2-氧代哌嗪基，2-氧代哌啶基，2-氧代吡咯烷基，噁唑烷基，哌啶基，哌嗪基，4-哌啶酮基，吡咯烷基，吡唑烷基，吡唑并嘧啶基，奎宁环基，噻唑烷基，四氢呋喃基，三噁烷基，三硫杂环己烷基，三嗪烷基，四氢吡喃基，硫吗啉基，硫杂吗啉基，1-氧代-硫吗啉基和1,1-二氧代-硫吗啉基。除非说明书中特别另有说明，杂环基团是任选经取代的。
"杂芳基"是指5-至14-元环系统包含一至十三个碳原子，一至六个选自氮、氧和硫的杂原子，和至少一个芳族环。出于本发明的某些实施方式的意图，杂芳基残基可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系；和杂芳基残基中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化。实例包括氮杂
Figure BDA0002747142950000141
基，吖啶基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并吲哚基，苯并二氧杂环戊二烯基，苯并呋喃基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并噻二唑基，苯并[b][1,4]二氧杂
Figure BDA0002747142950000142
基，1,4-苯并二噁烷基，苯并萘并呋喃基，苯并噁唑基，苯并二氧杂环戊二烯基，苯并二氧杂环己二烯基，苯并吡喃基，苯并吡喃酮基，苯并呋喃基，苯并呋喃酮基，苯并噻吩基(苯并噻吩基)，苯并三唑基，苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基，苯并噁唑啉酮基，苯并咪唑亚硫酰基，咔唑基，噌啉基，二苯并呋喃基，二苯并噻吩基，呋喃基，呋喃酮基，异噻唑基，咪唑基，吲唑基，吲哚基，吲唑基，异吲哚基，吲哚啉基，异吲哚啉基，异喹啉基，吲嗪基，异噁唑基，萘啶基，噁二唑基，2-氧代氮杂
Figure BDA0002747142950000143
基，噁唑基，氧化乙烯基，1-氧化吡啶基，1-氧化嘧啶基，1-氧化吡嗪基，1-氧化哒嗪基，1-苯基-1H-吡咯基，吩嗪基，吩噻嗪基，吩噁嗪基，酞嗪基，蝶啶基，蝶啶酮基，嘌呤基，吡咯基，吡唑基，吡啶基，吡啶酮基，吡嗪基，嘧啶基，嘧啶酮基，哒嗪基，吡咯基，吡啶并[2,3-d]嘧啶酮基，喹唑啉基，喹唑啉酮基，喹喔啉基，喹喔啉酮基，喹啉基，异喹啉基，四氢喹啉基，噻唑基，噻二唑基，噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮基，噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-酮基，三唑基，四唑基，三嗪基，和噻吩基(也即噻吩基)。除非说明书中特别另有说明，杂芳基是任选经取代的。
"稠合的"是指包含至少两个环的环系，其中所述两个环共享至少一个共同的环原子、例如两个共享的环原子。在稠环是杂环基环或杂芳基环的情况下，共享的环原子可以是碳或氮。稠环包括双环，三环，四环等。
术语"取代"在本文中所用意指任何上述基团(例如烷基，亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，杂烷基，杂烷氧基，磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基醚，碳环，环烷基，芳基，杂环和/或杂芳基)，其中至少一个氢原子(例如1、2、3个或全部氢原子)用连接至非氢原子的键替换，所述非氢原子是比如：卤素原子比如F，Cl，Br和I；基团比如羟基，烷氧基和酯基团中的氧原子；基团比如硫醇基团，硫代烷基，砜基团，磺酰基和亚砜基团中的硫原子；基团比如胺，酰胺，烷基胺，二烷基胺，芳基胺，烷基芳基胺，二芳基胺，N-氧化物，酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团比如三烷基甲硅烷基，二烷基芳基甲硅烷基，烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和各种其它基团中的其它杂原子。"取代"也意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子用连接至杂原子的更高等级的键(例如双键或三键)替换，所述杂原子是比如氧代，羰基，羧基和酯基团中的氧；和基团比如亚胺，肟，腙和腈中的氮。例如，"取代"包括任何上述基团，其中一个或多个氢原子用-NRgRh，-NRgC(＝O)Rh，-NRgC(＝O)NRgRh，-NRgC(＝O)ORh，-NRgSO2Rh，-OC(＝O)NRgRh，-ORg，-SRg，-SORg，-SO2Rg，-OSO2Rg，-SO2ORg，＝NSO2Rg，和-SO2NRgRh替换。"取代"也意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子用-C(＝O)Rg，-C(＝O)ORg，-C(＝O)NRgRh，-CH2SO2Rg，-CH2SO2NRgRh替换。在前文中，Rg和Rh是相同或不同的和独立地是氢，烷基，烷氧基，烷基氨基，硫代烷基，芳基，芳烷基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，杂环基，N-杂环基，杂环基烷基，杂芳基，N-杂芳基和/或杂芳基烷基。"取代"还意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子用连接至下述的键替换：氨基，氰基，羟基，亚氨基，硝基，氧代，硫代，卤代，烷基，烷氧基，烷基氨基，硫代烷基，芳基，芳烷基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，杂环基，N-杂环基，杂环基烷基，杂芳基，N-杂芳基和/或杂芳基烷基。在某些实施方式中，可选取代基是-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。此外，前述取代基各自还可以任选用一个或多个上述取代基取代。
"共轭"是指一个p-轨道与又一个p-轨道跨间隔的σ键重叠。共轭可以发生在环状或无环化合物中。"共轭度"是指至少一个p-轨道与又一个p-轨道跨间隔的σ键重叠。例如，1,3-丁二烯具有一个共轭度，而苯和其它芳族化合物一般具有多个共轭度。荧光和着色化合物一般包含至少一个共轭度。
"荧光"是指分子能够吸收特定频率的光和发出不同频率的光。荧光是本领域普通技术人员熟知的。
"着色"是指分子吸收着色光谱范围内的光(也即红、黄、蓝色等)。
"连接体"是指至少一个原子比如碳、氧、氮、硫、磷及其组合的连续链，其将分子的一部分与同一分子的又一部分连接或者与不同分子、部分或固体载体(例如微粒)连接。连接体可以经由共价键或其它手段比如离子键或氢键相互作用连接分子。
术语"生物分子"是指任何各种生物学物质，包括核酸，碳水化合物，氨基酸，多肽，糖蛋白，激素类，适体及其混合物。更特别地，该术语期望包括RNA，DNA，寡核苷酸，修饰的或衍生化的核苷酸，酶，受体，朊病毒，受体配体(包括激素类)，抗体，抗原和毒素，以及细菌，病毒，血液细胞和组织细胞。本发明的视觉可检测的生物分子(例如具有与其连接的生物分子的结构(I)化合物)制备如下：将生物分子与化合物接触，所述化合物具有反应性基团使得生物分子可以经由生物分子上任何可获得的原子或官能团比如氨基、羟基、羧基或氢硫基连接至化合物，如本文进一步描述。
"反应性基团"是能够与第二反应性基团(例如"互补反应性基团")反应形成一个或多个共价键的部分，例如通过取代、氧化、还原、加成或环加成反应。示范性反应性基团提供于表1并且包括例如亲核物质，亲电试剂，双烯，亲双烯体，醛，肟，腙，炔，胺，叠氮化物，酰基叠氮化物，酰卤，腈，硝酮，氢硫基，二硫化物，磺酰卤，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，活化的酯，酮，α,β-不饱和羰基，烯烃，马来酰亚胺，α-卤代酰亚胺，环氧化物，氮丙啶，四嗪，四唑，膦，生物素，硫杂环丙烷等。
术语"可视的"和"视觉可检测的"在本文中用于指通过视觉检查可以观察的物质，而不用预先光照或者化学或酶活化。所述视觉可检测的物质吸收和发出约300至约900nm光谱范围的光。优选，所述物质是强着色的，优选具有至少约40,000，更优选至少约50,000，还更优选至少约60,000，又还更优选至少约70,000，和最优选至少约80,000M-1cm-1的摩尔消光系数。本发明化合物可以检测如下：肉眼观察，或者借助基于光学的检测装置包括吸收分光光度计、透射光学显微镜、数字照相机和扫描仪。视觉可检测的物质并不局限于发出和/或吸收可见光谱光的那些。发出和/或吸收紫外(UV)区域的光(约10nm至约400nm)、红外(IR)区域的光(约700nm至约1mm)的物质，和发出和/或吸收其它区域的电磁光谱的物质也包括在"视觉可检测的"物质的范围内。
出于本发明实施方式的意图，术语"光稳定的可视染料"是指化学部分，其如上文所定义是视觉可检测的，并且在暴露于光的情况下不显著变化或分解。优选，光稳定的可视染料在暴露于光至少1小时之后不展示显著漂白或分解。更优选，可视染料在暴露于光至少12小时、还更优选至少24小时、又还更优选至少1周和最优选至少1个月之后是稳定的。适用于本发明化合物和方法的光稳定的可视染料的实例包括偶氮染料，硫靛蓝染料，喹吖啶酮色素，二噁嗪，酞菁，紫环酮(perinone)，二酮基吡咯并吡咯，喹酞酮，和truarycarbonium。
如本文所用，术语"苝衍生物"期望包括视觉可检测的任何取代的苝。然而，该术语并不期望包括苝本身。术语"蒽衍生物"，"萘衍生物"和"芘衍生物"类似地使用。在某些优选实施方式中，衍生物(例如苝、芘、蒽或萘衍生物)是苝、蒽、萘或芘的酰亚胺、双酰亚胺或肼酰亚胺衍生物。
本发明各种实施方式的视觉可检测的分子可用于各式各样的分析应用比如生物化学和生物医药应用，其中需要确定特定分析物(例如生物分子)的存在、位置或量。因此，在又一方面本发明提供视觉检测生物分子的方法，包括：(a)提供具有视觉可检测的生物分子的生物学系统，包含连接至生物分子的结构(I)化合物；和(b)通过其可视特性检测所述生物分子。出于本发明意图，短语"通过其可视特性检测所述生物分子"意指，在不用光照或化学或酶活化的情况下，用肉眼或者借助基于光学的检测装置包括吸收分光光度计、透射光学显微镜、数字照相机和扫描仪来观察生物分子。密度计可以用来定量存在的视觉可检测的生物分子的量。例如，生物分子在两个样品中的相对量能够通过测量相对光密度来测量。如果已知染料分子/生物分子的化学计量，且已知染料分子的消光系数，那么还能够从光密度的测量确定生物分子的绝对浓度。如本文所用，术语"生物学系统"用于指除了视觉可检测的生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。所述生物学系统的实例包括细胞，细胞提取物，组织样本，电泳凝胶，测试混合物，和杂交反应混合物。
"固体载体"是指本领域对于分子固相载体已知的任何固体基底，例如"微粒"是指用于连接至本发明化合物的任何各种小颗粒，包括玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方式中，微粒包含聚苯乙烯珠。
"固体载体残基"是指在分子从固体载体裂解后保持连接至分子的官能团。固体载体残基是在本领域已知的和能够基于固体载体结构和将分子与其连接的基团容易地衍生。
"靶向部分"是选择性结合或连接特定靶标比如分析物分子的部分。"选择性"结合或连接意指靶向部分相对其它靶标优先与希望靶标连接或结合。在某些实施方式中，本文公开的化合物包括出于将化合物与有关分析物(也即靶向部分的靶标)选择性结合或连接的意图连接靶向部分，从而允许分析物的检测。示范性靶向部分包括抗体，抗原，核酸序列，酶，蛋白质，细胞表面受体拮抗剂等。在某些实施方式中，靶向部分是部分比如抗体，其选择性结合或连接细胞上或细胞内的靶标特征，例如细胞膜或其它细胞结构上的靶标特征，从而允许有关细胞的检测。选择性结合或连接希望分析物的小分子也预期在某些实施方式中用作靶向部分。本领域技术人员将理解在各种实施方式中有用的其它分析物和相应靶向部分。
"碱基配对部分"是指能够与互补杂环部分经由氢键(例如Watson-Crick碱基配对)杂交的杂环部分。碱基配对部分包括天然和非天然碱基。碱基配对部分的实例是RNA和DNA碱基比如腺苷，鸟苷，胸苷，胞嘧啶和尿苷及其类似物。
本文公开的发明的实施方式也意在涵盖同位素标记的全部结构(I)或(II)化合物，其中一个或多个原子用具有不同的原子质量或质量数的原子替换。能够掺入公开化合物的同位素的实例包括氢，碳，氮，氧，磷，氟，氯和碘的同位素，分别比如2H，3H，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，31P，32P，35S，18F，36Cl，123I和125I。
同位素标记的结构(I)或(II)化合物能够一般地通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和下述实例描述的那些类似的过程用适当同位素标记的试剂代替原先使用的非标记试剂来制备。
"稳定化合物"和"稳定结构"意指化合物，其是足够稳健的从而经历从反应混合物分离为有用程度的纯度，和配制为有效的治疗剂还存在。
"任选的"或"任选地"意指随后描述的事件或环境可以或可以不发生，并且该描述包括其中所述事件或环境发生的情况和其并不发生的情况。例如，"任选经取代的烷基"意指烷基可以或可以不被取代并且该描述包括取代的烷基和不具有取代的烷基。
"盐"包括酸和碱加成盐。
"酸加成盐"是指与无机酸形成的那些盐，所述无机酸是比如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等，和与有机酸形成的那些盐，所述有机酸是比如乙酸，2,2-二氯乙酸，己二酸，藻酸，抗坏血酸，天冬氨酸，苯磺酸，苯甲酸，4-乙酰氨基苯甲酸，樟脑酸，樟脑-10-磺酸，癸酸，己酸，辛酸，碳酸，肉桂酸，柠檬酸，环拉酸，十二烷基硫酸，乙烷-1,2-二磺酸，乙磺酸，2-羟基乙磺酸，甲酸，富马酸，粘酸，龙胆酸，葡庚糖酸，葡萄糖酸，葡萄糖醛酸，谷氨酸，戊二酸，2-氧代-戊二酸，甘油磷酸，羟基乙酸，马尿酸，异丁酸，乳酸，乳糖酸，月桂酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，甲磺酸，粘酸，萘-1,5-二磺酸，萘-2-磺酸，1-羟基-2-萘甲酸，烟酸，油酸，乳清酸，草酸，棕榈酸，双羟萘酸，丙酸，焦谷氨酸，丙酮酸，水杨酸，4-对氨水杨酸，癸二酸，硬脂酸，丁二酸，酒石酸，硫氰酸，对-甲苯磺酸，三氟乙酸，十一烯酸等。
"碱加成盐"是指将无机碱或有机碱加至游离酸制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括钠盐，钾盐，锂盐，铵盐，钙盐，镁盐，铁盐，锌盐，铜盐，锰盐，铝盐等。衍生自有机碱的盐包括下述的盐：伯、仲和叔胺，取代的胺包括天然取代的胺，环状胺和碱性离子交换树脂，比如氨，异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺，二乙醇胺，乙醇胺，地阿诺，2-二甲基氨基乙醇，2-二乙基氨基乙醇，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，海巴明(hydrabamine)，胆碱，内铵盐，苯乙苄胺，N,N'-二苄基乙二胺，乙二胺，氨基葡萄糖，甲基葡萄糖胺，可可碱，三乙醇胺，氨丁三醇，嘌呤类，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，多元胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺，二乙胺，乙醇胺，三甲胺，二环己基胺，胆碱和咖啡因。
结晶可以产生本文描述的化合物的溶剂化物。本发明的实施方式包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用，术语"溶剂化物"是指聚集体，其包含一个或多个本发明化合物分子与一个或多个溶剂分子。溶剂可以是水，在该情况下溶剂化物可以是水合物。另选地，溶剂可以是有机溶剂。从而，本发明化合物可以作为水合物存在，包括一水合物，二水合物，半水合物，倍半水合物，三水合物，四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本发明化合物可以是真正的溶剂化物，而在另外的情况下本发明化合物可以仅保留外来水或其它溶剂或者是水和一些外来溶剂的混合物。
本发明化合物(例如结构I或II化合物)或它们的盐、互变异构体或溶剂化物的实施方式可以含有一个或多个不对称中心和可以从而产生对映体、非对映体和其它立体异构形式，其在绝对立体化学方面可以定义为(R)-或(S)-或者对于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明的实施方式意在包括全部所述可能异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以用手性合成子或手性试剂制备，或用常规技术例如色谱法和分步结晶拆分。用来制备/分离单独对映体的常规技术包括从适宜的光学纯前体手性合成或者用例如手性高压液体色谱法(HPLC)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。在本文描述的化合物含有烯式双键或其它几何不对称中心的情况下，并且除非另有指定，期望的是化合物包括E和Z几何异构体。类似地，也期望包括全部互变异构体形式。
"立体异构体"是指由通过相同键键合的相同原子构成的化合物，但是具有不可互换的不同三维结构。本发明预期各种立体异构体及其混合物和包括"对映体"，其是指两个立体异构体，其分子是彼此不可重叠的镜像。
"互变异构体"是指质子从分子的一个原子转移到相同分子的又一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的各种互变异构体形式可通过本领域普通技术人员容易地衍生。
本文使用的化学命名方案和结构图解是I.U.P.A.C.命名系统的修饰形式，采用ACD/Name版本9.07软件程序和/或ChemDraw Ultra版本11.0软件命名程序(CambridgeSoft)。也使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。
如上文所述，在本发明的一种实施方式中，提供在各种分析方法中用作荧光染料和/或着色染料的化合物。在其它实施方式中，提供用作制备用作荧光染料和/或着色染料的化合物的合成中间体的化合物。一般来说，本发明的实施方式涉及荧光部分和/或着色部分的二聚体和更高级的聚合物。荧光和/或着色部分通过连接部分连接。不受理论限制，据信连接体有助于保持荧光部分和/或着色部分之间充足的空间距离，从而减少或消除分子内猝灭，从而获得具有高摩尔"亮度"(例如高荧光发射)的染料化合物。
包含任何前述化合物和一种或多种分析物分子(例如生物分子)的组合物提供于各种其它实施方式中。在某些实施方式中，也提供所述组合物在分析方法中用于检测一种或多种分析物分子的应用。
有利地，发明人已发现二价或三价金属盐(例如MgCl2)能够与特别的聚合物染料组合用于电荷屏蔽和稳定化。在某些条件下，一种或多种二价或三价金属盐和本公开的聚合物染料的组合改善在缀合、洗脱、贮藏中或在温育期间使用时靶向部分的亲和力。令人惊讶地，发明人已发现二价或三价金属盐可以猝灭在溶液中和当在样品获得期间存在时的所述聚合物染料。
不受理论限制，二价或三价金属盐(例如MgCl2)在缀合、洗脱、贮藏、温育中使用或用作洗涤工具的情况下可以改变染料和/或靶向部分(当存在时)的亲和力，从而改善本公开聚合物染料的抗体缀合效率和改善测试结果(分辨率)。
聚合物染料与靶向部分(例如抗体)的缀合一般具有三个步骤：缀合，洗脱和贮藏。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐(例如MgCl2)在聚合物染料和靶向部分缀合期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在缀合的聚合物染料和靶向部分洗脱期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在缀合的聚合物染料和靶向部分贮藏期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在聚合物染料和靶向部分缀合和洗脱期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在缀合的聚合物染料和靶向部分洗脱和贮藏期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在聚合物染料和靶向部分缀合和贮藏期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在聚合物染料和靶向部分缀合、洗脱和贮藏期间存在。任选地，缀合过程可以包括染料的重构步骤。在抗体缀合(构建靶向部分)期间进行的阳离子配置可以表示为例如C+E-S-(也即在缀合中，但不在洗脱中且不在贮藏中)。
免疫荧光染色方法一般包括至少三个步骤：温育，洗涤和可视化。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在分析物-靶向部分复合物温育期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在分析物-靶向部分复合物洗涤期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在分析物-靶向部分复合物温育和洗涤期间存在。在实施方式中，一种或多种二价或三价金属盐在可视化期间不存在。
本文描述的各种方法的具体实施方式示于图12和13。图12显示一般化的方法。图13显示更特定的示例性方法。图12和图13的最左侧栏显示目前所用方法的实例。
在实施方式中，信噪比(S/N)在免疫荧光中得到增强，其中靶向部分与二价阳离子和细胞温育，然后洗涤除去。
在某些实施方式中，在抗体缀合物用二价阳离子处理的情况下存在过程增强。
在实施方式中，S/N在测试终点得到增强，其中抗体缀合物在不含阳离子的最终缓冲剂(pH 7.4)中可视化。
在实施方式中，S/N得到增强，其中抗体缀合物用含二价阳离子的缓冲液(pH 7.4)中洗涤，但在不含离子的缓冲液中可视化。在实施方式中，二价阳离子洗涤中断由底物组织引起的非特异性结合和猝灭，但用不含阳离子的可视化缓冲剂(pH 7.5)来增强信号：(I-W+V-)或(I+W+V-)。
在实施方式中，本公开提供包含下述的组合物：
a)聚合物染料，其包含：
i)两个或更多个荧光或着色部分；
ii)至少一个带负电基团；和
iii)反应性基团Q；和
b)二价或三价金属盐。
任何适宜的聚合物染料可以用于本公开的任何方法或组合物。
在实施方式中，本公开的方法包括形成聚合物染料和靶向部分的共价缀合物的方法，所述方法包括制备包含聚合物染料、靶向部分和二价或三价金属盐的混合物，和让混合物陈化，其持续的时间和所处的温度足以形成共价缀合物，其中：
a)聚合物染料包含：
i)两个或更多个荧光或着色部分；
ii)至少一个带负电基团；和
iii)能够与靶向部分上的互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团Q；和
b)靶向部分具有对靶标分析物的亲和力且包含互补反应性基团Q′。
在某些实施方式中，本公开方法包括检测靶标分析物的方法，所述方法包括：
a)在二价或三价金属盐存在下使共价缀合物与靶标分析物结合以形成分析物-靶向部分复合物，所述共价缀合物包含：
i)靶向部分，其具有对靶标分析物的亲和力和包含与聚合物染料共价键合的反应性基团Q′；
ii)聚合物染料，其包含：
A)两个或更多个荧光或着色部分；
B)至少一个带负电基团；和
C)与靶向部分互补反应性基团Q的共价键，所述Q与反应性基团Q′共价键合；和
b)检测来自分析物-靶向部分复合物的荧光或着色信号。
在实施方式中，方法还包括用包含二价或三价金属盐的洗涤溶液处理分析物-靶向部分复合物。
在某些实施方式中，本公开方法包括检测靶标分析物的方法，所述方法包括：
a)使共价缀合物与靶标分析物结合以形成分析物-靶向部分复合物，所述共价缀合物包含：
i)靶向部分，其具有对靶标分析物的亲和力和包含与聚合物染料共价键合的反应性基团Q′；和
ii)聚合物染料，其包含：
A)两个或更多个荧光或着色部分；
B)至少一个带负电基团；和
C)与靶向部分上的反应性基团Q′共价键合的互补反应性基团Q；
b)下述处理：
i)在使共价缀合物与靶标分析物结合期间，用二价或三价金属盐处理共价缀合物和靶标分析物；和/或
ii)在使共价缀合物与靶标分析物结合之后，用包含二价或三价金属盐的洗涤溶液处理分析物-靶向部分复合物；和
c)检测来自分析物-靶向部分复合物的荧光或着色信号。
在实施方式中，使共价缀合物与靶标分析物结合是在二价或三价金属盐存在下进行的。在实施方式中，方法还包括在检测荧光或着色信号之前从分析物-靶向部分复合物实质上除去全部二价或三价盐。在实施方式中，二价或三价金属盐是从包含分析物-靶向部分复合物的缓冲液除去的。
在实施方式中，方法还包括形成共价缀合物。在实施方式中，在形成共价缀合物之前，聚合物染料和二价或三价盐已混合形成包含聚合物染料和二价或三价盐的组合物。在实施方式中，方法还包括在形成共价缀合物之前陈化包含聚合物染料和二价或三价盐的组合物。在实施方式中，在形成共价缀合物时二价或三价盐实质上不存在。
在实施方式中，本公开组合物包含共价缀合物和二价或三价盐，所述共价缀合物包含：
i)靶向部分，其包含与聚合物染料的共价键；
ii)聚合物染料，其包含：
a)两个或更多个荧光或着色部分；
b)至少一个带负电基团；和
c)与靶向部分的共价键。
在实施方式中，靶向部分具有对靶标分析物的亲和力。在实施方式中，靶向部分包含抗体。在实施方式中，二价或三价盐是二价盐。在实施方式中，二价盐是镁盐。在实施方式中，镁盐是氯化镁。
在实施方式中，荧光或着色部分是荧光部分。在实施方式中，荧光或着色部分的各具体值独立地选自芘，苝，苝一酰亚胺和6-FAM部分。在实施方式中，荧光或着色部分的各具体值独立地具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000261
在实施方式中，聚合物染料包含多个带负电基团。在实施方式中，聚合物染料包含两个或更多个荧光或着色部分，所述两个或更多个荧光或着色部分各自经由包含至少一个带负电基团的连接体联接至相邻的荧光或着色部分。
在实施方式中，连接体还包含一个或多个亚烷基或氧化烯烃部分。在实施方式中，氧化烯烃部分包含聚氧化乙烯部分。在实施方式中，带负电基团是磷酸盐/酯。在实施方式中，聚合物染料包含2至100个荧光或着色部分，所述荧光或着色部分经由包含至少一个带负电基团的连接体联接至相邻的荧光或着色部分。在实施方式中，聚合物染料包含2至10个荧光或着色部分，所述荧光或着色部分经由包含至少一个带负电基团的连接体联接至相邻的荧光或着色部分。
在实施方式中，方法还包括纯化共价缀合物。在实施方式中，纯化共价缀合物包括从共价缀合物实质上除去全部二价或三价盐。
在实施方式中，共价缀合物具有在二价或三价盐不存在的情况下制备的相应缀合物的至少1.1倍的荧光消光系数。在实施方式中，共价缀合物具有在二价或三价盐不存在的情况下制备的相应缀合物的至少1.2倍的荧光消光系数。
在实施方式中，靶向部分是抗体。
在上述任何实施方式中，聚合物染料可以是结构(I)或结构(II)的化合物。
在各种实施方式中，检测荧光或着色信号包括用本领域技术人员所理解的技术来使用流式细胞术。
在实施方式中，化合物用于各种分析方法。例如，在某些实施方式中本公开提供染色样品的方法，所述方法包括向所述样品加入结构(I)化合物，例如其中R2或R3之一是包含连接至分析物分子(例如生物分子)或微粒的共价键的连接体，而R2或R3中另一个是H，OH，烷基，烷氧基，烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其量足以在以适当波长光照所述样品的情况下产生光学响应。
在前述方法的某些实施方式中，R2是连接体，包含与分析物分子比如生物分子的共价连接。例如，核酸，氨基酸或其聚合物(例如多核苷酸或多肽)。在还更多实施方式中，生物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
在前述方法的其它实施方式中，R2是连接体，包含与固体载体比如微粒的共价连接。例如，在某些实施方式中微粒是聚合物珠或非聚合物珠。
在甚至更多实施方式中，所述光学响应是荧光响应。
在其它实施方式中，所述样品包含细胞，和某些实施方式还包括通过流式细胞术观察所述细胞。
在还更多实施方式中，方法还包括将所述荧光响应区别于具有检测上不同的光学特性的第二荧光团的荧光相应。
在其它实施方式中，本公开提供视觉检测分析物分子比如生物分子的方法，包括：
(a)提供结构(I)化合物，例如其中R2或R3之一包含与分析物分子的共价键的连接体，而R2或R3中另一个是H，OH，烷基，烷氧基，烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
在某些实施方式中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物(例如多核苷酸或多肽)。在还更多实施方式中，分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
在其它实施方式中，提供视觉检测分析物分子比如生物分子的方法，所述方法包括：
(a)将任何前述化合物与一种或多种分析物分子混合；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
在其它实施方式中提供视觉检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求1的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子混合；
(b)形成化合物和分析物分子的缀合物；和
(c)通过其可视特性检测所述缀合物。
其它示范性方法包括检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供结构(I)化合物，其中R2或R3包含连接体，所述连接体包含与靶向部分的共价键，所述靶向部分具有对分析物的特异性；
(b)混合化合物和分析物，由此使靶向部分和分析物结合；和
(c)检测化合物，例如通过其可视特性或荧光特性进行。
在前述方法的某些实施方式中，分析物是颗粒比如细胞，和所述方法包括流式细胞术的应用。例如，可以向化合物提供靶向部分比如抗体，以选择性结合希望的细胞，从而使得细胞可以通过任何数量的技术比如可视检测或荧光检测来检测。适当的抗体能够由本领域普通技术人员取决于所希望的终端应用选择。用于某些实施方式中的示范性抗体包括UCHT1和MOPC-21。
本发明化合物的实施方式从而用于任何数量的方法，包括：细胞计数；细胞分选；生物标记检测；定量细胞凋亡；确定细胞存活率；鉴定细胞表面抗原；确定总DNA和/或RNA含量；鉴定特定核酸序列(例如作为核酸探针)；和诊断疾病比如血癌。
除了上述方法之外，结构(I)化合物的实施方式还用于各种学科和方法，包括：在内窥镜术过程中成像以鉴定癌性组织和其它组织；单细胞和/或单分子分析方法，例如几乎不用或不用扩增地检测多核苷酸；癌症成像，例如在结构(I)化合物中包括靶向部分比如抗体或糖或优先结合癌细胞的其它部分；在手术操作中成像；结合组蛋白以鉴定各种疾病；药物递送，例如在结构(I)化合物中用M部分替换活性药物部分；和/或在牙科工作和其它程序中的造影剂，例如结构(I)化合物优先结合各种菌丛和/或有机体。
应理解如上文描述的结构(I)化合物的任何实施方式，和如上文对结构(I)化合物中R1、R2、R3、R4、R5、L'、L1、L2、L3、L4、M、m和/或n变量描述的任何特定选择，可以独立地与结构(I)化合物的其它实施方式和/或变量组合以形成上文并未具体描述的本发明实施方式。此外，如果在具体实施方式和/或权利要求中对任何特定R1、R2、R3、R4、R5、L'、L1、L2、L3、L4、M、m和/或n变量列出了特选列表，应理解各单独选项可以从具体实施方式和/或权利要求删除，并且剩余的特选列表视为属于本发明范围以内。
在本发明的其它实施方式中，本文描述的各种方法和组合物中所用的荧光和/或着色染料可以是荧光和/或着色部分的二聚体和更高的聚合物。荧光和或着色部分通过在进行测试的pH具有多个带正电部分或多个带负电部分的连接体连接。
相应地，在某些实施方式中化合物具有下述结构(A)：
Figure BDA0002747142950000301
其中L是连接体，其足以保持一个或多个(例如各)M基团之间的空间分离，从而减少或消除分子内猝灭，和R1、R2、R3、L1、L2、L3和n如对结构(I)定义。在结构(A)的某些实施方式中，L是包含一个或多个乙二醇或聚乙二醇部分的连接体。
在其它实施方式中，提供具有下述结构(I)的化合物：
Figure BDA0002747142950000302
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，杂烷基，杂烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在结构(I)化合物的不同实施方式中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，包含与Q的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体，其中：Ra是O或S；Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；和Rd是平衡离子；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
结构(I)化合物中的各种连接体和取代基(例如M，Q，R1，R2，R3，Rc L1，L2，L3和L4)任选用一个或多个取代基取代。例如，在某些实施方式中选择可选取代基来优化结构(I)化合物的水溶解度或其它特性。在某些实施方式中，在结构(I)化合物中的各烷基、烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、磷酸基烷基、硫代磷酸基烷基、磷酸基烷基醚和硫代磷酸基烷基醚任选用一个或多个取代基取代，所述取代基选自羟基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，氢硫基，氨基，烷基氨基，羧基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚和硫代磷酸基烷基醚。在某些实施方式中，可选取代基是-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc如对结构(I)化合物的定义。
在某些实施方式中，L1的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体。在其它实施方式中，L1的各具体值独立地是连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团，例如Q基团。
在某些实施方式中，L4的各具体值独立地是杂亚烷基连接体。在其它更特定的实施方式中，L4的各具体值独立地是氧化烯烃连接体。
在实施方式中，聚合物染料具有下述结构(I)：
Figure BDA0002747142950000331
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M的各具体值独立地是包含荧光或着色部分的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是亚烷基或氧化烯烃连接体；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，或其经保护的形式，或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，杂烷基，杂烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数，从而化合物包括至少一个L4；和
n是1或更大的整数。
例如，在某些实施方式中L4是聚氧化乙烯，和化合物具有下述结构(IA)：
Figure BDA0002747142950000341
其中z是2至100的整数。在(IA)的某些实施方式中，z是2-30，例如约20至25，或约23的整数。在某些实施方式中，z是2至10的整数，例如3至6。在某些实施方式中，z是3。在某些实施方式中，z是4。在某些实施方式中，z是5。在某些实施方式中，z是6。
任选的连接体L1能够用作M部分与化合物其余部分的连接点。例如，在某些实施方式中制备结构(I)化合物的合成前体，和用任何数量的本领域已知的温和方法例如称为"点击化学"的方法将M部分连接至合成前体。出于该意图，快速和实质上不可逆的任何反应能够用来将M连接至合成前体以形成结构(I)化合物。示范性反应包括叠氮化物和炔形成三唑的铜催化反应(Huisgen 1，3-偶极环加成)，二烯和亲双烯体的反应(Diels-Alder)，张力促进的炔-硝酮环加成，张力烯烃与叠氮化物、四嗪或四唑的反应，烯烃和叠氮化物[3+2]环加成，烯烃和四嗪逆需求Diels-Alder，烯烃和四唑光反应以及各种取代反应，比如离去基团被亲电原子上的亲核进攻取代。示范性取代反应包括胺与下述的反应：活化的酯；N-羟基琥珀酰亚胺酯；异氰酸酯；异硫氰酸酯等。在某些实施方式中，形成L1的反应可以在含水环境中进行。
相应地，在某些实施方式中L1的各具体值是连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团，例如是前述"点击"反应之一的产物的官能团。在各种实施方式中，对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过醛、肟、腙、炔、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、氢硫基、二硫化物、磺酰卤、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化的酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)、酮、α、β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素或硫杂环丙烷官能团与互补反应性基团的反应形成。例如，胺与N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯的反应。
在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过炔和叠氮化物的反应形成。在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过胺(例如伯胺)和N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯的反应形成。
在更多实施方式中，对于L1的至少一个具体值，官能团包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基。在更多实施方式中，对于L1的至少一个具体值，官能团包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，硫脲，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基。在其它实施方式中，官能团包含酰胺或硫脲。在某些更特定的实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1是包含三唑基官能团的连接体。而在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1是包含酰胺或硫脲官能团的连接体。
在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000361
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
在不同的实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000362
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
在前述的各种实施方式中，L1a或L1b或两者不存在。在其它实施方式中，L1a或L1b或两者存在。
在某些实施方式中，L1a和L1b当存在时各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。例如，在某些实施方式中L1a和L1b当存在时独立地具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000363
在结构(I)的其它不同实施方式中，L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。在某些实施方式中，L1具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000364
在更多实施方式中，L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。例如，在某些实施方式中化合物具有下述结构(IB)：
Figure BDA0002747142950000371
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数；和
z是2至100，例如3至6的整数。
在结构(IB)化合物的某些实施方式中，x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。在其它实施方式中，x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。在其它实施方式中，x1和x3的各具体值各自是0。在某些实施方式中，x2和x4的各具体值各自是1。在其它实施方式中，x1和x3的各具体值各自是0，而x2和x4的各具体值各自是1。
在结构(IB)化合物的某些更特定的实施方式中，L1的各具体值独立地包含三唑基官能团。在结构(IB)化合物的某些其它特定的实施方式中，L1的各具体值独立地包含酰胺或硫脲官能团。在结构(IB)化合物的其它实施方式中，L1的各具体值独立地包含任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
在任何结构(I)化合物的其它实施方式中，R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。应理解"ORd"和"SRd"期望指与阳离子结合的O-和S-。例如，磷酸基团的二钠盐可以表示为：
Figure BDA0002747142950000372
其中Rd是钠(Na+)。
在任何结构(I)化合物的其它实施方式中，R5的各具体值是氧代。
在任何前述化合物的某些不同的实施方式中，R1是H。
在其它各种实施方式中，R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。在某些不同的实施方式中，R2或R3是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
在任何前述结构(I)化合物的还更多不同的实施方式中，R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。在这些实施方式的某些中，Rc是OL'。
在其它实施方式中，R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)OL'，而L'是亚烷基或与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
连接体L'能够是适于将Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物连接至结构(I)化合物的任何连接体。有利地，某些实施方式包括使用所选的L'部分来增加或优化化合物的水溶解度。在某些实施方式中，L'是杂亚烷基部分。在其它某些实施方式中，L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
在某些实施方式中，L'具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000381
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
在某些实施方式中，m”是4至10的整数，例如4、6或10。在其它实施方式中n”是3至6的整数，例如3、4、5或6。
在某些其它实施方式中，L”是亚烷基或杂亚烷基部分。在其它某些实施方式中，L”包含氧化烯烃，磷酸二酯部分，氢硫基，二硫化物或马来酰亚胺部分或其组合。
在某些前述实施方式中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
在任何前述结构(I)化合物的其它更特定的实施方式中，R2或R3具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000391
结构(I)化合物的某些实施方式能够根据固相合成方法制备，类似于制备寡核苷酸领域已知的那些。相应地，在某些实施方式中，L'是与固体载体、固体载体残基或核苷的连接体。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体是可容易获得的，和在某些实施方式中能够用作制备结构(I)化合物的原料。相应地，在某些实施方式中R2或R3具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000401
本领域技术人员将理解上文描述的dT基团仅出于便于合成和经济效率包括，并非是必须的。能够使用其它固体载体和会引起L'上存在不同的核苷或固体载体残基，或能够在合成之后除去或修饰核苷或固体载体残基。
在其它实施方式中，Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子或固体载体形成共价键。在其它实施方式中，Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与互补反应性基团Q′形成共价键。例如，在某些实施方式中，Q′存在于又一结构(I)化合物上(例如R2或R3位)，和Q和Q′包含互补反应性基团从而结构(I)化合物和又一结构(I)化合物的反应引起共价结合的结构(I)化合物的二聚体。多聚体结构(I)化合物还能够以类似方式制备和包括在本发明实施方式范围内。
Q基团的类型和Q基团与结构(I)化合物其余部分的连接性是不受限制的，条件是Q包含具有适当反应性的部分以形成希望的键。
在某些实施方式中，Q是在含水条件下不易水解的部分，但具有充足反应性以与分析物分子或固体载体上的相应基团成键(例如胺，叠氮化物或炔)。
结构(I)化合物的某些实施方式包含一般用于生物缀合领域的Q基团。例如在某些实施方式中，Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。在某些更特定的实施方式中，Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。在某些实施方式中，活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或多氟苯基酯。在其它实施方式中，炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
Q基团能够以保护形式方便地提供以增加贮藏稳定性或其它希望特性，然后在适当时间除去保护基团以与例如靶向部分或分析物缀合。相应地，Q基团包括"保护形式"的反应性基团，包括上文和下表1描述的任何反应性基团。Q的"保护形式"是指在预定反应条件下相对Q具有更低反应性的部分，但是其能够在各种条件下转化为Q，其优选不降解或与结构(I)化合物的其它部分反应。本领域技术人员能够基于特定Q和希望终端应用和贮藏条件而衍生Q的适当保护形式。例如，在Q是SH的情况下，Q的保护形式包括二硫化物，其能够用一般已知技术和试剂还原以展示SH部分。
示范性Q部分提供于下表1。
表1.示范性Q部分
Figure BDA0002747142950000411
Figure BDA0002747142950000421
Figure BDA0002747142950000431
在实施方式中，Q是选自表1的部分。
应注意在Q是SH的某些实施方式中，所述SH部分将倾向于与又一氢硫基(例如在又一结构(I)化合物上)形成二硫化物键。相应地，某些实施方式包括结构(I)化合物，其呈二硫化物二聚体形式，所述二硫化物键衍生自SH Q基团。
在某些实施方式范围中也包括结构(I)化合物，其中R2和R3之一或两者包含与又一结构(I)化合物的连接体。例如，其中R2和R3之一或两者是-OP(＝Ra)(Rb)Rc，和Rc是OL'，和L'是包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体。所述化合物能够制备如下：制备第一结构(I)化合物，其具有例如约10个"M"部分(也即n＝9)和具有适当的"Q"以与第二结构(I)化合物上的互补Q'基团反应。以该方式，能够制备具有任何数量例如100或更多个"M"部分的结构(I)化合物，而不需要依次偶联各单体。所述结构(I)化合物的示范性实施方式具有下述结构(I')
Figure BDA0002747142950000441
其中：
R1，R2，R3，R4，R5，L1，L2，L3，L4，M，m和n的各具体值独立地如对结构(I)化合物的定义；
L”是连接体，其包含Q部分与相应Q'部分反应形成的官能团；和
α是大于1，例如1至100，或1至10的整数。
结构(I')的示范性化合物提供于实施例5。其它结构(I')化合物可由本领域普通技术人员衍生，例如二聚体化或聚合本文提供的结构(I)化合物。
在其它实施方式中，Q部分被方便地掩蔽(例如保护)为二硫化物部分，其能够随后还原，提供活化的Q部分以结合至希望的分析物分子或靶向部分。例如，Q部分可以掩蔽为具有下述结构的二硫化物：
Figure BDA0002747142950000442
其中R是任选经取代的烷基。例如，在某些实施方式中，Q提供为具有下述结构的二硫化物部分：
Figure BDA0002747142950000451
其中n是1至10的整数，例如6。
在某些其它实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。例如，在某些实施方式中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。在其它实施方式中，分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。在不同的实施方式中，固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
m值是能够基于希望的荧光和/或颜色强度选择的又一个变量。在某些实施方式中，m的各具体值独立地是1至10的整数。在其它实施方式中，m的各具体值独立地是1至5的整数，例如1，2，3，4或5。
在其它实施方式中，m的各具体值独立地是大于2的整数，而z是3至10的整数，例如在某些实施方式中m的各具体值独立地是大于2的整数，比如3，4，5或6，而z是3至6的整数。
荧光强度还能够通过选择不同的n值调节。在某些实施方式中，n是1至100的整数。在其它实施方式中，n是1至10的整数。在某些实施方式中n是1。在某些实施方式中n是2。在某些实施方式中n是3。在某些实施方式中n是4。在某些实施方式中n是5。在某些实施方式中n是6。在某些实施方式中n是7。在某些实施方式中n是8。在某些实施方式中n是9。在某些实施方式中n是10。
M基于希望的光学特性，例如基于希望的颜色和/或荧光发射波长来选择。在某些实施方式中，M的各具体值是相同的；然而，需要强调指出的是M的各具体值并不需要是相同的M，而某些实施方式包括化合物，其中M的各具体值是不相同的。例如，在某些实施方式中各M是不相同的并且选择不同的M部分以具有用于荧光共振能量转移(FRET)方法中的吸收和/或发射。例如，在所述实施方式中选择不同的M部分从而吸收一个波长的辐射通过FRET机理导致发射不同波长的辐射。示范性M部分能够由本领域普通技术人员基于希望的终端用途适当选择。用于FRET方法的示范性M部分包括荧光素和5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明，琥珀酰亚胺基酯)染料。
M可以从M上的任何位置(也即原子)连接至分子其余部分。本领域技术人员将认识到将M连接至分子其余部分的手段。示范性方法包括本文描述的"点击"反应。
在某些实施方式中，M是荧光或着色部分。在实施方式中，M是荧光部分。在实施方式中，M是着色部分。可以使用任何荧光的和/或着色的部分，例如可以使用本领域已知的那些和在比色、UV和/或荧光测试中一般使用的那些。在本发明各种实施方式中有用的M部分的实例包括：呫吨衍生物(例如荧光素，罗丹明，Oregon绿，曙红或Texas红)；菁蓝衍生物(例如菁蓝，靛青，氧杂羰花青，硫杂羰花青或部花青)；方酸(squaraine)衍生物和环取代的方酸，包括Seta、SeTau和方形染料；萘衍生物(例如丹磺酰和prodan衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物(例如吡啶基噁唑，硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑)；蒽衍生物(例如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物比如级联蓝；噁嗪衍生物(例如Nile红，Nile蓝，甲酚基紫，噁嗪170)；吖啶衍生物(例如原黄素，吖啶橙，吖啶黄)；芳基次甲基衍生物：金胺，晶紫，孔雀绿；和四吡咯衍生物(例如卟吩，酞菁或胆红素)。其它示范性M部分包括：菁类染料，黄原酸盐/酯染料(例如Hex，Vic，Nedd，Joe或Tet)；Yakima黄；Redmond红；tamra；texas红和alexa
Figure BDA0002747142950000461
染料。
在任何前述的其它实施方式中，M包含三个或更多个芳基或杂芳基环或其组合，例如四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合，或甚至五个或更多个芳基或杂芳基环或其组合。在某些实施方式中，M的各具体值独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合的部分。在某些实施方式中，M包含六个芳基或杂芳基环或其组合。在其它实施方式中，各环是稠合的。例如在某些实施方式中，M包含三个或更多个稠环，四个或更多个稠环，五个或更多个稠环，或甚至六个或更多个稠环。在实施方式中，M的各具体值独立地包含稠合多环芳基部分，其包含至少四个稠合环。
在某些实施方式中，M是环状。例如，在某些实施方式中M是碳环。在其它实施方式中，M是杂环。在前述的其它实施方式中，M的各具体值独立地包含芳基部分。在这些实施方式的某些中，芳基部分是多环的。在其它更特定的实例中，芳基部分是稠合多环芳基部分，例如其可以包含至少3个、至少4个或甚至大于4个芳基环。
在任何前述结构(I)、(IA)、(IB)或(I')化合物的其它实施方式中，M的各具体值独立地包含至少一个杂原子。例如，在某些实施方式中，杂原子是氮，氧或硫。
在任何前述的更多实施方式中，M的各具体值独立地包含至少一个取代基。例如，在某些实施方式中所述取代基是氟，氯，溴，碘，氨基，烷基氨基，芳基氨基，羟基，氢硫基，烷氧基，芳氧基，苯基，芳基，甲基，乙基，丙基，丁基，异丙基，叔丁基，羧基，磺酸盐/酯基团，酰胺，或甲酰基。
在前述的某些甚至更特定的实施方式中，M的各具体值独立地是二甲基氨基茋，喹吖啶酮，氟苯基-二甲基-BODIPY，his-氟苯基-BODIPY，吖啶，骈三萘(terrylene)，联六苯，卟啉，苯并芘，(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，(二-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，四联苯，联-苯并噻唑，三联-苯并噻唑，联萘，联蒽，方酸(squaraine)，方酸鎓(squarylium)，9,10-乙炔基蒽或三联-萘部分。在其它实施方式中，M的各具体值独立地是对-三联苯，苝，偶氮苯，吩嗪，菲咯啉，吖啶，噻吨，
Figure BDA0002747142950000471
红荧烯，蒄，菁蓝，苝酰亚胺，或苝酰胺或其衍生物。在还更多实施方式中，M的各具体值独立地是香豆素染料，试卤灵染料，二吡咯甲烯硼二氟化物染料，钌联吡啶染料，能量转移染料，噻唑橙染料，聚甲炔染料或N-芳基-1,8-邻萘二甲酰亚胺染料。
在任何前述的还更多实施方式中，M的各具体值是相同的。在其它实施方式中，M各自是不同的。在还更多实施方式中，一个或多个M是相同的且一个或多个M是不同的。
在某些实施方式中，M是芘，苝，苝一酰亚胺或6-FAM或其衍生物。在某些其它实施方式中，M具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000481
尽管包含羧酸基团的M部分在上文以阴离子形式(CO2 -)描述，本领域技术人员将理解其将取决于pH变化，而质子化形式(CO2H)包括在各种实施方式中。
在某些特定实施方式中，化合物是选自表2的化合物。表2的化合物根据实施例描述的程序制备和由质谱确认其身份。
表2.结构I的示范性化合物
Figure BDA0002747142950000482
Figure BDA0002747142950000491
Figure BDA0002747142950000501
Figure BDA0002747142950000511
Figure BDA0002747142950000521
Figure BDA0002747142950000531
Figure BDA0002747142950000541
Figure BDA0002747142950000551
Figure BDA0002747142950000561
Figure BDA0002747142950000571
Figure BDA0002747142950000581
Figure BDA0002747142950000591
Figure BDA0002747142950000601
Figure BDA0002747142950000611
Figure BDA0002747142950000621
Figure BDA0002747142950000631
Figure BDA0002747142950000641
Figure BDA0002747142950000651
Figure BDA0002747142950000661
Figure BDA0002747142950000671
Figure BDA0002747142950000681
Figure BDA0002747142950000691
*TBD＝待确定
如表2和本申请通篇所用，R2，R3，m，n和L′具有为结构(I)化合物提供的定义，除非另有指定，而F，F′和F″分别是指具有下述结构的荧光素部分：
Figure BDA0002747142950000692
Figure BDA0002747142950000701
"dT"是指下述结构：
Figure BDA0002747142950000702
某些实施方式包括任何前述化合物，包括表2中提供的特定化合物，其缀合至靶向部分比如抗体。
本公开一般提供组合物，其包含具有相对更早已知化合物增加的荧光发射的化合物，以及使用其的方法。相应地，某些实施方式涉及包含Y个荧光部分M的荧光化合物，其中所述荧光化合物具有在预定波长紫外光激发下的峰值荧光发射，其是单个M部分在相同波长紫外光激发下的峰值荧光发射的至少85％*Y倍，和其中Y是2或更大的整数。荧光化合物包括在用光比如紫外光激发的情况下发出荧光信号的化合物。
在某些实施方式中，荧光化合物具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的至少90％*Y倍，95％*Y倍，97％*Y倍或99％*Y倍。
在某些实施方式中，Y是2至100，例如2-10的整数。
在某些实施方式中，所述Y个M部分独立地具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000711
其中
Figure BDA0002747142950000712
指出与荧光化合物的连接点。
在其它实施方式中，单个M部分独立地具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000721
在更特定的实施方式中，荧光化合物包含Y个M部分，所述部分独立地具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000722
其中
Figure BDA0002747142950000723
指出与荧光化合物的连接点，和单个M部分具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000724
在其它实施方式中，峰值荧光发射位于范围约500至约550nm的波长。
在还更多实施方式中，荧光化合物包含至少一个氧化乙烯部分。
还提供组合物，包含权利要求中任一项的荧光化合物和分析物。
目前公开的化合物是"可调的"，意味着通过合适选择任何前述化合物的变量，本领域技术人员能够获得具有希望和/或预先确定的摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许使用者容易地获得具有希望荧光和/或颜色的化合物，用于特定测试或用于鉴定有关的特定分析物。尽管全部变量都可以对化合物的摩尔荧光具有效果，合适选择M、L4、m和n据信在化合物的摩尔荧光中发挥重要作用。相应地，在一种实施方式中提供获得具有希望摩尔荧光的化合物的方法，所述方法包括选择具有已知荧光的M部分，制备包含M部分的结构(I)化合物，和为L4、m和n选择适当变量以获得所希望的摩尔荧光。
摩尔荧光在某些实施方式中能够表示为相对母体荧光团(例如单体)荧光发射的增加或降低倍数。在某些实施方式中，本发明化合物的摩尔荧光是相对母体荧光团1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x 10x或甚至更高。各种实施方式包括通过适当选择L4、m和n制备具有相对母体荧光团希望的荧光倍数增加的化合物。
为了便于举例说明，包含磷部分(例如磷酸盐/酯等)的各种化合物描述为阴离子状态(例如-OPO(OH)O-，-OPO3 2-)。本领域技术人员将容易地理解电荷取决于pH而未带电的(例如质子化，或盐比如钠或其它阳离子)形式也包括在本发明实施方式的范围内。
应理解在本说明书中，所描述式的取代基和/或变量的组合是可以允许的，只要这种贡献获得稳定化合物。
本领域技术人员还应认识到，在本文描述的过程中中间体化合物的官能团可以需要被适宜保护基团保护。所述官能团包括羟基，氨基，巯基和羧酸。羟基的适宜保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)，四氢吡喃基，苄基等。氨基，脒基和胍基的适宜保护基团包括叔丁氧基羰基，苄氧基羰基等。巯基的适宜保护基团包括-C(O)-R"(其中R"是烷基，芳基或芳基烷基)，对-甲氧基苄基，三苯甲基等。羧酸的适宜保护基团包括烷基，芳基或芳基烷基酯。保护基团可以按照标准技术加入或除去，其是本领域技术人员已知的和如本文描述的。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in OrganicSynthesis(1999),3rd Ed.,Wiley。本领域技术人员会理解保护基团还可以是聚合物树脂比如Wang树脂，Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。
另外，以游离碱或酸形式存在的全部本发明化合物能够通过用适当无机或有机碱或酸借助本领域技术人员已知的方法处理转化为它们的盐。本发明化合物的盐能够通过标准技术转化为它们的游离碱或酸形式。
下述反应方案说明制备本发明化合物的示范性方法。应理解本领域技术人员可以能够通过相似方法或通过组合本领域技术人员已知的其它方法来制备这些化合物。还应理解本领域技术人员能够通过用适当的初始组分并视需要修饰合成参数以与如下描述相似的方式制备并未具体说明如下的其它结构(I)化合物。通常，初始组分可以得自来源比如Sigma Aldrich，Lancaster Synthesis，Inc.，Maybridge，Matrix Scientific，TCI，和Fluorochem USA等或者根据本领域技术人员已知的来源合成(参见例如Advanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,5th edition(Wiley,December2000))或如本发明的描述制备。
反应方案I
Figure BDA0002747142950000741
反应方案I说明制备用于制备结构(I)化合物的中间体的示范性方法，其中R1、L2、L3和M如前文所定义，R2和R3如前文所定义或是其保护变型而L是任选的连接体。参照反应方案1，结构a化合物能够购买或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。a与M-X(其中x是卤素比如溴)在本领域已知的Suzuki偶联条件下的反应引起结构b化合物。结构b化合物能够用于制备结构(I)化合物，描述如下。
反应方案II
Figure BDA0002747142950000751
反应方案II说明制备用于制备结构(I)化合物的中间体的备择方法。参照反应方案II，其中R1、L1、L2、L3、G和M如前文所定义，而R2和R3如前文所定义或是其保护变型，能够购买或通过熟知技术制备的结构c化合物与M-G'反应产生结构d化合物。在此，G和G'代表具有互补反应性的官能团(也即反应形成共价键的官能团)。G’可以侧挂至M或是M结构骨架的一部分。G和G'可以是任何数量的本文描述的官能团比如分别是炔和叠氮化物，胺和活化的酯，或者胺和异硫氰酸酯等。
结构(I)化合物可以通过在熟知的自动化DNA合成条件下与具有下述结构(e)的亚磷酰胺化合物反应而制备自结构b或d之一：
Figure BDA0002747142950000752
其中A如本文定义和各L独立地是任选的连接体。
DNA合成方法是本领域熟知的。简言之，两个醇基团例如上述中间体b或d的R2和R3分别被二甲氧基三苯甲基(DMT)基团和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺基团官能化。亚磷酰胺基团一般在活化剂比如四唑存在下偶联至醇基团，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基能够用酸(例如氯乙酸)除去以暴露游离醇，其能够与亚磷酰胺基团反应。2-氰基乙基能够在低聚化之后用氨水处理除去。
制备用于低聚化方法中的亚磷酰胺也是本领域熟知的。例如，伯醇(例如R3)能够通过与DMT-Cl反应保护为DMT基团。仲醇(例如R2)则通过与适当试剂比如2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺反应官能化为亚磷酰胺。制备亚磷酰胺和它们低聚化的方法是本领域熟知的并且更加详细地描述于实施例中。
结构(I)化合物制备如下：根据上文描述的熟知亚磷酰胺化学使中间体b或d和e低聚化。通过将亚磷酰胺偶联重复希望次数将希望数量的m和n重复单元并入分子。
在某些其它实施方式中，化合物具有下述结构(II)：
Figure BDA0002747142950000761
或其立体异构体、互变异构体或盐，其中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1，L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基或杂亚炔基连接体；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，包含与Q的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体或包含与又一结构(II)化合物的共价键的连接体，其中：Ra是O或S；Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
Rd是阳离子；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是3或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在某些实施方式中，m的各具体值独立地是3或更大的整数。
在某些实施方式中，L1、L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
在结构(II)化合物的某些其它实施方式中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1、L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体；
L4的各具体值独立地是多至二十个原子长度的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基或杂亚炔基连接体；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，包含与的Q共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体，其中：Ra是O或S；Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Q是能够与分析物分子或固体载体键合的部分；
Rd是阳离子；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是3或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在其它实施方式中，化合物具有下述结构(IIA)：
Figure BDA0002747142950000781
其中x1，x2和x3的各具体值独立地是0至6的整数。
L4连接体能够与其它变量一起选择以提供所希望的荧光和/或颜色("调节"荧光和/或颜色)。在某些实施方式中，L4是多至20个原子长度，多至13个原子长度，例如多至10个原子长度或多至6个原子长度的连接体。在某些实施方式中，L4不包括二硫化物键。在其它实施方式中，L4的各具体值独立地是C1-C6亚烷基或C2-C6亚炔基。在某些实施方式中，L4是二-碳连接体。
在某些其它不同的实施方式中，化合物具有下述结构(IIB)：
Figure BDA0002747142950000782
其中：
x1，x2和x3的各具体值独立地是0至6的整数；和
y的各具体值独立地是1至6的整数。
在前述的某些实施方式中y是2。在其它实施方式中，x1、x2和x3的各具体值各自是1。在某些不同的实施方式中，各具体值x2是0和x3是1。
在其它实施方式中，R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。应理解"ORd"和"SRd"期望指与阳离子结合的O-和S-。例如，磷酸基团的二钠盐可以表示为：
Figure BDA0002747142950000791
其中Rd是钠(Na+)。
在额外的前述实施方式中，R5的各具体值是氧代。
在某些其它实施方式中，化合物具有下述结构之一(IIB′)或(IIB″)：
Figure BDA0002747142950000792
在前述的任何实施方式中，R1是H。
在不同的实施方式中，R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
例如，在某些实施方式中R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra是O，Rb是OH，O-或ORd；Rc是OH，O-，ORd，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；和Rd是平衡离子。
在其它不同的实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中的另一个是Q或包含与的Q共价键的连接体。例如，在某些实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中的另一个是Q或包含与的Q共价键的连接体，其中Ra是O，Rb是OH，O-或ORd；Rc是OH，O-，ORd，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；和Rd是平衡离子。
在其它实施方式中，Q是或包含能够与分析物分子或固体载体键合的部分。在某些实施方式中，Q提供将结构(II)化合物与分析物分子或固体载体(例如通过共价键)连接的手段。例如，在某些实施方式中Q是或包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团。在这方面，Q基团类型和Q基团与结构(II)化合物其余部分的连接性不受限制。在某些实施方式中，Q是在含水条件下不易水解的部分，但具有充足反应性以与分析物分子或固体载体上的相应基团成键(例如胺)。
结构(II)化合物的某些实施方式包含在生物缀合领域一般使用的Q基团。例如在某些实施方式中，Q是或包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。在某些更特定的实施方式中，Q是或包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺。在某些实施方式中，活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或多氟苯基酯。在其它实施方式中，炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。示范性Q部分提供于上表1。
应注意在Q是SH的某些实施方式中，所述SH部分将倾向于与在又一结构(II)化合物上的又一氢硫基形成二硫化物键。相应地，某些实施方式包括结构(II)化合物，其呈二硫化物二聚体形式，所述二硫化物键衍生自SH Q基团。
在某些其它实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。在某些不同的实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中的另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体，其中Ra是O，Rb是OH，O-或ORd；Rc是OH，O-，ORd，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；和Rd是平衡离子。例如，在某些实施方式中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。在其它实施方式中，分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。在不同的实施方式中，固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
m值是能够基于希望的荧光和/或颜色强度选择的又一个变量。在某些实施方式中，m的各具体值独立地是3至10的整数。在其它实施方式中，m的各具体值独立地是7至9的整数。
荧光强度还能够通过选择不同的n值调节。在某些实施方式中，n是1至100的整数。在其它实施方式中，n是1至10的整数。
M基于希望的光学特性，例如基于希望的颜色和/或荧光发射波长来选择。在某些实施方式中，M的各具体值是相同的；然而，需要强调指出的是M的各具体值并不需要是相同的M，而某些实施方式包括化合物，其中M的各具体值是不相同的。M可以从M上的任何位置(也即原子)连接至分子其余部分。本领域技术人员将认识到将M连接至分子其余部分的手段。
在某些实施方式中，M是荧光或着色部分。本领域已知的和在比色、UV和/或荧光测试中一般使用的任何荧光和/或着色部分都可以使用。在本发明各种实施方式中有用的M部分的实例包括：呫吨衍生物(例如荧光素，罗丹明，Oregon绿，曙红或Texas红)；菁蓝衍生物(例如菁蓝，靛青，氧杂羰花青，硫杂羰花青或部花青)；方酸(squaraine)衍生物和环取代的方酸，包括Seta、SeTau和方形染料；萘衍生物(例如丹磺酰和prodan衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物(例如吡啶基噁唑，硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑)；蒽衍生物(例如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物比如级联蓝；噁嗪衍生物(例如Nile红，Nile蓝，甲酚基紫，噁嗪170)；吖啶衍生物(例如原黄素，吖啶橙，吖啶黄)；芳基次甲基衍生物：金胺，晶紫，孔雀绿；和四吡咯衍生物(例如卟吩，酞菁或胆红素)。其它示范性M部分包括：菁类染料，黄原酸盐/酯染料(例如Hex，Vic，Nedd，Joe或Tet)；Yakima黄；Redmond红；tamra；texas红和alexa
Figure BDA0002747142950000821
染料。
在任何前述的其它实施方式中，M包含三个或更多个芳基或杂芳基环或其组合，例如四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合，或甚至五个或更多个芳基或杂芳基环或其组合。在某些实施方式中，M包含六个芳基或杂芳基环或其组合。在其它实施方式中，各环是稠合的。例如在某些实施方式中，M包含三个或更多个稠环，四个或更多个稠环，五个或更多个稠环，或甚至六个或更多个稠环。
在某些实施方式中，M是环状。例如，在某些实施方式中M是碳环。在其它实施方式中，M是杂环。在前述的其它实施方式中，M的各具体值独立地包含芳基部分。在这些实施方式的某些中，芳基部分是多环的。在其它更特定的实例中，芳基部分是稠合多环芳基部分，例如其可以包含至少3个、至少4个或甚至大于4个芳基环。
在任何前述结构(II)化合物的其它实施方式中，M的各具体值独立地包含至少一个杂原子。例如，在某些实施方式中，杂原子是氮，氧或硫。
在任何前述的更多实施方式中，M的各具体值独立地包含至少一个取代基。例如，在某些实施方式中所述取代基是氟，氯，溴，碘，氨基，烷基氨基，芳基氨基，羟基，氢硫基，烷氧基，芳氧基，苯基，芳基，甲基，乙基，丙基，丁基，异丙基，叔丁基，羧基，磺酸盐/酯基团，酰胺，或甲酰基。
在前述的某些甚至更特定的实施方式中，M的各具体值独立地是二甲基氨基茋，喹吖啶酮，氟苯基-二甲基-BODIPY，his-氟苯基-BODIPY，吖啶，骈三萘(terrylene)，联六苯，卟啉，苯并芘，(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，(二-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，四联苯，联-苯并噻唑，三联-苯并噻唑，联萘，联蒽，方酸(squaraine)，方酸鎓(squarylium)，9,10-乙炔基蒽或三联-萘部分。在其它实施方式中，M1的各具体值独立地是对-三联苯，苝，偶氮苯，吩嗪，菲咯啉，吖啶，噻吨，
Figure BDA0002747142950000822
红荧烯，蒄，菁蓝，苝酰亚胺，或苝酰胺或其衍生物。在还更多实施方式中，M的各具体值独立地是香豆素染料，试卤灵染料，二吡咯甲烯硼二氟化物染料，钌联吡啶染料，能量转移染料，噻唑橙染料，聚甲炔染料或N-芳基-1,8-邻萘二甲酰亚胺染料。
在任何前述的还更多实施方式中，M的各具体值是相同的。在其它实施方式中，M各自是不同的。在还更多实施方式中，一个或多个M是相同的且一个或多个M是不同的。
在某些实施方式中，M是芘，苝，苝一酰亚胺或6-FAM或其衍生物。在某些其它实施方式中，M1具有下述结构之一：
Figure BDA0002747142950000831
在某些其它实施方式中，M1具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000841
在某些特定实施方式中，化合物是选自表3的化合物：
表3.示范性化合物
Figure BDA0002747142950000842
Figure BDA0002747142950000851
Figure BDA0002747142950000861
Figure BDA0002747142950000871
Figure BDA0002747142950000881
Figure BDA0002747142950000891
Figure BDA0002747142950000901
如表3和本文通篇中所用，F、E和Y分别指荧光素、苝和芘部分，且具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000911
目前公开的染料化合物是"可调的"，意味着通过合适选择任何前述化合物的变量，本领域技术人员能够获得具有希望和/或预先确定的摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许使用者容易地获得具有希望荧光和/或颜色的化合物，用于特定测试或用于鉴定有关的特定分析物。尽管全部变量都可以对化合物的摩尔荧光具有效果，合适选择M、m、n和L4据信在化合物的摩尔荧光中发挥重要作用。相应地，在一种实施方式中提供获得具有希望摩尔荧光的化合物的方法，所述方法包括选择具有已知荧光的M部分，制备包含M的结构(II)化合物，和为m、n和L4选择适当变量以获得所希望的摩尔荧光。
摩尔荧光在某些实施方式中能够表示为相对母体荧光团(例如单体)荧光发射的增加或降低倍数。在某些实施方式中，本发明化合物的摩尔荧光是相对母体荧光团1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x 10x或甚至更高。各种实施方式包括通过适当选择m、n和L4制备具有相对母体荧光团希望的荧光倍数增加的化合物。
为了便于举例说明，包含磷部分(例如磷酸盐/酯等)的各种化合物描述为阴离子状态(例如-OPO(OH)O-，-OPO3 2-)。本领域技术人员将容易地理解电荷取决于pH而未带电的(例如质子化，或盐比如钠或其它阳离子)形式也包括在本发明的范围内。
应理解如上文描述的结构(II)化合物的任何实施方式，和如上文对结构(II)化合物中R1、R2、R3、R4、R5、L1、L2、L3、L4、M、m和n变量描述的任何特定选择，可以独立地与结构(II)化合物的其它实施方式和/或变量组合以形成上文并未具体描述的本发明实施方式。此外，如果在具体实施方式和/或权利要求中对任何特定R1、R2、R3、R4、R5、L1、L2、L3、L4、M、m和n变量列出了特选列表，应理解各单独选项可以从具体实施方式和/或权利要求删除，并且剩余的特选列表视为属于本发明范围以内。
应理解在本说明书中，所描述式的取代基和/或变量的组合是可以允许的，只要这种贡献获得稳定化合物。
本领域技术人员还应认识到，在本文描述的过程中中间体化合物的官能团可以需要被适宜保护基团保护。所述官能团包括羟基，氨基，巯基和羧酸。羟基的适宜保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)，四氢吡喃基，苄基等。氨基，脒基和胍基的适宜保护基团包括叔丁氧基羰基，苄氧基羰基等。巯基的适宜保护基团包括-C(O)-R"(其中R"是烷基，芳基或芳基烷基)，对-甲氧基苄基，三苯甲基等。羧酸的适宜保护基团包括烷基，芳基或芳基烷基酯。保护基团可以按照标准技术加入或除去，其是本领域技术人员已知的和如本文描述的。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in OrganicSynthesis(1999),3rd Ed.,Wiley。本领域技术人员会理解保护基团还可以是聚合物树脂比如Wang树脂，Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。
另外，以游离碱或酸形式存在的全部本发明化合物能够通过用适当无机或有机碱或酸借助本领域技术人员已知的方法处理转化为它们的盐。本发明化合物的盐能够通过标准技术转化为它们的游离碱或酸形式。
下述反应方案说明制备本发明化合物的示范性方法。应理解本领域技术人员可以能够通过相似方法或通过组合本领域技术人员已知的其它方法来制备这些化合物。还应理解本领域技术人员能够通过用适当的初始组分并视需要修饰合成参数以与如下描述相似的方式制备并未具体说明如下的其它结构(II)化合物。通常，初始组分可以得自来源比如Sigma Aldrich，Lancaster Synthesis，Inc.，Maybridge，Matrix Scientific，TCI，和Fluorochem USA等或者根据本领域技术人员已知的来源合成(参见例如Advanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,5th edition(Wiley,December2000))或如本发明的描述制备。
反应方案I
Figure BDA0002747142950000931
反应方案I说明制备用于制备结构(II)化合物的中间体的示范性方法，其中R1、L1、L2、L3和M如前文所定义，而R2和R3如前文所定义或是其保护变型。参照反应方案1，结构a化合物能够购买或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。a与M-X(其中x是卤素比如溴)在本领域已知的Suzuki偶联条件下的反应引起结构b化合物。结构b化合物能够用于制备结构(II)化合物，描述如下。
反应方案II
Figure BDA0002747142950000932
反应方案II说明制备用于制备结构(II)化合物的中间体化合物的备择方法。参照反应方案II，其中R1、L1、L2、L3和M如前文所定义，而R2和R3如前文所定义或是其保护变型，能够购买或通过熟知技术制备的结构c化合物与M-Z反应产生结构d化合物。在此，Y和Z代表具有互补反应性的官能团(也即反应形成共价键的官能团)。Z可以侧挂至M或是M结构骨架的一部分，例如环状酸酐。Y可以是任何数量的官能团比如氨基。
在某些实施方式中，结构I化合物是包含2-100个重复单元的低聚物。所述低聚物能够用类似于熟知的自动化DNA合成方法的方法制备。DNA合成方法是本领域熟知的。简言之，两个醇基团例如上述中间体b或d的R2和R3分别被二甲氧基三苯甲基(DMT)基团和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺基团官能化。亚磷酰胺基团一般在活化剂比如四唑存在下偶联至醇基团，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基能够用酸(例如氯乙酸)除去以暴露游离醇，其能够与亚磷酰胺基团反应。2-氰基乙基能够在低聚化之后用氨水处理除去。
制备用于低聚化方法中的亚磷酰胺也是本领域熟知的。例如，伯醇(例如R3)能够通过与DMT-Cl反应保护为DMT基团。仲醇(例如R2)则通过与适当试剂比如2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺反应官能化为亚磷酰胺。制备亚磷酰胺和它们低聚化的方法是本领域熟知的并且更加详细地描述于实施例中。
中间体b或d的低聚物根据上文描述的熟知亚磷酰胺化学制备。通过将亚磷酰胺偶联重复所希望的次数将所希望数量的m个重复单元掺入分子，其使用适当的中间体，例如下述结构的中间体：
Figure BDA0002747142950000941
在实施方式中，列于表4的染料化合物可以用于本公开的组合物和/或方法。列于表4的染料化合物根据本领域已知程序制备(参见例如WO 2016/183185，通过援引并入本文以教导有关的合成方法)。UV和荧光特性于2nM和pH 9测定。
表4.染料化合物
Figure BDA0002747142950000942
Figure BDA0002747142950000951
εt＝理论摩尔消光系数
在实施方式中，列于表5的染料化合物可以用于本公开的组合物和/或方法。列于表5的染料化合物根据本领域已知程序制备(参见例如WO 2016/183185，通过援引并入本文以教导有关合成方法)。
表5.染料化合物
Figure BDA0002747142950000952
Figure BDA0002747142950000961
Figure BDA0002747142950000971
εt和F如前文所定义，和"C连接体"具有下述结构：
Figure BDA0002747142950000972
"C连接体"
在实施方式中，列于表6的染料化合物可以用于本公开的组合物和/或方法。列于表6染料化合物根据本领域已知程序制备(参见例如WO 2016/183185，通过援引并入本文以教导有关合成方法)。UV和荧光特性于2nM和pH 9测定。
表6.染料化合物
Figure BDA0002747142950000973
Figure BDA0002747142950000981
εt和F如前文所定义。
在实施方式中，列于表7的染料化合物可以用于本公开的组合物和/或方法。列于表7的染料化合物根据本领域已知程序制备(参见例如WO 2016/183185，通过援引并入本文以教导有关合成方法)。UV和荧光特性于25nM和pH 9测定。
表7.染料化合物
Figure BDA0002747142950000982
Figure BDA0002747142950000991
εt和F如前文所定义。
在实施方式中，列于表8的染料化合物可以用于本公开的组合物和/或方法。列于表8的染料化合物根据本领域已知程序制备(参见例如WO 2016/183185，通过援引并入本文以教导有关合成方法)。UV和荧光特性于10nM和pH 9测定。
表8.染料化合物
Figure BDA0002747142950001001
Figure BDA0002747142950001011
F如前文所定义。
在实施方式中，列于表9的染料化合物可以用于本公开的组合物和/或方法。列于表9的染料化合物根据本领域已知程序制备(参见例如WO 2016/183185，通过援引并入本文以教导有关合成方法)。UV和荧光特性于50nM和pH 9测定。
表9.染料化合物
Figure BDA0002747142950001012
E如前文所定义。
提供下述实施例的目的是举例说明而并非限制。
实施例
一般方法
质谱分析在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(MS单模式)进行，用MassLynx 4.1采集软件。用于染料LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，8.6mM三乙胺(TEA)，pH 8。亚磷酰胺和前体分子也用Waters Acquity UHPLC系统分析，具有2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱，保持在45℃，采用乙腈/水流动相梯度。单体中间体的分子量在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(MS单模式)上用
Figure BDA0002747142950001021
鎓阳离子输注增强离子化获得。激发和发射特征实验在Cary Eclipse谱图光度计上记录。
全部反应在炉干的玻璃仪器中在氮气氛下进行，除非另有说明。可商购的DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling，VA)。无水的吡啶，甲苯，二氯甲烷，二异丙基乙基胺，三乙胺，乙酸，吡啶和THF购自Aldrich。全部其它化学品购自Aldrich或TCI并原样用作不加额外纯化。
实施例1
用乙二醇间隔物合成染料
具有氧化乙烯连接体的化合物制备如下：
低聚荧光核苷类似物(oligofluoroside)结构(也即结构(I)化合物)在AppliedBiosystems 394DNA/RNA合成器上以1μmol规模合成和具有3’-磷酸基团或3’-S2-(CH2)6-OH基团或本文描述的任何其它基团。合成在CPG珠或在聚苯乙烯固体载体上用标准亚磷酰胺化学直接进行。低聚荧光核苷类似物以3’至5’方向用标准固相DNA方法合成，和用标准β-氰基乙基亚磷酰胺化学偶联。将荧光核苷类似物亚磷酰胺和间隔物(例如六乙氧基-二醇亚磷酰胺，三乙基氧基-二醇亚磷酰胺，聚乙二醇亚磷酰胺)和连接体(例如，5’-氨基-调节剂亚磷酰胺和硫醇-调节剂S2亚磷酰胺)溶于乙腈制得0.1M溶液，和用下述合成循环依次添加：1)在二氯甲烷中用二氯乙酸除去5’-二甲氧基三苯甲基保护基团，2)在乙腈中将下一个亚磷酰胺与活化剂偶联，3)用碘/吡啶/水氧化P(III)以形成稳定的P(v)，和4)用乙酸酐/1-甲基咪唑/乙腈封端任何未反应的5’-羟基。重复合成循环直至组装好完整长度低聚荧光核苷类似物结构。在链组装末尾，在二氯甲烷中用二氯乙酸除去一甲氧基三苯甲基(MMT)基团或二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。
在受控孔隙玻璃(CPG)载体上在标记的离心管中以0.2umol规模提供化合物。加入400μL 20-30％NH4OH和温和混合。将开口管置于55℃持续～5分钟或直至过量气体被释放，然后紧密封闭和温育2hrs(+/-15分钟。)。将管从加热块移除和使其达到室温，随后于13,400RPM离心30秒以固定上清液和固体。仔细除去上清液，置于标记的管中，然后加入150μL乙腈以洗涤载体。在洗涤液加入管中之后，将其置入40℃的CentriVap设备直至干燥。
产品通过ESI-MS(参见表2)，UV-吸光度，和荧光光谱表征。
实施例2
化合物的光谱测试
干燥的化合物在150μL 0.1M Na2CO3缓冲剂中重构以制得～1mM储备液。浓缩储备液在0.1x PBS中稀释50x和在NanoDrop UV光谱仪上分析以后的吸光读数。吸光读数与消光系数(75,000M-1cm-1，各FAM单元)和Beer定律一起使用以确定储备液真实浓度。
从计算的储备浓度，在0.1M Na2CO3(pH 9)中制备～4mL的5μM溶液和在1x1cm石英池中于Cary 60UV光谱仪上分析，用300nm至700nm的光谱范围，以测量相对基团的总吸光度。从这些5μM溶液进行50nM或25nM(也在0.1M Na2CO3中，pH 9)的第二稀释，用于CaryEclipse荧光计上的光谱分析。激发设于494nm而从499至700nm收集发射谱图。
图1和图2提供代表性结构(I)化合物和比较化合物("化合物A")的紫外吸光度。如图1和2所示，包含两个荧光素部分的代表性结构(I)化合物的UV消光系数是化合物A的大约两倍。
Figure BDA0002747142950001031
Figure BDA0002747142950001042
代表性结构(I)化合物的荧光发射谱图也加以确定并与化合物A的发射光谱相比。如图3和4的数据展示，代表性结构(I)化合物的荧光发射高于化合物A，和发射随着三甘醇或六乙二醇单元的数量增加而增加。虽然不期望受理论所限，据信该出乎意料的荧光发射增加涉及内部猝灭的减少，其与L4提供的空间距离有关。
测试化合物I-10和I-11以确定M部分的数量对化合物紫外吸光度和荧光发射的效果。图5提供数据，于5μm将化合物I-10和I-11的紫外吸光度与具有单个M部分的比较化合物("化合物B")相比。在5uM，含有1个FAM单元的化合物B以0.43AU吸收，而化合物I-10(3个FAM单元)以1.17AU吸收和化合物I-11(5个FAM单元)以2.00AU吸收。
Figure BDA0002747142950001041
化合物I-10，I-11和B于25nM的荧光发射谱图示于图6。不同于猝灭(隔开更紧密的FAM单元会如此)，化合物I-10和I-11显示与化合物B的值相比分别增加2.5x和4.3x的发射响应。
实施例3
比较荧光发射响应
制备化合物"HEG,""TEG,""C2,""C3,""C4"和"C6"，其中R2和R3如对化合物I-3的定义和m从1至9变化，和确定它们的荧光发射谱图。结果示于图7。数据显示，根据本发明实施方式的化合物(也即HEG和TEG)在较少重复的间隔物部分(也即较低m值)的情况下相对其它染料化合物具有增加的荧光发射。
图8提供数据比较"HEG"化合物相对化合物A的荧光发射，其中m是1、2或3(50nM，pH＝9)。数据显示，在m大于2的情况下，HEG相对化合物A荧光发射增加。
Figure BDA0002747142950001051
Figure BDA0002747142950001061
实施例4
制备代表性化合物
制备化合物I-29、I-32和代表性类似物并测试以确定是否L4是长连接体(～1,000道尔顿PEG)的化合物与具有较短L4连接体但是多次重复(也即m大于1)的化合物具有相似的特性。图9提供化合物I-60、化合物I-46和化合物B的紫外吸光度数据。数据显示具有长L4连接体的化合物与具有多次重复的较短连接体的那些化合物具有类似的紫外吸光度，并且两种化合物都具有相对对照化合物B增加的吸光度。
实施例5
制备99聚体染料
用如本文描述的标准固相寡核苷酸技术制备具有33个荧光素部分的化合物I-42。I-42(在下述方案中用"A"代表)如下文说明和描述三聚体化，以形成99聚体染料。
Figure BDA0002747142950001071
在200μL聚丙烯管中置入磷酸钠缓冲剂(3.5μL，100mM，pH＝6.5)和I-42双-二硫化物的溶液(5.5μL，0.18mM，在水中)。向其加入溶液三(2-羧乙基)膦(TCEP，1.0μL，10mM，在水中)。将管封端，涡流搅拌和在室温下温育2h。混合物通过微Zeba Spin脱盐柱(Pierce，Cat#89877)脱盐。脱盐的溶液用磷酸钠缓冲剂(2.0μL，500mM，pH＝7.2)和双马来酰亚胺基乙烷的DMSO溶液(BMOE，1.0μL，0.25mM)处理和在室温下温育过夜。反应混合物用水稀释(100μL)和用PAGE分析(图10，Invitrogen EC6875，10％TBE-尿素凝胶，180V恒定，最高MW种类拆分完成即停止电泳，通过UV光照(365nm)可视化)。
具有任何希望数量染料部分的其它低聚物染料以类似的方式制备。
实施例6
一般流式细胞术方法
除非另有指出，下述一般程序用于下文实施例。
全血的裂解：
缓冲氯化铵方法。为了染色活细胞，将乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝的普通人类血液用氯化铵溶液(ACK)批量裂解，15mL血液对35mL在室温下(RT)裂解15分钟。细胞用50％Hank's平衡盐溶液(HBSS)和50％1％胎牛血清(FBS)1x Dulbecco's磷酸缓冲盐水(DPBS)(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中再悬浮为100μL/试验/0.1-1x10e6。在聚丙烯96孔HTS板中，将血浆细胞加入预稀释的100μL的Vf抗体，1％牛血清白蛋白(BSA)和含0.02％叠氮化钠的1x DPBS。在RT温育45分钟之后，将细胞用50％HBSS和50％-1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。
裂解/固定方法。血液用1.0mL RBC裂解溶液(氯化铵)裂解，100-15mL血液对35mL在RT裂解15分钟。细胞然后用50％HBSS和50％-1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中再悬浮为100μL/试验/1x10e6。将预稀释的抗体加入100μL1％BSA和1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)。将100μL细胞加入96孔聚丙烯HTS板(共200μL试验规模)。在RT温育45分钟之后，将细胞用50％HBSS和50％1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。
制备抗体缀合物：
抗体缀合物制备如下：将包含具有下述结构的Q部分的结构(I)化合物：
Figure BDA0002747142950001081
与希望抗体反应。从而化合物和抗体通过抗体上的S与Q部分的反应缀合形成下述连接结构：
Figure BDA0002747142950001082
抗体缀合物通过抗体名称和随后的化合物编号指明。例如，UCHT1-I-45指出化合物I-45和UCHT1抗体形成的缀合物。如果所引化合物编号不包括上述表2的Q部分，应理解安置了Q部分且所述缀合物制备自具有Q部分的所得化合物。
缀合物的稀释：
使抗体达到RT。将抗体缀合物在细胞染色缓冲剂(1X DPBS，1％BSA，0.02％叠氮化钠)中稀释至0.1-540nM(8.0微克或更少每试验)范围的浓度。在某些实施例中，各样品的系列稀释开始于在细胞染色缓冲剂中的269nM抗体，和保持抗体稀释液避光直至使用。在其它实验中，稀释开始于4.0μg抗体/试验规模，试验规模的范围是100-200μL。滴定以两倍或四倍稀释进行以产生结合曲线。在某些情况下，8.0或2.0μg/试验规模用于稀释系列的第一孔中。
采用缀合物的流式细胞术：
在物理表征之后，测试缀合物的活性和功能(抗体结合亲和力和染料亮度)并与参比抗体染色相比。然后如下确定分辨率质量：使用流细胞计数器检查亮度，并与自体荧光阴性对照和其它非特异性结合比较。在测试I-45时并未包括对小鼠IgG1,k同种型对照MOPC-21缀合物的广泛研究，原因是MOPC-21非特异性结合已在早先测试中于测试UCHT1-化合物C和UCHT1-I-45期间表征。I-45缀合物在Jurkat T细胞、Ramos B细胞、和人血白细胞异质群体或外周血液单核细胞(PBMC)上测试，并且使用聚苯乙烯山羊-抗-小鼠Ig包覆的珠。全血筛选对于测试UCHT1I-45及其类似物是最常规的。由于新结构形成而进行桥连研究。在测试缀合物(UCHT1-I-56，I-48，I-49，I-16，和I-21B)时使用额外的流式细胞术方法，并且与Sony Biotechnology的抗体缀合物参比(UCHT1-FITC)和绝大多数研究中预先表征的关键桥连参比(例如UCHT1-I-45，UCHT1-I-49)比较。
Figure BDA0002747142950001091
进行游离染料流式细胞术：
在分子和物理表征之后，也测试染料对细胞的潜在亲和力，与参比染料染色相比。因为染料具有也充当细胞探针并结合至细胞物质的能力，染料能够在高浓度(>100nM-至-10,000nM)对血液进行一般筛选以确定特定特征。然后通过评价在稀释时的亮度和线性来品评期望或出乎意料的脱靶结合，与自体荧光阴性对照和其它染料对照比较，使用流细胞计数器。化合物D(化合物C游离染料，但是非官能化的)的研究是染料亮脱靶结合的阳性对照并且已在缀合物形式中预先表征。在细胞用裂解和固定溶液处理的情况下，和在血液陈化的情况下，或在应用于PBMC单核细胞群体的情况下在人血白细胞异质群体上测试I-45染料。为了染料批次比较而进行评价亲和力(化合物D，I-45，I-49和I-16)的桥连研究，并且在表征化合物D时包括很早先研究的染料。
Figure BDA0002747142950001101
流式细胞术工作流程：
培养细胞和观察代谢性应激的视觉征兆以用于染料筛选或脱靶结合(数据未显示)，或者将新鲜健康细胞用于缀合物筛选。周期地计数细胞以检查细胞密度(1x10e5和1x10e6活细胞/mL)。(优选在板或管中)稀释抗体缀合物，随后在染色缓冲剂(DPBS，0.1％BSA，0.02％叠氮化钠)中收获细胞。使用存活率范围80-85％的细胞。细胞通过离心洗涤两次和用缓冲剂洗涤细胞除去pH指示剂，和用包含于FBS中的Ig和其它蛋白质阻断细胞。在染色缓冲剂中将细胞密度调节至试验规模。铺板细胞，1次试验/孔，或将染料(预稀释的)施用至板中的细胞。然后，细胞在23℃温育45分钟。细胞通过离心洗涤两次和用洗涤缓冲剂洗涤细胞，然后抽吸板。将细胞再悬浮于采集缓冲剂中。通过流式细胞术采集5000个完好细胞。
染料荧光通过488nM蓝色激光线借助流式细胞术检测，其中峰值发射(521nM)用525/50带通滤波器检测。通过流式细胞术采集至少1500个完好的细胞，采集目标是3000-5000个完好细胞，并且分析以鉴定细胞制备液中的活细胞。
数据分析方法：
描述性统计.EC-800软件允许使用者收集各样品采集的许多统计学数据。在通过流式细胞术查询的情况下和在检查噪音的情况下，用FL1-A通道中的平均值或中位数荧光强度(MFI)来度量抗体-染料试剂的亮度。评价其它统计数据以确定染料特征和试剂的总品质，包括中位数信噪比和绝对荧光(中位数或几何平均值)。
直方图.流式细胞术事件通过向前散射vs侧面散射(细胞体积vs细胞颗粒性)的规模来门控。那些细胞然后通过于515nm荧光发射的平均荧光强度(MFI)来门控。收集的数据展示为双参数直方图，用y-轴事件数vs x-轴log等级代表的荧光强度作图。数据可以概括为相对荧光强度的直方图或亲和力曲线。
结合曲线.选择MFI是原因是其是在通过FCM查询的情况下度量抗体-染料试剂亮度的最佳参数，其能够表示为几何平均值、中位数或平均值，并且代表绝对荧光度量。为了比较，在噪音能够高度表征的情况下，信噪比报告为MFI，S/N。
二变量、双参数直方图。在某些情况下，FCM事件并不进行门控以便检查定性输出，和数据表达为细胞颗粒性(SSC)vs染料荧光。该方法允许总体评价全血中回收的全部群体。
实施例7
用MGCL2梯度中的UCHT1-I-16染色和用显微技术成像固定的PMBC。
PBMCs用2％p.f.固定和用1xPBS洗涤和离心2x。细胞然后用透化/阻断缓冲液温育。细胞然后用1％BSA 1XDPBS(含mAbs，DAPI，和Biolegend CD14抗体)温育以共染色单核细胞1小时。UCHT1期望标记表面和细胞内CD3两者，并且伴随固定蛋白质的NSB。在黑色96平孔板中，将UCHT1-染料-抗体在MgCl2梯度(0-1000mM)中温育。将细胞加入抗体-MgCl2混合物和温育1小时。细胞然后用1xPBS(不含二价阳离子)洗涤两次。加入10ul Prolong GoldDAPI和温育5分钟。细胞然后用1xPBS洗涤2x。细胞然后在透明96平孔板中在1xPBS中铺板，和用10x物镜(100x总放大率)成像。参见图13、14和15。相似方法也用Jurkat T细胞进行(图16)。
实施例8
用MGCL2梯度中的UCHT1-I-16染色和用显微技术成像的WBC或PBMC。
将150,000至200,000个低聚甲醛固定(于2％，于2-8℃，在1x DPBS中持续1-24小时)和贮藏(2-8℃<7天)的WBC或PBMC每孔用氯化镁(MgCl2)梯度中的UCHT1-I-16染色。细胞于2000RPM(600RCF)离心5分钟，用1x DPBS洗涤，再次离心，和在阻断缓冲液(1x DPBS+1％FBS+0.02％叠氮化钠)中再悬浮。细胞在阻断缓冲液中于RT温育40分钟。
分开地，在1.5mL离心管中将MgCl2在1x PBS+1％FBS+0.02％叠氮化钠中稀释至希望浓度(0，10，25，50，100，250，500，或1000mM)和将UCHT1-I-16(A4级分，批次C0042170105MFJ，1.39mg/mL，DOL 3.07)于0.7μg或1.0μg加入各稀释液。混合溶液在RT避光温育40分钟。在40分钟温育之后，离心细胞，和除去上清液。细胞然后在各滴定的MgCl2溶液中再悬浮。样品在RT避光温育45分钟。细胞于600RCF离心5分钟和用800μL的1x DPBS洗涤两次。在洗涤之后，细胞在100μL 1x DPBS中再悬浮和置于96-透明平孔板用于成像。图像用MetaMorphTM成像软件拍摄，曝光时间500ms，10x物镜(总放大率100x)。Nikon滤光立方96311B-2E/C用于检测荧光素。图像用ImageJ成像软件(NIH)分析。全部图像以相同方式处理。使用背景减法(50像素)。图像转化为8-比特图像和赋予阈值14。计数细胞和分析每图像的积分强度，用GraphPadTM作直方图。为了清楚起见图中仅显示PBMC数据，但在PBMC研究之前就进行了WBC实验并获得相似结果(数据未显示)。
实施例9
用流式细胞术评价抗体在MGCL2溶液中的特异性结合和荧光分辨率
通过MgCl2溶液(pH 7.5)中的流式细胞术评价抗体的特异性结合和荧光分辨率。根据ATCC提供的指南培养Jurkat细胞和收获活细胞。在细胞施用至贮藏在MgCl2中的缀合抗体时进行染色，温育，洗涤，和通过流式细胞术获得。
MgCl2在15mL聚丙烯管中在1x PBS中稀释至希望浓度(0，10，25，50或100nM)，测量pH并保持稳定为pH 7.5。然后将90μL MgCl2分配至96孔聚丙烯板的各孔中。抗体用MgCl2溶液预处理：将抗体加入第一孔，在各浓度的MgCl2中系列稀释，和在使用前在RT贮藏40分钟。将UCHT1-I-51、-I-56和-I-49抗体级分稀释，开始于8.0μg/试验的系列(C对Vf100μL调节)。细胞从T-25烧瓶收获，然后在1％FBS洗涤缓冲液中在RT洗涤和离心(225RCF)2次从而用蛋白阻断细胞和用代谢抑制剂叠氮化钠处理。在离心之后除去上清液。细胞在用于温育的BSA染色缓冲液中再悬浮至1-3x105细胞/10μL试验，然后加至MgCl2，溶液(100μL Vf的90μL抗体和10μL细胞)，涡流搅拌，和在RT避光温育40分钟。于225RCF离心和用1.6mL BSA染色缓冲液洗涤混合物2次持续5分钟，和除去上清液。用800μL 1x DPBS再一次洗涤和离心细胞，然后在含有0.1％BSA和0.02％叠氮化钠的400μL 1x DPBS中再悬浮，和通过流式细胞术获得。获得数据和在SONY EC-800流式细胞术分析仪上评价，和输出至Microsoft Excel以进行描述性分析。I-51和I-56的比较结果示于图17。I-51、I-56和I-16的比较结果示于图18。
实施例10
制备亚磷酰胺和化合物
示范性化合物用标准固相寡核苷酸合成方案制备和含荧光素的亚磷酰胺具有下述结构：
Figure BDA0002747142950001141
其购自ChemGenes(Cat.#CLP-9780)。
示范性连接体(L4)通过与具有下述结构的亚磷酰胺偶联而包括在化合物中：
Figure BDA0002747142950001142
其也是可商购的。
其它示范性化合物用亚磷酰胺制备，所述亚磷酰胺根据下述方案制备：
Figure BDA0002747142950001151
最终脱保护产生希望的F”部分。其它可商购的亚磷酰胺试剂按需要使用以便安置化合物的各个部分。具有下述结构的Q部分：
Figure BDA0002747142950001152
通过下述反应安置：
Figure BDA0002747142950001153
与游离氢硫基反应。其它Q部分以类似方式根据本领域普通技术人员的知识来安置。
实施例11
Jurkat新鲜活细胞。比较UCHT1 I-16级分，一份不含MgCl2而另一份含MgCl2，并且与I-21B和右侧其它参比(参见图23)比较。全部抗体在相同板上用相同样本一起测试。通过流式细胞术在缀合期间施用MgCl2评价I-16的特异性结合和荧光分辨率。MgCl2仅在缀合期间的两个阶段施用至UCHT1 I-16：(1)在反应与马来酰亚胺(水+0.1M MgCl2)缀合再悬浮的情况下。(2)在PBS中在0.1MgCl2中纯化和洗脱和贮藏期间。将抗体稀释入BSA染色缓冲液而不向含细胞的缓冲液额外施用任何MgCl2。流动方法：按照American Type CultureCollection(ATCC)提供的指导培养Jurkat T细胞并且收获活细胞。简言之，在细胞施用至缀合抗体时进行染色，温育，洗涤然后通过流式细胞术获得：稀释抗体级分从而开始2.0μg/试验的系列(对Vf 100μL调节C)。从T-25烧瓶收获细胞，在1％FBS洗涤缓冲液中在室温下(RT)洗涤和离心(225RCF)2次从而用蛋白质阻断细胞，和用代谢抑制剂叠氮化钠处理。在离心之后除去上清液。细胞在温育用的BSA染色缓冲液中再悬浮至1-3x105细胞/100μL试验，然后加至抗体，涡流搅拌，和在RT避光温育40分钟。混合物用1.6mL BSA染色缓冲液于225RCF离心和洗涤2次持续5分钟，除去上清液。细胞用800μL 1xDPBS再一次洗涤和离心，然后再悬浮于含有0.1％BSA和0.02％叠氮化钠的400μL 1xDPBS中，和通过流式细胞术获得。获得数据并在SONY EC-800流式细胞术分析仪上评价，输出至Microsoft Excel进行描述性分析。DOL为2.47，f/p 25的UCHT1 I-16级分A5显示与UCHT1 I-21B级分A5，DOL 3.0，f/p 30相等或更亮的荧光。在缀合期间加入MgCl2使得UCHT1 I-16相对不存在MgCl2的UCHT1 I-16级分A6，DOL 4.18，f/p 42增强。该发现具有实际意义，原因是在先前实验中观察到UCHT1I-16比I-51和I-21B都更暗淡，但在此处用MgCl2来纯化抗体的情况下更则亮。
实施例12
通过流式细胞术将I-16与BB515和FITC比较
概括地，图19和20-24显示具有不同阳离子配置的标记度(DOL)具有一些差异的3种缀合物构造通过流式细胞术测试(如前文描述)的结果。简言之，进行I-16与I-21B、BB515和FITC的比较。对新鲜血液或细胞进行细胞外染色，裂解，洗涤，然后在室温下温育45分钟，然后洗涤再次。
在WBC中比较CD3+T细胞和Jurkat T细胞(图23中的Jurkat T细胞)标记用于人CD3表达的情况(如先前描述)。将UCHT1-I-16和/或I-21A和I-57与UCHT1-BB515和UCHT1-FITC比较。发现UCHT1-I-16比UCHT1-BB515更亮1.7x和比UCHT1 FITC更亮5.7x。如上文所指出，MgCl2存在于制备过程的不同阶段(例如缀合、在纯化期间洗脱和/或贮藏，在实施例中缩写为C+E+S+)，参见图19。
图20A和20B显示UCHT1-I-16和UCHT1-1-21A的C+E+S+与C+E-S-比较。图21展示UCHT1-1-16使用配置C+E+S+、C+E-S-和C+E-S-的3种缀合操作，将其与C+E+S+的第1试验操作(缀合阳性对照参考)比较。
图22显示流式细胞术的额外实验程序，其用来确定绝对荧光而不是信噪比。用可溶荧光团当量滴定标记的珠群体校准曲线。获得珠的条件与获得数据的那些相同，其用流式细胞术来鉴定离散当量水平的荧光团通道。评价珠产生的标准曲线，将与图21相似的实验的数据用幂线性回归计算重新表示。以此方式，能对三个批次确定3种过程配置的分子当量可溶荧光团(MESF)估计值。然后将配置分别为C+E+S+、C+E-S-、C+E-S-的UCHT1-I-16UCHT1-1-16批次(1st、2nd、3rd)与BB515(1个批次)和FITC(2个批次)相比。该方法展示比FITC更亮8-10x且相当于BB515的绝对亮度。
图23显示UCHT1-I-16(C+E+S+)与作为阴性对照的其它(C-E-S-)配置I-51、I-21B和I-16以及阳性对照参考FITC的比较。在该情况下C+E+S+配置如果与靶标f/p 30比较则超过理论荧光水平，而C-E-S-配置则不如理论所指那样明亮。
图24显示所测试的3个批次A、B和C，显示来自缀合的两种级分。C+E-S-配置超过理论S/N。
总的来说，通过流式细胞术确定，在配置中含有阳离子的那些缀合物比其它缀合物更亮，并且观察到洗脱和贮藏仅在温育期间在高浓度靶向部分的情况下具有轻微优势。这是在不同分析方法中用缀合物配置之间的线性回归确定的，但此处并未展示数据。
实施例13
展示低聚荧光核苷类似物染料是离子传感器以及通过共同施用镁的流式细胞术的高分辨率
测试用于生物缀合的备择反应的生产能力。在马来酰亚胺预活化的染料从冻干状态重构期间加入水和0.1M氯化镁，然后施用至经还原剂处理的抗体(TCEP)用于生物缀合，其假设改善抗体缀合物，原因可能是电荷屏蔽或路易斯酸配位的相同效果。另外还可能来自在进入与游离氢硫基的反应之前的多磷酸盐电荷屏蔽。总体来说，缀合试验显示镁适于修饰超亮荧光团聚合物以进一步用于马来酰亚胺缀合反应和随后施用抗体缀合物进行使用流式细胞术(FCM)的分析程序中的染色。
方法：三种途径引导的实验：
1)在UCHT1抗体缀合标记至10x染料的过程中选择包含镁的体系，同时靶向规格小于5.0的标记(DOL)上的最终染料
2)在细胞上CD3抗原的染色方法之前和在其期间选择镁施用至抗体。离子对分析程序的干扰研究。
3)评价缀合物在溶液中的荧光发射。
上述代表抗体开发过程中的三个询问点，其影响染料构象和随后的测试输出。该系统途径采用缀合方法1)将改变染料与抗体相互作用的方式，2)将改善DOL的靶向(有效标记)，和3)改善FCM的荧光分辨率(改善信号和抗体亲和力)。
缀合方法：将染料再悬浮在水+0.1M MgCl2中，然后与抗体合并和在0℃温育一小时(最终MgCl2 C～25mM)。在10x 300nm Superdex 200柱上用1x PBS缓冲液将缀合物纯化和洗脱。级分收集于微离心小瓶中。汇集一些级分，用30k MWCO浓缩器浓缩。在进行含镁洗脱和贮藏的情况下，洗脱缓冲液包括0.1M MgCl2，和/或贮藏缓冲液中掺入Cf0.1M的MgCl2。缀合物浓度用Nano Drop 2000确定。于280nm和495nm记录吸收值。用对于10x染料的校正因子(OD280/0D495)0.19和Beer定律的原理来确定荧光染料与蛋白质(f/p)的比率＝(标记上的染料，DOL)。例如3的DOL等价于30的f/p。
荧光研究：在制备缀合物之后，用活Jurkat T细胞、和/或钾缓冲的氯化铵裂解的(ACK)全血细胞(WBC)和其它WBC模型来证实FCM中的荧光分辨率。研究使用MgCl2与细胞温育，然后洗涤除去，施用以监测向测试加入二价阳离子的直接效果。参见图17和18。与之相对，(仅在缓冲液中)进行溶液光谱研究以输出存在和不存在二价阳离子的吸收和发射谱。参见图25B和27B。类似地，(通过FCM)用最终获得缓冲液研究来代表在抗体结合至细胞的情况下在读取期间包括或排除离子的实际结果。参见图27A和28。
缀合研究：一般地，用不同配置系列制备三个批次并与先前的物质比较。过程改善研究如下：在不同点将MgCl2掺入本申请标准马来酰亚胺UCHT1(抗-CD3)生物缀合。用预先建立的本申请缀合方法以系列步骤进行缀合系统的等价和桥连研究以优化FCM分辨率。参见图21，20B，23，24和25A。在不同缀合系统中在缀合过程中施用镁以进行比较。系统测试是(C+E+S+)、(C+E-S-)、(C+E-S+)，(用缀合+洗脱+贮藏+的首字母缩拼词表达)。在各系统中基于关于TCEP的先前观察靶向f/p(标记上的染料)，并且申请人实验室中预先建立的非-MgCl2马来酰亚胺反应的马来酰亚胺化学计量以高于靶标DOL的2-4当量初始标记度(DOL)来限制最终DOL<5.0。在某些实验中，将其它链系长度(4x、6x、10x)的染料与1x I-16的对照链系长度一起测试。(数据未显示)。
三个系统的输出的数据分析用下述来描述：标记上的染料效率[缀合情况下的真实DOL/施用DOL]*100，荧光强度(相对发射)(图25A)，FCM信噪比(S/N)(CD3+群体的平均信号/CD3-群体的平均噪音)，各系统间S/N的回归分析，还评价了其它效能参数(例如非特异性结合度)。
用缀合至珠标准物(Bangs实验室)的FITC对FCM通道进行额外定量，将其用来通过FCM测量10x FAM UCHT1 I-16的当量可溶荧光染料分子(MESF)输出。参见图22。
结果：早期研究指出，在抗体和抗原温育期间存在MgCl2(0-100mM)且为继续FCM方法洗涤除去的情况下，于25-100mM，特别是在高浓度抗体(染料)的情况下观察到信号增强效果，如图17和18。在缀合的全部阶段(染料重构、缀合、洗脱、贮藏[符号化系统(C+E+S+)])包括MgCl2的额外初步研究显示产生超明亮的参比抗体，其效能比对不用MgCl2预先观察到的那些更优异。
推定MgCl2将如初步研究的观察具有对亮度的正面效果，因此申请人制备了额外批次(C+E+S+)并靶向低DOL(也即1-3)[理论染料:蛋白质当量为4.5:1]以避免过度缀合和限制抗体亲和力的变化，期望制得优异的试剂。再次，流式细胞术的明亮S/N引起实际荧光输出，其具有约30的f/p和1.4-2.7的DOL(f/p 14-27)。S/N与FITC相比超过理论值，其具有f/p 6.2，并且超过理论亮度因子(30/6.2)，其是FITC对照的4.8倍。
然后用I-16(C+E-S-)vs.(C+E-S+)进行中期离子干扰研究以潜在排除过程中的洗脱条件，并且研究贮藏的重要性。本申请展示(C+E-S-)与(C+E-S-)、(C+E+S+)比较起到期望的作用(对于高分辨率来说洗脱并非必需)，并且用在贮藏时经掺入的配制剂(C+E-S+)作为最初参比试验，图21。结果指出，在为了FCM稀释贮藏物质期间存在残余量镁的情况下，与细胞温育对信号几乎没有额外益处。这些结果一起显示，至少在缀合时包括MgCl2能对效能具有实际益处，同时可以不考虑洗脱和贮藏。
因此，假定通过在更简单的系统(C+E-S-)中包含镁能够增加DOL，其使用理论染料:蛋白质当量7:1。因此，用该配置(C+E-S-)制备额外批次来靶向最终高DOL(3-5)，并且还保留经贮藏掺入的级分(C+E-S+)用于后续贮藏效果的再确认(在温育期间存在残余镁)。一般来说，信号正如对UCHT1-I-16所期望那样被保留。贮藏和温育信号增强也再确认上述观察，但对系统的总等价性几乎没有影响(C+E-S-～C+E-S+)。在相同实验中UCHT1 I-16第1和第2批次的比较再次确认低DOL 1-3试剂和包含MgCl2有助于超过UCHT1 BB515(BDBiosciences)的S/N结果，并且对于两个系统基于FITC对照接近了30的理论f/p。
第3批次用配置C+E-S-制备，其具有4.5:1的理论染料:蛋白质当量。该系统靶向类似第1批次的DOL(最终DOL范围1-3)。再次，观察到UCHT1 I-16增强。实际意义是，I-16染料缀合物具有更高FCM分辨率，其是在使用MgCl2前的染料标记效率的约两倍(平均绝对标记效率：原先＝24％，和与之相比的含MgCl2的3组缀合53％、58％、62％)。
在模拟溶液施用之后，在含有MgCl2浓度(0-1000mM)的PBS(pH 7.4)溶液中的缀合物吸收和发射谱图显示离子浓度依赖性的猝灭，而不是信号增强。溶液中的发射数据显示缀合的染料能够如所期望通过预定量的DOL(通过Nano Drop确定)排序，但是在溶液中以添加剂EDTA<MgCl2<CaCl2的排序猝灭和以各构造和配置独特的方式通过聚阳离子阻断剂引起。数据未显示。该观察与对下述的观察相符：在通过FCM获得样品时用含或不含镁的不同再悬浮缓冲液猝灭。在任何方法的荧光可视化期间存在MgCl2加入，如图27A、27B和28(在溶液中或在通过FCM获得期间)显示信号猝灭。这些观察与初步研究FCM相对照，其中观察到MgCl2在与细胞温育期间存在但随后在样品获得之前洗涤除去的情况下增强信/噪比。参见图17和18。
最终，为了确认初步研究(其使用不同配置的早期系列实验制备的批次)，在同一天用等同的物质和等同的纯化程序再次平行地制备缀合物。仅改变阳离子配置(C-E-S-对照，和C+E-S-，C+E+S)。另外，通过先前实验的发现，目标是使全部缀合物的最终f/p大致相同(19.7至24.7)以消除对标记度的混杂解释。然后通过FCM测试这些缀合物。一般地，该实验确认向系统加入MgCl2的效果有利于产生具有更有效荧光输出的靶向部分。参见图25A。
最终，在加入缀合反应之前用来溶解活化染料的情况下MgCl2改善缀合标记效率，从而支持在早期过程输入与在后续过程输出中观察到的有效标记和更高分辨率荧光之间的质量关系。这些观察也支持证实能实现生产能力改善的第一研究目的。参见图26。FCM通道设备动态范围的额外定量和表征和用BangsTM珠FITC标准物(Bangs实验室)来定量当量可溶荧光素分子(MESF)指出，缀合物比UCHT1 FITC f/p 6-7更亮8-10x。这比如FCM平均信噪比所确定的绝对S/N所能报告的那些更加明亮。参见图22。
讨论：最初设计高密度电荷的聚合物以在水中高度可溶，从而在引入盐的情况下能够期望构象变化。在相似设计的更低电荷密度分子(I-16)的情况下可能如此，但程度更低。这代表离子能够干扰分析程序的一般情况(在该情况中是荧光和CD3检测)。通过对程序或试剂本身的化学调整能够消除或控制干扰。
总体来说，认为镁具有正面改变生物缀合的染料和/或抗体的潜力。额外地，所测试的聚合物具有离子传感特性，其是弱二价离子螯合剂且对相似pH的不同缓冲液配制剂敏感。不受理论所限的理解是，在施用MgCl2的情况下染料呈有效缀合的有利构象，限制抗体等电点变更和改善较低浓度的抗原结合。假定MgCl2在某些条件下屏蔽电荷和稳定化染料，在缀合、洗脱、贮藏或在温育期间使用时改善抗体亲和力，但是在溶液观察时发生猝灭。
虽然需要更多研究，理想地，如果这些化合物能够是在用于测试之前稳定化(或电荷中和)的而不猝灭且不与其它聚阳离子相互作用的离子和盐形式，则染料的效用和生物缀合物的制备能得到显著改善。大致地，对于FCM方案(特别是全血裂解的)，其中在染色/裂解/固定程序期间存在血浆、补充血清、阻断剂或螯合剂，能够期望染料与(或缺少)离子的一些相互作用。已观察到所述相互作用表现为亲和力损失(通过滴定亲和力曲线表达)和与固定WBC的和在进行染色/裂解/固定/洗涤程序的新鲜细胞中的增加的非特异性结合。(数据未显示)。因为二价阳离子和聚阳离子存在于血浆中(特别是从裂解的红细胞释放)、或在活化的细胞中、或在细胞表面上，能期望相似的离子相互作用。实际上，用镁阻断瞄准染料或聚骨架阻断瞄准靶标底物能适用于防范血浆和复杂组织中的干扰性因素。额外地，还能进行经鉴定用来利用该效果的特定方法，特别是免疫组织化学中的苛刻固定/持久方法(甲醇)，和致密组织切片，其中希望电荷屏蔽和非线性的更加电中性的构象用来有效扩散通过细胞内基质。最后，镁洗涤或在温育期间包含镁也能打断由于任何非特异性结合和猝灭导致的高背景和低信号。这在染色条件中可以是重要的，其导致与在固定和可渗透化组织中存在的聚阳离子的强离子结合。实际上，对2.0％低聚甲醛固定的、红细胞裂解的和分离的全血细胞PBMC和Jurkat T细胞的观察指出用UCHT1-I-16和氯化镁温育的细胞中的S/N增强。结果还显示两个阶段的效果：S/N在低浓度较低，其在100mM-250mM增强，然后于1000mM再次猝灭。这再次确认离子结合通过期望的构象变化扰动荧光强度。图13、14、15和16。
本说明书提及和/或申请数据页列出的全部U.S.专利、U.S.专利申请公开、U.S.专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开，包括2018年3月19日提交的U.S.临时专利申请No.62/645,121，都通过援引整体并入本文且不与本文矛盾。
从前文应认识到，尽管本发明的具体实施方式已在本文中出于举例目的描述，可以进行各种修饰而不偏离本发明的主旨和范围。相应地，本发明除了受所附权利要求限制以外并不受限。

Claims (80)

1.用于形成聚合物染料和靶向部分的共价缀合物的方法，所述方法包括制备包含聚合物染料、靶向部分和二价或三价金属盐的混合物，并且让混合物陈化，其持续的时间和所处的温度足以形成共价缀合物，其中：
a)聚合物染料包含：
i)两个或更多个荧光或着色部分；
ii)至少一个带负电基团；和
iii)反应性基团Q，其能够与靶向部分上的互补反应性基团Q′形成共价键；和
b)靶向部分具有对靶标分析物的亲和力且包含互补反应性基团Q′。
2.检测靶标分析物的方法，所述方法包括：
a)在二价或三价金属盐存在下使共价缀合物与靶标分析物结合以形成分析物-靶向部分复合物，所述共价缀合物包含：
i)靶向部分，其具有对靶标分析物的亲和力且包含与聚合物染料的共价键；
ii)聚合物染料，其包含：
A)两个或更多个荧光或着色部分；
B)至少一个带负电基团；和
C)与靶向部分的共价键；
b)检测来自分析物-靶向部分复合物的荧光或着色信号。
3.权利要求2的方法，还包括用包含二价或三价金属盐的洗涤溶液处理分析物-靶向部分复合物。
4.检测靶标分析物的方法，所述方法包括：
a)使共价缀合物与靶标分析物结合以形成分析物-靶向部分复合物，所述共价缀合物包含：
i)靶向部分，其具有对靶标分析物的亲和力且包含与聚合物染料的共价键；和
ii)聚合物染料，其包含：
A)两个或更多个荧光或着色部分；
B)至少一个带负电基团；和
C)与靶向部分的共价键；
b)下述处理：
i)在使共价缀合物与靶标分析物结合期间用二价或三价金属盐处理共价缀合物和靶标分析物；和/或
ii)在使共价缀合物与靶标分析物结合之后用包含二价或三价金属盐的洗涤溶液处理分析物-靶向部分复合物；和
c)检测来自分析物-靶向部分复合物的荧光或着色信号。
5.权利要求4的方法，其中使共价缀合物与靶标分析物结合在二价或三价金属盐存在下进行。
6.权利要求2-5中任一项的方法，还包括在检测荧光或着色信号之前从分析物-靶向部分复合物实质上除去全部二价或三价盐。
7.权利要求6的方法，其中二价或三价金属盐是从包含分析物-靶向部分复合物的缓冲液除去的。
8.权利要求2-7中任一项的方法，还包括形成共价缀合物。
9.权利要求3-8中任一项的方法，其中在形成共价缀合物之前聚合物染料和二价或三价盐已混合形成包含聚合物染料和二价或三价盐的组合物。
10.权利要求9的方法，还包括在形成共价缀合物之前陈化包含聚合物染料和二价或三价盐的组合物。
11.权利要求8或9的方法，其中在形成共价缀合物时二价或三价盐实质上不存在。
12.包含共价缀合物和二价或三价盐的组合物，所述共价缀合物包含：
i)靶向部分，其包含与聚合物染料的共价键；
ii)聚合物染料，其包含：
a)两个或更多个荧光或着色部分；
b)至少一个带负电基团；和
c)与靶向部分的共价键。
13.权利要求12的组合物，其中靶向部分具有对靶标分析物的亲和力。
14.权利要求13的组合物，其中靶向部分包含抗体。
15.权利要求1-14中任一项的方法或组合物，其中二价或三价盐是二价盐。
16.权利要求15的方法或组合物，其中二价盐是镁盐。
17.权利要求16的方法或组合物，其中镁盐是氯化镁。
18.权利要求1-17中任一项的方法或组合物，其中荧光或着色部分是荧光部分。
19.权利要求1-18中任一项的方法或组合物，其中荧光或着色部分的各具体值独立地选自芘，苝，苝一酰亚胺和6-FAM部分。
20.权利要求1-19中任一项的方法或组合物，其中荧光或着色部分的各具体值独立地具有下述结构之一：
Figure FDA0002747142940000041
21.权利要求1-20中任一项的方法或组合物，其中聚合物染料包含多个带负电基团。
22.权利要求1-21中任一项的方法或组合物，其中聚合物染料包含两个或更多个荧光或着色部分，所述两个或更多个荧光或着色部分各自经由包含至少一个带负电基团的连接体联接至相邻的荧光或着色部分。
23.权利要求22的方法或组合物，其中连接体还包含一个或多个亚烷基或氧化烯烃部分。
24.权利要求23的方法或组合物，其中氧化烯烃部分包含聚氧化乙烯部分。
25.权利要求1-24中任一项的方法或组合物，其中带负电基团是磷酸盐/酯。
26.权利要求1-25中任一项的方法或组合物，其中聚合物染料包含2至100个荧光或着色部分，所述荧光或着色部分经由包含至少一个带负电基团的连接体联接至相邻的荧光或着色部分。
27.权利要求26的方法或组合物，其中聚合物染料包含2至10个荧光或着色部分，所述荧光或着色部分经由包含至少一个带负电基团的连接体联接至相邻的荧光或着色部分。
28.权利要求1-27中任一项的方法或组合物，还包括纯化共价缀合物。
29.权利要求28的方法或组合物，其中纯化包含从共价缀合物实质上除去全部二价或三价盐。
30.权利要求1-29中任一项的方法或组合物，其中共价缀合物具有在二价或三价盐不存在的情况下制备的相应缀合物的至少1.1倍的荧光消光系数。
31.权利要求1-30中任一项的方法或组合物，其中共价缀合物具有在二价或三价盐不存在的情况下制备的相应缀合物的至少1.2倍的荧光消光系数。
32.权利要求1-31中任一项的方法或组合物，其中靶向部分是抗体。
33.权利要求1-32中任一项的方法或组合物，其中聚合物染料具有下述结构(I)：
Figure FDA0002747142940000061
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M的各具体值独立地是包含荧光或着色部分的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是亚烷基或氧化烯烃连接体；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，或其经保护的形式，或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，杂烷基，杂烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数，从而化合物包括至少一个L4；和
n是1或更大的整数。
34.权利要求1-33中任一项的方法或组合物，其中聚合物染料具有下述结构(IA)：
Figure FDA0002747142940000071
其中z是2至100的整数。
35.权利要求34的方法或组合物，其中z是3至6的整数。
36.权利要求1-35中任一项的方法或组合物，其中L1具有下述结构之一：
Figure FDA0002747142940000081
37.权利要求34或35的方法或组合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
Figure FDA0002747142940000082
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
38.权利要求34、35或37中任一项的方法或组合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
Figure FDA0002747142940000083
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
39.权利要求37或38的方法或组合物，其中L1a或L1b或两者是不存在。
40.权利要求37-39中任一项的方法或组合物，其中L1a或L1b或两者是存在。
41.权利要求37-40中任一项的方法或组合物，其中L1a和L1b当存在时各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。
42.权利要求37-41中任一项的方法或组合物，其中L1a和L1b当存在时独立地具有下述结构之一：
Figure FDA0002747142940000091
43.权利要求34-42中任一项的方法或组合物，其中L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
44.权利要求34-43中任一项的方法或组合物，其中L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。
45.权利要求34-44中任一项的方法或组合物，其中化合物具有下述结构(IB)：
Figure FDA0002747142940000092
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数；和
z是2至100的整数。
46.权利要求45的方法或组合物，其中x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。
47.权利要求45或46的方法或组合物，其中x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。
48.权利要求45-47中任一项的方法或组合物，其中L1的各具体值独立地包含三唑基官能团。
49.权利要求34-48中任一项的方法或组合物，其中L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
50.权利要求33-49中任一项的方法或组合物，其中R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。
51.权利要求33-50中任一项的方法或组合物，其中R5的各具体值是氧代。
52.权利要求33-51中任一项的方法或组合物，其中R1的各具体值是H。
53.权利要求33-52中任一项的方法或组合物，其中R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
54.权利要求33-53中任一项的方法或组合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
55.权利要求33-54中任一项的方法或组合物，其中R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
56.权利要求55的方法或组合物，其中Rc是OL'。
57.权利要求33-56中任一项的方法或组合物，其中L'是与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
58.权利要求33-57中任一项的方法或组合物，其中L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分或其组合。
59.权利要求33-58中任一项的方法或组合物，其中L'具有下述结构：
Figure FDA0002747142940000111
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
60.权利要求33-59中任一项的方法或组合物，其中R2或R3具有下述结构之一：
Figure FDA0002747142940000112
Figure FDA0002747142940000121
61.权利要求33-60中任一项的方法或组合物，其中R2或R3具有下述结构：
Figure FDA0002747142940000122
62.权利要求33-61中任一项的方法或组合物，其中Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。
63.权利要求33-62中任一项的方法或组合物，其中Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。
64.权利要求63的方法或组合物，其中活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或多氟苯基酯。
65.权利要求63的方法或组合物，其中叠氮化物是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
66.权利要求33-65中任一项的方法或组合物，其中Q是选自表1的部分。
67.权利要求33-66中任一项的方法或组合物，其中m的各具体值独立地是1至10的整数。
68.权利要求33-67中任一项的方法或组合物，其中m的各具体值独立地是1至5的整数。
69.权利要求33-68中任一项的方法或组合物，其中n是1至100的整数。
70.权利要求33-69中任一项的方法或组合物，其中n是1至10的整数。
71.权利要求33-70中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合的部分。
72.权利要求33-71中任一项的方法或组合物，其中M是着色的。
73.权利要求33-71中任一项的方法或组合物，其中M是荧光的。
74.权利要求33-73中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地包含稠合多环芳基部分，其包含至少四个稠环。
75.权利要求33-74中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地是二甲基氨基茋，喹吖啶酮，氟苯基-二甲基-BODIPY，his-氟苯基-BODIPY，吖啶，骈三萘，联六苯，卟啉，苯并芘，(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，(二-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，四联苯，联-苯并噻唑，三联-苯并噻唑，联萘，联蒽，方酸，方酸鎓，9,10-乙炔基蒽或三联-萘部分。
76.权利要求33-75中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地是对-三联苯，苝，偶氮苯，吩嗪，菲咯啉，吖啶，噻吨，
Figure FDA0002747142940000141
红荧烯，蒄，菁蓝，苝酰亚胺，或苝酰胺或其衍生物。
77.权利要求33-76中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地是香豆素染料，试卤灵染料，二吡咯甲烯硼二氟化物染料，钌联吡啶染料，能量转移染料，噻唑橙染料，聚甲炔染料或N-芳基-1,8-邻萘二甲酰亚胺染料。
78.权利要求33-77中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地是芘，苝，苝一酰亚胺或6-FAM或其衍生物。
79.权利要求33-78中任一项的方法或组合物，其中M的各具体值独立地具有下述结构之一：
Figure FDA0002747142940000151
80.权利要求33-79中任一项的方法或组合物，其中聚合物染料具有选自表2的结构。
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