KR101041446B1

KR101041446B1 - 공액고분자 2단계 ｆｒｅｔ 시스템 및 바이오센서

Info

Publication number: KR101041446B1
Application number: KR1020080070539A
Authority: KR
Inventors: 우한영; 진영읍; 서홍석
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2008-07-21
Filing date: 2008-07-21
Publication date: 2011-06-14
Also published as: KR20100009760A

Abstract

본 발명은 공액고분자 2단계 FRET 바이오센서 및 이를 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양이온성 공액고분자 및 음이온성 공액고분자의 정전기착체를 형광공여체로 하는 2 단계의 FRET 바이오센서 및 이를 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 FRET 바이오센서 있어서, 상기 양이온성 공액고분자(CCP) 및 음이온성 공액고분자(ACP)의 정전기착체 CCP/ACP는 전체적으로 양전하를 띠고, 상기 공액고분자를 여기시키면, 상기 정전기착체를 형성하고 있는 ACP는 제 1 형광공여체로서 제 1 형광 수용체인 CCP로 1단계 FRET이 이루어지고, 상기 CCP는 다시 제 2 형광공여체로서, 최종 형광 수용체인 상기 핵산과 결합한 형광분자 (-C*)로 2단계 FRET이 이루어진다. 또한, 본 발명의 FRET 바이오센서는 상기 정전기착체를 형성하는 CCP/ACP의 혼합비에 의하여, 상기 정전기착체의 총전하 및 상기 형광 수용체 주변의 정전기착체의 밀도를 조절함으로써, 안테나효과를 극대화할 수 있도록 한 것이다.

따라서 본 발명의 FRET 바이오센서는 공액고분자 기반의 FRET DNA 검출 분석에서 보다 향상된 안테나효과와 민감도를 얻을 수 있다.

바이오센서, two-step FRET, DNA 분석. 응집, 공액고분자 전해질

Description

공액고분자 2단계 ＦＲＥＴ 시스템 및 바이오센서{Conjugated Polymer-based Two-Step FRET System and Biosensor thereof}

본 발명은 공액고분자 2단계 FRET 바이오센서 및 이를 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양이온성 및 음이온성 공액고분자의 정전기착체를 형광공여체로 하는 2 단계의 FRET 바이오센서 및 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

최근 공액고분자 구조를 이용하여 공액 구조에서 기인한 반도체적 특성과 형광 특성 혹은 전기화학적 성질을 활용하고 분자구조에 이온 그룹을 도입하여 물에 녹는 특성을 결합함으로써 특정 염기서열을 갖는 DNA 검출, 단백질 검출, 효소 활성 조사, 생리활성 물질 검출 등 바이오센서나 유전자 전달, 바이오이메징 등에 활용하고자 하는 첨단 고부가 연구가 세계적으로 점차 확대되고 있다.

여러 가지 DNA 염기서열 분석법 중에서도 공액고분자의 형광 특성을 이용한 분석법은 고분자에 의한 신호 증폭과 형광 현상의 빠른 응답성에 의해 높은 감도의 실시간 분석을 가능하게 하고 분석과정이 간편하므로 점차로 주목을 받고 있는 현 실이다. 이를 위해서 공액고분자는 친수성인 DNA에 대한 높은 친화력을 가지고 있어야 하는데, 공액고분자는 소수성 주쇄로 인해 본질적으로 물에 녹지 않는 특성을 가지므로 극성을 증가시키기 위해 주쇄에 알킬 체인을 달고 그 끝을 이온화하는 방법이 이용되고 있다. 1987년 UCLA의 Fred Wudl 교수에 의해 수용성 폴리티오펜 (polythiophene)이 보고된 이후로 다양한 양이온성 및 음이온성 수용성 공액고분자 구조가 발표되었다.

특히, 고분자에서 발색단으로의 FRET (Fluorescence resonance energy transfer)을 이용한 검출방법은 고분자의 안테나 효과에 의해 발색단의 형광 신호가 증폭되어 DNA 검출감도를 증대시킬 수 있는 장점을 갖고 있다. 미국 캘리포니아 산타바바라 대학의 Bazan 교수는 수용성 형광 공액고분자와 발색단을 레이블한 단일가닥 PNA를 이용하여 특정 염기서열의 DNA를 검출하는 센싱 메커니즘을 고안하였다.((a) Gaylord, B. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 10954. (b) Gaylord, B. S. et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 896. (c) US patent 7,144,950, 2006) 특정 target DNA에 상보적인 PNA에 발색단을 레이블하고(PNA-C*), 분석하고자 하는 DNA와 PNA-C*의 hybridization을 유도한 후 양전하 공액고분자를 첨가한다. 샘플 DNA가 PNA-C*에 상보적일 경우 hybridization에 의해 duplex(음전하)가 형성되고 여기에 양이온 공액고분자가 첨가되면 정전기적 인력에 의해 양전하 공액고분자와 음전하의 DNA/PNA-C* duplex 사이에 정전기착물이 형성된다. 따라서 발색단과 고분자가 FRET이 발생할 수 있을 정도로 가까워져서 고분자를 여기시 FRET에 의한 발색단의 형광을 볼 수 있다. DNA가 PNA-C*에 상보적이지 않을 경우 DNA만이 양전하 공액고분자에 근접하게 되어 발색단과 고분자 간 거리가 좁혀지지 않아 고분자를 여기시킬 경우 FRET이 일어날 수 없고, 결과적으로 발색단의 형광이 발현되지 않는다. 따라서 FRET에 의해 유도된 형광의 유무로부터 특정 염기서열을 갖는 DNA의 존재여부를 실시간으로 빠르게 검출할 수 있다.

이 검출방법의 장점은 무엇보다도 고분자의 안테나 효과에 의해 발색단의 형광 신호를 증대시킬 수 있다는 데에 있다. 수용성 형광 고분자의 FRET 바이오센서의 경우 고분자의 안테나 효과를 활용해 기존 형광센서에 비해 감도를 25 내지 80배까지 증대시킬 수 있는 가능성이 보고된 바 있으며, 몇 가지 문제를 해결하면 매우 효율적인 실시간 고감도의 센서 구현이 가능하리라 예상되고 있다.

한편 이온성 공액고분자 (Conjugated Polyelectrolytes, CPs)와 음전하를 띠는 DNA 사이의 정전기적 상호작용은 효율적인 FRET이 일어나도록 정전기적 복합체를 형성하도록 유도하고, 안테나 효과 및 광학적 증폭은 수용체 주변의 포스터 거리(FRET 효율이 초기값 대비 50%로 감소했을 때 공여체-수용체 거리) 내에 있는 공여체 분자의 수에 의하여 제한된다 (T. N. Grossmann, L. Rㆆglin, O. Seitz, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5223.). DNA의 음전하가 CPs의 양전하에 의하여 상쇄된 후에는, 더 이상의 정전기적 인력이나 CPs와 DNA가 근접할 수 있는 추진력이 없게 된다. 따라서 1:1 의 전하비에서, 수용체 근처의 공여체 광학적 단위의 최대 농도는 FRET-유도 신호증폭의 수준을 결정할 수 있고 (J. A. Riddle, X. Jiang, J. Huffman, D. Lee, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 7019.), 또한 이러한 FRET- 유도 신호증폭은 공여체-수용체(D-A) 거리, 스펙트럼 겹침, 쌍극자 오리엔테이션 등과 같은 다른 요소에 의하여 영향을 받을 수 있다. 즉, 정전기적 응집 구조, D-A 거리, PCT (photo-induced charge transfer)에 의한 형광감쇄 (quenching)의 최소화, 보다 향상된 민감도와 선택도 등은 FRET-기반 공액고분자 바이오센서를 최적화하기 위하여 효과적으로 제어되어야 한다. (H. Y. Woo, D. Vak, D. Korystov, A. Mikhailovsky, G. C. Bazan, D.-Y. Kim, Adv. Funct. Mater. 2007, 17, 290.)

이에, 본 발명자들은 수용성 공액고분자전해질, 즉 양이온성 공액고분자 및 음이온성 공액고분자를 합성하고 고분자를 여기시켜 FRET을 유도하였고, 2단계 FRET 프로세스에 의하여 양이온성 공액고분자 및 음이온성 공액고분자의 정전기적 복합체가 효과적인 형광공여체로서 작동함을 검증하였다. 이로써 양이온성 / 음이온성 공액고분자 복합체에서 혼합비를 변화시킴으로써 총 양(+)전하량을 조절하고, 최적화된 신호 증폭을 위한 수용체 근처의 공여체 농도를 제어할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 공액고분자 2단계 FRET 시스템 및 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양이온성 및 음이온성 공액고분자의 정전기착체를 형광공여체로 하는 2 단계의 FRET 시스템 및 이를 이용한 바이오센서를 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,

본 발명에서는 a-PFP (음이온성 폴리(9,9-비스(4'-술포네이토부틸)플루오렌-코-알트-1,4-페닐렌) 다이소디움 솔트)와, c-PFB₁₅ (양이온성 폴리(9,9-비스(6'-N,N,N,-트리메틸암모늄)헥실)플루오렌-코-2,1,3-벤조티아디아졸) 다이브로마이드(85:15))사이의 수용성 공액고분자 정전기적 복합체가, Texas Red (TR)로 표지된 단일 가닥 DNA (ssDNA-TR)로의 2단계 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 프로세스에 있어서, 효과적인 FRET 공여체로서 작동함을 검증하였다.

따라서 본 발명에서는 고분자 정전기적 복합체, a-PFP/c-PFB₁₅ 와 ssDNA-TR과의 복합체는 2단계 FRET 과정을 통하여 최종적으로 TR로 형광 공명 에너지 전달을 유도함을 확인하였다.

또한, 수용액 내의 a-PFP와 c-PFB₁₅의 정전기적 복합체는 고분자 사슬의 응집, 고분자 사슬간 거리의 감소에 의해 벤조티아디아졸(BT) 분절로의 에너지 전달을 유도하였음을 확인하였다. 따라서 본 발명에서는 상기 양이온성/음이온성 공액고분자 복합체에서 전하비의 조정 및 형광 수용체 주변의 결합 공액고분자의 밀도 조절을 통한 FRET-유도 신호의 증폭을 확인하였으며, 이러한 원리에 의하여 결과적으로 공액고분자-기반 FRET DNA 검출 분석에서 보다 향상된 안테나효과와 민감도를 얻을 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 제 1 견지에 의하면, 본 발명은 공액고분자를 형광 공여체로 하고, 핵산과 결합한 형광분자 (-C*)를 형광 수용체로 포함하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 바이오센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 있어서,

상기 공액고분자는, 양이온성 공액고분자(Cationic Conjugated Polyelectrolytes, CCP)와 음이온성 공액고분자(Anionic Conjugated Polyelectrolytes, ACP)간에 전체적으로 양전하를 띠는 정전기착체 CCP/ACP를 형성하고 있는 것으로서,

상기 정전기착체 CCP/ACP 는 제 1 형광공여체로서 ACP에서 제 1 형광 수용체로서 CCP로 1단계 FRET이 이루어지고, 상기 CCP는 다시 제 2 형광공여체로서, 최종 형광 수용체인 상기 핵산과 결합한 형광분자 (-C*)로 2단계 FRET이 이루어지며,

상기 정전기착체를 형성하는 CCP/ACP의 혼합비에 의하여, 상기 정전기착체의 총 양(+)전하 및 상기 형광 수용체 주변의 고분자 정전기착체의 밀도를 조절함을 특징으로 하는 FRET 바이오센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 핵산은 단일가닥 DNA (ssDNA)인 것을 특징으로 한다.

FRET 바이오센서에 있어서, FRET 형광수용체의 주위 (포스터 거리 안)에 형광공여체 분자인 공액고분자가 많이 존재해야 효과적으로 빛을 흡수하고 전달하는 안테나 효과를 증대시킬 수 있고 안테나 효과를 제어하기 위해서는 수용체 주위의 공여체 농도를 제어하여야 한다. 따라서 본 발명의 FRET 바이오센서는 양이온성 공액고분자(CCP)와 음이온성 공액고분자(ACP)를 사용하여 양이온성 공액고분자 및 음이온성 공액고분자 간의 정전기 착체 CCP/ACP를 먼저 형성하도록 하고, 이 때 CCP를 ACP에 비해 과량 넣어주어 항상 총 전하가 양 (+) 전하를 띠게 하면서, CCP와 ACP의 혼합에 있어 혼합비를 달리함으로써 총 유효전하를 조절하고, 이를 통하여 결국 수용체 주변의 공여체인 고분자 농도를 증가 또는 조절할 수 있도록 한 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 FRET 바이오센서는 상기 정전기착체 형성시 CCP와 ACP의 혼합농도비를 조절함으로써, 수용체 주변의 고분자(공여체) 농도를 쉽게 조절하여 최종 안테나 효과를 제어하고 최적화할 수 있도록 한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명의 FRET 바이오센서는 상기 정전기착체를 형광 공여체로 하고 있으며, 에너지를 여기시켰을 때 결과적으로 형광신호는 두 단계의 FRET을 거쳐 형광 신호를 전달하게 됨을 특징으로 한다. 즉, 정전기적 인력에 의하여 복합체를 형성하고 있는 상기 정전기착체 내에서, 음이온성 공액고분자로부터 양이온성 공액고분자로 일차적으로 FRET에 의하여 유도된 형광신호를 전달 및 증폭하고, 양이온 공액고분자는 다시 형광 공여체로서 FRET에 의하여 최종 수용체인 핵산에 결합된 형광분자에 형광신호를 전달 및 증폭하게 된다.

또한, 본 발명의 FRET 바이오센서에 사용되는 형광분자는 신호 발색군(signaling chromophore)으로서, 공액고분자로부터 에너지를 흡수할 수 있고, 광을 방출할 수 있는 물질을 포함한다. 전형적인 형광분자로는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질을 포함한다.

형광 염료의 예로는, 플루오레신, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(상표명), Cy3(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어(상표명) 430, 알렉사 플로어(상표명) 488, 알렉사 플로어(상표명) 532, 알렉사 플로어(상표명) 546, 알렉사 플로어(상표명) 568, 알렉사 플로어(상표명) 594, 알렉사 플로어(상표명) 633, 알렉사 플로어(상표명) 647, 알렉사 플로어(상표명) 660, 알렉사 플로어(상표명) 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피(상표명) FL-Br 2 , 보디피(상표명) 530/550, 보디피(상표명) 558/568, 보디피(상표명) 564/570, 보디피(상표명) 576/589, 보디피(상표명) 581/591, 보디피(상표명) 630/650, 보디피(상표명) 650/665, 보디피(상표명) R6G, 보디피(상표명) TMR, 보디피(상표명) TR, 이의 콘쥬게이트화물, 이들의 배합물을 포함한다. 란탄화물 킬레이트의 예로는 유로피윰(europium) 킬레이트, 테르비 윰(terbium) 킬레이트 및 사마리윰(samarium) 킬레이트를 포함한다.

또한, 본 발명의 FRET 바이오센서에 있어서 상기 정전기착체를 형성하는 양이온 공액고분자는 암모늄이온 (-N⁺R₃ , R = H, 알킬 또는 아릴 그룹), 포스핀이온 (-P⁺R₃ , R = H, 알킬 또는 아릴 그룹), 옥소늄 이온 (-O⁺R₂), 설포늄 이온 (-S⁺R₂) 또는 그 유도체를 곁사슬 치환기로 갖는 공액고분자 중에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 정전기착체를 형성하는 음이온 공액고분자는 카복실레이트(-CO₂ ^-), 카보네이트 (-OCO₂ ^-), 포스페이트 (-PO₄ ^-), 포스포네이트 (-PO₃ ^2-), 포스파이트 (-OPO₂ ^2-), 술포네이트 (-SO₃ ^-), 술페이트(-SO₄ ^-) 또는 그 유도체를 곁사슬 치환기로 갖는 공액고분자 중에서 선택될 수 있다.

상기 양이온성 공액고분자 또는 음이온성 공액고분자는, 주사슬로서 폴리플루오렌, 폴리페닐렌비닐렌, 폴리티오펜, 폴리페닐렌, 폴리아쥴렌, 폴리퓨란, 폴리싸이에닐렌비닐렌 또는 폴리피롤를 가질 수 있으며, 또한 상기 공액고분자는 상기 주사슬구조를 포함하는 공중합물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 과정에 있어서, a-PFP (음이온성 폴리(9,9-비스(4'-술포네이토부틸)플루오렌-코-알트-1,4-페닐렌) 다이소디움 솔트)와 c-PFB₁₅ (양이온성 폴리(9,9-비스(6'-N,N,N,-트리메틸암모늄) 헥실)플루오렌-코-2,1,3-벤조티아디아졸) 다이브로마이드(85:15))사이의 정전기적 복합체가 형광공여체로서, Texas Red로 표지된 단일 가닥 DNA로 형광에너지를 전달함을 확인하였다.

또한, 수용액 내의 a-PFP와 c-PFB₁₅의 정전기적 복합체는 고분자 사슬의 응집, 고분자 사슬 간 거리의 감소에 의해 벤조티아디아졸(BT) 분절로의 에너지 전달을 유도하였다.

도 1은 양이온성 및 음이온성 공액고분자의 정전기 복합체를 사용하여 ssDNA-TR로의 2단계 FRET 과정을 도식적으로 나타낸다. 이러한 검출 방법은 양이온성/음이온성 공액고분자 복합체에서 전하비의 조정 및 수용체 주변의 결합 공액고분자의 밀도 조절을 통한 FRET-유도 신호의 증폭을 보여준다.

이러한 원리에 의하여 결과적으로 공액고분자-기반 FRET DNA 검출 분석에서 보다 향상된 안테나효과와 민감도를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 제 2 견지에 의하면,

본 발명은 형광수용체로서 타겟 DNA에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 PNA에 결합된 형광분자 (-C*) 및 형광공여체로서 전체적으로 양전하를 띠는 정전기착체 CCP/ACP를 포함하고, 상기 정전기착체를 형성하는 CCP/ACP의 혼합비에 의하여, 상기 정전기착체의 총전하 및 상기 형광 수용체 주변의 정전기착체의 밀도를 조절함으로써, 고분자의 안테나 효과를 극대화함으로써 FRET 신호 증대와 센서 민감도를 향상시키는 것을 특징으로 하는, 타겟 DNA를 실시간으로 검출 하는 공액고분자 FRET 바이오센서를 제공한다.

다수의 광학 유닛의 결합체인 공액고분자의 안테나 효과를 활용한 형광 바이오센서는 기존의 형광센서에 비해 에너지 전달을 효과적으로 제어하면 검출 한도를 25~80 배 정도 증대시킬 수 있다고 보고되었으며 특정 염기서열의 DNA 존재 유무를 높은 감도로 실시간으로 분석할 수 있다.

따라서, FRET 수용체인 PNA-C* 또는 DNA-C*의 주위에 (포스터 거리 안에) FRET 공여체 분자인 공액고분자가 많이 존재해야 효과적으로 빛을 흡수하고 전달하는 안테나 효과를 증대시킬 수 있다. 이론적으로는 표적 DNA/PNA-C* 의 duplex의 (-)전하와 CCP의 (+) 전하가 1:1로 전하균형이 이루어진 후에는 수용체 주위에 CCP가 다가갈 수 있는 추진력이 사라지게 되고 그 이후에 CCP를 더 첨가해도 안테나 효과는 포화되고 증가하지 않으나, 이러한 정전기 인력 이외에 CCP와 duplex 사이에 소수성 상호작용과 같은 상호작용도 존재하기 때문에 실제 포화는 (+):(-) = 1:1이 아니라 3:1 정도에서 보통 관찰된다.

본 발명의 FRET 바이오센서에 있어서, FRET 수용체인 -C* 주위에 고분자의 농도를 높일 수 있어야 안테나 효과를 극대화할 수 있고 안테나 효과를 제어하기 위해서는 FRET 수용체인 -C* 주위에 FRET 공여체의 농도를 제어할 수 있어야 하는데, 본 발명은 상기에서 설명한 바와 같이 CCP와 ACP의 정전기착체를 FRET 공여체로 이용하면서, 상기 정전기착체의 형성시 CCP와 ACP의 혼합비를 조절하여 정전기착체의 총 유효전하(+)를 조절하고, 결국, DNA-C*의 (-) 전하와 총 (+) 전하가 전하균형이 달성될 때까지 수용체 주위에 공여체인 고분자 농도를 증가시키거나 농도 를 조절하여 최종 안테나 효과를 제어하고 최적화하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 공액고분자 기반 DNA 분석에서 검출 민감도를 향상시킬 수 있는 공액고분자 FRET 바이오센서 및 이를 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 양이온성 공액고분자와 음이온성 공액고분자의 독특한 구조적, 광학적 성질은 2단계 FRET 과정을 통하여 형광 에너지를 전달하고, 양이온- 및 음이온성 고분자의 비를 변화시켜 쉽게 총 유효전하를 조절할 수 있어, 균일상 및 고체상 DNA 분석법에서 형광 수용체 주변에 결합하는 FRET 공여체 고분자의 수 밀도를 제어할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 자세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재료 및 방법

모든 화학물질은 Aldrich Co.에서 구입하여 사용되었다. ¹H- and ¹³C-NMR 스펙트럼은 Varian Unity 400 MHz (또는 200 MHz) 스펙트로미터로 측정되었다. UV/vis 흡수 스펙트럼은 Shimadzu UV-2401 PC 다이오드 분석 스펙트로미터로 기록되었다. 광발광 스펙트럼은 Xenon lamp excitation source 을 갖는 PTI Quantum Master 플루오로미터(형광광도측정기)로 측정되었다. 수용액 내 pH=11일 때 플루오레신을 기준하여 형광 양자 수득율을 측정하였다. PL(photoluminescence) 수명의 측정은 time-correlated single-photon counting technique (TCSPC)를 사용하여 수행되었다 (D. V. O'Connor, D. Phillips, Time Correlated Single Photon Counting; Academic Press, London, U. K., 1984.). 광원으로 100 fs 의 펄스폭을 갖는 레이저 펄스를 사용하였다. 이 때 레이저 펄스는 mode-locked Ti:sapphire laser (Spectrophysics Tsunami)의 출력으로부터 second harmonic generation process를 통하여 생산되었다. 올리고뉴클레오타이드 (ssDNA-TR: 5'-TR-ATC TTG ACT ATG TGG GTG CT, 20-염기 올리고뉴클레오타이드)는 Genscript Corp.에서 구입하였고, DNA 농축용액의 농도는 200 ㎕ 석영 큐벳 내, 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다.

<실시예 2> 공액고분자의 합성

도 2는 이온성 공액고분자전해질(a-PFP, c-PFP, c-PFB₁₅및 TR)의 분자구조를 나타낸 것이다. 양이온성 및 음이온성 공액고분자는 이전에 보고된 절차를 수정하여 합성하였다 ( a) B. Liu, G. C. Bazan, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1942 b) R. Q. Yang, A. Garcia, D. Korystov, A. Mikhailovsky, G. C. Bazan, T. Q. Nguyen, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16532 c) F. Huang, X. Wang,D. Wang, W. Yang, Y. Cao, Polymer 2005, 46, 12010.).

2-1 음이온성 공액고분자 전해질 합성

도 3은 Huang 등에 의하여 보고된 절차에 따라 음이온성 고분자인 a-PFP를 합성하는 방법을 나타낸 것이다. 음이온성 고분자의 합성에 있어서, 모노머인 2,7-dibromo-9,9-bis(4-sulfonatobutyl)-fluorene disodium salt는 60℃, DMSO에서 NaOH를 이용하여 4-butane sulfone 과 2,7-dibromofluorene의 알킬레이션 반응에 의하여 준비되었다. 순수 화합물은 62.5% 수율로 acetone/H₂O로부터 두 번 재결정화에 의하여 정제되었다.

또한, a-PFP의 합성은 물과 DMF의 혼합물에서 2,7-dibromo-9,9-bis(4ㅄ-sulfonatobutyl)-fluorene disodium salt와 1,4-phenylenebisboronic acid를 Pd(OAc)₂ 및 sodium carbonate를 사용하여 Suzuki 공고분자화(copolymerization) 방법을 이용하여 제조하였다 (수득률:65%). 최종 반응 혼합물은 아세톤으로 침전되고, 침전된 고분자는 투석에 의하여 정제되었다. 물에서 여분의 소디움 솔트(NaOH 및 NaCl)를 제거하기 위하여. 최종 생성물은 탈염수에서 재용해되었고, 최종 산물을 얻기 위해 3일 동안 10,000 g/mol 이하 분자량을 제거할 수 있는 막을 사용한 투석에 의하여 추가로 정제되었다. 크기 배제 크로마토그래피와 결합한 멀티-앵글 레이저 광 산란 분석 (Multi-angle laser light scattering combined with size exclusion chromatography; MALLS-SEC) 에 의하여 평균분자량 M_n=103,000 과 PDI=2.1을 측정하였다.

2-2 양이온성 공액고분자 전해질 합성.

도 4는 일련의 반응에 의하여 양이온성 고분자인 c-PFB₁₅를 수득하는 과정을 나타낸 것이다. 물과 1,6-dibromohexane의 2상 혼합물에서 NaOH를 사용하여 2,7-dibromofluorene의 알킬레이션 반응을 수행하여 모노머 1을 합성한 후, n-butyl lithium과 2-isopropoxy-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane을 사용하여 2,7-bis[9,9-bis(6-bromohexyl)fluorenyl]-4,4,5,5-tetramethyl-[1.3.2]dioxaborolane (모노머 2)을 제조하였다. 모노머 1(227 mg 0.35 mmol), 2 (372 mg, 0.5 mmol), 4,7-dibromo-2,1,3-benzothiadiazole (44.1 mg, 0.15 mmol), Pd(PPh₃)₄ (10 mg), 및 포타슘 카보네이트 (1660 mg, 12 mmol)를 80 ℃에서 20 시간동안 물(6 ml) 과 톨루엔 (12 ml)에서 스즈키 중합법에 의하여 c-PFB₁₅을 합성하였다. 고분자를 여과하고 메탄올과 아세톤으로 세척하고난 후, c-PFB₁₅를 얻기위하여 24시간동안 진공상태에서 건조시켰다. 액화 트리메틸아민 (4ml)를 -78 ℃의 THF에서 중성 전구체 고분자 용액에 한 방울씩 첨가하고 혼합물이 실내온도에 이를 때까지 둔 후 12시간 동안 반응하였다. 침전물을 물을 첨가하여 재용해하고 다시 동일한 방법으로 트리메틸아민을 가하고 24시간동안 상온에서 저어주었다. 용매를 진공회전농축법으로 제거한 후, 반응 혼합물을 아세톤으로 세척하고, 탈염수로 재 용해하고, 3일동안 투석(Mw 10,000 cut-off)에 의하여 정제하였다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 측정은 tetrahydrofuran (THF)에서 폴리스티렌 표준을 기준하여, 중성 전구체 고분자 (M _n=22,500 및 PDI=1.8)에 대하여 수행하였다.

<실시예 3> 분광분석

3-1 a-PFP 및 c-PFP의 분광분석

표 1은 물 속에서 흡광도 및 광발광 (PL) 분광분석 데이터를 요약한 것이다. a-PFP에 대한 흡수 (λ_abs) 및 PL (λ_PL) 스펙트럼에서 최대값은 365 nm 및 406 nm에서 관찰되었다. c-PFP는 386 nm에서 흡광 최대값을 보였으며, 416 nm에서 PL 최대값을 보여, a-PFP의 값과 비교하여 적색 편이를 나타냈다. a-PFP 및 c-PFP의 두 고분자는 거의 동일한 공액 전자적 구조를 가진다. 두 고분자에 대한 λ_abs 및 λ_PL에 있어 미세한 차이는 알킬 치환기 및 극성 용매에서 용해도 차이에 기인할 수 있다. (결과적으로 분자의 conformation 변화 및/또는 멀티크로모포어 응집을 이룬다) a-PFP(90%)의 PL 양자 효율(Φ)은 c-PFP(42%)의 경우보다 높다 ( a) A. Maciejewski, R. P. Steer, J. Photochem . 1986, 35, 59; b) N. C. Greenham, I. D. W. Samuel, G. R. Hayes, R. T. Phillips, Y. A. R. R. Kessener, S. C. Moratti, A. B. Holmes, R. H. Friend, Chem . Phys . Lett . 1995, 241, 89.). 이는 부분적으로 c-PFP보다 수용액에서 a-PFP의 더 높은 용해도와 관련이 있다. 음이온성 a-PFP는 수용액에서 절대적으로 높은 PL 양자효율 때문에, 형광 바이오센서의 검출민감도를 향상시키는데 c-PFP보다 더 큰 이점을 가질 수 있다. 희석 조건 (10^{- 5}~10^-6 M)에서, 양이온성 c-PFB₁₅ 는 λ_abs = 383nm에서 최대 흡수를 보이며 λ_PL = 411nm에서 푸른색 방출을 보여준다. 사실 흡광과 방출은 BT 부분을 포함하지 않는 c-PFP의 그것과 거의 동일하다 (M. S. Stock, B. S. Gaylord, A. J. Heeger, G. C. Bazan, Adv . Mater . 2002, 14, 361.).

분광분석 요약

시료	λ _abs (nm)	λ _PL (nm)	Φ (%) ^a	τ _m (ns)^b
a-PFP	365	406	90	0.71
c-PFP	386	416	42	0.43
c-PFB₁₅	383	411	8	0.60

a: pH=11일 때 플루오레신을 기준으로 측정한 양자수득량.

b: 시간-상관 단일광자카운팅(time-correlated single-photon-counting, TCSPC) 기술(D. V. O'Connor, D. Phillips, Time Correlated Single Photon Counting; Academic Press, London, U. K., 1984.)을 사용한 PL 수명 측정.

<실시예 4> 정전기적 복합체에 의한 응집

4-1 응집에 의한 양자수득량

도 5A는 전형적인 정전기적 복합체에 의한 응집 때문에 a-PFP와 함께 c-PFP의 PL 약화를 보여준다. 반대로 c-PFB₁₅ 및 a-PFP의 혼합물로부터 신호 방출은 다른 경향을 보여준다. 즉, c-PFB₁₅ 용액에 a-PFP를 부가([a-PFP] = 0 M ~ 3 × 10^-7 M)함에 따라, 420nm에서 PL 신호가 감소하고, 570nm에서 방출이 증가하였다 (도 5B). 이는 반대 전하를 띠고 있는 고분자전해질 사이의 정전기적 상호작용에 기초하여( a) I. Gㆆssl, L. Shu, A. D. Schlㆌter, J. P. Rabe, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6860 b) T. K. Bronich, H. K. Nguyen, A. Eisenberg, A. V. Kabanov, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8339.), 수용액에서 a-PFP 와 c-PFB₁₅ 의 정전기적 복합체는 고분자 사슬의 응집, 분자 사슬간 거리의 감소 및 BT 분절로의 에너지 전달을 유도할 수 있음을 의미한다 (a) S.-J. Lim, B.-K. An, S. D. Jung, M.-A. Chung, S. Y. Park, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6346 b) M. U. Pralle, K. Urayama, G. N. Tew, D. Neher, G. Wegner, S. I. Stupp, Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 1486.).

동일한 경향은 a-PFP 와 정전기적 복합체 형성 후 c-PFP 와 c-PFB₁₅ 에 대한 시간분해 PL 측정으로부터 관찰되었다.

도6을 참고하면, 측정된 PL 신호는 각각 c-PFP에 대한 수명시간상수 0.43 ns, c-PFB₁₅에 대한 수명시간상수 0.6 ns, a-PFP에 대한 수명시간상수 0.71 ns 를 갖는 단일 지수함수 감소형태를 보여주고 있다. c-PFP 와 a-PFP 의 정전기적 복합체형성은 형광 수명의 실질적인 감소를 유도하였다. c-PFP 와 a-PFP 의 1:1 혼합물의 시간분해 PL 신호(λ_det = 410nm)는 이중지수함수로 감소하는 형태를 보이며 수명시간상수는 0.36 ns (19%)와 40 ps (81%)보다 작은 값을 가지며, 응집으로 인해 심각한 형광약화를 보였다. 그러나 c-PFB₁₅/a-PFP 복합체는 분명하게 다른 경향을 보여주고 있으며, 측정된 PL 신호(λ_det = 579nm)는 2.36 ns (53%), 0.54 ns (47%)의 수명시간상수를 갖는 이중지수함수적으로 감소하였다.

4-2 정전기적 복합체에 의한 2단계 FRET

c-PFB₁₅/a-PFP 복합체에서 플루오렌 단위로부터 BT로의 효율적 에너지 전달은 λ_PL = 570nm에서 형광 방출을 유도하였다. 긴 형광 수명(2.36 ns)은 여기된 BT와 관련이 있고, 이는 a-PFP (0.7 ns) 또는 c-PFB₁₅ (0.6 ns)의 형광수명과는 분명히 다르다. 짧은 수명상수 (0.54 ns)는 응축된 상(condesed phase)에서 응집된 플루오렌 부분과 관련된 여기된 종으로부터 기인할 것이다. 이러한 값은 BT 영역을 갖지 않는 c-PFP/a-PFP 복합체의 형광 수명상수 (0.36 ns)와 비슷하다. 측정된 평균 수명상수는 1.50 ns 이다. 이러한 시간분해 형광 데이터는 정상 상태의 PL측정 결과와 잘 일치한다.

TR의 흡수와 정전기적 복합체 c-PFB₁₅/a-PFP의 형광 스펙트럼 겹침은 [a-PFP]의 농도 증가에 따라 실질적으로 증가되었다 (도 5B). 따라서 포스터 방정식에서 스펙트럼 겹침 적분의 증가 및 c-PFB₁₅/a-PFP로부터 TR-표지된 DNA로의 FRET이 예측된다.

ssDNA-TR과 추가 정전기 복합체화를 위해 c-PFB₁₅/a-PFP 복합체의 총 양전하를 유지하기 위하여 [c-PFB₁₅] = 2 × 10^-5M 와 [a-PFP] = 1 × 10^-5M의 2:1 복합체 (고분자 반복 단위, RU에 기초)원액을 준비하였고, 혼합 용액은 잉여 양전하([(+) net charges] = 2 × 10^-5M)를 갖는 정전기적 복합체인 c-PFB₁₅/a-PFP를 포함하도록 하였다. ssDNA-TR (5′-TR-ATCTTGACTATGTGGGTGCT, 20-염기 올리고뉴클레오티드)과 c-PFB₁₅/a-PFP와의 복합체는 플루오렌 분절에서 BT로 다시 BT에서 TR로 2단계 FRET 프로세스에 의하여 에너지 전달을 유도한다.

<실시예 5> 공액고분자의 안테나 효과

(1) 도 7에서 보여지는 바와 같이, ssDNA-TR 용액 ([ssDNA-TR] = 1× 10^-8M 및 [(-) charge] = 2 × 10^-7 M)으로부터 λ_PL = 617 nm에서 적색 방출은 2:1 c-PFB₁₅/a-PFP 복합체 용액([(+) charge] = 0 ~ 24 10^-8M)을 첨가할 때, 2단계 FRET 프로세스가 효과적으로 일어남을 확인해준다. a-PFP 와 c-PFB₁₅에서 플루오렌-페닐렌 분절로부터 청색 방출은 사라지고, 570 nm 및 617 nm에서 방출은 FRET을 통해 BT로, 다시 BT에서 TR로 FRET이 연속적으로 일어남을 보여준다. TR로부터 FRET-유도 방출은 CPs의 안테나 효과에 의해 [2:1 c-PFB₁₅/a-PFP]의 농도증가에 따라 증대되었다.

(2) 형광 에너지 전달을 위해서는, 포스터 반지름 내에 있는 수용체 근처의 공여체의 농도를 조절하는 것이 중요하다. 이러한 검출원리에서 CPs (FRET 공여체)를 ssDNA-TR(FRET 수용체) 근처로 가져가는 추진력은 정전기적 인력 즉, 상기 정전기적 인력이 CPs 의 양전하가 DNA의 음전하와 균형을 맞추는 것에 의하여 멈추도록 하는 것이다. 최대 안테나 효과는 이론적으로 CPs 와 DNA간의 1:1의 전하비에서 수행될 수 있고, 만일 그들 사이의 소수성 상호작용 같은 다른 상호작용을 무시한다면 용액 내 과잉의 CPs는 수용체로의 먼 거리 때문에 FRET-유도 신호 증폭에 기여하지 못할 것이다. 이러한 응집-유도 FRET 원리는 최적화된 신호 증폭을 위하여 ssDNA-TR 근처 CPs의 수 밀도를 통제하는 매우 간단한 방법을 제공한다. 즉, CPs의 총 양전하 및 TR 근처 c-PFB₁₅/a-PFP 의 최대 농도는 CPs 정전기적 복합체에서 양이온- 및 음이온 고분자의 혼합비를 조정함으로써 쉽게 조절될 수 있다.

도 8에서는 c-PFB₁₅와 a-PFP의 혼합비를 변화시키는 것에 의하여 c-PFB₁₅/a-PFP 복합체에서 총 양전하를 조절함에 의한 FRET-유도 TR 방출의 신호 증폭을 보여준다. 이러한 응집-매개 2단계 FRET 원리는 또한, 염료 표지된/표지되지 않은 CPs에 기초한 고체상 FRET DNA 분석에서도 사용될 수 있다 (B. Liu, G. C. Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 589.). 안테나 효과 및 신호증폭을 최적화함으로써, 고체상 분석의 검출 민감도는 본 발명의 원리를 사용하여 향상될 수 있다.

본 발명은 바람직한 실시형태를 참고하여 보다 자세하게 설명되었지만, 당업에 통상의 지식을 가진 자에게 본 명세서의 기술의 도움으로 본 발명의 범주나 정신에서 벗어나지 않는 범위 내에서의 어떤 변화 및 변형이 가능할 수 있음은 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.

본 발명의 FRET을 이용하는 바이오센서는 안테나 효과 및 광 수확 특성을 향상시키는 것에 의하여 검출민감도를 향상시켜, 특정 염기서열의 DNA 존재 유무를 높은 감도로 실시간으로 분석할 수 있는 장점이 있고 이와 같은 고분자 기반의 안정적이고 고감도의 바이오센서가 개발될 경우 실제 임상에서 감염진단, 유전자 전달 및 유전자 변형 진단 등을 실시간, 저비용으로 수행할 수 있다.

도 1은 양이온성 및 음이온성 공액고분자의 정전기 복합체를 사용하여 ssDNA-TR로의 2단계 FRET을 유도하는 과정을 도식적으로 나타낸다.

도 2는 이온성 공액고분자전해질(a-PFP, c-PFP, c-PFB₁₅)및 TR의 분자구조를 나타낸 것이다.

도 3은 음이온성 고분자인 a-PFP를 합성하는 방법을 나타낸 것이다.

도 4는 일련의 반응에 의하여 양이온성 고분자인 c-PFB₁₅를 수득하는 과정을 나타낸 것이다.

도 5(A)는 a-PFP(a), c-PFP(b), a-PFP 및 c-PFP 혼합물(c)의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다. (단, (a): [a-PFP] = 1 × 10^-5 M, (b): [c-PFP] = 1 × 10^-5 M, (c): [a-PFP] = [c-PFP] = 5 × 10^-6M). 또한 도 5(B)는 [a-PFP]의 농도를 증가시키면서 측정한 c-PFB₁₅ 의 PL 스펙트럼(λ_ex = 380nm)을 나타낸 것이다. ([c-PFB₁₅] = 2 × 10^-7 M) ([a-PFP] = 0 M ~ 3 × 10^-7 M).

도 6은 λ_ex = 380 nm에서, 시간분해 PL 신호 감소를 측정한 것이다. (a) c-PFB₁₅, (b) a-PFP (c) c-PFB₁₅/a-PFP 의 1:1 복합체.

도 7은 수용액에서 2:1 c-PFB₁₅/a-PFP 복합체를 첨가하면서 ssDNA-TR의 FRET 유도 형광 스펙트럼(λ_ex = 380 nm)을 측정한 것이다. ([+ charge] in c-PFB₁₅/a-PFP = 0 ~ 24 × 10^-8 M, [ssDNA-TR] = 1 × 10^-8 M , [-charge] in ssDNA-TR = 2 × 10^-7 M.)

도 8은 혼합비를 달리한 c-PFB₁₅/a-PFP 복합체를 첨가한 경우, ssDNA-TR로부터 FRET-유도 방출(λ_ex = 380 nm)을 나타낸 것이다. (a) [a-PFP] = 0 M, (b) [a-PFP] = 1 ×10^-7 M, (c) [a-PFP] = 1.5 × 10^-7 M, [c-PFB₁₅] = 3 × 10^-7 M, [ssDNA-TR] = 1× 10^-8 M.

Claims

공액고분자를 형광 공여체로 하고, 핵산과 결합한 형광분자 (-C*)를 형광 수용체로 포함하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 바이오센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법에 있어서,

상기 공액고분자는, 양이온성 공액고분자 (Cationic Conjugated Polyelectrolytes, CCP)와 음이온성 공액고분자 (Anionic Conjugated Polyelectrolytes, ACP)간에 전체적으로 양전하를 띠는 정전기착체 CCP/ACP를 형성하고 있는 것으로서,

상기 정전기착체 CCP/ACP 는 제 1 형광공여체로서 ACP에서 제 1 형광 수용체로서 CCP로 1단계 FRET이 이루어지고, 상기 CCP는 다시 제 2 형광공여체로서, 최종 형광 수용체인 상기 핵산과 결합한 형광분자 (-C*)로 2단계 FRET이 이루어지며,

상기 정전기착체를 형성하는 CCP와 ACP의 혼합비에 의하여, 상기 정전기착체의 총전하 및 상기 형광분자 (-C*) 주변의 상기 정전기착체의 밀도를 조절함을 특징으로 하는 FRET 바이오 센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산은 단일가닥 DNA인 것을 특징으로 하는 FRET 바이오 센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 형광분자는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트, 또는 녹색 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 FRET 바이오 센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 정전기착체를 형성하는 양이온성 공액고분자는 암모늄이온 (-N⁺R₃, R은 H, 알킬 또는 아릴 그룹), 포스핀이온 (-P⁺R₃, R은 H, 알킬 또는 아릴 그룹), 옥소늄 이온 (-O⁺R₂, R은 H, 알킬 또는 아릴 그룹), 설포늄 이온 (-S⁺R₂, R은 H, 알킬 또는 아릴 그룹) 또는 그 유도체를 곁사슬 치환기로 갖는 공액고분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 FRET 바이오 센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 정전기착체를 형성하는 음이온성 공액고분자는 카복실레이트(-CO₂ ^-), 카보네이트 (-OCO₂ ^-), 포스페이트 (-PO₄ ^-), 포스포네이트 (-PO₃ ^2-), 포스파이트 (-OPO₂ ^2-), 술포네이트 (-SO₃ ^-), 술페이트(-SO₄ ^-) 또는 그 유도체를 곁사슬 치환기로 갖는 공액고분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 FRET 바이오 센서를 이용하여 DNA를 검출하는 방법.
형광수용체로서 타겟 DNA에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 PNA에 결합된 형광분자 (-C*) 및 형광공여체로서 전체적으로 양전하를 띠는 정전기착체 CCP/ACP를 포함하고, 상기 정전기착체 CCP/ACP 는 제 1 형광공여체로서 ACP에서 제 1 형광 수용체로서 CCP로 1단계 FRET이 이루어지고, 상기 CCP는 다시 제 2 형광공여체로서, 최종 형광 수용체인 상기 핵산과 결합한 형광분자 (-C*)로 2단계 FRET이 이루어지며, 상기 정전기착체를 형성하는 CCP와 ACP의 혼합비에 의하여, 상기 정전기착체의 총전하 및 상기 형광분자 (-C*) 주변의 상기 정전기착체의 밀도를 조절함을 특징으로 하는, 타겟 DNA를 실시간으로 검출하는 공액고분자 FRET 바이오센서.