KR101312354B1 - 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법 - Google Patents
양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 검출하고자 하는 표적 물질의 존재 여부에 따라 고리 구조의 분자 압타머 비콘이 양이온성 공액 고분자 전해질 형광 공여체와 반응하여 선형 또는 G-4중 나선 구조(G-quadruplex)를 형성하고 이에 따라 나타나는 형광 신호 변화를 측정하여 표적 물질을 검출하는, 검출 한계능을 개선한 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 FRET 시스템을 이용하는 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적물질 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 표적 물질이 존재하는 경우 분자 압타머 비콘이 G-4중 나선 구조를 형성하게 되어 형광 발현이 억제되고, 표적 물질 비 존재시 분자 압타머 비콘이 선형 구조로 변화되어 형광 신호가 증폭되는 것을 이용한 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다.
최근 공액 고분자 전해질 (Conjugated Polyelectrolytes, CPEs)은 공액 구조에서 기인한 반도체적 특성과 형광 특성 혹은 전기 화학적 성질과 분자 구조에 이온 그룹을 도입하여 물에 녹는 특성을 결합함으로써 특정 염기 서열을 갖는 DNA 검출, 단백질 검출, 효소 활성 조사, 생리 활성 물질 검출 등 바이오 센서나 유전자 전달, 바이오 이메징 등에 활용하고자 하는 첨단 고부가 연구가 세계적으로 점차 확대되고 있다.
수용성 공액 고분자 전해질을 이용한 화학 · 바이오센서는 고분자의 형광 세기 변화, 고분자의 색 또는 형광 변화, 고분자에서 다른 형광체로의 fluorescence resonance energy transfer (FRET)에 의한 에너지 전달 현상 등이 주요 메커니즘으로 이용되고 있다. 특히 단분자와 비교했을 때, 공액 고분자 전해질에서는 여러 광학적 활성 단위로부터 형성된 다수의 엑시톤이 π-공액 구조의 주사슬을 통해 이동 · 집적되어 형광 신호가 증대되는 분자선 효과 (molecular wire effect)를 기대할 수 있어 센서의 감도 측면에서 장점으로 작용한다.
칼륨 이온 (K+)은 세포막의 전위차를 유지하는데 관여하며, 세포 예정사 (apoptosis) 및 신경계에서 전기적 신호를 만드는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 생체 내에서 적정 농도를 유지하는 것이 매우 중요하다. 따라서 K+을 효율적으로 검출하기 위한 다양한 센서가 발표되었으나, 보고된 센서의 검출 한계는 수 mM 수준으로 생체 내에서 K+의 농도가 3.50 ~ 5.30mM 인 것을 감안하면 효율적인 검출이 어렵다.
따라서 생체 내에서 중요한 역할을 하는 칼륨 이온을 nM농도 수준까지 검출할 수 있는 효율적인 칼륨 이온 검출을 위한 센서는 아직까지 보고된 바 없어 칼륨 이온 존재 하에서 검출 감도를 향상시킨 이온 검출용 형광 센서가 절실히 필요하다.
또한 Adenosine-5'-triphosphate (ATP)는 생체 내 주요 대사 물질로 생체 내 에너지를 전달 및 저장하는 역할을 하며, 다양한 대사 산물의 전구체이고, DNA의 구성 요소가 되는 등 다양한 역할을 수행한다. ATP는 키나제 효소들의 기질로 세포내 ATP양에 따라 키나제 활성을 조절함으로써 생체 내 세포 사멸, 세포 분열, 생체 내 신호 전달 등 다양한 역할을 수행한다. 기존의 ATP의 양을 측정하는 일반적인 방법은 루시페린(luciferine)과 ATP가 루시페라제(luciferase)에 의해 반응이 진행 시 빛을 방출하게 되는 원리에 기초한다. 이때 방출되는 빛을 정량함으로써 ATP의 양을 측정할 수 있다. 하지만 이러한 방법은 효소를 사용함으로 인해 온도, pH, 염 농도 등 주의 환경에 매우 민감함으로 ATP의 양의 측정에 어려움이 따른다. 초분자 화학을 이용하여 ATP를 인지하고 더 나아가 검출하는 화학센서들이 최근 들어 다양한 연구 집단에 의해 개발되었다. 초기의 ATP의 화학 센서는 정전기적 상호작용, 수소결합 등을 이용하여 ATP 내의 음이온을 감지함으로써 ATP를 검출하는 화학센서들이 개발되었다. 하지만 이러한 센서들은 정전기적 상호 작용을 이용하기 때문에 다른 음이온들이 존재 시 선택성이 매우 낮을 뿐만 아니라 수용액 상에서는 ATP를 검출하는데 어려움이 있었다.
최근 들어 이러한 문제점을 극복하고자 금속-리간드 상호 작용을 이용한 ATP 형광 화학센서들이 개발되었다. 이러한 형태의 ATP 센서는 수용액 상에서 ATP를 검출할 수 있었을 뿐만 아니라 다른 음이온에 대해서도 높은 감도를 보였다. 하지만 상기 센서는 센서 자체의 큰 형광 세기에 의해 낮은 농도의 ATP 검출 시 작은 형광 변화로 인해 어려움이 있었다.
따라서, 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하고 대상물질의 검출에 있어 효과적인 형광 검출 센서에 대하여 연구를 지속한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 양이온성 공액 고분자 전해질 및 표적 물질 특이적 분자 압타머 비콘을 이용하여 형광 발현의 억제 및 증폭을 유도함으로써 검출 한계능이 개선된 표적 물질 검출 방법을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은 형광 수용체가 레이블 된 분자 압타머 비콘이 압타머 특이적 표적 물질 존재 여부에 따라 선형 또는 G-4중 나선 구조(G-quadruplex)를 형성하여 형광 신호가 억제 또는 증폭됨을 이용한 표적 물질 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 표적 물질의 존재 여부에 따라 고리 구조의 분자 압타머 비콘이 양이온성 공액 고분자 전해질 형광 공여체와 소수성 상호작용을 통해 선형 또는 G-4중 나선 구조를 형성하는 단계; FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템을 통해 형광 신호의 변화가 일어나는 단계; 를 갖는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 종래 검출 한계능을 개선하여 분석 시료에서 표적 물질을 높은 선택성과 민감도를 가지고 검출할 수 있다. 보다 구체적인 예로써 종래의 칼륨 이온 검출 센서가 수 mM의 검출 한계를 갖고 있는 것과 비교하여 nM 수준까지의 칼륨 이온의 검출이 가능하며 ATP의 경우 약 20μM 수준까지 검출이 가능하게 된다.
도 1은 분자 압타머 비콘(MAB)을 이용한 칼륨 이온 검출용 형광 센서를 도시한다.
도 2는 수용성 공액 고분자 전해질 합성을 위한 모노머 합성단계를 도시한다.
도 3은 도 2의 모노머를 이용하여 양이온성 공액 고분자 전해질을 합성하는 단계를 도시한다.
도 4는 양이온성 공액 고분자 전해질 (MP2~MP6)의 흡수 및 형광 스펙트럼을 나타낸다 ((A)유기 용매 (메탄올 혹은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)), (B) phosphate buffer solution (PBS)용매)
도 5는 PBS 용매에서의 양이온성 공액 고분자 전해질의 몰흡광계수 (α) (A) 및 형광효율 (ΦPL) (B)을 나타낸다.
도 6은 분자 비콘 (Molecular Beacon) MB1, MB2, MB3의 형태 및 염기 서열을 나타낸다.
도 7은 분자 비콘 MB1, MB2, MB3, MB4의 형광 스펙트럼을 나타낸다. (여기 파장 λex = 490nm)
도 8은 분자 비콘 MB1에 양이온성 공액 고분자 전해질이 첨가되었을 때의 형광 스펙트럼을 나타낸다. (MP2 (A), MP3 (B), MP4 (C), MP5 (D), MP6 (E) [MB1] = 2.0 × 10-8 M, [MPs] = 0 ~ 1.5 × 10-7 M, 여기파장 λex = 490nm)
도 9는 양이온성 공액 고분자 전해질에 의한 MB1의 형광증대 비율 (I/I0)을 나타낸다. (I0 = 공액 고분자 전해질 첨가 전 초기 분자 비콘의 형광 세기, I = 공액 고분자 전해질 존재 시 분자 비콘의 형광 세기) ([MB1] = 2.0 × 10-8 M and [MPs] = 1.5 × 10-7 M, 여기 파장 λex = 490nm)
도 10은 MB2 (사각형), MB3 (원)의 양이온성 공액 고분자 전해질에 의한 형광증대 비율 (I/I0)을 나타낸다. ([MB2] = [MB3] = 2.0 × 10-8 M and [MPs] = 1.5 × 10-7 M, 여기 파장 λex = 490nm)
도 11은 각각 칼륨 이온이 존재하지 않을 경우에 MP2, MP4, MP6에 의한 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 신호 세기를 도시한다. (IFRET : 공액 고분자 전해질 첨가에 따른 분자 비콘의 FRET 유도 형광 신호 세기) ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = [MP4] = [MP6] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M, Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM, 여기 파장 λex = 380nm))
도 12는 각각 칼륨 이온 존재 시 MP2, MP4, MP6에 의한 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 신호 세기를 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M , [MP2] = [MP4] = [MP6] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M, Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM, [KCl] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 13은 다양한 금속 이온에 대한 칼륨 이온 검출용 MAB 센서의 선택성에 관하여 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M, Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [금속이온] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 14는 칼륨 이온의 농도 (0 ~ 100nM) 에 따른 FRET 유도 형광 신호 세기 (IFRET/I0)를 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M. Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), 여기 파장 λex = 380nm.)
도 15는 칼륨 이온이 존재하지 않을 경우 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M , [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), 여기 파장 λex = 380nm)
도 16은 칼륨 이온이 존재할 경우의 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼을 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M and [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [KCl] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 17은 ATP가 존재하지 않을 경우 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼을 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), 여기 파장 λex = 380nm)
도 18은 ATP가 존재할 경우의 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼을 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [ATP] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 19는 유사종에 대한 ATP 검출용 MAB 센서의 선택성에 관하여 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M, Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM) [UTP] = [GTP] = [CTP] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 20은 ATP의 농도 (20 ~ 100μM)에 따른 FRET 유도 형광 신호 세기를 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M, Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [ATP] = 20 ~ 100μM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 2는 수용성 공액 고분자 전해질 합성을 위한 모노머 합성단계를 도시한다.
도 3은 도 2의 모노머를 이용하여 양이온성 공액 고분자 전해질을 합성하는 단계를 도시한다.
도 4는 양이온성 공액 고분자 전해질 (MP2~MP6)의 흡수 및 형광 스펙트럼을 나타낸다 ((A)유기 용매 (메탄올 혹은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)), (B) phosphate buffer solution (PBS)용매)
도 5는 PBS 용매에서의 양이온성 공액 고분자 전해질의 몰흡광계수 (α) (A) 및 형광효율 (ΦPL) (B)을 나타낸다.
도 6은 분자 비콘 (Molecular Beacon) MB1, MB2, MB3의 형태 및 염기 서열을 나타낸다.
도 7은 분자 비콘 MB1, MB2, MB3, MB4의 형광 스펙트럼을 나타낸다. (여기 파장 λex = 490nm)
도 8은 분자 비콘 MB1에 양이온성 공액 고분자 전해질이 첨가되었을 때의 형광 스펙트럼을 나타낸다. (MP2 (A), MP3 (B), MP4 (C), MP5 (D), MP6 (E) [MB1] = 2.0 × 10-8 M, [MPs] = 0 ~ 1.5 × 10-7 M, 여기파장 λex = 490nm)
도 9는 양이온성 공액 고분자 전해질에 의한 MB1의 형광증대 비율 (I/I0)을 나타낸다. (I0 = 공액 고분자 전해질 첨가 전 초기 분자 비콘의 형광 세기, I = 공액 고분자 전해질 존재 시 분자 비콘의 형광 세기) ([MB1] = 2.0 × 10-8 M and [MPs] = 1.5 × 10-7 M, 여기 파장 λex = 490nm)
도 10은 MB2 (사각형), MB3 (원)의 양이온성 공액 고분자 전해질에 의한 형광증대 비율 (I/I0)을 나타낸다. ([MB2] = [MB3] = 2.0 × 10-8 M and [MPs] = 1.5 × 10-7 M, 여기 파장 λex = 490nm)
도 11은 각각 칼륨 이온이 존재하지 않을 경우에 MP2, MP4, MP6에 의한 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 신호 세기를 도시한다. (IFRET : 공액 고분자 전해질 첨가에 따른 분자 비콘의 FRET 유도 형광 신호 세기) ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = [MP4] = [MP6] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M, Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM, 여기 파장 λex = 380nm))
도 12는 각각 칼륨 이온 존재 시 MP2, MP4, MP6에 의한 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 신호 세기를 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M , [MP2] = [MP4] = [MP6] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M, Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM, [KCl] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 13은 다양한 금속 이온에 대한 칼륨 이온 검출용 MAB 센서의 선택성에 관하여 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M, Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [금속이온] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 14는 칼륨 이온의 농도 (0 ~ 100nM) 에 따른 FRET 유도 형광 신호 세기 (IFRET/I0)를 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M. Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), 여기 파장 λex = 380nm.)
도 15는 칼륨 이온이 존재하지 않을 경우 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M , [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), 여기 파장 λex = 380nm)
도 16은 칼륨 이온이 존재할 경우의 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼을 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M and [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [KCl] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 17은 ATP가 존재하지 않을 경우 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼을 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), 여기 파장 λex = 380nm)
도 18은 ATP가 존재할 경우의 6-FAM이 레이블 된 MAB의 FRET 유도 형광 스펙트럼을 나타낸다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 0 ~ 2.0 × 10-6 M. Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [ATP] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 19는 유사종에 대한 ATP 검출용 MAB 센서의 선택성에 관하여 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M, Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM) [UTP] = [GTP] = [CTP] = 50mM, 여기 파장 λex = 380nm)
도 20은 ATP의 농도 (20 ~ 100μM)에 따른 FRET 유도 형광 신호 세기를 도시한다. ([MAB] = 2.0 × 10-8 M, [MP2] = 2.0 × 10-6 M, Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM), [ATP] = 20 ~ 100μM, 여기 파장 λex = 380nm)
본 발명은 표적 물질의 존재 여부에 따라 고리 구조의 분자 압타머 비콘이 양이온성 공액 고분자 전해질 형광 공여체와 소수성 상호 작용을 통해 선형 또는 G-4중 나선 구조를 형성하는 단계; FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템을 통해 형광 신호의 변화가 일어나는 단계; 를 갖는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 방법을 제공한다.
본 명세서 상에서 “검출”이란, 단순히 시료 내에 표적물질이 존재하는지 여부에 대한 “검출”과 시료 내 대상 표적물질의 “정량 분석”을 모두 일컫는다.
본 발명에서 “양이온성 공액 고분자 전해질 (Cationic Conjugated Polyelectrolytes)”은 FRET에 의해 형광체의 형광이 증폭되는 고분자의 안테나 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 양이온성 공액 고분자 전해질은 분자 비콘과의 소수성 상호 작용에 의하여 분자 비콘을 고리 구조에서 선형 구조로 변화시키는 성질을 가진 고분자를 이용할 수 있다. 공액 고분자 전해질은 소수성의 공액 고분자 주쇄 (폴리파라페닐렌, 폴리 플루오렌, 폴리파라페닐렌비닐렌, 폴리티오펜, 폴리카바졸 등)에 양이온성 이온 그룹을 갖는 사이드 체인을 도입하여 친수성을 동시에 부여한 구조는 모두 사용 가능하다. 바람직하게는 양이온성 공액 고분자 전해질로써 표1의 양이온성 공액 고분자 전해질 등을 사용할 수 있다.
| 양이온성 공액 고분자 전해질 |
| Poly[((9,9´-bis(4-(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-alt-(benzene-1,4-diyl)]dibromide |
| Poly[((9,9´-bis(4-(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-((9,9´-bis(3,4-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-(benzene-1,4-diyl)]tribromide |
| Poly[((9,9´-bis(3,4-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-alt-(benzene-1,4-diyl)]tetrabromide |
| Poly[((9,9´-bis(3,4-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-((9,9´-bis(3,4,5-tris(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-(benzene-1,4-diyl)]pentabromide |
| Poly[((9,9´-bis(3,4,5-tris(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-alt-(benzene-1,4-diyl)]hexabromide |
| Poly[9,9´-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene-alt-phenylene]dibromide |
| Poly[9,9´-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene]dibromide |
| Poly[9,9´-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene]dibromide |
| Poly[9,9´-bis(2-(2-(2-methoxyethoxy)ethoxy)ethyl)fluorene-alt-phenylene]dibromide |
| Poly[9,9´-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene-alt-1,4-(2,5-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyloxy)phenylene)]tetrabromide |
| Poly[3-(6-trimethylammoniumhexyl)thiophene]bromide |
| Poly[9,9´-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene-alt-thiophene]dibromide |
| Poly[2,5-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenylene-alt-phenylene]dibromide |
본 발명의 ”분자 압타머 비콘(molecular aptamer beacon, MAB)”은 염기 서열의 한쪽에는 형광체, 다른 한쪽에는 형광 억제제가 각각 레이블 되어 있고, 검출하고자 하는 표적물질에 특이적인 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드 탐침을 말한다. 특히 본 발명의 칼륨 이온 검출을 위한 MAB는 바람직하게는 칼륨 이온에 특이적인 칼륨 이온 압타머 염기 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는 본 발명의 칼륨 이온 압타머 염기 서열은 GGTT GGTG TGGT TGG을 갖는 것을 특징으로 하나, 이에 제한됨 없이 본 발명의 칼륨 이온 검출에 사용될 수 있는 가능한 압타머 (GGGT TAGG GTTA GGGT TAGGG, TGAG GGTG GGGA GGGT GGGG AA, GTGG GTCA TTGT GGGT GGGT GTGG, TTTA AGGG TGTG GGTG TGGG TGTG 등)라면 사용 가능하다.
또한 ATP 검출을 위한 분자 압타머 비콘은 ATP에 특이적인 염기 서열을 가지며 바람직하게는 GGGG AGTA TTGC GGAG GA의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한됨 없이 ATP 검출에 사용될 수 있는 압타머 (ACCT GGGG GAGT ATTG CGGA GGAA GGT ACCT, TGGA AGGA GGCG TTAT GAGG GGGT, GCAC CTGG GGGA GTAT TGCG GAGG AAGGT 등)라면 사용 가능하다.
본 발명의 “압타머 (Aptamer)”란 핵산 리간드로써 매우 높은 선택성과 친화도를 가지고 표적물질에 결합할 수 있음을 특징으로 한다. 특히 구아닌 염기가 매우 풍부한 서열을 가진 단일 가닥 DNA는 2차 구조를 형성할 수 있으며, 내부 분자의 수소 결합에 의하여 G-사중 나선 구조(G-quadruplex) 형성이 가능하다. 상기 압타머는 바람직하게는 G-사중 나선구조를 형성할 수 있는 염기 서열을 가지며, 압타머 특이적인 표적 물질 존재 시 G-사중 나선 구조 형성이 증진됨을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 칼륨 이온 또는 ATP 존재 하에서 G-사중 나선 구조의 형성이 더욱 촉진될 수 있다. 따라서, 본 발명은 표적 물질 존재 시 G-사중 나선 구조를 형성할 수 있는 압타머의 경우에 제한 없이 형광체와 형광 억제제를 표지한 분자 압타머 비콘을 디자인하여 다양한 화학 물질 및 바이오 물질 검출 센서로 사용할 수 있으며, 이 경우 압타머는 검출하고자 하는 표적 물질에 특이적인 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 FRET 시스템에 사용되는 형광 분자는 신호 발색군으로써 공액 고분자 전해질로부터 에너지를 흡수할 수 있고, 광을 방출할 수 있는 물질을 포함한다. 전형적인 형광 분자로는 형광 염료, 반도체 나노 크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질을 포함한다.
형광염료의 예로는, 플루오레신, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(상표명), Cy3(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어(상표명) 430, 알렉사 플로어(상표명) 488, 알렉사 플로어(상표명) 532, 알렉사 플로어(상표명) 546, 알렉사 플로어(상표명) 568, 알렉사 플로어(상표명) 594, 알렉사 플로어(상표명) 633, 알렉사 플로어(상표명) 647, 알렉사 플로어(상표명) 660, 알렉사 플로어(상표명) 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피(상표명) FL-Br 2 , 보디피(상표명) 530/550, 보디피(상표명) 558/568, 보디피(상표명) 564/570, 보디피(상표명) 576/589, 보디피(상표명) 581/591, 보디피(상표명) 630/650, 보디피(상표명) 650/665, 보디피(상표명) R6G, 보디피(상표명) TMR, 보디피(상표명) TR, 이의 콘쥬게이트화물, 이들의 배합물을 포함한다. 란탄화물 킬레이트의 예로는 유로피윰(europium) 킬레이트, 테르비윰(terbium) 킬레이트 및 사마리윰(samarium) 킬레이트를 포함할 수 있다.
형광 억제제의 예로는 4-(4-dimethylaminophenyl) diazenylbenzoic acid (DABCYL), Black Hole Quenchers, Qxl quenchers, lowa black FQ, lowa black RQ, IRDye QC-1 등을 포함할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 분자 압타머 비콘은 5´말단에 형광체 6-FAM, 형광 억제제로써 3´말단에 DABCYL을 레이블할 수 있다.
보다 구체적으로 표적 물질 검출 방법은 표적 물질 존재시 분자 압타머 비콘이 G-4중 나선 구조를 형성하는 단계; 형광체와 형광억제제가 접촉 상태를 유지하게 되어 효율적인 형광 억제 현상이 일어나는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 방법을 통하여 검출이 가능하며, 표적 물질 비 존재시 양이온성 공액 고분자 전해질에 의해 분자 압타머 비콘의 고리 구조가 선형 구조로 변화되는 단계; 형광 공여체 양이온성 공액 고분자 전해질에서 형광 수용체인 분자압타머 비콘으로 FRET이 일어나는 단계; 형광 신호의 증폭이 일어나는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 방법에 의하여 표적 물질 유무를 검출할 수 있게 된다.
보다 구체적으로는 G-4중 나선 구조를 형성할 수 있는 압타머에 특이적인 표적물질이 존재할 경우 분자 압타머 비콘이 G-사중 나선 구조를 형성하여 분자 압타머 비콘의 형광체와 형광억제제가 접촉하게 되어 효율적인 형광억제 현상이 일어나, 양이온성 공액 고분자 전해질 첨가 시에도 효율적인 형광억제가 일어나는 것을 특징으로 할 수 있다.
압타머에 특이적인 표적 물질이 존재하지 않을 경우 분자 압타머 비콘은 양이온성 공액 고분자 전해질과의 소수성 상호작용에 의하여 고리 형태가 선형 형태로 변화되고, 이에 따라 형광체와 형광억제제의 분자간 거리가 증가하여 형광억제가 감소된다. 특히, 본 발명의 바람직한 실험 예에 기재된 양이온성 공액 고분자 전해질을 포함하는 FRET 시스템에서는 고분자에서 형광체로 에너지 전달이 일어나고 안테나 효과에 의하여 형광체의 형광 신호가 증폭되어 기존의 형광 센서에 비하여 감도를 증가시킬 수 있다.
본 명세서 상에서 실시 가능한 양이온성 공액 고분자 전해질을 예시하였으나, 이에 제한됨 없이 형광체로 FRET에 의한 안테나 효과를 나타낼 수 있는 양이온성 공액 고분자 전해질을 포함하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 시험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 시험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 시험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조 예1. 시료 및 측정 방법.
본 발명의 모든 화학 물질은 Aldrich Chemical Co.에서 구입하였으며, 사용된 모든 분자 비콘은 HPLC 급으로 정제된 것을 사용하였다. 분자 비콘 (5´-ACTA TTGA TCGG CGTT TTAA ATAGG-3´, 5´-ACGC TCGA TCGG CGTT TTAG AGAGG-3´, 5´-ACGC GCGA TCGG CGTT TTAG CGCGG-3´, 5´-ACGC GCGA TCGG CGTT TTAT ATATG-3´과 칼륨 이온 검출을 위한 분자 압타머 비콘(5´-ACGC GCGG TTGG TGTG GTTG GGCG CGG-3´), ATP 검출을 위한 분자 압타머 비콘 (5´-TGCG CTGG GGAG TATT GCGG AGGA AGCG CA-3´)은 각각 5´말단에 6-FAM과 3´-말단에 DABCYL을 각각 형광체와 형광 억제제로서 레이블하였다.
본 명세서 상의 UV/Vis 흡수 스펙트럼은 Jasco (V-630) 로 측정하였으며, photoluminsecence (PL) 스펙트럼은 Xenon 램프를 여기 소스로 가지는 Jasco (FP-6500) 스펙트로 플로로미터를 사용하여 측정하였다.
본 명세서 상의 분자 비콘 스펙트럼은 PBS (40mM, pH = 8, [NaCl] = 100mM) 에서 수행되었다. 또한 칼륨 이온 및 ATP 검출 실험은 Tris-HCl buffer (20 mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM)에서 수행되었다.
제조 예2.
양이온성 공액
고분자 전해질의 합성
양이온성 공액 고분자 전해질을 위한 단량체 합성은 종전에 공지되어 있는 방법을 통하여 합성하였으며, 단량체 4,4'-(2,7-dibromo-9H-fluorene-9,9-diyl)diphenol (1), 4,4'-(2,7-dibromo-9H-fluorene-9,9-diyl)dibenzene-1,2-diol (2) 및 5,5'-(2,7-dibromo-9H-fluorene-9,9-diyl)dibenzene-1,2,3-triol (3)과 1,4-phenylenebisboronic ester의 Suzuki coupling을 통해 고분자를 중합하였다. (도2 및 도3 참조)
중성 전구체 (P1 ~ P5)는 분자 반복 단위당 각기 다른 개수의 브로모알킬 체인을 가지고 있으며, 트리메틸아민 (tirmethylamine)을 이용하여 quaternization 반응을 통해 양이온성 공액 고분자 전해질을 합성하였다. 최종적인 양이온성 공액 고분자 전해질, Multi-charged Polymers (MPs, MP2~MP6)는 동일한 poly(fluorene-co-phenylene) 고분자 주쇄를 기반으로 고분자 반복 단위당 암모늄 양이온 그룹의 수가 +2 에서 +6까지 다르게 합성되었다.
시험 예1.
공액
고분자 전해질의 성질.
상기 제조 예2를 통하여 합성한 공액 고분자 전해질의 광학적인 특성에 대하여 조사하였다. 최종 양이온성 공액 고분자 전해질들 (이하, MPs)은 동일한 고분자 주쇄와 전자 구조를 가지나, 알킬 체인의 말단에 치환된 양이온 그룹의 수가 달라짐에 따라 고분자 내의 전하 밀도가 달라져 수용액 상에서 각기 다른 용해도와 광학적 특성을 지니게 된다.
| MP2 | Poly[((9,9´-bis(4-(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-alt-(benzene-1,4-diyl)] dibromide |
| MP3 | Poly[((9,9´-bis(4-(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-((9,9´-bis(3,4-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-(benzene-1,4-diyl)] tribromide |
| MP4 | Poly[((9,9´-bis(3,4-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-alt-(benzene-1,4-diyl)] tetrabromide |
| MP5 | Poly[((9,9´-bis(3,4-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-((9,9´-bis(3,4,5-tris(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-co-(benzene-1,4-diyl)] pentabromide |
| MP6 | Poly[((9,9´-bis(3,4,5-tris(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)phenyl)fluorene)-2,7-diyl)-alt-(benzene-1,4-diyl)] hexabromide |
양이온성 공액 고분자 전해질(이하, MP) MP2는 물에 용해되지 않으나, MP3와 MP4는 부분적으로 물에 용해되었으며, MP5와 MP6는 물에 잘 용해되었다. 이는 고분자 전해질의 높은 전하 밀도에 기인한 특성으로 고분자 전해질의 반복단위 당 전하 밀도가 증가함에 따라 물에 대한 용해도가 증가하였다. 또한 MP2는 디메틸설폭사이드에 잘 용해되었고, MP3 ~ MP6는 메탄올에 잘 용해되었다.
모든 MPs는 동일한 고분자 주쇄 및 전자구조를 가지므로 유기용매 (메탄올 및 디메틸설폭사이드) 및 PBS 수용액에서 거의 동일한 광학적 특성을 나타냈다 (표3 참조). 유기 용매에서 MPs의 최대 흡수 파장은 ~376nm, 최대 발광 파장은 ~417nm이나, MP2의 경우 디메틸설폭사이드 용매에 의한 효과로 장파장 쪽으로 약간 이동하였다. PBS 수용액 내에서 MPs의 최대 흡수 파장은 ~375nm, 최대 방출 파장은 ~420nm로 모든 고분자 전해질 모두 거의 동일한 광학적 특성을 가진다. 그러나 MPs의 몰 흡광 계수 (α)와 PL 형광효율 (ΦPL)은 고분자의 전하 밀도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다. MP2의 경우 물에 대해 상대적으로 낮은 용해도로 인해 α = 1.8 x 104 M-1cm-1 및 ΦPL = 46%를 가지나, 전하 밀도가 증가함에 따라 MP5에서 α 및 ΦPL 값은 포화되었으며, MP5와 MP6는 거의 동일한 α = 3.4 x104 M-1cm-1 및 ΦPL = 92%의 값을 보였다. (도4, 5참조)
| Polymer | UV-Vis absorption (λabs, nm)a |
PL emission (λPL, nm)b |
||
| In methanol |
In PBS | In methanol |
In PBS | |
| MP2 | 376c | 375 | 417c | 423 |
| MP3 | 368 | 373 | 411 | 421 |
| MP4 | 370 | 377 | 412 | 421 |
| MP5 | 367 | 373 | 411 | 419 |
| MP6 | 368 | 373 | 412 | 418 |
a최대 흡수 파장 b최대 발광 파장 c in 디메틸설폭사이드
시험 예2.
양이온성 공액
고분자 전해질에 의한 분자
비콘의
구조 변화.
본 시험 예에서는 전하밀도가 다른 MPs에 의해 분자 비콘의 구조 변화 효과를 알아보기 위해 5´말단에 6-FAM 형광체, 3´말단에 형광 억제제 DABCYL이 레이블 된 3종류의 분자 비콘을 사용하였다. 본 발명에서 사용된 분자 비콘의 염기 서열은 다음 표4와 같다. (도 6 참조)
| 분자비콘 | 염기서열 |
| MB1 | 5´[6-FAM] ACTATTGATCGGCGTTTTAAATAGG [DABCYL]3´ |
| MB2 | 5´[6-FAM] ACGCTCGATCGGCGTTTTAGAGAGG [DABCYL]3´ |
| MB3 | 5´[6-FAM] ACGCGCGATCGGCGTTTTAGCGCGG [DABCYL]3´ |
| MB4 | 5´[6-FAM] ACGCGCGATCGGCGTTTTATATATG [DABCYL]3´ |
MB1, MB2, MB3는 분자 비콘의 스템 부분이 상보적인 염기서열을 갖도록 디자인되어 효율적인 고리 구조 (형광체와 형광억제제가 접촉하게 되어 효율적인 형광억제) 형성이 가능하나, 대조군MB4는 스템 부분의 염기 서열이 비상보적이도록 디자인되어 고리 구조가 아닌 선형 구조 (형광체와 형광억제제의 분자간 거리가 증가하여 형광억제 감소)를 가지도록 설계하였다. 또한 MB1, MB2, MB3의 스템 부분의 염기 서열에 G-C 수소결합의 개수를 각각 1, 3, 5개로 각각 조절하여 분자 비콘의 안정성을 조절하였다. 분자 비콘이 고리 구조 형성을 통해 효과적인 형광 억제 현상이 일어남을 확인하기 위해, 선형 구조를 가진 MB4와 형광 세기를 비교 확인하였다. MB4와 비교하여 (형광 세기 = 1) 효율적인 고리 구조 형성이 가능한 MB1, MB2, MB3 는 효과적인 형광 억제에 의해 각각 0.2, 0.09 그리고 0.05의 상대적인 형광 세기를 나타내었다. 즉, 분자 비콘의 안정성이 증가할수록 고리 구조에서 선형 구조로의 구조변화가 억제되어 형광 세기도 점차적으로 감소하였으며, 이를 통해 분자 비콘의 안정성이 증대됨에 따라 분자 비콘은 고리 구조가 더욱 우세함을 확인하였다. (도 7 참조)
공액 고분자 전해질과의 소수성 상호작용에 의해 분자 비콘의 고리 구조가 선형 구조로 유도됨을 확인하기 위해, PBS (40mM, [NaCl] = 100mM, pH = 8)용액에서 분자 비콘 용액에 MPs를 추가하면서 형광 스펙트럼을 측정하였다. 초기 분자 비콘의 농도는 2.0 × 10-8 M이며, MPs의 농도는 0 ~ 1.5 × 10-7 M이며, 각각의 스펙트럼은 490nm에서 분자 비콘의 6-FAM을 직접적으로 여기하여 측정하였다. 형광 스펙트럼은 공액 고분자 전해질 존재 시 분자 비콘의 형광 세기 (I)를 공액 고분자 전해질 첨가 전 초기 분자 비콘의 형광 세기 (I0)로 나누어준 값으로 나타내었다. (도 8 참조)
각 분자 비콘은 MPs를 첨가함에 따라 직접적으로 여기된 6-FAM의 형광 세기가 증가하는 것으로 나타났다. 또한 MPs의 고분자 반복 단위당 전하 밀도가 증가할수록 형광 증대 비율 (I/I0)은 감소하였다. 이것은 각 MPs의 상대적인 소수성 및 친수성의 차이에서 기인한 것으로 고분자의 전하 밀도가 증가함에 따라 상대적으로 친수성은 증가하고, 소수성이 감소하여 결과적으로 분자 비콘과의 소수성 상호작용이 약화되었음을 알 수 있었다. 각 분자 비콘에 따른 I/I0는 다음 표5와 같다.
| Polymer | I/I0 | ||
| MB1 | MB2 | MB3 | |
| MP2 | 2.3 | 1.7 | 1.4 |
| MP3 | 2.1 | 1.4 | 1.3 |
| MP4 | 1.7 | 1.3 | 1.2 |
| MP5 | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| MP6 | 1.2 | 1.1 | 1.0 |
또한 동일한 공액 고분자 전해질에 대해서도 분자 비콘의 안정성이 증가함에 따라 I/I0는 감소하였으며, 최종적으로 MB3는 높은 안정성에 의해 고분자에 의한 분자 비콘의 구조 변화 효과가 거의 없는 것으로 확인되었다. (도 9, 10 참조)
시험 예3.
FRET
에 의한 분자
비콘의
형광 신호 증폭 효과.
본 시험 예에서는 공액 고분자 전해질의 농도가 증가됨에 따라 고리 구조의 분자 비콘이 선형구조로 변형되어 형광억제 현상이 감소하고 결과적으로 공액 고분자에서 6-FAM이 레이블된 분자 비콘으로의 FRET 유도에 의해 형광 신호 증폭 효과를 조사하였다. 분자 비콘 용액에 공액 고분자 전해질을 첨가하면서 FRET유도 형광신호의 세기(IFRET)를 공액 고분자 전해질 첨가 전 직접적으로 여기된 분자 비콘의 형광 세기(I0)로 나누어 나타내었다. MB1의 경우 MP2, MP3, MP4, MP5, MP6를 첨가하였을 때 각각 19, 7, 6, 5, 4배의 신호 증폭 (IFRET/I0) 효과가 관찰되었다. MPs 첨가 후 분자 비콘의 FRET에 의한 형광신호의 증폭 효과를 표6에 나타내었다.
| Polymer | IFRET/I0 | ||
| MB1 | MB2 | MB3 | |
| MP2 | 19 | 44 | 50 |
| MP3 | 7 | 17 | 30 |
| MP4 | 6 | 14 | 22 |
| MP5 | 5 | 12 | 17 |
| MP6 | 4 | 10 | 14 |
고분자 전해질의 반복단위당 전하 밀도가 증가됨에 따라 FRET 유도 신호 증폭 효과는 감소하였으며, 분자 비콘의 안정성이 증가함에 따라 고분자 전해질에 의한 FRET 유도 신호 증폭 효과는 증대되었다. 따라서, 본 발명은 분자 비콘과 공액 고분자 전해질을 이용할 경우 형광 방출의 세기가 FRET에 의해 증대되고 민감도가 더욱 향상된 검출 센서로 사용 가능함을 확인하였다.
시험 예4. 칼륨 이온 검출을 위한 분자
압타머
비콘
센서
본 발명의 바람직한 실시 예로서 칼륨 이온 검출을 위한 특이적 염기서열을 갖는 분자 압타머 비콘을 사용하여 칼륨 이온 검출을 수행하였다. 이를 위한 칼륨 이온 특이적 분자 압타머 비콘의 염기 서열은 5´[6-FAM] ACGC GCGG TTGG TGTG GTTG GGCG CGG [DABCYL] 3´으로 디자인되었다.
칼륨 이온 특이적 분자 압타머 비콘은 칼륨 이온 존재 시 G-사중 나선 구조를 형성하여 고리 구조와 동일하게 형광체와 형광 억제제가 접촉상태를 유지하여 효율적인 형광 억제 효과를 나타낸다. 이 경우 G-사중 나선 구조가 형성된 분자 압타머 비콘 용액에 공액 고분자 전해질을 첨가하여도 칼륨 이온과 분자 압타머 비콘 간의 높은 결합력에 의해 분자 압타머 비콘의 구조 변화가 유도되지 않아, 효과적인 형광억제 현상을 관찰하였다 (off 상태). 그러나 칼륨 이온이 존재하지 않을 경우 분자 압타머 비콘과 공액 고분자 전해질 사이의 소수성 상호작용에 의하여 고리 구조에서 선형 구조로 구조변화가 유도되고 공액 고분자 전해질에서 분자 압타머 비콘의 6-FAM으로의 효율적인 FRET이 일어나며, 형광신호는 증폭되게 된다. (on 상태)
시험예4
-1 칼륨 이온이 존재하지 않을 경우의 FRET 유도 형광 세기.
Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM) 내에서 분자 압타머 비콘 ([분자 압타머 비콘] = 2.0 × 10-8 M) 용액에 MPs를 첨가하면서 (0 ~ 2.0 × 10-6M) FRET 유도 형광 신호 세기 (IFRET)를 측정하여, 공액 고분자 전해질 첨가 전 직접적으로 여기된 분자 압타머 비콘의 형광 세기 (I0)로 나누어 신호 증대 효과를 조사하였다.
공액 고분자 전해질 (MP2, MP4, MP6) 첨가에 의해 분자 압타머 비콘의 고리 형태에서 선형 형태로의 구조 변화 및 FRET에 의한 신호 증폭 효과에 의해 6-FAM이 레이블 된 분자 압타머 비콘의 형광 세기는 직접적으로 여기된 형광 세기에 비해 각각 IFRET/I0 = ~ 41, ~ 11, ~ 6 배 증대된 것으로 나타났다 (on 상태). (도 11, 15 참조)
시험예4
-2 칼륨 이온이 존재할 경우의
FRET
유도 형광 세기
Tris-HCl buffer 용액에 (20mM, pH = 7.2, [NaCl] = 100mM)에 50mM KCl이 존재하는 경우 분자 압타머 비콘의 FRET유도 형광 신호를 측정하였다.
칼륨 이온 존재 시에는 분자 압타머 비콘과 칼륨 이온과의 높은 친화력에 의해 안정한 G-사중 나선 구조를 형성하여 분자 압타머 비콘에 레이블 된 형광체와 형광 억제제가 직접적인 접촉 형태를 유지하게 되고, 이로 인해 효율적인 형광 억제가 일어난다. 이에 따라 공액 고분자 전해질에 의해 분자 압타머 비콘의 고리 구조가 선형 구조로 변화되지 못해 FRET 유도 형광 신호는 현저히 낮게 관찰되었다 (off 상태).
MP2의 경우 상대적으로 높은 소수성 상호작용에 의해 G-사중 나선 구조의 일부가 열려 FRET 유도 형광 신호가 나타났으나, 칼륨 이온이 존재하지 않을 때와 비교할 경우 여전히 높은 형광 억제 현상이 관찰되었다.
상기와 같은 시험 예에 따른 칼륨 이온이 존재할 경우와 존재하지 않을 경우의 IFRET/I0비율 (on/off)은 MP2, MP4, MP6에 대하여 각각 최대 20, 11, 6.7 로 나타났다. 이를 통하여 본 발명의 검출 센서 시스템은 칼륨 이온을 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. (도 12, 16 참조)
시험 예5. 분자
압타머
비콘을
이용한 칼륨 이온 검출 센서의 선택성.
분자 압타머 비콘을 이용한 칼륨 이온 센서의 선택성을 알아보기 위하여 다른 양이온 존재 시 6-FAM이 레이블 된 분자 압타머 비콘의 FRET 유도 형광 신호의 세기를 측정하였다. 본 시험예에서는 NaCl, CaCl2, LiCl, MgCl2, NH4Cl, CuCl2, FeCl2, ZnCl2,, AlCl3을 사용하여 각각 나트륨 이온, 칼슘 이온, 리튬 이온, 마그네슘 이온, 암모늄 이온, 구리 이온, 철 이온, 아연 이온, 알루미늄 이온 존재 시에 본 발명의 센서 시스템의 칼륨이온에 대한 선택성을 알아보았다.
Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM)에서 각 금속 이온의 농도는 50mM였으며, 분자 압타머 비콘의 농도는 2.0 × 10-8 M, MP2의 농도는 2.0 × 10-8 M 이다.
칼륨 이온이 존재하는 경우를 제외하고 FRET 유도 형광 신호는 MP2에 의해 25배에서 45배까지 증폭됨을 확인할 수 있었다. 비록 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 경우 G-사중 나선구조 형성이 가능하므로 다소 감소된 FRET 신호가 관찰되었으나, 칼륨 이온 특이적 분자 압타머 비콘에 대한 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 결합력은 칼륨 이온에 비해 현저히 낮으므로, 칼륨 이온과 쉽게 구분될 수 있었다. 또한 나트륨 이온, 리튬 이온, 암모늄 이온, 구리 이온, 철 이온, 아연 이온, 알루미늄 이온은 칼륨 이온 특이적 분자 압타머 비콘에 대해 G-사중 나선 구조 형성 능력이 없으므로, 금속 이온이 존재하지 않을 경우와 유사한 FRET 유도 형광 신호 세기를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 칼륨 이온 특이적 압타머를 포함하는 분자 압타머 비콘의 검출은 다른 금속 이온들에 대하여 높은 선택성을 갖는다. (도 13 참조)
시험 예6. 분자
압타머
비콘의
칼륨 이온 검출 센서의 민감도 및 검출한계 측정.
본 발명의 칼륨 이온 검출 센서의 민감도 및 검출 한계를 측정하기 위하여 5nM 부터 100nM의 칼륨 이온을 포함하는 용액에서 FRET 신호 세기를 측정하였다. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM)에서 분자 압타머 비콘의 농도는 2.0 × 10-8 M, MP2의 농도는 2.0 × 10-6M이다.
칼륨 이온의 농도가 mM수준일 경우에는 농도에 상관없이 효율적으로 G-사중 나선 구조가 형성되어 형광체의 형광이 형광 억제제와의 직접적인 접촉에 의해 효율적으로 억제되었으나, 칼륨 이온의 농도가 감소함에 따라 점차적으로 6-FAM이 레이블 된 분자 압타머 비콘의 FRET 유도 형광 신호는 증가하였다. 칼륨 이온 농도가 5~100nM일 때 IFRET (on/off) 는 칼륨 이온 농도와 선형적인 관계를 가졌으며, 이 때의 검출 한계는 대략 ~1.5nM로 나타났다. (도 14참조)
시험 예7.
ATP
검출을 위한 분자
압타머
비콘
센서
본 발명의 검출 센서는 특이적 검출 표적 물질이 존재하는 경우 분자 압타머 비콘이 G-사중 나선 구조를 형성하는 경우에 제한 없이 적용 가능하므로, ATP 특이적 압타머와 ATP가 존재할 경우에 G-사중 나선 구조를 형성하는 분자 압타머 비콘을 디자인하였다. ATP특이적 분자 압타머 비콘의 서열은 5´TGCG CTGG GGAG TATT GCGG AGGA AGCG CA-3´이며, 5´말단과 3´말단에는 각각 형광체 6-FAM과 형광 억제제 DABCYL이 레이블 하였다.
칼륨 이온 검출과 동일하게 ATP가 존재하지 않을 때에는 양이온성 공액 고분자 전해질에 의해 분자 압타머 비콘이 고리 구조에서 선형 구조로 변형되고, 공액 고분자 전해질에서 6-FAM이 레이블 된 분자 압타머 비콘으로의 FRET이 가능하다. 그러나 ATP가 존재할 경우에는 분자 압타머 비콘이 ATP와 안정한 G-사중 나선구조 구조를 형성하여 공액 고분자 전해질 첨가 시에도 형광체와 형광억제제가 접촉하게 되어 효율적인 형광 억제 현상이 일어나게 된다.
시험 예7-1
시료내
ATP
가 존재하지 않을 경우
FRET
유도 형광 세기
Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM) 내에서 분자 압타머 비콘 ([분자 압타머 비콘] = 2.0 × 10-8 M) 용액에 MP2를 0 ~ 1.5 × 10-6M농도로 첨가하면서 FRET 유도에 의한 형광 신호를 관찰하였다. MP2에 의해 분자 압타머 비콘의 고리 구조는 선형 구조로 변화되면서 효율적인 FRET이 가능하여, MP2의 안테나 효과에 의해 6-FAM이 레이블 된 분자 압타머 비콘의 FRET 유도 형광 세기는 직접적으로 여기된 형광 세기에 비해 ~13배 (IFRET/I0) 가량 증폭되었다. (도 17 참조)
시험 예7-2
시료내
ATP
가 존재할 경우의
FRET
유도 형광 세기.
Tris-HCl buffer (20mM, pH = 7.2, [NaCl] = 100mM)에서 50mM ATP가 존재할 때의 ATP 특이적 분자 압타머 비콘의 농도는 2.0 × 10-8 M이며, MP2 의 농도는 0 ~ 1.5 × 10-6M이다.
ATP가 존재할 경우에는 ATP 특이적 분자 압타머 비콘이 ATP와 G-사중 나선 구조를 형성하여 형광체와 형광 억제제 간의 접촉 상태를 유지하여 효율적인 형광 억제 현상이 나타남으로써 공액 고분자 전해질 존재 하에서도 완벽하게 형광 억제 되는 것을 관찰하였다. (도 18 참조)
시험 예8. 분자
압타머
비콘을
이용한
ATP
검출 센서의 선택성.
ATP를 검출하기 위한 검출 센서의 선택성을 알아보기 위하여 유사종인 GTP (Guanosine-5'-triphosphate), CTP (Cytidine-5'-triphosphate), UTP (Uridine-5'-triphosphate)가 존재할 때 FRET 유도 신호 세기를 측정하였다. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM)에서 GTP, CTP, UTP의 농도는 50mM였으며, 분자 압타머 비콘의 농도는 2.0 × 10-8 M, MP2의 농도는 2.0 × 10-6M이다.
ATP를 제외한 CTP, GTP, UTP는 ATP 특이적 분자 압타머 비콘에 대한 결합력이 없으므로, 공액 고분자 전해질 첨가 시 분자 압타머 비콘의 구조가 고리에서 선형구조로 변형되어 6-FAM이 레이블 된 분자 압타머 비콘의 FRET유도 형광 신호가 관찰되었다. 이를 통해 이 검출 센서는 ATP에 대해 높은 선택성을 갖는 것을 확인하였다. (도 19 참조)
시험 예9. 분자
압타머
비콘을
이용한
ATP
검출 센서의 민감도 및 검출 한계 측정.
ATP 검출 센서의 민감도 및 검출 한계를 측정하기 위하여 20μM 부터 100μM의 ATP를 포함하는 용액에서 FRET 유도 형광 신호 세기를 측정하였다. Tirs-HCl buffer (20mM, pH = 7.4, [NaCl] = 100mM)에서 분자 압타머 비콘의 농도는 2.0 × 10-8 M, MP2의 농도는 2.0 × 10-6M에서 측정하였다.
용액 내 ATP의 농도가 감소함에 따라 G-사중 나선 구조 형성이 약화되므로 점차적으로 증가된 FRET 유도 형광 신호를 관찰하였다. 또한 20 ~ 100μM ATP 농도 범위에서 FRET 유도 형광 신호는 ATP농도와 선형적인 관계를 가지며, 본 발명의 ATP 검출 한계는 대략 20μM로 나타났다. (도 20 참조)
서열목록 전자파일 첨부
Claims (9)
- 표적 물질로서 칼륨의 존재 여부에 따라, 고리 양 말단에 형광체와 형광 억제제를 갖는 고리 구조의 분자 압타머 비콘이 양이온성 공액 고분자 전해질 형광 공여체와의 상호 작용을 통해서,
표적 물질 존재 시 분자 압타머 비콘이 G-4중 나선 구조를 형성하여 형광체와 형광억제제가 접촉 상태를 유지하게 되어 형광 억제 현상이 일어나거나, 또는
표적물질 비 존재 시 양이온성 공액 고분자 전해질에 의해 분자 압타머 비콘의 고리 구조가 선형 구조로 변화되어 형광 공여체 양이온성 공액 고분자 전해질에서 형광 수용체인 분자 압타머 비콘으로 FRET이 일어나 형광 신호의 증폭이 일어나는,
FRET 현상을 통해 형광 신호의 변화가 일어나는 단계; 를 포함하는, 표적 물질 검출 방법.
- 표적 물질로서 ATP의 존재 여부에 따라, 고리 양 말단에 형광체와 형광 억제제를 갖는 고리 구조의 분자 압타머 비콘이 양이온성 공액 고분자 전해질 형광 공여체와의 상호 작용을 통해서,
표적 물질 존재 시 분자 압타머 비콘이 G-4중 나선 구조를 형성하여 형광체와 형광억제제가 접촉 상태를 유지하게 되어 형광 억제 현상이 일어나거나, 또는
표적물질 비 존재 시 양이온성 공액 고분자 전해질에 의해 분자 압타머 비콘의 고리 구조가 선형 구조로 변화되어 형광 공여체 양이온성 공액 고분자 전해질에서 형광 수용체인 분자 압타머 비콘으로 FRET이 일어나 형광 신호의 증폭이 일어나는,
FRET 현상을 통해 형광 신호의 변화가 일어나는 단계; 를 포함하는, 표적 물질 검출 방법.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온성 공액 고분자 전해질 형광 공여체는 하기 표로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 표적 물질 검출 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 분자 압타머 비콘의 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열인 것을 특징으로 하는, 표적 물질 검출 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 분자 압타머 비콘의 압타머는 서열번호 6 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열인 것을 특징으로 하는, 표적 물질 검출 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 염기 서열 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열의 5' 말단에 형광체, 3' 말단에 형광 억제제를 갖는 것을 특징으로 하는, 표적 물질 검출 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 염기 서열 6 내지 9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열의 5' 말단에 형광체, 3' 말단에 형광 억제제를 갖는 것을 특징으로 하는, 표적 물질 검출 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020110067354A KR101312354B1 (ko) | 2011-07-07 | 2011-07-07 | 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법 |
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| KR1020110067354A KR101312354B1 (ko) | 2011-07-07 | 2011-07-07 | 양이온성 공액 고분자 전해질 기반 표적 물질 검출 방법 |
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