CN113777312A - 乙肝抗体片段的制备方法、乙肝抗体片段、试剂盒及应用 - Google Patents
乙肝抗体片段的制备方法、乙肝抗体片段、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请属于医疗器械技术领域，具体公开了本申请提供的乙肝抗体片段的制备方法、乙肝抗体片段、试剂盒及应用，所述制备方法包括以下步骤：在乙肝抗体溶液中加入胃蛋白酶，二硫赤酰糖醇和2‑巯基乙醇，第一次温育；再加入甘氨酸，第二次温育后进行纯化。本申请至少具有以下有益效果之一：本申请提供的乙肝抗体片段的制备方法，其所制备出的乙肝抗体片段应用于检测乙肝抗原时，能够显著减低假阳性的产生以提高检测结果的准确性。
Description
技术领域
本申请属于抗体及其制备技术领域，更具体地说，它涉及一种乙肝抗体片段的制备方法、乙肝抗体片段、试剂盒及应用。
背景技术
乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前2～8周时，可在血清中测到阳性结果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。因此快速检测乙肝病毒是临床需要。
但在医疗实践中，现有的乙肝抗体在应用于检测时，经常出现一些副反应，例如，非特异性结合导致临床出现假阳性诊断等。
发明内容
基于此，为了减少假阳性的出现，本申请提供一种乙肝抗体片段的制备方法，由该方法制备出的乙肝抗体片段应用于乙肝抗原检测时，能够降低假阳性的出现。
本申请是通过以下方案实现的：
本申请提供一种乙肝抗体片段的制备方法，其包括以下步骤：在乙肝抗体溶液中加入胃蛋白酶，二硫赤酰糖醇和2-巯基乙醇，第一次温育；再加入甘氨酸，第二次温育后进行纯化。
本申请通过利用胃蛋白酶消化乙肝抗体从而形成乙肝抗体片段，将乙肝抗体片段应用于乙肝抗原检测时，假阳性明显降低。而且，本申请在制备乙肝抗体片段时，加入了二硫赤酰糖醇和2-巯基乙醇，能够显著促进胃蛋白酶的作用速率。
在本申请的一个具体实施方式中，所述二硫赤酰糖醇的加入量为1-2g/L。例如，二硫赤酰糖醇的加入量为1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L或2g/L等。
在本申请的一个具体实施方式中，所述二硫赤酰糖醇的加入量为1.5g/L。
在本申请的一个具体实施方式中，所述2-巯基乙醇的加入量为0.2-0.5g/L。例如，2-巯基乙醇的加入量为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、或0.5g/L等。
在本申请的一个具体实施方式中，所述2-巯基乙醇的加入量为0.3g/L。
在本申请的一个具体实施方式中，所述甘氨酸的加入量为3-3.5g/L。例如，所述甘氨酸的加入量为3g/L、3.1g/L、3.2g/L、3.3g/L、3.4g/L或3.5g/L等。
在本申请的一个具体实施方式中，按照乙肝抗体的重量计，所述胃蛋白酶的加入量为0.5-2U/ug。例如，所述胃蛋白酶的加入量为0.5U/ug、0.8U/ug、1.0U/ug、1.2U/ug、1.5U/ug、1.8U/ug或2U/ug等。
在本申请一个具体实施方式中，所述胃蛋白酶的加入量为1U/ug。
在本申请一个具体实施方式中，所述胃蛋白酶先溶于柠檬酸缓冲液中，调整胃蛋白酶溶液的pH值为1.5-2.5，再将胃蛋白酶溶液加入到乙肝抗体溶液中。
在本申请的一个具体实施方式中，所述胃蛋白酶溶液的pH值为1.5、2.0或2.5。
在本申请的一个具体实施方式中，所述胃蛋白酶溶液的pH值为2.0。
在本申请的一个具体实施方式中，所述第一次温育的时间为15-25min。例如，第一温育时间为15min、18min、20min、22min或25min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述第一次温育的时间为20min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述第二次温育的时间为8-13min。例如，第二次温育的时间为8min、9min、10min、11min、12min或13min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述第二次温育的时间为10min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述纯化为利用proteinG柱进行纯化。
在本申请的一个具体实施方式中，所述乙肝抗体为市售产品。
在本申请的一个具体实施方式中，所述乙肝抗体先放入透析袋中进行透析。
本申请另一方面提供一种乙肝抗体片段，所述乙肝抗体片段通过上述制备方法制备而得。
本申请另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的乙肝抗体片段。
本申请又一方面提供上述所述的乙肝抗体片段在制备用于检测乙肝抗原试剂中的应用。
本申请提供的乙肝抗体片段的制备方法至少具有以下有益效果之一：
本申请提供的乙肝抗体片段的制备方法，其所制备出的乙肝抗体片段应用于检测乙肝抗原时，能够显著减低假阳性的产生以提高检测结果的准确性。
附图说明
图1为本申请实施例中提供的凝胶电泳结果图。
其中，1表示实施例1中的试剂制备的试剂盒；CK表示对比例1中的试剂制备的试剂盒；M表示Marker；原抗体表示没有没有酶切的抗体。
具体实施方式
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请提供的乙肝抗体片段的制备方法，包括以下步骤：
在乙肝抗体溶液中加入胃蛋白酶，二硫赤酰糖醇和2-巯基乙醇，第一次温育；再加入甘氨酸，第二次温育后进行纯化。通过利用胃蛋白酶消化乙肝抗体以提高抗体的亲和力，减少非特异性结合。
实施例1 乙肝抗体片段的制备
本实施例中以以下工艺参数为例进行说明。
1. 将胃蛋白酶（北京索莱宝，货号：P8160，10000U/mg）用柠檬酸缓冲液（0.06mol/L pH4.8）稀释成1mg/ml，用浓盐酸调整pH值为2.0，备用。
2. 取2ml的乙肝抗体（菲鹏生物，批号：20200518，5mg/ml）放入50KD的透析袋中，用100ml的柠檬酸缓冲液（0.06mol/L pH4.8）透析30min。透析后，按照1U胃蛋白酶切割1ug的乙肝抗体，向其中滴加0.5ml上述胃蛋白酶，再加入0.005ml浓度为5mM的二硫赤酰糖醇DTE（1.5g/L）和0.1ml浓度为100mM的2-巯基乙醇（0.3g/L），将混合物放入25℃烘箱内，温育20min后，再加入75ul浓度为1.5mol/L的甘氨酸（3.3g/L），室温旋转10min进行反应，反应后利用NaOH碱溶液调整pH值8.0。
3. 纯化，先用0.01M PBS进行proteinG柱平衡，冲洗10个柱体积后，将反应后的产物加入到柱子内，收集流穿液进行SDS-PAGE电泳检测。其实验结果如图1所示。
对比例1 本对比例中不加二硫赤酰糖醇DTE和2-巯基乙醇，其他同实施例1。其实验结果如图1所示。
从图1可知，实施例1中酶切20min后，原乙肝抗体被完全酶切形成了乙肝抗体片段，而对比例1中，原乙肝抗体被酶切的量较少，只有少量的乙肝抗体片段形成。由此可知，加入二硫赤酰糖醇DTE和2-巯基乙醇能够显著提供胃蛋白酶的酶切速率。
实施例2 检测乙肝抗原
利用实施例1中的乙肝抗体片段（简称片段）检测乙肝抗原。利用抗体检测抗原的方法较多，本实施例中采用胶体金测试为例进行说明。
膜包被液：Tris 1.21g，蔗糖 0.5g，EDTA-2Na 0.5g，SDS 0.15g，盐酸 200ul，定容到100ml水中。
胶体金复溶液：Tris 1.21g，蔗糖 2.5g，聚乙烯吡络烷酮（PVA）0.05g，BSA 0.5g，聚乙二醇 0.05g，酪蛋白钠 0.5g，盐酸 200ul，吐温20 0.5ml，定容到100ml水中。
结合垫处理液：KH2PO4 0.02g，TW20 0.1ml，Na2HPO4 0.29g，蔗糖 10g，BSA 1g，PC0.05ml，定容到100ml水中。
样品垫处理液：KH2PO4 0.02g，Na2HPO4·12H2O 0.29g，KCl 0.02g，PC 0.05ml，TW201ml，Trition100 0.1ml，定容到100ml水中。
校准品稀释液：乙酰神经氨酸钠盐0.075g，5g海藻糖，0.02923g EDTA-2Na，PC0.1ml，0.1ml T-20，纯水定容到100ml。
具体实施方法：
（1）样品垫处理
将样品垫置于样品垫处理液中浸泡5分钟后，沥水至液体滴落时平铺鼓风干燥箱架上，37℃干燥。
（2）结合垫处理
将结合垫置于结合垫处理液中浸泡5分钟后，沥水至液体滴落时平铺鼓风干燥箱架上，37℃干燥。
（3）胶体金制备工艺
取超纯水100mL，置三角瓶中，加入1%的HAuCl4水溶液1ml，在加热磁力搅拌器上加热至沸腾，搅拌下加入0.11mL 10%的柠檬酸三钠水溶液。持续加热搅拌煮沸7分钟～8分钟至溶液呈透明的紫红色，冷却至室温，制备得到粒径为40nm的胶体金。
（4）结合垫的制备工艺
结合垫的制备工艺条件如表1所示。
表1 结合垫的制备工艺条件
（5）干燥包被NC膜板的制备
包被NC膜板制备工艺如表2所示。
（6）复合裁切、内包装工艺
1）清洁工作区域，准备好包被NC膜、结合垫和其他原材料。
2）将吸水纸贴在塑料衬片的吸水纸端，向下盖在贴好的硝酸纤维素膜的上端，覆盖1.5mm～2mm，压紧。
3）将塑料衬片另一侧的纸片撕开，将结合垫贴在硝酸纤维素膜下端，覆盖1.5mm～2mm；再将样品垫贴在结合垫上面，覆盖1.5mm～2mm，压紧，组装成半成品板。
4）调节好切刀参数，将半成品板切成规格、尺寸一致的试纸。
5）利用上述制备的试纸检测血清中乙肝表面抗原，其检测结果与罗氏试剂检测结果进行对比。共随机选出30份血清试验进行检测，其检测结果如表3所示。
表3 检测结果
从表3可知，分别利用原抗体、酶切后的抗体以及罗氏试剂检测30份血清样本，将原抗体的检测结果与罗氏试剂检测结果相比，出现了4例假阳性，而酶切抗体的检测结果与罗氏试剂检测结果相一致。由此可见，利用酶切后抗体进行检测时，减少了假阳性的出现，使最终的检测结果更加准确。根据表3中5和6的数据可知，利用酶切后的抗体进行检测时，能够提高灰区（即在阈值1附近）的阳性测试，使最终的测定结果更加可信。
综上，本申请提供的乙肝抗体片段的制备方法所制备的乙肝抗体片段在用于检测乙肝抗原时，能够显著降低假阳性的出现，提高检测结果的准确性，因此，更适用于临床应用；而且在制备过程中，加入二硫赤酰糖醇DTE2-巯基乙醇能够显著提高胃蛋白酶的酶切速率。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种乙肝抗体片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在乙肝抗体溶液中加入胃蛋白酶，二硫赤酰糖醇和2-巯基乙醇，第一次温育；再加入甘氨酸，第二次温育后进行纯化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二硫赤酰糖醇的加入量为1-2g/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述2-巯基乙醇的加入量为0.2-0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘氨酸的加入量为3-3.5g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按照乙肝抗体的重量计，所述胃蛋白酶的加入量为0.5-2U/ug。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶先溶于柠檬酸缓冲液中，调整胃蛋白酶溶液的pH值为1.5-2.5，再将胃蛋白酶溶液加入到乙肝抗体溶液中。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为利用proteinG柱进行纯化。
8.一种乙肝抗体片段，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的方法制备而成。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求8中的乙肝抗体片段。
10.权利要求8所述的乙肝抗体片段在制备用于检测乙肝抗原试剂中的应用。
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