JPH04274762A - 生物学的活性たんぱく質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフタロシアニン色素を担
体とする生物学的活性たんぱく質の固定方法に関する。

【０００２】

【従来技術】近年、医薬、診断薬など製剤化学および分
析化学の分野において、酵素、ホルモン、抗原−抗体反
応あるいはハプテン抗体反応に関与する能力のある物質
、凝固因子など生物学的活性たんぱく質を固定化する技
術が重要となってきている。

【０００３】生物学的活性たんぱく質である酵素を用い
る酵素的測定法は、強酸、強アルカリなど強い試薬を使
用せず、比較的おだやかな条件で体液中の病理学的成分
を測定できるため、特公昭４５−１８７５号公報記載の
ブドウ糖検出用品など診断試験試薬として広く用いられ
るようになってきた。これらの用途には酵素を固定化し
て用いると簡便である。

【０００４】酵素の固定化については、千畑一郎編「固
定化酵素」（講談社、昭和６１年８月刊）に詳細に記載
されており、酵素を固定化する事により活性が長期間持
続し、安定化し、また分離がしやすくなることが、また
固定化の方法としては担体結合法（共有結合法、イオン
結合法、物理的吸着法）、架橋法、および包括法がある
ことが、それぞれ示されている。

【０００５】最も一般的な担体結合法の担体としては各
種ポリマー類、セルロース類、澱粉などの他、特定の用
途においては多孔性ガラス、活性炭、酸性白土、シリカ
ゲルが用いられる。これらの担体はいずれも明白な分散
状態と凝集状態の差異を目視判定しにくく、確認には熟
練した技術が必要で個人差が出るという欠点があった。

【０００６】また、抗原−抗体反応を利用した微量血中
物質の測定法が最近用いられるようになり、各種の病原
が確認出来るようになった。例えば、モノクロナール抗
体法により特定の病原を確認する方法も開発されている
。これらの確認法には、ラテックス凝集法、発色法など
があり分析装置の開発も進んでいる。しかしながら、ラ
テックス凝集法は一般にはポリスチレンラテックスをも
ちいるため色調は白色であり判定には専門的技術と訓練
を必要するなどの欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した従
来の生物学的活性たんぱく質の固定化方法の欠点を改良
し、保存安定性が良好で、担体が色素のため色調を帯び
ているため、診断薬や分析測定剤とりわけ抗原−抗体反
応法、特にモノクロナール抗体法による診断薬として用
いたときに定量性と同時に、目視判定が容易で信頼性が
高く、細胞レセプターのマーカー、たとえば細胞表面の
糖たんぱくを認識するためのマーカーなどとしても利用
できる。

【０００８】また、発酵分野において用いたときに、担
体が着色しているために、精製、分離が容易となり、ま
たリサイクル使用が可能となる生物学的活性たんぱく質
の固定化方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】本発明は、担体材料とし
てフタロシアニン色素の粒子を用いて生物学的活性たん
ぱく質の固定化方法であって、上記フタロシアニン色素
の粒子が粒子径１０００ｎｍ以下である上記固定化方法
である。

【０００９】本発明において生物学的活性たんぱく質と
しては、特に制限はなく、植物性または動物性の生物学
的活性たんぱく質、あるいはこれらに架橋剤がグラフト
した形の変性体が用いられるが、診断薬や分析測定剤な
どの用途に用いる場合には酵素、および抗原−抗体反応
をおこす生物学的活性たんぱく質が用いられる。

【００１０】また、抗原−抗体反応を起こす生物学的活
性たんぱく質としては、とくに制限はなく、たんぱく質
などの高分子物質に結合すると免疫応答を示す物質とし
てのハプテンや免疫グロブリンと総称される抗体などで
あり、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ウ
マ、鳥類、は虫類、両生類、魚類、円口類などから得ら
れる免疫グロブリンを用いる事が出来がこれらに限定さ
れるものではない。

【００１１】本発明において、フタロシアニン色素は特
に制限はなく、無置換のフタロシアニン色素、置換基を
有するフタロシアニン色素であり、置換基としてはカル
ボキシル基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、チ
オシアネート基、エポキシ基、エチレン不飽和二重結合
、チオール基、アルデヒド基、酸無水物基、イミダゾー
ル基、ハロゲン基、核塩基、などから適時選択される。 また上記フタロシアニン色素誘導体の金属錯体も使用可
能である。場合によっては、上記フタロシアニン色素単
独で用いてもよく、２種類以上混合して用いることも可
能である。また下記に示すように物理吸着着法を用いる
場合には、アルキル基やとりわけ高級アルキル基や芳香
族基で置換されたフタロシアニン誘導体が好ましいがこ
れに限定されるものでない。

【００１２】本発明において、固定化方法としては担体
結合法（共有結合法、物理的吸着法）、架橋法、包括法
あるいはこれらを複合した方法があるが、好ましくは生
物学的活性たんぱく質を変性させるなどの影響を与えな
い物理的吸着法が好ましいがこれに限定されるものでな
い。

【００１３】本発明のおいてフタロシアニン色素ととも
に必要に応じて、有機溶剤、顔料、染料、体質顔料、指
示薬、架橋剤、硬化触媒、重合禁止剤、消泡剤、滑剤、
充填剤、無機塩、水などの添加剤、熱可塑樹脂、熱硬化
樹脂、感光性樹脂などの樹脂を用いてもよい。

【００１４】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。

【００１５】

【実施例１】粒径１０００ｎｍ以下のメタルフリー無置
換フタロシアニン色素の０．１ｇを炭酸緩衝液（０．１
Ｍ、ｐＨ６．５）２０ｍｌ中に５分間高速ミキサーにて
分散し、抗ヒト絨毛ゴナドトロピン（ａｈＣＧ）（１１
ｇ／ｌ）Ｄａｋｏ社製ポリクロナール抗体（βーＳａｂ
ｕｎｉｔ）ウサギ免疫、ＩｇＧ分画の０．２ｍｌを加え
て４℃にて１６時間撹拌した。反応後、遠心分離して上
澄みをデカンテーションにて除去し、炭酸緩衝液（０．
１Ｍ，ｐＨ６．５）の２０ｍｌを加えて１時間撹拌した
。この操作を３回繰り返し行なった。２０ｍｌの炭酸緩
衝液を加えた後、その混合物の５ｍｌ中にＴｗｅｅｎ２
０（界面活性剤　　和光純薬社製）を２０μｌ加えて２
時間撹拌した。この溶液を５μｍ径のフィルターでろ過
し、凝集物を除去した。このろ過液の粒径を大塚電子（
株）レーザー粒径解析システムＬＰＡ３０００で測定し
た結果、３００ｎｍ±５０ｎｍ粒径分布の試料（ａ）が
得られた。得られた試料（ａ）５ｍｌ中に抗原としてヒ
ト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（５００ＩＵ／ｌ）の
０．２ｍｌを加えて３時間後の粒径を測定した結果、３
６００ｎｍ±５００ｎｍの粒径分布であり完全に３００
ｎｍのピークが消失しており、抗原−抗体反応により凝
集反応が起こっていることが判った。また、試料（ａ）
５ｍｌ中に抗原としてヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ
）（５００ＩＵ／ｌ）の０．２ｍｌを加えて６時間放置
した結果、凝集反応で凝集したブルー色の沈澱物が確認
された。この結果から簡単に目視判定が出来ることが判
った。なお、試料（ａ）を２日間放置し、その溶液の粒
径分布を測定した結果、３００±５０ｎｍであり変化は
無かった。

【００１６】

【実施例２】実施例１と同様に抗体としてヒトγーグロ
ブミン（Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂ社製）を精製したものを
ＩｇＧ分画したものを用い、フタロシアニン色素（１０
００ｎｍ以下の粒径）に固定化し、フィルターろ過した
後、抗原としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（和光純
薬工業（株）社製）を添加した結果、抗原−抗体反応に
て凝集反応が生じ、ブルー色の凝集体が目視にても確認
できた。

【００１７】

【実施例３】カルボキシル化フタロシアニン色素（１０
００ｎｍ以下の粒径）の０．５ｇを５０ｍｌの冷水中に
酵素としてグルコースオキシダーゼ（東洋紡績（株）社
製グレイド　　Ｉ）０．０１ｇおよびＮ，Ｎ−シクロヘ
キシルカルボジイミド０．１ｇを、０〜５℃の条件下で
８時間反応後、尿素をろ過で除去し、冷水で透析精製し
、グルコースオキシダーゼを色素に固定化した。酵素活
性を測定した結果、４０℃で７日間放置しても活性は失
われず、安定な色素固定化酵素を得ることが出来た。

【００１８】

【発明の効果】本発明により、保存安定性が良好で、色
素の粒子径がほぼ一定であるために、診断薬や分析測定
剤、とりわけ抗原−抗体反応法、特にモノクロナール抗
体法による診断薬として用いた時に定量性、目視判定性
に優れ、信頼性が高い固定化された生物学的活性たんぱ
く質が得られるようになった。本発明は、細胞レセプタ
ーのマーカー、例えば細胞表面の糖たんぱくを認識する
ためのマーカーにも利用できる。また、本発明による分
離の容易さにより、発酵分野での操作性の向上が可能と
なった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　担体材料としてフタロシアニン色素を
   用いて生化学的活性たんぱく質を固定することを特徴と
   する生化学的活性たんぱく質の固定化方法。
2. 【請求項２】　　フタロシアニン色素の粒径が、１００
   ０ｎｍ以下の粒子径を有することを特徴とする請求項１
   記載の生化学的活性たんぱく質の固定方法。