JPH08269089A

JPH08269089A - ペプチド

Info

Publication number: JPH08269089A
Application number: JP7073253A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Sato; 佐藤　　淳; Mayumi Fukuyama; 真弓福山; Takashi Miwa; 敬史三和
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1996-10-15

Abstract

(57)【要約】【構成】スーパー抗原に結合し、スーパー抗原と主要組
織適合性抗原クラスII蛋白との結合を阻害するペプチド
であり、かつ主要組織適合性抗原クラスII蛋白とのアミ
ノ酸配列の相同性が６０％以下であることを特徴とする
ペプチド。【効果】本発明によりスーパー抗原に結合しかつスーパ
ー抗原（TSST-1）とMHCクラスIIの結合を阻害する能力
を有するペプチドが提供される。これらペプチドはトキ
シンショック等の治療薬として活用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はスーパー抗原に結合し、
スーパー抗原と主要組織適合性抗原クラスII蛋白との結
合を阻害するペプチドに関する物であり、更に詳しくは
感染症の治療薬として使用し得るペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】スーパー抗原とは従来の抗原と異なり抗
原提示細胞内におけるプロセッシングを経ることなく抗
原提示細胞上の主要組織適合性抗原クラスII蛋白（以下
MHC クラスIIという）に結合し、さらにこのMHC クラス
IIとの複合体を形成することによりＴ細胞を異常に活性
化させる物質の総称である。この物質により、敗血症の
発熱、発疹、血圧低下などが引き起こされることが明ら
かにされている。さらに最近では慢性疾患との関係も示
唆されており、例えば川崎病、泉熱、アトピー性皮膚炎
などが関係しているのではないかと考えられている (Sc
hlievert,P.Mら.J.Infect.Dis. Vol.167, P.997-1002,
1993)。

【０００３】スーパー抗原は細菌性とウイルス性に大別
され、前者の細菌性スーパー抗原にはブドウ球菌外毒素
である Toxic shock syndrome toxin-I (TSST-1)、Stap
hyloccal enterotoxins (SEs) 、連鎖球菌外毒素(SPEs)
などが代表例である。特にブドウ球菌外毒素 Toxicshoc
k syndrome toxin-I (TSST-1) は検出される症例が増加
しており、トキシンショック症候群、急性全身性感染症
の主要原因外毒素であることが知られている (Schlieve
rt,P.Mら. J.Infect.Dis. Vol.143, P.509-516, 1981)
。さらに TSST-1 はエンドトキシンとの相乗効果で毒
性が増強されることが報告されており臨床上問題である
(Fujikawa et al., Infect. Immun. 48,134-137, 198
6)。この細菌性スーパー抗原は抗原提示細胞上のMHC ク
ラスIIへの結合を介してＴ細胞上のＴ細胞レセプターの
リガンドとして働きＴ細胞の活性化を促す。この活性化
されたＴ細胞は自己免疫的な攻撃を引き起こしいわゆる
急性のトキシンショックや慢性の疾患を引き起こすと考
えられている。したがってスーパー抗原とMHC クラスII
との結合を阻害することができればＴ細胞の活性化を抑
えることができ、トキシンショック症状あるいは他の疾
患の治療薬として使用できる可能性があると言える。

【０００４】この様なスーパー抗原とMHC クラスIIとの
結合を阻害する試みはすでにいくつかのグループで報告
されておりその主なアプローチは以下の方法である。

【０００５】スーパー抗原であるトキシンのアミノ酸
配列にしたがって数種のペプチドを設計し、スーパー抗
原とMHC クラスIIとの結合を阻害することができる領域
（ペプチド）を同定する方法。エンテロトキシンＢ（Ｓ
ＥＢ）に関してJettら Infect.Immun. Vol.62, 3408- 3
415, 1994、エンテロトキシンＣ１（ＳＥＣ１）に関し
てHoffman ら Infect. Immun. Vol. 62,3396-3407,199
4、ＴＳＳＴ−１に関してSoosら BBRC Vol.191, 1211-1
217, 1993の方法が報告されている。これらはすべてMHC
クラスIIに結合するペプチドをスーパー抗原の配列か
ら同定し用いているのであって、スーパー抗原に結合し
て作用するものではない。したがってこのようなスーパ
ー抗原の一部であるペプチド自身がＴ細胞活性化作用を
有していて問題になる可能性が考えられる。スーパー抗
原の一部であるペプチドがＴ細胞活性化作用を有してい
た例はエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）に関してPontzer
ら J.Immunol. Vol.143, 280-284, 1989 、エンテロト
キシンＣ１（ＳＥＣ１）に関してHoffman ら Infect. I
mmun. Vol. 62,3396-3407,1994、ＴＳＳＴ−１で報告さ
れている。特にＴＳＳＴ−１ではアミノ酸３９−６８の
領域がＴＳＳＴ−１とMHC クラスIIとの結合を阻害した
が (Soosら BBRC Vol.191, 1211-1217, 1993) 一方この
付近の領域（アミノ酸３４−６３）はＴ細胞活性化作用
を有していた（Rameshら。 J.Immunol. Vol.148, 1025-
1030,1992)。さらにIn Vivo でこれらペプチドを作
用させる場合にはスーパー抗原により誘導産生された抗
体によって認識されてしまい実際に機能しない事も考え
られる。

【０００６】スーパー抗原に対する抗体を作製しスー
パー抗原とMHC クラスIIとの結合を阻害する抗体を選択
する。例えばＴＳＳＴ−１に関してはMurphyらの報告が
ある（Murphyら J.Infect.Dis. Vol.158, 549-555, 19
88) 。この方法では抗体の分子量が大きく、治療薬とし
た場合にはその抗原性の大きさから免疫系に認識されや
すく問題となる場合が少なくない。

【０００７】近年、蛋白質（例えば抗体やレセプター）
に結合する分子構造を同定する方法としてファージラン
ダムペプチドライブラリー（Scctt ら、Science, Vol.2
49,386-390, 1990) や化学合成ライブラリー(Lam,KS e
t al, Nature, Vol.354, 821991) を利用する方法が報
告されている。これは例えば前者のファージランダムペ
プチドライブラリーではランダムなアミノ酸配列を表面
上に発現しているファージライブラリーを構築し、この
ライブラリーから特定分子と結合可能な配列を選択する
方法である。すでにこの方法を用いてモノクローナル抗
体の抗原決定基の同定やレセプターに対するアンタゴニ
ストの同定が報告されているが、スーパー抗原に関して
はこの方法を用いた報告はない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記問
題点をもたない低分子ペプチドを提供するところにあ
り、具体的にはブドウ球菌外毒素 Toxic shock syndro
me toxin-I (TSST-1）に代表されるスーパー抗原に特異
的に結合し、かつスーパー抗原 Toxic shock syndrome
toxin-I (TSST-1)と主要組織適合性抗原クラスII蛋白と
の結合を阻害するペプチドを提供するところにある。こ
れにより低分子であるペプチドを用いた Toxic shock s
yndrome toxin-I (TSST-1) によるＴ細胞活性の抑制が
可能であり、すなわちトキシンショック症状の治療薬の
開発が可能になる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的は下記本発明に
より解決される。すなわち本発明はスーパー抗原に結合
し、スーパー抗原と主要組織適合性抗原クラスII蛋白と
の結合を阻害するペプチドであり、かつ主要組織適合性
抗原クラスII蛋白とのアミノ酸配列の相同性が６０％以
下であることを特徴とするペプチドである。

【００１０】本発明におけるスーパー抗原とは従来の抗
原と異なり抗原提示細胞内におけるプロセッシングを経
ることなく抗原提示細胞上の主要組織適合性抗原クラス
II蛋白（以下MHC クラスIIという）に結合し、さらにこ
のMHC クラスIIとの複合体を形成することによりＴ細胞
を異常に活性化させる物質である。スーパー抗原は細菌
性とウイルス性に大別され、前者の細菌性スーパー抗原
にはブドウ球菌外毒素である Toxic shock syndrome to
xin-I (TSST-1)、Staphyloccal enterotoxins (SEs) 、
連鎖球菌外毒素(SPEs)などが代表例である。特にブドウ
球菌外毒素 Toxicshocksyndrome toxin-I (TSST-1) は
検出される症例が増加しており、トキシンショック症候
群、急性全身性感染症の主要原因外毒素であることが知
られている(Schlievert,P.Mら. J.Infect.Dis. Vol.14
3, P.509-516, 1981) 。

【００１１】スーパー抗原例えば Toxic shock syndrom
e toxin-I (TSST-1)を得るためには、TSST-1を産生する
ブドウ球菌を培養し、培地中に分泌されるTSST-1を精製
することができる。その方法としては例えば五十嵐らの
方法（Igarashi et al., Infect.Immun. Vol.44, 175-1
81, 1984) を用いることができる。

【００１２】本発明のペプチドを得るためには例えば以
下に述べるペプチドライブラリー法が挙げられる。ファ
ージランダムペプチドライブラリーを構築する方法とし
ては、例えばM13 系ファージの表面蛋白質（例えばgene
III 蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を
連結し作製すれば良い。その方法としてはScott, JK.an
d Smith, GP., Science Vol. 249, 386, 1990, やCwirl
a, SE et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA Vol. 87, 6
378, 1990 等の報告がある。挿入する遺伝子の大きさは
ペプチドが安定に発現できれば特に制限はないが、作製
したライブラリーがすべてのランダム配列を網羅し、し
かも結合能を有するためには６から４０アミノ酸に相当
する長さ（分子量約６００から４０００に相当）が適当
で、中でも１５アミノ酸が好ましい。目的のTSST-1に結
合するファージを選択するためにはTSST-1を例えばカラ
ムやプレート上に固定化し上記のライブラリーをTSST-1
に接触させ結合ファージを残し非結合ファージは洗浄で
洗い流す。洗浄後残ったファージを酸などにより溶出し
緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファージを増幅す
る。この選別を複数回繰り返すと目的のTSST-1に親和性
のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一なクロ
ーンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレ
ート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニー
を液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファー
ジをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基
配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。

【００１３】ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド
ライブラリーの作製方法としては、上記のようなファー
ジを用いる方法のほか化学合成したペプチドを用いるこ
とも可能である。その方法として例えばビーズを用いる
方法(Lam,KS et al, Nature,354, 82, 1991) 、液相フ
ォーカシング法(Houghton, RA et al., Nature, 354,8
4, 1991)、マイクロプレート法(Fodor, SPA et al., Sc
ience, 251, 767, 1991)などが報告されている。

【００１４】このようにして得られる本発明のペプチド
はＭＨＣクラスIIとの相同性が６０％以下さらに好まし
くは４０％以下のランダム配列由来であり、そのためス
ーパー抗原とペプチドの複合体がＴ細胞レセプターに認
識されＴ細胞活性化を示す可能性が極めて小さいため好
ましい。また本発明のペプチドは低分子であり、かつス
ーパー抗原との相同領域を持たないため、ペプチド自身
がＴ細胞を活性化したり、スーパー抗原より誘導産生さ
れた抗体により認識される可能性も極めて低いという利
点を持つ。

【００１５】さらに得られた配列を含むペプチドを大量
に調製するためには人工的に合成して使用する方法や遺
伝子組換え技術を利用して大腸菌、酵母、昆虫細胞、動
物細胞などで発現させる方法が挙げられる。前者の方法
としては一般のペプチド合成法により行うことができ、
例えば固相合成法により行うことが操作上簡便である。
後者の場合は、例えば大腸菌では得られたＤＮＡ配列を
プロモーター配列例えばトリプトファン合成酵素オペロ
ン(Trp) 、ラクトースオペロン(lac) 、ラムダファージ
プロモーター、tac プロモーター、T7ファージプロモー
ターなどに連結し、リボゾーム結合配列例えばシヤイン
−ダルガルノ配列（SD配列）や、転写終結因子などを付
加するのが望ましい。作製した発現ベクターを大腸菌に
導入する方法は例えばマニアテイスのモルキュラークロ
ーニング（コールドスプリングハーバーラボラトリー
プレス、１９８９）Ｐ．１．７４〜１．８４記載の方法
を用いることができる。形質転換された株は例えばマニ
アテイスのモルキュラークローニング（コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、１９８９）Ｐ．１
７．２〜１７．４の方法で培養し発現させることができ
る。発現産物を精製する方法は公知の方法が用いられ、
例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、遠心分離
等がある。

【００１６】得られたペプチドがTSST-1とMHC クラスII
との結合を阻害することができるかを評価するために
は、例えばTSST-1を¹²⁵Ｉでラベルし、MHC クラスIIが
発現している培養細胞、ヒト由来リンパ球、あるいはマ
クロファージとの結合が起こる際にペプチドを混合さ
せ、混合させない時と比べてどの位結合が阻害されるか
を放射能活性で調べることができる。あるいはMHC クラ
スIIを培養細胞、ヒト由来リンパ球やマクロファージか
ら分離精製してきてプレートなどに固相化し、１次反応
としてTSST-1を反応させる。このときペプチドを混合し
てTSST-1との競合反応を行う。その後２次反応としてた
とえば酵素標識した抗TSST-1抗体を反応させたのち、基
質を加え発色させると阻害が大きい程発色が低くなるこ
とからも判定可能である。

【００１７】本発明のペプチドは、TSST-1とMHC クラス
IIとの結合を阻害することができるためTSST-1によるト
キシンショック治療剤としての利用が可能となる。

【００１８】また、本発明のペプチドは安定に合成でき
る長さ、結合能の保持の点、さらに治療剤として使用す
ることを考慮すると免疫系に認識されにくくするために
できるだけ低分子であることが好ましい。具体的には蛋
白質ー蛋白質結合の典型例である抗原ー抗体反応を考え
た場合、抗体が認識するエピトープは短くても６アミノ
酸の長さが必要なことから考えて少なくとも６アミノ酸
以上が好ましくさらに得られるペプチドを安定的に合成
することを考えた場合長くとも４０アミノ酸が好まし
い。特に得られたペプチドが３次構造的にリガンドとし
て結合するためにはある程度の長さは必要であることか
ら、３０ないし４０アミノ酸が好ましい。

【００１９】本発明のペプチドは分子量として、上記記
載理由から６００〜４０００が好ましく、さらに３次構
造的にリガンドとして結合することを考えた場合は３０
００〜４０００が好ましい。

【００２０】さらに治療剤として使用する場合を考慮す
ると、得られたペプチド配列の結合能、立体構造が変化
しない程度に親水性のアミノ酸で置換したり付加したり
することによりペプチドを水溶性にして使用することも
可能である。

【００２１】

【実施例】以下実施例をあげて本発明の詳細を説明す
る。

【００２２】実施例１ペプチドライブラリーの作製ファージランダムペプチドライブラリーの作製方法の概
要は実験医学の11巻13号1993、 P.95-98に記載されてい
る。以下簡単にその方法を説明する。

【００２３】ファージベクターfuse5 （Dr.G.Smithらよ
り供与。University of Missouri,Scott,J.K. and Smit
h,G.P. Science 249、 386-390(1990) )を大腸菌K802株
に塩化カルシウム法で導入しテトラサイクリン耐性を指
標に形質転換株を選択した。この株を大量培養し、fuse
5 を塩化セシュウム法で精製後、30μｇのfuse5 を制限
酵素120UのSfiIで50℃、２時間で完全に消化した。

【００２４】ベクターに挿入するDNA 断片として、アミ
ノ酸１５残基に相当するランダムな配列を有する２本鎖
オリゴヌクレオチドをあらかじめPCR 法を用いて作製し
BglIで完全消化した。得られたフラグメントをSfiIで完
全消化したfuse5 にリガーゼを用いて連結した。

【００２５】上記fuse5 DNA を電気穿孔法によりあらか
じめ調製したコンピテントセル（MC1061) に導入し、テ
トラサイクリンを含む培地で一晩培養した。翌日上清に
でてくるファージ粒子をポリエチレングリコールで沈殿
させ高濃度のファージライブラリーとした。最終的に６
×１０^８のクローンを含む１５アミノ酸ライブラリーが
作製できた。

【００２６】実施例２TSST-1の精製 TSST-1の精製は五十嵐らの方法（Igarashi et al., Inf
ect. Immun. 44, 175-181, 1984) に従った。TSST-1を
産生するブドウ球菌をNZアミン／イーストエクストラク
ト培地（4 % NZアミン、0.5 % イーストエクストラク
ト、10mg/ ｌニコチン酸、0.5 mg/ ｌチアミン塩酸）で
30℃、48時間培養した。遠心分離して菌体を沈め上清を
別の容器に移し蒸留水で５倍に希釈した。塩酸でpHを５
に調整し、10mMリン酸−クエン酸pH5.0 溶液で平衡化し
た陽イオン交換カラムSP- セファデックスC25 （ファル
マシア社）に吸着させた。10mMリン酸−クエン酸pH5.0
溶液で洗浄後、20mMリン酸溶液 pH 8.0 でTSST-1を溶出
した。溶液を20mMエタノール−アミンpH9.4 に交換しフ
ァルマシア社のクロマトフォーカシング（PBE94)で精製
した。得られたTSST-1をSDS-PAGEで調べたところ単一バ
ンドしか認められず純度は95% 以上と考えられる。

【００２７】実施例３TSST-1結合ファージの選択（パニング）実施例２で得られたをTSST-1を PBSバッファー（塩化ナ
トリウム8g、塩化カリウムで0.2g、燐酸水素2 ナトリウ
ム（12水）2.9g、燐酸水素カリウム0.2g /ｌ）で5 μｇ
／mlの濃度に調製した。直径３５mmのポリスチレン製シ
ャーレ（ファルコン社製）に上記溶液を２ml入れ４℃一
晩反応させ物理的吸着でシャーレに固定化した。PBS バ
ッファーで１回洗浄し、TBS バッファー（ 50 ｍＭトリ
ス塩酸溶液 pH8.0 、150 ｍＭ塩化ナトリウム）に0.5%
のBSA （ウシ血清アルブミン）を溶解したブロッキング
溶液で室温１時間反応させブロッキングした。洗浄液
（0.5%のツイーン20を含むTBS バッファー）で２回洗浄
し、緩衝液（0.5%のツイーン20を含むTBS バッファー）
400 μｌと実施例１で作製したファージライブラリーを
約１０¹²バイロン（ファージの個数）加え室温で１時間
反応させた。洗浄液で１０回洗浄し非結合ファージを除
去し、pH2.2 のグリシンバッファーで結合ファージを溶
出させた。溶出後、大腸菌K91kanに感染させテトラサイ
クリンを含むLB培地で一晩培養しファージの増幅を行っ
た。上清に出てくるファージをポリエチレングリコール
で沈殿濃縮後このファージを２回目のパニングに用い
た。このパニングを全部で３回行いTSST-1に結合するフ
ァージを選択した。

【００２８】実施例４TSST-1結合ファージの選択（９６穴マイクロプレートを
使用）実施例３で選択したTSST-1に結合するファージをもう一
度大腸菌K91kanに感染させテトラサイクリンを含むLB寒
天培地上でシングルコロニーを形成させた。各コロニー
を滅菌したつまようじでつつき、テトラサイクリンを含
むLB培地３mlにうえ一晩培養した。翌日上清に存在する
ファージをポリエチレングリコールで沈殿精製した。こ
の得られたファージをTSST-1が固相化されている９６穴
マイクロプレート（１μg/mlの濃度のTSST-1を100 μｌ
／ウエル加え４℃で一晩反応させた）のウエルに約１０
⁹〜１０¹⁰バイロン加え室温で１時間反応させた（１次
反応）。洗浄液（0.05% のツイーン20を含むPBS バッフ
ァー）で３回洗浄した後、５０００倍希釈したHRP （西
洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗M13 ファージ抗体
（ファルマシア社製）を室温３０分反応させた（２次反
応）。３回洗浄した後基質（３、３´、５、５´−テト
ラメチルベンジジン）を加え室温５分で発色させ、１Ｍ
硫酸で反応を停止した。マイクロプレートリーダーで４
５０ｎｍの吸光度を測定した。さらに反応の特異性を
確認するために、１次反応の際に１０ｎｇのTSST-1を各
ウエルに加え固相化TSST-1との競合反応を行った。その
結果を図１に示す。１６個のクローンを調べて１、６、
１０の３クローン以外は競合反応において発色の低下を
認め、TSST-1との特異的反応を確認した。

【００２９】実施例５クローンの塩基配列の決定実施例４に示した方法で得られた各クローンのファージ
をフェノール、クロロホルム処理し蛋白を除いた後、さ
らにエタノールでＤＮＡを精製し塩基配列決定のための
鋳型DNA とした。ベクターであるfuse5 の塩基配列を基
にしてプライマーをデザインし、ジデオキシ法で塩基配
列を決定した。１２クローンの配列を決定し配列表に示
した４種類の配列が確認できた（ファージ２：配列番号
１、ファージ３：配列番号２、ファージ８：配列番号
３、ファージ１１：配列番号４と命名した）。これら得
られた配列と既知蛋白との相同性を調べたところ、ファ
ージ８以外にはＭＨＣクラスIIの配列との相同領域は認
められなかった。ファージ８はＭＨＣクラスIIβ鎖の５
７〜６２番目と１８８〜１９３番目に相同領域を認めた
が、一致したアミノ酸は１５アミノ酸中最大で８アミノ
酸（５３．３％）であり、アミノ酸相同性は６０％以下
であった（図２）。

【００３０】実施例６ペプチドの合成塩基配列を決定した４種類の配列を基にしてペプチド自
動合成装置（米国、アプライドバイオシステムズ社製）
でペプチドを合成した。得られたファージの１５アミノ
酸の配列にスペーサーとして２アミノ酸残基（グリシン
とアラニン）を前後に付加した１９アミノ酸の合成ペプ
チドを調製した（配列番号１から４に対応するペプチド
をペップ２、３、８、１１と命名）。

【００３１】例えばファ−ジ３（配列番号２）のペプチ
ド（ペップ３と命名）の配列は式 NH3-Gly-Ala-Asp-Arg-Ser-Tyr-Leu-Ser-Phe-Ile-His-Le
u-Tyr-Pro-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala -COOH で示される。

【００３２】得られたペプチドは逆相液体クロマトグラ
フィーで精製し、95% 以上の純度であることを確認し
た。

【００３３】実施例７ペプチドによるファージとTSST-1との結合阻害実施例５で異なる配列を有していた４種類のファージ
（ファージ２：配列番号１、ファージ３：配列番号２、
ファージ８：配列番号３、ファージ１１：配列番号４と
命名、）に関して、実施例６で作製したペップ３がこれ
らファージとTSST-1との結合を阻害することができるか
を実施例４記載の方法で調べた。得られた４種類のファ
ージをTSST-1が固相化されている９６穴マイクロプレー
ト（１μg/mlの濃度のTSST-1を100 μｌ／ウエル加え４
℃で一晩反応させた）のウエルに約１０⁹〜１０¹⁰バイ
ロン加えた。次にこれらウエルにペップ３をまったく加
えない場合、１μｇ加えたもの、１０μｇ加えたものを
用意し室温で１時間反応させた（１次反応）。陰性コン
トロールとしては得られた配列とはまったく相同性を有
さない２４アミノ酸のペプチドをペップ３の場合と同様
に用意した。洗浄液（0.05% のツイーン20を含むPBS バ
ッファー）で３回洗浄した後、５０００倍希釈したHRP
（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗M13 ファージ抗
体（ファルマシア社製）を室温３０分反応させた（２次
反応）。３回洗浄した後基質（３、３´、５、５´−テ
トラメチルベンジジン）を加え室温５分で発色させ、１
Ｍ硫酸で反応を停止した。マイクロプレートリーダーで
４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図３に示
す。縦軸は４５０ｎｍの吸光度の相対値を示しており、
まったくペプチドを加えない場合の値を１００としてい
る。ペップ３を加えた場合にはすべてのクローンに対し
て濃度依存的に吸光度の減少が確認できたが、コントロ
ールペプチドではこの減少は認められなかった。この事
実は得られた４種類のファージの配列には相同性は認め
られないが、TSST-1との結合認識部位に関してはすくな
くともオーバーラップしていることを示唆している。

【００３４】実施例８ペプチドによるTSST-1とMHC クラスIIとの結合阻害次にペップ３がTSST-1とMHC クラスIIとの結合を阻害す
ることが可能かを調べた。MHC クラスIIを発現している
Ｂ細胞（Daudi)をウシ胎児血清10% を含むRPM1640 培地
で培養した。Kaufman らが報告している方法 (Kaufman,
JF,et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76, P.6304-6308,
1979)に準じてDEAEカラムおよびコンカナバリンＡカラ
ムでMHC クラスIIを精製した。得られた約１μｇ／mlの
MHC クラスIIを９６穴のマイクロプレートのウエルに10
0 μｌに入れ4 ℃一晩反応させ固相化した。0.5%ウシ血
清アルブミン溶液でブロッキングした後、 10 ｎｇ／ml
の濃度のTSST-1を加え室温で１時間反応させた。この際
ペップ３と陰性コントロールペプチド（実施例７と同じ
ペプチド）を各ウエルに0 、 0.5、2.5 、5.0 、10.0、
25.0、50.0μＭの濃度になるよう加えた。３回洗浄後ビ
オチン化標識された抗TSST-1抗体（モノクローナル抗
体、三和ら、J. Clin. Microbiol. 32、P.539-542 、 1
994)を室温で１時間反応させ、洗浄後5000倍希釈したア
ビジン標識したHRP を室温１５分反応させた。３回洗浄
した後基質（3,3',5,5' −テトラメチルベンジジン）を
加え室温１５分で発色させ、１Ｍ硫酸で反応を停止し
た。マイクロプレートリーダーで450 ｎｍの吸光度を測
定した。結果を図４に示す。陰性コントロールペプチド
では阻害は起こらなかったが、ペップ３を加えた場合に
濃度依存的な吸光度の低下を確認することができペップ
３によるTSST-1とMHC クラスIIとの結合阻害が認められ
た。なおペップ３を２５０ｎＭ加えてもTSST-1とビオチ
ン化抗TSST-1抗体との反応、およびビオチン−HRP アビ
ジン反応はまったく阻害されないことは別の実験で確認
した。なお実施例６で得られた残り３種類のペプチド
（ペップ２、８、１１）に関しても同様にTSST-1とMHC
クラスIIとの結合阻害が認められた。

【００３５】

【発明の効果】本発明によりスーパー抗原（特にTSST-
1）に結合しかつスーパー抗原とMHC クラスIIの結合を
阻害する能力を有するペプチドが提供される。これらペ
プチドはトキシンショック等の治療薬として活用可能で
ある。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Phe Asn Gly Gly Ala Gln Met Gly Trp Asp Tyr Tyr Trp Phe Phe 1 5 10 15

【００３７】配列番号：２配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Arg Ser Tyr Leu Ser Phe Ile His Leu Tyr Pro Glu Leu Ala 1 5 10 15

【００３８】配列番号：３配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Trp Asp Ala Met Tyr Trp Asn Trp Arg Ser Val Ser Glu Phe His 1 5 10 15

【００３９】配列番号：４配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Ala Arg Leu Trp Ala Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Arg His Met 1 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】各ファージクローンのTSST-1に対する反応性
をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す。表中横軸の番号は
クローン番号である。黒いバーは非競合反応、白いバー
はTSST-1を加えた競合反応での450nm の吸光度を示して
いる。

【図２】ファージ８の配列とＭＨＣクラスＩＩβ鎖の
相同領域を示す。ＤＲ１，５，７、ＤＱ１，３、ＤＲＷ
５３、ＤＰＷ２，ＤＰＷ４はＨＬＡのタイプを示してい
る、配列の上の数字はアミノ酸番号を示しており、スタ
ー印は一致したアミノ酸残基を示している。

【図３】ペップ３によるファージとTSST-1との結合阻
害の結果を示す。表中横軸の番号はファージ番号であ
る。縦軸は450nm の吸光度の相対値を示しており100 は
ペプチドを加えない非競合反応での吸光度を示してい
る。各バーは左からペップ３を１μg 、１０μg 加えた
反応での吸光度、陰性コントロールペプチド１μg 、１
０μg を加えた時の吸光度の相対値を示す。

【図４】ペップ３によるTSST-1とMHC クラスIIとの結
合阻害の結果を示す。表中横軸は添加したペプチドの濃
度をしめし、縦軸は450nm の吸光度を示している。白丸
がペップ３を、黒丸が陰性コントロールペプチドの結果
である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スーパー抗原に結合し、スーパー抗原と主
要組織適合性抗原クラスII蛋白との結合を阻害するペプ
チドであり、かつ主要組織適合性抗原クラスII蛋白との
アミノ酸配列の相同性が６０％以下であることを特徴と
するペプチド。
【請求項２】分子量が６００以上４０００以下である請
求項１記載のペプチド。
【請求項３】スーパー抗原がブドウ球菌外毒素であるこ
とを特徴とする請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を
含む請求項１〜３記載のペプチド。
【請求項５】配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を
含む請求項１〜３記載のペプチド。
【請求項６】配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を
含む請求項１〜３記載のペプチド。
【請求項７】配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を
含む請求項１〜３記載のペプチド。