JP2008535481A

JP2008535481A - Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉのキメラ組換え抗原

Info

Publication number: JP2008535481A
Application number: JP2008500081A
Authority: JP
Inventors: ニコーラ・ガルガノ; エリーザ・ベゲット; アンドレア・スパドーニ
Original assignee: Kenton Srl
Current assignee: Kenton Srl
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-02-27
Publication date: 2008-09-04
Also published as: PL1856159T3; WO2006094665A1; DK1856159T3; EA013349B1; IL184845A0; EP1856159A1; EA200701911A1; EP1856159B1; DE602006013428D1; CN101137674A; US7790187B2; SI1856159T1; KR20080003330A; ATE463515T1; US20110027810A1; AU2006222315A1; RS51327B; PT1856159E; BRPI0608342A2; CY1110157T1

Abstract

本明細書に記載の本発明は、キメラ融合産物の形態にてToxoplasma gondii タンパク質の抗原フラグメントを組合せるための方法、および診断剤および免疫剤としてのそれらの使用に関する。

Description

（本発明の技術分野）
本明細書に記載の発明は、動物またはヒトの体に直接的に適用されない診断手段の調製の技術分野に関する。また、本発明は、最終化合物であり、その調製方法、その使用方法およびそれらを含有する組成物にも関し、これらは、医薬品および診断分野における産業的利用にとって、特にToxoplasma gondii感染の検出および診断、ならびに該感染の処置および予防にと適切である。

（本発明の背景技術）
初期診断は、医薬品の全ての分野において優先的かつ非常に望まれる目的である。その理由は、特に患者の生活における相当な改善と同時に医療制度または実際の患者の側への救済をもたらし得るからである。本明細書に記載した本発明の特定の場合には、初期診断は、胎児の健康に特に関わる妊婦および感染患者（特に免疫不全患者）におけるToxoplasma gondii感染の可能性や存在に関する。

Toxoplasma gondiiは、ヒト患者の細胞を包含する全ての哺乳動物細胞を感染させる偏性細胞内パラサイトである(McCabe and Remington, N. Engl. J. Med. 1988, 318-313-5)。形態学的に、パラサイトは感染の３つの異なる形態を示す：タキゾイト（tachyzoite）(無性の)、ブラディゾイト(組織中の嚢胞、無性)およびスポロゾイト(オーシスト中、有性生殖)。伝染は、通常、組織嚢胞を担持する調理中の肉やネコにより落とされたオーシストにより汚染された野菜の摂取からおこる。ヒト感染は、一般的に免疫応答宿主中で無症状かつ自己制限的である。対照的に、免疫不全罹患患者(特にAIDS罹患患者)では、トキソプラズマ症は、重度の日和見感染であり、非常に深刻な結果を伴う脳炎を引き起こす可能性がある(Luft, B.J., Remington J.S., 1992, Clin. Infect. Dis. 15, 211-22)。さらに、妊娠中に一次感染にかかると、哺乳類では流産または重大な死産を引き起こし得る。

トキソプラズマ症の問題についての広範な概説については、特定の医学文献を引用されたい。

T. gondii感染の診断は、血液または体液中の微生物を単離し、組織中のパラサイトを同定し、ＰＣＲを用いて特異的なヌクレオチド配列を検出すること、または特異的抗T. gondii感染応答において宿主により産生される免疫グロブリンを検出することによって確かめられる(Beaman et al., 1995 Principles and Practice of Infectious Diseases 4th Ed., Churchill Livingstone Inc., New York, 2455-75; Remington JS et al. 1995, Infectious Deseases of the Fetus and Newborn Infant, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 140-267)。

医者にとっての主な課題は、妊婦におけるT. gondii一次感染の診断およびその新生児/幼児における先天的感染の診断である。両ケースにおいて、適切な時期に適当な治療を実施するためおよび胎児および新生児/乳幼児に対する起こりうるダメージを回避するため、寄生虫感染が生じているかどうかを妊婦における受胎前または後に明らかにすることが重要である。さらに、その母親から胎児への垂直感染が生じた時期を決定することが重要である。最終的に、新生児/幼児の臨床的管理のために、妊娠中の一次トキソプラズマ症に罹患した母親に産まれた感染者および非感染者の彼らの人生初期において両者を識別できる感受性の高い診断方法が緊急に必要である。

妊娠期間中の血清変換および新生児における先天的感染診断は、一般的に抗Toxoplasma免疫グロブリン(IgG、IgM、IgA、IgGの結合活性)の多様なクラスの存在を検出し、母親とその子供の免疫学的プロファイルを比較することによって行われる。しかしながら、利用可能な市販アッセイは、全ての患者における感染を正しく診断し得るに十分な感受性および特異性を提供しない。そのため、特異的、感受性のあるおよび革新的な診断剤の供給が望まれる。

T. gondii 抗原は、昔から知られており、また最初には様々な方法で得られた抗原混合物として、次いで純粋抗原のその後の単離物として(EP 0 082 745, Merieux; EP 0 301 961, INSERM, Pasteur; WO 89/5658, Transgene)、そしてタンパク質およびその各遺伝子として両者のその特徴(WO 89/08700, U. Leland, Dartmouth Coll.; US 4,877,726, Res. Inst. Palo Alto; WO 89/12683, INSERM, Pasteur; EP 0 391 319, Mochida Pharm.; IT 1,196,817, CNR; EP 0 431 541, Behringwerke; WO 92/01067, CNRS; WO 92/02624, U. Flinders; WO 92/11366, Innogenetics, Smithkline Beecham; US 5,215,917, Res. Inst. Palo Alto; WO 92/25689, FR 2702491, INSERM, Pasteur; WO 96/02654, bioMerieux, Transgene; EP 0 710 724 Akzo; EP 0 724 016, bioMerieux; EP 0 751 147, Behringwerke; US 5,633,139, Res. Inst. Palo Alto; WO 97/27300, Innogenetics; US 5,665,542, US 5,686,575, Res. Inst. Palo Alto; WO 99/32633, Heska; JP 11225783, Yano; WO 99/61906, Abbott; WO 99/66043, Smithkline Beecham; JP 2000300278, Yano; WO 00/164243, Virsol)、最後にToxoplasma 遺伝子産物の抗原領域の単離および特徴(WO 03/080839, Kenton S.r.l.)を利用可能である(FR 2,226,468, Merieux; SU 533376, Veterinary Research Institute; JP 54044016, Nihon Toketsu Kanso)。

多くの研究から、T. gondiiの様々な異なる抗原タンパク質が見出され、これらの遺伝子配列も決定されてきた。

診断および治療目的の両方で最も興味のあるタンパク質のなかで、ワクチン形態において我々は言及すべきである：ミクロネームタンパク質(WO 03/080839, Kenton S.r.l. ; Beghetto et al., The Journal of Infectious Deseases, 2005, 191:637-645; Beghetto et al., International Journal for Parasitology, 2003, 33:163-173)；表面抗原SAG1 (またはP30) (WO 89/08700, Stanford University; WO 89/12683 Pasteur, INSERM; WO 94/17813, WO 96/02654, Transgene, bioMerieux; EP 0 724 016, WO 99/61906, US 5,962,654, Harning et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, May 1996, 355-357)およびSAG2(またはP22) (Parmley et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30, 1127-33);濃縮顆粒タンパク質GRA1(またはP24)(EP 0 301 961, Pasteur, INSERM; WO 89/05658, Transgene, Cesbron-Delauw, et al., 1989 P.N.A.S. USA 86, 7537-41)、GRA2 (または P28) (WO 93/25689, INSERM, Pasteur; US 5,633,139, US 5,665,542, US 5,686,575, Res. Inst. Palo Alto; Prince et al., Mol. Biochem. Parasitol., 34 3-14)、GRA4(Mevelec et al., Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-38)、GRA6(または P32) (FR 2,702,491, INSERM, Pasteur; Lecordier al., Mol. Biochem. Parasitol. 70, 85-94)、GRA7 (WO 99/61906, Abbott; Jacobs et al., Mol. Biochem. Parasitol. 91, 237-49)およびGRA3(Robben et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 17544-47)：ロプトリー抗原ROP1(またはP66)(US 5,976,553, U. Leland; EP 0 431 541, Innogenetics)およびROP2(またはP54)(Sharma et al., J. Immunol., 131, 377-83)。

上記引例に記載のとおり、該抗原は、発現ベクターにおいて組換えｃＤＮＡ技術を用いて得られた。例えば、抗原SAG1について、WO 98/08700では、ファージλgt11において既知の発現ベクターを使用している。WO 98/12683では、同じファージを使用し、独自のプラスミドまたはWO 96/02654のような特異的な発現カセットを調製することによってE. coliをトランスフェクトする。EP 0 724 016では、ペプチドのコンビナトリアル発現ライブラリィを用いてミモトープを得る。EP 0 301 961は、20 kDa 〜185 kDaの範囲の分子量を有する排出−分泌抗原を得る方法を説明している。WO 89/05658は、Toxoplasma 排出-分泌抗原に対する産生抗体によって認識される24 kDa タンパク質のエピトープを含有するタンパク質を説明するものである;このタンパク質は、発現ベクターを用いる細胞のトランスフェクションによって得られる。WO 03/080839では、T. gondiiタンパク質の抗原フラグメントを同定するためのファージディスプレイ技術を基にした方法、および診断および免疫学的剤としてのその使用を説明している。該抗原P28(GRA2)はUS 5,633,139で説明されており、それを得る方法はファージλ-gt11での発現によって行われる。該抗原P32(GRA6)は、親出願のFR 2,702,491に記載されており、US特許5,976,553においては抗原ROP1(P66)、EP 0 431 541、WO 99/57295およびWO 99/61906においてはP35(またはGRA8)、そして最近ではEP 0 431 541においてはP68が記載されている。

Yangら(Parasitol. Res., 2004, 92: 58-64)は、マウスにおいてT. gondiiに対する免疫を発生させるために、SAG1およびSAG2を含有するキメラタンパク質およびその使用を説明している。

中国特許番号11 94991Cでは、２つのtoxoplasma 抗原(GRA6およびp30)を含有する組換え融合タンパク質を説明する。この組換え融合タンパク質を基にしたアッセイがIgGおよびIgMを基にした研究において獲得感受性を持つということを示すデータは報告されていない。

最近の10年間に、いくつかの研究がT. gondii感染の血清学診断のために組換え抗原の使用を報告している。しかしながら、有望ではあるが、タキゾイト抗原を置換することが必要な組換え抗原を基にしたいずれのアッセイも、IgG-およびIgM-を基にした試験においてタキゾイト抗原を置換するに必要な全ての特徴を提示していないため、組換え産物を用いるイムノアッセイを医療目的に使用する前には、さらなる試験が必要であることを指摘している。

従って、この分野においてこの試験の主な目的は、組換え産物を基にした酵素結合イムノアッセイの性能を改良することであり、すなわち例えば、新生児／幼児における先天的トキソプラズマ症の早期診断を改善することである。

本発明の要約
組換え融合産物の形態において、Toxoplasma gondiiタンパク質の抗原領域の組合せは個々の抗原フラグメントの抗原特性を保持することが判った。即ち、こうして産生した対応するキメラタンパク質は、診断および治療目的に使用できる。

診断剤としての前記キメラ抗原およびそれらを含有する関連のある診断補助物の使用、例えば酵素結合イムノアッセイまたはキット形態における使用は、本発明の別の対象を構成する。

本発明の別の目的は、上記キメラ抗原をコードする遺伝子配列、医薬物としてのそれらの使用、特にToxoplasma gondii感染の予防および治療、例えば遺伝子治療としての使用に関する。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において上記キメラ抗原の配列とハイブリダイズする遺伝子配列を含む。

本発明の別の目的は、感染の予防および治癒に有用である医薬品としての、特にワクチン形態における、キメラ抗原の使用である。本発明のワクチンは、ヒトおよび他の動物(特にブタ、ネコ、ヒツジ)における使用に適当である。

これらおよび他の対象は、下記において詳細に、また実施例および図によっても詳細に説明される。

本発明の詳細な説明
即ち、本発明の主な目的は、Toxoplasma gondii 遺伝子産物の様々な抗原領域の融合により得られた組換えキメラ抗原の提供および選択的な診断および治療方法を開発するために、このように得た該組換えタンパク質の使用である。

上記に報告した文献において知られる抗原フラグメント抗原または他の型を超える本発明の主な利点は下記の点であり、これら抗原が感染の検出のためのサンプル血清に対する診断的イムノアッセイに使用される場合に明確である：
−全Toxoplasma gondii 抗原の使用に関して、溶解した全細胞抽出物としてパラサイトから調製し、キメラ組換え抗原は、他の非タンパク質物質の存在による非特異的反応を避けるという利点および良好な再現性を提供するという利点を有している。さらに、パラサイトのいくつかの天然タンパク質抗原は不溶性であり、その結果として、T.gondiiの溶解した全細胞抽出物を用いる市販アッセイではほとんど提示されない。

−一つの抗原領域または一つの抗原フラグメントの使用に関して(WO 03/080839に記載したとおり)、該組換えキメラ抗原は、アッセイにおいてそれらを使用してアッセイの感受性を改良する利点を示している。言い換えると、その使用により、偽陰性応答の発生が低下するかまたは消滅する。

−Ａ）混合物または一つの抗原領域の収集物の使用に関して(WO 03/080839において想定したような)、この利点は少なくとも２つ存在する。産業的利用性および製造の観点からすると、各々一つのフラグメントを別々に産生し、続いてそれらを経済的かつ再現性のある方法によって組み立てるよりもむしろ３つまたはそれ以上の抗原領域を含有する一つの改変した構築体を産生することの方がより扱い易い。２点目は、既に前記したとおり、本発明のキメラ組換え抗原の使用により、アッセイの感受性が改善されることである。

これらおよびその他の利点は、実施例の章に示されている。

特に、本発明は、Toxoplasma gondiiの少なくとも３つの異なる抗原領域で該融合部を含有するキメラ組換え抗原に関し、前記抗原領域はＢ細胞エピトープであって、これはToxoplasma gondii-特異的抗体と結合する。好ましくは、Toxoplasma gondii-特異的抗体は、Toxoplasma gondiiに感染している患者の血清から抽出される。

より具体的には、本発明はキメラ抗原を含む。ここで３つの異なる抗原領域は、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：33、配列番号：34、配列番号：35、配列番号：36、配列番号：37、配列番号：38、配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41および配列番号：42からなるからなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ。上記群における好ましい配列は、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10および配列番号：12である。

例えば、本発明のキメラ抗原は、配列番号：28のアミノ酸配列または配列番号：30のアミノ酸配列または配列番号：32のアミノ酸配列を含む。

本発明のキメラ抗原は、既知の方法を用いて設計され得る。該融合部は、直接的であってもよく(１つのアミノ酸配列のＣ末端は、一つの共有結合を介してもう一つのＮ末端に結合される)、またそれらはフレキシブルリンカードメイン（例えばヒトＩｇＧのヒンジ領域）または低分子アミノ酸（例えばグリシン、セリン、スレオニンまたはアラニン）からなるポリペプチドリンカーを様々な長さおよび組合せにて用いることも可能である。例えば、該リンカーは、特定の間隔にてセリンまたはスレオニンにより遮えぎられたポリグリシン・リピートであり得る。好ましくは、該リンカーは、３つのグリシン残基および２つのセリン残基によって構成され、アミノ酸配列Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SGGGSリンカー)を示す。

さらに、本発明のキメラ抗原は、金属キレートクロマトグラフィーによりおよび／またはエピトープに対する抗体を利用することにより迅速に精製できるように、またウェスタンブロッティング免疫沈降またはバイオアッセイにおける活性枯渇/ブロッキングで検出できるように、His-His-His-His-His-His (His6)によってタグ化され得る。

本発明の別の対象は、上記に定義したとおりのキメラ抗原をコードするヌクレオチド配列である。本発明の好ましい実施形態に従って、かかるヌクレオチド配列は、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9および配列番号：11からなる群から選択される少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態に従って、かかるヌクレオチド配列は、配列番号：27のヌクレオチド配列または配列番号：29のヌクレオチド配列または配列番号：31のヌクレオチド配列を含む。

また、本発明の範囲に含まれるものは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記したあらゆる配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、ならびにかかるハイブリダイズしたヌクレオチド配列によってコードされた対応するキメラ組換え抗原である。

本発明のキメラ抗原は、適切な発現ベクターを用いる、原核または真核発現系においてクローニングおよび発現によって調製され得る。当業者に既知のいずれの方法をも用い得る。

例えば、本発明の抗原をコードしているＤＮＡ分子は、当業者にはよく知られた技術により適切に構築された発現ベクター中に挿入される(Sambrook et al, 1989を参照されたい)。かかるベクターは、本発明の別の対象である。

所望のタンパク質(この場合ではキメラ抗原)を発現し得るために、発現ベクターは、遺伝子発現およびタンパク質の産物を可能にするような方法において所望のタンパク質をコードしているＤＮＡと結合した転写および翻訳調節情報を含有する特異的なヌクレオチド配列も含むべきである。まず、転写されるべき遺伝子については、ＲＮＡポリメラーゼによって認識し得るプロモーターにより先行され、ポリメラーゼと結合し、このようにして転写過程を開始するべきである。使用において様々なかかるプロモーターが存在し、様々な能率(強力および弱いプロモーター)にて機能する。

真核宿主に対して、様々な転写および翻訳調節配列は、宿主の性質によって用いられ得る。それらは、ウイルス起源物、例えばアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアン・ウイルス等から得ることができ、調節シグナルが特定遺伝子と関連している場合に、高い発現レベルを有する。例示としては、ヘルペスウイルスのTKプロモーター、SV40初期プロモーター、酵母gal4遺伝子プロモーター等である。遺伝子の発現が調節されるように、抑制および活性化を可能にする転写開始調節シグナルが選択され得る。全てのこのような宿主は本発明のさらなる対象である。

本発明のキメラ抗原をコードする核酸分子は、組合せた核酸分子が融合タンパク質をコードするように非相同配列に連結され得る。このように組み合わせた核酸分子は、本発明の実施形態に包含される。例えば、それらを、アフィニティークロマトグラフィーの一工程のみによってキメラ抗原を精製できるタンパク質をコードしているＤＮＡと連結させ得る。この連結／融合タンパク質は、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)であり、GSTタンパク質のカルボキシ末端で融合産物を生成させことができる。形質転換したE. coli細胞の細胞質で発現した対応する組換えタンパク質を、グルタチオン−セファロース樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。

本発明のキメラ分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、操作可能に結合された転写および翻訳調節シグナルを持つベクターに挿入され、宿主細胞中へ所望の遺伝子配列を組み込むことが可能である。導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された該細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１または１以上のマーカーを導入することによって選択され得る。また、該マーカーは、栄養要求宿主に対する光合成栄養、農薬耐性、例えば抗生物質、または重金属、例えば銅等を提供する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列と直接結合され得るか、または同一細胞にコトランスフェクションによって導入され得る。さらなるエレメントは、本発明のタンパク質の至適合成に必要とされ得る。

特定プラスミドまたはウイルスのベクターを選択する際に重要なファクターには、次のものが包含される：ベクターを含有するレピシエント細胞が該ベクターを含有しないこれらのレピシエント細胞から認識され、選択され得る容易性；特定宿主中で所望されるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを"行き来"させ得ることが望ましいかどうか。

構築体を含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために一旦調製されると、該ＤＮＡ構築体は、多様な適切な手段：形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質融合、電気泳動、カルシウムリン酸塩沈殿、直接的なマイクロインジェクション等のいずれかによって適切な宿主細胞に導入され得る。

宿主細胞は、原核または真核細胞の何れかであってよい。真核宿主の例示は、哺乳動物細胞、例えばヒト、サル、マウスおよびチャイニーズ・ハムスターの卵巣(ＣＨＯ)細胞である。これらの宿主細胞における発現は、タンパク質分子への、正しい部位での正しいホールディングまたはグリコシル化を包含する翻訳後の修飾を提供する。酵母細胞もまた、グリコシル化を包含する翻訳後のペプチド修飾を実施できる。酵母中の所望のタンパク質の産物に利用され得る強力なプロモーター配列およびプラスミドの高コピー数を利用できる数多くの組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローン化哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド(即ち、前ペプチド)を分泌する。原核生物宿主の例示は、細菌、例えばEscherichia coliである。

ベクターの導入後、宿主細胞は選択培地中で培養され、これをベクター含有細胞の増殖のために選択する。クローン化遺伝子配列の発現により、所望のタンパク質が産生する。

組換え抗原の精製は、この目的のための既知の方法、即ち抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等を包含する従来方法のいずれか一つによって実施される。本発明の抗原を精製するために好ましく使用され得るさらなる精製方法は、標的タンパク質を結合するモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーであって、これはカラム内に含むゲルマトリックス上で作製され、固定される。組換えタンパク質を含有する不純な調製物をカラムに通過させる。該抗原は、特異抗体によってカラムに結合され、一方で不純物は通過する。洗浄後、ｐＨまたはイオン強度の変化により、該抗原がゲルから溶出される。

本発明の別の態様は、本発明のヌクレオチド配列を含有するベクターで形質転換した宿主細胞を培養すること、所望の生成物を単離することを含む、上記したようなキメラ抗原の組換え産物のための方法である。

本発明の別の目的は、上記融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列、ならびにヌクレオチド配列実質同一物を含むＤＮＡ分子である。

"ヌクレオチド配列実質同一物"とは、遺伝子コードの縮重により、また所定のアミノ酸配列をコードする、あらゆる他の核酸配列を包含する。

本発明の別の対象は、得られた抗原が同じ生物学的活性、即ちパラサイトに対する抗体との結合能を維持する限り、高ストリンジェントまたは中程度のストリンジェントな条件下で本発明のキメラ抗原をコードしているヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列である。

明細書に使用したような用語"ハイブリダイゼーション"とは、水素結合による、その各々と２つの核酸分子の会合を示す。通常、一つの分子は固体支持体に固定され、もう一つは溶液中に遊離している。そのため、この２つの分子は、水素結合に適した条件下で互いに接触する位置に存在し得る。該結合に影響を与えるファクターは次のものを包含する：溶媒の型および容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；攪拌；固体支持体と液相分子の非特異的結合を遮断する試薬(Denhardt's試薬またはBLOTTO)；該分子の濃度；分子の会合速度を増加させる化合物の使用 (デキストランスルフェートまたはポリエチレングリコール)；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。

ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション実験において使用した温度、ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンのモル濃度およびホルムアミドの％の関数である。任意の所定の一連の条件に関連するストリンジェンシーの程度を決定するために、最初に、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリドの融解温度Ｔｍとして表現される１００％同一のハイブリドの安定性を決定するためにMeinkoth et al. (1984)の式を使用する：Ｔｍ＝８１.５℃＋１６．６(LogM)＋０.４１(％ＧＣ)-０.６１（％form)−５００/Ｌ、ここでＭは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のＧおよびＣのヌクレオチド％であり、％formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの％であって、Ｌは塩基対におけるハイブリドの長さである。各々１℃毎に、Ｔｍは１００％同一のハイブリドに対して計算した値から低下し、許容されるミスマッチの量は約１％増加される。即ち、特定の塩およびホルムアミドの濃度で、任意の所定のハイブリダイゼーション実験に使用したＴｍがMeinkothの式に従って１００％ハイブリドについて計算したＴｍの１０℃以下である場合、約１０％のミスマッチが存在したとしてもハイブリダイゼーションはおこる。

本明細書中で使用したように、高ストリンジェントな条件とは、約１５％までの配列相違に耐容である条件であり、一方で中程度のストリンジェントな条件とは、約２０％までの配列相違に耐容である条件である。限定しないが、高ストリンジェントな(ハイブリドの計算されたＴｍの１２-１５℃以下)および穏やかなストリンジェントな(ハイブリドの計算されたＴｍの１５-２０℃以下)条件の例示は、ハイブリドの計算したＴｍ以下の適切な温度で２xＳＳＣの洗浄溶液(標準的なクエン酸生理食塩水)および０.５％ＳＤＳを使用する。この条件の最大のストリンジェンシーは、主に洗浄条件、特に使用したハイブリダイゼーション条件が安定性の低いハイブリドを安定なハイブリドと共に形成させる条件かどうかによる。高いストリンジェンシーでの洗浄条件は、その後安定でないハイブリドを除去する。上記したような高ストリンジェントから穏やかなストリンジェントな洗浄条件を用いて使用され得る共通するハイブリダイゼーション条件は、５x Denhardt's試薬、０．５％ＳＤＳ、おおよそＴｍ２０℃〜２５℃以下の温度で変性断片化されたサーモン精子のＤＮＡ（１００μg/ml）、６xＳＳＣ(または６xＳＳＰＥ)の溶液におけるハイブリダイゼーションである。混合プローブを用いる場合、ＳＳＣに代えてテトラメチル塩化アンモニウム(ＴＭＡＣ)を使用することが好ましい(Ausubel, 1987-1998)。

該用語"核酸分子"は、ＤＮＡおよびＲＮＡのアナログ、例えば修飾されたバックボーンを含有するものも包含する。

本発明の核酸分子は、本発明の抗原をコードしている核酸分子と部分的に相補的であって、そのためコード化核酸分子(ハイブリダイゼーション)とハイブリダイズするアンチセンス分子をも包含する。かかるアンチセンス分子、例えばオリゴヌクレオチドは、当業者には既知の方法によって、本発明のポリペプチドをコードしている標的核酸を認識し、特異的に結合し、転写を防止するように設計され得る[例えば、Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10,435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56,560 (1991); Lee et al., Nucleic acids Res 6, 3073 (1979); Cooneyetal., Science 241, 456(1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)を参照されたい]。

本明細書で使用した用語に従って、化合物[Ｘ]を含有する組成物は、該組成物中の総Ｘ＋Ｙが少なくとも８５重量％がＸである場合に、不純物[ここではＹ]"を実質的に含まない"。好ましくは、Ｘは該組成物中のＸ＋Ｙの全量のうち、少なくとも約９０重量％を含み、より好ましくは少なくとも約９５％、９８％またはさらに９９重量％を含む。

本発明の別の態様は、医薬品としての上記したキメラ抗原の使用である。具体的には、本発明の主な対象の一つは、Toxoplasma gondii感染の予防または処置のための医薬品製造のための活性な成分としてのキメラ抗原の使用である。

遺伝子治療の場合において、本発明の別の対象は、医薬品としての本発明の抗原をコードするヌクレオチド配列の使用であって、特にToxoplasma gondii感染の処置および予防に有用な医薬品製造のための使用である。

医薬組成物は、治療上有効量の本発明のキメラ抗原または対応するヌクレオチド配列を含むのが好ましい。従って、本発明のキメラ抗原は、Toxoplasma gondii感染の予防または処置のためのワクチンとして作用し得る。

医薬品またはワクチンの調製が、さらなる引用文献に対して一般的な知識のフレームワーク内にある治療用途については、本明細書において引用した特許文献、特にBeghetto et al., The Journal of Infectious Deseases, 2005, 191:637-645を参照されたい。

本明細書において使用したように該用語"治療上有効量"とは、標的疾患または症状を、処置、軽減または予防するため、または検出可能な治療効果または予防効果を示すために必要とされる治療剤の量を示す。あらゆる化合物について、治療上有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、例えば新生物細胞、または動物モデルにおいて、通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタのいずれかにおいてまず評価され得る。

動物モデルもまた、投与に関する適切な濃度範囲および経路を決定するために使用され得る。かかる情報は、その後有用な用量およびヒトへの投与経路を決定するために使用され得る。

ヒト患者に対して正確な有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康、年齢、体重、対象の性別、食生活、投与時間および頻度、薬剤の組合せ、反応感受性ならびに治療に対する耐性/応答に依存する。この量は、通常の実験によって決定され得るし、医師の判断の範囲にある。一般的に、有効な用量は、０.０１ mg/kg〜５０mg/kg、好ましくは０．０５mg/kg〜１０mg/kgである。組成物は、患者に個々に投与され得るか、または他の薬剤、剤またはホルモンと併用して投与され得る。

医薬組成物は、治療薬剤の投与のために医薬的に許容し得る担体もまた含有し得る。かかる担体は、抗体および他のポリペプチド、遺伝子および他の治療薬剤、例えばリポソームを包含する、ただし該担体それ自身が、組成物を受容する個体に対して有害な抗体産生を誘導しない場合に限る。

適当な担体は、大きく、徐々に代謝されるマクロ分子、例えばタンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコン酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子であってもよい。

医薬上許容し得る塩も使用され得る；無機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など。医薬上許容し得る担体の詳細な説明は、Remington's Pharmadeutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J.1991)より得られる。

治療組成物において医薬上許容し得る担体は、液体、例えば水、生理食塩水、グリセリンおよびエタノールをさらに含有し得る。また、助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ調整物質等も、かかる組成物中に存在し得る。かかる担体は、患者による摂取のために、錠剤、ピル、糖衣錠（dragees）、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として医薬組成物を製剤することを可能にする。

製剤されてから、本発明の該組成物は、患者に直接投与され得る。処理されるべき患者は動物であり得る；特にヒト患者を処理することもできる。

この発明において利用される医薬組成物は、次のものに限定しないが、経口、静脈、筋肉内、動脈内、骨髄内、心室内、経皮または経皮的用途(例えばW098/20734を参照されたい)、皮下、腹腔内、経鼻的、経腸、局所的、舌下用、膣内または直腸的手段を包含するあらゆる数の経路によって投与され得る。遺伝子ガンまたはハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。通常、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかで注射物質として調製され得る；液体ビヒクル中で溶液または懸濁液として適する固体形態も注射前に調製され得る。

組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内注射によって達成されるか、または組織の間質空間に送達される。該組成物は創傷へ投与されてもよい。

投薬処置は、単回投薬計画または多回投薬計画であってもよい。

Toxoplasma-gondii感染に罹患している哺乳動物を処置する方法は、上記のようなワクチンの治療上有効量を投与することを含んでおり、本発明の一態様を示すものである。

本発明のさらなる対象は、Toxoplasma gondii 感染の診断のための、特に感染時期の診断のための、活性な剤として上記したようなキメラ抗原の使用である。

また、少なくとも１つのキメラ抗原を含有するToxoplasma gondii 感染の診断のためのキットは、本発明の一部である。かかるキットは、急性および／または慢性Toxoplasma gondii感染の診断に有用であり得る。

本発明のキメラ抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を用いる事実上あらゆるアッセイ形式に用いられ得る。これらアッセイの共通する全ての特徴は、該抗原が成分中に存在するあらゆるかかる抗体と結合することが可能である条件下で、抗体を含有する疑いのある身体成分と接触されることである。このような条件は、通常、過剰抗原を用いる生理学的な温度、ｐＨおよびイオン強度であろう。試験標本と抗原とのインキュベーションの後に抗原を含む免疫性複合体の検出を行う。

イムノアッセイの設計は、かなりのバリエーションをもたらし、多くの形式が当業者に知られている。プロトコールは、例えば固体支持体または免疫沈殿を使用し得る。大部分のアッセイは、標識した抗体またはポリペプチドの使用を包含する；該標識は、例えば酵素分子、蛍光性分子、化学発光分子、放射性分子または色素分子であり得る。免疫複合体由来のシグナルを増幅するアッセイも知られている；この例示には、ビオチンおよびアビジン、酵素標識化および介在性免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイを利用するアッセイがある。

イムノアッセイは、限定するものではないが、異種または同種形式において、また標準的または競合型のものであってもよい。異種形式では、ポリペプチドは、通常固体マトリックスに結合されるか、またはインキュベーション後のポリペプチドからのサンプルを分離できるようにサポートされる。

使用され得る固体支持体の例示には、ニトロセルロース(例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態)、塩化ポリビニル(例えば、シート類またはマイクロタイターウェル類)、ポリスチレンラッテクス(例えば、ビーズ類またはマイクロタイタープレート、ポリビニリジンフッ化物(Immulon（商標登録）として知られる)、ジアゾ化された紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。例えばDynatech Immulon^TM1 または Immulon^TM2 マイクロタイタープレートまたは0.25インチポリスチンレンビーズ (Precision Plastic Ball)は、異種形式で使用され得る。抗原ポリペプチドを含有する固体支持体は、通常、試験サンプルからそれを分離した後、結合抗体の検出前に洗浄される。

標準的および競合形式の両方が当分野で知られている。

同種形式では、試験サンプルは、溶液中で抗原を組み合わせてインキュベートされる。例えば、形成されるあらゆる抗原-抗体複合体を沈殿させるという条件下であり得る。これらのアッセイに対する標準的および競合形式の両方が当分野で知られている。

標準的形式では、抗体-抗原複合体を形成する抗体の量は直接追跡される。これは、抗Toxoplasma gondii抗体上のエピトープを認識する標識された抗−異種(例えば、抗ヒト)抗体が、複合体形成が原因で結合するかどうかを決定することによって達成され得る。競合形式においては、サンプル中の抗体の量は、複合体中の標識された抗体(または他の競合リガンド)の既知の量の結合に対する競合効果を追跡することによって推定される。

抗Toxoplasma gondii 抗体(または、競合アッセイの場合には競合抗体の量)を含んで形成した複合体は、この形式により、様々な既知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の非標識抗体は、標識と共に複合体を形成した抗異種Igのコンジュゲート(例えば、酵素標識）を用いて検出され得る。

免疫沈殿または凝集アッセイ形式においては、キメラ抗原と抗体との間の反応により、溶液または懸濁液から沈殿し、沈殿物の可視層またはフィルムを形成するネットワークを形成する。抗Toxoplasma gondii 抗体が試験標本内に存在しなければ、可視沈殿物は形成されない。

本発明のキメラ抗原は、通常これらの免疫アッセイにおいて使用するために、キットの形態で梱包される。そのキットは、通常、抗原(固体マトリックスとすでに結合しているか、またはマトリックスとそれらを結合するための試薬とを別に)、コントロール抗体調製物(陽性および／または陰性)、アッセイフォーマットが同じものを必要とする場合には標識抗体および、標識が直接シグナルを生成しない場合にはシグナル生成試薬(例えば、酵素基質)の組合せ物を別々の容器に含有する。アッセイを行うための指示書(例えば、書き込み、テープ、VCR、CD-ROM等)は、通常キットに包含される。

そのため、本発明の対象である診断キットは、当業者にはよく知られている。例示のために、上記に引用した特許文献を参照し、これにさらなる文献としてUS 6,265,176, WO 01/63283およびWO 03/080839を追加する。

本発明は、明細書の実施例および図を用いてより詳細に説明される。

（図面の簡単な説明）
図１は、細菌の発現ベクターpGEX-SNのプラスミドマップである。

図２は、キメラ抗原の図式表示である。
T. gondii遺伝子MIC2、MIC3、SAG1、GRA3ｌ、GRA7およびM2APのタンパク質フラグメントを各々コードしているクローンTx-2.a、Tx-1.16、Tx-4.18、Tx-15.11、Tx-1.11およびTx-11.bのＤＮＡ配列を、GST-EC2、GST-EC3およびGST-EC4 融合タンパク質の構築に使用した。

図３は、E. coli 細胞におけるT. gondii キメラ抗原の発現である。
精製したGST-EC2、GST-EC3およびGST-EC4融合タンパク質のSDS-PAGE分析。組換えタンパク質を、12%アクリルアミドゲルで電気泳動(0,003 mg/lane)に供した。MWは分子量マーカー。

図４は、キメラ抗原の生物工学的特徴である。
精製したGST-EC2のHPLC 分析は、TSK G4000 SW-XLカラムを用いるゲル濾過によって行った。

図５は、キメラ抗原内の個々のタンパク質フラグメントの抗原特性である。
個々のTx-2.a、Tx-1.16、Tx-4.18、Tx-15.11、Tx-1.11およびTx-11.b抗原フラグメント、およびEC2、EC3およびEC4キメラ抗原と、T. gondiiに感染した個体由来の血清サンプルとの免疫反応性。血清は、全試験標本（血清）としてまたは抗原フラグメント(Tx-1.16/Tx-4.18 枯渇、Tx-2.a/Tx-4.18枯渇など)の組合せ物に対する特異的抗体の枯渇後に使用された。

図６は、キメラ抗原とToxoplasma-特異的IgM抗体との免疫反応性である。
Ａ）IgM Rec-ELISA 分析は、ビオチン標識したGST-EC2およびGST-EC3抗原の濃度を変えて、Toxoplasma-特異的IgM-陽性（Ｃ＋)およびIgM-陰性(Ｃ−)血清サンプル(血清希釈、1:100)を用いて行った。

Ｂ）IgM Rec-ELISA 分析は、Toxoplasma-特異的IgM-陽性(1:100から1:6400まで）およびIgM-陰性(コントロール血清、希釈1:100)血清サンプルの連続希釈物により行い、ビオチン標識 GST-EC2およびGST-EC2/GST-EC3の混合物を用いてアッセイした。

図７は、キメラ抗原の長期安定性である。
IgM Rec-ELISA分析は、ビオチン標識したGST-EC2およびGST-EC3抗原を用いて行った。これは、様々な時間間隔（日数)にて＋４℃で維持されている。結果を、Toxoplasma-特異的IgM陽性(ＯＤＣ＋)とIgM-陰性（ＯＤＣ−）血清サンプルを用いて測定した光学密度の割合として表現した。

実施例
下記の表Ｉは、実施例の方法によって得られ、このＤＮＡ配列を組換えToxoplasma gondiiキメラ抗原の構築体に使用した：

配列Tx-15.11は、遺伝子GRA3(Bermudes et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1994, 68:247-257)のフラグメントを構成する。前記クローンはアミノ酸配列 AALGGLAADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGVQEATAPGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPG(配列番号：2)を有し、キメラ抗原におけるその使用は本発明に包含される。

配列Tx-1.11は、抗原GRA7(Bonhomme et al., J. Histochem. Cytochem., 1998, 46:1411-1421)のフラグメントを構成する。前記クローンはアミノ酸配列ATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHF (配列番号：4)を有し、キメラ抗原におけるその使用は本発明に包含される。

配列Tx-1.16は、MIC3 遺伝子(Garcia-Reguet et al., Cellular Microbiol., 2000, 2:353-364)のフラグメントを構成する。前記クローンはアミノ酸配列 RRTGCHAFRENCSPGRCIDDASHENGYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISASSCKCD (配列番号：6)を有し、キメラ抗原におけるその使用が本発明に包含される。

配列Tx-4.18は、抗原SAG1(Burg et al., J. Immunol., 1988, 141:3584-3591)のフラグメントを構成する。前記クローンはアミノ酸配列 PSVVNNVARCSYGADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKDILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGCTGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAKSA (配列番号：8)を有し、キメラ抗原におけるその使用は本発明に包含される。

配列Tx-2.aはMIC2遺伝子(Wan et al, Mol. Biochem.Parasitol., 1997, 84:203-214) フラグメントを示す。前記クローンはアミノ酸配列 PQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWV (配列番号：10)を有し、キメラ抗原におけるその使用は本発明に包含される。

配列Tx-11.bは、M2AP遺伝子(Rabenau et al., Mol. Microbiol., 2001, 41:537-547)の異なるフラグメントを示す。前記クローンはアミノ酸配列NEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLGVSVSPDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESES(配列番号：12)を有し、キメラ抗原におけるその使用は本発明に包含される。

キメラ抗原の構築体
EC2 タンパク質生成物は、ＤＮＡ配列Tx-2.a, Tx-1.16 およびTx-4.18を含有するキメラ分子である。

配列番号：9を、オリゴヌクレオチドK551(5'-GGACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCC-3')およびK553 (5'-CATCCAGTCCTGCTACCGCCACCAGACCAGACGCCACATCC AGC-3')を用いてクローンTx-2.aのＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。オリゴヌクレオチドK553 は、配列Tx-2.aおよびTx-1.16.を連結するリンカーSGGGSをコードする配列を含有する。ＰＣＲ条件は、20サイクルに対して94℃で30"、 50℃で30"および72℃で60"であった。

配列番号：5を、オリゴヌクレオチドK552(5'-GTGGCGTCTGGTCTGGTGGCGGTAGCAG GACTGGATGTCATGCC-3')およびK555(5'-TGACGACCGAGCTAC CGCCACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATG-3')を用いてクローンTx-1.16のＤＮＡに対するテンプレートとして使用した。オリゴヌクレオチドK555は、配列Tx-1.16 およびTx-4.18を連結するリンカーSGGGSをコードする配列を含有する。ＰＣＲ条件は、20サイクルに対して94℃で30"、50℃で30"および72℃で60"であった。

配列番号：7を、オリゴヌクレオチドK554 (5'-ATGCGATAACTCTGGTGGCGG TAGCTCGGTCGTCAATAATGTCGC-3') およびK556 (5'-CCGCGGCC GCTAGCCGATTTTGCTGACCCTG-3')を用いてクローンTx-4.18のＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして用いた。ＰＣＲ条件は、20サイクルに対して94℃で30"、50℃で30"および72℃で60"であった。

このＰＣＲ産物を、"Qiagen精製キット"（Qiagen, CA, USA)を用いて精製した。配列番号：9および配列番号：5のＤＮＡ増幅産物（25 ng）を一緒に混合し、オリゴヌクレオチドK551 およびK555を用いてＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。ＰＣＲ条件は、20サイクルに対して94℃で30"、50℃で30"および72℃で60"であった。得られたＤＮＡ増幅物（25 ng）を、"Qiagen 精製キット"(Qiagen, CA, USA)で精製し、次いで、配列番号：4のＤＮＡ増幅生成物（25 ng)と混合した。最終的に、ＤＮＡ混合物をオリゴヌクレオチドK551およびK556を用いてＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用し、次いで20サイクルに対して94℃で30"、50℃で30"および72℃で90"のＰＣＲ条件に供する。

EC３タンパク質生成物は、ＤＮＡ配列Tx-15.11、Tx-1.11およびTx-11.bを含有するキメラ分子である。

配列番号：1を、オリゴヌクレオチドK563(5'-GGACTAGTCGGCTGG CTGCCTTGGGAGGCCTTG-3')およびK565(5'-GCCGCGGTAGCACTACCG CCACCAGACAAACCAGGGCGATCTGTG-3')を用いてクローンTx-15.11のＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。オリゴヌクレオチドK565は、配列Tx-15.11およびTx-1.11を結合するリンカーSGGGSをコードする配列を含有する。ＰＣＲプロトコールは、20サイクルに対して94℃で30"、 48℃で30"および72℃で60"である。

配列番号：3を、オリゴヌクレオチドK564(5'-GCCCTGGTTTGTCTGGTGGCGGTAG TGCTACCGCGGCCACCGCG-3')およびK567(5'-CCGGTTCGTTACTACCG CCACCAGAGAAATGAACTTCTTCTTGTTC-3') を用いてクローンTx-1.11のＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。オリゴヌクレオチドK567は、配列Tx-1.11およびTx-11.bを連結するリンカーSGGGSをコードしている配列を含有する。ＰＣＲプロトコールは、20サイクルに対して94℃で30"、48℃で30"および72℃で60"であった。

配列番号：11を、オリゴヌクレオチドK566 (5'-GAAGTTCATTTCTCTGGTGGCG GTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAG-3')およびK568 (5'-CCGCGGCCGC AGATTCAGACTCAGACGGAC-3')を用いてクローンTx-11.bのＤＮＡ増幅のためのＤＮＡのテンプレ−トとして使用した。ＰＣＲプロトコールは20サイクルに対して94℃で30"、45℃で30"および72℃で60"であった。

ＰＣＲ産物を、"Qiagen 精製キット"(Qiagen, CA, USA)によって精製した。配列番号：1および配列番号：3のＤＮＡ増幅産物（25 ng）を一緒に混合し、オリゴヌクレオチドK563およびK567を用いてＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。ＰＣＲプロトコールは、30サイクルに対して94℃で30"、45℃で30"および72℃で60"であった。得られるＤＮＡ増幅（25 ng）を精製し、次いで配列番号：11のＤＮＡ増幅産物（25 ng）で混合した。最終的に、ＤＮＡ混合物を、オリゴヌクレオチドK563およびK568を用いることによってＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用し、30 サイクルについて94℃で30"、45℃で30"および72℃で180"のＰＣＲ条件に供した。

EC4タンパク質生成物は、ＤＮＡ配列Tx-2.a、Tx-1.16およびTx-11.bを含有するキメラ分子である。

配列番号：9を、オリゴヌクレオチドK551およびK553を用いてクローンTx-2.aのＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。

配列番号：5を、オリゴヌクレオチドK552およびK572(5'-CGTTACTACCGC CACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATGA-3')を用いてクローンTx-1.16のＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。該オリゴヌクレオチド K572は、配列Tx-1.16およびTx-11.bを連結するリンカーSGGGSをコードする配列を含有する。

配列番号：11を、オリゴヌクレオチドK571(5'-TAACTCTGGTGGCGGTAGT AACGAACCGGTGGCCCTAGC-3')およびK568を用いてクローンTx-11.bのＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。

ＰＣＲ産物を、"Qiagen 精製キット"(Qiagen, CA, USA)を用いることによって精製した。配列番号：9および配列番号：5のＤＮＡ増幅産物（25 ng）を一緒に混合し、オリゴヌクレオチドK551およびK572を用いてＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。得られるＤＮＡ増幅物（25 ng）を精製し、次いで配列番号：11のＤＮＡ増幅生成物（25 ng）と混合した。最終的に、ＤＮＡ混合物を、オリゴヌクレオチドK551およびK568を用いることによってＤＮＡ増幅のためのテンプレートとして使用した。EC4の構築体に対するＰＣＲ条件は、EC2およびEC3構築体に使用したものと同一であった。

下記の表２は、実施例の方法により、EC2、EC3およびEC4 キメラ抗原のＤＮＡ配列を示す：

キメラタンパク質EC2は、アミノ酸配列TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHAFRENCSPGRCIDDASHENGYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISASSCKCDNSGGGSSVVNNVARCSYGADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKDILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGCTGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAKSASGR (配列番号：28)を有しており、複数のToxoplasma gondii タンパク質フラグメントを含有する組換え抗原としてのその使用は本発明に包含される。

キメラタンパク質EC3は、アミノ酸配列 TSRLAALGGLADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGVQEATAPGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPGLSGGGSATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFSGGGSNEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLGVSVSPDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESESAAA (配列番号：30)を有しており、複数のToxoplasma gondiiタンパク質フラグメントを含有する組換え抗原としてのその使用は、本発明に包含される。

キメラタンパク質EC4は、アミノ酸配列 TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHAFRENCRPGRCIDDASHENGYTCECPTWYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISASSCKCDNSGGGSNEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLDVSVSPDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESESAAA (配列番号：32)を有しており、複数のToxoplasma gondii タンパク質フラグメントを含有する組換え抗原としてのその使用は、本発明に包含される。

E. coli細胞の細胞質中のGSTを有する融合産物としてのキメラ抗原の発現に関するＤＮＡベクターの構築
EC2、EC3およびEC4キメラタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、タンパク質グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)を有する融合産物としてクローニングし、それらの特異性および選択性を決定する目的のために、細菌細胞の細胞質における可溶性タンパク質として発現させた。EC2、EC3およびEC4(配列番号：27、29および31各々)のＤＮＡ配列を、制限酵素 SpeIおよびNotIを用いて消化した。消化したＤＮＡを、SpeIおよびNotIエンドヌクレアーゼを用いて予め消化したベクターpGEX-SNにクローニングし(Minenkova et al., International Journal of Cancer, 2003, 106:534-44)、GSTタンパク質のカルボキシ末端で融合産物を作製した。得られたプラスミドを使用して、標準的プロトコールにしたがってコンピタントE.coli 細胞を形質転換した(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)。

組換えキメラ抗原の生物学的特徴
組換えタンパク質GST-EC2、GST-EC3およびGST-EC4を、形質転換したE. coli 細胞の細胞質で発現させ、製造者の指示書に従ってグルタチオン−セファロース樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)。タンパク質純度および濃度を、SDS-PAGE(ナトリウムドデシルスルフェート-ポリ-アクリルアミドゲル電気泳動)分析およびブラッドフォードアッセイにより各々評価した。アフィニティー精製組換え産物を、ＰＢＳで透析し、ＰＢＳを用いて1 mg/mlの濃度で希釈し、-20℃で使用するまで貯蔵した。精製産物の収量は、キメラ抗原 GST-EC2、GST-EC3およびGST-EC4各々について細菌培養物1リットルあたり、8 mg、5 mgおよび4 mgであった。組換えタンパク質を、次に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に供した。この目的のために、ゲル濾過を、TSK G4000 SW-XL HPLC-カラムを用いて、30μlの各サンプル(タンパク質濃度、2mg/ml)を該カラムに注入して、1 ml/分(移動相:KH₂PO₄ 0.05 M;NaCl 0.3 M pH 7.0)の流速にておこなった。HPLC分析からの結果は、キメラ抗原GST-EC2、GST-EC3および GST-EC4が、各々110.4、152.6および130 kDa(Da、ダルトン)の分子量を有するダイマー形態にある均質産物として精製したことを示した(GST-EC2のHPLC分析である図4は例として示される)。高分子量のタンパク質凝集体は、全ての精製タンパク質の調製物中には存在しなかった。

T. gondii感染個体の血清由来のIgG抗体とキメラ組換え抗原との免疫反応性：IgG Rec-ELISA
GST融合産物のELISA性能を、被覆緩衝液中(50 mM NaHCO₃, pH 9.6)で5μg/mlの濃度でMaxisorp-マルチウェルプレート(Nunc)を一つの抗原フラグメントまたはキメラタンパク質により被覆することによって行った。終夜4℃でのインキュベーションの後、プレートを、37℃でブロッキング緩衝液(PBS中で、5%無脂肪乾燥ミルク、0.05% Tween-20)で1時間インキュベートし、次に37℃でブロッキング緩衝溶液を用いて1:200希釈したT. gondii血清反応陽性および血清反応陰性個体由来の血清と共に1時間インキュベートした。プレートを、PBS中の0.05% Tween-20を用いて十分に洗浄し、次いでブロッキング溶液で1:10000希釈した抗ヒト-IgG ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ-結合抗体(1 mg/ml; Sigma-Aldrich, USA)を各ウェルに添加した。最終的に、発色基質のテトラメチルベンジジン(TMB; Sigma-Aldrich, USA)と共にプレートをインキュベートして、酵素学的活性を明らかにした。結果を、450と620 nmの間の吸収(光学密度密度、OD)の差違として記録し、自動ELISAリーダーによって検出した(Labsystem Multiskan, Finland)。各血清サンプルについて、アッセイを３回行い、平均値を計算した。

下記の表３は、36人(T1-T36)のT. gondii血清反応陽性および27人(N1-N27)のT. gondii血清反応陰性ヒト由来の血清を用いて、GST融合タンパク質として発現した単一の抗原フラグメントとEC2、EC3およびEC4キメラ抗原とのIgG 反応性を示している。市販アッセイ(VIDAS System, bioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)を用いる国際単位(IU)として計算されたToxoplasma特異的IgGレベルが報告された。各GST-融合生成物について、カット・オフ値を、Toxoplasma IgG 陰性血清から得た吸光度の２倍の標準偏差を平均値に足した値として決定した。正常型、ＯＤ＜カット・オフ;太字、ＯＤ＞カット・オフ。各細胞において報告された数値を、対応抗原(nd, 未決定)の試験ODとカット・オフ値の比率として計算した。１以上の値は陽性応答を示す。

表３は、陽性である幾つかの血清は、一つの抗原性フラグメントを用いる場合に陰性となるが、一方で本発明のキメラ抗原を用いた場合には、それらの結果は陽性(正しい)となったことを明らかにした。標準的アッセイを用いて得られたIgG濃度の数値は、他のものとは比較できないことに注目されたい、これは、それらが他のアッセイについて使用できない国際標準を基準として計算されたためである。

下記の表４は、T. gondii 血清反応陽性および血清反応陰性のヒト由来の血清サンプルを用いる組換えタンパク質を基にしたELISAアッセイの結果を要約するものである。各々において列は、反応性血清の数と対応する％を示している。表４から、アッセイの感受性（偽陰性の発生を示す第2番目の列）は、本発明のキメラ抗原を用いた場合に改善されることが明らかとなった。この改善は、一つの抗原フラグメントの使用および一つの異なる抗原フラグメントの回収物または混合物(Mix-Tx-1.16/Tx-4.18/Tx-2.a, Mix-Tx-1.16/Tx-4.18/Tx-2.a, Mix-Tx-1.16/Tx-2.a/Tx-11.b)の使用の両方に関して明らかである。

T. gondii感染個体由来の血清のIgG抗体を有するキメラ組換え抗原内での一つの抗原ドメインの免疫反応性
キメラ抗原が、その構築体に使用した一つの抗原フラグメントの免疫反応性を保持していることを評価するために、ELISAアッセイにおいて一つの抗原フラグメントと特異的に反応したヒト血清を、一つの抗原の様々な組合せを用いて吸着させ、次いでキメラタンパク質を用いてアッセイした。この目的のために、GST-融合産物として発現した抗原フラグメントの様々な組合せを被覆緩衝液中10μg/mlの濃度で(50 mM NaHCO₃, pH 9.6) Maxisorbマルチウェルプレート(Nunc) 上に被覆し、次いで終夜4℃でインキュベートした。該プレートを、十分洗浄し、次にブロッキング溶液(PBS中で、5% 無脂肪乾燥ミルク、0.05% Tween-20)中で血清サンプル(20μl/well)と共に30分間37℃でインキュベートした。フラグメントに特異的な抗体枯渇血清を、各ウェルから回収し、新しいウェルに添加し、30分間インキュベートし、同じ方法を６回以上繰り返した。一つのまたは複数の抗原フラグメントに対する特異的抗体について枯渇しているサンプルを、最後にキメラ抗原でのELISAアッセイによって分析した。この目的ために、GST-融合産物としてキメラ抗原EC2、EC3およびEC4を、5 μg/mlの濃度にてMaxisorb-マルチウェルプレート上に終夜4℃で被覆した。被覆したプレートをブロッキングし、次にブロッキング溶液で1:100に希釈した抗体枯渇ヒト血清を用いて、37℃で１時間インキュベートした。プレートを、十分に洗浄し、次いでブロッキング溶液において1:7500希釈した抗ヒト-IgGアルカリホスファターゼ−結合抗体(Sigma-Aldrich, USA)を各ウェルに添加した。最後に、発色性の基質 p-ニトロフェニルリン酸塩(Sigma-Aldrich, USA)により、酵素活性が明らかとなった。この結果を、自動ELISAリーダー(Labsystem Multiskan, Finland)によって検出した405と620 nmの吸収の差違として記録した。各サンプルについて、アッセイを２回行い、平均値を計算した。

EC2およびEC3キメラ抗原の生物学的修飾
患者血清における特異的抗ToxoplasmaIgM抗体とキメラ抗原EC2およびEC3との免疫反応性を分析するために、該組換えタンパク質を、ビオチン化により化学的に修飾した。この目的のために、PBSで1 mg/mlの濃度に希釈した精製GST-EC2およびGST-EC3を、氷上で３時間スルホスクシミジル-6-(ビオチン-アミド)ヘキサノエート(Pierce, USAからスルホ-NHS-LC-ビオチン)の５倍のモル過剰の存在においてインキュベートした。次いで、タンパク質をPBSに対して終夜透析し、反応しておらず、加水分解したビオチン試薬の過剰量を除去した。キメラ抗原中のビオチン組み込みのレベルは、"EZ Biotin Quantitation Kit"(Pierce, USA)を用いて決定され、GST-EC2については1.4 ビオチン/分子およびGST-EC3については1.3ビオチン/分子であった。ビオチン標識産物を、0.5 mg/mlの濃度で最終的に希釈し、使用するまで−20℃で貯蔵した。

Toxoplasma-特異的IgM 抗体を用いるビオチン標識EC2およびEC3の免疫反応性: IgM Rec-ELISA
Toxoplasma-特異的免疫グロブリンMを用いる組換え抗原の免疫反応性を調べるために、二重サンドイッチイムノアッセイを用いた(IgM Rec-ELISA)。Maxisorb プレート (Nunc, USA)を、被覆緩衝液(50 mM NaHCO₃, pH 9.6)において10μg/ml濃度の抗ヒトIgM 抗体(Sigma-Aldrich, USA)を用いて被覆した。プレートを、1時間37℃でPBSにおいて(ブロッキング溶液)３%ウシ血清アルブミンでブロッキングし、次にブロッキング溶液中の血清サンプルと共に1時間 37℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、次いでブロッキング溶液で希釈したビオチン標識したGST-融合タンパク質と共に2時間室温でインキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを１時間室温で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体のストレプタビジン(Pierce, USA)と共に、ブロッキング溶液において1μg/mlの濃度でインキュベートした。最終的に、室温で30分間、基質テトラメチルベンジジン(Sigma-Aldrich, USA)と共にプレートをインキュベートして酵素活性を明らかにした。結果を、450および620nmでの吸収の差違として記録し、自動ELISAリーダーによって検出した(Labsystem Multiskan, Finland)。各サンプルについて、アッセイを２回行い、平均値を計算した。

ビオチン標識したキメラ抗原の熱安定性
ビオチン標識したGST-EC2およびGST-EC3の熱安定性を決定するために、組換え産物を、市販緩衝液の"Stabilzyme"(SurModics, USA)で5μg/mlの濃度にて希釈し、使用するまで＋４℃で貯蔵した。様々な時間間隔後(80日まで)、IgM Rec-ELISA分析における組換えタンパク質の免疫反応性を評価し、-20℃で凍結させた対応産物を分析することによって得られた結果を比較した。IgM Rec-ELISAを、ブロッキング溶液(PBSで3% BSA)中500 ng/mlの終濃度でのビオチン標識 GST-EC2およびGST-EC3 抗原と、溶液で1:100に希釈したヒト血清とを用いて上記の通りに行った。各サンプルに対して、このアッセイを２回行い、平均値を計算した。50%のtoxoplasma-特異的IgM-免疫反応性を測定した場合に、日数限界として計算したID50を、GST-EC2およびGST-EC3各々について189日および97日であった。これらの知見は、本発明のキメラ抗原が長期間希釈溶液中で安定であるということを明白に示しており、組換え体生成物の産業的有用性についての基本的要件を満たす。

IgM Rec-ELISAの広範な評価
ビオチン標識GST-EC2およびGST-EC3 キメラ抗原を、T. gondii感染個体由来の血清中のIgM抗体を用いてアッセイし、このIgM Rec-ELISAの結果を、分解した全細胞Toxoplasma 抗原(bioMerieux, FranceからのVIDAS SYSTEM; DiaSorin, ItalyからのETI-TOXOK-M Reverse-PLUS)を用いる市販アッセイにより得られた結果と比較した。この目的のために、妊娠期間中に一次トキソプラズマ症に罹患し、the Center for Perinatal Infection of Campania Region, Italyで出生後の再調査を調べた女性からの血清サンプルをアッセイした。bioMerieux VIDAS Toxo IgGおよびIgM アッセイを使用して、Toxoplasma IgM Rec-ELISA 性能評価について、血清サンプルの３つの群を選択した。群A(n=22)は、VIDAS Toxo IgM およびIgGアッセイによって測定した場合にT. gondii-特異的IgMおよびIgG 抗体に対する陰性サンプルから構成された。群B(n=18)は、慢性感染(VIDAS Toxo IgMおよびIgGアッセイ各々によって測定した場合、T. gondii-特異的IgG 抗体の存在およびT. gondii-特異的IgMの非存在)に相応する血清学プロファイルを有するサンプルから構成された。群C(n=50)は、急性感染(VIDAS Toxo IgMおよびIgGアッセイによって測定した場合、T. gondii-特異的IgMおよびIgG 抗体の存在)に相応する血清学プロファイルを有するサンプルから構成された。IgM Rec ELISAを上記したとおりに行い、各血清サンプルについて、アッセイを２回行い、平均値を計算した。

下記の表５は、群A(A1-A22)、群B(B1-B18)および群C(C1-C50)からの血清を用いることによって市販アッセイ(VIDASおよびETI-TOXO-K)によって得られた結果と比較したビオチン標識したGST-EC2およびGST-EC3キメラ抗原のIgM 反応性を示す。国際単位(IU)として計算したToxoplasma-特異的IgGレベルも報告する。各ビオチン標識したGST-融合生成物について、カット・オフ値を、T. gondii-特異的IgM陰性血清(AおよびB群、n=40)から得た吸光度の、平均＋二倍標準偏差として計算した。VIDAS IgM, ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS GST-EC2およびGST-EC3についてのカット・オフ値は、各々0,650、0,500、0,343および0,378であった。太字で示した値は陽性応答を示す。

下記表6は、ビオチン標識したEC2およびEC3キメラ抗原(IgM Rec-ELISA)を用いて得た結果と比較した市販アッセイ(VIDAS IgMおよびETI-TOXOK-M Reverse PLUS)の性能特徴を示す。表6から、本発明のキメラ抗原を用いる場合にアッセイの特異性および陽性予測値の両方(擬陽性の出現を報告する第3番目の列を参照されたい)は最高値(100%)に達したことが明らかとなった。感受性および同一性に関して、分解した全細胞Toxoplasma 抗原を用いる市販試験ETI-TOXOK-Mおよびキメラ抗原EC2を用いるIgM rec-ELISAの両者は、同じ性能特性を示し、両方の値はほぼ100%に近いことを示す。

最後に、先天的トキソプラズマ症罹患幼児由来の血清中のIgM 抗体とビオチン標識 GST-EC2およびGST-EC3 抗原の免疫反応性を調べた。後ろ向き試験(retrospective test)において、妊娠中にT. gondii 一次感染に罹患した母親のうち30人の幼児由来の血清を分析した。各々12月令のToxoplasma-特異的IgG 抗体の存続または消失により示されたとおり、20人の幼児は、先天的トキソプラズマ症を示し、10人は感染していなかった。感染患者コホートにおいて、妊娠時の妊娠時期は6人の母親において第二期であり、14人の母親においては第三期であった。感染した幼児および感染していない幼児由来の30人の血清サンプルをIgM Rec-ELISAにより分析し、全細胞のToxoplasma 抗原(ELFA-IgMおよびETI-TOXOK-M Reverse PLUS)を用いる市販アッセイにより得られた結果を比較した。抗Toxoplasma IgGの特異的レベルは、感染した幼児血清について28〜1147 IU/mlの範囲にあり、感染していない患者からの血清について19〜170 IU/mlであった。各々GST-融合産物について、カット・オフ値は、感染していない幼児由来の血清を用いて得られた吸光度読み値の平均＋2SDとして決定した。表7は、感染した幼児由来の個々の血清を用いるIgM Rec-ELISAの結果をまとめたものである。全体として、IgM-反応性血清の数値は、GST-EC2およびGST-EC3抗原各々を用いると、70% (14/20)〜50%(10/20)の範囲であった。これに対して、20人の感染した幼児のうちの7人(35%)は、ELFA-IgMまたはETI-TOXOK-M アッセイを用いた場合に陽性の結果を示した。感染していない幼児の中で、IgM Rec-ELISAにおいてGST-EC2およびGST-EC3抗原を認識するか、または市販アッセイを用いて陽性となった血清はなかった。

結論として、これらの結果は、組換えキメラ抗原の使用は、感染していない個体とT. gondii感染とを区別する際に有効であって、全細胞タキゾイト抗原を用いることに関して同等かまたはより良好なアッセイ性能を有するということを示し、トキソプラズマ症血清学的診断のための標準的な市販免疫アッセイのための基礎を提供できるものである。

表７
妊娠中に獲得した一次T.gondii 感染した母親から出生した30人の幼児由来の血清サンプルのToxoplasma-特異的IgM反応性

表７に対する注：
T.gondii感染(T1-T20)または非感染幼児(N1-N10)由来の血清サンプルを、GST-EC2およびGST-EC3抗原を用いるIgM Rec-ELISAまたは市販アッセイ(ELFA-IgMおよびETI-TOXO-M)により分析した。
ｂ．臨床的発症の重大性：S.重症；B. 良性；Sub.無症状。
ｃ． ELFA-IgMおよびETI-TOXO-M アッセイについてのカット・オフ値は、製造者により示されたように各々0.65および0.41であった。太字、値＞カット・オフ。
ｄ．GST-EC2およびGST-EC3 抗原を用いるIgM Rec-ELISAについてのカット・オフ値は、各々0.25および0.26であった。太字、値＞カット・オフ。

図１は、細菌の発現ベクターpGEX-SNのプラスミドマップである。図２は、キメラ抗原の図式表示である。図３は、E. coli 細胞におけるT. gondii キメラ抗原の発現である。図４は、キメラ抗原の生物工学的特徴である。図５は、キメラ抗原内部の個々のタンパク質フラグメントの抗原特性である。図６は、キメラ抗原とToxoplasma-特異的IgM抗体との免疫反応性である。図７は、キメラ抗原の長期安定性である。

Claims

Toxoplasma gondiiの少なくとも３つの異なる抗原領域の融合部を含有するキメラ組換え抗原であって、該抗原領域がToxoplasma gondii特異的抗体に結合する B-細胞エピトープである、キメラ組換え抗原。
Toxoplasma gondii-特異的抗体がToxoplasma gondiiに感染している患者の血清から抽出されている、請求項1記載のキメラ抗原。
３つの異なる抗原領域が、共有結合によってまたはペプチドリンカーによって結合されている、前記請求項のいずれかに記載のキメラ抗原。
３つの異なる抗原領域が、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：33、配列番号：34、配列番号：35、配列番号：36、配列番号：37、配列番号：38、配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41および配列番号：42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれかに記載のキメラ抗原。
配列番号：28のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラ抗原。
配列番号：30のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のキメラ抗原。
配列番号：32のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のキメラ抗原。
前記請求項のいずれかに記載のキメラ抗原をコードしているヌクレオチド配列。
配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9および配列番号：11からなる群から選択される少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載のヌクレオチド配列。
配列番号：27のヌクレオチド配列を含む、請求項8または9に記載のヌクレオチド配列。
配列番号：29のヌクレオチド配列を含む、請求項8または9に記載のヌクレオチド配列。
配列番号：31のヌクレオチド配列を含む、請求項8または9に記載のヌクレオチド配列。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項8〜12のいずれかに記載の任意の配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列。
請求項13のヌクレオチド配列によりコードされたキメラ組換え抗原。
DNA配列である、請求項8〜13の何れかに記載のヌクレオチド配列。
請求項15記載のDNA配列を含む、ベクター。
請求項16のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
請求項17の宿主細胞を培養し、所望の産物を単離することを含む、
請求項1〜7または14のいずれかに記載のキメラ抗原の産生方法。
Toxoplasma gondii 感染の診断のための活性な薬剤としての請求項1〜7または14のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
幼児における先天的トキソプラズマ症の診断のための請求項19に記載の使用。
感染時期の診断のための請求項19に記載の使用。
請求項1〜7または14のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラ抗原を含有する、Toxoplasma gondii 感染の診断のためのキット。
請求項1〜7または14のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラ抗原を含有する急性および／または慢性のToxoplasma gondii 感染の診断のためのキット。
医薬品としての請求項1〜7または14のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
Toxoplasma gondii 感染の予防または処置のための医薬品製造のための、活性な成分としての請求項1〜7または14のいずれかに記載のキメラ抗原の使用。
医薬品として請求項8〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列の使用。
Toxoplasma gondii 感染の処置または予防に有用な医薬品製造のための、請求項8〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列の使用。
請求項1〜7または14のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラ抗原を含有する、特にワクチンの形態にある、医薬組成物。
請求項8〜13のいずれかに記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有する、特にワクチン形態にある、医薬組成物。
ヒトおよび／または動物の使用に適する、請求項27または28に記載の組成物。
請求項27〜29のいずれかに記載の治療上有効量のワクチンを投与することを含む、Toxoplasma-gondii 感染に罹患している哺乳動物を処置するための方法。