MX2007009524A - Antigenos recombinantes quimericos de toxoplasma gondii. - Google Patents

Abstract

La invencion descrita en este documento se refiere a un metodo para combinar fragmentos de antigeno de proteinas de Toxoplasma gondii, en la forma de productos de fusion quimericos y su uso como agentes de diagnostico e inmunogenicos.

Description

ANTIGENOS RECOMBINAN ES QUIMÉRICOS DE TOXOPLASMA GONDII CAMPO DE LA INVENCION La invención descrita en este documento se refiere al campo técnico de la preparación de medios de diagnóstico que no se aplican directamente al cuerpo animal o humano. La invención también proporciona compuestos, métodos para su preparación, métodos para su uso y composiciones que los contienen, los cuales son adecuados para la aplicación industrial en el campo farmacéutico y de diagnóstico, particularmente para la detección y el diagnóstico de infecciones por Toxoplasma gondii , asi como también para el tratamiento y la prevención de las infecciones .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El diagnóstico temprana es un objetivo prioritario y sumamente deseable en todos los campos de los medicamentos, particularmente debido a que permite un mejoramiento apreciable en la vida del paciente y un ahorro concomitante por parte de los sistemas de atención sanitaria o por parte de los pacientes reales. En el caso particular de la invención descrita en este documento, el diagnóstico temprana es aquella de una infección potencial o existente por Toxoplasma gondii en mujeres embarazadas, con una preocupación particular por la salud del feto, y en sujetos REF: 184500 infectados, particularmente aquellos con inmunidad deteriorada. Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligatorio que infecta todas las células de mamífero, inclusive aquellas de sujetos humanos (McCaje and Remington, N. Engl . J. Med. 1988, 318-313-5) . Morfológicamente, el parásito exhibe tres formas distintas de infección: taquizoito (asexual) , bradizoito (en quistes de tejido, asexual) y esporozoito (en ooquistes, reproducción sexual). La transmisión ocurre típicamente a través de la ingestión de carne no cocinada suficientemente que transporta quistes de tejido o vegetales contaminados con ooquistes arrojados por gatos . La infección humana es generalmente asintomática y autolimitante en hospederas inmunocompetentes. En contraste, en los sujetos con inmunidad deteriorada (particularmente aquellos afectados por SIDA) , la toxoplasmosis es una infección oportunista severa, la cual puede dar origen a la encefalitis con consecuencias muy serias (Luft, B . J. , Remington J. S. , 1992, Clin . Infect . Dis . 15, 211 -22) . Además, el contagio de la infección primaria durante el embarazo puede conducir a abortos o a una enfermedad fetal severa en mamíferos . Para una visión general extensiva del problema de la toxoplasmosis, el lector es remitido a la bibliografía médica específica.

El diagnóstico de la infección por T. gondii se establece al aislar el microorganismo en la sangre o fluidos corporales, identificar el parásito en tejidos, detectar las secuencias de nucleótidos específicas con la PCR o detectar las inmunoglobulinas específicas anti-T.' gondii producidas por el hospedera en respuesta a la infección (Beaman y colaboradores, 1995 Principies and Practice of Infectious Diseases 4 th Ed. , Churchill Livingstone Inc. , Nueva York, 2455- 75; Remington JS y colaboradores 1995, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, W. B. Saunders, Filadelfia, PA, 140-267) . Los retos principales para los especialistas clínicos son el diagnóstico de infecciones primarias por T. gondii en mujeres embarazadas y el diagnóstico de infección congénita en sus recién nacidos/infantes. En ambos casos, para implementar terapias adecuadas con suficiente antelación y para evitar un posible daño al feto y a los recién nacidos/infantes, es muy importante establecer si la infección parasitaria ha sido contraída antes o después de la concepción en mujeres embarazadas. Además, es esencial determinar cuando ocurrió la transmisión vertical de la madre al feto. Finalmente, para el manejo clínico de recién nacidos/infantes existe una necesidad urgente de un método de diagnóstico sensible que pueda diferenciar, al comienzo de su vida, entre sujetos infectados y no infectados, ambos nacidos de madres con toxoplasmosis primaria en el embarazo. La seroconversión durante la gestación y el diagnóstico de una infección congénita en neonatos se realizan generalmente al intentar detectar la presencia de varias clases de inmunoglobulinas anti- Toxoplasma (IgG, IgM, IgA, avidez de IgG) y comparar los perfiles inmunológicos de la madre contra su hijo. Sin embargo, los ensayos comerciales disponibles no proporcionan suficiente sensibilidad y especificidad para permitir una diagnosis correcta de infección en todos los pacientes. Por lo tanto, es deseable la disponibilidad de agentes de diagnóstico específicos, sensibles e innovadores. Los antígenos de T. gondii han sido conocidos y han estado disponibles durante mucho tiempo, en principio como mezclas de antígenos obtenidas de varias maneras (FR 2,226,468, Mérieux; SU 533376, Veterinary Research Institute; JP 54044016, Nihon Toketsu Kanso) , luego como aislamientos subsecuentes de antígenos puros (EP 0 082 745, Mérieux; EP 0 301 961, INSERM, Pasteur; WO 89/5658, Transgene) y su caracterización como proteínas y de sus genes respectivos (WO 89/08700, U. Leland, Dart outh Coll.; US 4,877,726, Res. Inst. Palo Alto; WO 89/12683, INSERM, Pasteur; EP 0 391 319, Mochida Pharm.; IT 1,196,817, CNR; EP 0 431 541, Behringwerke; WO 92/01067, CNRS; WO 92/02624, U. Flinders; WO 92/11366, Innogenetics, Smithkline Beecham; US 5,215,917, Res. Inst. Palo Alto; WO 92/25689, FR 2702491, INSERM, Pasteur; WO 96/02654, bioMeriéux, Transgene; EP 0 710 724 Akzo; EP 0 724 016, bioMeriéux; EP 0 751 147, Behring erke; US 5,633,139, Res. Inst. Palo Alto; WO 97/27300, Innogenetics; US 5,665,542, US 5,686,575, Res. Inst. Palo Alto; WO 99/32633, Heska; JP 11225783, Yano; WO 99/61906, Abbott; WO 99/66043, Smithkline Beecham; JP 2000300278, Yano; WO 00/164243, Virsol) y finalmente, el aislamiento y la caracterización de las regiones antigénicas de productos del gen de Toxoplasma (WO 03/080839, Kenton S.r.l.). Numerosos estudios han descubierto varias proteínas antigénicas diferentes de T. gondii y también se han determinado las secuencias de genes de estas proteínas. Entre las proteínas más interesantes para propósitos tanto de diagnóstico como terapéuticos, en la forma de vacunas, se deben mencionar: las proteínas de micronemo (WO 03/080839, Kenton S.r.l.; Beghetto y colaboradores, The Journal of Infectious Diseases, 2005, 191 : 637-645; Beghetto y colaboradores, International Journal for Parasi tology, 2003, 33 : 163-173) ; los antígenos de la superficie SAG1 (o P30) (WO 89/08700, Stanford University; WO 89/12683 Pasteur, INSERM; WO 94/17813, WO 96/02654, Transgene, bioMeriéux; EP 0 724 016, WO 99/61906, US 5,962,654, Haming y colaboradores, Clinical and Diagnostic Laboratory I munology, Mayo de 1996, 355-357) y SAG2 (o P22) (Parmley y colaboradores, 1992, J. Clin. Microbiol. 30, 1127-33); las proteínas de granulo denso GRAl (o P24) (EP 0 301 961, Pasteur, INSERM; WO 89/05658, Transgene, Cesbron-Delauw y colaboradores, 1989 P.N.A.S. EUA 86, 7537-41), GRA2 (o P28) (WO 93/25689, INSERM, Pasteur; US 5,633,139, US 5,665,542, US 5,686,575, Res. Inst. Palo Alto; Prince y colaboradores, Mol. Biochem. Parasitol . , 34 3-14), GRA4 (Mevelec y colaboradores, Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-38), GRA6 (o P32) (FR 2,702,491, INSERM, Pasteur; Lecordier y colaboradores, Mol. Biochem. Parasitol. 70, 85-94), GRA7 (WO 99/61906, Abbott; Jacobs y colaboradores, Mol. Biochem. Parasitol . 91, 237-49) y GRA3 (Robben y colaboradores, 2002, J. Biol. Chem. 277, 17544-47): los antígenos roptri ROPl (o P66) (US 5,976,553, U. Leland; EP 0 431 541, Innogenetics) y ROP2 (o P54) (Sharma y colaboradores, J. Immunol . , 131, 377-83). Como se describe en las referencias mencionadas anteriormente, los antígenos se obtuvieron con técnicas de ADNc recombinante en vectores de expresión. Por ejemplo, para el antígeno SAG1, el documento WO 98/08700 utiliza vectores de expresión conocidos en el fago lambda-gtll. El documento WO 98/12683 utiliza el mismo fago y transfecta E. coli con un plásmido patentado o por medio de la preparación de un cásete de expresión especial, como en el. documento WO 96/02654. El documento EP 0 742 016 obtiene mimotopos utilizando genotecas de expresión combinatorias de péptidos. El documento EP 0 301 961 describe como obtener antígenos de excreción-secreción con pesos moleculares que varían de 20 kDa a 185 kDa. El documento WO 89/05658 describe una proteína que contiene los epítopos de la proteína de 24 kDa reconocidos por los anticuerpos producidos contra los antígenos de excreción-secreción de Toxoplasma ; esta proteína se obtiene por medio de la transfección de células por medio de vectores de expresión. El documento WO 03/080839 describe un método basado en la tecnología de exhibición de fagos para identificar fragmentos de antígenos de las proteínas de T. gondii y su uso como agentes de diagnóstico e inmunogénicos. El antígeno P28 (GRA2) se describe en el documento US 5,633,139 y el método para obtenerlo es implementado nuevamente a través de la expresión en el fago lambda-gtll. El antígeno P32 (GRA6) se describe en la patente FR 2,702,491, el antígeno ROPl (P66) se describe en la patente norteamericana No. 5,976,553, P35 (o GRA8) se describe en los documentos EP 0 431 541, WO 99/57295 y WO 99/61906 y finalmente P68 se describe en el documento EP 0 431 541. Yang y colaboradores (Parasitol. Res., 2004, 92: 58-64) describen una proteína quimérica que contiene SAG1 y SAG2 y su uso para desarrollar inmunidad contra T. gondii en ratones . La patente china No. 11 94991C describe una proteína de fusión recombinante que contiene dos antígenos de toxoplasma (GRA6 y p30) . No se reportan datos para mostrar que ensayos basados en esta proteína de fusión recombinante exhiben la sensibilidad requerida en las pruebas basadas en IgG e IgM. Durante los últimos diez años, varios estudios han reportado el uso de antígenos recombinantes para el diagnóstico serológica de la infección por T. gondii . No obstante, aunque son promisorios ninguno de los ensayos basados en antígenos recombinantes exhibieron todas las características requeridas para reemplazar el antígeno de taquizoito en las pruebas basadas en igG e IgM, indicando que se necesita trabajo adicional antes que un inmunoensayo que emplea productos recombinantes esté disponible para propósitos clínicos. De esta manera, el propósito principal de los estudios en este campo es mejorar el desempeño de inmunoensayos unidos a enzimas basados en productos recombinantes, mejorando de esta manera, por ejemplo, el diagnóstico temprana de la toxoplasmosis congénita en recién nacidos/infantes. Se ha descubierto ahora que la combinación de regiones antigénicas de las proteínas de Toxoplasma gondii , en la forma de productos de fusión recombinantes, retiene las propiedades antigénicas de los fragmentos de antígenos individuales. Las proteínas quiméricas correspondientes que son producidas de esta manera se pueden utilizar para propósitos de diagnóstico y terapéuticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION El uso de los antígenos quiméricos como agentes de diagnóstico y los auxiliares de diagnóstico relacionados que los contienen, por ejemplo en la forma de inmunoensayos o kits unidos a enzimas, constituyen un objetivo adicional de la presente invención. Otro objetivo de la presente invención son las secuencias de genes que codifican los antígenos quiméricos mencionados anteriormente, su uso como medicamentos, particularmente para la prevención y la terapia de la infección por Toxoplasma gondii , por ejemplo como terapia génica. La presente invención también se extiende a las secuencias de genes que se hibridizan con las secuencias de los antígenos quiméricos mencionados anteriormente en condiciones de hibridación rigurosas . Otro objetivo de la presente invención es el uso de los antígenos quiméricos como medicamentos, particularmente en la forma de vacunas, las cuales son útiles para la prevención y la curación de la infección. Las vacunas de acuerdo con la presente invención son adecuadas para el uso en humanos y otros animales (particularmente cerdos, gatos, ovejas) .

Estos y otros objetivos serán ilustrados detalladamente en este documento a continuación, también por medio de los ejemplos y las figuras. Por lo tanto, el objetivo principal de la presente invención es la provisión de antígenos quiméricos recombinantes que se obtienen a través de la fusión de diferentes regiones antigénicas de productos del gen de Toxopl asma gondi i y el uso de las proteínas recombinantes obtenidas de esta manera para desarrollar medios de diagnóstico y terapéuticos selectivos . Las ventajas principales de la presente invención sobre los otros tipos de antígenos o fragmentos de antígenos conocidos en la bibliografía reportada anteriormente son las siguientes y son evidentes cuando estos antígenos se utilizan en inmunoensayos de diagnóstico en sueros de muestra para la detección de la infección: Con respecto al uso del antígeno completo de Toxoplasma gondii , preparado a partir del parásito como un extracto de células completas lisadas, los antígenos recombinantes quiméricos tienen la ventaja de evitar reacciones no específicas que se deben a la presencia de otro material no proteináceo y de proporcionar una mejor capacidad de reproducción. Además, algunos antígenos proteicos naturales del parásito son insolubles y, consecuentemente, son representados pobremente en ensayos comerciales que emplean el extracto de células completas lisadas de T. gondii . - Con respecto al uso de regiones antigénicas individuales o fragmentos de antígenos individuales (como se describe en el documento WO 03/080839) , los antígenos quiméricos recombinantes muestran la ventaja de mejorar la sensibilidad de los ensayos en los cuales se utilizan. En otras palabras, su uso disminuye o suprime la aparición de respuestas negativas falsas. A) Con respecto al uso de una mezcla o una colección de regiones antigénicas individuales (como también se contempla en el documento WO 03/080839) , las ventajas son al menos dos. Desde el punto de vista de la aplicabilidad industrial y la producción es mucho más fácil producir una construcción diseñada individual que contiene tres o más regiones de antígenos preferiblemente que producir por separado cada fragmento individual y ensamblarlos subsecuentemente por medio de un método económico y reproducible. En segundo lugar, como ya se mencionó anteriormente, el uso de los antígenos recombinantes quiméricos de la invención mejora la sensibilidad de los ensayos . Estas y otras ventajas se muestran en la sección de Ejemplos . En particular, la presente invención se refiere a un antígeno recombinante quimérico que contiene la fusión de al menos tres regiones antigénicas diferentes de Toxoplasma gondii , en donde las regiones antigénicas son epítopos de células B, los cuales se unen a los anticuerpos específicos para Toxoplasma gondii . Preferiblemente, los anticuerpos específicos para Toxoplasma gondii se extraen de sueros de sujetos quienes han sido infectados por Toxoplasma gondii . Más particularmente, la presente invención cubre un antígeno quimérico, en donde las tres regiones antigénicas diferentes tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEC. ID NO: 2, SEC. ID NO: 4, SEC. ID NO: 6, SEC. ID NO: 8, SEC. ID NO: 10, SEC. ID NO: 12, SEC. ID NO: 33, SEC. ID NO: 34, SEC. ID NO: 35, SEC. ID NO: 36, SEC. ID NO: 37, SEC. ID NO: 38, SEC. ID NO: 39, SEC. ID NO: 40, SEC. ID NO: 41 y SEC. ID NO: 42. Las secuencias preferidas en el grupo anterior son SEC. ID NO: 2, SEC. ID NO: 4, SEC. ID NO : 6, SEC. ID NO : 8, SEC. ID NO: 10 y SEC. ID NO: 12. Por ejemplo, el antígeno quimérico de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 28 o la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 30 o la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 32. Los antígenos quiméricos de la presente invención pueden diseñarse utilizando métodos conocidos. Las fusiones pueden ser directas (la terminación C de una secuencia de aminoácidos es unida a la terminal N de la otra a través de un enlace covalente simple) o pueden emplear un dominio conector flexible, tal como la región de rótula de la IgG humana, o conectores de polipéptidos que consisten en aminoácidos pequeños tales como glicina, serina, treonina o alanina, en varias longitudes y combinaciones. Por ejemplo, el conector puede ser una repetición de poliglicina interrumpida por serina o treonina en un cierto intervalo. Preferiblemente, el conector está compuesto por tres residuos de glicina y dos residuos de serina, proporcionando la secuencia de aminoácidos Ser-Gly-Gly-Gly-Ser (conector SGGGS) . Adicionalmente, los antígenos quiméricos de la invención pueden ser etiquetados por His-His-His-His-His-His (His6) , para permitir la purificación rápida por medio de la cromatografía de quelatos de metal y/o por medio de epítopos para los cuales están disponibles los anticuerpos, para permitir la detección en Western Blots, inmunoprecipitación o agotamiento/bloqueo de actividad en bioensayos . Otro objetivo de la presente invención es una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico como se describiera anteriormente. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, esta secuencia de nucleótidos comprende al menos tres diferentes secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEC. ID NO: 1, SEC. ID NO: 3, SEC. ID NO: 5, SEC. ID NO: 7, SEC. ID NO: 9 y SEC. ID NO: 11. De acuerdo con una modalidad más preferida, esta secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 27 o la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 29 o la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 31. También están incluidas en el alcance de la presente invención las secuencias de nucleótidos que se hibridizan con cualquier secuencia descrita anteriormente bajo condiciones de hibridación rigurosas, así como también el antígeno recombinante, quimérico, correspondiente que es codificado por esta secuencia de nucleótidos hibridizada. Los antígenos quiméricos de la presente invención se pueden preparar por medio de la clonación y la expresión en un sistema de expresión procariótico o eucariótico, utilizando los vectores de expresión apropiados. Se puede emplear cualquier método conocido en el campo. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican los antígenos de la invención son insertadas en vectores de expresión construidos apropiadamente por medio de técnicas bien conocidas en el campo (véase Sambrook y colaboradores, 1989). Estos vectores son otro objetivo de la presente invención. A fin de ser capaces de expresar la proteína deseada (en este caso los antígenos quiméricos) , un vector de expresión debe comprender también secuencias de nucleótidos específicas que contienen información reguladora de transcripción y traducción unida al ADN que codifica la proteína deseada de tal manera que permita la expresión y producción de genes de la proteína. Primero, a fin de que el gen sea transcrito, debe ser precedido por un promotor reconocible por la polimerasa del AD?, polimerasa a la cual se une e inicia de esta manera el proceso de transcripción. Hay una variedad de estos polímeros en uso, los cuales funcionan con diferentes eficacias (promotores fuertes y débiles) . Para los hospederas eucarióticos, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de transcripción y traducción, dependiendo del carácter del hospedera. Se pueden derivar de fuentes virales, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de los simios o similares, donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular, el cual tiene un alto nivel de expresión. Los ejemplos son el promotor TK del virus de herpes, el promotor temprano SV40, el promotor del gen gal4 de la levadura, etcétera. Se pueden seleccionar las señales reguladoras del inicio de la transcripción que permiten la represión y la activación, de manera que la expresión de los genes pueda modularse. Todos estos hospederas son un objetivo adicional de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos quiméricos de la invención pueden ligarse a una secuencia heteróloga de manera que la molécula de ácido nucleico combinada codifica una proteína de fusión. Estas moléculas de ácido nucleico combinadas están incluidas dentro de las modalidades de la invención. Por ejemplo, se pueden unir al ADN que codifica una proteína la cual permite la purificación del antígeno quimérico por medio de solo un paso de cromatografía de afinidad. Esta proteína unida/fusionada puede ser por ejemplo la Glutationa Sulfo-Transferasa (GST) para generar productos de fusión en la terminación carboxi de la proteína de GST. Las proteínas recombinantes correspondientes que son expresadas en el citoplasma de las células de E. coli transformadas pueden purificarse por medio de la cromatografía de afinidad utilizando una resina de Glutationa-Sefarosa . La molécula de AD? que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la molécula quimérica de la invención es insertada en vector (es) que tiene (n) las señales reguladoras de transcripción y traducción unidas de manera operable, la cual es capaz de integrar las secuencias de genes deseadas en la célula hospedera. Las células que han sido transformadas de manera estable por el ADN introducido se pueden seleccionar al introducir también uno o más marcadores los cuales permiten la selección de células hospederas las cuales contienen el vector de expresión. El marcador también puede proporcionar fototropía a un hospedera auxotrópico, resistencia a biocidas, por ejemplo antibióticos, o metales pesados tales como cobre o similares. El gen marcador seleccionable puede ya sea unirse directamente a las secuencias de genes de ADN que son expresadas o introducirse en la misma célula por medio de la co-transfección. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la invención. Los factores de importancia en la selección de un plásmido o vector viral particular incluyen: la facilidad con la cual las células receptoras, que contienen el vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas de aquellas células receptoras las cuales no contienen el vector: el número de copias del vector que se desea en un hospedera particular; y si es deseable ser capaz de transbordar el vector entre las células hospederas de diferentes especies. Una vez que el (los) vector (es) o secuencia de ADN que contiene (n) la(s) construcción (es) se ha(n) preparado para la expresión, la(s) construcción (es) de ADN puede (n) introducirse en una célula hospedera apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, etcétera. Las células hospederas pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas. Los ejemplos de células eucarióticas son células de mamífero, tales como células de humano, mono, ratón y ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) . La expresión en estas células hospederas proporciona modificaciones posteriores a la traducción a las moléculas de proteínas, inclusive el plegamiento o la glicosilación correctos en los sitios correctos. También las células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones de péptidos posteriores a la traducción que incluyen la glicosilación. Existe una variedad de estrategias de ADN recombinante las cuales utilizan secuencias de promotores fuertes y un alto número de copias' de plásmidos los cuales se pueden utilizar para la producción de proteínas deseadas en la levadura. La levadura reconoce las secuencias líderes en los productos de genes de mamíferos clonados y secreta péptidos que llevan las secuencias líderes (es decir, pre-péptidos) . Los ejemplos de células hospederas procarióticas son bacterias, tal como Escherichia coli . Después de la introducción del (los) vector (es), las células hospederas se desarrollan en un medio selectivo, el cual selecciona para el crecimiento de las células que contienen los vectores. La expresión de la(s) secuencia (s) de genes clonados da por resultado la producción de las proteínas deseadas . La purificación de los antígenos recombinantes se lleva a cabo por medio de cualquiera de los métodos conocidos para este propósito, es decir cualquier procedimiento convencional que implica la extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación adicional que se puede utilizar preferentemente para la purificación de los antígenos de la invención es la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales los cuales se enlazan a la proteína objetivo y los cuales se producen e inmovilizan en una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen la proteína recombinante son pasadas a través de la columna. Los antígenos serán enlazados a la columna por el anticuerpo específico mientras que las impurezas pasarán a través. Después del lavado, el antígeno se eluye del gel por medio de un cambio en el pH o intensidad iónica. Otro aspecto de la presente invención es el proceso para la producción recombinante del antígeno quimérico como se describiera anteriormente, que comprende cultivar la célula hospedera transformada con el vector que contiene la secuencia de nucleótidos de la invención y aislar el producto deseado . Un objetivo adicional de la presente invención es una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión anterior, así como también secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales. Las "secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales" incluyen tode,s las otras secuencias de ácido nucleico las cuales, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican la secuencia de aminoácidos dada. Otro objetivo de la presente invención es una secuencia de nucleótidos la cual se hibridiza con el complemento de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico de la invención bajo condiciones sumamente rigurosas o moderadamente rigurosas, siempre y cuando el antígeno obtenido mantenga la misma actividad biológica, es decir la capacidad para enlazarse a anticuerpos contra el parásito. El término "hibridación" utilizado en este documento se refiere a la asociación de dos moléculas de ácido nucleico con otra por medio del enlace de hidrógeno. Típicamente, una molécula se fijará a un soporte sólido y la otra estará libre en la solución. Luego, las dos moléculas pueden colocarse en contacto una con la otra bajo condiciones que favorecen el enlace de hidrógeno. Los factores que afectan este enlace incluyen: el tipo y el volumen del solvente; temperatura de reacción; tiempo de hibridación; agitación; agentes para bloquear la unión no específica de la molécula en fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO) ; la concentración de las moléculas; el uso de compuestos para incrementar la velocidad de asociación de las moléculas (sulfato de dextrano o polietilenglicol) ; y la rigurosidad de las condiciones de lavado después de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad son una función de la temperatura utilizada en el experimento de hibridación, la molaridad de los cationes monovalentes y el porcentaje de formamida en la solución de hibridación. Para determinar el grado de rigurosidad implicado con cualquier conjunto dado de condiciones, uno utiliza primero la ecuación de Meinkoth y colaboradores (1984) para determinar la estabilidad de los híbridos de 100% de identidad expresada como temperatura de fusión Tm del híbrido de ADN-ADN: Tm = 81.5°C + 16.6 (LogM) + 0.41 (% de GC) - 0.61 (% de form) - 500/L, donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de los nucleótidos G y C en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Para cada 1°C que se reduce la Tm de aquella calculada para un híbrido de 100% de identidad, la cantidad de apareamientos erróneos permitida se incrementa por aproximadamente 1%. De esta manera, si la Tm utilizada para cualquier experimento de hibridación en concentraciones especificadas de sal y formamida es 10°C inferior a la Tm calculada para un híbrido de 100% de identidad de acuerdo con la ecuación de Meinkoth, la hibridación ocurrirá aún si existe hasta aproximadamente 10% de apareamientos erróneos. Como se utiliza en este documento, las condiciones sumamente rigurosas son aquellas las cuales son tolerantes de hasta aproximadamente 15% de divergencia de secuencias, mientras que las condiciones moderadamente rigurosas son aquellas las cuales son tolerantes de hasta aproximadamente 20% de divergencia de secuencias. Sin limitación, los ejemplos de condiciones sumamente rigurosas (12-159C abajo de la Tm calculada del híbrido) y moderadamente rigurosas (15-209C abajo de la Tm calculada del híbrido) utilizan una condición de lavado de 2 X SSC (citrato salino estándar) y SDS al 0.5% a la temperatura apropiada abajo de la Tm calculada del híbrido. La rigurosidad final de las condiciones es principalmente debido a las condiciones de lavado, particularmente si las condiciones de hibridación utilizadas son aquellas que permiten que los híbridos menos estables se formen junto con. híbridos estables. Las condiciones de lavado en una rigurosidad más alta entonces retiran los híbridos menos estables. Una condición de hibridación común que se puede utilizar con las condiciones de lavado desde sumamente rigurosas hasta moderadamente rigurosas descritas anteriormente es la hibridación en una solución de 6 X SSC (o 6 X SSPE) , 5 X reactivo de Denhardt, SDS al 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado a una temperatura de aproximadamente 20aC a 25fiC abajo de la Tm. Si se utilizan sondas mezcladas, es preferible utilizar cloruro de tetrametil-amonio (TMAC) en lugar de SSC (Ausubel, 1987-1998) . El término "molécula de ácido nucleico" también incluye análogos de ADN y ARN, tales como aquellos que contienen estructuras principales modificadas. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen moléculas antisentido que son parcialmente complementarias para las moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos de la presente invención y que se hibridizan por lo tanto con las moléculas de ácido nucleico codificantes (hibridación) . Estas moléculas antisentido, tales como los oligonucleótidos, pueden diseñarse para reconocer, unirse específicamente a e impedir la transcripción de un ácido nucleico objetivo que codifica un polipéptido de la invención, como será sabido por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo (véase, por ejemplo, Cohén, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10,435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56,560 (1991); Lee y colaboradores, Nucleic Acids Res 6,3073 (1979); Cooneyetal., Science 241, 456 (1988); Dervan y colaboradores, Science 251, 1360 (1991) . De acuerdo con la terminología utilizada en este documento, una composición que contiene un compuesto [X] está "sustancialmente libre de" impurezas [en este documento, Y] cuando al menos 85% en peso del total de X+Y en la composición es X. Preferiblemente, X comprende al menos aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición. Más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 98% o aún 99% en peso. Otro aspecto de la invención es el uso de los antígenos quiméricos descritos anteriormente como medicamentos. En particular, uno de los objetivos principales de la invención es el uso de antígenos quiméricos como ingredientes activos para la preparación de medicamentos para la prevención o el tratamiento de infecciones por Toxoplasma gondii . En el caso de la terapia génica, otro objetivo de la invención es el uso de las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos de la invención como medicamentos, en particular para la preparación de medicamentos que son útiles para el tratamiento y la prevención de infecciones por Toxoplasma gondii .

Las composiciones farmacéuticas deben comprende preferiblemente una cantidad terapéuticamente efectiva de los antígenos quiméricos de la invención o la secuencia de nucleótidos correspondiente. Los antígenos quiméricos de la invención pueden actuar de esta manera como vacunas para la prevención o el tratamiento de la infección por Toxoplasma gondii . Para la aplicación terapéutica, donde la preparación de medicamentos o vacunas entra en la estructura del conocimiento general para referencia adicional, el lector es remitido nuevamente a la bibliografía de patente citada en la presente descripción y, particularmente, a Beghetto y colaboradores, The Journal of Infectious Diseases, 2005, 1991 : 637-645. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" utilizado en este documento se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición objetiyo o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente ya sea en ensayos de cultivos celulares, por ejemplo, de células neoplásicas o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede utilizarse para determinar el rango de concentración apropiado y la ruta de administración. Esta información entonces puede utilizarse para determinar dosis y rutas útiles para la administración en humanos . La cantidad efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación (es) de fármacos, sensibilidades a la reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse por medio de la experimentación rutinaria y se encuentra dentro del juicio del profesional clínico. Generalmente, una dosis efectiva será de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0.05 mg/kg a 10 mg/kg. Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrase en combinación con otros agentes , fármacos u hormonas . Una composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable, para la administración de un agente terapéutico. Estos portadores incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, con la condición que el portador no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos peligrosos para el individuo que recibe la composición y el cual pueda administrarse sin toxicidad indebida.

Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar en este documento, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión exhaustiva de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991). Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes de humedecimiento o emulsionantes, sustancias amortiguadoras de pH y similares pueden estar presentes en estas composiciones. Estos portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para la ingestión por el paciente. Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos que serán tratados pueden ser animales; en particular, se pueden tratar sujetos humanos. Las composiciones farmacéuticas que se utilizan en esta invención pueden administrarse por medio de cualquiera de una variedad de rutas que incluyen, pero no están limitadas a, aplicaciones orales, intravenosas, intramusculares, intra-arteriales, intramedulares , intratecales, intraventriculares, transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento WO98/20734) , medios subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, entérales, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. Las pistolas genéticas o hipopulverizaciones también se pueden utilizar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como composiciones inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas que son adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. El suministro directo de las composiciones se realizará generalmente por medio de la inyección, por la ruta subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión.

El tratamiento por dosificaciones puede ser un programa de dosis individuales o un programa de dosis múltiples . El método para tratar a un mamífero que sufre de infección por Toxoplasma gondii , que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la vacuna como se describiera anteriormente representa uno de los aspectos de la presente invención. Un objetivo adicional de la presente invención es el uso de antígenos quiméricos como se describiera anteriormente como agentes activos para el diagnóstico de infecciones por Toxoplasma gondii , en particular para el diagnóstico del tiempo de infección. También los kits para el diagnóstico de la infección por Toxoplasma gondii , que contienen al menos un antígeno quimérico son parte de la presente invención. Estos kits pueden ser útiles para el diagnóstico de una infección aguda y/o crónica por Toxoplasma gondii . El antígeno quimérico de la invención puede emplearse en virtualmente cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno se pone en contacto con el componente del cuerpo que se sospecha que contiene anticuerpos bajo condiciones que permiten que el antígeno se enlace a cualquier anticuerpo de este tipo que esté presente en el componente. Estas condiciones serán típicamente la temperatura fisiológica, pH e intensidad iónica utilizando un exceso del antígeno. La incubación del antígeno con el espécimen es seguida por la detección de complejos inmunes comprendidos del antígeno. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran cantidad de variación y se conocen en el campo muchos formatos. Los protocolos pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos o la inmunoprecipitación. La mayoría de ensayos implican el uso de un anticuerpo o polipéptido etiquetado; las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o tintes. También se conocen los ensayos que amplifican las señales del complejo inmune; los ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina e inmunoensayos etiquetados y mediados por enzimas, tales como los ensayos ELISA. El inmunoensayo puede estar, sin limitación, en un formato heterogéneo o en un formato homogéneo y puede ser de un tipo estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido se enlaza típicamente a una matriz o soporte sólido para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Los ejemplos de soportes sólidos que se pueden utilizar son nitrocelulosa, (por ejemplo, en forma de membrana o pocilios de microtítulo) , cloruro de polivinilo (por ejemplo, en láminas o en pocilios de microtítulo) , látex de poliestireno (por ejemplo, en perlas o placas de microtítulo) , fluoruro de polivinilideno (conocido como Immulon^) , papel diazotizado, membranas de nailon, perlas activadas y perlas de Proteína A. Por ejemplo, las placas de microtítulo Immulon lm o Immulon 2m de Dynatech o las perlas de poliestireno de 0.635 centímetros (0.25 pulgadas) (Precisión Plástic Ball) se pueden utilizar en el formato heterogéneo. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava típicamente después de separarlo de la muestra de prueba y antes de la detección de los anticuerpos enlazados. Los formatos tanto estándar como competitivos se conocen en el campo. En un formato homogéneo, la muestra de prueba es incubada con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, puede ser bajo condiciones que precipitarán cualquier complejo de antígeno-anticuerpo que se forme. Los formatos tanto estándar como competitivos para estos ensayos se conocen en el campo . En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos que forman el complejo de anticuerpo-antígeno es supervisada directamente. Esto se puede realizar al determinar si los anticuerpos anti-xenogénicos etiquetados (por ejemplo, antihumano) los cuales reconocen un epítopo sobre los anticuerpos anti- oxoplasma gondii se enlazarán debido a la formación de complejos. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos en la muestra es deducida al supervisar el efecto competitivo sobre el enlace de una cantidad conocida de anticuerpo etiquetado (u otro ligando competitivo) en el complejo. Los complejos formados que comprenden un anticuerpo anti - Toxoplasma gondii ( o , en el caso de los ensayos competitivos, la cantidad del anticuerpo competitivo) son detectados por medio de cualquiera de una variedad de técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos no etiquetados en el complejo pueden detectarse utilizando un conjugado de Ig anti-xenogénica en complejo con una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta enzimática) . En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre los antígenos quiméricos y el anticuerpo forma una red que se precipita de la solución o suspensión y que forma una capa o película visible de producto precipitado. Si no está presente un anticuerpo anti-Toxoplasma gondii en el espécimen de prueba, no se forma el producto precipitado visible. Los antígenos quiméricos de la invención serán empacados típicamente en la forma de un kit para el uso en estos inmunoensayos. El kit contendrá normalmente en recipientes separados la combinación de antígenos (bien sea ya enlazados a una matriz sólida o separados con reactivos para enlazarlos a la matriz) , formulaciones de anticuerpo de control (positivas y/o negativas) , un anticuerpo etiquetado cuando el formato del ensayo requiere los mismos reactivos generadores de señales (por ejemplo, substrato enzimático) si la etiqueta no genera directamente una señal . Las instrucciones (por ejemplo, escritas, grabadas en cinta magnética, en grabadora de cásete de video (VCR, por sus siglas en inglés) , disco compacto de memoria solo de lectura (CD-ROM, por sus siglas en inglés) , etcétera) para llevar a cabo el ensayo serán incluidas usualmente en el kit. Por lo tanto, los kits de diagnóstico, los cuales son el objetivo de la presente invención, son conocidos para la persona experta en el campo. A manera de ejemplo, el lector es remitido a la bibliografía de patente citada anteriormente, a la cual pueden agregarse los documentos US 6,265,176, WO 01/63283 y WO 03/080839 como referencias adicionales . La invención ahora será ilustrada con mayor detalle por medio de los ejemplos y las figuras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Mapa de plásmidos del vector de expresión bacteriano pGEX-SN. Figura 2. Representación esquemática de los antígenos quiméricos.

Las secuencias de ADN de los clones Tx-2.a, Tx-1.16, Tx-4.18, Tx-15.11, Tx-1.11 y Tx-ll.b, que codifican respectivamente los fragmentos de proteínas de los genes de T. gondii MIC2, MIC3, SAG1, GRA3, GRA7 y M2AP se utilizaron para la construcción de las proteínas de fusión GST-EC2 , GST-EC3 y GST-EC4. Figura 3. Expresión de antígenos quiméricos de T. gondii en células de E. coli . Análisis mediante SDS-PAGE de las proteínas de fusión purificadas GST-EC2 , GST-EC3 y GST-EC4. Las proteínas recombinantes se sujetaron a la electroforesis (0.003 mg/carril) en gel de 12% de acrilamida. MW, marcadores de peso molecular. Figura 4. Caracterización bioquímica de los antígenos quiméricos. Análisis de CLAR de la proteína purificada GST-EC2 realizado por medio de la filtración en gel utilizando la columna TSK G4000 SW-XL. Figura 5. Propiedades antigénicas de fragmentos de proteínas individuales dentro de los antígenos quiméricos.

Inmunorreactividad de los fragmentos de antígenos individuales Tx-2.a, Tx-1.16, Tx-4.18, Tx-15.11, Tx-1.11 y Tx-ll.b y de los antígenos quiméricos EC2, EC3 y EC4 con muestras de suero de individuos infectados por T. gondii . Los sueros se utilizaron ya sea como especimenes completos (suero) o después del agotamiento de anticuerpos específicos contra combinaciones de fragmentos de antígenos (agotamiento de Tx-1.16/Tx-4.18, agotamiento de Tx-2.a/Tx-4.18, etcétera). Figura 6. Inmunorreactividad de los antígenos quiméricos con anticuerpos de IgM específicos para Toxoplasma. A) análisis Rec-ELISA para prueba de IgM realizado con muestras de suero positivas para IgM (C+) y negativas para IgM (C-) específicas para Toxoplasma (dilución del suero, 1:100) al variar la concentración de los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 etiquetados con biotina. B) análisis Rec-ELISA para prueba de IgM realizado con diluciones en serie de muestras de suero positivas para IgM (de 1:100 a 1:6400) y negativas para IgM (el suero de control, diluido 1:100) específicas para Toxoplasma, sometidas a ensayo con GST-EC2 etiquetado con biotina y la mezcla de GST-EC2/GST-EC3. Figura 7. Estabilidad . a largo plazo de los antígenos quiméricos Análisis de Rec-ELISA para prueba de IgM realizado con los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 etiquetados con biotina, los cuales se han mantenido a +4°C durante diferentes intervalos de tiempo (días) . Los resultados se expresan como la relación de las Densidades Ópticas medidas con las muestras de suero positivas para IgM (OD C+) y negativas para IgM (OD C-) específicas para Toxoplasma .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION EJEMPLOS La siguiente Tabla 1 proporciona, a manera de ejepplo, las secuencias de ADN utilizadas para la construcción de antígenos quiméricos recambinantes de Toxoplasma gondii : Tabla 1 Nombre Secuencia Identificación Clasificación T?-15.11 GCTGCCTTGGGAGGCCTTGCGGCGGATC GRA 3 Proteína (SEC. ID NO: 1) AGCCTGAAAATCATCAGGCTCTTGCAGAA de gr nulo CCAGTTACGGGTGTGGGGGAAGCAGGA denso GTGTCCCCCGTCAACGAAGCTGGTGAGT CATACAGTTCTGCAACTTCGGGTGTCCAA GAAGCTACCGCCCCAGGTGCAGTGCTCC TGGACGCAATCGATGCCGAGTCGGATAA GGTGGACAATCAGGCGGAGGGAGGTGA GCGTATGAAGAAGGTCGAAGAGGAGTTG TCGTTATTGAGGCGGGAATTATATGATCG CACAGATCGCCCTGGT Tx-1.11 CAGTTCGCTACCGCGGCCACCGCGTCAG GRA 7 Proteína (SEC. ID NO: 3) ATGACGAACTGATGAGTCGAATCCGAAAT de granulo TCTGAC I I I I ICGATGGTCAAGCACCCGT denso TGACAGTCTCAGACCGACGAACGCCGGT GTCGACTCGAAAGGGACCGACGATCACC TCACCACCAGCATGGATAAGGCATCTGTA GAGAGTCAGCTTCCGAGAAGAGAGCCAT TGGAGACGGAGCCAGATGAACAAGAAGA AGTTCAT Tx-1.16 AGGAGGACTGGATGTCATGCCTTCAGGG MIC 3 Proteína de (SEC. ID NO: 5) AGAACTGCAGCCCTGGTAGATGTATTGAT micronermo GACGCCTCGCATGAGAATGGCTACACCT GCGAGTGCCCCACAGGGTACTCACGTGA GGTGACTTCCAAGGCGGAGGAGTCGTGT GTGGAAGGAGTCGAAGTCACGCTGGCTG AGAAATGCGAGAAGGAATTCGGCATCAG CGCGTCATCCTGCAAATGCGAT Tx-4.18 CCATCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGT SAG 1 Proteína de (SEC. ID NO: 7) GCTCCTACGGTGCAGACAGCACTCTTGG la superficie TCCTGTCAAGTTGTCTGCGGAAGGACCC ACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAG ATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAAT CAGTACTGTTCCGGGACGACGCTGACTG GTTGCAACGAGAAATCGTTCAAAGATATT TTGCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCA GGGTAACGCTTCGAGTGATAAGGGTGCC ACGCTAACGATCAAGAAGGAAGCATTTCC AGCCGAGTCAAAAAGCGTCATTATTGGAT GCACAGGGGGATCGCCTGAGAAGCATCA CTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCCGGG GCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCT Tx-2.a CCCCAGGATGCCATTTGCTCGGATTGGT MIC2 Proteína de (SEC. ID NO: 9) CCGCATGGAGCCCCTGCAGTGTATCCTG micronemo CGGTGACGGAAGCCAAATCAGGACGCGA ACTGAGGTTTCTGCTCCGCAACCTGGAA CACCAACATGTCCGGACTGCCCTGCGCC CATGGGAAGGACTTGCGTGGAACAAGGC GGACTTGAAGAAATCCGTGAATGCAGTG CGGGGGTATGTGCTGTTGACGCTGGATG TGGCGTCTGGGTT Tx-11.b AACGAACCGGTGGCCCTAGCTCAGCTCA M2AP Proteína de (SEC. ID GCACATTCCTCGAGCTCGTCGAGGTGCC micronemo NO: 11) ATGTAACTCTGTTCATGTTCAGGGGGTGA TGACCCCGAATCAAATGGTCAAAGTGACT GGTGCAGGATGGGATAATGGCGTTCTCG AGTTCTATGTCACGAGGCCAACGAAGAC AGGCGGGGACACAAGCCGAAGCCATCTT GCGTCGATCATGTGTTATTCCAAGGACAT TGACGGCGTGCCGTCAGACAAAGCGGGA AAGTGCTTTCTGAAGAACTTTTCTGGTGA AGACTCGTCGGAAATAGACGAAAAAGAA GTATCTCTACCCATCAAGAGCCACAACGA TGCGTTCATGTTCGTTTGTTCTTCAAATGA TGGATCCGCACTCCAGTGTGATGTTTTCG CCCTTGATAACACCAACTCTAGCGACGG GTGGAAAGTGAATACCGTGGATCTTGGC GTCAGCGTTAGTCCGGATTTGGCATTCG GACTCACTGCAGATGGGGTCAAGGTGAA GAAGTTGTACGCAAGCAGCGGCCTGACA GCGATCAACGACGACCCTTCCTTGGGGT GCAAGGCTCCTCCCCATTCTCCGCCGGC CGGAGAGGAACCGAGTTTGCCGTCGCCT GAAAACAGCGGGTCTGCAACACCAGCGG AAGAAAGTCCGTCTGAGTCTGAATCT La secuencia Tx-15 . 11 constituye un fragmento del gen GRA3 ( Bermudes y colaboradores, Mol . Biochem . Parasi tol . , 1994 , 68 : 247-257) . El clon tiene la secuencia de aminoácidos AALGGLAADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGVQEATA PGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPG ( SEC . ID NO : 2 ) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención . La secuencia Tx-1 . 11 constituye un fragmento del antígeno GRA7 (Bonho me y colaboradores, J. Histochem .

Cytochem . , 1998, 46 : 1411 -1421 ) . El clon tiene la secuencia de aminoácidos ATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDK ASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHF (SEC. ID ?O : 4) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención. La secuencia Tx-1.16 constituye un fragmento del gen MIC3 ( Garcia-Réguet y colaboradores, Cellular Microbiol . , 2000, 2 : 353 -364 ) . El clon tiene la secuencia de aminoácidos RRTGCHAFRE?CSPGRCIDDASHE?GYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGV EVTLAEKCEKEFGISASSCKCD (SEC. ID ?O: 6) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención. La secuencia Tx-4.18 constituye un fragmento del antígeno SAG1 (Burg y colaboradores, J. Immunol . , 1988, 141 : 3584-3591 ) . El clon tiene la secuencia de aminoácidos PSW?NVARCSYGADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQD?NQYCS GTTLTGC?EKSFKDILPKLTE?PWQG?ASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGC TGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAKSA (SEC. ID ?O : 8) y SU USO en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención. La secuencia Tx-2.a representa un fragmento del gen MIC2 ( Wan y colaboradores, Mol . Biochem . Parasi tol . , 1997, 84 : 203-214 ) . El clon tiene la secuencia de aminoácidos PQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRT CVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWV (SEC. ID ?O: 10) y SU USO en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención. La secuencia Tx-ll.b representa un fragmento distinto del gen M2AP (Rabenau y colaboradores, Mol . Microbiol . , 2001 , 41 : 537-547) . El clon tiene la secuencia de aminoácidos NEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHJQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYV TRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKE VSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLGVSVS PDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAI?DDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPE ?SGSATPAEESPSESES (SEC. ID ?O: 12) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.

Construcción de antígenos quiméricos El producto de proteína EC2 es una molécula quimérica que contiene las secuencias de AD? Tx-2.a, Tx-1.16 y Tx-4.18. La SEC. ID ?O: 9 se utilizó como molde para la amplificación de AD? del clon Tx-2.a por medio del uso de los oligonucleótidos K551 (5' -GGACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCC-3 ' ) y K553 ( 5 ' -CATCCAGTCCTGCTACCGCCACCAGACCAGACGCCACATCCAGC-3 ' ) . El oligonucleótido K553 contiene una secuencia que codifica al conector SGGGS, el cual une las secuencias Tx-2.a y Tx-1.16. La condición de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 50°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. La SEC. ID ?O: 5 se utilizó como molde para el AD? del clon Tx-1.16 por medio del uso de los oligonucleótidos K552 (5'-GTGGCGTCTGGTCTGGTGGCGGTAGCAGGACTGGATGTCATGCC-3' ) y K555 ( 5 ' -TGACGACCGAGCTACCGCCACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATG-3 ' ) . El oligonucleótido K555 contiene una secuencia que codifica al conector SGGGS, el cual une las secuencias Tx-1.16 y Tx-4.18. La condición de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 50°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. La SEC. ID NO: 7 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-4.18 por medio del uso de los oligonucleótidos K554 ( 5 ' -ATGCGATAACTCTGGTGGCGGTAGCTCGG TCGTCAATAATGTCGC-3' ) y K556 (5 ' -CCGCGGCCGCTAGCCGATTTTGCT GACCCTG-3'). La condición de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 50°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. Los productos de la PCR se purificaron por medio del "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) . 25 ng de los productos de amplificación de ADN de la SEC. ID NO: 9 y la SEC. ID NO: 5 se mezclaron conjuntamente y se utilizaron como moldes en la reacción PCR por medio del uso de los oligonucleótidos K551 y K555. La condición de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 50°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. 25 ng de la amplificación de ADN resultante se purificaron con el "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) y luego se mezclaron con 25 ng del producto de amplificación de ADN de la SEC. ID NO: 4. Finalmente, la mezcla de ADN se utilizó como molde para la amplificación de ADN por medio del uso de los oligonucleótidos K551 y K556, siguiendo la condición de la PCR de 30" a 94°C, 30" a 50°C y 90" a 72°C durante 20 ciclos . El producto de proteína EC3 es una molécula quimérica que contiene las secuencias de ADN Tx-15.11, Tx-1.11 y Tx-ll.b. La SEC. ID NO: 1 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-15.11 por medio del uso de los oligonucleótidos K563 ( 5 ' -GGACTAGTCGGCTGGCTGCCTTGGGAGG CCTTG-3') y K565 (5 ' -GCCGCGGTAGCACTACCGCCACCAGACAAACCAGGGC GATCTGTG-3 ' ) . El oligonucleótido K565 contiene una secuencia que codifica al conector SGGGS, el cual une las secuencias Tx-15.11 y Tx-1.11. El protocolo de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 48°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. La SEC. ID NO: 3 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-1.11 por medio del uso de los oligonucleótidos K564 ( 5 ' -GCCCTGGTTTGTCTGGTGGCGGTAGTGCTA CCGCGGCCACCGCG-3' ) y K567 (5 ' -CCGGTTCGTTACTACCGCCACCAGAGAAA TGAACTTCTTCTTGTTC-3 ' ) . El oligonucleótido K567 contiene una secuencia que codifica al conector SGGGS, el cual une las secuencias Tx-1.11 y Tx-ll.b. El protocolo de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 48°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. La SEC. ID NO: 11 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-ll.b por medio del uso de los oligonucleótidos K566 ( 5 ' -GAAGTTCATTTCTCTGGTGGCG GTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAG-3' ) y K568 (5 ' -CCGCGGCCGCAGATTCAGACT CAGACGGAC-3' ) . El protocolo de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 45°C y 60" a 72°C durante 20 ciclos. Los productos de la PCR se purificaron por medio del "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) . 25 ng de los productos de amplificación de ADN de la SEC. ID NO: 1 y SEC. ID NO: 3 se mezclaron conjuntamente y se utilizaron como moldes en la reacción PCR por medio del uso de los oligonucleótidos K563 y K567. El protocolo de la PCR fue 30" a 94°C, 30" a 45°C y 60" a 72°C durante 30 ciclos. 25 ng de la amplificación de ADN resultante se purificaron y luego se mezclaron con 25 ng del producto de amplificación de ADN de la SEC. ID NO: 11. Finalmente, la mezcla de ADN se utilizó como molde para la amplificación de ADN por medio del uso de los oligonucleótidos K563 y K568, siguiendo la condición de la PCR de 30" a 94°C, 30" a 45°C y 180" a 72°C durante 30 ciclos. El producto de proteína EC4 es una molécula quimérica que contiene las secuencias de ADN Tx-2.a, Tx-1.16 y Tx-11.b. La SEC. ID NO: 9 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-2.a utilizando los oligonucleótidos K551 y K553. La SEC. ID NO: 5 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-1.16 por medio del uso de los oligonucleótidos K552 y K572 (5 ' -CGTTACTACCGCCACCAGAG TTATCGCATTTGCAGGATGA-3' ) . El oligonucleótido K572 contiene una secuencia que codifica al conector SGGGS, el cual une las secuencias Tx-1.16 y Tx-ll.b. La SEC. ID NO: 11 se utilizó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-ll.b por medio del uso de los oligonucleótidos K571 (5 ' -TAACTCTGGTGGCGGTAGTAACGAACCGGT GGCCCTAGC-3 ' ) y K568. Los productos de la PCR se purificaron por medio del uso del "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) . 25 ng de los productos de amplificación de ADN de la SEC. ID NO: 9 y la SEC. ID NO : 5 se mezclaron conjuntamente y se utilizaron como moldes en la reacción PCR por medio del uso de los oligonucleótidos K551 y K572. 25 ng de la amplificación de ADN resultante se purificaron y luego se mezclaron con 25 ng de la amplificación de ADN de la SEC. ID NO: 11. Finalmente, la mezcla de ADN se utilizó como molde para la amplificación de ADN por medio del uso de los oligonucleótidos K551 y K568. Las condiciones de la PCR para la construcción de EC4 fueron las mismas que aquellas utilizadas para las construcciones EC2 y EC3. La siguiente Tabla 2 proporciona, a manera de ejemplo, las secuencias de ADN de los antígenos quiméricos EC2, EC3 y EC4: Tabla 2 Nombre Secuencia EC2 ACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCCATTTGCTCGGATTGGTC SEC. CGCATGGAGCCCCTGCAGTGTATCCTGCGGTGACGGAAGC ID CAAATCAGGACGCGAACTGAGGTTTCTGCTCCGCAACCTGG NO: 27 AACACCAACATGTCCGGACTGCCCTGCGCCCATGGGAAGGA CTTGCGTGGAACAAGGCGGACTTGAAGAAATCCGTGAATGC AGTGCGGGGGTATGTGCTGTTGACGCTGGATGTGGCGTCT GGTCTGGTGGCGGTAGCAGGACTGGATGTCATGCCTTCAG GGAGAACTGCAGCCCTGGTAGATGTATTGATGACGCCTCGC ATGAGAATGGCTACACCTGCGAGTGCCCCACAGGGTACTCA CGTGAGGTGACTTCCAAGGCGGAGGAGTCGTGTGTGGAAG GAGTCGAAGTCACGCTGGCTGAGAAATGCGAGAAGGAATTC GGCATCAGCGCGTCATCCTGCAAATGCGATAACTCTGGTGG CGGTAGCTCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTACG GTGCAGACAGCACTCTTGGTCCTGTCAAGTTGTCTGCGGAA GGACCCACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGT CAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGGACGA CGCTGACTGGTTGCAACGAGAAATCGTTCAAAGATATTTTGC CAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGT GATAAGGGTGCCACGCTAACGATCAAGAAGGAAGCATTTCC AGCCGAGTCAAAAAGCGTCATTATGGGATGCACAGGGGGAT CGCCTGAGAAGCATCACTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCC GGGGCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCTAGCGGCCGC EC3 ACTAGTCGGCTGGCTGCCTTGGGAGGCCTTGCGGATCAGC SEC. CTGAAAATCATCAGGCTCTTGCAGAACCAGTTACGGGTGTG ID GGGGAAGCAGGAGTGTCCCCCGTCAACGAAGCTGGTGAGT NO: 29 CATACAGTTCTGCAACTTCGGGTGTCCAAGAAGCTACCGCC CCAGGTGCAGTGCTCCTGGACGCAATCGATGCCGAGTCGG ATAAGGTGGACAATCAGGCGGAGGGAGGTGAGCGTATGAA GAAGGTCGAAGAGGAGTTGTCGTTATTGAGGCGGGAATTAT ATGATCGCACAGATCGCCCTGGTTTGTCTGGTGGCGGTAGT GCTACCGCGGCCACCGCGTCAGATGACGAACTGATGAGTC GAATCCGAAATTCTGACTTTTTCGATGGTCAAGCACCCGTTG ACAGTCTCAGACCGACGAACGCCGGTGTCGACTCGAAAGG GACCGACGATCACCTCACCACCAGCATGGATAAGGCATCTG TAGAGAGTCAGCTTCCGAGAAGAGAGCCATTGGAGACGGAG CCAGATGAACAAGAAGAAGTTCATTTCTCTGGTGGCGGTAG TAACGAACCGGTGGCCCTAGCTCAGCTCAGCACATTCCTCG AGCTCGTCGAGGTGCCATGTAACTCTGTTCATGTTCAGGGG GTGATGACCCCGAATCAAATGGTCAAAGTGACTGGTGCAGG ATGGGATAATGGCGTTCTCGAGTTCTATGTCACGAGGCCAA CGAAGACAGGCGGGGACACAAGCCGAAGCCATCTTGCGTC GATCATGTGTTATTCCAAGGACA?TGACGGCGTGCCGTCAG ACAAAGCGGGAAAGTGCTTTCTGAAGAACTTTTCTGGTGAAG ACTCGTCGGAAATAGACGAAAAAGAAGTATCTCTACCCATCA AGAGCCACAACGATGCGTTCATGTTCGTTTGTTCTTCAAATG ATGGATCCGCACTCCAGTGTGATGTTTTCGCCCTTGATAACA CCAACTCTAGCGACGGGTGGAAAGTGAATACCGTGGATCTT GGCGTCAGCGTTAGTCCGGATTTGGCATTCGGACTCACTGC AGATGGGGTCAAGGTGAAGAAGTTGTACGCAAGCAGCGGC CTGACAGCGATCAACGACGACCCTTCCTTGGGGTGCAAGGC TCCTCCCCATrCTCCGCCGGCCGGAGAGGAACCGAGTTTGC CGTCGCCTGAAAACAGCGGGTCTGCAACACCAGCGGAAGA AAGTCCGTCTGAGTCTGAATCTGCGGCCGCGG EC4 ACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCCATTTGCTCGGATTGGTC SEC. CGCATGGAGCCCCTGCAGTGTATCCTGCGGTGACGGAAGC ID CAAATCAGGACGCGAACTGAGGTTTCTGCTCCGCAACCTGG NO: 31 AACACCAACATGTCCGGACTGCCCCGCGCCCATGGGAAGG ACTTGCGTGGAACAAGGCGGACTTGAAGAAATCCGTGAATG CAGTGCGGGGGTATGTGCTGTTGACGCTGGATGTGGCGTCT GGTCTGGTGGCGGTAGCAGGACTGGATGTCATGCCTTCAG GGAGAACTGCCGCCCTGGTAGATGTATTGATGACGCCTCGC ATGAGAATGGCTACACCTGCGAGTGCCCCACATGGTACTCA CGTGAGGTGACTTCCAAGGCGGAGGAGTCGTGTGTGGAAG GAGTCGAAGTCACGCTGGCTGAGAAATGCGAGAAGGAATTC GGCATCAGCGCGTCCTCCTGCAAATGCGATAACTCTGGTGG CGGTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAGCTCAGCTCAGCACAT TCCTCGAGCTCGTCGAGGTGCCATGTAACTCTGTTCATGTTC AGGGGGTGATGACCCCGAATCAAATGGTCAAAGTGACTGGT GCAGGATGGGATAATGGCGTGCTCGAGTGCTATGTCACGAG GCCAACGAAGACAGGCGGGGACACAAGCCGAAGCCACCTT GCGTCGATCATGTGTTATTCCAAGGACATTGACGGCGTGCC G?CAGACAMGCGGGAAAGTGCTTTTTGAAGAACTTTTCTGG TGAAGACTCGTCGGAAATAGACGAAAAAGAAGTATCTCTACC CATCAAGAGCCACAACGATGCGTTCATGTTCGTTTGTTCTTC AAATGATGGATCCGCACTCCAGTGTGATGTTTTCGCCCTTGA TAACACCAACTCTAGCGACGGGTGGAAAGTGAATACCGTGG ATCTTGACGTCAGCGTTAGTCCGGATTTGGCATTCGGACTCA CTGCAGATGGGGTCAAGGTGAAGAAGTTGTACGCAAGCAGC GGCCTGACAGCGATCAACGACGACCCTTCCTTGGGGTGCAA GGCTCCTCCCCATTCTCCGCCGGCCGGAGAGGAACCGAGT TTGCCGTCGCCTGAAAACAGCGGGTCTGCAACACCAGCGGA AGAAAGTCCGTCTGAGTCTGAATCTGCGGCCGCGG La proteína quimérica EC2 tiene la secuencia de aminoácidos TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCP APMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHAFRENCSPGRCIDDASHE NGYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISASSCKCDNSGGGSSWNNV ARCSYGADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKDILP KLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGCTGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAK SASGR (SEC. ID NO: 28) y su uso como antígeno recombinante, que contiene múltiples fragmentos de proteína de Toxoplasma gondii , está cubierto por la presente invención. La proteína quimérica EC3 tiene la secuencia de aminoácidos TSRLAALGGLADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGV QEATAPGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPGLSGGGSAT AATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRRE PLETEPDEQEEVHFSGGGSNEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGW DNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEK EVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLGVSVSPDLAFGLT ADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESE SAAA (SEC. ID NO: 30) y su uso como antígeno recombinante, que contiene múltiples fragmentos de proteína de Toxoplasma gondii , está cubierto por la presente invención. La proteína quimérica EC4 tiene la secuencia de aminoácidos TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCP APMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHAFRENCRPGRCIDDASHE NGYTCECPTWYSREVTSKAEESCV?GVEVTLAEKCEKEFGISASSCKCDNSGGGSNEPVAL AQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLA SIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSAL QCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLDVSVSPDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLG CKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESESAAA (SEC. ID NO : 32) y su uso como antígeno recombinante, que contiene múltiples fragmentos de proteína de Toxoplasma gondii , está cubierto por la presente invención.

Construcción de vectores de ADN que dirigen la expresión de antígenos quiméricos como productos de fusión con GST en el citoplasma de células de E. coli Los fragmentos de ADN que codifican las proteínas quiméricas EC2 , EC3 y EC4 se clonaron como productos de fusión con la proteína Glutationa Sulfo-Transferasa (GST) y se expresaron como proteínas solubles en el citoplasma de células bacterianas, con el propósito de determinar su especificidad y selectividad. Las secuencias de ADN de EC2, EC3 y EC4 (SEC. ID NOS: 27, 29 y 31, respectivamente) se digirieron con las enzimas de restricción Spel y Notl. El ADN digerido se clonó en el vector pGEX-SN (Minenkova y colaboradores, International Journal of Cáncer, 2003 , 106 : 534-44 ) , el cual se digirió previamente con las endonucleasas, Spel y Notl, para generar productos de fusión en la terminación carboxi de la proteína GST. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar las células competentes de E. coli siguiendo protocolos estándar ( Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) .

Caracterización bioquímica de los antígenos quiméricos recombinantes Las proteínas recombinantes GST-EC2, GST-EC3 y GST-EC4 se expresaron en el citoplasma de células transformadas de E. coli y se purificaron por medio de la cromatografía de afinidad utilizando la resina de Glutationa-Sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia) , siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza y la concentración de la proteína se evaluaron por medio del análisis en SDS-PAGE (Electroforesis en Gel de Dodecil-Sulfato de Sodio-Poliacrilamida) y el ensayo de Bradford, respectivamente. Los productos recombinantes purificados por afinidad se dializaron contra PBS, se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml con PBS y se almacenaron a -20°C hasta el uso. El rendimiento de los productos purificados fue 8 mg/litro de cultivo bacteriano, 5 mg/litro y 4 mg/litro para los antígenos quiméricos GST-EC2, GST-EC3 y GST-EC4, respectivamente. Las proteínas recombinantes se sujetaron subsecuentemente al análisis en la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) . Con este propósito, se realizó una filtración en gel utilizando una columna para CLAR TSK G4000 SW-XL, al inyectar 30 µl de cada muestra (concentración de proteína, 2 mg/ml) en la columna con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto (fase móvil: KH2P04 0.05 M; NaCl 0.3 M pH 7.0). Los resultados del análisis en CLAR demostraron que los antígenos quiméricos GST-EC2, GST-EC3 y GST-EC4 se purificaron como productos homogéneos en formas diméricas (véase la Figura 4 donde el análisis de CLAR de GST-EC2 se muestra como un ejemplo) , con un peso molecular respectivo de 110.4, 152.6 y 130 kDa (Da, Dalton). Los agregados de proteínas de alto peso molecular están ausentes en la totalidad de las preparaciones de proteínas purificadas.

Inmunorreactividad de los antígenos recombinantes quiméricos con anticuerpos de IgG de sueros de individuos infectados por T. gondii : Rec-ELISA para prueba de IgG El desempeño en ELISA de los productos de fusión de GST se realizó al revestir placas de múltiples pocilios Maxisorp"1* (Nunc) con fragmentos de antígenos individuales o proteínas quiméricas a una concentración de 5 µg/ml en amortiguador de revestimiento (NaHC03 50 mM, pH 9.6). Después de la incubación durante toda la noche a 4°C, las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C con amortiguador de bloqueo (leche en polvo descremada al 5%, Tween-20 al 0.05% en PBS) y se incubaron subsecuentemente durante 1 hora a 37°C con sueros de individuos seropositivos o seronegativos para T. gondii , diluidos 1:200 en solución de bloqueo. Las placas se lavaron extensivamente con Tween-20 al 0.05% en PBS y los anticuerpos conjugados en peroxidasa de rábano picante anti-IgG de humano (1 mg/ml; Sigma-Aldrich, EUA), diluidos 1:10000 en solución de bloqueo, entonces se agregaron a cada pocilio. Finalmente, la incubación de las placas con el substrato cromogénico tetrametilbencidina (TMB; Sigma-Aldrich, EUA) reveló la actividad enzimática. Los resultados se registraron como la diferencia entre la absorbancia (Densidad Óptica, OD, por sus siglas en inglés) a 450 y 620 nm, detectada por un lector de ELISA automatizado (Labsystem Multiskan, Finlandia) . Para cada muestra de suero, el ensayo se realizó por triplicado y se calcularon los valores promedio. La siguiente Tabla 3 muestra la reactividad con IgG de los fragmentos de antígenos individuales y los antígenos quiméricos EC2 , EC3 y EC4, expresados como proteínas de fusión de GST, mediante el uso de sueros de 36 humanos seropositivos para T. gondii (T1-T36) y 27 humanos seronegativos para T. gondii (N1-N27) . Se reportan los niveles de IgG específicos del Toxoplasma, calculados como Unidades Internacionales (IU, por sus siglas en inglés) utilizando un ensayo comercial (sistema VIDAS, bioMerieux, Marcy-I 'Etoile, Francia). Para cada producto de fusión de GST, el valor de corte se determinó como el promedio más dos veces la desviación estándar de las lecturas de absorbencia obtenidas de los sueros negativos para IgG de Toxoplasma . Tipo normal, OD<corte; estilo tipográfico negrita, OD>corte. El valor numérico reportado en cada célula se calculó como la relación de la OD de prueba con respecto al corte del antígeno correspondiente (nd, no determinado) . Los valores mayores que 1 indican una respuesta positiva. La Tabla 3 muestra claramente que algunos de los sueros que son positivos resulta que son negativos cuando se utilizan fragmentos antigénicos individuales, mientras que resulta que son positivos (correctamente) cuando se utilizan los antígenos quiméricos de la presente invención. Favor de observar que los valores numéricos de las concentraciones de IgG obtenidas con el ensayo estándar no pueden compararse con los otros, debido a que se han calculado por referencia a un Estándar Internacional, el cual no puede utilizarse para los otros ensayos . Tabla 3 Muestra Niveles de Proteínas de fusión de GST Recombinantes de Suero IgG (lU/ml) Tx-15.11 Tx-1.11 Tx-1.16 Tx-4.18 Tx-2.a Tx-11.b EC2 EC3 EC4 Muestra Niveles de Proteínas de fusión de GST Recombinantes Muestra Niveles de Proteínas de fusión de GST Recombinantes Muestra Niveles de Proteínas de fusión de GST Recombinantes La siguiente Tabla 4 resume los resultados de los ensayos ELISA basados en proteínas recombinantes, empleando muestras de suero de humanos seropositivos y seronegativos para T. gondii . En cada columna se reporta el número y los porcentajes correspondientes de sueros reactivos. A partir de la Tabla 4 resulta claro que la sensibilidad del ensayo (véase la 2a columna que reporta la ocurrencia de negativos falsos) es mejorada cuando se utilizan los antígenos quiméricos de la invención. Este mejoramiento es evidente con respecto a tanto el uso de fragmentos antigénicos individuales como el uso de una colección o mezclas (Mezcla Tx-1.16/Tx-4.18/Tx-2.a, Mezcla Tx-1.16/Tx-4.18/Tx-2. a, Mezcla Tx-1.16/Tx-2.a/Tx-11.b) de los diferentes fragmentos antigénicos individuales.

Tabla 4 Proteína de fusión de GST Sueros de sujetos Suero de sujetos infectados por T. gondii no infectados por T. gondii Tx-15.11 28/34 (82.4%) 0/15 Tx-1.11 29/33 (87.9%) 0/15 Tx-1.16 31/34 (91.2%) 0/15 Tx-4.18 27/33 (81.8%) 0/15 Tx-2.a 21/23 (91.3%) 0/14 Tx-11.b 18/23 (78.3%) 0/14 Mezcla Tx-1.16 Tx-4.18/Tx-2.a 35/36 (97.2) 0/27 Quimera EC2 36/36 (100%) 0/27 Mezcla Tx-15.1 MJ -? .11 Tx-11.b 35/36 (97.2%) 0/27 Quimera EC3 36/36 (100%) 0/27 Mezcla Tx-1.16 Tx-2.a/Tx-11.b 34/36 (94.4%) 0/27 Quimera EC4 36/36 (100%) 0/27 Inmunorreactividad de dominios de antígenos individuales dentro de los antígenos recombinantes quiméricos con anticuerpos para IgG de sueros de individuos infectados por T . gondi i Para verificar que los antígenos quiméricos retienen la inmunorreactividad de los fragmentos de antígenos individuales utilizados para su construcción, los sueros de humanos que reaccionaron específicamente, en ensayos ELISA, con los fragmentos de antígenos individuales fueron absorbidos con diferentes combinaciones de antígenos individuales y luego se sometieron a ensayo con las proteínas quiméricas. Con este propósito, distintas combinaciones de los fragmentos de antígenos, expresadas como productos de fusión de GST, se revistieron sobre placas de múltiples pocilios Maxisorb01 (Nunc) a una concentración de 10 µg/ml en amortiguador de revestimiento (NaHC03 50 mM, pH 9.6) y luego se incubaron durante toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron extensivamente y se incubaron subsecuentemente durante 30 minutos a 37°C con muestras de suero (20 µl/pocillo) en solución de bloqueo (leche en polvo descremada al 5%, Tween-20 al 0.05% en PBS). Los sueros agotados en anticuerpos específicos para el fragmento se recuperaron de cada pocilio, se agregaron a un nuevo pocilio, se incubaron durante 30 minutos y el mismo procedimiento se repitió 6 veces más. Las muestras que han sido agotadas por anticuerpos específicos contra fragmentos de antígenos individuales o múltiples se analizaron finalmente por medio de ensayos ELISA sobre los antígenos quiméricos. Con este propósito, los antígenos quiméricos EC2 , EC3 y EC4, como productos de fusión de GST, se revistieron durante toda la noche a 4°C en placas de múltiples pocilios Maxisorb"1* a una concentración de 5 µg/ml. Las placas revestidas se bloquearon y se incubaron subsecuentemente durante 1 hora a 37°C con los sueros de humano agotados en los anticuerpos que estaban diluidos 1:100 en solución de bloqueo. Las placas se lavaron extensivamente y los anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina anti-IgG de humano (Sigma-Aldrich, EUA), diluidos 1:7500 en solución de bloqueo, entonces se agregaron a cada pocilio. Finalmente, el substrato cromogénico de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma-Aldrich, EUA) reveló la actividad enzimática. Los resultados se registraron como la diferencia entre la absorbancia a 405 y 620 nm, detectada por medio de un lector de ELISA automatizado (Labsystem Multiskan, Finlandia) . Para cada muestra, el ensayo se realizó por duplicado y los valores promedio se calcularon.

Modificación bioquímica de los antígenos quiméricos EC2 y EC3 Para analizar la inmunorreactividad de los antígenos quiméricos EC2 y EC3 con los anticuerpos específicos anti-IgM de Toxoplasma en sueros de pacientes, las proteínas recombinantes se modificaron químicamente por medio de la biotinilación. Con este propósito, los GST-EC2 y GST-EC3 purificados, diluidos a una concentración de 1 mg/ml en PBS, se incubaron en presencia de un exceso molar de cinco veces del sulfosuccinimidil-6- (biotin-amido) hexanoato (Sulfo-NHS-LC-Biotina de Pierce, EUA) durante 3 horas sobre hielo. Las proteínas entonces se dializaron durante toda la noche contra PBS para retirar el exceso de reactivos de biotina sin reaccionar e hidrolizados. Los niveles de incorporación de biotina en los antígenos quiméricos se determinaron por medio del uso de un "Kit de Cuantificación de Biotina EZ" (Pierce, EUA), dando por resultado 1.4 biotina/molécula para GST-EC2 y 1.3 biotina/molécula para GST-EC3. Los productos etiquetados con biotina se diluyeron finalmente a una concentración de 0.5 mg/ml y se almacenaron a -20°C hasta su uso.

Inmunorreactividad de EC2 y EC3 etiquetados con biotina con los anticuerpos de IgM específicos para Toxoplasma : Rec-ELISA para prueba de igM Para investigar la inmunorreactividad de los antígenos recombinantes con inmunoglobulinas M específicas para Toxoplasma, se empleó un inmunoensayo de doble-emparedado (Rec-ELISA para prueba de IgM) . Las placas Maxisorb" (Nunc, EUA) se revistieron con anticuerpos de IgM anti-humano (Sigma-Aldrich, EUA) a una concentración de 10 µg/ml en amortiguador de revestimiento (NaHC03 50 mM, pH 9.6). Las placas se bloquearon con albúmina de suero bovino al 3% en PBS (solución de bloqueo) durante 1 hora a 37°C y se incubaron subsecuentemente durante 1 hora a 37°C con muestras de suero en solución de bloqueo. Las placas se lavaron y luego se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con las proteínas de fusión de GST etiquetadas con biotina, diluidas en solución de bloqueo. Después de lavarse extensivamente, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce, EUA) a una concentración de 1 µg/ml en solución de bloqueo. Finalmente, la actividad enzimática se reveló incubando las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente con el substrato tetrametilbenzidina (Sigma-Aldrich, EUA) . Los resultados se registraron como la diferencia entre la absorbancia a 450 y 620 nm, detectada por medio de un lector de ELISA automatizado (Labsystem Multiskan, Finlandia) . Para cada muestra, el ensayo se realizó por duplicado y los valores promedio se calcularon.

Estabilidad térmica de los antígenos quiméricos etiquetados con biotina A fin de determinar la estabilidad térmica de GST-EC2 y GST-EC3, etiquetados con biotina, los productos recombinantes se diluyeron a una concentración de 5 µg/ml en el amortiguador comercial "Stabilzyme1™" (SurModics, EUA) y se almacenaron a +4°C hasta el uso. Después de diferentes intervalos de tiempo (hasta 80 días) , la inmunorreactividad de las proteínas recombinantes en el análisis Rec-ELISA para prueba de IgM se valoró y los resultados obtenidos analizando los productos correspondientes mantenidos en congelamiento a -20°C se compararon. El ensayo Rec-ELISA para prueba de IgM se realizó como se describiera anteriormente, utilizando los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 etiquetados con biotina a una concentración final de 500 ng/ml en solución de bloqueo (BSA al 3% en PBS) y sueros humanos diluidos 1:100 en solución de bloqueo. Para cada muestra, el ensayo se realizó por duplicado y los valores promedio se calcularon. El valor ID50, calculado como el límite de días cuando se midió 50% de inmunorreactividad con IgM específica para toxoplasma, fueron 189 días y 97 días para GST-EC2 y GST-EC3 , respectivamente. Estos descubrimientos indican claramente que los antígenos quiméricos de la invención son estables en soluciones diluidas durante mucho tiempo, lo cual es un requisito fundamental para la utilidad comercial de un producto recombinante.

Evaluación expandida de Rec-ELISA para prueba de IgM Los antígenos quiméricos GST-EC2 y GST-EC3 etiquetados con biotina se sometieron a ensayo con anticuerpos de IgM en sueros de individuos infectados por T. gondii y los resultados de los ensayos Rec-ELISA para prueba de IgM se compararon para aquellos obtenidos con ensayos comerciales empleando un antígeno de Toxoplasma de células completas lisadas (sistema VIDAS de bioMerieux, Francia; ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS de DiaSorin, Italia) . Con este propósito, se sometieron a ensayo las muestras de suero de mujeres quienes adquirieron la toxoplasmosis primaria durante la gestación y quienes fueron remitidas para el seguimiento post-natal en Center for Perinatal Infection of Campania Región, Italia. Los ensayos para prueba de IgG e IgM bioMerieux VIDAS Toxo"11 se utilizaron para seleccionar tres grupos de muestras de suero para la evaluación de desempeño del ensayo Rec-ELISA para prueba de IgM específica para Toxoplasma . El Grupo A (n = 22) estaba compuesto de muestras negativas para el anticuerpo de IgM e IgG específico para T. gondii medido por medio de los ensayos para prueba de IgM e IgG VIDAS Toxo" . El Grupo B (n = 18) estaba compuesto de muestras con un perfil serológico consistente con una infección crónica (presencia del anticuerpo de IgG específico para T. gondii y la ausencia de la IgM específica para T. gondii medido por medio de los ensayos para prueba de IgM e IgG VIDAS Toxo" , respectivamente) . El Grupo C (n = 50) estaba compuesto de muestras con un perfil serológico consistente con una infección aguda (presencia de anticuerpos de IgM e IgG específicos para T. gondii medidos por medio de los ensayos para prueba de IgM e IgG VIDAS Toxo"11) . El ensayo Rec-ELISA para prueba de IgM se realizó como se describiera anteriormente y para cada muestra de suero, el ensayo se realizó por duplicado y los valores promedio se calcularon. La siguiente Tabla 5 muestra la reactividad con IgM de los antígenos quiméricos GST-EC2 y GST-EC3 etiquetados con biotina, comparados con los resultados obtenidos con ensayos comerciales (VIDAS"* y ETI-TOXO-K" ) , por medio del uso de sueros del grupo A (A1-A22), grupo B (B1-B18) y grupo C (Cl-C50) . Los niveles de IgG específica para Toxoplasma, calculados como Unidades Internacionales (IU) también se reportan. Para cada producto de fusión de GST etiquetado con biotina, el corte se determinó como el promedio más dos veces la desviación estándar de las lecturas de absorbencia obtenidas de los sueros negativos para IgM específica para T. gondii (grupos A y B, n = 40) . Los valores de corte para la VIDAS-IgM, ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS, GST-EC2 y GST-EC3 fueron 0.650, 0.500, 0.343 y 0.378, respectivamente. Los valores en estilo tipográfico negrita indican una respuesta positiva.

Tabla 5 Suero Toxo-lgG VIDAS- ETI-TOXOK- Rec-ELISA para prueba de IgM (lU/ml) lg MR Reverse-PLUSMR GST-EC2 GST-EC3 A1 0 0.05 0.397 0.268 0.256 A2 4 0.22 0.317 0.263 0.270 A3 0 0.18 0.252 0.264 0.237 A4 0 0.05 0.375 0.324 0.241 A5 2 0.17 0.272 0.298 0.222 A6 0 0.03 0.288 0.270 0.234 A7 0 0.19 0.210 0.215 0.379 A8 0 0.10 0.108 0.203 0.296 A9 0 0.06 0.324 0.314 0.291 A10 0 0.09 0.339 0.325 0.286 Suero Toxo-lgG VIDAS- ETI-TOXOK-M Rec-ELISA para p irueba de IgM (lU/ml) lgMMR Reverse-PLUSMR GST-EC2 GST-EC3 A11 0 0.05 0.193 0.223 0.271 A12 2 0.08 0.134 0.268 0.378 A13 4 0.12 0.115 0.309 0.335 A14 0 0.23 0.115 0.221 0.286 A15 0 0.06 0.230 0.281 0.374 A16 2 0.08 0.132 0.317 0.269 A17 1 0.18 0.123 0.277 0.281 A18 0 0.35 0.097 0.316 0.279 A19 0 0.28 0.346 0.274 0.272 A20 0 0.09 0.054 0.259 0.132 A21 0 0.61 0.206 0.24 0.312 A22 0 0.06 0.127 0.238 0.233 B1 24 0.06 0.239 0.255 0.189 B2 10 0.09 0.076 0.283 0.304 B3 44 0.14 0.124 0.265 0.261 B4 44 0.28 0.195 0.298 0.216 B5 25 0.1 0.131 0.273 0.185 B6 57 0.12 0.164 0.296 0.293 B7 12 0.22 0.185 0.257 0.194 B8 58 0.12 0.148 0.255 0.248 B9 56 0.4 0.174 0.232 0.268 B10 19 0.09 0.068 0.290 0.194 B11 56 0.16 0.136 0.179 0.221 Suero Toxo-lgG VIDAS- ETI-TOXOK-M Rec-ELISA para prueba de igM (lU/ml) lgMMR Reverse-PLUSMR GST-EC2 GST-EC3 B12 45 0.12 0.139 0.235 0.181 B13 87 0.12 0.096 0.207 0.218 B14 27 0.15 0.144 0.196 0.174 B15 33 0.46 0.242 0.285 0.378 B16 13 0.04 0.064 0.161 0.177 B17 67 0.13 0.111 0.177 0.213 B18 53 0.27 0.170 0.238 0.165 C1 28 5.37 1.04 0.350 0.548 C2 255 3.86 1.49 0.546 0.498 C3 78 3.01 1.38 0.471 0.867 C4 1358 2.28 1.17 0.464 0.453 C5 178 2.31 1.27 0.598 0.406 C6 155 2.00 0.97 0.993 0J20 C7 109 3.20 1.76 0J94 0.642 C8 99 3.16 1J8 0.572 0.389 C9 103 2.28 1.34 1.056 1.222 C10 85 2.22 1.44 0.930 0.704 C11 70 1.01 0J9 0.416 0.376 C12 26 1.34 0.93 0.392 0.461 C13 36 1.22 0.86 0.532 0.499 C14 156 0.99 0.58 0.534 0.833 C15 204 0.93 0.90 0.810 0J10 C16 133 1.13 0.85 0.465 0.322 Suero Toxo-lgG VIDAS- ETI-TOXOK-M Rec-ELISA parí i prueba de IgM (lU/ml) IgM MR Reverse-PLUS MR GST-EC2 GST-EC3 C17 183 1.14 0.82 0.320 0.327 C18 242 0.90 0.71 0.497 0.500 C19 80 1.00 0J9 0.444 0.706 C20 258 1.40 0.88 2.678 0.484 C21 278 1.69 1.06 0J03 0.509 C22 246 1.25 0.76 1.094 0.780 C23 59 1.23 0J1 0.495 1. C24 38 0J8 0.87 0.584 0.455 C25 130 0J6 0.92 0.562 0.545 C26 262 0.84 0.65 0.649 0.551 C27 168 0.96 0.85 1.439 0.938 C28 126 0J8 0.80 2.475 1.160 C29 197 1.36 0.61 0.544 0.358 C30 127 0.86 0.52 0.847 0.531 C31 72 1.28 0.93 1J56 0.891 C32 130 0J7 0J1 0.505 0.381 C33 439 1.00 0.66 0.834 0.464 C34 83 0.66 1.32 1.162 0.989 C35 178 0.89 0.87 0.694 0.487 C36 560 0.86 0.69 0.817 0.628 C37 223 0.96 0J3 0.531 0.819 C38 242 0.98 0.41 0.379 0.318 C39 118 1.16 0.84 0.420 .0.380 Suero Toxo-lgG VIDAS- ETI-TOXOK-M Rec-ELISA para prueba de IgM (lU/ml) lgMMR Reverse-PLUSMR GST-EC2 GST-EC3 C40 232 1.39 1.01 0.490 0.467 C41 213 1.03 1.05 0J50 0.822 C42 243 1.06 0.97 0.534 0.502 C43 154 0J5 0J3 0.455 0.337 C44 35 1.90 1.51 0.383 1.008 C45 667 0.85 1.01 0.366 0.285 C46 275 0.95 0.99 0.411 0.544 C47 157 1.93 1.36 0.382 0.464 C48 1037 1.08 0.51 0.385 0.301 C49 92 1.31 0.68 0.537 0.427 C50 255 0.69 0.69 0.354 0.30 ] La siguiente Tabla 6 muestra las características de desempeño de los ensayos comerciales (VIDAS-IgM"* y ETI- TOXOK-M Reverse PLUS"*) , comparados con los resultados obtenidos con los antígenos quiméricos EC2 y EC3 etiquetados con biotina (Rec-ELISA para prueba de IgM) . A partir de la Tabla 6 resulta claro que los valores tanto de especificidad como predictivos positivos de íos ensayos (véase la 3a columna que reporta la ocurrencia de positivos falsos) alcanzaron el máximo (100%) cuando se utilizan los antígenos quiméricos de la invención. Con respecto a la sensibilidad y al convenio, ambas pruebas comerciales ETI-TOXOK-M*01 que empleaba el antígeno para Toxoplasma de células completas lisadas y el ensayo rec-ELISA para prueba de IgM con el antígeno quimérico EC2 exhiben características de desempeño idénticas, con ambos valores muy cercanos al 100%.

Tabla 6 Prueba de diagnóstico Sensibilidad Especificidad Convenio PPV* NPV* (%) (%) (%) (%) (%) VIDAS-IgNT MR" 100 100 100 100 100 ETI-TOXOK-MMR 98.0 100 98.9 100 97.6 Rec-ELISA para prueba de EC2-lgM 98.0 100 98.9 100 97.6 Rec-ELISA para prueba de EC3-lgM 84.0 100 91.1 100 83.3 * PPV, valor predictivo positivo; NPV, valor predictivo negativo. Finalmente, se investigó la inmunorreactividad de los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 etiquetados con biotina con los anticuerpos para prueba de igM en sueros de infantes con toxoplasmosis congénita. En un estudio retrospectivo, se analizaron los sueros de 30 infantes de madres con infección primaria por T. gondii durante el embarazo. Veinte infantes tuvieron toxoplasmosis congénita y diez no estaban infectados, como se demostró por medio de la persistencia o desaparición de anticuerpos de IgG específicos para Toxoplasma después de 12 meses de edad, respectivamente. Dentro del grupo de pacientes infectados, la edad gestacional al momento de la infección materna fue el segundo trimestre en 6 madres y el tercer trimestre en 14 madres. 30 muestras de suero de infantes infectados y no infectados se analizaron por medio del ensayo Rec-ELISA para prueba de IgM y los resultados obtenidos con ensayos comerciales que empleaban el antígeno de Toxoplasma de células completas (ELFA-IgM y ETI-TOXOK-M Reverse PLUS") se compararon. Los niveles específicos de la IgG anti-Toxoplasma variaron de 28 a 1147 IU/ml para sueros de infantes infectados y de 19 a 170 IU/ml para sueros de sujetos no infectados. Para cada producto de fusión de GST, el valor de corte de determinó como el promedio más 2SD de las lecturas de absorbencia obtenidas con sueros de infantes no infectados. En la Tabla 7 se resumen los resultados de los ensayos Rec-ELISA para prueba de IgM con sueros individuales de infantes infectados. En su conjunto, el número de sueros reactivos con IgM varió de 70% (14/20) a 50% (10/20) utilizando los antígenos GST-EC2 y GST-EC3, respectivamente. En contraste, solo 7 de 20 infantes infectados (35%) tuvieron resultados positivos cuando se emplearon los ensayos ELFA-IgM" o ETI-TOXOK-M" . Entre los infantes no infectados, ninguno dé los sueros reconoció los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 en el ensayo Rec-ELISA para prueba de IgM o dio por resultado ser positivo utilizando ensayos comerciales . En conclusión, estos resultados demuestran que el uso de antígenos quiméricos recombinantes es efectivo en la distinción de individuos infectados por T. gondii de aquellos individuos no infectados, teniendo un desempeño de ensayo comparable o aún mejor con respecto al uso del antígeno taquizoito de células completas y podría proporcionar la base para inmunoensayos comerciales estandarizados para la serodiagnosis de toxoplasmosis.

Tabla 7 Reactividad con IgM específica para toxoplasma de muestras de suero de 30 infantes nacidos de madres con infección primaria por T. gondii adquirida durante el embarazo* Paciente Tiempo después Comienzo13 Niveles de Corte de Corte de Corte de Rec-ELISA no. del nacimiento IgG (lU/ml) ELF A- ETI- para prueba de IgM d (semanas) lgMc Toxo c GST-EC2 GST-EC3 T1 1 B 169 : 6.41 2.66 2.479 0.542 T2 2 B 988 0.73 0.15 0.360 0.270 T3 2 Sub 300 0.09 0.13 0.212 0.209 T4 3 Sub 57 0.05 0.23 0.206 0.211 T5 3 Sub 124 0.13 1.62 0.641 1.103 T6 4 Sub 218 0.04 0.09 0.452 0.269 T7 4 S 157 2.61 1.62 1.522 0.225 T8 4 S 172 3.98 1.50 1.804 0.353 T9 5 S 1147 0.07 0.10 0.519 0.206 Paciente Tiempo después Comienzo Niveles de Corte de Corte de Corte de Rec-ELISA no. del nacimiento IgG (lU/ml) ELFA- ETI- para prueba de IgM (semanas) lgMe Toxo c GST-EC2 GST-EC3 T10 5 B 47 0.11 0.12 0.272 0.276 T11 6 Sub 28 0.10 0.18 2.617 0.731 T12 6 Sub 136 0.07 0.11 0.314 0.216 T13 7 S 209 0.88 0.47 0.683 0.217 T14 8 Sub 43 0.06 0.07 0.196 0.213 T15 8 B 160 0.82 0.08 0.206 0.219 T16 8 B 64 0.02 0.40 0.231 0.228 T17 8 Sub 145 0.31 0.57 0.985 0.314 T18 9 Sub 300 6.37 1.30 0.548 0.315 T19 12 Sub 196 0.05 0.17 0.463 0.268 T20 12 Sub 75 0.05 0.07 0.237 0.222 N1 5 90 0.38 0.06 0.237 0.218 N2 5 170 0.06 0.07 0.204 0.200 N3 5 66 0.23 0.09 0.238 0.235 N4 3 44 0.07 0.12 0.176 0.209 N5 9 41 0.05 0.05 0.209 0.193 N6 5 66 0.07 0.06 0.194 0.196 N7 8 13 0.09 0.06 0.193 0.201 N8 9 13 0.14 0.06 0.208 0.231 N9 6 19 0.28 0.07 0.184 0.215 N10 5 20 0.13 0.05 0.189 0.240 Notas para la Tabla 7 a Las muestras de suero de niños infectados por T. gondii (T1-T20) o niños no infectados (Ni-NIO) se analizaron por medio de ensayos Rec-ELISA para prueba de IgM con los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 o por medio de ensayos comerciales (ELFA-IgM y ETI-TOXO-M" ) Gravedad del comienzo clínico: S. grave; B. benigno; Sub. subclínico. c Los valores de corte para los ensayos ELFA-IgM" y ETI-T0X0-M"* fueron 0.65 y 0.41 como fue indicado por los fabricantes, respectivamente. Negrita, valores > corte. d Los valores de corte para el ensayo Rec-ELISA para prueba de IgM utilizando los ancígenos GST-EC2 y GST-EC3 fueron 0.25 y 0.26, respectivamente. Negrita, valores > corte. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un antígeno recombinante quimérico que contiene la fusión de al menos . tres diferentes regiones antigénicas de Toxoplasma gondii , caracterizado porque las regiones antigénicas son epítopos de células B, los cuales se unen a los anticuerpos específicos para Toxoplasma gondii .
2. 2. El antígeno quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los anticuerpos específicos para Toxoplasma gondii se extraen de sueros de sujetos quienes han sido infectados por Toxoplasma gondii .
3. 3. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las tres diferentes regiones antigénicas se unen por medio de un enlace covalente o por medio de un conector peptídico.
4. 4. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las tres diferentes regiones antigénicas tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEC. ID NO: 2, SEC. ID NO : 4, SEC. ID NO: 6, SEC. ID NO: 8, SEC. ID NO: 10, SEC. ID NO: 12, SEC. ID NO: 33, SEC. ID NO: 34, SEC. ID NO: 35, SEC. ID NO: 36, SEC. ID NO: 37, SEC. ID NO: 38, SEC. ID NO: 39, SEC. ID NO: 40, SEC. ID NO: 41 y SEC. ID NO: 42.
5. 5. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO : 28.
6. 6. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 30.
7. 7. El antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 32.
8. 8. Una secuencia de nucleótidos, caracterizada porque codifica el antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. 9. La secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende al menos tres diferentes secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEC. ID NO: 1, SEC. ID NO: 3, SEC. ID NO: 5, SEC. ID NO : 7, SEC. ID NO : 9 y SEC. ID NO: 11.
10. 10. La secuencia de nucleótidos de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 27.
11. 11. La secuencia de nucleótidos de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 29.
12. 12. La secuencia de nucleótidos de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 31.
13. 13. Una secuencia de nucleótidos, caracterizada porque se hibridiza con cualquier secuencia de conformidad con las reivindicaciones 8 a 12 bajo condiciones de hibridación rigurosas.
14. 14. El antígeno recombinante quimérico, caracterizado porque es codificado por la secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 13.
15. 15. La secuencia de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizada porque es una secuencia de ADN.
16. 16. Un vector, caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 15.
17. 17. Una célula hospedera, caracterizada porque es transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 16.
18. 18. Un proceso para la producción del antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17 y aislar el producto deseado.
19. 19. El uso de antígenos quiméricos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14 como agentes activos para el diagnóstico de infecciones por Toxoplasma gondii .
20. 20. El uso de conformidad con la reivindicación 19 para el diagnóstico de la toxoplasmosis congénita en infantes .
21. 21. El uso de conformidad con la reivindicación 19 para el diagnóstico del tiempo de infección.
22. 22. Los kits para el diagnóstico de la infección por Toxoplasma gondii , caracterizados porque contienen al menos un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14.
23. 23. Los kits para el diagnóstico de una infección aguda y/o crónica por Toxoplasma gondii , caracterizados porque contienen al menos un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14.
24. 24. El uso de antígenos quiméricos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14 como medicamentos .
25. 25. El uso de antígenos quiméricos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14 como ingredientes activos para la preparación de medicamentos para la prevención o el tratamiento de infecciones por Toxoplasma gondii .
26. 26. El uso de la secuencia de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 como medicamentos .
27. 27. El uso de la secuencia de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de medicamentos que son útiles para el tratamiento o la prevención de infecciones por Toxoplasma gondii .
28. 28. Una composición farmacéutica, particularmente en la forma de una vacuna, caracterizada porque contiene al menos un antígeno quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14.
29. 29. Una composición farmacéutica, particularmente en la forma de una vacuna, caracterizada porque contiene al menos una secuencia de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13.
30. 30. Una composición de conformidad con la reivindicación 27 o 28, caracterizada porque es adecuada para el uso humano y/o veterinario.
31. 31. Un método para tratar a un mamífero que sufre de infección por Toxoplasma gondii , caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29.