CN111116726A - 用于检测弓形虫的重组蛋白及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且与弓形虫的抗血清特异结合的蛋白。本发明实施例对弓形虫MIC2、MIC3、SAG1的基因进行抗原性分析，截取高抗原性区域，根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化，并加入连接链Linker(其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS)进行串联，构建重组表达载体以及重组表达菌，获得弓形虫MIC2‑MIC3‑SAG1重组表达蛋白，同时克服了表达蛋白产量低的缺陷。

Description

用于检测弓形虫的重组蛋白及其编码基因
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测弓形虫的重组蛋白及其编码基因。
背景技术
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫(Toxoplasma gondii)感染引起的一种可导致人及动物流产、畸形或死胎等的人兽共患寄生虫病，呈世界范围流行，严重危害公共卫生安全和畜牧业生产。孕妇、肿瘤患者、艾滋病患者等感染尤为严重，孕妇感染弓形虫病后可以导致流产、死胎和胎儿畸形，甚至导致胎儿发育迟缓以及弱智。此外器官移植患者以及艾滋病人等免疫力缺陷患者感染弓形虫可以导致死亡。
犬猫在弓形虫的生活史中扮演了重要角色，猫作为弓形虫的终末宿主，可将弓形虫卵囊随粪便排出，污染环境，犬摄入卵囊污染的水或食物，再排出未活化卵囊，起到搬运工的作用。随着我国经济迅猛发展和人们生活水平的提高，城市中宠物犬、猫饲养量逐渐上升，人亲密接触宠物犬、猫增加了弓形虫传播给人的几率。另外，动物接触弓形虫卵囊污染的环境后后发生感染，当人通过摄入含有弓形虫包囊的未煮熟的动物肉类或食用被弓形虫卵囊污染的水果、蔬菜、饮用水而感染。弓形虫病的快速诊断将是弓形虫病防控工作的重点，犬、猫弓形虫的感染检测显得尤为重要。
目前对于检测犬、猫弓形虫病的确诊很困难，临床常用的血清学检测方法有间接荧光抗体试验(IFA)、间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。虽然IFA及MAT可以作为弓形虫抗体检测标准，但是存在检测实验室仪器设备要求过高，检测费时、费力、成本过高等问题，不能在各个实验室推广使用。酶联免疫吸附试验(Enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)是目前诊断弓形虫病常用的特异性强、灵敏度高的血清学检测方法，其操作方便快捷、检样品量大、实验条件要求低、易于标准化等特点，而成为临床及实验室广泛使用的检测方法。
目前，国内外常用的弓形虫病免疫诊断抗原包括：速殖子粗抗原、速殖子纯化抗原、基因重组抗原三种。近年来弓形虫ELISA检测所用的抗原多是虫体可溶性抗原，需要培养具有感染性的速殖子，具有较大的生物安全隐患，且容易与其他寄生虫发生较高的交叉反应。另外，其成分不确定，抗原制备批次间差别较大，不易标准化。
综上所述，如何制备更加敏感、特异的弓形虫诊断抗原，建立特异性强、灵敏度高的动物弓形虫病血清学检测方法，是亟待解决的技术问题。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种用于检测弓形虫的重组蛋白及其编码基因，以解决现有技术中检测弓形虫的特异性差、灵敏度低的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且与弓形虫的抗血清特异结合的蛋白。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明实施例的保护范围。
编码所述蛋白质的基因为如下1)或2)或3)的基因；
1)其核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有97％、至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也是本发明实施例的保护范围。
所述载体为将所述基因插入pET-32a(+)或pET-28a(+)中得到表达所述蛋白质的重组载体。
所述重组菌为将上述任一重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Transetta、或大肠杆菌TransB中表达权利要求1所述蛋白质的重组菌。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例对弓形虫MIC2、MIC3、SAG1的基因进行抗原性分析，截取高抗原性区域，根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化，并加入连接链Linker(其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS)进行串联，构建重组表达载体以及重组表达菌，获得弓形虫MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白，同时克服了表达蛋白产量低的缺陷；
本发明实施例的成功表达蛋白，使得刺激原克服了成分不稳定及存在交叉反应的缺点，很好地提高了检测特异性和敏感性，可特异性识别弓形虫阳性血清，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例的密码子优化对比图；
图2为本发明实施例的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒的及酶切产物电泳鉴定图，其中，M为marker III，泳道1为酶切pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒，泳道2为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒；
图3为本发明实施例的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒和pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒PCR产物电泳鉴定图；其中，M为marker III，泳道1及泳道3为水的阴性对照，泳道2为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒，泳道4为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒；
图4为本发明实施例的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白SDS-PAGE电泳图，其中，M：蛋白质分析质量标准，泳道1为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1在BL21(DE3)菌表达菌体破碎沉淀，泳道2为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1在Trans B菌表达破碎沉淀，泳道3为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1在Transetta菌表达菌体破碎沉淀，泳道4为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1在BL21(DE3)菌表达菌体破碎上清，泳道5为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1在Trans B菌表达破碎上清，泳道6为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1在Transetta菌表达菌体破碎上清；
图5为本发明实施例的pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白SDS-PAGE电泳图，其中，M：蛋白质分析质量标准，泳道1为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在Transetta菌表达菌体破碎上清，泳道2为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在Trans B菌表达破碎上清，泳道3为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在BL21(DE3)菌表达菌体破碎上清，泳道4为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在Transetta菌表达菌体破碎沉淀，泳道5为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在Trans B菌表达破碎沉淀，泳道6为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在BL21(DE3)菌表达菌体破碎沉淀，泳道7为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1在BL21(DE3)菌未诱导表达菌体破碎全菌；
图6为本发明实施例的纯化的pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组串联蛋白及pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组串联蛋白SDS-PAGE电泳图，其中，M：蛋白质分析质量标准；1-2：纯化后pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组串联蛋白，3：纯化后pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组串联蛋白。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明实施例中，碳酸盐缓冲液(pH9.6)的配置方法为Na2CO3 1.59g，NaHCO32.93g，加入双蒸水至1000mL，调节pH 9.6。
5％小牛血清(Gibco)-PBS的配置方法为:称取NaCl 8g、Na2HPO4.12H2O3.63g、KH2PO4 0.24g溶于900mL双蒸水中，调节pH至7.4，加入50mL小牛血清(Gibco)，再加水定容至1L。
2％小牛血清(Gibco)-PBS的配置方法为:称取NaCl 8g、Na2HPO4.12H2O3.63g、KH2PO4 0.24g溶于900mL双蒸水中。
实施例1、基因序列及引物的设计和合成
参照Genbank中的弓形虫的MIC2基因序列(No.XM_002367433.1)、弓形虫的MIC3基因序列(No.EU572718.1)和SAG1基因序列(No.GQ253075.1)，根据大肠杆菌表达系统密码子偏好性进行密码子优化，并使用Linker连接(氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS)进行串联，密码子优化对比见图1。优化后的基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，同时在合成基因的5’和3’端加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，得到MIC2-MIC3-SAG1串联基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2、pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达质粒的构建
用EcoRⅠ和XhoⅠ分别双酶切载体pET-32a(+)和优化合成的弓形虫MIC2-MIC3-SAG1串联基因片段，将酶切的线性化的pET-32a(+)质粒和目的基因片段进行胶回收。用T4连接酶连接弓形虫MIC2-MIC3-SAG1串联基因片段与酶切线性化质粒pET-32a(+)，得到重组表达质粒，将该重组表达质粒命名为pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达质粒，pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，出现了约5900bp及948bp的DNA片段，与酶切线性化质粒pET-32a(+)和MIC2-MIC3-SAG1目的基因DNA片段大小相符，如图2所示。对挑选的质粒进行PCR鉴定，扩增出813bp的DNA片段，与目的基因DNA片段大小相符，如图3所示。所用引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；25μL PCR体系：PreMix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补至25μL；PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增DNA片段与理论大小相符。表明重组质粒pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1构建成功。阳性质粒送金唯智公司测序。
实施例3、pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达质粒的构建
用EcoRⅠ和XhoⅠ分别双酶切质粒pET-28a(+)和优化合成的弓形虫MIC2-MIC3-SAG1串联基因片段，对酶切的线性化的质粒pET-28a(+)和目的片段进行胶回收。用T4连接酶连接弓形虫MIC2-MIC3-SAG1串联基因片段与酶切的线性化的质粒pET-28a(+)，得到重组表达质粒，该重组表达质粒命名为pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达质粒，pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组质粒经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，得到约5300bp及948bp的DNA片段，与酶切的线性化的质粒pET-28a(+)和MIC2-MIC3-SAG1目的基因的DNA片段大小相符，对挑选的质粒进行PCR鉴定，扩增出813bp的DNA片段，与目的基因DNA片段大小相符，如图3所示，所用引物序列如SEQ ID NO:3-4所示；25μL PCR体系：PreMix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补至25μL；PCR反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增出813bp的条带，PCR扩增条带与理论大小相符。表明重组质粒pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1构建成功。阳性质粒送金唯智公司测序。
实施例4、pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组菌的优化及诱导表达与鉴定
各取1μl鉴定正确的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达质粒分别转化50μl的BL21(DE3)、Transetta、TransB感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴中热激90s后，快速将Eppendorf管移至冰浴中静置2-3min，加入800μL LB液体培养基中，37℃180r/min振荡培养50min复苏感受态细胞，3000r/min离心4-5min，弃大部分上清，混匀，吸取100μL菌液涂布LB/Amp+37℃培养过夜，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm，诱导6h。然后4℃，10000rpm，高速离心5min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤2次后用双蒸水重悬，超声波破碎后，高速离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白可溶性。
如图4所示，结果显示，MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白在各重组菌中均获得表达，其中在BL21(DE3)、Trans B和Transetta重组菌中为部分可溶性表达，但在Transetta重组菌中表达量最大，表达产物约53kD，与预期结果相符。
实施例5、pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组菌的优化及诱导表达与鉴定
各取1μl鉴定正确的pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达质粒分别转化50μl的Transetta、TransB感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴中热激90s后，快速将Eppendorf管移至冰浴中静置2-3min，加入800μL LB液体培养基中，37℃180r/min振荡培养50min复苏感受态细胞，3000r/min离心4-5min，弃大部分上清，混匀，吸取100μL菌液涂布LB/Kan+37℃培养过夜，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm，诱导6h。然后4℃，10000rpm，高速离心5min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤2次后用双蒸水重悬，超声波破碎后，高速离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白可溶性。如图5所示，结果显示，MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白在各重组菌中均获得表达，其中BL21(DE3)、Trans B和Transetta重组菌中均为可溶性表达，但在Transetta重组菌中表达量最大，表达产物约42kD，与预期结果相符。
实施例6、MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白的纯化
按上述方法进行pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1/Transetta重组菌和pET-21a-CaIFN-α2/Transetta重组菌的诱导、表达，将离心收集的菌体沉淀用PBS洗涤2次后用双蒸水重悬，冰浴超声波破碎后高速离心，取上清，弃沉淀。蛋白上清液经
Figure BDA0002366981410000081
滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱(HisTrap FF Crude colunm，购自GE公司)按操作手册在蛋白纯化仪(AKTApurifier，购自GE公司)上进行纯化，并用脱盐层析柱(HiTrap 26/10Desalting column，购自GE公司)进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS(pH7.4)缓冲溶液中，用SDS-PAGE检测蛋白大小，用BCA法测定目的蛋白终浓度。如图6所示，结果表明，经过亲和层析纯化后的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白和pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白纯度较高，均达到90％以上。经BCA法测定，纯化的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白浓度高达1.53mg/mL，而pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白浓度为1.12mg/mL。
实施例7、MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白免疫活性检测
取10μg纯化的pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白和pET-28a-MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白，加入2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，经12％SDS-PAGE电泳分离，电泳条件为90V浓缩40min、120V电泳分离90min。裁剪大小与凝胶面积一致的6张Whatman滤纸和1张PVDF膜，先将PVDF膜在甲醇中浸泡10min，然后将海绵垫、滤纸、PVDF膜置转印缓冲液中浸透约10min；转印电极装置从负极到正极依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸和海绵垫，每层在放置时均用玻棒轻轻滚动除尽气泡；固定好转印电极后，将电极插入电转槽，注满转印缓冲液(pH 8.2)，置冰浴中，60V恒压转印3h或35V转印过夜。转印结束后，取出PVDF膜，用PBS洗涤1次，浸入1×丽春红染色液中染色5-10min，取出PVDF膜，用蒸馏水漂洗直至条带清晰，检测转印效果。将丽春红染色后的PVDF膜转移至封闭液中，室温轻摇3-5h或者4℃封闭过夜；倾去封闭液，用PBST洗膜，5min×3次；加入1：50稀释的弓形虫多抗中，室温下振荡1-2h；PBST洗膜5次，每次5min；加入1：5000稀释的HRP标记的山羊抗犬IgG(Invitrogen)，室温振荡30min；PBST洗膜6-8次，每次10min，充分洗涤；在DAB底物中孵育5min，结果均出现了特异性条带。
综上，本发明实施例的MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白在pET-32a及pET-28a载体系统中均能成功表达，且具有免疫活性，但在pET-32a载体系统中的表达量更高，达15mg/L。
实施例8、弓形虫MIC2-MIC3-SAG1兔多克隆抗体的制备与鉴定
(1)将弓形虫速殖子注射免疫犬，免疫2次，第二次免疫后10天收集血清，采用间接ELISA检测纯化抗体，结果速殖子免疫兔的抗体效价为1：25600；
(2)用纯化的MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白作为抗原免疫犬，各免疫2只，200μg/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，3免后一周心脏采血，分离血清，以ELISA检测弓形虫抗体；经ELISA检测MIC2-MIC3-SAG1免疫犬的抗体效价为1:128000。具有较好的特异性。采用Protein G亲和层析，AKTA蛋白纯化仪进行了多抗的纯化，并用BCA试剂盒进行了蛋白定量。
实施例9、MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白介导的间接ELISA检测方法
采用表达的重组蛋白MIC2-MIC3-SAG1(pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组串联蛋白)作为检测抗原包被ELISA板，以弓形虫速殖子阳性血清和阴性血清为一抗，HRP标记兔抗犬IgG为二抗，进行ELISA检测。通过优化抗原包被浓度、一抗稀释度、二抗稀释度、封闭液的种类及封闭条件，稀释液种类等，最终选择重组蛋白MIC2-MIC3-SAG1(pET-32a-MIC2-MIC3-SAG1重组串联蛋白)包被浓度为0.2μg/孔，包被液为碳酸盐缓冲液(pH9.6)，最佳封闭液为5％小牛血清(Gibco)-PBS，封闭条件为4℃封闭过夜。一抗、二抗的最佳稀释液为2％小牛血清(Gibco)-PBS，阴、阳性血清的最佳稀释度为1:800，二抗的最佳稀释度为1：4000，最佳封闭液为5％小牛血清(Gibco)-PBS，4℃封闭过夜，一抗、二抗的最佳稀释液为2％小牛血清-PBS，初步建立了弓形虫间接ELISA检测方法。对弓形虫及亲缘关系较近的艾美耳球虫(早熟艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫)进行检测，结果均为阴性，表明其与其他寄生虫无交叉反应，特异性很高。与商品化胶体金试纸条进行比较，对146份临床犬血清进行检测，结果阳性率为26％(38/146)，而商品化胶体金试纸条检测阳性率为13.69％(20/146)，表明ELISA检测方法敏感性更高。
本发明实施例的MIC2-MIC3-SAG1重组表达蛋白具有较好的免疫原性，可用于弓形虫的临床检测使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002366981410000111
Figure BDA0002366981410000121
Figure BDA0002366981410000131
Figure BDA0002366981410000141
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 用于检测弓形虫的重组蛋白及其编码基因
<130> GG19691750A
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaattcctgc cgcaagatgc tatttgttca gattggtcag cctggtcgcc gtgttcggtg 60
tcgtgtggtg atggttctca gatccgtacc cgcaccgaag ttagtgcacc gcagccgggt 120
accccgacgt gcccggattg tccggctccg atgggtcgca cctgcgttga acaaggcggt 180
ctggaagaaa ttcgtgaatg cagcgccggt gtgtgtgcag ttgacgcagg ttgcggtgtg 240
tggggcggtg gcggtagtgg cggtggcggt tccggcggtg gcggttcacg taccggttgt 300
catgcgtttc gcgaaaactg cagcccgggt cgttgtattg atgacgcctc tcacgaaaat 360
ggctatacct gcgaatgtcc gacgggttac tcgcgcgaag tcaccagcaa agcggaagaa 420
tcttgcgtgg aaggcgtcga agtgacgctg gcggaaaaat gtgaaaagga atttggtatc 480
agcgccagct cttgcaaatg tgataacggc ggtggcggta gtggcggtgg cggttccggc 540
ggtggcggta gttccgtggt taacaatgtc gcgcgttgct catatggcgc cgattcgacc 600
ctgggtccgg ttaaactgtc tgccgaaggc ccgaccacga tgacgctggt ctgtggcaaa 660
gatggtgtta aggtcccgca ggacaacaat caatactgca gtggcaccac gctgaccggt 720
tgtaacgaaa agtccttcaa ggatatcctg ccgaaactga cggaaaaccc gtggcagggc 780
aatgcatcat cggacaaggg tgctaccctg acgatcaaaa aggaagcatt cccggctgaa 840
agcaaaagcg tgattatcgg ttgtaccggc ggtagcccgg aaaaacatca ttgtacggtg 900
aaactggaat ttgcgggtgc ggcgggttcg gctaagtcgg cactcgag 948
<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Leu Pro Gln Asp Ala Ile Cys Ser Asp Trp Ser Ala Trp Ser Pro Cys
1 5 10 15
Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ser Gln Ile Arg Thr Arg Thr Glu Val
20 25 30
Ser Ala Pro Gln Pro Gly Thr Pro Thr Cys Pro Asp Cys Pro Ala Pro
35 40 45
Met Gly Arg Thr Cys Val Glu Gln Gly Gly Leu Glu Glu Ile Arg Glu
50 55 60
Cys Ser Ala Gly Val Cys Ala Val Asp Ala Gly Cys Gly Val Trp Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr
85 90 95
Gly Cys His Ala Phe Arg Glu Asn Cys Ser Pro Gly Arg Cys Ile Asp
100 105 110
Asp Ala Ser His Glu Asn Gly Tyr Thr Cys Glu Cys Pro Thr Gly Tyr
115 120 125
Ser Arg Glu Val Thr Ser Lys Ala Glu Glu Ser Cys Val Glu Gly Val
130 135 140
Glu Val Thr Leu Ala Glu Lys Cys Glu Lys Glu Phe Gly Ile Ser Ala
145 150 155 160
Ser Ser Cys Lys Cys Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala Arg Cys Ser
180 185 190
Tyr Gly Ala Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Leu Ser Ala Glu Gly
195 200 205
Pro Thr Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val Pro
210 215 220
Gln Asp Asn Asn Gln Tyr Cys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn
225 230 235 240
Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ile Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp
245 250 255
Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys
260 265 270
Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser Val Ile Ile Gly Cys Thr Gly
275 280 285
Gly Ser Pro Glu Lys His His Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala Gly
290 295 300
Ala Ala Gly Ser Ala Lys Ser Ala
305 310
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccgtgttcgg tgtcgtgt 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
accgataatc acgcttttgc tttca 25

Claims (6)

1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且与弓形虫的抗血清特异结合的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码权利要求1所述蛋白质的基因为如下1)或2)或3)的基因；
1)其核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有97％、至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
5.如权利要求4所述载体，其特征在于，所述载体为将权利要求2或3所述基因插入pET-32a(+)或pET-28a(+)中得到表达权利要求1所述蛋白质的重组载体。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为将权利要求4或5中的重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Transetta、或大肠杆菌TransB中表达权利要求1所述蛋白质的重组菌。
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