CN113603760B - 一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，涉及蛋白纯化技术领域。本发明所述方法，选取弓形虫表面抗原SAG1的全长序列，融合组氨酸标签，在大肠杆菌中大量表达弓形虫重组抗原的包涵体，经过高浓度的尿素变性，依次进行镍柱纯化和阴离子交换柱纯化，最后复性得到抗原性较强的弓形虫重组抗原蛋白。本发明所述方法，首先可有效去除绝大多数杂蛋白，获得抗原性较强的弓形虫重组抗原蛋白，抗原纯度达95%以上，能够在‑20℃稳定保存；其次，本发明所述方法容易放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产需要。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术和蛋白质纯化技术领域，特别涉及一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法。
背景技术
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生虫。猫科动物是弓形虫的最终宿主，但弓形虫的中间宿主范围很广，可感染大多数温血动物，包括鸟类，啮齿动物和人类以及少数冷血动物。在大多数宿主中，弓形虫会在大脑，脊髓，骨骼肌，心肌或中枢神经系统等组织中建立终生潜伏感染并形成组织囊肿。由弓形虫作为病原体感染引发的弓形虫病是世界流行的人兽共患病，全球人群感染率约为25%-50%，部分地区可高达90%以上。
人类可以通过食用未洗净的蔬菜和未煮熟的肉类以及受污染的水感染弓形虫病。免疫力较强的人群，其感染症状接近流感症状，如感冒，肌肉酸痛，淋巴肿胀等，持续数天症状即可消失不会复发，甚至有人无感染症状。然而免疫力低下者如免疫功能缺陷者或老人小孩，弓形虫感染可能引发严重的肝肾疾病，脑部或眼部疾病等。值得重视的是，孕妇感染弓形虫病无论是否有临床症状，均可通过垂直传播直接感染胎儿。在妊娠早期感染的胎儿，其发育受到严重影响，造成胎儿畸形，早产，甚至导致流产，死胎等严重后果；妊娠晚期感染弓形虫的胎儿，可能在出生后乃至成年后才出现弓形虫病症。近年来，国民的肉食摄入量在增加，城市中饲养宠物也逐渐形成一股流行趋势，感染弓形虫病的外在风险不断增加，为了保证孕妇和胎儿的健康，针对弓形虫感染的早期抗体筛查是孕期优生优育检查项目中至关重要的一项，也是诊断其他疾病的重要指标。
现阶段实验室诊断弓形虫病最常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，配合重组抗原作为检测原料。表面抗原SAGs是检测弓形虫抗体的常用原料，其中SAG1对弓形虫IgG的敏感性和特异性均超过90%。以往通常使用活体培养获得弓形虫重组抗原，成本高昂，操作复杂。利用基因工程菌可以方便快捷地表达大量弓形虫重组抗原，但抗原通常表达为包涵体蛋白。传统方法使用0.5% SKL的缓冲体系可以部分溶解包涵体，但最终得到抗原的得率少，活性一般。因此，需要寻找一种适合工业化，效率较高的方法从包涵体中纯化弓形虫重组抗原SAG1。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，针对弓形虫表面抗原SAG1在大肠杆菌中呈包涵体表达的特点，本发明为工业生产提供了一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，该方法成本低廉，操作简便、制备高纯度、高活性的SAG1抗原。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）、将包含弓形虫重组抗原的菌体在破碎缓冲液A中重悬，每1 g菌体用15mL破碎缓冲液A；
步骤（2）、将步骤（1）中得到的菌液用超声破碎仪破菌，离心并收集上清液；
步骤（3）、将步骤（2）中得到的上清液上样至镍柱，用破碎缓冲液A冲洗柱子，洗杂缓冲液B洗脱杂蛋白，用解离缓冲液C解离目的蛋白，得到含有变性的弓形虫重组抗原的解离液；
步骤（4）、将步骤（3）中得到的解离液冰上搅拌，取等体积的复性缓冲液D分三次加入解离液中，冰上缓慢搅拌24 h；搅拌结束后，按1:100的体积比透析至上样缓冲液E，透析两次，得到含有复性弓形虫重组抗原的复性液；
步骤（5）、将步骤（4）中得到的复性液经过阴离子交换柱，上样缓冲液E冲洗柱子，解离缓冲液F解离目的蛋白，得到包含弓形虫重组抗原的溶液；
步骤（6）、将步骤（5）中得到的溶液透析至上样缓冲液E；最终得到包含弓形虫重组抗原SAG1的溶液。
进一步的，所述破碎缓冲液A中包括20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，20 mMimidazole，pH8.0。
进一步的，所述洗杂缓冲液B中包括20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，75 mMimidazole，pH8.0。
进一步的，所述解离缓冲液C中包括20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，500 mMimidazole，pH8.0。
进一步的，所述复性缓冲液D中包括20 mMTris，300 mMNaCl，5%（体积比（v/v））5%glycerol，pH8.0。
进一步的，所述上样缓冲液E中包括20 mMTris，pH8.0。
进一步的，所述解离缓冲液F中包括20 mMTris，500 mMNaCl，pH8.0。
进一步的，所述步骤（2）中，超声破碎的功率200W，超声破碎的时间为20 min；离心频率15000 rpm，离心时间30 min，离心温度4℃。
进一步的，所述步骤（1）中，包含弓形虫重组抗原的菌体制备方法，包括以下步骤：
步骤（11）、将pET28a-SAG1重组质粒转化至大肠杆菌感受态，涂布到含卡那霉素50μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB固体培养基上，37 ℃孵育16 h后挑取转化成功的阳性菌落，接种至含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃震荡培养8 h，取8mL菌液接种至800 mL LB液体培养基，37 ℃震荡培养3 h，OD600达到0.8-1时，添加IPTG至终浓度1 mM，37℃继续震荡培养4 h，5000 rpm离心5 min收集沉淀，得到包含弓形虫重组抗原的菌体。
进一步的，所述步骤（11）中的大肠杆菌感受态为Rosetta(DE3)，含氯霉素抗性，可表达稀有密码子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种弓形虫重组抗原SAG1的全长蛋白序列的表达纯化方法，该抗原对弓形虫抗体的敏感性和特异性均高达90%以上，但是该抗原使用现有的原核表达技术通常表达为包涵体，故本发明提供了针对该包涵体的纯化方法，通过这个方法，可以在较短的时间内，以较低的经济成本制备抗原性强的弓形虫重组抗原SAG1。
其中：弓形虫重组抗原SAG1的全长蛋白序列为现有技术，所述蛋白序列在数据库里的编号是GenBank: AAO72426.1。
附图说明
图1是pET28a-SAG1重组质粒图谱；
图2是SAG1第一解离液电泳图；
图3是SAG1阴离子交换柱纯化电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）、将包含弓形虫重组抗原的菌体在破碎缓冲液A（20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，20 mM imidazole，pH8.0）中重悬，每1 g菌体用15 mL破碎缓冲液A；
其中，包含弓形虫重组抗原的菌体制备方法：
步骤（11）、将pET28a-SAG1重组质粒转化至大肠杆菌感受态，涂布到含卡那霉素50μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB固体培养基上，37 ℃孵育16 h后挑取转化成功的阳性菌落，接种至含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃震荡培养8 h，取8mL菌液接种至800 mL LB液体培养基，37 ℃震荡培养3 h，OD600达到0.8-1时，添加IPTG至终浓度1 mM，37℃继续震荡培养4 h，5000 rpm离心5 min收集沉淀，得到包含弓形虫重组抗原的菌体。
所述步骤（11）中的大肠杆菌感受态为Rosetta(DE3)，含氯霉素抗性，可表达稀有密码子。
步骤（2）、将步骤（1）中得到的菌液用超声破碎仪破菌，离心并收集上清液；
所述步骤（2）中，超声破碎的功率200W，超声破碎的时间为20 min；离心频率15000rpm，离心时间30 min，离心温度4℃。
步骤（3）、将步骤（2）中得到的上清液上样至镍柱，用破碎缓冲液A冲洗柱子，洗杂缓冲液B（20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，75 mM imidazole，pH8.0）洗脱杂蛋白，用解离缓冲液C（20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，500 mM imidazole，pH8.0）解离目的蛋白，得到含有变性的弓形虫重组抗原的解离液；
步骤（4）、将步骤（3）中得到的解离液冰上搅拌，取等体积的复性缓冲液D（20mMTris，300 mMNaCl，5%（体积比（v/v））5% glycerol，pH8.0）分三次加入解离液中，冰上缓慢搅拌24 h；搅拌结束后，按1:100的体积比透析至上样缓冲液E（20 mMTris，pH8.0），透析两次，得到含有复性弓形虫重组抗原的复性液；
步骤（5）、将步骤（4）中得到的复性液经过阴离子交换柱，上样缓冲液E冲洗柱子，解离缓冲液F（20 mMTris，500 mMNaCl，pH8.0）解离目的蛋白，得到包含弓形虫重组抗原的溶液；
步骤（6）、将步骤（5）中得到的溶液透析至上样缓冲液E；最终得到包含弓形虫重组抗原SAG1的溶液。
实施例2
1、菌体培养
将pET28a-SAG1重组质粒转化至大肠杆菌中感受态Rosetta(DE3)，涂布到含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB固体培养基上，37 ℃孵育16 h后挑取转化成功的阳性菌落，接种至含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃震荡培养8h，取8 mL菌液接种至800 mL LB液体培养基，37 ℃震荡培养3 h，OD600达到0.8-1时，添加IPTG至终浓度1 mM，37 ℃继续震荡培养4 h，5000 rpm离心5 min收集菌体。
2、一种纯化人源弓形虫重组抗原蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将上述菌体在破碎缓冲液A（20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，20 mMimidazole，pH8.0）中重悬，每1 g菌体用15 mL破碎缓冲液。
（2）将上述重悬菌液用超声破碎仪破菌，功率200W，超声20 min；15000 rpm，4 ℃离心30 min，收集上清液；
（3）将所述上清液上样至镍柱，用破碎缓冲液A冲洗柱子，洗杂缓冲液B（20mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，75 mM imidazole，pH8.0）洗脱杂蛋白，用解离缓冲液C（20mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，500 mM imidazole，pH8.0）解离目的蛋白，得到含有变性的弓形虫重组抗原的解离液；
（4）将解离液置于冰上，取等体积的复性缓冲液D（20 mMTris，300 mMNaCl，5%glycerol，pH8.0）分三次加入解离液中，在冰上缓慢搅拌24 h；搅拌结束后，按1:100的体积比透析至上样缓冲液E（20 mMTris，pH8.0），透析两次，得到含有复性弓形虫重组抗原的复性液；
（5）将上述复性液经过阴离子交换柱，上样缓冲液E冲洗柱子，洗脱杂蛋白，解离缓冲液F（20 mMTris，500 mMNaCl，pH8.0）解离目的蛋白，得到得到包含复性弓形虫重组抗原的溶液；
（6）将上述溶透析至上述上样缓冲液E（20 mMTris，pH8.0）；最终得到包含弓形虫重组抗原SAG1的保存液，10mL，浓度为1.5 mg/mL；图3显示阴离子交换柱纯化得到的抗原SAG1纯度较高。
实施例3
实施例2中得到的重组人源弓形虫重组抗原蛋白理化功能研究：
（1）、蛋白纯度
SDS-PAGE纯度>95％(如图3所示)。
（2）、抗原活性
采用间接法检测重组弓形虫重组抗原SAG1活性，与市面上在售SAG1抗原活性基本一致，符合要求。
图1是pET28a-SAG1重组质粒图谱；图1中SAG1抗原全长基因的插入位点为NdeI/HindIII，N端融合组氨酸标签；
图2是SAG1第一解离液电泳图，图2中SDS-PAGE检测镍柱纯化的解离液；箭头所指为弓形虫重组抗原SAG1；
图3是SAG1阴离子交换柱纯化电泳图，图3中 SDS-PAGE检测阴离子交换柱纯化的弓形虫重组抗原SAG1。
实验室通常使用ELISA检测弓形虫抗体，常规的ELISA检测原料主要是裂解弓形虫或活体培养获得的弓形虫天然抗原，但天然抗原制备周期长，成本高，批间差异大，常伴随假阳性。
本发明提供了一种弓形虫重组抗原SAG1的全长蛋白序列的表达纯化方法，该抗原对弓形虫抗体的敏感性和特异性均高达90%以上，但是该抗原使用现有的原核表达技术通常表达为包涵体，故本发明提供了针对该包涵体的纯化方法，通过这个方法，可以在较短的时间内，以较低的经济成本制备抗原性强的弓形虫重组抗原SAG1。
其中：弓形虫重组抗原SAG1的全长蛋白序列为现有技术，所述蛋白序列在数据库里的编号是GenBank: AAO72426.1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）、将包含弓形虫重组抗原的菌体在破碎缓冲液A中重悬，每1 g菌体用15 mL破碎缓冲液A；
步骤（2）、将步骤（1）中得到的菌液用超声破碎仪破菌，离心并收集上清液；
步骤（3）、将步骤（2）中得到的上清液上样至镍柱，用破碎缓冲液A冲洗柱子，洗杂缓冲液B洗脱杂蛋白，用解离缓冲液C解离目的蛋白，得到含有变性的弓形虫重组抗原的解离液；
步骤（4）、将步骤（3）中得到的解离液冰上搅拌，取等体积的复性缓冲液D分三次加入解离液中，冰上搅拌24 h；搅拌结束后，按1:100的体积比透析至上样缓冲液E，透析两次，得到含有复性弓形虫重组抗原的复性液；
步骤（5）、将步骤（4）中得到的复性液经过阴离子交换柱，上样缓冲液E冲洗柱子，解离缓冲液F解离目的蛋白，得到包含弓形虫重组抗原的溶液；
步骤（6）、将步骤（5）中得到的溶液透析至上样缓冲液E；最终得到包含弓形虫重组抗原SAG1的溶液；
所述破碎缓冲液A中包括20 mM Tris，300 mM NaCl，4 M Urea，20 mM imidazole，pH8.0；
所述洗杂缓冲液B中包括20 mM Tris，300 mM NaCl，4 M Urea，75 mM imidazole，pH8.0；
所述解离缓冲液C中包括20 mM Tris，300 mM NaCl，4 M Urea，500 mM imidazole，pH8.0；
所述复性缓冲液D中包括20 mM Tris，300 mM NaCl，5% glycerol，pH8.0；
所述上样缓冲液E中包括20 mM Tris，pH8.0；
所述解离缓冲液F中包括20 mM Tris，500 mM NaCl，pH8.0；
所述步骤（2）中，超声破碎的功率200W，超声破碎的时间为20 min；离心频率15000rpm，离心时间30 min，离心温度4℃。
2.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，包含弓形虫重组抗原的菌体制备方法，包括以下步骤：将pET28a-SAG1重组质粒转化至大肠杆菌感受态，涂布到含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB固体培养基上，37℃孵育16 h后挑取转化成功的阳性菌落，接种至含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃震荡培养8 h，取8 mL菌液接种至800 mL LB液体培养基，37 ℃震荡培养3 h，OD600达到0.8-1时，添加IPTG至终浓度1 mM，37℃继续震荡培养4 h，5000 rpm离心5min收集沉淀，得到包含弓形虫重组抗原的菌体。
3.根据权利要求2所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态为Rosetta(DE3)，含氯霉素抗性，可表达稀有密码子。
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| CN1861633A (zh) * | 2005-05-10 | 2006-11-15 | 陈晓光 | 一种基于重组抗原的弓形虫检测试剂盒 |
| CN107098955A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-08-29 | 潍坊汉唐生物工程有限公司 | 一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法 |
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