CN107098955A

CN107098955A - 一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN107098955A
Application number: CN201710507548.9A
Authority: CN
Inventors: 杨致亭; 杨勤德; 李桂芹; 王爱法; 高立峰; 王婷
Original assignee: WEIFANG HIGHTOP BIOTECH CO Ltd
Current assignee: WEIFANG HIGHTOP BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2017-08-29

Abstract

本发明属于生物学检测技术领域，具体提供了一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法，重组抗原组合物包含弓形虫SAG1特异表位重组抗原、弓形虫SAG3特异表位重组抗原、弓形虫GRA3特异表位重组抗原和弓形虫MIC3特异表位重组抗原。本发明还提供了重组抗原组合物的制备方法。本发明中的重组抗原组合物具有较好的特异性和敏感性，将其用于诊断弓形虫抗体，大大提高了临床检出率，有效解决了检测时所存在的假阳性及漏检问题。

Description

一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生的原虫，最终的宿主是猫科动物，但是可以在任何一种温血动物体内进行繁殖。该虫呈世界性分布，寄生于人和哺乳动物组织细胞内，可以引起严重的人畜共患病。

弓形虫病可导致孕妇流产、早产、反复流产和畸胎，甚至死产。即使受染成活，婴儿中85％在成年以前会出现视网膜脉络膜炎和中枢神经系统异常，极大影响优生优育，所以弓形虫病诊断是优生优育检查项目里很重要的一项。弓形虫病对免疫力低下和免疫缺陷的人群危害极大，不仅可引起弓形虫性脑炎、视网膜脉络膜炎、腹膜炎等，甚至会导致死亡。

随着生活水平的提高，居民养殖宠物猫和摄入肉食的机会增多，人感染弓形虫的危险性越来越大。弓形虫病缺少特异性的临床症状和体征，增加诊断难度，如果再区分急性感染和慢性感染就难上加难。目前抗弓形虫抗体检测用抗原多为弓形虫虫体提取物、SAG1重组全长等，但是弓形虫虫体分为5种不同形态的阶段，即滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，仅仅是某一种重组蛋白很可能会出现漏检，而且弓形虫虫体的粗提物由于成分多而且复杂也会导致假阳性，因此针对临床病原体检测方法检出率低，免疫学诊断方法也会存在敏感性和特异性的局限，筛选高敏感性和特异性的抗原是研制弓形虫病诊断试剂盒的关键。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供一种具有高敏感性和特异性，可避免假阳性，而且检出率高的用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，所述重组抗原组合物包含弓形虫SAG1特异表位重组抗原、弓形虫SAG3特异表位重组抗原、弓形虫GRA3特异表位重组抗原和弓形虫MIC3特异表位重组抗原。

作为一种改进的技术方案，所述SAG1特异表位重组抗原、SAG3特异表位重组抗原、GRA3特异表位重组抗原和MIC3特异表位重组抗原在所述重组抗原组合物中按照1-5:1-5:1-5:1-5的比例组合。

作为一种改进的技术方案，所述SAG1特异表位重组抗原的特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸到第316个氨基酸；SAG3特异表位重组抗原的特异表位为SAG3蛋白N端第41个氨基酸到382个氨基酸；GRA3特异表位重组抗原的特异表位为GRA3蛋白N端第44个氨基酸到第160个氨基酸；MIC3特异表位重组抗原的特异表位为MIC3蛋白N端第38个氨基酸到第383个氨基酸。

本发明的另一个目的在于：针对现有技术存在的不足，提供一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：

(1)抗原表位的筛选

利用在线分析工具，分析弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫SAG1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫SAG3蛋白特异性抗原位于第41个氨基酸到第382个氨基酸；弓形虫GRA3蛋白特异性抗原位于第44个氨基酸到第160个氨基酸；弓形虫MIC3蛋白特异性抗原位于第38个氨基酸到第383个氨基酸；

(2)弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白抗原表位的基因克隆

分别设计SAG1、SAG3、GRA3和MIC3的上、下游引物，以弓形虫DNA为模板，分别用设计的上、下游引物扩增弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白抗原表位的基因片段，电泳胶回收目的片段，置-20℃冻存备用；

(3)分别构建SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白表达载体

提取PGEX-6P-1和PRSET-B质粒，将PGEX-6P-1、PRSET-B分别经过双酶切，电泳后分别胶回收PGEX-6P-1、PRSET-B双酶切的质粒片段；SAG1蛋白、SAG3蛋白、GRA3蛋白和MIC3蛋白分别经过双酶切，电泳后胶回收双酶切目的片段，-20℃备用；将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，分别得到重组质粒。

作为一种改进的技术方案，所述制备方法还包括下列步骤：

重组质粒的筛选和鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),涂布含氨苄青霉素LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒，将分别提取的质粒双酶切，跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；

蛋白工程菌高效表达：

将鉴定阳性表达菌接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5-1.5mmol/l IPTG，25℃条件下继续诱导过夜,离心收集沉淀的菌体，再将菌体进行破碎，破碎后收集的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测；上清中含有PGEX-6P-1-GRA3和PGEX-6P-1-SAG1表达的目的蛋白，PRSET-B-SAG3和PRSET-B-MIC3以包涵体形式表达存在于沉淀中；

表达蛋白的纯化：

将重组蛋白工程菌液离心，收集的沉淀菌体重悬于原离心体积1/10的裂解液内，冰浴超声菌体10-30min后，离心，分别收集菌液上清和沉淀的包涵体；取菌液上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，离心，弃上清，沉淀中加入10倍标准体积的PBS，混匀，再经过离心、弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入1-3倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，搅动，离心后将收集的上清移至新管中，在PBS中透析24-48h，离心取上清，-20℃备用；取沉淀的包涵体，并用含0.5％SKL缓冲体系溶解，室温裂解包涵体、离心，收集上清，将上清经过透析过夜，再离心过滤膜后上镍柱纯化。

作为一种改进的技术条件，步骤(2)中的扩增条件为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃30s、58℃30s、72℃1min，共30个循环；阶段3：72℃5min。

作为一种改进的技术方案，步骤(3)中的重组质粒分别是PGEX-6P-1-SAG1、PRSET-B-MIC3、PGEX-6P-1-GRA3和PRSET-B-SAG3。

作为一种改进的技术方案，所述SAG1的上游引物SAG1P1包含以下序列：5’-TCGAACCCACCACTTGT-3’，所述SAG1的下游引物SAG1P2包含以下序列：5’-ACTGGCTGCTCACGT-3’；上游引物5’端添加Ndel酶切位点(CATATG)，下游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)；

所述SAG3的上游引物SAG3P1具有以下序列：5’-GAGCATGGTCTGTTCAT-3’，所述SAG3的下游引物SAG3P2具有以下序列:5’-ATGCACAAGGAGACCGAGA-3’；上游引物5’端添加BamHⅠ酶切位点(GGATCC)，下游引物5’端添加Ncol酶切位点(CCATGG)；

所述GRA3的上游引物GRA3P1具有以下序列：5’-CCTTACGTCCCTTTTTTA-3’，所述GRA3的下游引物GRA3P2具有以下序列:5’-ATAACGACAACGCCACT-3’；上游引物5’端添加BamHⅠ酶切位点(GGATCC)，下游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)；

所述MIC3的上游引物MIC3P1具有以下序列：5’-AGGTATGAAACGAGCCGA-3’，所述MIC3的下游引物MIC3P2具有以下序列:5’-ATCTTGTTTTTCACACCGA-3’；上游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，下游引物5’端添加Ncol酶切位点(CCATGG)。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：

本发明选择SAG1、SAG3、GRA3和MIC3四个代表性的抗原蛋白，分析四种蛋白氨基酸序列，挑选抗原性比较强的部分片断，作为重组抗原的对象，大大提高了表达的产量和特异性，将四种重组抗原复配得到的抗原组合物具有较好的特异性和敏感性，将其用于诊断弓形虫抗体，大大提高了临床检出率，有效解决了检测时所存在的假阳性及漏检问题。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，重组抗原组合物包含弓形虫SAG1特异表位重组抗原、弓形虫SAG3特异表位重组抗原、弓形虫GRA3特异表位重组抗原和弓形虫MIC3特异表位重组抗原。

其中SAG1特异表位重组抗原、SAG3特异表位重组抗原、GRA3特异表位重组抗原和MIC3特异表位重组抗原在所述重组抗原组合物中按照1-5:1-5:1-5:1-5的比例组合。

其中SAG1特异表位重组抗原的特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸到第316个氨基酸；SAG3特异表位重组抗原的特异表位为SAG3蛋白N端第41个氨基酸到382个氨基酸；GRA3特异表位重组抗原的特异表位为GRA3蛋白N端第44个氨基酸到第160个氨基酸；MIC3特异表位重组抗原的特异表位为MIC3蛋白N端第38个氨基酸到第383个氨基酸。

实施例2

一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，包括下列步骤：

(1)抗原表位的筛选

(2)弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白抗原表位的基因克隆

SAG1抗原表位DNA序列两侧设计引物；

上游引物SAG1P1：5’-TCGAACCCACCACTTGT-3’；下游引物SAG1P2：5’-ACTGGCTGCTCACGT-3’，上游引物5’端添加Ndel酶切位点(CATATG)，下游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)；

SAG3抗原表位DNA序列两侧设计引物；

上游引物SAG3P1：5’-GAGCATGGTCTGTTCAT-3’；下游引物SAG3P2:5’-ATGCACAAGGAGACCGAGA-3’；上游引物5’端添加BamHⅠ酶切位点(GGATCC)，下游引物5’端添加Ncol酶切位点(CCATGG)；

GRA3抗原表位DNA序列两侧设计引物；

上游引物GRA3P1：5’-CCTTACGTCCCTTTTTTA-3’；下游引物GRA3P2:5’-ATAACGACAACGCCACT-3’；上游引物5’端添加BamHⅠ酶切位点(GGATCC)，下游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)；

MIC3抗原表位DNA序列两侧设计引物；

上游引物MIC3P1：5’-AGGTATGAAACGAGCCGA-3’；下游引物MIC3P2:5’-ATCTTGTTTTTCACACCGA-3’，上游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，下游引物5’端添加Ncol酶切位点(CCATGG)；

以弓形虫DNA为模板，用引物SAG1P1和SAG1P2扩增弓形虫SAG1蛋白抗原表位的基因片段；用引物SAG3P1和SAG3P2扩增弓形虫SAG3蛋白抗原表位的基因片段；用GRA3P1和GRA3P2扩增弓形虫GRA3蛋白抗原表位的基因片段；用MIC3P1和MIC3P2扩增弓形虫MIC3蛋白抗原表位的基因片段，阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃30s、58℃30s、72℃1min，共30个循环；阶段3：72℃；电泳胶回收目的片段，SAG1目的片段为819bp，SAG3目的片段为1038bp，GRA3目的片段为363bp，MIC3目的片段为1050bp，置-20℃冻存备用；

(3)分别构建SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白表达载体

提取PGEX-6P-1和PRSET-B质粒，PGEX-6P-1分别用Ndel和XhoⅠ、BamH和XhoⅠ双酶切，PRSET-B分别用BamHⅠ和Ncol、XhoⅠ和Ncol双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；Ndel和XhoⅠ双酶切SAG1蛋白，BamHⅠ和Ncol双酶切SAG3蛋白，BamH和XhoⅠ双酶切GRA3蛋白，XhoⅠ和Ncol双酶切MIC3蛋白，电泳后胶回收双酶切目的片段，-20℃备用；

将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接后的重组质粒分别是PGEX-6P-1-SAG1、PRSET-B-MIC3、PGEX-6P-1-GRA3和PRSET-B-SAG3；

(4)重组质粒的筛选和鉴定

将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),涂布含氨苄青霉素(60ug/ml)LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒；PGEX-6P-1-SAG1、PRSET-B-SAG3、PGEX-6P-1-GRA3和PRSET-B-MIC3分别用Ndel和XhoⅠ、BamHⅠ和Ncol、XhoⅠ和Ncol、BamH和XhoⅠ双酶切，酶切后跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；

(5)蛋白工程菌高效表达

将鉴定阳性表达菌接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为1mmol/l IPTG，25℃条件下继续诱导过夜,离心收集沉淀的菌体，再将菌体进行破碎，破碎后收集的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测；上清中含有PGEX-6P-1-GRA3和PGEX-6P-1-SAG1表达的目的蛋白，而PRSET-B-SAG3和PRSET-B-MIC3以包涵体形式在沉淀中；对照菌中无目的蛋白条带，说明分别获得了高表达的SAG1、SAG3、GRA3和MIC3抗原性片段蛋白的工程菌；

(6)表达蛋白的纯化

高效表达的重组蛋白工程菌高速(10000rpm)低温(4℃)离心10min，将沉淀的菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液(50mM Tris-Hcl、10mM EDTA、15mM NaCL、10mM DTT)内，冰浴超声菌体20min，高速(12000rpm)低温(4℃)离心30min，分别收集菌液上清和沉淀的包涵体；

PGEX-6P-1-GRA3和PGEX-6P-1-SAG1表达的蛋白在上清中，上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，于室温下轻摇30min，混合物于4℃离心机中2100rpm/min转速下离心5min，弃上清；沉淀中加入10倍标准体积的PBS，颠倒数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白，将混合物于4℃离心机中2100rpm/min转速下离心5min，弃上清，收集沉淀，并向沉淀中加入1倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白，并4℃2100rpm/min转速下离心5min，上清移至新管中，重复2次，合并3次上清，在PBS(10mM，PH7.4)中透析48h，离心取上清即分别获得SAG1和GRA3抗原性目的蛋白，-20℃备用；

PRSET-B-SAG3和PRSET-B-MIC3表达蛋白以包涵体形式存在，包涵体用0.5％SKL的缓冲体系溶解(缓冲体系为50mM Tris-Hcl、10mM EDTA、15mM NaCL、10mM DTT)，室温裂解包涵体1h，4℃12000rpm/min离心20min，收集上清4℃透析过夜(透析液为50mM Tris-Hcl、10mM EDTA、15mM NaCL、10mM DTT)，透析后离心过0.22um的滤膜后上镍柱纯化；按0.5ml/min的流速使上述表达蛋白样品缓缓流过镍柱，用5倍柱床体积的BindingBuffer洗涤层析柱，再按照0.5ml/min的流速用ElutingBuffer洗脱目的蛋白。

实施例3 阳性表达菌重组质粒测序

将上述阳性表达菌用治理提取试剂盒提取质粒送于上海生工测序。

重组质粒内的SAG1基因片段的DNA序列完全正确，结果如下：

TCGGATCCCCCTCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACCTGCCCAGATAAAAAATCGACAGCCGCGGTCATTCTCACACCGACGGAGAACCACTTCACTCTCAAGTGCCCTAAAACAGCGCTCACAGAGCCTCCCACTCTTGCGTACTCACCCAACAGGCAAATCTGCCCAGCGGGTACTACAAGTAGCTGTACATCAAAGGCTGTAACATTGAGCTCCTTGATTCCTGAAGCAGAAGATAGCTGGTGGACGGGGGATTCTGCTAGTCTCGACACGGCAGGCATCAAACTCACAGTTCCAATCGAGAAGTTCCCCGTGACAACGCAGACGTTTGTGGTCGGTTGCATCAAGGGAGACGACGCACAGAGTTGTATGGTCACAGTGACAGTACAAGCCAGAGCCTCATCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTACGGTGCAGACAGCACTCTTGGTCCTGTCAAGTTGTCTGCGGAAGGACCCACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGGACGACGCTGACTGGTTGCAACGAGAAATCGTTCAAAGATATTTTGCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGTGATAAGGGTGCCACGCTAACGATCAAGAAGGAAGCATTTCCAGCCGAGTCAAAAAGCGTCATTATTGGATGCACAGGGGGATCGCCTGAGAAGCATCACTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCCGGGGCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCTGCGGGAACAGCCAGT

重组质粒内的SAG3基因片段的DNA序列完全正确，结果如下：

GAGCACGGACTGTTCGTCGCCGCAGGGAAATCGAGAAGTAAGATAACCTATTTTGGCACGCTCACTCAGAAGGCTCCGAACTGGTACCGCTGCTCTTCAACGAGGGCGAATGAAGAGGTCGTAGGACATGTGACGCTGAACAAAGAGCACCCTGATATGACAATTGAATGCGTCGACGACGGCTTGGGCGGAGAGTTTTTGCCGCTCGAAGGCGCGACGTCGTCGTACCCGCGAGTATGTCACATTGATGCCAAGGACAAGGGCGACTGCGAGCGCAACAAGGGCTTTCTGACCGACTACATACCGGGCGCGAAGCAGTACTGGTACAAGATAGAAAAGGTGGAGAACAACGGCGAGCAATCCGTTCTGTACAAATTCACAGTTCCTTGGATATTCCTTCCGCCCGCCAAGCAGCGATACAAGGTTGGATGCCGATACCCGAACCACGAGTATTGCTTTGTTGAGGTCACCGTCGAACCCACGCCGCCAATGGTCGAAGGCAAGAGAGTGACCTGCGGGTACCCCGAGTCCGGCCCCGTGAATCTCGAGGTGGACTTGTCAAAGGACGCGAACTTTATCGAGATTCGGTGCGGCGAACAGCACCACCCGCAGCCGTCGACCTACACGCTGCAGTACTGCTCAGGTGACTCGGTGGACCCGCAGAAGTGTTCGCCGCAGTCCCTGACGAACATTTTTTATGACTACAGCTCTTCGTGGTGGAAGGGGAAACTGAACGGGCCTGACGGGGCAACTCTCACCATTCCACCCGGCGGGTTCCCCGAAGAAGACAAATCTTTTCTTGTCGGGTGTTCACTCACTGTGGACGGGCCGCCCTTCTGCAACGTCAAAGTGAGAGTTGCCGGGAACCCCAGAAAGTGGGGGAGAGGCGGAGGCGGCCATCCAGGAAGCGGAGGATTGCAGCCGGGAACTGAAGGGGAAAGTCAAGCTGGAACAGAAAGTTCAGCCGGCGCGAGTTCGCGAATGGCTTCCGTTGCCCTGGCGTTCCTTCTCGGTCTCCTTGTGCAT

重组质粒内的GRA3基因片段的DNA序列完全正确，结果如下：

CCATATGTCCCTTTTTTATACAGAGTTTCACAATGTCAACTGCTTTGAAGCGGCTCATTCCATTTCTAGTTCCCTTTGTGGTTTTCCTGGTCGCTGCTGCCTTGGGAGGCCTTGCGGCGGATCAGCCTGAAAATCATCAGGCTCTTGCAGAACCAGTTACGGGTGTGGGGGAAGCAGGAGTGTCCCCCGTCAACGAAGCTGGTGAGTCATACAGTTCTGCAACTTCGGGTGTCCAAGAAGCTACCGCCCCAGGTGCAGTGCTCCTGGACGCAATCGATGCCGAGTCGGATAAGGTGGACAATCAGGCGGAGGGAGGTGAGCGTATGAAGAAGGTCGAAGAGGAGTTGTCGT

重组质粒内的MIC3基因片段的DNA序列完全正确，结果如下：

TTTGACAAAGTTGTGCCGAGCCGCGAAGTCGTCTCTGAGAGTCTTGCTCCGTCTTTCGCGGTGACTGAGACTCACTCGTCTGTGCAATCCCCCAGCAAGCAGGAGACGCAACTCTGTGCTATCTCGAGTGAAGGCAAGCCATGTCGAAACCGTCAGTTGCACACTGACAACGGGTACTTCATCGGGGCCAGTTGCCCCAAGAGCGCTTGCTGCAGCAAGACCATGTGCGGCCCCGGCGGCTGCGGAGAATTCTGCTCCAGCAACTGGATTTTTTGCAGCAGTTCGCTCATCTACCATCCTGACAAAAGCTATGGAGGAGACTGCAGCTGTGAAAAGCAGGGCCATCGGTGCGACAAAAACGCAGAATGCGTCGAAAACTTGGACGCGGGTGGGGGTGTGCACTGCAAGTGCAAAGACGGCTTCGTCGGCACTGGGTTGACTTGCTCCGAGGATCCTTGTTCAAAAAGAGGGAACGCGAAGTGCGGACCCAACGGGACGTGCATCGTCGTCGATTCAGTCAGCTACACATGCACCTGCGGCGACGGCGAAACTCTAGTGAACCTCCCGGAAGGGGGACAAGGATGCAAGAGGACTGGATGTCATGCCTTCAGGGAGAACTGCAGCCCTGGTAGATGTATTGATGACGCCTCGCATGAGAATGGCTACACCTGCGAGTGCCCCACAGGGTACTCACGTGAGGTGACTTCCAAGGCGGAGGAGTCGTGTGTGGAAGGAGTCGAAGTCACGCTGGCTGAGAAATGCGAGAAGGAATTCGGCATCAGCGCGTCATCCTGCAAATGCGATAACGGATACTCCGGATCTGCTTCCGCAACCTCCCACCATGGGAAAGGAGAATCGGGATCCGAGGGGAGCTTGAGTGAAAAAATGAATATTGTCTTCAAGTGCCCCAGTGGCTACCATCCAAGATACCATGCCCACACCGTGACGTGTGAGAAAATTAAGCACTTTGCCCTTGACGGGGCCGGCAACCACGACACGACTACGTATGTCGCAAGACGAAGGTACCCAGCGAGTCTC

实施例4 用纯化的重组蛋白检测弓形虫抗体

将纯化的4种重组蛋白同等浓度下混合，用碳酸盐缓冲液(50mM，PH9.6)稀释后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜；洗涤后加200ul/孔10％小牛血清的PBS37℃水浴封闭2h，洗涤后4℃备用。

间接酶联免疫法检测5份抗弓形虫阳性血清及5份正常人血清，使用450nm波长测定OD值。结果显示(见表1)融合蛋白组合物能与5份抗弓形虫阳性血清反应，不与5份正常人血清反应，说明该组合物有较好的抗原性和特异性。

表1 间接酶联免疫法实验结果(A450值)

	1	2	3	4	5
						抗弓形虫IgM阳性血清	1.135	1.684	1.360	1.211	1.308
正常人血清	0.036	0.025	0.044	0.031	0.019

本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 潍坊汉唐生物工程有限公司

<120> 一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物SAG1P1

<400> 1

tcgaacccac cacttgt 17

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 下游引物SAG1P2

<400> 2

actggctgct cacgt 15

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物SAG3P1

<400> 3

gagcatggtc tgttcat 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 下游引物SAG3P2

<400> 4

atgcacaagg agaccgaga 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物GRA3P1

<400> 5

ccttacgtcc ctttttta 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 下游引物GRA3P2

<400> 6

ataacgacaa cgccact 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物MIC3P1

<400> 7

aggtatgaaa cgagccga 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 下游引物MIC3P2

<400> 8

atcttgtttt tcacaccga 19

<210> 9

<211> 807

<212> DNA

<213> SAGI特异表位的核苷酸序列

<400> 9

tcggatcccc ctcttgttgc caatcaagtt gtcacctgcc cagataaaaa atcgacagcc 60

gcggtcattc tcacaccgac ggagaaccac ttcactctca agtgccctaa aacagcgctc 120

acagagcctc ccactcttgc gtactcaccc aacaggcaaa tctgcccagc gggtactaca 180

agtagctgta catcaaaggc tgtaacattg agctccttga ttcctgaagc agaagatagc 240

tggtggacgg gggattctgc tagtctcgac acggcaggca tcaaactcac agttccaatc 300

gagaagttcc ccgtgacaac gcagacgttt gtggtcggtt gcatcaaggg agacgacgca 360

cagagttgta tggtcacagt gacagtacaa gccagagcct catcggtcgt caataatgtc 420

gcaaggtgct cctacggtgc agacagcact cttggtcctg tcaagttgtc tgcggaagga 480

cccactacaa tgaccctcgt gtgcgggaaa gatggagtca aagttcctca agacaacaat 540

cagtactgtt ccgggacgac gctgactggt tgcaacgaga aatcgttcaa agatattttg 600

ccaaaattaa ctgagaaccc gtggcagggt aacgcttcga gtgataaggg tgccacgcta 660

acgatcaaga aggaagcatt tccagccgag tcaaaaagcg tcattattgg atgcacaggg 720

ggatcgcctg agaagcatca ctgtaccgtg aaactggagt ttgccggggc tgcagggtca 780

gcaaaatcgg ctgcgggaac agccagt 807

<210> 10

<211> 1026

<212> DNA

<213> SAG3特异表位的核苷酸序列

<400> 10

gagcacggac tgttcgtcgc cgcagggaaa tcgagaagta agataaccta ttttggcacg 60

ctcactcaga aggctccgaa ctggtaccgc tgctcttcaa cgagggcgaa tgaagaggtc 120

gtaggacatg tgacgctgaa caaagagcac cctgatatga caattgaatg cgtcgacgac 180

ggcttgggcg gagagttttt gccgctcgaa ggcgcgacgt cgtcgtaccc gcgagtatgt 240

cacattgatg ccaaggacaa gggcgactgc gagcgcaaca agggctttct gaccgactac 300

ataccgggcg cgaagcagta ctggtacaag atagaaaagg tggagaacaa cggcgagcaa 360

tccgttctgt acaaattcac agttccttgg atattccttc cgcccgccaa gcagcgatac 420

aaggttggat gccgataccc gaaccacgag tattgctttg ttgaggtcac cgtcgaaccc 480

acgccgccaa tggtcgaagg caagagagtg acctgcgggt accccgagtc cggccccgtg 540

aatctcgagg tggacttgtc aaaggacgcg aactttatcg agattcggtg cggcgaacag 600

caccacccgc agccgtcgac ctacacgctg cagtactgct caggtgactc ggtggacccg 660

cagaagtgtt cgccgcagtc cctgacgaac attttttatg actacagctc ttcgtggtgg 720

aaggggaaac tgaacgggcc tgacggggca actctcacca ttccacccgg cgggttcccc 780

gaagaagaca aatcttttct tgtcgggtgt tcactcactg tggacgggcc gcccttctgc 840

aacgtcaaag tgagagttgc cgggaacccc agaaagtggg ggagaggcgg aggcggccat 900

ccaggaagcg gaggattgca gccgggaact gaaggggaaa gtcaagctgg aacagaaagt 960

tcagccggcg cgagttcgcg aatggcttcc gttgccctgg cgttccttct cggtctcctt 1020

gtgcat 1026

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> GRA3特异表位的核苷酸序列

<400> 11

ccatatgtcc cttttttata cagagtttca caatgtcaac tgctttgaag cggctcattc 60

catttctagt tccctttgtg gttttcctgg tcgctgctgc cttgggaggc cttgcggcgg 120

atcagcctga aaatcatcag gctcttgcag aaccagttac gggtgtgggg gaagcaggag 180

tgtcccccgt caacgaagct ggtgagtcat acagttctgc aacttcgggt gtccaagaag 240

ctaccgcccc aggtgcagtg ctcctggacg caatcgatgc cgagtcggat aaggtggaca 300

atcaggcgga gggaggtgag cgtatgaaga aggtcgaaga ggagttgtcg t 351

<210> 12

<211> 1038

<212> DNA

<213> MIC3特异表位的核苷酸序列

<400> 12

tttgacaaag ttgtgccgag ccgcgaagtc gtctctgaga gtcttgctcc gtctttcgcg 60

gtgactgaga ctcactcgtc tgtgcaatcc cccagcaagc aggagacgca actctgtgct 120

atctcgagtg aaggcaagcc atgtcgaaac cgtcagttgc acactgacaa cgggtacttc 180

atcggggcca gttgccccaa gagcgcttgc tgcagcaaga ccatgtgcgg ccccggcggc 240

tgcggagaat tctgctccag caactggatt ttttgcagca gttcgctcat ctaccatcct 300

gacaaaagct atggaggaga ctgcagctgt gaaaagcagg gccatcggtg cgacaaaaac 360

gcagaatgcg tcgaaaactt ggacgcgggt gggggtgtgc actgcaagtg caaagacggc 420

ttcgtcggca ctgggttgac ttgctccgag gatccttgtt caaaaagagg gaacgcgaag 480

tgcggaccca acgggacgtg catcgtcgtc gattcagtca gctacacatg cacctgcggc 540

gacggcgaaa ctctagtgaa cctcccggaa gggggacaag gatgcaagag gactggatgt 600

catgccttca gggagaactg cagccctggt agatgtattg atgacgcctc gcatgagaat 660

ggctacacct gcgagtgccc cacagggtac tcacgtgagg tgacttccaa ggcggaggag 720

tcgtgtgtgg aaggagtcga agtcacgctg gctgagaaat gcgagaagga attcggcatc 780

agcgcgtcat cctgcaaatg cgataacgga tactccggat ctgcttccgc aacctcccac 840

catgggaaag gagaatcggg atccgagggg agcttgagtg aaaaaatgaa tattgtcttc 900

aagtgcccca gtggctacca tccaagatac catgcccaca ccgtgacgtg tgagaaaatt 960

aagcactttg cccttgacgg ggccggcaac cacgacacga ctacgtatgt cgcaagacga 1020

aggtacccag cgagtctc 1038

Claims

1.一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，其特征在于：所述重组抗原组合物包含弓形虫SAG1特异表位重组抗原、弓形虫SAG3特异表位重组抗原、弓形虫GRA3特异表位重组抗原和弓形虫MIC3特异表位重组抗原。

2.根据权利要求1所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，其特征在于：所述SAG1特异表位重组抗原、SAG3特异表位重组抗原、GRA3特异表位重组抗原和MIC3特异表位重组抗原在所述重组抗原组合物中按照1-5:1-5:1-5:1-5的比例组合。

3.根据权利要求1所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，其特征在于：所述SAG1特异表位重组抗原的特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸到第316个氨基酸；SAG3特异表位重组抗原的特异表位为SAG3蛋白N端第41个氨基酸到382个氨基酸；GRA3特异表位重组抗原的特异表位为GRA3蛋白N端第44个氨基酸到第160个氨基酸；MIC3特异表位重组抗原的特异表位为MIC3蛋白N端第38个氨基酸到第383个氨基酸。

4.一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：

(1)抗原表位的筛选

分析弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫SAG1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫SAG3蛋白特异性抗原位于第41个氨基酸到第382个氨基酸；弓形虫GRA3蛋白特异性抗原位于第44个氨基酸到第160个氨基酸；弓形虫MIC3蛋白特异性抗原位于第38个氨基酸到第383个氨基酸；

(2)弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白抗原表位的基因克隆

(3)分别构建SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白表达载体

提取PGEX-6P-1和PRSET-B质粒，将PGEX-6P-1、PRSET-B质粒分别经过双酶切，电泳后分别胶回收PGEX-6P-1、PRSET-B双酶切的质粒片段；SAG1蛋白、SAG3蛋白、GRA3蛋白和MIC3蛋白分别经过双酶切，电泳后胶回收双酶切目的片段，-20℃备用；将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，分别得到重组质粒。

5.根据权利要求4所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法还包括下列步骤：

重组质粒的筛选和鉴定：

蛋白工程菌高效表达：

表达蛋白的纯化：

将重组蛋白工程菌液离心，收集的沉淀菌体重悬于原离心体积1/10的裂解液内，冰浴超声菌体10-30min后，离心，分别收集菌液上清和沉淀的包涵体；取菌液上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，离心，弃上清，沉淀中加入8-12倍标准体积的PBS，混匀，再经过离心、弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入1-3倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，搅动，离心后将收集的上清移至新管中，在PBS中透析24-48h，离心取上清，-20℃备用；取沉淀的包涵体，并用含0.5％SKL缓冲体系溶解，室温裂解包涵体、离心，收集上清，将上清经过透析过夜，再离心过滤膜后上镍柱纯化。

6.根据权利要求4所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的扩增条件为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃30s、58℃30s、72℃1min，共30个循环；阶段3：72℃5min。

7.根据权利要求4所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的重组质粒分别是PGEX-6P-1-SAG1、PRSET-B-MIC3、PGEX-6P-1-GRA3和PRSET-B-SAG3。

8.根据权利要求4所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于：所述SAG1的上游引物SAG1P1具有以下序列：5’-TCGAACCCACCACTTGT-3’，所述SAG1的下游引物SAG1P2具有以下序列：5’-ACTGGCTGCTCACGT-3’；

所述SAG3的上游引物SAG3P1具有以下序列：5’-GAGCATGGTCTGTTCAT-3’，所述SAG3的下游引物SAG3P2具有以下序列:5’-ATGCACAAGGAGACCGAGA-3’；

所述GRA3的上游引物GRA3P1具有以下序列：5’-CCTTACGTCCCTTTTTTA-3’，所述GRA3的下游引物GRA3P2具有以下序列:5’-ATAACGACAACGCCACT-3’；

所述MIC3的上游引物MIC3P1具有以下序列：5’-AGGTATGAAACGAGCCGA-3’，所述MIC3的下游引物MIC3P2具有以下序列:5’-ATCTTGTTTTTCACACCGA-3’。