CN106153894A - 一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒,包括以下组分:抗人IgM标记的FITC;TOXO抗原;标记有抗FITC抗体的磁珠;鼠抗TOX抗体标记ALP和TOXO IgM定标液。其中,所TOXO抗原为在2~8℃下混匀的虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3。同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒减少了TOXO IgM检测时,IgG的干扰,而鼠抗人IgM亲和力和特异性较多抗优异,也避免了多抗特异性差引起的假阳性的;另一方面,本发明避免了抗原标记ALP回收率低的问题,抗体稳定性较好,标记过程中活性损失少。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒的制备领域,具体为一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
弓形虫(TOXO)是一种细胞内寄生的真核病原体微生物,它能通过血液传播,感染宿主体内许多不同的器官和组织。弓形虫感染后,约50%的患者没有临床症状,而另外50%的感染者经潜伏期后,只有一些非特异性症状如低烧、疲乏、头痛、肌肉和关节痛;少数病人会出现高烧和颈部淋巴结肿大。儿童和未成年人感染后还会有1%的病人出现并发症如心肌炎、脑膜炎或肺炎等。孕妇弓形虫感染的筛查是有重大意义的。弓形虫通过胎盘传播在怀孕的各个阶段都有可能发生,通过胎盘垂直传播给胎儿,损害胚胎发育,严重者致畸甚至死亡,同时可使孕妇流产或早产,其危险性较未感染孕妇大10倍。
IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体,在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM,故脐带血IgM升高提示胎儿有宫内感染。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体,血清中检出IgM提示新近发生感染,可用于感染的早期诊断。因此,TOX-IgM的检测对于孕妇的辅助诊断具有重要意义。
临床上用于TOXO IgM测定的常用方法有:放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、免疫放射分析法、时间分辨荧光免疫分析等。而磁微粒化学发光免疫诊断法(CLIA)是一种新型的检测方法,相比于传统的放射免疫分析法和酶联免疫吸附法,其通过磁微粒吸附特异性免疫复合物,使它的灵敏度高,步骤简便。临床上,通常采用间接法和捕获法测定TOXO IgM,但间接法测定TOXO IgM会有血清IgG的干扰,而采用捕获法测定TOXO IgM存在抗原标记碱性磷酸酶(ALP)活性及回收率较低的情况,造成试剂盒成本较高,临床推广难度大。因此需要发明制备一种既减小IgG类抗体干扰又成本较低的TOXO IgM检测试剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷,提供一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:
一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒,包括以下组分:
抗人IgM标记的FITC,该抗体为单抗,较兔多抗、羊多抗特异性、活性高;
TOXO抗原;
标记有抗FITC抗体的磁珠;
鼠抗TOX抗体标记ALP;
TOXO IgM定标液。
进一步的,所述的TOXO抗原为虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3。采用2种不同TOXO抗原:虫体表面膜蛋白1(SAG1)、弓形虫微线体蛋白3(MIC3),这两种蛋白在虫体对宿主识别、转移粘附中具有重要作用,具有良好的免疫原性。虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3在2~8℃下混匀1h,确保充分混匀。
进一步的,该试剂盒还包括浓缩洗液,所述浓缩洗液为含有Tween-20、Proclin300的Tris-Cl缓冲液。
本发明的试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
1)、将待测样本至合适浓度稀释;
2)、在反应管中加入待测样本、TOXO IgM定标液和抗人IgM标记的FITC,37℃孵育15min;
3)、加入TOXO抗原,37℃孵育15min;
4)、加入磁珠,37℃孵育5min;
5)、清洗三次后,加入鼠抗TOX抗体标记ALP,37℃孵育15min;
6)、清洗三次后,加入底物,读取发光值,仪器自动计算样本发光值与定标发光值的比值,即S/CO。
7)、结果判读:S/CO<1.0为阴性;S/CO≥1.0为阳性。
本发明所达到的有益效果是:
本发明的试剂盒将稀释的样本与标记FITC的抗人IgM结合,反应后加入 TOXO抗原,减少了TOXO IgM检测时,IgG的干扰,而鼠抗人IgM亲和力和特异性较多抗优异,也避免了多抗特异性差引起的假阳性的;另一方面,本发明避免了抗原标记ALP回收率低的问题,因抗原在标记ALP过程中易失活和降解,其回收率一直不理想。本发明标记抗体,抗体稳定性较好,标记过程中活性损失少。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1抗人IgM抗体的确定
样本来源:临床筛选弓形虫IgM抗体阳5例、阴性5例,阳性样本编号:1-5;阴性样本编号6-10。鼠抗人IgM购自厂家1,羊抗人IgM购自厂家2,兔抗人IgM购自厂家3。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本,待测样本按1:300比例稀释,浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行。
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL,再分别加入鼠、羊、兔抗人IgM标记的FITC 30uL,37℃孵育15min;
3)、加入30uL TOXO抗原,37℃孵育15min;
4)、加入磁珠30uL,37℃孵育5min;
5)、清洗三次后,加入100uL TOXO抗体-ALP,37℃孵育15min。
6)、清洗三次后,加入底物,读取发光值,计算S/CO,结果如表1所示:
表1不同抗人IgM抗体对检测的影响
表1的结果表明,采用鼠抗人IgM,结果符合临床样本检测要求,而羊抗人和兔抗人则存在假阳性。
实施例2TOXO抗原的确定
样本来源:临床筛选弓形虫IgM抗体阳5例、阴性5例,阳性样本编号:1-5;阴性样本编号6-10。TOXO SAG1、MIC3购自厂家4。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本,待测样本按1:300比例稀释,浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行。
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL,再加入鼠抗人IgM标记的FITC30uL,37℃孵育15min;
3)、分别加入30uL SAG1、30uL MIC3抗原、30uL SAG1和MIC3(5ug/ml,各15uL),37℃孵育15min;
4)、加入磁珠30uL,37℃孵育5min;
5)、清洗三次后,加入100uL TOXO抗体-ALP,37℃孵育15min。
6)、清洗三次后,加入底物,读取发光值,计算S/CO。
表2不同TOXO抗原对检测的影响
表2的结果表明,采用SAG1和MIC3抗原共同使用,结果符合临床样本检测要求,而单独使用两种抗原都则存在错误结果,无法达到临床样本要求。
实施例3TOXO抗体标记ALP的确定
样本来源:临床筛选弓形虫IgM抗体阳5例、阴性5例,阳性样本编号:1-5;阴性样本编号6-10。鼠抗TOXO购自厂家1、兔抗TOXO购自厂家3。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本,待测样本按1:300比例稀释,浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行;
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL,再加入鼠抗人IgM标记的FITC30uL,37℃孵育15min;
3)、分别加入30uL抗原、30uL(SAG1和MIC3各15uL),37℃孵育15min;
4)、加入磁珠30uL,37℃孵育5min;
5)、清洗三次后,各加入100uL鼠、兔抗TOXO抗体-ALP,37℃孵育15min。
6)、清洗三次后,加入底物,读取发光值,计算S/CO。
表3不同TOXO抗体标记ALP对检测的影响
表3的结果表明,采用鼠抗TOXO标记ALP,结果符合临床样本检测要求, 而使用兔抗TOXO存在假阴和假阳,无法达到临床样本要求。
实施例4-临床符合率
样本来源:临床筛选弓形虫IgM抗体阳20例、阴性100例。
1)、准备试剂盒各组分及待测样本,待测样本按1:300比例稀释,浓缩洗液按1:20比例进行稀释。具体操作在化学发光免疫分析仪上进行。
2)、在反应管中加入稀释后的待测样本、定标30uL,再加入鼠抗人IgM标记的FITC30uL,37℃孵育15min;
3)、分别加入30uL抗原、30uL(SAG1和MIC3各15uL),37℃孵育15min;
4)、加入磁珠30uL,37℃孵育5min;
5)、清洗三次后,各加入100uL鼠、兔抗TOXO抗体-ALP,37℃孵育15min。
6)、清洗三次后,加入底物,读取发光值,计算S/CO。
表4120例临床样本的符合率
结果表明,临床样本检测符合率:阳性100%,阴性100%。相比于临床结果,本发明试剂盒有相同的灵敏度和符合率。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒,其特征在于,包括以下组分:
抗人IgM标记的FITC;
TOXO抗原;
标记有抗FITC抗体的磁珠;
鼠抗TOX抗体标记ALP;
TOXO IgM定标液。
2.如权利要求1所述的测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒,其特征在于,所述的TOXO抗原为虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3。
3.如权利要求2所述的测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒,其特征在于,虫体表面膜蛋白1和弓形虫微线体蛋白3在2~8℃下混匀1h。
4.如权利要求1所述的测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒,其特征在于,还包括浓缩洗液,所述浓缩洗液为含有Tween-20、Proclin300的Tris-Cl缓冲液。
5.权利要求1-4任一项所述的测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)、将待测样本至合适浓度稀释;
2)、在反应管中加入待测样本、TOXO IgM定标液和抗人IgM标记的FITC,37℃孵育15min;
3)、加入TOXO抗原,37℃孵育15min;
4)、加入磁珠,37℃孵育5min;
5)、清洗三次后,加入鼠抗TOX抗体标记ALP,37℃孵育15min;
6)、清洗三次后,加入底物,读取发光值,仪器自动计算样本发光值与定标发光值的比值,即S/CO。
7)、结果判读:S/CO<1.0为阴性;S/CO≥1.0为阳性。
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