CN111089961A - 一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒及其制备方法,属于免疫诊断技术领域。该试剂盒包括:含有链酶亲和素磁微粒的悬液,化学发光标记物标记的Toxo抗原悬液,生物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液。本发明还提供一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒的制备方法。采用本方法制备的试剂盒具有较高的检测灵敏度,操作简单、定量检测准确、快速,采用顺磁性的微粒作为固相载体,其比表面积大,提高了检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于化学发光体外诊断技术领域,涉及一种弓形虫IgM抗体检测试剂 盒及其制备方法。
背景技术
弓形虫病是一种由细胞内的原虫寄生虫(称为刚地弓形虫)所引起的广泛传 播的感染性疾病。此种疾病可感染人类及其它温血动物。弓形虫感染主要是摄 入被猫粪的成熟包囊污染的食物或水或摄入含有组织包囊的生肉引起的获得性 感染,健康个体中原发性急性感染大多症状轻微甚至无症状,常有长期持续的 潜伏感染。但是,免疫抑制者(如器官移植、AIDS患者等)潜伏弓形虫感染的 复发常诱发脑膜脑炎,弓形虫脑炎已经证实是获得性免疫缺陷综合症患者的重 要死因之一。由于弓形虫可通过胎盘传播给胎儿,因此怀孕期间原发性母体弓 形虫感染可能导致胎儿严重损害,大多数先天性感染婴儿在出生时没有临床症 状,但后来可能发展呈严重的后遗症,如智障和精神运动性阻抑、脉络视网膜 炎、大脑钙化以及听力丧失等。随着怀孕年龄增加胎儿感染率增加。但有严重 临床表现着在早期母体感染病例中较高。对妊娠期间的急性感染进行早期药物 治疗可以组止先天损害并改变临床表现的严重程度。
弓形虫病感染通常通过检测抗弓形虫特异性IgG和IgM抗体进行诊断。弓 形虫IgG抗体检测用于评价弓形虫血清学状态,反映急性或潜伏感染。弓形虫 IgM抗体检测反映急性、新近或复发弓形虫感染。
目前常用的检测弓形虫IgM抗体的方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析 技术等,但以上方法存在诸多不足,如放射免疫分析法存在放射性污染、标记 物半衰期短、对操作者具有放射性损伤、操作繁琐、检测时间长等缺点;ELISA 具有灵敏度低、检测范围窄、检测时间长、重复性差等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒及其制备方法,该试 剂盒检测方法灵敏,准确度高,重复性好。
本发明的首先提供一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,该试剂盒包括:
含有链酶亲和素磁微粒的悬液,化学发光标记物标记的Toxo抗原悬液,生 物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液。
优选的是,所述的含有链酶亲和素磁微粒的悬液中,链酶亲和素磁微粒的 粒径为1~3μm。
优选的是,生物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液中,生物素与抗体标记 的摩尔比例为(1~10):1。
优选的是,化学发光标记物标记的Toxo抗原悬液中,化学发光标记物与抗 原标记的摩尔比例为(1~10):1。
优选的是,化学发光标记物为吖啶酯或吖啶酯衍生物。
优选的是,该试剂盒中还包括化学发光预激发液A液和B液;所述A液为 过氧化氢和硝酸溶液;所述B液为氢氧化钠溶液。
优选的是,该试剂盒中还包括清洗液;所述清洗液为磷酸缓冲液。
本发明还提供了上述一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒的制备方法,包括以 下步骤:
步骤一:将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器 上,直至上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试 剂,得到含有链酶亲和素磁微粒的悬液;
步骤二:取Toxo抗原,用缓冲液稀释,加入化学发光标记物进行标记,标 记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭后用离心管进行超滤离心,将化学发光 标记物标记的Toxo抗原重悬于缓冲液中保存;
步骤三:取抗人IgM单克隆抗体,用缓冲液稀释,加入生物素进行标记, 标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭后用离心管进行超滤离心,将生物素 标记的抗人IgM单克隆抗体重悬于缓冲液中保存。
本发明的有益效果
1、本发明采用吖啶酯直接发光,降低了本底空白,提高了灵敏度。采用顺 磁微粒作为固相载体,其比表面积大,提高了检测的灵敏度。
2、本发明使用生物素-亲和素体系,有效避免了抗体直接包被磁珠导致的磁 珠凝集现象,解决了试剂稳定性的问题。而生物素-亲和素体系是通过链酶亲和 素-生物素之间的特殊作用,将生物素标记的抗人IgM单克隆抗体连接到磁微粒 上,同时吖啶酯标记的Toxo抗原、生物素标记的抗人IgM单克隆抗体与样本中 的Toxo IgM抗体发生免疫反应,形成抗原抗体复合物,并通过生物素与链酶亲 和素之间的反应结合到磁颗粒上。
3、本检测试剂盒为化学发光免疫分析法,该方法具有种操作简单,无放射 性风险及其检测时间短,并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测;另一方 面,弓形虫IgM化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统, 降低了人为操作的误差,提高了整个系统的灵敏度与准确度。
4、本发明适用于体外检测血清、血浆中弓形虫(Toxo)IgM抗体的含量。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实 例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细 节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式 来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此 本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明的首先提供一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,该试剂盒包括:
含有链酶亲和素磁微粒的悬液,化学发光标记物标记的Toxo抗原悬液,生 物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液。
按照本发明,所述的含有链酶亲和素磁微粒的悬液浓度优选0.03%~0.1%, 生物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液的浓度优选0.1~2μg/mL,化学发光标记 物标记的Toxo抗原悬液的浓度优选0.5~2μg/mL。
按照本发明,所述的含有链酶亲和素磁微粒的悬液中,链酶亲和素磁微粒 的粒径优选为1~3μm。
按照本发明,生物素标记的抗人IgM单克隆抗体中,生物素与抗体标记的 摩尔比例为(1~10):1。
按照本发明,化学发光标记物标记的Toxo抗原中,化学发光标记物与抗原 标记的摩尔比例为(1~10):1。化学发光标记物优选为吖啶酯或吖啶酯衍生物。
按照本发明,所述的试剂盒中还包括化学发光预激发液A液和B液;所述 A液为过氧化氢和硝酸溶液;所述B液为氢氧化钠溶液。
按照本发明,所述的试剂盒中还包括清洗液;所述清洗液为磷酸缓冲液。
本发明还提供了上述一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒的制备方法,包括以 下步骤:
1、含有链酶亲和素磁微粒的悬液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器上,直至 上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试剂,得到 链霉亲和素磁颗粒悬浮液;
所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50~100mg/mL;链霉亲和素磁 颗粒溶液和TBST溶液的体积比优选为(0.5~1):(5~10);所述的混匀时间优选 为10~15min,所述的缓冲液为50mmol/L MES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300, pH6.5;所述的固相试剂链霉亲和素磁颗粒悬浮液的浓度优选为0.01%~1%;所 述的链霉亲和素磁颗粒溶液的来源为商购,选自安捷伦科技有限公司公司,货 号PL6727-1001。
2、化学发光物质标记的Toxo抗原的制备:
取Toxo抗原,用30KDa超滤离心管进行超滤离心,将原材料缓冲液置换 为标记缓冲液,离心机转速为9000rpm,离心时间为30min,原材料缓冲液为20 mmol/L PB pH 7.4,0.01%SDS;标记缓冲液为100mmol/L PB,150mmol/L NaCl, pH6.0。
按照吖啶酯:抗体摩尔比为10:1加入吖啶酯原液,混匀,37℃,标记4h, 标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/L PB, 150mmol/L NaCl,10%赖氨酸,pH6.0。
3、生物素标记的抗人IgM单克隆抗体的制备:
取抗人IgM单克隆抗体,用30KDa超滤离心管进行超滤离心,将原材料缓 冲液置换为标记缓冲液,离心机转速为9000rpm,离心时间为30min。原材料缓 冲液为20mmol/L PB,pH 7.4,0.01%SDS;标记缓冲液为100mmol/L PB, 150mmol/L NaCl,pH6.0。
按照生物素:抗体摩尔比为10:1加入生物素原液,混匀,37℃,标记4h, 标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/L PB 缓冲液,150mmol/LNaCl,10%赖氨酸,pH6.0。
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心,除去未偶联的生物素分子。超 滤结束后,测定蛋白浓度,作为中间品保存。
取适量的中间品和试剂缓冲液,配制成抗体浓度为0.5μg/mL的R3试剂。 所述试剂缓冲液为100mmol/L PB,150mmol/L NaCl,pH6.0。
本发明的弓形虫IgM抗体检测试剂盒用于Toxo IgM抗体检测时,利用全自 动化学发光免疫分析仪对大量样本进行检测,通过统计学方法计算出公式,内 置于射频卡;接着测试两点校准,对主校准曲线进行校准;接着测试质控品, 质控品测试结果落在靶值范围内认为校准合格。测试实际临床样本,根据样本 发光值计算样本浓度;样本的结果以有反应性或无反应性以及cutoff指数(样本 发光值/cutoff值)表示,最后对弓形虫IgM抗体检测试剂盒进行性能的评价。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面将结合实施 例对本发明进一步详细介绍。
实施例1
1、链霉亲和素磁颗粒悬浮液制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器上,直至 上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试剂,得到 链霉亲和素磁颗粒悬浮液;
所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度为100mg/mL;链霉亲和素磁颗粒溶液 和TBST溶液的体积比优选为1:10;所述的混匀时间优选为10min,所述的缓 冲液为50mmol/LMES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300,pH6.5;所述的固相 试剂的浓度优选为0.01%~1%;所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的来源为商购,选 自安捷伦科技有限公司公司,货号PL6727-1001。
2、化学发光物质标记的Toxo抗原的制备:
取0.5mg Toxo抗原,用30KDa超滤离心管进行超滤离心,将原材料缓冲液 置换为标记缓冲液,离心机转速为9000rpm,离心时间为30min。原材料缓冲液 为20mmol/L PB pH7.4,0.01%SDS;标记缓冲液为100mmol/L PB,150mmol/L NaCl,pH6.0。
按照吖啶酯:抗体摩尔比为10:1加入吖啶酯原液,混匀,37℃,标记4h, 标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/L PB, 150mmol/L NaCl,10%赖氨酸,pH6.0。
封闭后用超滤离心管进行超滤离心,除去未偶联的吖啶酯分子。超滤结束 后,测定蛋白浓度,作为中间品保存。用于试剂配制。
取适量的中间品和试剂缓冲液,配制成抗体浓度为0.5μg/mL的R2试剂。 所述试剂缓冲液为100mmol/L PB,150mmol/L NaCl,pH6.0。
3、生物素标记的抗人IgM单克隆抗体的制备:
取0.5mg抗人IgM单克隆抗体,用30KDa超滤离心管进行超滤离心,将原 材料缓冲液置换为标记缓冲液,离心机转速为9000rpm,离心时间为30min。原 材料缓冲液为20mmol/L PB,pH 7.4,0.01%SDS;标记缓冲液为100mmol/L PB, 150mmol/L NaCl,pH6.0。
按照生物素:抗体摩尔比为10:1加入生物素原液,混匀,37℃,标记4h, 标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭时间为1h。封闭缓冲液为100mmol/L PB 缓冲液,150mmol/LNaCl,10%赖氨酸,pH6.0。
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心,除去未偶联的生物素分子。超 滤结束后,测定蛋白浓度,作为中间品保存。用于试剂配制。
取适量的中间品和试剂缓冲液,配制成抗体浓度为0.5μg/mL的R3试剂。 所述试剂缓冲液为100mmol/L PB,150mmol/L NaCl,pH6.0。
4、弓形虫IgM抗体校准品、质控品的制备
取赋值结果为5.0S/CO的弓形虫IgM抗体阳性血清,用校准品基质稀释成 2.0S/CO,作为高浓度校准品。
取校准品基质赋值结果为0.0S/CO,作为低浓度校准品。
取赋值结果为5.0S/CO的弓形虫IgM抗体阳性血清,用质控品基质稀释成 2.0S/CO,作为高浓度质控品。
取质控品基质赋值结果为0.0S/CO,作为低浓度质控品。
实施例2
弓形虫IgM抗体检测试剂盒企业参考品的制备:
本参考品从全国供血员和弓形虫感染病人中选出,经过国外几家弓形虫IgM 抗体试剂筛选,用PCR方法确证,并经国内有关单位复核。用于制备企业参考 品的全部样品均为血清。弓形虫IgM抗体检测试剂盒企业参考品包含:阴性参 考品、阳性参考品、最低检出限参考品和精密性参考品,具体制备方法如下:
阴性参考品:
用于控制诊断试剂的特异性。由20份正常人血清组成,弓形虫IgM抗体均 为阴性。选用Toxo IgM抗体为阴性的正常人血清,以0.2μm滤膜过滤后,置2~ 8℃保存。
阳性参考品:
用于控制诊断试剂对弓形虫IgM抗体样品的检出能力。由10份强、中、弱 阳性血清组成,其中S/CO大于5.0的占30%,S/CO大于3的占40%,S/CO 大于1的占30%。选用ToxoIgM抗体阳性血清,经60℃1h处理后,以0.2μm 滤膜过滤后,置2~8℃保存。
最低检出限参考品:
用于控制诊断试剂的最低检出限。由阴性血清稀释的弓形虫IgM抗体阳性 血清样本组成。
精密性参考品:
用于控制诊断试剂的精密性。由1份中等偏弱阳的血清组成。
弓形虫IgM抗体检测试剂盒企业参考品的用途、组成、检测标准及注意事 项如下:
1、用途
本品系用Toxo IgM抗体阴性和阳性血清组成,经过商业化弓形虫IgM抗体 诊断试剂(雅培贸易(上海)有限公司生产的弓形虫IgM测定试剂盒)对参考 品进行赋值。本参考品用于自配弓形虫IgM抗体诊断试剂的质量检定。
2、组成2.1阴性参考品20份,0.5mL/支。
2.2阳性参考品10份,0.5mL/支。
2.3最低检出限参考品:1份弓形虫IgM抗体弱阳性用用弓形虫IgM抗体 阴性血清系列稀释组成(稀释比例分别为1:10、1:20、1:40),0.5mL/支, 共3支。
2.4精密性参考品1份,1.0mL/支。
3、检测标准
3.1阴性参考品符合率20份阴性参考品检测符合率(-/-)为20/20。
3.2阳性参考品符合率10份阳性参考品检测符合率(+/+)为10/10。
3.3最低检出限参考品:弱阳性样本经1:20稀释后应能检出。
3.4精密性CV(%):重复测定10次,要求CV≤15%。
4、注意事项
4.1本参考品应在-20℃以下保存,避免反复冻溶。
4.2使用时应待样本完全融化颠倒混匀。
实施例3
弓形虫IgM抗体检测试剂盒性能评估:
(1)阴性参考品符合率
用本发明制备的试剂盒测定企业阴性参考品(N1-N20)进行检测,每个样 本各测试1次,结果如表1:
表1企业阴性参考品测定结果
注:阳性判断值S/CO≥1.1。
(2)阳性参考品符合率
用本发明配制的试剂盒测定企业阳性参考品(P1-P10),每个样本各测试 1次结果如表2:
表2企业阳性参考品测定结果
(3)最低检出限
用配制的试剂盒测定企业最低检出限参考品(L1-L3),每样本各测试1次结 果如表3:
表3最低检出限参考品测定结果
(4)精密性
式中:CV—变异系数;
SD—测量结果的标准差;
表4重复性测定结果
实施例4
弓形虫IgM抗体检测试剂盒检测方法:
以迪瑞全自动化学发光免疫分析仪(CM-180)为检测仪器,方法学为捕获 法,样本量10μL,生物素标记的抗人IgM单克隆抗体试剂量50uL,化学发光 物质标记的Toxo抗原试剂量50μL,链霉亲和素磁微粒试剂量40μL。首先,加 入样本10uL,加入290uL稀释液,稀释30倍,然后分别加入R3、R1试剂孵育 18min,洗涤,加入R2试剂孵育5min,洗涤。仪器将反应物送入暗室,一次加 入发光激发液A液(H2O2和HNO3溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应,最 后记录样本发光值(RLU)。仪器(比较由样本反应产物获得的化学发光样本发 光值和先前定标获得的cutoff值)自动计算检测结果。
Claims (8)
1.一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:
含有链酶亲和素磁微粒的悬液,化学发光标记物标记的Toxo抗原悬液,生物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液。
2.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,所述的含有链酶亲和素磁微粒的悬液中,链酶亲和素磁微粒的粒径为1~3μm。
3.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,生物素标记的抗人IgM单克隆抗体悬液中,生物素与抗体标记的摩尔比例为(1~10):1。
4.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,化学发光标记物标记的Toxo抗原悬液中,化学发光标记物与抗原标记的摩尔比例为(1~10):1。
5.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,化学发光标记物为吖啶酯或吖啶酯衍生物。
6.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒中还包括化学发光预激发液A液和B液;所述A液为过氧化氢和硝酸溶液;所述B液为氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒中还包括清洗液;所述清洗液为磷酸缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器上,直至上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试剂,得到含有链酶亲和素磁微粒的悬液;
步骤二:取Toxo抗原,用缓冲液稀释,加入化学发光标记物进行标记,标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭后用离心管进行超滤离心,将化学发光标记物标记的Toxo抗原重悬于缓冲液中保存;
步骤三:取抗人IgM单克隆抗体,用缓冲液稀释,加入生物素进行标记,标记反应结束后,加入封闭缓冲液,封闭后用离心管进行超滤离心,将生物素标记的抗人IgM单克隆抗体重悬于缓冲液中保存。
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