JP3831754B2 - トキソプラズマ・ゴンディ抗原、これをコードする核酸並びに該抗原に対する抗体 - Google Patents
トキソプラズマ・ゴンディ抗原、これをコードする核酸並びに該抗原に対する抗体 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）抗原、該抗原をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該抗原に対する抗体及び該抗原又は該抗体を用いて抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体又はトキソプラズマ・ゴンディ抗原を免疫測定する方法に関する。本発明はトキソプラズマ・ゴンディによる感染症の診断に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
現在、トキソプラズマ虫体の各型に特異的な抗原に関して、幾つかの抗原領域について明確化されているが、増殖型虫体特異的抗原として１１６、７８、６４、６１、５４、５２、４２、３０、２４、６ＫＤａ蛋白質が知られている。また、シスト型虫体特異的抗原としては、３６、３４、２１、１８ＫＤａ蛋白質が知られている。さらに、スポロゾイト特異的抗原としては、２５、６７ＫＤａが存在する。これら様々な抗原の中でトキソプラズマ症に於ける病変は増殖型虫体の増殖が原因で発生することから臨床的側面から現存している各種抗トキソプラズマ特異抗体検出試薬は増殖型虫体抗原を使用している例が多く存在する。また、最近では、分子生物学的な手法を用いて増殖型虫体抗原の一つであるトキソプラズマ膜抗原であるＰ３０を大腸菌発現やそれらの領域の抗原エピトープを含む合成ペプタイドを用いた試薬も存在している。
【０００３】
トキソプラズマは、哺乳類、鳥類の血液、組織の細胞内に寄生する細胞内寄生性原虫であり、広く世界に分布する。その生活史は、終宿主であるネコの粘膜上皮細胞内で有性生殖によってオーシストを生じ便内に排出する。外界に出たオーシストはやがて８個のスポロゾイトを生じ成熟オーシストとなり感染力を持つようになる。成熟オーシストの経口感染によって腸管内でスポロゾイトが遊離して、腸管壁から侵入し、増殖型虫体となり増殖しながら全身に伝播される。
【０００４】
トキソプラズマ症の急性期には増殖体によって発熱、リンパ節腫脹の症状を呈し、網脈絡膜炎、肺炎、心筋炎などが起きるが、やがて慢性期に移行すると、脳、リンパ節や筋肉内に嚢子型虫体を包含する嚢子を形成して、ほとんど増殖を止めた状態でおとなしく感染を継続する。
【０００５】
トキソプラズマ原虫は、地域、年齢によって異なるが、日本においても数十パーセントから７０〜８０％の感染率を示す重要な原虫感染疾患である。最も悲惨なトキソプラズマ症は先天性トキソプラズマ症である。
【０００６】
ＡＩＤＳの日和見感染として注目されているトキソプラズマ症は、最近、医原病としての重要性が言われてきている。すなわち未感染の臓器移植患者がトキソプラズマ感染臓器の移植を受ける事により、急性トキソプラズマ症を起こす。臓器移植による拒絶反応を抑える為に使用される免疫抑制剤は、同時に移植患者の感染症に対する免疫反応を低下させ、その結果、感染臓器の移植によって感染した場合のトキソプラズマ症は重症であり、致命的な場合が多い。
【０００７】
トキソプラズマ原虫は細胞内寄生によって増殖、生存可能である。感染初期に於け る防御免疫の面からはマクロファージ感染が重要である。マクロファージが異物を貪食するとファゴソームを形成し、このファゴソームはやがてリソソームと融合し、ファゴリソソーム（二次リソソーム）になり、プロテアーゼによる酵素分解を行う。細胞内寄生体はこの異物消化機序から逃れられる。
【０００８】
トキソプラズマ原虫の場合は、マクロファージに侵入、感染すると、細胞内に侵入したトキソプラズマ原虫によってファゴソーム膜は修飾され、parasite-phorous vacuoleと呼ばれる特異的な細胞内構造物を作り上げる。このparasitophorous vacuole membraneは宿主細胞質膜分子を欠いている。やがて、ロプトリーから分泌された物質によりparasito phorous networkと呼ばれる索状構造物が出来る。これはトキソプラズマ原虫の生存、増殖に必要な栄養、環境の維持に機能しているのだと考えられている。さらに、生存しているトキソプラズマ原虫が感染しているparasitophorous vacuoleはリソソームと融合せす゛プロテアーゼによる攻撃を受けない。一方、死んだトキソプラズマの場合にはマクロファージによって取り込まれた液胞（ファゴソーム）はリソソームと融合し酵素消化を受ける。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来知られていない新規なトキソプラズマ・ゴンディ抗原を提供することである。また、本発明の目的は、本発明の新規トキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該抗原に対する抗体及び該抗原又は該抗体を用いて抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体又はトキソプラズマ・ゴンディ抗原を免疫測定する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、トキソプラズマ・ゴンディには、ヒトｈｓｐ７０蛋白質（Hunt, C., and R.I. Morimoto. 1985. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82; 6455-6459）にある程度類似した新規な抗原が存在することを見出し、該抗原をコードするＤＮＡのクローニング及び発現並びに該抗原の精製に成功し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性を発揮するアミノ酸配列から成る、トキソプラズマ・ゴンディ抗原を提供する。また、本発明は、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原に対する抗体を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
下記実施例において精製された、本発明の新規トキソプラズマ・ゴンディ抗原の好ましい一例は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
なお、一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸残基が挿入若しくは付加された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性を発揮するアミノ酸配列から成る抗原も本発明の範囲に含まれる。なお、ここで、「トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列から成るタンパク質に対する抗体と特異的に抗原抗体反応を行うことを意味する。
【００１４】
また、本発明は、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸を提供する。下記実施例においてクローニングされた、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードするＤＮＡの塩基配列が、そのコードする推定アミノ酸配列とともに配列表の配列番号２に示されている。なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列は配列番号１に示されるアミノ酸配列と同じである。なお、上記した本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原（配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたものを包含する）をコードするいずれの核酸も本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
さらに、本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を発現することができる組換えベクターを提供する。この組換えベクターは、宿主中での複製を可能にする複製開始点と、プロモーターと、該プロモーターの下流にクローニング部位とを少なくとも有する発現ベクターのクローニング部位に上記本発明の核酸を挿入、連結することにより作製することができる。上記のような発現ベクターは、この分野において周知であり、種々のものが市販されている。本発明の組換えベクターは、このような市販の発現ベクターのマルチクローニング部位に常法により本発明の核酸を挿入、連結することにより容易に作製することができる。なお、下記実施例に組換えベクター作製の手順の一例が具体的に記載されている。
【００１６】
本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原は、上記の組換えベクターで常法により宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体から目的のタンパク質を精製することにより得ることができる。組換えベクター中に挿入される核酸は、下記実施例において具体的に記載する方法によっても作製することができるし、また、該核酸の塩基配列が本発明により明らかにされているので、トキソプラズマ・ゴンディ細胞から常法であるＲＴ−ＰＣＲ法により容易に作製することもできる。
【００１７】
本発明はさらに、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原に対する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定に用いた場合の測定結果の信頼性の観点からモノクローナル抗体がより好ましい。ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も常法により得ることができる。すなわち、ポリクローナル抗体は、上記抗原を常法により動物に免疫し、抗血清として又は抗血清からさらに精製することにより得ることができる。また、モノクローナル抗体は、上記抗原を常法により動物に免疫し、脾細胞又はリンパ球を回収してミエローマ細胞と常法により融合し、融合細胞を選択し、上記抗原と抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を産生しているクローンを選択し、該クローンを培養してモノクローナル抗体を回収することにより得ることができる。なお、モノクローナル抗体の作製方法の一例が下記実施例に具体的に記載されている。
【００１８】
本発明はさらに、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原又は上記本発明の抗体を用いて検体中の抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体又はトキソプラズマ・ゴンディ抗原を免疫測定する方法を提供する。免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、種々の方式のものが知られているが、そのいずれの方式をも採用することができる。すなわち、例えば、反応形式により分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法等があるが、これらのいずれであってもよく、また、用いる標識の種類により分類すると、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、ビオチン免疫測定法等があるがこれらのいずれであってもよい。要するに、本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原と、検体中の抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体との抗原抗体反応を利用して検体中の抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体を測定する免疫測定方法、及び本発明の抗体と、検体中のトキソプラズマ・ゴンディ抗原との抗原抗体反応を利用して検体中のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を測定する免疫測定方法は全て本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明の免疫測定方法の対象となる検体としては、トキソプラズマ・ゴンディによる感染が疑われる人の血液や血清等の体液が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
トキソプラズマ・ゴンディのｈｓｐ７０様蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ＭＯＳＥＩ ｃＤＮＡライブラリー作製キット（Amersham LIFE SCIENCE社より市販）を用い、トキソプラズマ・ゴンディＲＨ株のtayzoiteから分離したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから構成されたｃＤＮＡを作製した。これらのｃＤＮＡライブラリーに対してヒトのｈｓｐ７０ ＤＮＡを放射性核種である（３２Ｐ）で標識したプローブ（ＡＴＣＣ受託番号５７４９４ヒトｇＤＮＡ由来）を用いてクロスハイブリダイゼーション法によってヒトｈｓｐ７０遺伝子領域と特異的に反応するトキソプラズマ・ゴンディ遺伝子のスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーション時に使用したハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファーの各組成及び反応温度は次の通りであった。すなわち、３×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０ｍＭトリスベース（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ及び６０℃で変性した２０μｇ／μｌのサケ精子を各々添加してハイブリダイゼーションに用いた。また、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを各々添加し、各々６０℃で反応及び洗浄を行った。この方法によって１×１０５個のｃＤＮＡクローンからヒトｈｓｐ７０ ＤＮＡプローブに対して特異的に反応する１５クローンを取得した。
【００２２】
また、これらの１５クローンの内最もｃＤＮＡのサイズが大きいｐＴＨ１４クローンをクローニングベクターpBluescript SKII(+)(Stratagene社製）のマル チクローニングサイト内の制限酵素サイトＢａｍＨＩ内に挿入し、クローン化した。
【００２３】
実施例２
クローン化ＤＮＡ：ｐＴＨ１４の塩基配列の決定
塩基配列の決定は、ジェネティックアナライザー３１０（パーキンエルマー社製）を使用して行った。この際、シークエンスプライマーの標識には、サイクルシークエンスキットＦＳ（パーキンエルマー社製）を使用しダイターミネーター法により実施した。また、シークエンシングに際しては、合計１２個のプライマーを合成し（パーキンエルマー社 ＡＢＩ ＤＮＡシンセサ イザー ３９１型）プライマーウォーキングによるシークエンシングに供試した。決定された塩基配列を、これがコードする推定アミノ酸配列とともに配列番号２に示す。
【００２４】
実施例３ 塩基配列のデータ解析
遺伝子塩基配列及びアミノ酸配列の解析は、Genetyx-Mac software( Software development)を用いて行った。
【００２５】
実施例４
組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質の発現と精製
（１）発現ベクターの構築
発現ベクターを構築する際には、ｐＴＨ１４クローンを鋳型としてＰＣＲ法を用いてＴ．ｇｏｎｄｉｉ ｈｓｐ７０領域を増幅し、発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（米国Novagen社より市販）の制限酵素サイトＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ内に再クローニングした。この際、５’末端の転写開始コドンを設定プライマー内から除外する事で削除した。この際目的領域を増幅する為に使用したプライマーを以下に示す。
【００２６】
TH: 5'-CGGGATCCTTAACCGAGAGAGAGAGGCGC-3'
T7: 5'-CATCTCGAGCTGGAGACAGCTGGTGGT-3'
【００２７】
（２）目的遺伝子の発現及び発現蛋白質の精製
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクター ｐＥＴ１５ｂで形質転換した宿主細胞 Escherichia coli BL21を培養して目的遺伝子の発現を行った。その際、培養液としてＬＢ培地（ＢＩＯ １０１社製）を使用し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／μｌになる様に添加した。また、培養温度は３７℃で実施した。更に、蛋白質の発現は終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（ナカライ タスク社製）を添加し、３時間誘導した。
【００２８】
（３）発現蛋白質の回収及び精製
５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに発現抗原を浮遊させ、超音波破砕装置（オリンパス社製）によって２００Ｗ、５分、０℃の条件で細胞を破砕した。次に、これらの細胞破砕物を除外する為に１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件で遠心沈殿した。
【００２９】
次に、細胞破砕物を結合バッファ中（６０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）でホモジナイズした。遠心沈殿後の上清をニッケルキレートカラム精製の為にProbond column(Invitrogen、San Diego、CA)に１０ｍｌアプライした。次に、Probond columnを洗浄バッファー（６０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）４ｍｌで２回洗浄した。
【００３０】
そして最終的にカラムに結合した精製発現蛋白質は、溶出バッファー（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）５ｍｌを用いて溶出した。これらの蛋白質は、セントリプレップ−３０（アミコン社製）濃縮器を用いて遠心濃縮した。その結果、これらの組換え蛋白質の収量は、１Ｌの培養で約１ｍｇであった。更に、これらの精製済み発現蛋白質の精製度は、クマシーブリリアントブルー蛋白質染色で７６ＫＤａ，４６ＫＤａ，３１ＫＤａの三本のメジャーなバンドとして確認出来た。
【００３１】
実施例５
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様組換え精製蛋白質の抗原性の確認
実施例４で精製した組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質を用いてその免疫学的な特異性について臨床材料を用いてウエスタンブロッティングによる抗原解析を行った。この操作の具体的な手順は次の通りであった。すなわち、組換えトキソプラズマ・ゴンディhsp70様蛋白質１μｇを１０％ＳＤＳ−ポリアクリラマイドゲルで電気泳動した後、ニトロセルロース膜へ再び電気泳動によって転写した。ニトロセルロース膜の活性基を脱脂粉乳液（明治乳業製）でコートした後、リン酸緩衝液（0.01 M, pH7.2)で１００倍に希釈した血清検体１ｍｌで室温２時間反応させた後、リン酸緩衝液（0.01 M, pH7.2)で４回洗浄した。その後、パーオキシダーゼ結合抗ヒト免疫グロブリン抗体（Amersham製）を反応させ、ＥＣＬキット（Amersham製）にてフィルム（フジフィルム）に感光させた。
【００３２】
その結果、各種特異抗体の検出状況とウエスタンブロッティングの結果が完全に一致する結果となった。結果を下記表１に示す。
【００３３】
【表１】
＊：イムノグロブリンクラスＩｇＧ及びＩｇＭ抗体使用
【００３４】
実施例６
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様精製発現蛋白質を用いた抗体の作製
トキソプラズマ・ゴンディＨＲ株のTachyzoitesは、ヒトＢ細胞系ＡＲＨで生成した。また、トキソプラズマ・ゴンディＦＵＫＡＹＡ株は、Ｂ１０．Ａ（４Ｒ）マウスで生成した。
【００３５】
（１）抗トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様タンパク質モノクローナル抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、２００μｇ／ｍｌの精製組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質をＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントと１：１で混合し、体幹部皮下の３ヶ所に対して各々０．２５ｍｌ接種し初回免疫を実施した。次に、２週間後、初回免疫時同様の抗原を用いてＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントによって誘導免疫を行った。この際のアジュバントと抗原の混合比、接種容量及び接種部位は初回免疫時と同様である。
【００３６】
さらに、誘導免疫以後３日後にハイブリドーマ作製のためマウス脾臓細胞を取り出し細胞融合装置ＳＳＨ−１型（島津製作所社製、京都）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス由来ＳＰ２ミエローマ細胞と融合した。なお、摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Kohler et al.,Nature, vol.256,p495-497(1975)）により実施した。
【００３７】
さらに、融合細胞は、ＨＡＴ選択培地（ベーリンガーマンハイム社製）で中２日ごとに２回に亘り細胞選択を行った。この際の培養上清から、ＥＬＩＳＡによって抗トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ ７０様タンパク質モノクローナル抗体の存在を確認した。陽性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法によってクローニングを行った。また、ヒト ｈｓｐ７０に対して非特異的な反応を示すモノクローナル抗体については、ポリエチレングリコールを用いた細胞融合方法を使用した事を除き他は同様の方法によって選択した。さらに、取得した腹水は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによってＩｇＧを精製しモノクロナール抗体とした。
【００３８】
（２）ＥＬＩＳＡの構築
上記の工程で行なったＥＬＩＳＡは次ぎのように行なった。ＥＬＩＳＡは、Current Protocols in immunology 1997, vol. 1, 2.1.2-2.1.20に従い構築した。すなわち、平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Ｚｕｇ、スイス国）に２μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ（−）で調整した精製組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様発現 蛋白質を固相した。固相条件は、４℃で１２時間以上静置した。前述の固相プレートは、ブロッキング液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ホウ酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ3）を用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は、４℃で一夜静置した。
【００３９】
以下にこれらの条件で作製した抗トキソプラズマ・ゴンディＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡの行程を示す。
【００４０】
１．非検血清及び培養上清を適宜希釈した後各ホール内へ１００μｌ滴下し、むらなく免疫反応が起こる様に振とうした後静置して常温（１５〜２５℃）で１時間インキュベートした。
【００４１】
２．１．の操作の後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．４ｍＭリン酸二水素カリウム３．６ｍＭ リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、１４６ｍＭ 塩化ナトリウム）を用いて３回洗浄後、２０００倍希釈アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧコンジュゲート（Tago、Camarillo、CA）を１００μｌ各ホール内に分注し振とうした後常温で１時間インキュベートした。
【００４２】
３．２．の操作後、前出同一の洗浄液にて３回洗浄後、１ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸を各ホールに１００μｌ分注した後、振とうし、常温暗所で３０分間発色させる。その後１．５Ｎ硫酸 １００μｌを添加し反応を停止した。
【００４３】
４．発色済みプレートは４９２ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。
【００４４】
実施例７
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するＩｇＧ抗体（ヒト）検出酵素免疫測定法の構築
平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Zug、スイス国）に１０μｇ蛋白／ｍｌの濃度に０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で調整した精製組み換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質を５０μｌ固相した。 固相条件は、４℃で一晩静置した。 前述のプレートは、ブロッキング液（０．２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０加、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０））２００μｌを用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は常温（１５〜２５℃）２時間静置した。ブロッキング後洗浄液（ブロッキング液と同様のもの）２００μｌで３回洗浄した。
【００４５】
以下にこれらの条件で作製した抗トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質ＩｇＧ抗体（ヒト）酵素免疫測定法の行程を示す。
【００４６】
１． ０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した被検血清及び髄液５０μｌを各ホール内へ滴下し、むらなく免疫反応が起きるように振とうした後静置して常温で２時間インキュベートした。
【００４７】
２． １．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ社製）５０μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で２時間インキュベートした。
【００４８】
３． ２．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５ｍＭ塩化マグネシウムの入った溶液で３ｍＭとなるように希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０〜６０分間インキュベートした。
【００４９】
４． 反応終了後４０５ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。このときＯＤが0.110以下を陰性、0.200以上を陽性、0.110〜0.200を判定保留とした。
【００５０】
５．結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
６． これらは水頭症のなかで、血清でのトキソプラズマ・ゴンディ特異ＩｇＭ抗体の検出、胎盤でのＰＣＲ法によるトキソプラズマ・ゴンディ特異ＤＮＡの検出により先天性トキソプラズマ症と診断した症例で、健常人２例に比べて先天性トキソプラズマ症新生児やその母はODが高く、トキソプラズマ・ゴンディ感染急性期及び治療効果判定のマーカーとして有用である。
【００５３】
実施例８ トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質の検出酵素免疫測定法の構築
平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Zug、スイス国）に１０μｇ蛋白／ｍｌの濃度に０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で調整したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するモノクローナル抗体を１００μｌ固相した。 固相条件は、４℃で一晩静置した。 前述のプレートは、ブロッキング液（０．２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０加、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０））２００μｌを用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は、常温（１５〜２５℃）２時間静置した。ブロッキング後洗浄液（ブロッキング液と同様のもの）２００μｌで３回洗浄した。
【００５４】
以下にこれらの条件で作製したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質検出の酵素免疫測定法の行程を示す。
【００５５】
１． ０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈した被検血清及び髄液１００μｌを各ホール内へ滴下し、むらなく免疫反応が起きるように振とうした後静置して常温で１時間インキュベートした。
【００５６】
２． １．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したビオチン標識トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質５０μｌ（０．１μｇ蛋白）を各ホール内に分注し振とうした後常温で２時間インキュベートした。
【００５７】
３．２．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識アビジン（１μｇ／ｍｌ Sigma製、Mo、米国）１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０分間インキュベートした。
【００５８】
４．３．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５ｍＭ塩化マグネシウムの入った溶液で３ｍＭとなるように希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０〜６０分間インキュベートした。
【００５９】
５．反応終了後４０５ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。このときＯＤが1.000以上を陰性、0.800以下を陽性、0.800〜1.000を判定保留とした。
【００６０】
６．結果を表３に示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】
７．これらは水頭症のなかで、血清でのトキソプラズマ・ゴンディ特異ＩｇＭ抗体の検出、胎盤でのＰＣＲ法によるトキソプラズマ・ゴンディ特異ＤＮＡの検出により先天性トキソプラズマ症と診断した症例で、健常人２例に比べて先天性トキソプラズマ症新生児やその母はODが低く、トキソプラズマ・ゴンディ感染急性期及び治療効果判定のマーカーとして有用である。
【００６３】
実施例９ トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質の検出酵素免疫測定法の構築
平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Zug、スイス国）に１０μｇ蛋白／ｍｌの濃度に０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で調整したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するモノクローナル抗体（ＹＡ−１）を１００μｌ固相した。 固相条件は、４℃で一晩静置した。 前述のプレートは、ブロッキング液（０．２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０加、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０））２００μｌを用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は、常温（１５〜２５℃）２時間静置した。ブロッキング後洗浄液（ブロッキング液と同様のもの）２００μｌで３回洗浄した。
【００６４】
以下にこれらの条件で作製したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質検出の酵素免疫測定法の行程を示す。
【００６５】
１．０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈した被検血清及び髄液１００μｌを各ホール内へ滴下し、むらなく免疫反応が起きるように振とうした後静置して常温で１時間インキュベートした。
【００６６】
２．１の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したビオチン標識トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するモノクローナル抗体（ＹＡ−２）５０μｌ（０．１μｇ蛋白／ml）を各ホール内に分注し振とうした後常温で２時間インキュベートした。
【００６７】
３．２．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識アビジン（１μｇ／ｍｌ Sigma製、Mo、米国）１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０分間インキュベートした。
【００６８】
４．３．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５ｍＭ塩化マグネシウムの入った溶液で３ｍＭとなるように希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０〜６０分間インキュベートした。
【００６９】
５．反応終了後４０５ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。このときＯＤが0.150以下を陰性、0.500以上を陽性、0.150〜0.500を判定保留とした。
【００７０】
６．結果を表４に示す。
【００７１】
【表４】
【００７２】
７．これらは水頭症のなかで、血清でのトキソプラズマ・ゴンディ特異ＩｇＭ抗体の検出、胎盤でのＰＣＲ法によるトキソプラズマ・ゴンディ特異ＤＮＡの検出により先天性トキソプラズマ症と診断した症例で、健常人２例に比べて先天性トキソプラズマ症新生児やその母はODが高く、トキソプラズマ・ゴンディ感染急性期及び治療効果判定のマーカーとして有用である。
【００７３】
【発明の効果】
本発明により、新規なトキソプラズマ・ゴンディ抗原が提供された。本発明の方法に従い、この抗原又はこの抗原に対する抗体を免疫測定することにより、トキソプラズマ・ゴンディの感染を診断することができる。特に、本発明の抗原を用いた免疫測定によると、感染初期に生じる抗体を感度良く測定することができる。
【００７４】
【配列表】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）抗原、該抗原をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該抗原に対する抗体及び該抗原又は該抗体を用いて抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体又はトキソプラズマ・ゴンディ抗原を免疫測定する方法に関する。本発明はトキソプラズマ・ゴンディによる感染症の診断に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
現在、トキソプラズマ虫体の各型に特異的な抗原に関して、幾つかの抗原領域について明確化されているが、増殖型虫体特異的抗原として１１６、７８、６４、６１、５４、５２、４２、３０、２４、６ＫＤａ蛋白質が知られている。また、シスト型虫体特異的抗原としては、３６、３４、２１、１８ＫＤａ蛋白質が知られている。さらに、スポロゾイト特異的抗原としては、２５、６７ＫＤａが存在する。これら様々な抗原の中でトキソプラズマ症に於ける病変は増殖型虫体の増殖が原因で発生することから臨床的側面から現存している各種抗トキソプラズマ特異抗体検出試薬は増殖型虫体抗原を使用している例が多く存在する。また、最近では、分子生物学的な手法を用いて増殖型虫体抗原の一つであるトキソプラズマ膜抗原であるＰ３０を大腸菌発現やそれらの領域の抗原エピトープを含む合成ペプタイドを用いた試薬も存在している。
【０００３】
トキソプラズマは、哺乳類、鳥類の血液、組織の細胞内に寄生する細胞内寄生性原虫であり、広く世界に分布する。その生活史は、終宿主であるネコの粘膜上皮細胞内で有性生殖によってオーシストを生じ便内に排出する。外界に出たオーシストはやがて８個のスポロゾイトを生じ成熟オーシストとなり感染力を持つようになる。成熟オーシストの経口感染によって腸管内でスポロゾイトが遊離して、腸管壁から侵入し、増殖型虫体となり増殖しながら全身に伝播される。
【０００４】
トキソプラズマ症の急性期には増殖体によって発熱、リンパ節腫脹の症状を呈し、網脈絡膜炎、肺炎、心筋炎などが起きるが、やがて慢性期に移行すると、脳、リンパ節や筋肉内に嚢子型虫体を包含する嚢子を形成して、ほとんど増殖を止めた状態でおとなしく感染を継続する。
【０００５】
トキソプラズマ原虫は、地域、年齢によって異なるが、日本においても数十パーセントから７０〜８０％の感染率を示す重要な原虫感染疾患である。最も悲惨なトキソプラズマ症は先天性トキソプラズマ症である。
【０００６】
ＡＩＤＳの日和見感染として注目されているトキソプラズマ症は、最近、医原病としての重要性が言われてきている。すなわち未感染の臓器移植患者がトキソプラズマ感染臓器の移植を受ける事により、急性トキソプラズマ症を起こす。臓器移植による拒絶反応を抑える為に使用される免疫抑制剤は、同時に移植患者の感染症に対する免疫反応を低下させ、その結果、感染臓器の移植によって感染した場合のトキソプラズマ症は重症であり、致命的な場合が多い。
【０００７】
トキソプラズマ原虫は細胞内寄生によって増殖、生存可能である。感染初期に於け る防御免疫の面からはマクロファージ感染が重要である。マクロファージが異物を貪食するとファゴソームを形成し、このファゴソームはやがてリソソームと融合し、ファゴリソソーム（二次リソソーム）になり、プロテアーゼによる酵素分解を行う。細胞内寄生体はこの異物消化機序から逃れられる。
【０００８】
トキソプラズマ原虫の場合は、マクロファージに侵入、感染すると、細胞内に侵入したトキソプラズマ原虫によってファゴソーム膜は修飾され、parasite-phorous vacuoleと呼ばれる特異的な細胞内構造物を作り上げる。このparasitophorous vacuole membraneは宿主細胞質膜分子を欠いている。やがて、ロプトリーから分泌された物質によりparasito phorous networkと呼ばれる索状構造物が出来る。これはトキソプラズマ原虫の生存、増殖に必要な栄養、環境の維持に機能しているのだと考えられている。さらに、生存しているトキソプラズマ原虫が感染しているparasitophorous vacuoleはリソソームと融合せす゛プロテアーゼによる攻撃を受けない。一方、死んだトキソプラズマの場合にはマクロファージによって取り込まれた液胞（ファゴソーム）はリソソームと融合し酵素消化を受ける。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来知られていない新規なトキソプラズマ・ゴンディ抗原を提供することである。また、本発明の目的は、本発明の新規トキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該抗原に対する抗体及び該抗原又は該抗体を用いて抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体又はトキソプラズマ・ゴンディ抗原を免疫測定する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、トキソプラズマ・ゴンディには、ヒトｈｓｐ７０蛋白質（Hunt, C., and R.I. Morimoto. 1985. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82; 6455-6459）にある程度類似した新規な抗原が存在することを見出し、該抗原をコードするＤＮＡのクローニング及び発現並びに該抗原の精製に成功し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性を発揮するアミノ酸配列から成る、トキソプラズマ・ゴンディ抗原を提供する。また、本発明は、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原に対する抗体を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
下記実施例において精製された、本発明の新規トキソプラズマ・ゴンディ抗原の好ましい一例は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
なお、一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸残基が挿入若しくは付加された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性を発揮するアミノ酸配列から成る抗原も本発明の範囲に含まれる。なお、ここで、「トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列から成るタンパク質に対する抗体と特異的に抗原抗体反応を行うことを意味する。
【００１４】
また、本発明は、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸を提供する。下記実施例においてクローニングされた、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードするＤＮＡの塩基配列が、そのコードする推定アミノ酸配列とともに配列表の配列番号２に示されている。なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列は配列番号１に示されるアミノ酸配列と同じである。なお、上記した本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原（配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたものを包含する）をコードするいずれの核酸も本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
さらに、本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を発現することができる組換えベクターを提供する。この組換えベクターは、宿主中での複製を可能にする複製開始点と、プロモーターと、該プロモーターの下流にクローニング部位とを少なくとも有する発現ベクターのクローニング部位に上記本発明の核酸を挿入、連結することにより作製することができる。上記のような発現ベクターは、この分野において周知であり、種々のものが市販されている。本発明の組換えベクターは、このような市販の発現ベクターのマルチクローニング部位に常法により本発明の核酸を挿入、連結することにより容易に作製することができる。なお、下記実施例に組換えベクター作製の手順の一例が具体的に記載されている。
【００１６】
本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原は、上記の組換えベクターで常法により宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体から目的のタンパク質を精製することにより得ることができる。組換えベクター中に挿入される核酸は、下記実施例において具体的に記載する方法によっても作製することができるし、また、該核酸の塩基配列が本発明により明らかにされているので、トキソプラズマ・ゴンディ細胞から常法であるＲＴ−ＰＣＲ法により容易に作製することもできる。
【００１７】
本発明はさらに、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原に対する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定に用いた場合の測定結果の信頼性の観点からモノクローナル抗体がより好ましい。ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も常法により得ることができる。すなわち、ポリクローナル抗体は、上記抗原を常法により動物に免疫し、抗血清として又は抗血清からさらに精製することにより得ることができる。また、モノクローナル抗体は、上記抗原を常法により動物に免疫し、脾細胞又はリンパ球を回収してミエローマ細胞と常法により融合し、融合細胞を選択し、上記抗原と抗原抗体反応を行うモノクローナル抗体を産生しているクローンを選択し、該クローンを培養してモノクローナル抗体を回収することにより得ることができる。なお、モノクローナル抗体の作製方法の一例が下記実施例に具体的に記載されている。
【００１８】
本発明はさらに、上記本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原又は上記本発明の抗体を用いて検体中の抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体又はトキソプラズマ・ゴンディ抗原を免疫測定する方法を提供する。免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、種々の方式のものが知られているが、そのいずれの方式をも採用することができる。すなわち、例えば、反応形式により分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法等があるが、これらのいずれであってもよく、また、用いる標識の種類により分類すると、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、ビオチン免疫測定法等があるがこれらのいずれであってもよい。要するに、本発明のトキソプラズマ・ゴンディ抗原と、検体中の抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体との抗原抗体反応を利用して検体中の抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体を測定する免疫測定方法、及び本発明の抗体と、検体中のトキソプラズマ・ゴンディ抗原との抗原抗体反応を利用して検体中のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を測定する免疫測定方法は全て本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明の免疫測定方法の対象となる検体としては、トキソプラズマ・ゴンディによる感染が疑われる人の血液や血清等の体液が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
トキソプラズマ・ゴンディのｈｓｐ７０様蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ＭＯＳＥＩ ｃＤＮＡライブラリー作製キット（Amersham LIFE SCIENCE社より市販）を用い、トキソプラズマ・ゴンディＲＨ株のtayzoiteから分離したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから構成されたｃＤＮＡを作製した。これらのｃＤＮＡライブラリーに対してヒトのｈｓｐ７０ ＤＮＡを放射性核種である（３２Ｐ）で標識したプローブ（ＡＴＣＣ受託番号５７４９４ヒトｇＤＮＡ由来）を用いてクロスハイブリダイゼーション法によってヒトｈｓｐ７０遺伝子領域と特異的に反応するトキソプラズマ・ゴンディ遺伝子のスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーション時に使用したハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファーの各組成及び反応温度は次の通りであった。すなわち、３×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０ｍＭトリスベース（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ及び６０℃で変性した２０μｇ／μｌのサケ精子を各々添加してハイブリダイゼーションに用いた。また、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを各々添加し、各々６０℃で反応及び洗浄を行った。この方法によって１×１０５個のｃＤＮＡクローンからヒトｈｓｐ７０ ＤＮＡプローブに対して特異的に反応する１５クローンを取得した。
【００２２】
また、これらの１５クローンの内最もｃＤＮＡのサイズが大きいｐＴＨ１４クローンをクローニングベクターpBluescript SKII(+)(Stratagene社製）のマル チクローニングサイト内の制限酵素サイトＢａｍＨＩ内に挿入し、クローン化した。
【００２３】
実施例２
クローン化ＤＮＡ：ｐＴＨ１４の塩基配列の決定
塩基配列の決定は、ジェネティックアナライザー３１０（パーキンエルマー社製）を使用して行った。この際、シークエンスプライマーの標識には、サイクルシークエンスキットＦＳ（パーキンエルマー社製）を使用しダイターミネーター法により実施した。また、シークエンシングに際しては、合計１２個のプライマーを合成し（パーキンエルマー社 ＡＢＩ ＤＮＡシンセサ イザー ３９１型）プライマーウォーキングによるシークエンシングに供試した。決定された塩基配列を、これがコードする推定アミノ酸配列とともに配列番号２に示す。
【００２４】
実施例３ 塩基配列のデータ解析
遺伝子塩基配列及びアミノ酸配列の解析は、Genetyx-Mac software( Software development)を用いて行った。
【００２５】
実施例４
組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質の発現と精製
（１）発現ベクターの構築
発現ベクターを構築する際には、ｐＴＨ１４クローンを鋳型としてＰＣＲ法を用いてＴ．ｇｏｎｄｉｉ ｈｓｐ７０領域を増幅し、発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（米国Novagen社より市販）の制限酵素サイトＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ内に再クローニングした。この際、５’末端の転写開始コドンを設定プライマー内から除外する事で削除した。この際目的領域を増幅する為に使用したプライマーを以下に示す。
【００２６】
TH: 5'-CGGGATCCTTAACCGAGAGAGAGAGGCGC-3'
T7: 5'-CATCTCGAGCTGGAGACAGCTGGTGGT-3'
【００２７】
（２）目的遺伝子の発現及び発現蛋白質の精製
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクター ｐＥＴ１５ｂで形質転換した宿主細胞 Escherichia coli BL21を培養して目的遺伝子の発現を行った。その際、培養液としてＬＢ培地（ＢＩＯ １０１社製）を使用し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／μｌになる様に添加した。また、培養温度は３７℃で実施した。更に、蛋白質の発現は終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（ナカライ タスク社製）を添加し、３時間誘導した。
【００２８】
（３）発現蛋白質の回収及び精製
５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに発現抗原を浮遊させ、超音波破砕装置（オリンパス社製）によって２００Ｗ、５分、０℃の条件で細胞を破砕した。次に、これらの細胞破砕物を除外する為に１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件で遠心沈殿した。
【００２９】
次に、細胞破砕物を結合バッファ中（６０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）でホモジナイズした。遠心沈殿後の上清をニッケルキレートカラム精製の為にProbond column(Invitrogen、San Diego、CA)に１０ｍｌアプライした。次に、Probond columnを洗浄バッファー（６０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）４ｍｌで２回洗浄した。
【００３０】
そして最終的にカラムに結合した精製発現蛋白質は、溶出バッファー（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）５ｍｌを用いて溶出した。これらの蛋白質は、セントリプレップ−３０（アミコン社製）濃縮器を用いて遠心濃縮した。その結果、これらの組換え蛋白質の収量は、１Ｌの培養で約１ｍｇであった。更に、これらの精製済み発現蛋白質の精製度は、クマシーブリリアントブルー蛋白質染色で７６ＫＤａ，４６ＫＤａ，３１ＫＤａの三本のメジャーなバンドとして確認出来た。
【００３１】
実施例５
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様組換え精製蛋白質の抗原性の確認
実施例４で精製した組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質を用いてその免疫学的な特異性について臨床材料を用いてウエスタンブロッティングによる抗原解析を行った。この操作の具体的な手順は次の通りであった。すなわち、組換えトキソプラズマ・ゴンディhsp70様蛋白質１μｇを１０％ＳＤＳ−ポリアクリラマイドゲルで電気泳動した後、ニトロセルロース膜へ再び電気泳動によって転写した。ニトロセルロース膜の活性基を脱脂粉乳液（明治乳業製）でコートした後、リン酸緩衝液（0.01 M, pH7.2)で１００倍に希釈した血清検体１ｍｌで室温２時間反応させた後、リン酸緩衝液（0.01 M, pH7.2)で４回洗浄した。その後、パーオキシダーゼ結合抗ヒト免疫グロブリン抗体（Amersham製）を反応させ、ＥＣＬキット（Amersham製）にてフィルム（フジフィルム）に感光させた。
【００３２】
その結果、各種特異抗体の検出状況とウエスタンブロッティングの結果が完全に一致する結果となった。結果を下記表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
実施例６
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様精製発現蛋白質を用いた抗体の作製
トキソプラズマ・ゴンディＨＲ株のTachyzoitesは、ヒトＢ細胞系ＡＲＨで生成した。また、トキソプラズマ・ゴンディＦＵＫＡＹＡ株は、Ｂ１０．Ａ（４Ｒ）マウスで生成した。
【００３５】
（１）抗トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様タンパク質モノクローナル抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、２００μｇ／ｍｌの精製組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質をＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントと１：１で混合し、体幹部皮下の３ヶ所に対して各々０．２５ｍｌ接種し初回免疫を実施した。次に、２週間後、初回免疫時同様の抗原を用いてＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントによって誘導免疫を行った。この際のアジュバントと抗原の混合比、接種容量及び接種部位は初回免疫時と同様である。
【００３６】
さらに、誘導免疫以後３日後にハイブリドーマ作製のためマウス脾臓細胞を取り出し細胞融合装置ＳＳＨ−１型（島津製作所社製、京都）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウス由来ＳＰ２ミエローマ細胞と融合した。なお、摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Kohler et al.,Nature, vol.256,p495-497(1975)）により実施した。
【００３７】
さらに、融合細胞は、ＨＡＴ選択培地（ベーリンガーマンハイム社製）で中２日ごとに２回に亘り細胞選択を行った。この際の培養上清から、ＥＬＩＳＡによって抗トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ ７０様タンパク質モノクローナル抗体の存在を確認した。陽性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法によってクローニングを行った。また、ヒト ｈｓｐ７０に対して非特異的な反応を示すモノクローナル抗体については、ポリエチレングリコールを用いた細胞融合方法を使用した事を除き他は同様の方法によって選択した。さらに、取得した腹水は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによってＩｇＧを精製しモノクロナール抗体とした。
【００３８】
（２）ＥＬＩＳＡの構築
上記の工程で行なったＥＬＩＳＡは次ぎのように行なった。ＥＬＩＳＡは、Current Protocols in immunology 1997, vol. 1, 2.1.2-2.1.20に従い構築した。すなわち、平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Ｚｕｇ、スイス国）に２μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ（−）で調整した精製組換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様発現 蛋白質を固相した。固相条件は、４℃で１２時間以上静置した。前述の固相プレートは、ブロッキング液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０加ホウ酸バッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ3）を用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は、４℃で一夜静置した。
【００３９】
以下にこれらの条件で作製した抗トキソプラズマ・ゴンディＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡの行程を示す。
【００４０】
１．非検血清及び培養上清を適宜希釈した後各ホール内へ１００μｌ滴下し、むらなく免疫反応が起こる様に振とうした後静置して常温（１５〜２５℃）で１時間インキュベートした。
【００４１】
２．１．の操作の後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１．４ｍＭリン酸二水素カリウム３．６ｍＭ リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、１４６ｍＭ 塩化ナトリウム）を用いて３回洗浄後、２０００倍希釈アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧコンジュゲート（Tago、Camarillo、CA）を１００μｌ各ホール内に分注し振とうした後常温で１時間インキュベートした。
【００４２】
３．２．の操作後、前出同一の洗浄液にて３回洗浄後、１ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸を各ホールに１００μｌ分注した後、振とうし、常温暗所で３０分間発色させる。その後１．５Ｎ硫酸 １００μｌを添加し反応を停止した。
【００４３】
４．発色済みプレートは４９２ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。
【００４４】
実施例７
トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するＩｇＧ抗体（ヒト）検出酵素免疫測定法の構築
平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Zug、スイス国）に１０μｇ蛋白／ｍｌの濃度に０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で調整した精製組み換えトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質を５０μｌ固相した。 固相条件は、４℃で一晩静置した。 前述のプレートは、ブロッキング液（０．２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０加、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０））２００μｌを用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は常温（１５〜２５℃）２時間静置した。ブロッキング後洗浄液（ブロッキング液と同様のもの）２００μｌで３回洗浄した。
【００４５】
以下にこれらの条件で作製した抗トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質ＩｇＧ抗体（ヒト）酵素免疫測定法の行程を示す。
【００４６】
１． ０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した被検血清及び髄液５０μｌを各ホール内へ滴下し、むらなく免疫反応が起きるように振とうした後静置して常温で２時間インキュベートした。
【００４７】
２． １．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ社製）５０μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で２時間インキュベートした。
【００４８】
３． ２．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５ｍＭ塩化マグネシウムの入った溶液で３ｍＭとなるように希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０〜６０分間インキュベートした。
【００４９】
４． 反応終了後４０５ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。このときＯＤが0.110以下を陰性、0.200以上を陽性、0.110〜0.200を判定保留とした。
【００５０】
５．結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
６． これらは水頭症のなかで、血清でのトキソプラズマ・ゴンディ特異ＩｇＭ抗体の検出、胎盤でのＰＣＲ法によるトキソプラズマ・ゴンディ特異ＤＮＡの検出により先天性トキソプラズマ症と診断した症例で、健常人２例に比べて先天性トキソプラズマ症新生児やその母はODが高く、トキソプラズマ・ゴンディ感染急性期及び治療効果判定のマーカーとして有用である。
【００５３】
実施例８ トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質の検出酵素免疫測定法の構築
平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Zug、スイス国）に１０μｇ蛋白／ｍｌの濃度に０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で調整したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するモノクローナル抗体を１００μｌ固相した。 固相条件は、４℃で一晩静置した。 前述のプレートは、ブロッキング液（０．２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０加、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０））２００μｌを用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は、常温（１５〜２５℃）２時間静置した。ブロッキング後洗浄液（ブロッキング液と同様のもの）２００μｌで３回洗浄した。
【００５４】
以下にこれらの条件で作製したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質検出の酵素免疫測定法の行程を示す。
【００５５】
１． ０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈した被検血清及び髄液１００μｌを各ホール内へ滴下し、むらなく免疫反応が起きるように振とうした後静置して常温で１時間インキュベートした。
【００５６】
２． １．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したビオチン標識トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質５０μｌ（０．１μｇ蛋白）を各ホール内に分注し振とうした後常温で２時間インキュベートした。
【００５７】
３．２．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識アビジン（１μｇ／ｍｌ Sigma製、Mo、米国）１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０分間インキュベートした。
【００５８】
４．３．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５ｍＭ塩化マグネシウムの入った溶液で３ｍＭとなるように希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０〜６０分間インキュベートした。
【００５９】
５．反応終了後４０５ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。このときＯＤが1.000以上を陰性、0.800以下を陽性、0.800〜1.000を判定保留とした。
【００６０】
６．結果を表３に示す。
【００６１】
【表３】
７．これらは水頭症のなかで、血清でのトキソプラズマ・ゴンディ特異ＩｇＭ抗体の検出、胎盤でのＰＣＲ法によるトキソプラズマ・ゴンディ特異ＤＮＡの検出により先天性トキソプラズマ症と診断した症例で、健常人２例に比べて先天性トキソプラズマ症新生児やその母はODが低く、トキソプラズマ・ゴンディ感染急性期及び治療効果判定のマーカーとして有用である。
【００６３】
実施例９ トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質の検出酵素免疫測定法の構築
平底マイクロタイタープレート（Dynatech社製、Zug、スイス国）に１０μｇ蛋白／ｍｌの濃度に０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で調整したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するモノクローナル抗体（ＹＡ−１）を１００μｌ固相した。 固相条件は、４℃で一晩静置した。 前述のプレートは、ブロッキング液（０．２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０加、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０））２００μｌを用いてブロッキングを行った。ブロッキングの条件は、常温（１５〜２５℃）２時間静置した。ブロッキング後洗浄液（ブロッキング液と同様のもの）２００μｌで３回洗浄した。
【００６４】
以下にこれらの条件で作製したトキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質検出の酵素免疫測定法の行程を示す。
【００６５】
１．０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈した被検血清及び髄液１００μｌを各ホール内へ滴下し、むらなく免疫反応が起きるように振とうした後静置して常温で１時間インキュベートした。
【００６６】
２．１の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したビオチン標識トキソプラズマ・ゴンディｈｓｐ７０様蛋白質に対するモノクローナル抗体（ＹＡ−２）５０μｌ（０．１μｇ蛋白／ml）を各ホール内に分注し振とうした後常温で２時間インキュベートした。
【００６７】
３．２．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈したアルカリフォスファターゼ標識アビジン（１μｇ／ｍｌ Sigma製、Mo、米国）１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０分間インキュベートした。
【００６８】
４．３．の操作の後、洗浄液２００μｌを用いて２回、蒸留水２００μｌで１回洗浄後、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム及び０．５ｍＭ塩化マグネシウムの入った溶液で３ｍＭとなるように希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μｌを各ホール内に分注し振とうした後常温で３０〜６０分間インキュベートした。
【００６９】
５．反応終了後４０５ｎｍの波長を用いて吸光度の測定を行った。このときＯＤが0.150以下を陰性、0.500以上を陽性、0.150〜0.500を判定保留とした。
【００７０】
６．結果を表４に示す。
【００７１】
【表４】
７．これらは水頭症のなかで、血清でのトキソプラズマ・ゴンディ特異ＩｇＭ抗体の検出、胎盤でのＰＣＲ法によるトキソプラズマ・ゴンディ特異ＤＮＡの検出により先天性トキソプラズマ症と診断した症例で、健常人２例に比べて先天性トキソプラズマ症新生児やその母はODが高く、トキソプラズマ・ゴンディ感染急性期及び治療効果判定のマーカーとして有用である。
【００７３】
【発明の効果】
本発明により、新規なトキソプラズマ・ゴンディ抗原が提供された。本発明の方法に従い、この抗原又はこの抗原に対する抗体を免疫測定することにより、トキソプラズマ・ゴンディの感染を診断することができる。特に、本発明の抗原を用いた免疫測定によると、感染初期に生じる抗体を感度良く測定することができる。
【００７４】
【配列表】
Claims (8)
- 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、トキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性を発揮するアミノ酸配列から成る、トキソプラズマ・ゴンディ抗原。
- 前記トキソプラズマ・ゴンディ抗原は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその一部分であってトキソプラズマ・ゴンディに特異的な抗原性を発揮するアミノ酸配列から成る請求項１記載のトキソプラズマ・ゴンディ抗原。
- 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列から成る請求項２記載のトキソプラズマ・ゴンディ抗原。
- 請求項１ないし３のいずれか１項に記載のトキソプラズマ・ゴンディ抗原をコードする核酸。
- 配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する請求項４記載の核酸。
- 請求項４又は５記載の核酸を含み、宿主細胞中で請求項１ないし３のいずれか１項に記載のトキソプラズマ・ゴンディ抗原を発現することができる組換えベクター。
- 請求項１ないし３のいずれか１項に記載のトキソプラズマ・ゴンディ抗原に対する抗体。
- モノクローナル抗体である請求項７記載の抗体。
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