KR20170046836A - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 - Google Patents

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 Download PDF

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KR20170046836A
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syndrome virus
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차상호
우인옥
유지은
최세은
이지현
송재영
조인수
정광면
이상오
김춘회
전은성
이혜영
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대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae

Abstract

본 발명은 북미형 및 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 및 이를 이용한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 키트를 이용하면 신속 면역크로마토그라피법을 이용하여 특별한 검사 장비 없이 현장에서 간편하고 신속하게 북미형 및 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염여부를 진단할 수 있다. 본 발명의 키트는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 측정에 있어서 우수한 민감도 및 특이도를 보이며, 골드 리더기를 사용하여 수치로 결과 표현이 가능하기 때문에 육안으로 확인하는 기존 키트 보다 편리하고 정확한 판정이 가능하다.

Description

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트{Rapid Kit for Diagnosing the specific antibodies against Porcine Respiratory Reproductive Syndrome Virus}
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 및 이의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단 용도에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기 증후군(PRRS, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) 은 1980년대 말 북미에서 최초로 발생 보고된 후 현재 국내뿐만 아니라 전세계 양돈 산업 국가에서 발생하고 있는 질병이다.
돼지생식기호흡기 증후군의 원인체는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)로써 Nidovirales, Arterviridae, Arterivirus 에 속하는 RNA 바이러스이다. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스는 크게 항원적, 유전학적 특성들에 따라 유럽형 타입 1(European genotype, EU)과 북미형 타입 2(North American genotype, NA)로 구분될 수 있다. 돼지생식기호흡기증후군의 증상으로는 불임, 임신말기 미이라 태아, 유산, 조산 등이 나타나며, 바이러스에 감염되어 태어난 허약 자돈은 생후 호흡기에 2차 감염으로 인해 폐사하는 것으로 알려져 있다.
농장 내 돼지생식기호흡기증후군의 감염실태를 더욱 효과적으로 파악하기 위해서는 북미형/유럽형을 감별하는 것이 중요하며 이로써 효율적인 방제를 목적으로 한 백신 선정을 유도할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 생물학적 시료에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 여부를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 진단 키트를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체와 특이적으로 결합하는 항원 및 골드 나노입자를 이용하여 시료로부터 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 존재 여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 키트를 이용하여 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이 항체를 진단하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome Virus) 특이항체 진단용 래피드 키트로서,
상기 래피드 키트는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고,
상기 컨쥬게이트 패드에는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원과 골드 나노입자가 결합된 항체 탐지용 제1 컨쥬게이트 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원과 골드 나노입자가 결합된 항체 탐지용 제2 컨쥬게이트가 포함되어 있고,
상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 검사선 및 대조선이 순차적으로 형성되어 있고,
상기 검사선에는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원이 고정되어 있고,
상기 대조선에는 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위해 액체 시료에 포함되는 대조군 항체에 특이적으로 결합하는 항체(항-토끼 IgG)가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트를 제공한다.
본 발명자들은 생물학적 시료에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 감염 여부를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 진단 키트를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체와 특이적으로 결합하는 항원 및 골드입자를 이용하여 시료로부터 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 존재 여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 규명하였다.
본 발명에서 돼지생식기호흡기증후군 진단에 사용하고 있는 면역크로마토그래피법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 임신진단 또는 간염발병 등과 같은 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서 모세관 현상이 작용하는 다공성 박막을 고상(solid phase)으로 하고 금 콜로이드 또는 착색 폴리스티렌 나노 입자 등의 유색입자를 측정 라벨로 사용하는 신속 현장진단용 면역검사법의 일종이다.
본 발명의 키트는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항체와 특이적으로 결합하는 항원을 이용하여 시료로부터 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 존재 여부를 특이적으로 진단할 수 있게 한다.
본 발명의 키트는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드(sample pad), 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 감지용 컨쥬게이트 패드(conjugate pad), 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 캡쳐용 항원이 고정된 멤브레인(membrane) 및 액체 시료를 흡수할 수 있는 흡수 패드(Absorption pad)가 순차적으로 연결된 구조를 포함한다.
본 발명의 키트에서 상기 “샘플 패드”는 분석을 행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 행할 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 키트에서 상기 “컨쥬게이트 패드”는 샘플 패드로부터 확산되어 이동되는 샘플을 수용하며, 동시에 나노입자와 항원이 연결된 “나노입자-항원 컨쥬게이트”가 포함되어 있는 패드이다. 컨쥬게이트 패드는 샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다.
본 발명의 키트에서 상기 “멤브레인”은 샘플 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함한다.
본 발명의 키트에서 상기 “흡수패드”는 상기 멤브레인의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들인다. 흡수 패드는 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 동일한 지지체상에 순차적으로 연결되어 구성된다.
상기 지지체는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에서 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체와 결합하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 캡쳐용 항원이 고정된 시험선(test line) 및 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위한 대조선(control line)이 순차적으로 형성되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 시험선에 고정되는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 캡쳐용 항원은 서열목록 제1서열의 아미노산으로 이루어진 항원 및 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 항원이다.
대조선에는 시료가 전개되었다는 것을 확인하기 위해 액체 시료에 포함되는 대조군 항체에 특이적으로 결합하는 항체가 고정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 대조군 항체로 토끼 IgG, 마우스 IgG 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 액체 시료에 포함되는 대조군 항체는 토끼 IgG이고, 대조선에 고정되는 항체는 항-토끼 IgG이다. 액체 시료가 정상적으로 전개되는 경우, 액체 시료에 포함된 대조군 항체 및 골드나노입자의 결합체와 대조선에 고정된 항체가 반응하여 발색된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 생물학적 시료는 검체희석용액에 적절히 희석된 후 샘플 패드의 검체 적하창에 투입되면서 본 발명의 키트에 적용된다.
본 발명의 키트에 적용되는 생물학적 시료로서 돼지 유래 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 기타 체액(소변 등) 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트에 적용되는 생물학적 시료는 돼지의 전혈, 혈장 또는 혈청이다.
보다 상세하게는, 생물학적 시료를 검체희석액에 적절히 희석한 후 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 측정용 래피드 키트의 샘플 패드에 위치한 검체 적하창에 넣어 전개시킨다. 시료 중에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항체가 존재할 경우, 상기 항체는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 탐지용 항원-골드 나노입자 결합제, 그리고 시험선에 고정된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 캡쳐용 항원과 결합하여 시험선에 골드 색이 나타나게 된다. 따라서, 생물학적 시료 내에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항체가 있는 경우에는 멤브레인의 대조선 및 시험선에서 모두 발색되고, 생물학적 시료 내에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 항체가 없는 경우에는 대조선에서만 발색된다(도 2 참조).
본 발명의 키트에서 대조선 및 시험선에서 모두 발색되는 경우, 생물학적 시료는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 감염 또는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 백신 투여에 의해 항체가 생산된 것으로 판정하고 대조선에서만 발색되는 경우, 생물학적 시료는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 감염되지 않은 것 또는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 백신 투여 후 항체가 생산되지 않은 것으로 판정한다.
본 발명의 키트는 돼지 유래 생물학적 시료에 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이적인 항체가 존재하는지 여부를 판단하는데 사용될 수 있다. 돼지 유래의 생물학적 시료로부터 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이적인 항체가 존재하는지 여부를 판단함으로써 상기 돼지가 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 감염되었는지 또는 백신 접종에 의해 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이적인 항체를 생산했는지 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 CSFV, BVDV, FMDV, PCV, APP5, HP, PCV2, APP2 및 MH 등에 대하여 교차반응을 보이지 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 특이항체의 진단 방법을 제공한다:
(a) 생물학적 시료를 검체희석액에 희석하여 본 발명의 키트의 샘플 패드에 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 키트에서 발생하는 신호를 분석하여 상기 생물학적 시료에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체의 존재 여부를 측정하는 단계.
본 발명을 이용하면 북미형 또는 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 특이항체를 모두 진단할 수 있다.
본 발명은 상기 키트를 이용하여 돼지생식기호흡기증후군 특이항체를 진단하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 북미형 및 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트 및 이를 이용한 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 키트를 이용하면 신속 면역크로마토그라피법을 이용하여 특별한 검사 장비 없이 현장에서 간편하고 신속하게 북미형 및 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염여부를 진단할 수 있다.
(c) 본 발명의 키트는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 측정에 있어서 우수한 민감도 및 특이도를 보이며, 골드 리더기를 사용하여 수치로 결과 표현이 가능하기 때문에 육안으로 확인하는 기존 키트 보다 편리하고 정확한 판정이 가능하다.
도 1은 면역크로마토그래피법에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 진단키트에 대한 양성/음성 판별 원리를 나타낸 모식도이다.
도 3은 스트립에 대한 모식도이다.
도 4는 진단 키트에 대한 검출한계를 측정한 결과이다.
도 5는 타 질병 항체에 대한 교차반응을 측정한 결과이다.
도 6은 재현성을 평가한 결과이다.
도 7은 상용화되어있는 ELISA (IDEXX PRRS X3 Ab)와 본 발명의 PRRS 항체 래피드 키트의 반응성을 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
개발 내용 및 방법
“돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체 진단 래피드 키트”는 돼지 혈청에 포함되어 있는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)에 대한 항체를 특이적으로 검출하는 키트로 면역크로마토그래피법을 이용하여 검출한다(도 1).
PRRSV 항체 진단 방법에는 IFA와 ELISA 방법이 많이 사용되고 있으나, 이 진단 방법은 여러 과정이 필요하고 많은 시간이 소요되며 고가의 장비가 필요하여 간편하고 신속한 진단에는 어려움이 있고 래피드 키트 보다 비용이 비싼 단점이 있다.
검사방법의 장점 및 단점
검사방법 장점 단점
IFA - 가격이 저렴함
PRRSV 항체진단 표준 시험법		 - 실험자에 따른 판독 오차가 큼
- 고가 장비 필요
ELISA - 여러 샘플 동시 측정 가능
- 비교적 저렴함		 - 검사시간 2~3시간
- 복잡한 검사과정
고가 장비 필요
RAPID - 빠르고 간편한 검사 가능
(10~20분 이내)
- 저렴한 비용		 Indirect rapid-정량분석 어려움
본 진단키트는 검체를 투입하고 10분 후 PRRSV 항체를 검출할 수 있고 비용이 저렴한 장점이 있다. 또한 북미형 PRRSV와 유럽형 PRRSV 감염에 의해 유발되는 항체를 모두 검출가능하며 감염초기를 진단할 수 있다. 상용화되어있는 ELISA와 병행하여 사용할 경우 감염시기(초기감염)를 판단할 수 있어 스크리닝 후 감염확산방지를 위한 초동대처에 유용하게 적용될 수 있다. IFA ELISA에 비해 민감한 검출한계를 보여 현장에서의 초기 질병 스크리닝 용으로 적합하며, 백신접종 후 백신에 의한 항체 생성유무 등을 간편하게 진단하여 파악하는데 용이하다 .
본 키트의 사용 방법은 혈청 검체를 희석 버퍼와 섞고 5분 후 투입구에 넣으면 혈청 중에 PRRSV 항체가 존재할 경우 PRRSV 재조합 항원-골드 콘쥬게이트와 결합하여 모세관력에 의해 멤브레인을 이동하면서 멤브레인 상에 분주되어 있는 PRRSV 재조합 항원과 반응하여 검사선에 붉은 색 선이 나타나는 샌드위치 방식의 진단키트이다(도 2).
실시예 1: 래피드 진단 키트 제조
1-1: 골드 콘쥬게이트 제조
골드 콘쥬게이트는 항원과 골드 입자(40 nm) 간의 결합체를 뜻하며 콘쥬게이트 제조를 위해 흡착 방법을 이용하여 아래와 같이 제조를 하였다.
제조방법
1) 항원 준비: 검사선 반응을 위해 북미형 PRRSV 재조합 뉴클레오캡시드 항원과 유럽형 PRRSV 재조합 뉴클레오캡시드 항원을 준비하고, 대조선 반응을 위해 토끼항체를 준비한다(골드용액 1 ml coupling 시 각각 10 μg이 필요).
2) 골드 용액 준비: 40 nm 콜로이드 골드를 분광광도계를 이용하여 525 nm 파장에서 OD값 1이 되도록 만들고, pH 10으로 맞춰 준비한다.
3) 콘쥬게이트 제조: 위에서 준비한 항원과 골드를 10 μg/ml로 섞고 상온에서 1시간 반응 시킨다.
4) 블로킹 및 세척: 골드 용액의 항원과 반응하지 못한 부분을 블로킹 하기 위해 0.3% 카제인을 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨다. 제조된 콘쥬게이트 외 반응하지 못한 항원과 블로킹 용액을 제거하기 위해 원심분리를 이용하여 상층액을 버리고 1% BSA 용액을 첨가하여 다시 원심분리한 후 상층액을 제거하고 1% BSA 용액을 첨가하여 다시 원심분리한 후 상층액을 제거하고 1% BSA 용액으로 처음 시작한 볼륨에서 약 1/10이 되도록 첨가한 후, 분광광도계를 이용하여 525 nm 파장에서 OD값을 측정한다.
5) 골드 콘쥬게이트 안정성 유지를 위한 건조
골드 콘쥬게이트는 시간이 지날수록 활성이 떨어진다는 단점이 있다. 이 단점을 극복하고, 안정성을 확보하기 위해 유리 섬유에 3가지 화학 물질을 첨가하여 건조하는 방법을 사용했다. 5% 수크로오스, 0.1% 카제인, 0.1% NaN3의 첨가물을 각각 넣고, 토끼 IgG 골드 콘쥬게이트를 분광광도계 OD 값 기준 0.7이 되도록 넣고 PRRSV 재조합 항원-골드 콘쥬게이트 OD 5가 되도록 넣어 드라이어를 이용하여 20분간 건조한다.
1-2: 스트립의 제조
스트립은 샘플패드(Ahlstrom), 멤브레인(Millipore), 흡수패드(Ahlstrom)를 중첩되게 하여 일정한 방향으로 흘러가면서 캡처와 반응하도록 하는 형태를 갖는다(도 3).
제조방법
1) 항원 준비 : 항-토끼 IgG(Arista) 1 mg/ml과 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원(뉴클레오캡시드) 혼합액 0.6 mg/ml에 각각 0.5% 수크로오스(Sigma)와 0.1% NaN3(Sigma)을 첨가하여 준비한다.
2) 항원 분주 및 고정 : 백킹 카드(backing card)(PJ상사)에 멤브레인을 붙이고 컨트롤 라인에는 항-토끼 IgG를, 테스트 라인에는 북미형 및 유럽형 PRRSV 재조합 항원(뉴클레오캡시드) 혼합액을 베드 스피드 10 cm/sec, 분주 볼륨 0.9 μl/cm로 분주한다. 그 후 제습 캐비닛에서 24시간 이상 건조하여 항원을 멤브레인에 고정시킨다.
3) 패드 부착 및 절단 : 항원이 고정이 되면 샘플패드와 흡수패드를 각각 정해진 위치에 붙이고 로터리 슬리터를 이용하여 4 mm 간격으로 자른다.
4) 조립 및 포장 : 완성된 스트립을 하우징에 조립하고 알루미늄 파우치에 실리카겔과 밀봉하여 포장한다.
1-3: 검출 용액 제조
50 mM 보랙스 버퍼에 0.4% Tween20(Sigma), 0.5 N NaCl, 0.01% NaN3를 넣어준다.
1-4: 사용 방법 및 결과 판정
1) 테스트 하고자 하는 혈청 샘플을 샘플용 드롭퍼로 채취하여 2방울을 희석용 튜브에 넣고, 희석 버퍼도 드롭퍼를 이용하여 8방울 넣어 잘 섞어 5분간 반응시킨다.
2) 디바이스를 꺼내 평평한 곳에 놓고 샘플 주입구에 1번에서 혼합한 용액을 3방울 넣는다.
3) 상온에서 10분 동안 로딩시키고 골드 리더기를 이용하여 수치 값을 측정한다.
4) 수치 값이 40 미만이면 음성, 40 이상이면 양성으로 판정한다.
1-5: 결과 분석
검출 한계 비교
본 키트는 기존 ELISA 키트(IDEXX indirect ELISA)의 검출한계보다는 약 2배정도 낮은 농도까지 검출하는 것으로 나타났다(도 4).
샘플 IFA IDEXX PRRS X3 Ab ELISA (S/P) VDRG®PRRSV AB RAPID KIT
Cal.1 1/80 (+) 2.579 (+) +
Cal.2 1/40 (+) 1.634 (+) +
Cal.3 1/20 (+) 1.013 (+) +
Cal.4 - 0.568 (+) +
Cal.5 - 0.268 (-) +
Cal.6 - 0.171 (-) -
Cal.7 - 0.074 (-) -
Cal.8 - 0.047 (-) -
IDEXX PRRS X3 Ab ELISA (S/P) cut-off value :
negative result : S/P < 0.4, positive result : S/P ≥ 0.4
민감도 특이도 측정
PRRSV 항체 측정 상위 방법인 ELISA 방법과 비교하여 민감도, 특이도를 측정하였다.
㈜메디안디노스틱 검사 결과
IDEXX PRRS X3 Ab ELISA 래피드 측정민감도
(래피드 양성/ELISA 양성)		 100%
양성 음성 합
ELISA 양성 100 0 100 측정 특이도
(래피드 음성/ELISA 음성)		 97.1%
음성 3 102 105
농림축산검역본부 평가 의뢰 결과
IDEXX PRRS X3 Ab ELISA 래피드 측정민감도
(래피드 양성/ELISA 양성)		 93.2%
양성 음성 합
ELISA 양성 218 16 234 측정 특이도
(래피드 음성/ELISA 음성)		 95.7%
음성 10 221 231
㈜메디안디노스틱 검사결과 IDEXX PRRS X3 Ab ELISA에서 양성인 검체 100건 중 100건을 래피드에서 양성으로 검출하여 민감도는 100%이고, IDEXX PRRS X3 Ab ELISA에서 음성인 검체 105건 중 102건을 음성으로 검출하여 특이도는 97.1%이다.
농림축산검역본부에 평가를 의뢰하여 테스트한 결과 IDEXX PRRS X3 Ab ELISA에서 양성인 검체 234건 중 218건을 래피드에서 양성으로 검출하여 민감도는 93.2%이며, IDEXX PRRS X3 Ab ELISA에서 음성인 검체 231건 중에 221건을 음성으로 검출하여 95.7% 의 특이도를 나타내었다.
실시예 2: 교차반응성 평가
다른 항혈청과의 교차반응을 확인하기 위해 돼지 혈청 내에 타 질병 항체를 ELISA를 통해 확인하여 PRRSV에 대한 항체는 음성이면서 타 질병 원인체에 대해 항체 양성인 검체를 시제품으로 검사하여 타 항체에 대한 교차반응을 확인하였다. 테스트 결과 타 질병 항혈청과의 교차반응은 없는 것으로 확인되었다(도 5).
번호 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PRRSV S/P 0.06 0.02 0.01 0.03 0.01 0.01 0.02 0.01 0.05 0.16
CSFV PC% 99.7 104.8 102.3 95.1 33.1 95.8 88.1 84.6 103.3 101.0
BVDV S/N 0.80 0.98 0.57 1.05 0.98 0.77 1.02 1.02 0.63 1.03
FMDV S/N 0.67 0.41 0.82 0.80 0.76 0.81 0.17 0.83 0.36 0.68
PCV S/P 2.08 2.28 0.28 2.10 0.54 2.04 0.72 1.68 1.65 2.18
APP5 S/P 0.40 0.90 0.90 1.77 0.68 1.39 1.06 1.52 0.53 0.17
HP S/P 0.28 0.35 0.29 0.79 0.46 0.45 0.33 0.40 0.34 0.36
PCV2 S/P 1.44 1.57 0.51 1.65 0.47 1.40 0.78 1.21 0.82 1.18
APP2 S/P 0.58 0.78 0.78 1.47 0.66 1.15 1.09 1.86 0.56 0.13
MH S/P 0.61 0.60 0.26 0.36 0.41 0.09 0.18 0.10 0.37 0.97
PMA S/P 1.50 1.00 0.56 1.60 0.93 0.71 0.57 1.01 0.74 0.53
실시예 3: 재현성 시험
래피드 테스트의 재현성을 확인하기 위해 양성 검체 2종과 음성 검체 1종으로 3개의 스트립으로 재현성 시험을 진행하였다. 골드 리더기의 수치상으로 모두 CV가 10% 이내로 재현성이 우수한 것으로 나타났다(도 6).
검체 No. 1스트립 2스트립 3스트립 평균 STDEV CV%
음성 110866 16 18 15 16 2 9
저양성 110752 242 239 251 244 6 3
중양성 110816 384 403 423 403 20 5
실시예 4: 반응성 비교
북미형 PRRSV 3종 및 유럽형 PRRSV 3종을 SPF 돼지에 공격접종한 후 주기적으로 채혈하여 상용화되어있는 ELISA(IDEXX PRRS X3 Ab)와 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체진단용 래피드 키트의 반응성을 비교하였다(도 7). 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항체진단용 래피드 키트에서 감염 초기에 유발되는 것으로 사료되는 항체를 ELISA에 비해 먼저 감지하는 결과를 확인하였으며, 상용화된 ELISA와 병행하여 사용할 경우 초기감염인지 판단 가능할 것으로 사료되어 감염확산 방지를 위한 초동 대처에 용이할 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> MEDIAN Diagnostics Inc. <120> Rapid Kit for Diagnosing the specific antibodies against Porcine Respiratory Reproductive Syndrome Virus <130> PN150433 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> North American genotype PRRSV(VR2332) Nucleocapsid protein <400> 1 Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 128 <212> PRT <213> European genotype PRRSV(Lelystad) Nucleocapsid protein <400> 2 Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro 1 5 10 15 Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys 35 40 45 Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile 50 55 60 Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr 100 105 110 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Ser 115 120 125

Claims (5)

  1. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome Virus, PRRSV) 특이항체 진단용 래피드 키트로서,
    상기 래피드 키트는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고,
    상기 컨쥬게이트 패드에는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원과 골드 나노입자가 결합된 항체 탐지용 제1 컨쥬게이트 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원과 골드 나노입자가 결합된 항체 탐지용 제2 컨쥬게이트가 포함되어 있고,
    상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 검사선 및 대조선이 순차적으로 형성되어 있고,
    상기 검사선에는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 항원이 고정되어 있고,
    상기 대조선에는 대조선 항체가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 지지체상에 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 대조선 항체는 항-토끼 항체(anti-rabbit IgG) 또는 항-마우스 항체(anti-mouse IgG)인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 다음 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체의 진단 방법:
    (a) 생물학적 시료를 검체희석액에 희석하여 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 키트의 샘플 패드에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 키트에서 발생하는 신호를 분석하여 상기 생물학적 시료에서 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체의 존재 여부를 측정하는 단계.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 돼지의 전혈, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
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