KR20160124905A - 면역 크로마토그래피 분석 방법 - Google Patents

면역 크로마토그래피 분석 방법 Download PDF

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Abstract

검출 감도를 저하 시키지 않고 전개 시간을 짧게 하며, 또한 전개 성분의 액 복귀를 저감 할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 방법을 제공하는 것을 과제로 하고, 유리 섬유로 이루어지는 흡수부를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용해서 검체에 함유되는 피검출 물질을 검출하는 방법이며, 비이온성 계면 활성제 존재하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시켜, 피검출 물질을 검출부에서 검출하는 방법을 제공한다.

Description

면역 크로마토그래피 분석 방법{IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY METHOD}
면역 크로마토그래피 분석 방법, 면역 크로마토그래피 분석 장치 및 면역 크로마토그래피 분석 키트에 관한 것이다.
최근 들어, 검체의 전처리를 행할 필요가 없는, 면역 크로마토그래피에 의한 면역검정은 항체가 갖는 특이적 반응성을 이용하여, 시료액 내의 항원을 검출하는 간편한 체외 진단 키트 또는 휴대용 진단 장치로서 중요성이 높아지고 있다. 특히, 바이러스나 세균 등의 병원체 검사 키트는 일반 병원이나 클리닉에서도 범용되고 있는 가까운 면역 크로마토그래피 장치이다.
면역 크로마토그래피 장치의 가장 간단한 구조로서는, 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체 및 흡수부가 서로 연결된 구조다.
이 안에서 흡수부에는, 종래 셀룰로오스 섬유, 또는 펄프 섬유 등으로 이루어지는 면, 부직물 또는 여과지 등이 사용되고 있다. 그러나 이들 소재만으로 구성되는 흡수재는 일단 흡수한 전개 성분을 유지하는 힘이 결여되고, 그 결과, 흡수재로부터의 전개 성분의 역류가 발생한다는 문제가 있었다.
종래, 이러한 흡수재로부터의 전개 성분의 역류를 방지하기 위해서, 고흡수성 섬유를 사용해서 흡수재를 구성하는 것이 시도되었다(특허문헌 1). 또한, 흡수성 중합체를 함유한 흡수재가 제안되었다(특허문헌 2).
일본 특허 공개 제2009-63482호 공보 일본 특허 공개 제2012-189346호 공보
그러나 특허문헌 1에 기재된 고흡수성 섬유를 함유하는 흡수재는 전개 성분의 흡수 속도가 느리고, 규정된 반응시간(10 내지 15분간) 내에 전개 성분이 충분히 흡수재에 흡수되지 않고, 크로마토그래프 매체 상에 잔존한 과잉의 액체 시료에 의해 검출부에 나타나는 양성 시그널이 번지거나, 유색의 표지 물질이 충분히 회수되지 않기 때문에 백그라운드 시그널이 상승한다는 문제가 있었다.
또한, 특허문헌 2에 기재된 흡수성 중합체를 함유한 흡수재는 상기 문제점은 해결하고 있지만, 제조 시에 흡수성 중합체가 흘러내려 떨어지기 쉽다고 하는 문제가 있었다.
또한, 전개 성분의 전개 시간을 짧게 하기 위해서 전개 속도를 상승시키면, 흡수부에서 전개 성분의 흡수 효율이 나쁜 것에 의해, 흡수부에서 전개 성분을 전부 흡수할 수 없고, 전개 성분의 액 복귀가 발생하고, 거짓 양성이 발생한다는 문제가 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 검출 감도를 저하시키지 않고, 전개 시간을 짧게 하고, 또한 전개 성분의 액 복귀를 저감할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 이하와 같다.
1. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 유리 섬유로 이루어지는 흡수부를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용해서 검체에 함유되는 피검출 물질을 검출하는 방법이며, 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 방법.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 표지 물질에 의해 피검출 물질을 인식시키는 공정
(3) 비이온성 계면 활성제 존재 하에 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
(4) 전개된 이동상 중의 피검출 물질을 검출부에서 검출하는 공정
2. 상기 시료 첨가부 및 상기 검체 희석액 중 적어도 한쪽에 비이온성 계면 활성제를 함유하는 전항 1에 기재된 방법.
3. 상기 시료 첨가부에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 1cm2당 0.05 내지 5mg인 전항 2에 기재된 방법.
4. 상기 검체 희석액에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 0.05 내지 10질량%인 전항 2에 기재된 방법.
5. 상기 비이온성 계면 활성제의 HLB값이 10 이상인 전항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
6. 상기 크로마토그래프 매체부가 음이온성 계면 활성제를 함유하는 전항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
7. 상기 크로마토그래프 매체부에서의 음이온성 계면 활성제의 함유량이 0.02 내지 4질량%인 전항 6에 기재된 방법.
8. 상기 크로마토그래프 매체부가 니트로셀룰로오스로 이루어지는 전항 1 내지 7 중 어느 한 항에 기재된 방법.
9. 상기 흡수부의 여수 시간이 20초 내지 110초이며, 또한 밀도가 150 내지 500mg/m3인 전항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 방법.
10. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 순차 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치이며, 해당 시료 첨가부는 비이온성 계면 활성제를 건조 유지하고, 해당 흡수부는 유리 섬유로 이루어지는 면역 크로마토그래피 분석 장치.
11. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 순차 포함하는 면역 크로마토그래피 장치와, 검체에 포함되는 피검출 물질을 희석하는 검체 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트이며, 해당 흡수부가 유리 섬유로 이루어지고, 해당 검체 희석액이 비이온성 계면 활성제를 함유하는 면역 크로마토그래피 분석 키트.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법은 비이온성 계면 활성제 존재 하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용함으로써 검출 감도를 저하 시키지 않고, 또한 전개 시간을 짧게 할 수 있다.
종래의 면역 크로마토그래피 분석 방법에서는, 전개 시간이 짧아짐에 따라, 흡수부에서 전개 성분을 전부 흡수할 수 없고, 전개 성분의 액 복귀가 발생해 버리지만, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법은 흡수부에 유리 섬유를 사용함으로써 전개 성분의 액 복귀를 감소하고, 거짓 양성을 회피할 수 있다.
도 1은 면역 크로마토그래피 분석 장치의 구조를 나타낸다.
이하에, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 설명한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법은 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 유리 섬유로 이루어지는 흡수부를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여, 비이온성 계면 활성제의 존재 하에서 검체에 함유되는 피검출 물질을 검출하는 방법이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 면역 크로마토그래피 분석 장치 및 그 사용 방법에 대해서 이하에 설명을 한다.
면역 크로마토그래피 분석 장치는 도 1에 도시한 바와 같이, 시료 첨가부(샘플 패드라고도 함)(1), 표지 물질 유지부(콘쥬게이트 패드라고도 함)(2), 크로마토그래프 매체부(3), 검출부(4), 흡수부(5)를 순차 포함하고 있고, 또한 배킹 시트(6)를 갖고 있다. 순차란, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에서 시료가 전개하는 각 부위의 순서를 나타낸다. 그들 각 부위의 구조, 사양 및 형태는 이하와 같다.
시료 첨가부(1)는 면역 크로마토그래피 분석 장치에서, 샘플을 적하하는 부위이다. 통상 면역 크로마토그래프에 사용되는 소재라면 어떤 것이라도 좋다. 통상, 시료 첨가부는 시료를 흡수 유지하는 유리 섬유 또는 셀룰로오스의 막이 사용된다.
시료 첨가부에는 비이온성 계면 활성제를 함유시켜 두는 것이 바람직하다. 이에 의해, 검체가 시료부의 첨가 부재에 흡착해 검출 감도가 저하되는 것을 방지한다. 이에 더하여, 시료의 표면 장력을 내림으로써, 전개 시간이 짧아진다.
시료 첨가부에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량은 0.05 내지 5mg인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2mg 내지 5mg이며, 더욱 바람직하게는 0.2mg 내지 2.5mg이다.
시료 첨가부에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 0.05mg 이상인 것에 의해, 시료의 표면 장력을 유의미하게 내릴 수 있고, 5mg 이하인 것에 의해, 비이온성 계면 활성제에 의한 시료에의 변성 작용을 억제할 수 있기 때문이다.
비이온성 계면 활성제로서는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(상품명 「Tween」 시리즈), 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸페닐 에테르(상품명 「Triton」 시리즈), 폴리옥시에틸렌 p-t-노닐페닐 에테르(상품명 「TritonN」 시리즈), 알킬 폴리글루코시드, 지방산 디에탄올 아미드, 알킬모노글리세릴 에테르, NP-40(시그마 알드리치제), IGAPEL CA-520(시그마 알드리치제) 등을 들 수 있다.
비이온성 계면 활성제의 HLB값은 10 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 11.0 이상이며, 더욱 바람직하게는 12.4 이상이다. 상한값에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 18 이하이다.
비이온성 계면 활성제의 HLB값이 10 이상인 것에 의해, 소수성 상호 작용에 의한 시료에의 변성 효과를 억제할 수 있다. 비이온성 계면 활성제의 HLB값이 18 이하인 것에 의해, 소수성 상호 작용에 의한 시료에의 변성 효과를 억제할 수 있다.
비이온성 계면 활성제의 CMC값은 5㎛ol 내지 60mmol인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10㎛ol 내지 60mmol이며, 더욱 바람직하게는 12㎛ol 내지 60mmol이다.
비이온성 계면 활성제의 CMC값이 5㎛ol 이상인 것에 의해 첨가 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 60mmol 이하인 것에 의해 사용량을 적게 할 수 있어, 경제적이다.
시료 첨가부에 함유시키는 경우의 비이온성 계면 활성제는 0.05 내지 10질량% 농도의 수용액이라고 하고, 이 용액에 시료 첨가부에 사용하는 부재를 침지하고, 그 후 진공 건조 또는 자연 건조시켜서, 비이온성 계면 활성제를 함유한 시료 첨가부로 한다.
표지 물질 유지부(2)는 미리 피검출 물질과 결합하는 항체에 결합한, 후술하는 표지 물질(마커 물질)이 함유되어 있다. 표지 물질 유지부 내를 피검출 물질이 이동할 때에 항체와 결합하고, 표지화된다. 표지 물질 유지부는 예를 들어, 유리 섬유 부직포 또는 셀룰로오스 막 등으로 이루어져 있다.
크로마토그래프 매체부(3)는 크로마토그래프의 전개 부위다. 크로마토그래프 매체부는 모관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질로 이루어지는 불활성 막이다. 크로마토그래프에서 사용되는 검출 시약, 고정화 시약 또는 피검출 물질 등과 반응성을 갖지 않는 것으로서, 예를 들어, 니트로셀룰로오스제 멤브레인(이하 「니트로셀룰로오스 멤브레인」이라고 할 경우가 있음) 등을 들 수 있다.
니트로셀룰로오스제 멤브레인으로서는, 니트로셀룰로오스가 주체로 함유되어 있으면 되고, 순품 또는 니트로셀룰로오스 혼합품 등 니트로셀룰로오스를 주재로 하는 멤브레인을 사용하면 좋지만, 기타 재료라도 전혀 문제는 없다. 기타 재료로서는, 예를 들어, 셀룰로오스류 멤브레인, 나일론 멤브레인 및 다공질 플라스틱 천류(폴리에틸렌, 폴리프로필렌) 등을 들 수 있다.
상기 니트로셀룰로오스 멤브레인은 또한 모세관 현상을 촉진시키는 물질을 함유시킬 수도 있다. 해당 물질로서는 막 면의 표면 장력을 저하시키고, 친수성을 초래하는 물질이 바람직하다. 예를 들어, 당류, 아미노산의 유도체, 지방산 에스테르, 각종 합성 계면 활성제 또는 알코올 등의 양친매성 작용을 갖는 물질이며, 면역 크로마토그래프 상에서의 피검출 물질의 이동에 영향이 없고, 마커 물질(예를 들어, 금 콜로이드 등)의 발색에 영향을 미치지 않는 물질이 바람직하다.
상기 물질로서는 예를 들어, 음이온성 계면 활성제, 양쪽 이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제, 글리세린을 들 수 있고, 그 중에서 음이온성 계면 활성제가 바람직하다. 음이온성 계면 활성제로서는 예를 들어, 도데실벤젠술폰산 나트륨(SDBS), 도데실술폰산 나트륨(SDS), C12 내지 C18의 알킬술폰산 나트륨(알칸술폰산 나트륨), 디알킬술포숙신산 나트륨 및 콜산 나트륨 등을 들 수 있다.
특히 바람직하게는, 도데실술폰산 나트륨(SDS) 또는 C12 내지 C18의 알킬술폰산 나트륨(알칸술폰산 나트륨)이다.
크로마토그래프 매체부에서의 음이온성 계면 활성제의 함유량은 0.02 내지 4질량%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.02 내지 1질량%이며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1질량%이다.
크로마토그래프 매체부에서의 음이온성 계면 활성제의 함유량이 0.02질량% 이상인 것으로, 충분한 감도와 검출시간의 단축 효과가 얻어지고, 보존 안정성의 저하를 피할 수 있다. 크로마토그래프 매체부에서의 음이온성 계면 활성제의 함유량이 4질량% 이하인 것으로, 음성 검체에서의 비특이 반응이 발생하는 것을 방지할 수 있다.
크로마토그래프 매체부 중에 함유시키는 음이온성 계면 활성제는 0.1 내지 10질량% 농도의 수용액이라 하고, 이 용액에 니트로셀룰로오스 멤브레인을 침지하고, 그 후 진공 건조 또는 자연 건조시켜서, 음이온성 계면 활성제를 함유한 크로마토그래피 매체로 한다. 상기 방법 외에, 제막된 멤브레인에 대하여 첨가제를 직접 첨가해 건조시키는 등, 제막된 멤브레인에 대하여 외부 첨가에 의해 함유시키면 되고, 이들 방법에 한정되지 않는다.
이와 같이 하여 제조한 니트로셀룰로오스 멤브레인은 다공성이며, 모세관 현상을 나타낸다. 이 모세관 현상의 지표는 흡수 속도(흡수시간: capillary flow time)를 측정함으로써 확인할 수 있다. 흡수 속도는 검출 감도와 검사시간에 영향을 미친다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법에서 사용하는 크로마토그래프 매체로서의 니트로셀룰로오스 멤브레인의 형태 및 크기는 특별히 제한되는 것은 아니고, 실제 조작의 관점 및 반응 결과 관찰의 관점에서 적절하면 된다.
또한, 조작을 보다 간편하게 하기 위해서는, 반응 부위가 표면에 형성되어 있는 크로마토그래프 매체의 이면에, 플라스틱 등으로 되는 지지체를 설치하는 것이 바람직하다. 이 지지체의 성상은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 목시 판정에 의해 측정 결과의 관찰을 행하는 경우에는, 지지체는 표지 물질에 의해 초래되는 색채와 유사하지 않은 색채를 갖는 것이 바람직하고, 통상 무색 또는 백색인 것이 바람직하다.
검출부(4)는 상기 크로마토그래프 매체부(3) 상에 형성되고, 즉, 피검출 물질과 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항체가 고정화 시약으로서 임의의 위치에 고정화된 반응 부위가 형성된다.
고정화 시약을 크로마토그래프 매체에 고정화하는 방법으로서는 고정화 시약을 크로마토그래프 매체에 물리적 또는 화학적 수단에 의해 직접 고정화하는 방법과, 고정화 시약을 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합하고,이 미립자를 크로마토그래프 매체에 포착해서 고정화하는 간접 고정화 방법이 있다.
직접적으로 고정화하는 방법으로서는 물리 흡착을 이용해도 되고, 공유 결합에 의해서도 된다. 니트로셀룰로오스 멤브레인일 경우, 물리 흡착을 행할 수 있다. 공유 결합에서는 크로마토그래프 매체의 활성화에는 일반적으로 브롬화시안, 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 등이 사용되지만, 어느 방법이라도 사용할 수 있다.
간접적으로 고정화하는 방법으로서는 불용성 미립자에 고정화 시약을 결합한 후에, 크로마토그래프 매체에 고정화하는 방법이 있다. 불용성 미립자의 입경은 크로마토그래프 매체에 포착되지만 이동할 수 없는 사이즈의 것을 선택할 수 있고, 바람직하게는 평균 입경 5㎛ 정도 이하의 미립자이다.
이들 입자로서는 항원 항체 반응에 사용되는 것이 여러 가지 알려져 있고, 본 발명에서도 이들 공지된 입자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌-부타디엔 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 폴리글리시딜 메타크릴레이트 또는 아크롤레인-에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 공중합체 등의 유화 중합법에 의해 얻어지는 유기 고분자 라텍스 입자 등의 유기 고분자 물질의 미립자, 젤라틴, 벤토나이트, 아가로오스 또는 가교 덱스트란 등의 미립자, 실리카, 실리카-알루미나 또는 알루미나 등의 무기 산화물 또는 무기 산화물에 실란 커플링 처리 등으로 관능기를 도입한 무기 입자 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 감도 조정의 용이함 등에서 직접 고정화 쪽이 바람직하다. 또한, 크로마토그래프 매체에의 고정화 시약의 고정화에는, 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마이크로시린지, 조절 펌프 딸린 펜 또는 잉크 분사 인쇄 등, 여러 가지 기술이 사용 가능하다. 반응 부위의 형태로서는 특별히 한정되지 않지만, 원형의 스폿, 크로마토그래프 매체의 전개 방향에 수직으로 길어지는 라인, 숫자, 문자 또는 +, - 등의 기호 등으로서 고정화할 수도 있다.
고정화 시약을 고정화한 후, 비특이적인 흡착에 의해 분석의 정밀도가 저하되는 것을 방지하기 위해서, 필요에 따라, 크로마토그래프 매체에 공지된 방법으로 블로킹 처리를 행할 수 있다.
일반적으로 블로킹 처리는 소 혈청 알부민, 스킴 밀크(skim milk), 카제인 또는 젤라틴 등의 단백질이 적합하게 사용된다. 이러한 블로킹 처리 후에, 필요에 따라, 예를 들어, Tween20, TritonX-100 또는 SDS 등의 계면 활성제를 1개 또는 2개 이상 조합해서 세정해도 된다.
흡수부(5)는 크로마토그래프 매체의 말단에, 전개액을 흡수시키기 위해서 설치된다. 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 흡수부는 유리 섬유로 이루어진다. 흡수부가 유리 섬유로 이루어짐으로써, 전개 성분의 액 복귀를 대폭으로 저감할 수 있다.
비이온성 계면 활성제 존재하에서 면역 크로마토그래피 분석을 행함으로써 전개 시간이 짧아지지만, 흡수부에서 전개 성분의 흡수 효율이 나쁘면, 흡수부에서 전개 성분을 전부 흡수할 수 없고, 전개 성분의 액 복귀가 발생해버린다.
여기서, 흡수부에 셀룰로오스 섬유 등의 범용되는 부재를 흡수제로서 사용하면, 흡수 속도가 느리고 흡수부에서의 전개 성분이나 비이온성 계면 활성제 등의 확산 속도도 늦기 때문에, 비이온성 계면 활성제에 의한 흡착 억제 효과가 현재화하기 때문에 전개 성분의 역류가 발생해버린다.
그러나 유리 섬유로 이루어지는 흡수부는 흡수 속도가 빠르고, 전개 성분이 흡수부에서 빠르게 확산해 전개 성분이나 비이온성 계면 활성제 등은 희박하게 되어 역류가 억제된다. 즉, 흡수부에 유리 섬유를 사용함으로써, 전개 성분의 액 복귀를 대폭으로 저감할 수 있고, 전개 시간의 단축 및 거짓 양성의 저감이 가능하게 된다.
상술한 시료 첨가부에서는, 체적당 비이온성 계면 활성제의 밀도가 높기 때문에 부재에의 흡착을 억제하는 작용을 발휘하지만, 흡수부에서는 첨가부보다 체적이 크기 때문에 비이온성 계면 활성제의 흡수부 체적당 밀도가 낮아져 흡착 억제가 완화되기 때문에 흡수 부재로부터의 전개 성분의 역류는 일어나기 어려워진다.
흡수부는 여수 시간이 20초 내지 110초인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20 내지 105초이며, 더욱 바람직하게는 20 내지 100초이다.
흡수부의 여수 시간이 20초 이상인 것에 의해, 반응에 필요한 시간을 최저한 확보할 수 있고, 검출 감도가 저하되는 일이 없다. 흡수부의 여수 시간이 110초 이하인 것에 의해, 판정시간을 짧게 할 수 있다. 흡수부의 여수 시간은 JIS P 3801:1995에 따라 측정할 수 있다.
또한, 사용하는 흡수부의 밀도는 150 내지 500mg/m3인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 200 내지 500mg/m3이며, 더욱 바람직하게는 200 내지 350mg/m3이다. 밀도가 200 내지 350mg/m3인 유리 섬유를 사용함으로써, 전개 성분의 액 복귀를 대폭으로 경감할 수 있다.
배킹 시트(6)는 기재이다. 편면에 점착제를 도포하거나, 점착 테이프를 부착함으로써, 편면이 점착성을 갖고, 해당 점착면 위에 시료 첨가부(1), 표지 물질 유지부(2), 크로마토그래프 매체부(3), 검출부(4) 및 흡수부(5)의 일부 또는 전부가 밀착해서 설치되어 있다. 배킹 시트(6)는 점착제에 의해 시료액에 대하여 불투과성, 비투습성이 되는 것이라면, 기재로서는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법은 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하고, 상기 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용해서 검체에 함유되는 피검출 물질을 검출한다.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 표지 물질에 의해 피검출 물질을 인식시키는 공정
(3) 비이온성 계면 활성제 존재하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
(4) 전개된 이동상 중의 피검출 물질을 검출부에서 검출하는 공정
각 공정에 대해서 이하에 설명한다.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
공정(1)에서는, 첫째로, 검체를, 측정 정밀도를 저하 시키지 않고, 면역 크로마토그래프 매체 중을 원활하게 이동하는 정도의 농도로 검체 희석액으로 조정 또는 희석해서 검체 함유액으로 한다. 둘째로, 해당 검체 함유액을 시료 첨가부(1) 상에 소정량(통상, 0.1 내지 2ml) 적하한다. 검체 함유액이 적하되면, 검체 함유액은 시료 첨가부(1) 중에서 이동을 개시한다.
검체 희석액은 비이온성 계면 활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 검출 감도가 저하되지 않고, 또한 전개 시간이 짧아진다. 비이온성 계면 활성제는 상기와 마찬가지 것을 사용할 수 있다. 검체 희석액에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량은 0.05 내지 10질량%인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05 내지 5질량%이며, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 3.5질량%이다.
검체 희석액에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 0.05질량% 이상인 것에 의해, 검체가 시료 적하부의 부재에 흡착하고, 검출 감도가 저하되는 것을 방지하고, 또한 검체 희석액의 표면 장력을 저하시킴으로써 전개 시간을 짧게 할 수 있다.
검체 희석액에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 10질량% 이하인 것에 의해, 비이온성 계면 활성제에 의한 시료의 변성 작용을 억제할 수 있기 때문이다.
피검출 물질을 함유하는 검체로서는 예를 들어, 생체시료, 즉, 전혈, 혈청, 혈장, 오줌, 타액, 객담, 비강 또는 인두 분비액, 골수액, 양수, 유두분비액, 눈물, 땀, 피부로부터의 침출액, 조직이나 세포 및 변으로부터의 추출액 등 외에, 우유, 알, 소맥, 콩, 쇠고기, 돼지고기, 닭고기 등이나 그들을 포함하는 식품 등의 추출액 등을 들 수 있다.
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 표지 물질에 의해 피검출 물질을 인식시키는 공정
공정 (2)는 공정 (1)에 있어서 시료 첨가부에 첨가된 검체 함유액을, 표지 물질 유지부(2)에 이동시키고, 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 표지 물질에 의해 검체 중의 피검출 물질을 인식시키는 공정이다.
표지 물질은 피검출 물질과 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항체를 표지화한다. 면역 크로마토그래피법에서의 검출 시약의 표지에는 일반적으로 효소 등도 사용되지만, 피검출 물질의 존재를 목시로 판정하는데도 적합한 점에서, 표지 물질로서는 불용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다. 검출 시약을 불용성 담체에 감작함으로써 표지화한 검출 시약을 제조할 수 있다.
표지 물질로서의 불용성 담체에는 금, 은 또는 백금과 같은 콜로이드상 금속 입자, 산화철과 같은 콜로이드상 금속 산화물 입자, 황 등의 콜로이드상 비금속 입자 및 합성 고분자로 이루어지는 라텍스 입자 또는 기타를 사용할 수 있다. 특히 금 콜로이드가 검출이 간편해서 바람직하다.
불용성 담체는 피검출 물질의 존재를 시각적으로 판정하기에 적합한 표지 물질이며, 목시에 의한 판정을 용이하게 하기 위해서는 유색인 것이 바람직하다. 콜로이드상 금속 입자 및 콜로이드상 금속 산화물 입자는 그 자체가 입경에 따른 특정한 자연색을 나타내는 것이며, 그 색채를 표지로서 이용할 수 있다.
표지 물질로서 사용할 수 있는 콜로이드상 금속 입자 및 콜로이드상 금속 산화물 입자에는, 예를 들어, 콜로이드상 금 입자, 콜로이드상 은 입자, 콜로이드상백금 입자, 콜로이드상 산화철 입자, 콜로이드상 수산화알루미늄 입자 등을 들 수 있다.
특히, 콜로이드상 금 입자와 콜로이드상 은 입자가 적당한 입경에서, 콜로이드상 금 입자는 적색, 콜로이드상 은 입자는 황색을 나타내는 점에서 바람직하다.
콜로이드상 금속 입자로서, 예를 들어, 콜로이드상 금 입자를 사용하는 경우에는 시판하는 것을 사용해도 좋다. 또는, 통상의 방법, 예를 들어, 염화금산을 시트르산 나트륨으로 환원하는 방법에 의해 콜로이드상 금 입자를 제조할 수 있다.
검출 시약을 콜로이드상 금속 입자에 감작하는 방법으로서는, 물리 흡착이나 화학 결합 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 콜로이드상 금 입자에 항체를 감작한 검출 시약은 금 입자가 콜로이드상으로 분산한 용액에 항체를 첨가해서 물리 흡착시킨 후, 소 혈청 알부민 용액을 첨가해서 항체가 미결합인 입자 표면을 블로킹함으로써 조제한다.
실제 면역 크로마토그래피 분석의 실시에서, 불용성 담체에 의해 표지화한 검출 시약은 이동상을 구성하는 전개액에 분산해서 적용할 수도 있고, 고정상을 구성하는 크로마토그래프 매체에서의 이동상의 전개 이동 경로 상, 즉 크로마토그래프 매체의 이동상이 적용되는 단부와 반응 부위 사이의 영역에 존재시켜서 적용할 수도 있다.
크로마토그래프 매체 상에 존재시킬 경우, 검출 시약이 전개액에 빠르게 용해해서 모관 작용에 의해 자유롭게 이동할 수 있도록, 검출 시약을 지지시키는 것이 바람직하다. 지지시키는 부위에는 검출 시약이 감작된 불용성 담체의 재용해성을 양호하게 하기 위해서, 사카로오스, 말토오스 또는 락토오스 등의 당류 또는 만니톨 등의 당 알코올을 첨가해서 도포하거나, 이들 물질을 미리 코팅하거나 해 둘 수도 있다.
검출 시약을 도포·건조 등에 의해 크로마토그래프 매체 상에 존재시킬 때는, 고정화 시약이 고정화된 크로마토그래프 매체에 직접 도포·건조 등 할 수도 있고, 별도의 다공성 물질, 예를 들어, 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유 여과지 또는 나일론 부직포에 도포·건조 등을 해서 검출 시약 유지 부재를 형성한 후, 고정화 시약이 고정화된 크로마토그래프 매체와 모관으로 연결되도록 배치해도 좋다.
본 발명의 방법에 의해 검출되는 피검출 물질로서는, 거기에 특이적으로 결합하는 물질이 존재하는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 핵산, 당(특히 당 단백질의 당 부분, 당 지질의 당 부분 등), 복합 당질 등을 들 수 있다.
본 발명에서 「특이적으로 결합하는」이란, 생체 분자가 갖는 친화력에 기초해서 결합하는 것을 의미한다. 이러한 친화력에 기초하는 결합으로서는 예를 들어, 항원과 항체와의 결합, 당과 렉틴과의 결합, 호르몬과 수용체와의 결합, 효소와 저해제와의 결합, 상보적 핵산끼리 및 핵산과 핵산 결합 단백질과의 결합 등을 들 수 있다.
따라서, 피검출 물질이 항원성을 갖는 경우, 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 물질로서는, 예를 들어, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 또한, 피검출 물질이 당일 경우, 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 물질로서는 예를 들어, 렉틴 단백질을 들 수 있다.
구체적인 피검출 물질로서는, 예를 들어, 암 태아성 항원(CEA), HER2 단백, 전립선 특이 항원(PSA), CA19-9, α-페토프로테인(AFP), 면역제어 산성 단백(IPA), CA15-3, CA125, 에스트로겐 리셉터, 프로게스테론 리셉터, 변잠혈, 트로포닌 I, 트로포닌 T, CK-MB, CRP, 인간 융모성 고나드트로핀(hCG), 황체형성호르몬(LH), 난포자극호르몬(FSH), 매독 항체, 인플루엔자 바이러스, 인간 헤모글로빈, 클라미디아 항원, A군 β용련균 항원, HBs 항체, HBs 항원, 로타 바이러스, 아데노 바이러스, 알부민 또는 당화 알부민 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
(3) 비이온성 계면 활성제 존재하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
공정 (3)은 공정 (2)에 있어서 피검출 물질이 표지 물질에 인식된 후, 검체 및 표지 물질을, 비이온성 계면 활성제 존재 하에서 크로마토그래프 매체부(3) 위를 이동상으로서 통과시키는 공정이다.
비이온성 계면 활성제는 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 과정에서 존재시켜 둔다. 상기한 바와 같이 시료 첨가부에 함유시켜 두거나, 또는 검체 희석액에 함유시키는 것이 바람직하다.
비이온성 계면 활성제를 함유시켜 둠으로써 검체가 시료 적하부의 부재에 흡착하고, 검출 감도가 저하되는 것을 방지할 수 있고, 시료 용액의 표면 장력을 낮춤으로써 판정시간을 짧게 할 수 있기 때문이다. 보다 바람직하게는 검체 희석액에 비이온성 계면 활성제를 함유시킨다.
검체 희석액에 비이온성 계면 활성제를 함유시킴으로써, 시료 중에 성분을 미리 균일화할 수 있고, 부재에 함유시키는 것보다도 부재에의 흡착을 더 억제하는 효과를 기대할 수 있다. 그 외에, 시료 적하부에서의 비이온성 계면 활성제의 용출시간이 없어서, 보다 판정시간을 짧게 할 수 있기 때문이다. 비이온성 계면 활성제는 시료 첨가부와 검체 희석액의 양쪽에 함유시켜 두어도 좋다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법에서는, 필요하면 전개액을 사용해도 좋다. 전개액은 면역 크로마토그래피법에서 이동상을 구성하는 액체이며, 고정상인 크로마토그래프 매체 상을, 피검출 물질을 함유하는 시료 및 표지화한 검출 시약과 함께 이동한다. 이러한 전개액이라면, 어떤 것이어도 좋다.
(4) 전개된 이동상 중의 피검출 물질을 검출부에서 검출하는 공정
공정(4)는 크로마토그래프 매체부(3) 위를 이동상으로서 통과한 검체 중의 피검출 물질이 항원·항체의 특이적 결합 반응에 의해, 검출부(4)에 유지, 즉, 담지 고정되어 있는 항체와 표지 시약에 의해 샌드위치 형상으로 끼워지도록 특이적으로 반응 결합하여, 검출부(4)가 착색하는 공정이다.
피검출 물질이 존재하지 않을 경우에는, 시료의 수분에 용해한 표지 시약은 크로마토그래프 매체부(3) 상의 검출부(4)를 통과해도 특이적 결합 반응이 일어나지 않으므로, 검출부(4)가 착색하지 않는다.
마지막으로, 검체 함유액의 수분은 흡수부(5)로 이동한다.
이와 같이, 검체에 함유되는 피검출 물질, 예를 들어, 검체 함유액 내의 인플루엔자 바이러스의 유무를 검사함으로써, 인플루엔자 바이러스의 감염 유무를 정확하게 판정할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 재차 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것이 아니다.
[실시예 1 내지 4]
(1) 크로마토그래프 매체 상으로의 검출부의 제작
멤브레인으로서 니트로셀룰로오스로 이루어지는 시트(밀리포어사제, 상품명: HF120, 300mm×25mm)를 사용하였다. 전처리로서 멤브레인을 0.25질량%의 표 1에 기재된 음이온성 계면 활성제의 수용액에 침지한 후, 30℃에서 24시간 건조시켰다.
이어서, 5질량%의 이소프로필알코올을 함유하는 인산 완충액(pH7.4)으로 1.0mg/ml의 농도가 되도록 마우스 유래 항 인플루엔자 A 모노클로날 항체(제1 항체)를 희석한 용액 150μL를, 음이온성 계면 활성제를 함유시켜 건조된 멤브레인 상의 검출 부위(검출 라인)에 1mm의 폭으로 도포하고, 금 나노 입자 표지 시약의 전개 유무나 전개 속도를 확인하기 위해서 검출 부위의 하류에, 금 나노 입자 표지 물질이나 피검출 물질인 동물 고기 단백질 등과 널리 친화성을 갖는 염소 유래 항혈청을 인산 완충액(pH7.4)으로 희석한 액을 컨트롤 부위(컨트롤 라인)에 도포하였다. 그 후, 50℃에서 30분간 건조시키고, 실온에서 밤새 건조시켜, 크로마토그래프 매체를 제작하였다.
(2) 표지 물질 용액의 제작
금 콜로이드 현탁액(다나까 긴조꾸 고교사제: LC40nm) 0.5ml에, 인산 완충액(pH7.4)으로 0.05mg/ml의 농도가 되도록 희석한 마우스 유래 항 인플루엔자 A 모노클로날 항체(제2 항체)를 0.1ml 가하여, 실온에서 10분간 정치하였다.
계속해서, 1질량%의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1ml 첨가하고, 실온에서 10분간 더 정치하였다. 그 후, 충분히 교반한 후, 8000×g로 15분간 원심 분리를 행하고, 상청을 제거한 후, 1질량%의 BSA를 함유하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1ml 첨가하였다. 이상의 순서로 표지 물질 용액을 제작하였다.
(3) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유로 이루어지는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 2질량%의 표 1에 나타내는 비이온성 계면 활성제 수용액에 침지한 후, 30℃에서 24시간 건조해 시료 첨가부를 제작하였다. 제작된 시료 첨가부 중에 함유되는, 비이온성 계면 활성제의 종류, 그 HLB값 및 함유량을 표 1에 나타낸다. 표 1중, Tween20이란 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트이며, Tween80이란 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노올리에이트이며, TritonX-100이란 폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐 에테르이며, 모두 와코 쥰야꾸 고교 가부시끼가이샤제이다. 또한, NP-40이란, (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올이며, 시그마 알드리치사제이다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
상기 제작한 표지 물질 용액 300μL에 300μL의 10질량% 트레할로오스 수용액과 1.8mL의 증류수를 첨가한 것을 15mm×300mm의 유리 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지게 첨가한 후, 진공 건조기에서 건조시켜, 표지 물질 유지 부재를 제작하였다.
이어서, 배킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기 제작한 크로마토그래프 매체, 표지 물질 유지 부재, 시료를 첨가하는 부분에 사용하는 시료 첨가부, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수부로서 유리 섬유제의 부직포(밀도 0.25g/m3)를 접합하였다. 그리고 재단기로 폭이 5mm로 되도록 재단하고, 면역 크로마토그래피 분석 장치로 하였다. 흡수부에 사용한 부직물의 종류 및 흡수부의 여수 시간을 표 1에 나타낸다.
여수 시간은 JIS P 3801:1995에 따라 측정하였다.
(5) 검체 희석액
2질량% 카제인, 25mM KCl, 0.095% 아지드화나트륨을 함유하는 50mM BICINE 완충액(pH8.5)을 조제하여, 검체 희석액으로 하였다.
(6) 측정
상기 제작한 면역 크로마토그래피용 시험편을 사용하여, 이하의 방법으로 시료 중의 인플루엔자 A 바이러스의 존재 유무를 측정하였다. 즉, 흡인 트랩의 한쪽 관을 흡인 펌프에, 다른 한쪽 관을 인플루엔자에 감염되지 않은 사람의 비강 안쪽까지 삽입하고, 흡인 펌프를 음압으로 해서 콧물을 채취하였다. 채취한 콧물을 상기 검체 희석액으로 20배로 희석하고, 이것을 음성 검체 시료로 하였다. 또한, 음성 검체 시료에, 단백 농도가 50ng/mL가 되게 시판하고 있는 불활성화 인플루엔자 A 바이러스를 첨가한 것을 양성 검체 시료로 하였다.
음성 검체 시료, 양성 검체 시료 모두 150μL를 면역 크로마토그래피용 시험편의 시료 첨가부 위에 실어서 전개시켜, 10분 후에 목시 판정을 하였다. 테스트 라인의 빨간 선을 확인할 수 있는 것을 「+」, 빨간 선은 확인할 수 있지만, 매우 색이 엷은 것을 「±」, 빨간 선을 확인할 수 없는 것을 「-」로 하였다.
또한, 검사 개시부터 10분의 시점에서의 백그라운드 착색의 유무, 검사 개시부터 60분의 시점에서의 전개 성분의 역류 및 거짓 양성의 유무(음성 검체만)를 관찰하였다. 시험 결과를 표 1에 나타낸다.
백그라운드의 착색은 전개되는 표지 물질(금 나노 입자)에 유래하고, 적색의 금 나노 입자가 흡수 패드에 완전히 흡수되면, 백그라운드의 착색이 빠져, 크로마토그래프 매체 본래의 백색이 관찰되게 된다. 표 1에서는, 백그라운드가 크로마토그래프 매체 본래의 백색과 동등한 색이었던 것을 ○(양호), 약간 붉은빛이 있었던 것을 △(약간 불량), 붉은빛을 띠고 있었던 것을 ×(불량)로 나타낸다.
크로마토그래프 매체는 건조 상태와 습윤 상태에서는 색조가 다르게 보이기 때문에, 전개 성분의 역류는 크로마토그래프 매체의 색조를 목시로 관찰함으로써 판정하였다. 전개 성분의 역류 평가는 60분 후의 백그라운드 착색이 10분 후보다도 악화되어 있는(붉은빛이 증가하고 있음) 것을 있음으로 평가하고, 그 이외를 없음으로 평가하였다.
거짓 양성의 유무는 검사 개시부터 60분의 시점에서, 크로마토그래프 매체의 검출부에 표지 물질(금 나노 입자)에서 유래되는 빨간 라인이 생기는 지의 여부를 관찰함으로써 판정하였다. 사용한 시료는 PCR법에 의한 검사에서 음성으로 판정된 시료이며, 면역 크로마토그래피법에 의한 검사 키트를 사용한 시험에서도, 검사 개시부터 15분의 시점에서는, 검출부에 양성을 나타내는 빨간 라인은 관찰되지 않았다. 그러나 전개 성분의 역류가 있을 경우에는, 검사 개시부터 60분의 시점에서, 검출부에 빨간 라인이 생기는 것이 있고, 이 경우에 거짓 양성 있음으로 판정하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 5]
(1) 크로마토그래프 매체 상에의 검출부 제작
검출부에 대해서는, 실시예 1 내지 4와 마찬가지로 제작하였다.
(2) 표지 물질 용액의 제작
표지 물질 용액에 대해서는, 실시예 1 내지 4와 마찬가지로 제작하였다.
(3) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부에 대해서는, 실시예 1 내지 4와 마찬가지로 제작하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
면역 크로마토그래피 분석 장치에 대해서는, 실시예 1 내지 4와 마찬가지로 제작하였다.
(5) 검체 희석액
2질량% 카제인, 25mM KCl, 0.095% 아지드화나트륨을 함유하는 50mM BICINE 완충액(pH8.5)을 제조하고, 2질량% Tween80을 기재 함유율이 되도록 혼합해 검체 희석액을 제작하였다.
(6) 측정
측정에 대해서는, 실시예 1 내지 4와 마찬가지로 실시하고, 평가하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 6 내지 8]
(1) 크로마토그래프 매체 상에의 검출부 제작
검출부에 대해서는, 실시예 1 내지 5와 마찬가지로 제작하였다.
(2) 표지 물질 용액의 제작
표지 물질 용액에 대해서는, 실시예 1 내지 5와 마찬가지로 제작하였다.
(3) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유로 이루어지는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 사용하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
면역 크로마토그래피 분석 장치에 대해서는, 실시예 1 내지 5와 마찬가지로 제작하였다.
(5) 검체 희석액
2질량% 카제인, 25mM KCl, 0.095% 아지드화나트륨을 함유하는 50mM BICINE 완충액(pH8.5)을 조제하고, 표 1에 기재된 비이온성 계면 활성제를 각각 기재 함유율이 되도록 혼합해 검체 희석액을 제작하였다. 표 1중, IGAPEL CA-520이란, 폴리옥시에틸렌(5)이소옥틸페닐 에테르이며, 시그마 알드리치사제이다.
(6) 측정
측정에 대해서는, 실시예 1 내지 5와 마찬가지로 실시하고, 평가하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 1, 2]
(1) 크로마토그래프 매체 상에의 검출부 제작
검출부에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 제작하였다.
(2) 표지 물질 용액의 제작 표지 물질 용액에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 제작하였다.
(3) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유로 이루어지는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 사용하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
상기 제작한 표지 물질 용액 300μL에 300μL의 10질량% 트레할로오스 수용액과 1.8mL의 증류수를 첨가한 것을 15mm×300mm의 유리 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지게 첨가한 후, 진공 건조기에서 건조시켜, 표지 물질 유지 부재를 제작하였다.
이어서, 배킹 시트로 이루어지는 기재에, 상기 제작한 크로마토그래프 매체, 표지 물질 유지 부재, 시료를 첨가하는 부분에 사용하는 시료 첨가부, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수부로서 부직포를 접합하였다. 그리고 재단기로 폭이 5m)m로 되도록 재단하고, 면역 크로마토그래피 분석 장치로 하였다. 흡수부에 사용한 부직물의 종류 및 흡수부의 여수 시간을 표 1에 나타낸다.
여수 시간은 JIS P 3801:1995에 따라 측정하였다.
(5) 검체 희석액
2질량% 카제인, 25mM KCl, 0.095% 아지드화나트륨을 함유하는 50mM BICINE 완충액(pH8.5)을 제조하고, 표 1에 기재된 비이온성 계면 활성제를 각각 기재 함유율이 되도록 혼합해 검체 희석액을 제작하였다.
(6) 측정
측정에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 실시하고, 평가하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 3]
(1) 크로마토그래프 매체 상에의 검출부 제작
검출부에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 제작하였다.
(2) 표지 물질 용액의 제작
표지 물질 용액에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 제작하였다.
(3) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유로 이루어지는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 사용하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
면역 크로마토그래피 분석 장치에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 제작하였다.
(5) 검체 희석액
2질량% 카제인, 25mM KCl, 0.095% 아지드화나트륨을 함유하는 50mM BICINE 완충액(pH8.5)을 조제하고, 검체 희석액을 제작하였다.
(6) 측정
측정에 대해서는, 실시예와 마찬가지로 실시하고, 평가하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 8에서, 흡수부에 유리 섬유를 사용하고, 비이온성 계면 활성제 존재하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시킨 결과, 시료의 액 복귀가 확인되지 않고, 그 결과, 거짓 양성의 반응은 보이지 않았다.
한편, 비교예 1에서는, 흡수부에 코튼 린터를 사용하고 있고, 비교예 2에서는, 흡수부에 셀룰로오스 섬유를 사용하고 있고, 그 결과, 시료의 액 복귀가 확인되어, 거짓 양성의 반응이 보였다.
또한, 비교예 3에서는, 흡수부에 유리 섬유를 사용하고 있지만, 비이온성 계면 활성제의 비존재 하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시킨 결과, 시료의 액 복귀가 확인되지 않았지만, 거짓 양성의 반응이 보였다.
이것은 비이온성 계면 활성제가 존재하지 않기 때문에 전개 속도가 감소하고, 전개 성분의 박리 속도도 감소하기 때문에, 전개 성분의 역류는 발생하지 않으나, 크로마토그래프 매체 상에 표지 시약이 머물어버리기 때문에, 10분 후와 60분 후의 백그라운드의 착색에 변화가 보이지 않고, 거짓 양성의 반응이 보였다고 생각된다.
이상의 결과로부터, 비이온성 계면 활성제 존재 하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키면, 시료의 전개 속도를 상승시킬 수 있고, 또한 시료의 전개 속도가 상승했다고 해도, 흡수부에 유리 섬유를 사용함으로써, 전개 성분의 액 복귀를 저감하고, 거짓 양성을 회피할 수 있음을 알았다.
본 발명을 특정한 형태를 사용해서 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 여러 가지 변경 및 변형이 가능한 것은 당업자에 있어서 명백하다. 또한, 본 출원은 2014년 4월 4일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2014-077861호)에 기초하고 있고, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
1. 시료 첨가부(샘플 패드)
2. 표지 물질 유지부(콘쥬게이트 패드)
3. 크로마토그래프 매체부
4. 검출부
5. 흡수부
6. 배킹 시트

Claims (11)

  1. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 유리 섬유로 이루어지는 흡수부를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용해서 검체에 포함되는 피검출 물질을 검출하는 방법이며, 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 방법.
    (1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
    (2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 표지 물질에 의해 피검출 물질을 인식시키는 공정
    (3) 비이온성 계면 활성제 존재하에서 검체 및 표지 물질을 이동상으로서 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
    (4) 전개된 이동상 중의 피검출 물질을 검출부에서 검출하는 공정
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료 첨가부 및 상기 검체 희석액 중 적어도 한쪽에 비이온성 계면 활성제를 함유하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 시료 첨가부에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 1cm2당 0.05 내지 5mg인 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 검체 희석액에서의 비이온성 계면 활성제의 함유량이 0.05 내지 10질량%인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비이온성 계면 활성제의 HLB값이 10 이상인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 크로마토그래프 매체부가 음이온성 계면 활성제를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 크로마토그래프 매체부에서의 음이온성 계면 활성제의 함유량이 0.02 내지 4질량%인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 크로마토그래프 매체부가 니트로셀룰로오스로 이루어지는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 흡수부의 여수 시간이 20초 내지 110초이며, 또한 밀도가 150 내지 500mg/m3인 방법.
  10. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 순차 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치이며, 해당 시료 첨가부는 비이온성 계면 활성제를 건조 유지하고, 해당 흡수부는 유리 섬유로 이루어지는 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  11. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부가 담지된 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 순차 포함하는 면역 크로마토그래피 장치와, 검체에 포함되는 피검출 물질을 희석하는 검체 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트이며, 해당 흡수부가 유리 섬유로 이루어지고, 해당 검체 희석액이 비이온성 계면 활성제를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 키트.
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