ES2552649T3 - Dispositivos, métodos y kits de inmunocromatografía - Google Patents

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ES2552649T3 ES11826474.6T ES11826474T ES2552649T3 ES 2552649 T3 ES2552649 T3 ES 2552649T3 ES 11826474 T ES11826474 T ES 11826474T ES 2552649 T3 ES2552649 T3 ES 2552649T3
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Abstract

Dispositivo para inmunoensayo que comprende: - una membrana que tiene una zona de captura de proteína Z-AAT definida por un anticuerpo 5 de captura inmovilizado en la misma; - una zona de aplicación de muestra y una trayectoria de flujo desde la zona de aplicación de muestra a la zona de captura de proteína Z-AAT; y - una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, cuya estructura conjugada comprende un reactivo de detección específico para la proteína Z-AAT, siendo el reactivo de detección móvil o movilizable, en el que el anticuerpo de captura es: el anticuerpo monoclonal LG96 producido por células de hibridoma depositadas con nº de Acceso DSM ACC3092; o el anticuerpo monoclonal MG97 producido por células de hibridoma depositadas con nº de Acceso DSM ACC3093; y en el que el reactivo de detección es un anticuerpo detector seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por células de hibridoma depositadas con nº de Acceso DSM ACC3092; o bien anticuerpo monoclonal MG97 producido por células de hibridoma depositadas con nº de Acceso DSM ACC3093.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivos, metodos y kits de inmunocromatografia SECTOR DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a dispositivos y ensayos que implican la union especifica, en particular, dispositivos y ensayos inmunocromatograficos.
TECNICA ANTERIOR
De forma comun, se utilizan varios procedimientos y dispositivos anallticos en ensayos dinamicos para determinar la presencia y/o la concentracion de analitos que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. Los ensayos de flujo lateral, tambien conocidos como ensayos inmunocromatograficos de flujo lateral o ensayos de flujo lateral (LFA), se utilizan comunmente, por ejemplo, en los dispositivos de diagnostico medico del punto de cuidado (POC). Los disenos de ensayos individuales estan adaptados a una aplicacion particular.
La deficiencia de antitripsina alfa-1 (AATD) es una enfermedad hereditaria, que puede ser diagnosticada mediante ensayos geneticos. Sin embargo, la AATD esta subdiagnosticada y solo se identifica en un 10-15%. En algunos casos, pacientes no identificados son diagnosticados erroneamente con la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) y el asma "habitual", respectivamente.
En el estado de la tecnica se ha descrito ya un anticuerpo monoclonal contra AATZ, es decir ATZ11 y se han disenado varios ensayos ELISA basados en dicho anticuerpo para la deteccion de la presencia del alelo PiZ. Ninguno de los ensayos ELISA generados es capaz de distinguir homocigotos o heterocigotos individuales para el alelo PiZ (STEN ERIKSSON Y OTROS: “Lack of Association between Hemochromatosis and [alpha]-Antitrypsin Deficiency”, ACTA MEDICA SCANDINAVICA, vol. 219, no. 3, 12 Enero 1986 (1986-01-12), paginas 291-294; WALLMARK A Y OTROS: “MONOCLONAL ANTOBODY SPECIFIC FOR THE MUTANT PiZ ALPHA1-ANTITRYPSIN AND ITS APPLICATION IN AN ELISA PROCEDURE POR IDENTIFICATION OF PIZGENE CARRIERS”, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 81, no. 18, 1 Septiembre 1984 (1984-09-01), paginas 5690-5693; GERSHAGEN, S. Y OTROS: “ELISA for specific detection of PiZ-related alphal-antitrypsin deficiency.”, CLIN. CHEM., vol. 50, no. 12, 2004, paginas 2407-2410; and JANCIAUSKIENE, S. Y OTROS: “Detection of circulating and endothelial cell polymers of Z and wild type alphal-antitrypsin by a monoclonal antibody”, J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 29, 2002, paginas 26540-26546)
Es interesante observar que anticuerpos monoclonales especificos contra AATZ no solamente se han utilizado en ensayos ELISA, sino tambien para marcar secciones de tejido de higado. De esta manera, se ha demostrado que una nueva variante similar a M (M Cagliari) no se relaciona con la variante Z puesto que muestra diferente antigenicidad (SERGI, C. Y OTROS: “Immunohistochemical and genetic characterization of the M Cagliari alpha-1-antitrypsin molecule (M-like alpha-1-antitrypsin deficiency).”, LAB. INVEST., vol. 70, no. 1, 1994, paginas 130-133).
La solicitud de Patente de Estados Unidos US20110294201 da a conocer un dispositivo de prueba que esta destinado a constituir un dispositivo de “todo en uno” (es decir, para llevar a cabo secuencialmente y en orden todas las reacciones requeridas para llevar a cabo una prueba de diagnostico) y preferentemente tiene forma de tubo, Comprende una zona de alimentacion para anadir un fluido corporal (preferentemente sangre). Una vez la muestra ha sido aplicada mediante un capilar, se puede cortar o arrancar una barrera de manera que dicha muestra pueda avanzar a traves de los diferentes cartuchos que contienen reactivos de interes y pasar luego a un area de indicacion a traves de un orificio.
La solicitud de Patente de Estados Unidos US2003/092090 da a conocer un dispositivo de prueba para detectar la presencia de protelna de priones, basada en inmunocromatografia, en el que la tira de pruebas tiene varios componentes o partes: zona absorbente para aplicar la muestra, zona con proteinasa K inmovilizada para digerir la protelna original de priones (opcional), zona conjugada, en la que la muestra reacciona con un reactivo marcado, zona separadora o almohadilla (opcional), zona de deteccion (con una prueba en linea y, opcionalmente, una linea de control) y una almohadilla de capilaridad (opcional) para impulsar el liquido a traves de la tira.
La solicitud de Patente de Estados Unidos US2006/246513 da a conocer un dispositivo o aparato de prueba que permite la deteccion de la presencia o ausencia de uno o varios analitos en una muestra liquida. El dispositivo de pruebas que da a conocer tiene la forma de una inmunocromatografia de todo en uno con una almohadilla de muestra, en la que la muestra es aplicada y reacciona con los correspondientes marcadores, una zona de quelado para eliminar el exceso de marcador, una ventana de observacion (con una linea de prueba y una linea de control) y una almohadilla absorbente para impulsar el liquido a traves del dispositivo.
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Existe todavla la necesidad de un ensayo de flujo lateral eficaz para determinar la presencia de un analito, en particular una protelna Z-AAT.
CARACTERlSTICAS DE LA INVENCION
En un aspecto, la presente invencion da a conocer un dispositivo de inmunocromatografla que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de ensayo, en el que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito y en el que el dispositivo comprende ademas una estructura conjugada acoplada fluidicamente a la membrana en un extremo proximo, de manera que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fraccion informadora conjugada al mismo de manera que el analito es una protelna Z-AAT presente en una muestra de un portador del gen PiZ, de manera que el anticuerpo de captura es: el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas bajo el n° de Acceso DSM ACC3092; o el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas bajo el n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas bajo el n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas segun el n° de Acceso DSM ACC3093.
En algunos aspectos, la presente invencion da a conocer un dispositivo de inmunoensayo que comprende:
- una membrana que tiene una zona de captura de protelnas Z-AAT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado en la misma, en la que el anticuerpo de captura es un anticuerpo de protelna anti Z-AAT;
- una zona de aplicacion de muestra y una trayectoria de flujo desde la zona de aplicacion de muestra a la zona de captura de protelna Z-AAT; y
- una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, de manera que la estructura conjugada comprende un reactivo de deteccion especifico para la protelna Z-AAT, siendo el reactivo de deteccion movil o movilizable,
en el que el anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el reactivo de deteccion es un anticuerpo detector seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas segun n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un dispositivo de inmunoensayo para determinar la presencia o la cantidad de una protelna Z-AAT en una muestra de fluido. El dispositivo comprende:
una zona de aplicacion de muestras;
una membrana microporosa que tiene una zona de captura de protelnas Z-AAT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado en la misma, en la que el anticuerpo de captura es LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; una trayectoria de flujo desde la zona de aplicacion de la muestra a la zona de captura de proteina Z-AAT, de manera que la presencia o cantidad de la proteina Z-AAT en una muestra de fluido se puede determinar por formation de un complejo entre el anticuerpo de captura y la proteina Z-AAT que puede encontrarse presente en la muestra de fluido; y
una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, de manera que la estructura conjugada comprende un reactivo de deteccion especifico para la proteina Z-AAT, siendo el reactivo de deteccion movil o movilizable, en el que el reactivo de deteccion es LG96 conjugado de oro, producido por celulas de hibridoma depositadas segun n° de Acceso DSM ACC3092.
En un aspecto, se da a conocer un procedimiento para detectar una proteina Z-AAT en un individuo. El procedimiento comprende:
aplicar una muestra biologica del individuo al dispositivo de inmunoensayo de la presente invencion; y detectar un complejo que se forma entre el anticuerpo de captura y la proteina Z-AAT que se puede encontrar presente en la muestra de fluido, de manera que la deteccion del complejo indica la presencia de la protelna Z-AAT en la muestra.
En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un metodo para determinar un portador del gen PiZ. El metodo comprende someter a inmunocromatografla una muestra de un individuo utilizando un dispositivo segun la presente invencion; y determinar la union de un analito a un anticuerpo de captura, en el que la union del analito al anticuerpo de captura indica que el individuo es un portador de PiZ.
En algunos aspectos, la presente invencion da a conocer un metodo para diagnosticar una afeccion o enfermedad asociada con la deficiencia de AAT. El metodo comprende someter a inmunocromatografla una muestra de un individuo utilizando un dispositivo segun la presente invencion, y determinar la union de un analito a un anticuerpo de captura, en el que la union del analito al anticuerpo de captura indica que el individuo tiene la afeccion o la enfermedad.
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En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un metodo para determinar la predisposicion de un individuo a desarrollar una afeccion o enfermedad asociada con la deficiencia de AAT. El metodo comprende someter a inmunocromatografla una muestra de un individuo utilizando un dispositivo segun la presente invencion, y determinar la union de un analito a un anticuerpo de captura, en el que la union del analito al anticuerpo de captura es indicativa de la predisposicion del individuo al desarrollo de la afeccion o enfermedad.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un kit que comprende un dispositivo de acuerdo con la presente invencion, y un anticuerpo detector que tiene una fraccion informadora conjugada del mismo.
En otra realizacion, la presente invencion da a conocer un anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas bajo n° de Acceso DSM ACC3092; y el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas bajo n° de Acceso DSM ACC3093.
DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra los resultados de los ensayos de ELISA de tipo sandwich por parejas coincidentes, con anticuerpos monoclonales LG96 y MG97. Se utilizaron anticuerpos monoclonales LG96 y MG97 parcialmente purificados bien como anticuerpos de captura o bien como anticuerpos de deteccion marcados con peroxidasa de rabano picante (LG96HRP o MG97HRP respectivamente). Sueros ZZ o MM agrupados fueron diluidos en serie con solucion tampon de muestra y se utilizaron como solucion de antigeno. Las parejas coincidentes LG96-LG96HRP, LG96-MG97HRP, MG97-LG96hRP y MG97-MG97HRP muestran una union especifica con suero PiZZ, pero no con suero PiMM.
La figura 2 muestra los resultados de ensayos de reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales LG96 y MG97 con AAT recubierta (forma M). Los anticuerpos especificos de M F43.8.1 y 1AT actuan como controles positivos y ambos muestran una union especifica muy fuerte con AAT recubierta (forma M). Por el contrario, los anticuerpos LG96 y MG97 no muestran union a la forma M de AAT recubierta.
La figura 3 ilustra un diagrama esquematico de un dispositivo de ensayo de flujo lateral (LFA) para inmunocromatografla segun una realizacion de la presente invencion.
La figura 4 ilustra un diagrama esquematico, tal como el de la figura 3, en el que la muestra no contiene el analito diana.
La figura 5 es una imagen de un dispositivo de FLA, en el que los componentes de inmunocromatografla se representan alojados en una carcasa hecha, por ejemplo, de un material plastico. La linea o zona de ensayo se muestra como ausente lo que indica que los resultados del ensayo son negativos para la presencia del analito en la muestra. La linea o zona de control es positiva lo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente.
La figura 6 ilustra un diagrama esquematico, tal como el de la figura 3, en el que la muestra contiene el analito diana.
La figura 7 es una imagen de un dispositivo de FLA, en el que los componentes de inmunocromatografla se representan alojados en una carcasa, tal como en la figura 5. La linea o zona de ensayo se muestra presente lo que indica que los resultados del ensayo son positivos para la presencia del analito en la muestra. La linea o zona de control tambien es positiva lo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente.
La figura 8 ilustra el principio de un FLA segun una realizacion de la presente invencion, en el que la muestra es sangre de un individuo de tipo ZZ. Anticuerpo de captura LG96; anticuerpo de deteccion MG97 conjugado con HRP; anticuerpo de control: Ig.
La figura 9 ilustra el principio de un FLA segun otra realizacion de la presente invencion, en el que la muestra es sangre de un individuo de tipo MM. Anticuerpo de captura LG96; anticuerpo de deteccion MG97 conjugado con HRP; anticuerpo de control: Ig.
La figura 10 ilustra el principio de un FLA segun otras realizaciones de la presente invencion, en el que la muestra es sangre de un individuo de tipo MZ. Anticuerpo de captura LG96; anticuerpo de deteccion MG97 conjugado con HRP; anticuerpo de control: Ig.
La figura 11 muestra los resultados de las curvas de union de LG96-MG97HRP sobre suero ZZ y MM.
La figura 12 muestra los resultados de la union especifica de LG96-MG97HRP en suero ZZ. Sin union para suero MM.
La figura 13 muestra los resultados del cribado de muestras reales (diluidas 1:20) en ensayos en blanco.
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La figura 14 muestra la determinacion de la concentracion de Z-AAT en diferentes muestras de suero/plasma disponibles comercialmente e internas utilizando ELISA de PiZZ.
Las figuras 15A-15D muestran el analisis de muestras de suero #1-6 en cada combinacion posible de anticuerpos, en el que el anticuerpo mencionado primero es el anticuerpo de captura inmovilizado sobre la nitrocelulosa, y el anticuerpo mencionado despues de la barra es el anticuerpo de deteccion acoplado a las particulas de oro.
La figura 16 muestra una vista lateral de una realizacion de un dispositivo de la presente invencion.
La figura 17 es una seccion longitudinal del dispositivo mostrado en la figura 16.
La figura 18 es una vista ampliada del area de alimentacion del dispositivo mostrado en la figura 16.
La figura 19 es una representation ampliada del area de reaction de: (A) el dispositivo mostrado en la figura 16, y (B) otra realizacion de un dispositivo, en el que el dispositivo comprende un solo cartucho.
La figura 20 muestra una vista lateral de la tapa y la seccion de corte del dispositivo mostrado en la figura 16.
La figura 21 es una seccion longitudinal de una realizacion de un dispositivo de la presente invencion.
La figura 22 es otra realizacion de un dispositivo de la presente invencion.
La figura 23 es un dispositivo de la presente invencion segun algunas realizaciones.
La figura 24 es un dispositivo de la presente invencion segun otras realizaciones.
La figura 25 es un dispositivo de la presente invencion segun otras realizaciones adicionales.
La figura 26 muestra los resultados de tres cribados separados de muestras de suero ZZ(+) utilizando una realizacion de un dispositivo de la presente invencion.
La figura 27 muestra el ensayo de sangre capilar frente a muestras de suero (comparacion de 20 gl de sangre capilar y muestra de suero del mismo donante). Las senales de ensayo se midieron despues de 15 minutos utilizando un lector optico (lector QuickSens Omega 100). Los numeros en mg/dl indican los niveles en suero de AAT determinados por nefelometria.
La figura 28 muestra el efecto de diferentes anticoagulantes en resultados de ensayos. Control: suero MM. Muestras de ensayo: plasma ZZ-EDTA, plasma ZZ-citrato, plasma ZZ-heparina. Las senales de ensayo se midieron con un lector optico 15 minutos despues de comenzar el ensayo. Los numeros en mg/dl indican los niveles en suero de AAT determinados por nefelometria.
La figura 29 muestra el analisis de muestras de suero procedentes de: (A) donante MM; (B) donante ZZ, y (C) donante SZ (se utilizaron muestras de suero de 20 gl y los resultados se muestran despues de diferentes tiempos). 'Vol. es intensidad de la senal de la linea de ensayo (T) medida por un lector optico. La linea de control se designa por “C":
La figura 30 muestra un resumen de n-65 ensayos con suero y sangre entera. 0 = muestras PiMM, 1 = muestras PiMZ, PiSZ y PiZZ. Las senales de ensayo se midieron despues de 15-20 minutos utilizando un lector optico.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
En un aspecto, la presente invencion da a conocer un dispositivo de inmunocromatografia que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de ensayo, en el que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito y en el que el dispositivo comprende ademas una estructura conjugada acoplada fluidicamente a la membrana en un extremo proximo, de manera que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fraction informadora conjugada del mismo en el que el analito es una proteina Z-AAT presente en una muestra del portador de gen PiZ, en el que el anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas segun n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093. El dispositivo se puede utilizar para determinar la presencia del analito en una muestra.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el termino "proteina Z-AAT", se refiere a un polimero o polimeros de aminoacidos Z-AAT y no se pretende hacer referencia a una longitud especifica de la proteina; de este
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modo, los fragmentos de la misma estan incluidos dentro de la definicion de "proteina Z-AAT". Este termino incluye tambien formas, variantes, y analogos de la proteina Z-AAT entre los que se incluyen monomeros, dimeros, multimeros, etc., asl como modificaciones post-traduccionales de la proteina, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. De este modo, en algunas realizaciones, el termino "proteina Z-AAT" puede ser sinonimo del termino "polipeptido Z-AAT" o puede referirse a un complejo de dos o mas polipeptidos Z-AAT (por ejemplo, dimericos, multimericos, agregados).
Muestra
En general, la muestra, se refiere a un material que puede contener o no el analito. La muestra se puede utilizar directamente tal como se obtiene de una fuente de procedencia o despues de un tratamiento previo para modificar o alterar una caracteristica de la muestra. La fuente de la muestra puede ser cualquier fuente biologica, tal como un fluido fisiologico, entre los que se incluyen, sin que constituyan limitation, sangre, fluido intersticial, saliva, fluido de la lente ocular, fluido espinal cerebral, sudor, orina, leche, liquido ascitico, mucosidades, liquido sinovial, liquido peritoneal, fluido vaginal, fluido amniotico o similares. Preferentemente, la muestra es una muestra acuosa.
En algunas realizaciones, la muestra es una muestra no diluida, es decir, la muestra se obtiene de la fuente biologica y se aplica directamente al dispositivo sin dilucion previa de la muestra. En otras realizaciones, la muestra se trata previamente antes de su utilization, tal como preparando el plasma a partir de sangre, diluyendo los fluidos viscosos, y similares. El tratamiento previo de la muestra puede incluir filtracion, precipitation, dilution, destilacion, concentracion, inactivacion de componentes interferentes, y adicion de reactivos. En una realizacion, un material solido sospechoso de contener el analito puede ser utilizado como la fuente de la muestra, preferentemente mediante la modification del material solido para formar una composition liquida o semiliquida.
En una realization, la muestra es sangre completa, plasma o suero. En otra realization, la muestra es sangre capilar.
Membrana
El dispositivo de la presente invencion da a conocer un ensayo inmunocromatografico basado en membranas para determinar la presencia o la cantidad del analito en la muestra, tal como se define en las reivindicaciones. El analito es una proteina Z-AAT. Por ejemplo, en una realizacion, el analito es una proteina Z-AAT, en la que la presencia del analito en una muestra de sangre obtenida de un mamifero (por ejemplo, humano) indica que el mamifero es un portador del gen PiZ.
La membrana se puede preparar a partir de cualquiera de una variedad de materiales a traves de los que la muestra es capaz de pasar. Por ejemplo, entre los materiales utilizados para formar la membrana se pueden incluir, sin que constituyan limitacion, materiales naturales, sinteticos, o de origen natural que estan modificados sinteticamente, tales como polisacaridos (por ejemplo, materiales de celulosa tales como papel y derivados de celulosa, tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa); polieter sulfona; membranas de nailon, silice, materiales inorganicos, tales como alumina desactivada, tierra de diatomeas, MgSO4, u otro material inorganico finamente dividido uniformemente dispersado en una matriz polimerica porosa, con polimeros tales como cloruro de vinilo, copolimero de cloruro de vinilo-propileno, y copolimero de cloruro de vinilo-acetato de vinilo; tejido, tanto de origen natural (por ejemplo, algodon) como sintetico (por ejemplo, nailon o rayon); geles porosos, tales como gel de silice, agarosa, dextrano y gelatina; peliculas polimericas, tales como poliacrilamida, y similares.
En una realizacion, la membrana se forma a partir de materiales de nitrocelulosa y/o de poliester sulfona. La nitrocelulosa puede ser de esteres de acido nitrico de celulosa, que pueden ser solo de nitrocelulosa o un ester mixto de acido nitrico y otros acidos, tales como acidos carboxilicos alifaticos que tienen uno o mas atomos de carbono.
En algunas realizaciones, la membrana comprende nitrocelulosa. La nitrocelulosa puede tener la capacidad de unirse a proteinas sin requerir la sensibilization previa. Ciertos reactivos, tales como anticuerpos, se pueden aplicar directamente a la nitrocelulosa e inmovilizarse sobre la misma. Se requiere poco tratamiento quimico del mismo o ninguno, que podria interferir con la actividad de union especifica esencial del reactivo. Posteriormente, los sitios de union sobre la nitrocelulosa no utilizados se pueden bloquear utilizando materiales simples, tales como alcohol de polivinilo. Por otra parte, la nitrocelulosa esta disponible facilmente en una gama de tamanos de poro y esto facilita la seleccion de un material de membrana para satisfacer requisitos en particular, tales como el caudal de la muestra, etc.
En una realizacion, la membrana comprende una unica zona o linea o region de ensayo que tiene el anticuerpo de captura unido a la misma.
En otras realizaciones, la membrana comprende una pluralidad de zonas de ensayo dispuestas, por ejemplo, en serie, sobre la membrana, a traves de las que la muestra acuosa puede pasar progresivamente. En una realizacion, la pluralidad de zonas de ensayo se puede utilizar para proporcionar una medicion cuantitativa del analito o, en otra
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realizacion, se pueden cargar individualmente con diferentes anticuerpos de captura especificos para proporcionar un ensayo para multiples analitos.
En otras realizaciones adicionales, la membrana comprende una zona de control para proporcionar una determination de que el dispositivo ha funcionado. Preferentemente, la zona de control esta ubicada aguas debajo de la zona o zonas de ensayo en las que se determina el resultado del ensayo deseado. Por lo tanto, un indicador de control positivo proporciona information de que la muestra ha penetrado, como mlnimo, la distancia requerida a traves de la membrana.
Por ejemplo, la zona de control se puede cargar con un anticuerpo u otra molecula/reactivo que se unira a un reactivo de detection para confirmar que la muestra ha permeado suficientemente a traves de la membrana. Por ejemplo, en los casos en los que el reactivo de deteccion es un anticuerpo marcado derivado de un hibridoma murino, la zona de control puede comprender un anticuerpo "anti-raton" (por ejemplo, IgG anti-raton). En otra realizacion, la zona de control puede contener un reactivo anhidro que, cuando se humedece, produce un cambio de color o la formation de color, por ejemplo, sulfato de cobre anhidro que se vuelve azul cuando se humedece con una muestra acuosa. Como una realizacion adicional, una zona de control puede contener analito inmovilizado (por ejemplo, protelna Z-AAT) que reaccionara con el exceso de reactivo de deteccion.
En una realizacion, la membrana comprende una zona de control que tiene un anticuerpo de control unido a la misma, en la que el anticuerpo de control es capaz de unirse con el reactivo de deteccion. En algunas realizaciones, el anticuerpo de control es una IgG anti-raton.
Anticuerpo de captura
El anticuerpo de captura que esta unido a la membrana en la zona de ensayo es un anticuerpo, que es especifico para la protelna Z-AAT.El anticuerpo, presenta sustancialmente poca o ninguna reactividad cruzada con sueros PiMM o AAT purificada de tipo salvaje. El anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
Los terminos “policlonal” y “monoclonal” se refieren al grado de homogeneidad de una preparation de anticuerpos, y no se pretende que esten limitados a metodos de production particulares. El termino "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a una poblacion de moleculas de anticuerpo que contienen solo una especie de sitio de union al antigeno capaz de inmunorreaccionar con un epitopo particular.
Entre los fragmentos de anticuerpos se incluyen, sin que constituyan limitation, anticuerpos de cadena unica, quimericos, humanizados, primatizados, o tambien se contemplan “revestidos” (“veneered”). Por ejemplo, entre los fragmentos de anticuerpos capaces de unirse especificamente a la protelna Z-AAT se pueden incluir, sin que constituyan limitacion, Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio unico (DABs), Fv, scFv (Fv de cadena unica), anticuerpos lineales, diacuerpos, anticuerpos camelidos y similares. Las tecnicas para preparar y utilizar diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidas en la tecnica. Tales fragmentos pueden ser producidos por escision enzimatica o mediante tecnicas recombinantes. Por ejemplo, la escision con papalna o pepsina puede generar respectivamente fragmentos Fab o F(ab')2. Tambien se pueden utilizar otras proteasas con la especificidad de sustrato requerida para generar fragmentos Fab o F(ab')2. Los anticuerpos tambien se pueden producir en una variedad de formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los que uno o mas codones de termination han sido introducidos aguas arriba del sitio de termination natural. Por ejemplo, un gen quimerico que codifica un fragmento de cadena pesada F(ab')2 puede ser disenado para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CHi y la region “bisagra” de la cadena pesada.
La presente invention abarca tambien anticuerpos de cadena unica, y anticuerpos quimericos, humanizados o primatizados (injertados con una region determinante de la complementariedad (injertados con CDR), o anticuerpos “revestidos”, as! como quimericos, injertados con CDR o anticuerpos “revestidos” de cadena sencilla, que comprenden partes derivadas de diferentes especies, y similares. Las diferentes partes de estos anticuerpos pueden unirse entre si quimicamente mediante tecnicas convencionales, o pueden prepararse como una protelna contigua utilizando tecnicas de ingenierla genetica.
En una realizacion, el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092. En una realizacion, el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; y el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
Muestras de celulas representativas de las lineas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales LG96 y MG97 se depositaron el 14 de septiembre de 2010 en la "Deutsche Sammlung von
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Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (“Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares"), Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemania, dentro de los terminos del Tratado de Budapest bajo numeros de acceso DSM ACC3092 y DSM ACC3093, respectivamente.
Un experto habitual en la tecnica puede determinar las secuencias de acido nucleico de anticuerpos monoclonales utilizando multiples tecnicas conocidas en la materia. Los acidos nucleicos que codifican anticuerpos monoclonales se pueden clonar para preparar un anticuerpo monoclonal "recombinante". Se puede utilizar, cualquier tecnica de clonacion recombinante, entre las que se incluye la utilizacion de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para cebar la sintesis de las secuencias de acidos nucleicos que codifican anticuerpos. Por lo tanto, entre los metodos de preparacion de anticuerpos monoclonales se incluyen metodos que comprenden la obtencion, como mlnimo, de una primera molecula o segmento de acido nucleico que codifica el anticuerpo anti-Z-AAT adecuado a partir de una celula productora de anticuerpos anti-Z-AAT adecuada, preferentemente un hibridoma, y la expresion de la molecula o segmento de acido nucleico en una celula huesped recombinante para obtener un anticuerpo monoclonal anti-Z-AAT recombinante. Otras tecnicas recombinantes son conocidas en la tecnica, tales como, por ejemplo, los metodos basados en biblioteca de fagemidos. Por ejemplo, el metodo puede comprender: (a) inmunizar un animal mediante la administracion al animal, como mlnimo, de una dosis y, opcionalmente, mas de una dosis, de una composition que comprende una cantidad inmunogenicamente eficaz de una protelna Z-AAT inmunogenica, preferentemente una composicion que comprende celulas endoteliales activadas; (b) preparar una biblioteca combinatoria de fagemidos de inmunoglobulina que expresan ARN aislado de las celulas productoras de anticuerpos, preferentemente del bazo, del animal inmunizado; (c) seleccionar de la biblioteca de fagemidos, como mlnimo, un primer clon que expresa, como mlnimo, un primer anticuerpo anti-Z-AAT, opcionalmente uno que sustancialmente reacciona de forma cruzada o compite con el anticuerpo monoclonal LG96 o MG97; (d) obtener acidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-Z-AAT, como mlnimo, a partir de un primer clon seleccionado y expresar los acidos nucleicos en una celula huesped recombinante para proporcionar, como mlnimo, el primer anticuerpo anti-Z-AAT, y (e) obtener, como mlnimo, un primer anticuerpo anti-Z-AAT expresado por los acidos nucleicos obtenidos, como mlnimo, a partir del primer clon seleccionado.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno con una especificidad epitopica que es igual a la de los anticuerpos monoclonales LG96 o MG97, o es similar a la misma, se pueden identificar por una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un anticuerpo con la especificidad epitopica igual o similar se puede identificar en base a la capacidad de competir con el anticuerpo monoclonal por la union a un polipeptido Z-AAT. En otro ejemplo, la union de, por ejemplo, mAb LG96, y la union de un anticuerpo con la especificidad epitopica igual o similar a un polipeptido Z-AAT puede ser inhibida por un solo peptido (por ejemplo, un peptido natural, un peptido sintetico).
Sin querer quedar limitado por ninguna teorla particular, se cree que un problema con concentraciones de analito elevadas en una muestra a ensayar puede ser el denominado "efecto Hook", que se entiende por un experto habitual en la tecnica como una disminucion de la senal detectable a concentraciones muy elevadas de analito. Normalmente, en un formato de ensayo de tipo sandwich heterogeneo, el anticuerpo marcado soluble (por ejemplo, reactivo de detection) y el anticuerpo de fase solida (por ejemplo, anticuerpo de captura) estan presentes en un exceso con relacion al analito que se determina, de manera que se pueden formar los complejos sandwich y tambien detectar esencialmente por completo. Sin embargo, en presencia de una concentration elevada de analito, un numero limitado de anticuerpos se enfrentan a un numero muy grande de moleculas de analito que pueden estar presentes en la muestra. En el caso extremo, hay un deficit de anticuerpo de fase solida de tal manera que el analito esta solo parcialmente unido y, por otra parte, la fraction de analito unido a la fase solida no puede ser completamente detectada debido a que el anticuerpo marcado es capturado por el exceso de analito, con formacion de complejos solubles de anticuerpo de deteccion/analito. Esto puede dar como resultado una reduction de la senal de medida que puede conducir a un resultado de falso negativo.
En algunas realizaciones, la muestra es una muestra diluida previamente, que despues se somete a la inmunocromatografla.
En otras realizaciones, la membrana comprende una o mas zonas de captura dispuestas (por ejemplo, en serie) sobre la membrana, cada una en una position proxima a la zona o zonas de ensayo, a traves de las que la muestra acuosa puede pasar progresivamente antes de alcanzar la zona o zonas de ensayo. En algunas realizaciones, la zona o zonas de captura comprenden los anticuerpos monoclonales LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, inmovilizados/unidos a las mismas. La zona o zonas de captura se pueden proporcionar para la prevencion, reduccion o eliminacion del efecto gancho en los ensayos de muestras que potencialmente estan sometidas a este efecto.
Estructura conjugada
En una realizacion, el dispositivo comprende ademas una estructura conjugada que tiene un reactivo de deteccion, tal como un anticuerpo de deteccion marcado con un grupo informador, en el que el anticuerpo detector es seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso
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DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
En algunas realizaciones, la estructura conjugada se coloca en contacto con la membrana, en la que cuando un liquido se pone en contacto con la estructura conjugada, el reactivo de deteccion se rehidrata y se transporta a traves de la membrana.
En otras realizaciones, la estructura conjugada se acopla en linea de fluido a la membrana en un extremo proximal de la membrana.
En otra realizacion, la estructura conjugada es una almohadilla conjugada que se superpone parcialmente con la membrana en el extremo proximal de la membrana.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la estructura conjugada se hace de un material absorbente, poroso o fibroso capaz de absorber liquido rapidamente. La porosidad del material puede ser unidireccional (por ejemplo, con poros o fibras que discurren total o predominantemente paralelos a un eje de la estructura) o multidireccional (por ejemplo, omnidireccional, de modo que el miembro tiene una estructura amorfa de tipo esponja). Se pueden utilizar materiales plasticos porosos, tales como polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, acetato de vinilo-etileno, acrilonitrilo y politetrafluoroetileno. Puede ser ventajoso tratar previamente el material con un agente surfactante durante su fabricacion, ya que esto puede reducir cualquier hidrofobicidad inherente en el material y, por lo tanto, aumentar su capacidad de absorber y liberar una muestra humeda con rapidez y eficacia. La estructura porosa puede estar fabricada ademas de papel u otros materiales celulosicos, tales como nitrocelulosa. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los materiales que se utilizan actualmente en las puntas de los denominados lapices con punta de fibra y estos materiales se pueden conformar o extruir en una variedad de longitudes y secciones transversales apropiadas en el contexto de la presente invencion. Preferentemente, el material que comprende la estructura conjugada porosa se elige de manera que el material poroso se puede saturar con liquido acuoso en cuestion de segundos. Preferentemente, el material sigue siendo solido cuando esta humedo.
En otras realizaciones, la estructura conjugada es un acabado o recubrimiento sobre el que se deposita una capa de reactivo de deteccion. En una realizacion, una parte de la membrana porta la estructura conjugada. Un experto en la tecnica apreciara que, en la practica, el acabado/recubrimiento puede no formar una capa superficial verdadera y el material de acabado/recubrimiento puede penetrar en el espesor de la membrana en cierta extension. El reactivo de deteccion depositado puede penetrar tambien en la membrana. Segun estas realizaciones, una muestra acuosa puede fluir a lo largo de la longitud de la membrana y, al hacerlo, disuelve el acabado/recubrimiento y moviliza el reactivo de deteccion, y transporta el reactivo de deteccion a lo largo de la membrana.
Reactivo de Deteccion
En realizaciones preferentes, el reactivo de deteccion es un anticuerpo de deteccion marcado con un grupo informador.
En una realizacion, el anticuerpo de deteccion es un anticuerpo, que es especifico para la proteina Z-AAT, presenta sustancialmente poca o ninguna reactividad cruzada con sueros PiMM o AAT purificada de tipo salvaje y es seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
En otras realizaciones, el anticuerpo de deteccion es el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, en el que el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092 En algunas realizaciones, el anticuerpo de deteccion es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, en las que el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093. En algunas realizaciones, el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; y el anticuerpo de deteccion es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
El fragmento informador puede ser cualquiera de una amplia gama de materiales/sistemas informadores conocidos en la tecnica. En algunas realizaciones, el fragmento informador comprende un primer miembro de un par ligando-receptor, entre los que se incluyen, sin que constituyan limitation, una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante (HRP), fosfatasa alcalina, luciferasa, P-galactosidasa, glucosa oxidasa, lisozima, malato deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa); dispersiones coloidales de metal, dispersiones coloidales de selenio, dispersiones coloidales de carbono, y similares; particulas coloreadas o coloreables (por ejemplo, particulas de latex coloreadas o coloreables); particulas coloidales metalicas (por ejemplo, oro coloidal, plata coloidal, platino coloidal, selenio coloidal). Entre los ejemplos de metodos conocidos en la tecnica para detectar el informador se
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incluyen, sin que constituyan limitacion, los metodos de deteccion mediante inspeccion visual, espectrofotometrla de ultravioleta (UV) y visible, fluorimetrla y conteo de radiacion.
El fragmento informador puede estar enlazado/acoplado covalente o no covalentemente con el anticuerpo de deteccion. El enlace/acoplamiento puede realizarse por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, entre los reactivos utilizados para el enlace/acoplamiento se incluyen, sin que constituyan limitacion, glutaraldehido, p-tolueno diisocianato, diversos reactivos de carbodiimida, p-benzoquinona m-peryodato, N,Ni-o-fenilendimaleimida, metodos recombinantes, y similares.
Sistema de separacion sanguineo
En otras realizaciones, el dispositivo comprende ademas un sistema de separacion sanguineo para recibir la muestra, en el que el sistema de separacion sanguineo esta acoplado en linea de fluido a la estructura conjugada. En una realizacion, el sistema de separacion de sangre es un sistema de separacion sanguineo que se superpone parcialmente con la almohadilla conjugada.
En algunas realizaciones, la muestra no tiene que ser aplicada directamente a la estructura conjugada o la seccion de membrana del dispositivo. En una realizacion preferente, la muestra se aplica al sistema de separacion sanguineo {por ejemplo, material/almohadilla de absorcion) que se acopla en linea de fluido a la estructura conjugada. Por ejemplo, el sistema de separacion sanguineo puede funcionar como un filtro, por ejemplo, para eliminar las celulas de sangre de la muestra. A continuacion, la muestra filtrada puede llegar a la estructura conjugada. En otras realizaciones, durante el curso del proceso de filtracion, se puede llevar a cabo al mismo tiempo la adicion de reactivos mediante la disolucion de estos ultimos en los componentes presentes en el sistema de separacion de la sangre en un estado seco. Se pueden eliminar factores de interferencia de la solucion mediante estos componentes. De este modo, por ejemplo, el acido ascorbico presente en una muestra, que podria interferir con la utilizacion de oxidasas y peroxidasas como agentes de marcaje, puede hacerse inefectivo con un agente oxidante adecuado. El sistema de separacion de la sangre puede tambien funcionar como un adsorbente que elimina factores de interferencia de la muestra por adsorcion.
Estructura distal
Preferentemente, el reactivo de deteccion (por ejemplo, el anticuerpo marcado) migra con la muestra liquida a la zona de ensayo. El flujo de muestra continua mas alla de la zona de ensayo y se aplica muestra de forma suficiente a la membrana con el fin de que esto pueda tener lugar. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende ademas una estructura distal acoplada en linea de fluido con la membrana en un extremo distal de la membrana, en el que la estructura distal esta configurada para proporcionar suficiente paso de flujo del extremo proximal al extremo distal. La estructura distal funciona, como mlnimo, como un "sumidero" absorbente en el extremo distal de la membrana. El sumidero absorbente puede comprender, por ejemplo, papel de cromatografla Whatman 3MM.
En una realizacion, la estructura distal es una almohadilla adsorbente que se superpone parcialmente con la membrana en el extremo distal, en la que la almohadilla adsorbente esta configurada para proporcionar suficiente paso de flujo del extremo proximal al distal de la membrana mediante accion capilar.
Metodos
En algunas realizaciones, en funcionamiento, una muestra acuosa se aplica al sistema de separacion de la sangre en el extremo proximal del dispositivo. La muestra fluye por accion capilar a traves de la estructura conjugada y transporta el reactivo de deteccion de la estructura conjugada a la zona o zonas de ensayo, a continuacion a la zona de control para dar lugar, por ejemplo, a una senal de color observable a simple vista con independencia de si la muestra contiene o no el analito a determinar. La determinacion del analito tiene lugar en la zona o zonas de ensayo. En algunas realizaciones, el usuario del dispositivo puede determinar si el analito esta presente en la muestra comparando la senal producida en las dos areas.
Por ejemplo, en una realizacion, si el ensayo se utiliza para determinar la presencia de una protelna Z-AAT en una muestra de sangre obtenida de un mamifero, el componente de la membrana del aparato puede comprender una unica zona de ensayo que tiene anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; inmovilizado sobre la misma, y una unica zona de control que tiene inmovilizada sobre ella IgG anti-raton. Una almohadilla conjugada puede estar superpuesta con la membrana en el extremo proximal de la membrana, en la que la almohadilla conjugada comprende el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, marcado con un grupo informador tal como, por ejemplo, particulas de latex coloreadas. La deteccion de una banda visible en la zona de ensayo indica la presencia de la protelna Z-AAT en la sangre y la deteccion de una banda visible en la zona de control confirma que la muestra ha permeado suficientemente a traves de la membrana.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un metodo para determinar un portador del gen PiZ. El metodo comprende:
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(a) someter una muestra a inmunocromatografla utilizando un dispositivo inmunocromatografico que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en un zona de ensayo, en la que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito, en el que el analito es una protelna Z-AAT presente en una muestra de un portador del gen PiZ, en el que el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas segun el n° de Acceso DSM ACC3092; o el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con el n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y
(b) determinar la union del analito al anticuerpo de captura, en el que la union del analito al anticuerpo de captura indica que el sujeto es un portador de PiZ.
En otras realizaciones, el portador de PiZ tiene un fenotipo que es cualquier combinacion alelica que tiene un alelo PiZ.
En algunas realizaciones, el fenotipo es PiZZ, PiMZ, PiSZ, o PiZ/Nulo.
En otra realizacion, la circulation sangulnea del individuo tiene una concentration de protelna Z-AAT que es detectable y, por lo tanto, indicativa de la existencia del alelo PiZ.
En otras realizaciones, el portador de PiZ es un portador de MZ heterocigotico que tiene un nivel de AAT en suero de, como mlnimo, 80 mg/dl, aproximadamente.
En otros aspectos adicionales, la presente invention da a conocer un metodo para diagnosticar una afeccion o enfermedad asociada con deficiencia de AAT, metodo que comprende:
(a) someter una muestra a inmunocromatografla utilizando un dispositivo inmunocromatografico que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de ensayo, en la que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito, y en el que el dispositivo comprende ademas una estructura conjugada acoplada fluidicamente a la membrana en un extremo proximo, en el que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fraction informante conjugada al mismo en el que el analito es una protelna Z-AAT presente en una muestra de un portador del gen PiZ, en el que el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas segun el n° de Acceso DSM ACC3092; o el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con el n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y
(b) determinar la union del analito al anticuerpo de captura en el que la union del analito al anticuerpo de captura indica que el sujeto tiene la afeccion o la enfermedad.
Dispositivos
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un dispositivo para realizar ensayos de union especifica, en particular ensayos inmunocromatograficos tal como se define en las reivindicaciones. Los dispositivos se pueden adaptar facilmente para utilizar los anticuerpos y metodos de la presente invencion para detectar Z-AAT. Entre los dispositivos de ensayo de fase solida se incluyen, sin que constituyan limitacion, dispositivos de inmunocromatografla de inmunoensayo, dispositivos de ensayo dinamico, placas de microtitulacion, varillas de inmersion e inmunocapilares.
En una realizacion preferente, un dispositivo, que puede adaptarse para su utilization con los anticuerpos y metodos de la presente invencion, se describe en el documento WO 2010/089102, que da a conocer un dispositivo para liquidos de un cuerpo humano o animal.
En algunas realizaciones, el dispositivo es un sistema cerrado de un solo uso, que tiene un componente de lanceta y un componente de recogida de sangre a traves de una interfaz integrada para la determination capilar directa de una deficiencia de alfa-1-antitripsina.
En una realizacion, el dispositivo esta configurado para realizar un inmunoensayo de tipo sandwich para el antigeno Z-AAT segun los metodos de inmunocromatografla y los anticuerpos de la presente invencion. La realizacion de un dispositivo -10-, tal como el que se ilustra en la figura 16 a modo de ejemplo, tiene una carcasa -11- alargada, tubular.
Una tapa -12- esta en el interior de la carcasa -11- mirando hacia un lado de un soporte -13- que mantiene un elemento en forma de tira -45-. El elemento en forma de tira -45- se extiende axialmente en la carcasa -11- y se
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asienta, en su extremo proximal, en un tubo de entrada en forma de boquilla -44- de un elemento separador en forma de copa -41-. El elemento separador -41-, que separa el area de indication -40- del area de reaction -30-, tiene una section transversal en forma de copa, que se abre hacia arriba y se asienta hermeticamente con un ajuste apretado en la carcasa -11-. El orificio de paso -42- en la parte inferior del elemento de separation -41- se abre directamente sobre la cara del elemento en forma de tira -45-. El elemento de separacion -41- esta rodeado por el orificio pasante -42- de los espaciadores -43- (figuras 17 y 19).
En algunas realizaciones, el elemento en forma de tira -45- comprende una membrana (por ejemplo, una pieza de material microporoso absorbente, tal como nitrocelulosa), que opcionalmente que puede ser laminado en un soporte (por ejemplo, un soporte de plastico). En contacto con la membrana esta: (a) una estructura conjugada que tiene un reactivo de deteccion, tal como un anticuerpo de deteccion marcado con un fragmento informador, y (b) una estructura distal, por ejemplo, una tira de un segundo material absorbente (por ejemplo, papel de cromatografla Whatman 3MM, fibra de vidrio), dicha estructura distal esta en comunicacion de fluido con la membrana a efectos de ayudar en el arrastre de los fluidos de ensayo a traves de la membrana desde su extremo proximal hasta el extremo distal. La estructura distal tambien funciona como un absorbente que absorbe los fluidos que pasan a traves de la membrana.
La membrana comprende una zona de ensayo con un anticuerpo de captura segun la presente invention inmovilizado sobre la misma. En una realizacion, la membrana comprende ademas una zona de control para proporcionar una determination de que el dispositivo ha funcionado. Preferentemente, la zona de control esta ubicada aguas abajo de la zona o zonas de ensayo en las que se determina el resultado del ensayo deseado. Por lo tanto, un informador de control positivo proporciona information de que la muestra ha permeado, como mlnimo, la distancia requerida a traves de la membrana. Por ejemplo, la zona de control se puede cargar con un anticuerpo u otra molecula/reactivo que se unira a un reactivo de detection para confirmar que la muestra ha permeado suficientemente a traves de la membrana. Por ejemplo, cuando el reactivo de deteccion es un anticuerpo marcado derivado de un hibridoma murino, la zona de control puede comprender IgG anti-raton. El anticuerpo de captura en la zona de ensayo es LG96, y/o MG97, el reactivo de deteccion es LG69 que esta marcado con un marcador detectable, y la zona de control comprende IgG anti-raton inmovilizada sobre la misma. En otra realizacion, el anticuerpo de captura en la zona de ensayo es LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con el n° de Acceso DSM ACC3092; o el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; el reactivo de deteccion seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, que esta marcado con un marcador detectable, y la zona de control comprende IgG anti-raton inmovilizada sobre la misma.
En algunas realizaciones, se disponen uno o mas cartuchos inmediatamente encima del elemento de separacion -41- en la direction axial de la carcasa -11-. En la realization representada en la figura 19A, se muestra el dispositivo comprendiendo tres cartuchos -31-, -34-, y -37- en el area de reaccion -30-, y en la realizacion representada en la figura 19B, se muestra un dispositivo con unico cartucho -37-.
A modo de ejemplo, con referencia a la figura 19A, en una realizacion, cada cartucho -31-, -34-, -37- tiene una parte de carcasa tubular -31a-, -34a-, -37a-, cuyas dimensiones exteriores coinciden con las dimensiones interiores de la carcasa -11-, y esta sellada en la parte superior e inferior mediante pellculas de sellado -32-/-33- y -35-/-36- y -38-/-39-. El o los cartuchos pueden comprender una solution tampon, reactivo u otra sustancia quimica que se requiera para el ensayo. El o los cartuchos pueden ser prefabricados y utilizados en el estado relleno y sellado con un ajuste apretado en la carcasa -11- de tal manera que las partes de la carcasa tubular se encuentran axialmente la una con la otra. En la realizacion mostrada en la figura 19A, la region del elemento en forma de tira -45- que mira hacia el cartucho -37- se asienta con su extremo inferior sobre el borde superior del elemento de separacion -41-. En el extremo superior opuesto del cartucho -31- existe un elemento de sujecion -15- dispuesto en forma de un manguito de sujecion, que se puede fijar bajo deformation elastica contra la pared interior de la carcasa -11- de tal manera que los uno o mas cartuchos estan bien posicionados y/o mantenidos los unos contra los otros.
Un dispositivo de corte -19- esta dispuesto encima de los cartuchos -31-, -34- y -37-, comprendiendo dicho dispositivo de corte una parte de corte -22-. La parte de corte -22- comprende un cuerpo de retention -21- y una extension tubular -21b-, que comprende en su extremo inferior mirando hacia el o los cartuchos -31-, -34-, -37- una cuchilla de corte -23-, por ejemplo, una cuchilla que comprende dientes de corte. Dispuesto cerca del extremo inferior de la proyeccion tubular -21b- esta un elemento de sellado -16- anular o cilindrico, que se asienta sobre el interior de la carcasa -11- y el exterior de la proyeccion tubular -21b- y esta soportado axialmente sobre la parte superior del manguito de sujecion -15-.
El cuerpo de retencion -21- de la parte de corte -22- tiene un orificio central axial -21a- en el que se inserta un tubo capilar -24-. Un casquillo tubular -25- tiene un orificio interno ciego -26- en el que se asienta la seccion superior que sobresale del tubo capilar -24-. En el extremo superior de la tapa -25- esta un soporte -28-, que un usuario puede girar y mover axialmente la tapa -25-. En el extremo inferior, frente al soporte -28- de la tapa -25- esta el miembro de gula -27-.
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Tal como se muestra en la figura 20, el cuerpo de retencion -21- de la parte de corte -22- tiene un pasador de gula -17- que se extiende radialmente hacia fuera que se acopla con una leva formada en la carcasa -11- en forma de una puerta -14- en forma de ranura (vease ademas la figura 16). Con referencia a la figura 16, la puerta -14- tiene una primera seccion -14a- en la direccion circunferencial de la carcasa -11- que delimita una primera seccion -14a-, una segunda seccion -14b- en una direccion longitudinal de la carcasa -11- que delimita una segunda seccion -14b, una tercera seccion -14c- en la direccion circunferencial de carcasa -11- que delimita una tercera seccion -14c- y una cuarta seccion -14d- en la direccion longitudinal de la carcasa -11- que delimita una cuarta seccion -14d-. En algunas realizaciones, puede dotarse de una seccion transversal de estrechamiento leve en el extremo -46- en el area de transicion entre la tercera seccion -14c- y la cuarta seccion -14d- con el fin de evitar la transferencia erronea del pasador de gula -17- desde la seccion -14c- hasta la seccion -14d-. El acoplamiento del pasador de gula -17- en la puerta -14- da lugar al movimiento de la parte de corte -22- con relacion a la carcasa -11- y cubre las secciones -14a- y -14c- en las rotaciones, y las secciones -14b- y -14d- en los movimientos axiales.
Para llevar a cabo un ensayo con el dispositivo -10-, la muestra que va a examinarse (por ejemplo, sangre entera) se introduce en la region superior -20-. Por ejemplo, se retira la tapa -25- para exponer una parte del tubo capilar -24-, que se pone en contacto con una gota de sangre, por ejemplo, en la punta del dedo de un individuo. La muestra entra en el tubo capilar -24- por accion capilar. Posteriormente, la tapa -25- se coloca con su orificio ciego -26- sobre el tubo capilar -24- y se desliza completamente de tal manera que se reduce el volumen entre la parte inferior del orificio ciego -26- y el extremo superior del tubo capilar -24-, lo que conduce a un aumento de la presion que hace que la muestra salga del extremo inferior del tubo capilar -24- en el interior -29- de la proyeccion tubular -21b- de la parte de corte -22-.
Al colocar de nuevo la tapa -25- en el dispositivo, el segmento -27a- de la gula -27- de la tapa -25- se acopla con la entrada -22a- de modo que se lleva a cabo una transmision de un movimiento de rotacion de la tapa -25- sobre la parte de corte -22-. El usuario gira la tapa -25- y, por lo tanto, se hace girar tambien parte de corte -22- hasta que el pasador de gula -17- se puede mover en la seccion -14a-. A continuacion, el usuario presiona hacia abajo sobre la tapa -25-, con lo que se presiona tambien hacia abajo la parte de corte -22- en la direccion axial de la carcasa -11- hasta que el pasador de gula -17- se puede mover en la seccion -14b-, como consecuencia de este desplazamiento axial de la parte de corte -22-, la cuchilla de corte -23- entra en contacto con la pellcula de sellado superior -32- del cartucho -31- destruyendo o cortando de este modo la pellcula -32-. Despues de la destruccion de la pellcula -32-, la muestra que esta presente en el interior -29- de la proyeccion tubular -21b- entra en contacto con el contenido del cartucho -31-. Los otros cartuchos -34- y -37- estan todavla cerrados.
Para iniciar la siguiente fase de ensayo, el usuario gira de nuevo la tapa -25-, con lo que el pasador de gula -17- se mueve a lo largo de la seccion -14c- del area de transicion entre la seccion -14c- y la seccion -14d-. En esta posicion, es posible para el usuario empujar aun mas la tapa -25- en la carcasa -11- de tal manera que la parte de corte -23- se mueve a una distancia suficiente dentro de la carcasa -11- para provocar la destruccion tanto de la pellcula de sellado -33- del cartucho -31- como de la pellcula de sellado -35- del cartucho -34-. Con el fin de destruir/cortar ademas las pellculas de sellado -36-, -38- y -39-, la tapa -25- se mueve adicionalmente a una distancia apropiada a lo largo de la seccion -14d-. De esta manera, la muestra entra en contacto ademas sucesivamente con el contenido de los cartuchos -34- y -37-. A continuacion, la muestra pasa al interior del separador en forma de copa -41- y fluye a traves del orificio pasante -42- para entrar en contacto con el elemento en forma de tira -45- inmediatamente por debajo, en el que puede provocar un cambio de color, que puede ser visualizado a traves de una ventana -18-.
En otras realizaciones, el dispositivo comprende ademas una lanceta -50- en un extremo distal de la carcasa -11- (vease, por ejemplo, las figuras 21-25). Preferentemente, la lanceta es una lanceta desechable.
Con referencia a la figura 21, para realizar el ensayo, se forma una abertura en un tejido corporal en un sitio de muestra mediante el componente de lanceta del dispositivo para obtener una muestra. A continuacion, se retira la tapa -25- para dejar al descubierto una parte del tubo capilar -24-, que se pone en contacto con la muestra. A continuacion, se coloca de nuevo la tapa -25- en el dispositivo -10- con su orificio ciego -26- sobre el tubo capilar -24- y se desliza completamente de tal manera que se reduce el volumen entre la parte inferior del orificio ciego -26- y el extremo superior del tubo capilar -24-. En una realizacion, se destruye una pellcula de sellado -32- del cartucho -31- con lo que se permite que la muestra entre en contacto con la solucion tampon contenida dentro del cartucho -31- para formar una composicion de muestra/solucion tampon. A continuacion, despues de la destruccion de la pellcula de sellado -33-, la composicion de muestra/solucion tampon entra en contacto con el elemento en forma de tira -45- que, comprende una membrana, una estructura conjugada que tiene un reactivo de deteccion, en la que el reactivo de deteccion es un anticuerpo de deteccion marcado con un fragmento informador, en el que el anticuerpo detector es seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y una estructura distal en comunicacion de fluido con la membrana, en la que la composicion de muestra/solucion tampon entra en contacto con la estructura conjugada de modo que la composicion de muestra/solucion tampon se absorbe en la misma por capilaridad (efecto mecha), con lo que la composicion de muestra/solucion tampon entra en contacto con el reactivo de deteccion. La mezcla de muestra/solucion tampon/reactivo de deteccion se absorbe continuamente por la parte de membrana del elemento
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en forma de tira -45- de manera que la mezcla entra en contacto con el anticuerpo de captura seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, e inmovilizado sobre la membrana en la zona de ensayo permitiendo de este modo que cualquier antigeno Z-AAT que pueda estar presente en la mezcla se una al anticuerpo de captura. Opcionalmente, una solucion de lavado se puede absorber en el dispositivo despues de una cantidad suficiente de tiempo, despues de que la mezcla se haya puesto en contacto con el anticuerpo de captura. A continuation, el marcador detectable del anticuerpo de detection se visualiza en el area del anticuerpo de captura inmovilizado. En una realization preferente del dispositivo de ensayo, se incluye un control positivo sobre la membrana en las proximidades del anticuerpo de captura inmovilizado, pero en un lugar diferente, preferentemente inmovilizado sobre la membrana en un area en contacto por el fluido de muestra que migra despues de que entre en contacto con el area del anticuerpo de captura inmovilizado.
En algunos aspectos, la presente invencion da a conocer un dispositivo de inmunoensayo que comprende: una membrana que tiene un area de captura de la protelna Z-AAT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado en la misma, una zona de aplicacion de muestra y una trayectoria de flujo desde la zona de aplicacion de muestra a la zona de captura de la protelna Z-AAT; y una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, de manera que la estructura conjugada comprende un reactivo de deteccion especifico para la protelna Z-AAT, siendo el reactivo de deteccion movil o movilizable, en el que el anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el reactivo de deteccion es un anticuerpo detector seleccionado entre: anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
La presencia o cantidad de una protelna Z-AAT en una muestra de fluido se puede determinar por formation de un complejo entre el anticuerpo de captura y la protelna Z-AAT que puede estar presente en la muestra de fluido.
En otra realizacion, el anticuerpo de deteccion esta marcado con un fragmento informador.
En otras realizaciones, el anticuerpo de deteccion es un anticuerpo de deteccion conjugado con oro.
En aun otras realizaciones adicionales, una fuente de la muestra de fluido es sangre capilar, suero o plasma.
En otros aspectos, la presente invention da a conocer un dispositivo de inmunoensayo para determinar la presencia o cantidad de una protelna Z-AAT en una muestra de fluido. El dispositivo comprende:
un area de aplicacion de la muestra;
una membrana microporosa que tiene un area de captura de la protelna Z-AAT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado sobre la misma, en la que el anticuerpo de captura es LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
una trayectoria de flujo desde el area de aplicacion de la muestra hasta el area de captura de la proteina Z-AAT, en la que se puede determinar la presencia o la cantidad de una proteina Z-AAT en una muestra de fluido mediante la formacion de un complejo entre el anticuerpo de captura y la proteina Z-AAT que pueda estar presente en la muestra de fluido; y
una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, en la que la estructura conjugada comprende un reactivo de deteccion especifico para la proteina Z-AAT, siendo el reactivo de deteccion movil o movilizable, en la que el reactivo de deteccion es LG96 conjugado con oro producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
En un aspecto, se da a conocer un metodo para detectar una proteina Z-AAT en un individuo. El metodo comprende:
aplicar una muestra biologica del individuo al dispositivo de inmunoensayo de la presente invencion; y
detectar un complejo que se forma entre el anticuerpo de captura y la proteina Z-AAT que pueda estar presente en
la muestra de fluido, en el que la deteccion del complejo indica la presencia de la protelna Z-AAT en la muestra.
Kits
En un aspecto, la presente invencion da a conocer un metodo para determinar la predisposition de un individuo a desarrollar una afeccion o enfermedad asociada con la deficiencia de AAT, comprendiendo el metodo:
(a) someter una muestra a inmunocromatografla utilizando un dispositivo inmunocromatografico que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de ensayo, en el que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito, y en el que el dispositivo comprende ademas una estructura conjugada fluidicamente acoplada a la membrana en un extremo proximo, de manera que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fraction informadora conjugada
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al mismo en el que el analito es una protelna Z-AAT presente en una muestra de un portador del gen PiZ, en el que el anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y
(b) determinar una senal en la zona de ensayo, en la que la presencia de una senal en la zona de ensayo es indicativa de la predisposicion del individuo a desarrollar la afeccion o enfermedad.
La presente invencion, en otros aspectos, da a conocer un kit que comprende:
(a) un dispositivo inmunocromatografico segun la presente invencion; y
(b) un anticuerpo de deteccion que tiene un fragmento informador conjugado al mismo.
En una realizacion, el anticuerpo de deteccion es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas Acceso DSM ACC3093, en el que el anticuerpo esta marcado con un fragmento informador.
En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un kit que comprende el anticuerpo monoclonal LG96 por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, MG97 producido por celulas de depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, o ambos.
En otros aspectos, el dispositivo y los reactivos para llevar a cabo el inmunoensayo se pueden ser envasar en forma de un kit. Por ejemplo, dicho kit puede incluir un dispositivo de ensayo apropiado, reactivos de anticuerpos y/o reactivos para el desarrollo del ensayo, tales como soluciones tampon y/o reactivos para la deteccion del marcador elegido, si es necesario.
En algunos aspectos, la presente invencion da a conocer un kit para determinar la presencia de una protelna Z-AAT en una muestra biologica de un individuo, comprendiendo dicho kit un dispositivo tal como el que se describe en la presente memoria descriptiva, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de utilizacion.
En otras realizaciones, el kit puede incluir ademas opcionalmente otros materiales/componentes deseables desde un punto de vista comercial y del usuario final, entre los que incluyen lancetas, soluciones tampon (por ejemplo, Solucion Tampon de Muestra, CANDOR Bioscience GmbH, Wangen, Alemania), diluyentes, filtros, capilares (por ejemplo, capilar de 20 gl), agujas y/o jeringas, por ejemplo para recoger/obtener una muestra biologica.
En otras realizaciones adicionales, el kit puede incluir ademas un sistema que permite la deteccion de los resultados del ensayo. Los resultados se pueden detectar visualmente o instrumentalmente dependiendo de la marca presente en los complejos. En una realizacion preferente, los resultados se detectan visualmente.
Anticuerpos monoclonales
En otra realizacion, la presente invencion da a conocer el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; y el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Anticuerpos monoclonales
Se prepararon los hibridomas LG96 y MG97 por inmunizacion de ratones BALB/c con alfa-1-antitripsina (AAT) polimerica humana en Adyuvante de Freud completo. Los ratones se inmunizaron intra-peritonealmente; los intervalos entre las inmunizaciones fueron de 7-8 dias. Las celulas de bazo de los ratones inmunizados se fusionaron con la linea celular de plasmacitoma de NSW. Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron frente a la presencia de anticuerpos monoclonales mediante ELISA utilizando placas de microtitulacion recubiertas con hAAT polimerica o suero de pacientes PiZZ con deficiencia de AAT.
Los hibridomas seleccionados se clonaron y se cribaron de nuevo para seleccionar aquellos que producen anticuerpos contra la AAT polimerica pero no contra la AAT nativa. Los anticuerpos monoclonales de hibridomas LG96 y MG97 pareclan reconocer la AAT polimerica y reaccionaron especificamente con suero PiZ.
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Los hibridomas se congelaron en medio especifico (DMEM con 20% de FCS y 10% DMSO) la concentracion de celulas en cada vial fue 2x106 celulas/ml. Las celulas se mantuvieron en atmosfera de nitrogeno. Las celulas pueden ser recuperadas utilizando medio DMEM-10 o 20% de suero.
Ejemplo 2
Ensayos de anticuerpos LG96 y MG97 contra la AAT de tipo PiZZ
Los anticuerpos monoclonales LG96 y MG97 fueron evaluados por su capacidad para unirse al tipo PiZZ nativo en un ELISA tipo sandwich. Se obtuvieron pequenas cantidades de sobrenadantes de cultivos celulares que comprenden los anticuerpos y se purificaron parcialmente ambos anticuerpos por CANDOR Bioscience GmbH (Wangen, Alemania).
Ensayo ELISA tipo sandwich por parejas coincidentes,
Todas las soluciones tampon utilizadas para los inmunoensayos fueron proporcionadas por CANDOR Bioscience. La placa de microtitulacion (MaxiSorp®, Nunc, Langenselbold, Alemania) se recubrio con anticuerpos LG96 o MG97 parcialmente purificados, respectivamente, mediante la adicion de 150 gl del correspondiente anticuerpo de captura a 1 gg/ml en solucion tampon de recubrimiento de pH 9,6 (numero de producto 121) a cada uno y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente en condiciones de agitacion. Despues de retirar la solucion de recubrimiento, las placas se bloquearon anadiendo 300 gl de solucion de bloqueo (numero de producto 110) a cada pocillo y se incubaron durante toda la noche a 4°C. La placa se lavo tres veces con solucion tampon de lavado (numero de producto 140). A continuacion, los sueros humanos (suero-ZZ- o suero-MM genotipado mezclado) se diluyeron con solucion tampon de muestra (numero de producto 105) 1:20 y 1:80 (5% y 1,25% de suero) que contenia 1 gg/ml de LG96HRP o MG97HRP, respectivamente. La solucion tampon de muestra sin suero actuo como control negativo (0%). Se anadieron 150 gl de estas mezclas a cada pocillo y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente en condiciones de agitacion. Despues de la etapa de incubacion, la placa se lavo tres veces. A continuacion se anadieron 150 gl de solucion de TMB (Kem-En-Tec, Dinamarca) a cada pocillo y se incubaron durante 15 min. La reaccion se detuvo con la adicion de 50 gl de H2SO4 2 N. Se determino la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
Ensayos de reactividades cruzadas
Se recubrio la placa de microtitulacion (MaxiSorp®, Nunc) con AAT purificada (BA672 forma M, Acris GmbH, Alemania) mediante la adicion de 150 gl de AAT a 1 gg/ml en solucion tampon de recubrimiento de pH 7,4 (numero de producto 120) a cada pocillo y se incubo durante 6 horas a temperatura ambiente en condiciones de agitacion. Despues de eliminar la solucion de recubrimiento, las placas se bloquearon mediante la adicion de 250 gl de solucion de bloqueo (numero de producto 110) a cada pocillo y se incubaron durante la noche a 4°C. La placa se lavo cuatro veces con solucion tampon de lavado (numero de producto 140). Posteriormente, los anticuerpos Z-especificos LG96 y MG97 purificados, y los anticuerpos F43.8.1 disponibles comercialmente (Monosan®, Uden, Palses Bajos) y 1AT (Acris Antibodies GmbH, Herferd, Alemania), ambos dirigidos contra la forma M, se diluyeron en serie con solucion tampon de muestra (numero de producto 105) para producir diferentes concentraciones de ensayo de cada anticuerpo (1.000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng ml, 2,5 ng/ml, 1,25 ng/ml 0,625 ng ml y 0 ng/ml). Se anadieron 150 gl de cada anticuerpo diluido en serie a los pocillos y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente en condiciones de agitacion. Despues de la etapa de incubacion la placa se lavo cuatro veces. Para la deteccion, se utilizo un anticuerpo secundario marcado con HRP (IgG anti-raton-HRP 610-703-124, Biotrend, Alemania), que se diluyo con solucion tampon de muestra a 0,5 gg/ml y se anadio a cada pocillo seguido de una etapa de incubacion de 2 h aproximadamente a temperatura ambiente en condiciones de agitacion. Posteriormente, se lavo la placa cuatro veces. A continuacion, se anadieron 150 gl de una solucion de TMB (Kem-En-Tec, Dinamarca) a cada pocillo y se incubaron durante 26 min. La reaccion se detuvo con la adicion de 50 gl de H2SO4 2 N. Se determino la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2. La figura 1 muestra un ELISA tipo sandwich (ensayo por parejas coincidentes) en el que ambos anticuerpos se utilizaron bien como anticuerpos de captura o bien como anticuerpos de deteccion, estos ultimos marcados con peroxidasa de rabano picante (HRP). Se utilizaron una mezcla de sueros humanos de 10 pacientes portadores de AAT ya sea de tipo PiZZ o PiMM (genotipo no mostrado) como solucion de antigeno. Utilizando anticuerpos parcialmente purificados, se observo una union especifica positiva a la mezcla de sueros tipo PiZZ y no se observo reactividad cruzada con la mezcla de suero tipo PiMM.
Los resultados de un ensayo adicional para las reactividades cruzadas se muestran en la figura 2. En este, la forma M de AAT purificada se recubrio en pocillos de ELISA y se determino la union de los anticuerpos LG96 y MG97 nativos. A diferencia de la union especifica de los anticuerpos de control M-especificos 1AT y F43.8.1 frente a AAT de tipo M recubierta, los anticuerpos LG96 y MG97 no muestran reactividad cruzada con la AAT de tipo M.
Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales LG96 y MG97 pueden ser utilizados con exito en un ELISA tipo sandwich contra AAT de tipo PiZZ. Los anticuerpos monoclonales LG96 y MG97 se pueden utilizar como
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anticuerpos de ensayo en un inmunoensayo de formato sandwich especifico para la AAT de tipo PiZZ sin reactividades cruzadas con el tipo PiMM.
Ejemplo 3
Desarrollo de un ELISA para Z-AAT de referencia
Se cribaron diez muestras (ensayos en blanco) de individuos diferentes (P1-P10) frente a la existencia de Z-AAT con una relacion de aciertos del 100% (figura 13). Se indicaron todas las muestras con Z, y no se indicaron las que no tienen Z (tales como MM).
Ejemplo 4
Ensayos adicionales de ELISA
Se utilizaron muestras de suero de un paciente ZZ (suero #1 y 2), de un paciente MZ que esta siendo sustituida con Prolastin® (suero #3 y 4), y de una persona de control (MM; suero #5+6). Se midieron las muestras de suero 1-6 (descritas anteriormente). Se utilizo como estandar el suero #1 con una concentracion conocida de 36 mg/dl (determinada por nefelometrla). La concentracion de las muestras de suero #2-6 se determino en el ensayo ELISA (Tabla 1).
Tabla 1: Concentracion de proteina-Z en las muestras de suero 1-6.
Suero #1 (PiZZ) Suero #2 (PiZZ) Suero #3 (MZ) Suero #4 (MZ) Suero #5 (PiMM) Suero #6 (PiMM)
Concentracion de protelna-Z [mg/dl]
36,0 34,0 35,8 34,1 0,0 0,0
Se confirmo la especificidad de los anticuerpos MG97 y LG96. Las muestras de suero #5 y 6 fueron claramente negativas, pero las muestras de suero #1-4 mostraron una fuerte senal positiva. Se ensayaron en su contenido en AAT-Z diferentes preparaciones de suero y plasma, disponibles comercialmente preparadas internamente (figura 14). Las muestras de suero/plasma disponibles comercialmente, asl como las muestras internas, se pueden utilizar como muestras negativas.
Marcaje de anticuerpos
Se acoplo tanto el anticuerpo MG97 como el LG96 con exito a particulas de oro coloidal de 40 nm.
Combination de anticuerpos
Los anticuerpos se utilizaron como anticuerpo de captura, asl tambien como anticuerpo de detection en cada combinacion posible. Las muestras de suero #1-6 se utilizaron para la deteccion de anticuerpos (figuras 15A-15D).
Conclusion
Se identificaron las combinaciones MG97/LG96 y LG96/LG96 (anticuerpo de captura/anticuerpo de deteccion) como las mejores en terminos de diferenciacion entre muestras positivas (#1-4) y muestras negativas (#5 y 6). La combinacion LG96/LG96 puede ser preferente debido a que los resultados de #1+2, 3+4 y 5+6 fueron mas semejantes.
Ejemplo 5
Dispositivo de ensayo
Se probo el suero ZZ(+) en tres dispositivos separados, tal como se muestra en la figura 26. Todos los ensayos fueron positivos.

Claims (32)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Dispositivo para inmunoensayo que comprende:
    - una membrana que tiene una zona de captura de protelna Z-AAT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado en la misma;
    - una zona de aplicacion de muestra y una trayectoria de flujo desde la zona de aplicacion de muestra a la zona de captura de protelna Z-AAT;
    y
    - una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, cuya estructura conjugada comprende un reactivo de deteccion especifico para la protelna Z-AAT, siendo el reactivo de deteccion movil o movilizable,
    en el que el anticuerpo de captura es:
    el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y
    en el que el reactivo de deteccion es un anticuerpo detector seleccionado entre:
    anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o bien
    anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
  2. 2. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que la presencia o cantidad de una protelna Z-AAT en una muestra de fluido se puede determinar por formation de un complejo entre el anticuerpo de captura y la protelna Z-AAT que puede encontrarse presente en la muestra de fluido.
  3. 3. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092 y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
  4. 4. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092 y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
  5. 5. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093 y el anticuerpo de deteccion es el anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
  6. 6. Dispositivo, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo detector esta marcado con una fraccion informadora.
  7. 7. Dispositivo, segun la reivindicacion 6, en el que el anticuerpo detector es un anticuerpo detector conjugado de oro.
  8. 8. Dispositivo, segun la reivindicacion 2, en el que una fuente de muestra de fluido es sangre capilar, suero o plasma.
  9. 9. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que dicho dispositivo de inmunoensayo es un dispositivo inmunocromatografico que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de prueba, en el que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito y en el que el dispositivo comprende ademas una estructura conjugada acoplada fluidicamente a la membrana en un extremo proximo, de manera que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fraction informadora conjugada a la misma de manera que el analito es una protelna Z-AAT presente en una muestra de un portador de gen PiZ, en el que el anticuerpo de captura es:
    anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093; y en el que el anticuerpo detector es:
    anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092; o anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
  10. 10. Dispositivo, segun la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
  11. 11. Dispositivo, segun la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96,
    producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, y el anticuerpo detector es el
    anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
  12. 12. Dispositivo, segun la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96,
    producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, y el anticuerpo detector es el
    anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
  13. 13. Dispositivo, segun la reivindicacion 9, en el que la estructura conjugada es una almohadilla conjugada que se superpone parcialmente con la membrana en el extremo proximo de la membrana.
  14. 14. Dispositivo, segun la reivindicacion 9, que comprende ademas un sistema separador de sangre para recibir la muestra, en el que el sistema de separacion de la sangre esta acoplado fluidicamente a la estructura conjugada.
  15. 15. Dispositivo, segun la reivindicacion 14, en el que el sistema de separacion de sangre se superpone parcialmente a la almohadilla conjugada.
  16. 16. Dispositivo, segun la reivindicacion 14, que comprende ademas una estructura distal acoplada fluidicamente a la membrana en un extremo distal de la misma, de manera que la estructura distal esta configurada para proporcionar suficiente paso de la muestra desde el extremo proximo al extremo distal de la membrana.
  17. 17. Dispositivo, segun la reivindicacion 16, en el que la estructura distal es una almohadilla absorbente configurada para proporcionar suficiente flujo de la muestra desde el extremo proximo de la membrana hasta, como mlnimo, una zona de control por accion capilar.
  18. 18. Dispositivo, segun la reivindicacion 9, en el que la membrana comprende ademas una zona de control que tiene un anticuerpo de control unido a la misma, de manera que el anticuerpo de control es capaz de unirse con un reactivo de deteccion.
  19. 19. Dispositivo, segun la reivindicacion 18, en el que el anticuerpo de control es un IgG anti-raton.
  20. 20. Procedimiento para determinar un portador de gen PiZ, cuyo procedimiento comprende:
    someter una muestra de un sujeto a inmunocromatografla utilizando el dispositivo de la reivindicacion 9; y determinar la union del analito al anticuerpo de captura, de manera que la union del analito al anticuerpo de captura indica que el sujeto es un portador de PiZ.
  21. 21. Procedimiento, segun la reivindicacion 20, en el que el portador de PiZ tiene un fenotipo que es una combinacion alelica que tiene un alelo PiZ.
  22. 22. Procedimiento, segun la reivindicacion 20, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093, y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
  23. 23. Procedimiento, segun la reivindicacion 20, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
  24. 24. Procedimiento, segun la reivindicacion 20, en el que el anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal LG96, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092, y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal MG97, producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
  25. 25. Procedimiento, segun la reivindicacion 21, en el que el fenotipo es PiZZ, PiMZ, PiSZ, o PiZ/nulo.
  26. 26. Procedimiento para diagnosticar un estado o enfermedad asociada con deficiencia de AAT, cuyo procedimiento comprende:
    someter una muestra del sujeto a inmunocromatografla utilizando el dispositivo de la reivindicacion 9; y determinar la union del analito al anticuerpo de captura, de manera que la union del analito al anticuerpo de captura indica que el sujeto tiene dicho estado o enfermedad.
  27. 27. Procedimiento para determinar la predisposicion de un sujeto en desarrollar un estado o enfermedad asociado con deficiencia de AAT, cuyo procedimiento comprende:
    someter una muestra del sujeto a inmunocromatografla utilizando el dispositivo de la reivindicacion 9; y determinar la union del analito al anticuerpo de captura, de manera que la union del analito al anticuerpo de captura
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    es indicativa de la predisposicion del sujeto a desarrollar dicho estado o enfermedad.
  28. 28. Dispositivo, segun la reivindicacion 1, en el que dicho dispositivo comprende: una zona de aplicacion de la muestra;
    una membrana microporosa que tiene una zona de captura de protelna Z-AAT definida por un anticuerpo de captura
    inmovilizado a la misma, en el que el anticuerpo de captura es LG96, producido por celulas de hibridoma
    depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092;
    una trayectoria de flujo desde la zona de aplicacion de la muestra a la zona de captura de la protelna Z-AAT, de
    manera que la presencia o cantidad de la protelna Z-AAT en una muestra de fluido se puede determinar por
    formacion de un complejo entre el anticuerpo de captura y la protelna Z-AAT que puede encontrarse presente en la muestra de fluido; y
    una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, de manera que la estructura conjugada comprende un reactivo de deteccion especifico para la protelna Z-AAT, siendo el reactivo de deteccion movil o movilizable, de manera que el reactivo de deteccion es LG96 conjugado de oro, producido por celulas de hibridoma depositadas con el n° de Acceso DSM ACC3092.
  29. 29. Procedimiento, segun la reivindicacion 20, en el que dicho procedimiento comprende:
    aplicar una muestra biologica del sujeto al dispositivo de inmunoensayo de la reivindicacion 28; y
    detectar un complejo que se forma entre el anticuerpo de captura y la protelna Z-AAT que puede encontrarse
    presente en la muestra de fluido, en el que la deteccion del complejo indica la presencia de la protelna Z-AAT en la
    muestra.
  30. 30. Kit que comprende:
    (a) el dispositivo de la reivindicacion 9; y
    (b) un anticuerpo detector que tiene una fraccion informadora conjugada al mismo
  31. 31. Anticuerpo monoclonal LG96 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3092.
  32. 32. Anticuerpo monoclonal MG97 producido por celulas de hibridoma depositadas con n° de Acceso DSM ACC3093.
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