KR101981806B1

KR101981806B1 - 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포 및 이를 포함하는 폐암 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101981806B1
Application number: KR1020130054180A
Authority: KR
Inventors: 오진건; 조성문; 송봉준; 최은화; 조제열; 성혜진
Original assignee: 엘지전자 주식회사; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2019-05-23
Also published as: KR20140134400A

Abstract

본 발명은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(Quescin-sulfhydryl oxidase 1 : QSOX 1)에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포 및 이를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 대한 것으로, 특히 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열(항원결합부위(epitope))에 상응하는 결합부위를 가짐으로서 상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질과 높은 반응성을 가지기 때문에, 더욱 명확하게 폐암을 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포 및 이를 포함하는 폐암 진단용 조성물{Quescin-sulfhydryl oxidase 1 specific antibody, Hybridoma cell producing the same, and Composition for diagnosis of lung cancer having the same}

본 발명은 폐암 조직에서 발현이 증가하거나 감소하는 폐암 특이적인 단백질 마커를 더욱 명확하게 확인하기 위한 폐암 진단용 조성물과, 상기 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 대한 것이다.

폐암 환자는 조기진단이 중요하기 때문에, 빠르고 간편하며 정확하게 진단할 수 있는 새로운 방법이 필요하다. 따라서, 폐암의 스크리닝의 개념에서 객담검사 분석(sputum assay) 또는 흡인액(bronchial aspiration)을 통한 세포학(cytology) 검사방법이 사용되어 왔다. 그러나, 상기 방법들도 진단율이 낮아 스크리닝 개념에서의 그 유용성은 여전히 의문시되고 있다.

이러한 점에서 정상과 그렇지 않은 병적 상태를 구별하는 물질인 바이오마커의 발굴은 다른 질병에서와 마찬가지로 폐암에서 매우 필요한 부분이다. 바이오마커란 신체의 생리, 병태학적 상황을 진단할 수 있는 모든 물리적, 생화학적 지표를 일컫는 단어로서, 바이오마커의 범주에는 모든 생물학적 물질인 DNA, RNA, 단백질(protein) 뿐만 아니라, 이미징 혹은 생리학적인 검사방법들도 모두 포함된다. 하지만 생물학적 기능 물질로서 단백질은 여러 종류의 바이오마커 중 가장 신체 내의 상황을 잘 대변하며, 따라서 좋은 바이오마커가 될 수 있다.

한편, 본 발명자들은 대한민국 공개특허 제2013-0040293호에서 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(Quescin-sulfhydryl oxidase 1; QSOX1) 단백질이 폐암에서 특이적으로 높게 발현된다는 점을 밝힘으로써 새로운 폐암 진단용 바이오마커로 발굴하였다. 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)은 티오레독신(thioredoxin)과 ERV1 도메인을 포함하는 효소이다. 현재 섬유아세포(fibroblast)에서 세포 증식 주기에서 휴지기로 들어갈 때 그 발현이 증가되는 것으로 알려져 있으며, 이로부터 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 단백질이 세포 증식의 조절에 중요한 역할을 한다고 추측할 수 있다. 그러나, 상기 대한민국 공개특허 제2013-0040293호에서는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 단백질이 폐암 진단용 바이오마커로 사용될 수 있는 가능성만을 확인하였을 뿐, 상업적인 바이오마커로 사용하기 위한 반응성에 대한 연구는 이루어지지 못했다.

이에 따라, 폐암 특이적인 단백질 마커를 더욱 명확하게 확인하기 위한 폐암 진단용 조성물에 대한 연구는 항시 필요한 실정이다.

또한, 이러한 단백질 바이오마커를 활용한 진단 방법을 개발하기 위해서는 좋은 민감도를 갖는 항체의 개발이 절실히 요구되고 있으며, 특히 지속적으로 동일한 항체의 생산을 위해서는 단일클론항체의 개발이 필수적이다. 그러나, 현재까지 QSOX1에 대한 단일클론항체의 개발은 전혀 이루어진 바 없다.

즉, 폐암에 높게 발현되는 폐암 특이적 마커인 QSOX1에 대한 항체의 제작과 이를 이용한 진단제의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질과 높은 반응성을 가짐으로서, 더욱 명확하게 폐암을 진단할 수 있는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이 목적이다.

또한, 본 발명은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1 항원(QSOX1)에 대한 결합 특이성이 높아서 폐암특이 진단에 매우 유용한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물은, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(Quescin-sulfhydryl oxidase 1 : QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 상기 단백질은 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 것이 특징이다.

여기서, 상기 단백질은 서열번호 6의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명의 다른 양태는, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 폐암 진단용 조성물이다.

여기서, 상기 항체는 서열번호 6의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질을 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하고, 상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 서열을 가지는 폐암 진단용 조성물이다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는, 폐암 마커인 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 상기 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상의 단백질을 검출하는 방법으로서, 상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것을 특징으로 하는 방법이다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포이다.

여기서, 상기 하이브리도마 세포는 단일클론항체를 생산하는 KCTC 12366BP 인 것이 가능하다.

상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것이 바람직하고, 그 중에서도 서열번호 6의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는 상술한 하이브리도마 세포에 의해 생산되며, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체이다.

또한, 본 발명은 상술한 하이브리도마 세포에 의해 생산되며, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체일 수 있다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

상기한 본 발명은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체나 프라이머 또는 프로브가 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열(항원결합부위(epitope))에 상응하는 결합부위를 가짐으로서, 상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질과 높은 반응성을 가지기 때문에, 더욱 명확하게 폐암을 진단할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상기한 항체나 프라이머 또는 프로브를 포함하여, 폐암의 조기 진단에 유용하게 쓰일 수 있는 민감성 및 특이성이 뛰어난 폐암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 하이브리도마 세포 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 항원에 대한 결합 특이성이 높아서, 폐암특이 진단에 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 전체 서열(full sequence)에서 면역원성(immunogenicity)이 높은 부위를 선택하기 위한 항원결합부위 분석(epitope analysis) 결과를 나타내는 그래프이다(왼쪽(L)은 소수성(Hydrophobicity)을 나타내는 것이고, 오른쪽(R)은 친수성(Hydrophilicity)을 나타내는 것이다).
도 2 내지 도 4는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 펩타이드 1(Peptide #1), 펩타이드 5(Peptide #5) 및 펩타이드 8(Peptide #8)에서 면역원성이 높은 부위를 선택하기 위한 항원결합부위 분석 결과를 나타내는 그래프이다(왼쪽은 소수성을 나타내는 것이고, 오른쪽은 친수성을 나타내는 것이다).
도 5 내지 도 11은 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 배양된 세포의 배양액을 항체로 이용해서, 3종류의 펩타이드(펩타이드 1, 5, 8) 면역원에 대하여 ELISA 실험을 한 7개 플레이트(PL1 : plate 1, PL2 : plate 2, PL3 : plate 3, PL4 : plate 4, PL5 : plate 5, PL6 : plate 6, PL7 : plate 7) 상의 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 단일 세포(single cell)로 분리된 배양액을 항체로 이용해서, 3종류의 펩타이드(펩타이드 1, 5, 8) 면역원에 대하여 ELISA 실험을 한 결과이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 하이브리도마 세포(7H10 QSOX1_5)의 상층액이 임상 시료에 존재하는 단백질에도 반응을 하는지 확인하기 위해, 폐암 환자(#800, #940, #942) 시료를 대상으로 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다(대조군 : 시판중인 항체(Peprotech)).

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물은, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(Quescin-sulfhydryl oxidase 1 : QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 상기 단백질은 서열번호 2, 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 것이 특징이다. 바람직하게는 상기 폐암 진단용 조성물은 상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함한다.

종래에 본 발명자들은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 단백질이 폐암 진단용 바이오마커로 사용될 수 있는 가능성을 확인하였으나, 상기 단백질 전체를 상업적인 바이오마커로 제품화하기에는 반응성이 미흡하였다. 이에, 추가적인 연구를 거듭한 결과 상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 단백질 중에서도 서열번호 2, 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 단백질 서열이 항원결합부위(epitope)로 사용하기에 바람직하다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다. 더욱 바람직하게는 상기 단백질이 서열번호 6의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 것이 적합하다.

이에 따라, 본 발명은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 상기 단백질은 서열번호 2, 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 것이 특징이다. 다시 말해서, 본 발명은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 폐암 진단용 조성물일 수 있다. 여기서, 상기 항체는 서열번호 6의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것이 더욱 바람직하다.

이러한 본 발명은 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질 중에서도 특정 단백질 서열을 항원의 항원결합부위(epitope) 및/또는 이에 상응하는 항체의 결합부위로 이용함으로서, 상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질과 높은 반응성을 가지기 때문에, 더욱 명확하게 폐암을 진단할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "폐암"은 폐에 발생하는 악성종양을 의미하며, 조직학적으로는 폐선암, 편평상피암, 대세포폐암 및 소세포폐암을 모두 포함한다.

본 발명에서 항체는 전체 형태의 항체(이하 "전항체"라고 함) 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서, 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위(epitope)를 인식하는 것을 의미한다.

상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 단일쇄 가변영역(scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.

상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 통상 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어진다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 하는 폐암 진단용 마이크로 어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.

상기 프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산 서열로서 상보적인 템플리트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플리트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다.

상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수 개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 공지된 바와 같이 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법, 올리고뉴클레오타이드 연장 분석, 대립형질 특이적 PCR법, RNase 불일치 절단, 단일가닥 입체 다형화, SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE), 변성 고압 액체 크로마토그래피, 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션, 인시츄 하이브리다이제이션 및 마이크로어레이 방법 등이 있다.

상기 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함될 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명의 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 유전자(서열번호 2, 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 단백질 서열을 가지는 유전자)에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등이 있다.

또한, 본 발명은 폐암 마커인 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(Quescin-sulfhydryl oxidase 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(서열번호 2, 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것)를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 상기 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상의 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 폐암 마커인 상기 단백질 서열들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 이들 단백질을 검출하여, 폐암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질들 또는 이것을 포함하는 시료액을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 전이하여 고정시킨 후, 상기 단백질들에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, 이들 단백질의 발현 수준을 측정한다. 즉, 폐암 환자와 정상인의 조직에서 이들 단백질의 발현 수준을 측정하고 비교하여, 폐암 환자의 조직에서의 이들 단백질의 발현 수준이 정상인의 조직에서 보다 높으면, 폐암을 갖는 것으로 진단하거나 폐암의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.

상기 생물학적 시료는 포유동물로부터 수득된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 소변과 같은 시료를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등으로 전처리할 수 있다.

상기 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.

상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능 면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 양태는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포이다. 이러한 하이브리도마 세포는 폐암 진단용으로 유용한 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태는 상술한 하이브리도마 세포에 의해 생산되며, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체이다. 또한, 본 발명은 상술한 하이브리도마 세포에 의해 생산되며, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체일 수 있다.

여기서, 상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것이 바람직하고, 그 중에서도 서열번호 6의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 항체는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질과 높은 반응성을 가지기 때문에, 더욱 명확하게 폐암을 진단할 수 있는 효과가 있다.

그리고, 상기 하이브리도마 세포는 단일클론항체를 생산하는 KCTC 12366BP 인 것이 가능하다. 본 발명의 단일클론항체는 하이브리도마 세포(KCTC12366BP)에 의해 생산되고, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 단일클론항체를 얻기 위해서는, 먼저 이를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 마우스를 면역화시켜야 한다. 이 과정에서 본 발명자들은 반응성이 우수한 항체를 생성하기 위하여 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 전체 단백질 서열로부터 구조적으로 외부로 도출될 가능성이 높은 단백질 서열 8개를 1차로 선정하였고, 그것들의 소수성 및 친수성을 바탕으로 면역원성이 높을 것으로 예상되는 단백질 서열 3개를 2차로 선정하였다(나아가, 이들에 대한 검증을 통하여 그 중에서도 가장 바람직한 단백질 서열 1개를 최종적으로 도출하였다.)

다시, 본 발명에 따른 단일클론항체를 얻기 위해서는, 상기와 같이 선정된 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)를 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS)에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강 내에 1차 주사한다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 혈청 아밀로이드 Ａ와 동일한 부피의 프로인트 불완전 아주반트(incomplete Freund's adjuvant, Sigma)를 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강 내에 2차 주사한다. 2차 면역화 후 2주 후에 3차 면역화하고, 마지막 면역화한 후 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 혈청 아밀로이드 Ａ를 마우스의 꼬리 정맥에 부스터(booster) 주사한다. 상기 면역화된 마우스의 혈청을 채취하여 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인하고, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 적출한다. 적출된 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 넣어 세포융합시키고 배양한다.

상기 융합세포군 중에서 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 선별된 융합세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법(limiting dilution)을 사용하여 융합세포를 희석한 후, 하나의 세포로부터 증식한 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택한다. 최종적으로 선택한 융합세포를 "7H10 QSOX1 1-5"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2013년 02월 06일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC12366BP).

본 발명에 따른 하이브리도마 세포(7H10 QSOX1 1-5) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1 항원(QSOX1)의 발현 수준이 높게 나타난다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(7H10) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1 항원(QSOX1)에 대한 결합 특이성이 모두 높음을 알 수 있다.

본 발명의 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 폐암 진단 키트는, 폐암 마커인 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 발현 수준을 측정하여, 폐암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 구체적으로, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 또는 이것을 포함하는 시료액을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 전이하여 고정시킨 후, 고정된 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 발현 수준을 측정한다. 즉, 폐암 환자와 정상인의 혈청에서 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 발현 수준을 측정하고 비교하여, 폐암 환자 혈청에서의 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 발현 수준이 정상인의 혈청에서보다 높으면, 폐암을 갖는 것으로 진단하거나 폐암의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료 중 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 키트를 제공한다.

상기 폐암 진단 키트는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 단백질을 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 폐암 진단 키트는 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있다.

상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.

상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.

세척액은 인산염 완충액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 마우스의 면역화 ( Immunization )

실시예 1-1. 면역원 제조 ( Immunogen Preparation )

먼저, 펩타이드 면역원을 사용한 항체를 제작하였다. 즉, 전체 단백질의 일부분의 펩타이드 서열을 항원으로 사용하여 항체를 제작하였다. 구체적으로는, 항체 제작이 잘되는 면역원성(immunogenicity)이 높은 부위를 선택하기 위하여, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 단백질 전체 서열(sequence, 서열번호 1)을 분석하여 에피토프 분석을 수행하였다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 전체 서열(full sequence)에서 면역원성(immunogenicity)이 높은 부위를 선택하기 위한 항원결합부위 분석(epitope analysis) 결과를 나타내는 그래프이다(왼쪽(L)은 소수성(Hydrophobicity)을 나타내는 것이고, 오른쪽(R)은 친수성(Hydrophilicity)을 나타내는 것이다).

여기에 나타난 바와 같이, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 전체 단백질 구조 분석을 통하여, 단백질의 4차원적 구조를 아미노산의 친수성과 소수성 성질을 통해 예측하였고, 이에 따라 4차원 구조에서 밖(외부)으로 표출될 가능성이 있는 8개의 펩타이드를 선정하였다. 상기 8개의 펩타이드는 일반적인 에피토프 길이에 해당하는 12~16개의 아미노산으로 선정하였다.

상기 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 전체 서열(서열번호 1)과, 이 중에서 선정된 8개의 1차 후보 펩타이드 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

구분	서열번호	단백질 서열
전체 서열	서열번호1	MRRCNSGSGP PPSLLLLLLW LLAVPGANAA PRSALYSPSD PLTLLQADTV RGAVLGSRSA WAVEFFASWC GHCIAFAPTW KALAEDVKAW RPALYLAALD CAEETNSAVC RDFNIPGFPT VRFFKAFTKN GSGAVFPVAG ADVQTLRERL IDALESHHDT WPPACPPLEP AKLEEIDGFF ARNNEEYLAL IFEKGGSYLG REVALDLSQH KGVAVRRVLN TEANVVRKFG VTDFPSCYLL FRNGSVSRVP VLMESRSFYT AYLQRLSGLT REAAQTTVAP TTANKIAPTV WKLADRSKIY MADLESALHY ILRIEVGRFP VLEGQRLVAL KKFVAVLAKY FPGRPLVQNF LHSVNEWLKR QKRNKIPYSF FKTALDDRKE GAVLAKKVNW IGCQGSEPHF RGFPCSLWVL FHFLTVQAAR QNVDHSQEAA KAKEVLPAIR GYVHYFFGCR DCASHFEQMA AASMHRVGSP NAAVLWLWSS HNRVNARLAG APSEDPQFPK VQWPPRELCS ACHNERLDVP VWDVEATLNF LKAHFSPSNI ILDFPAAGSA ARRDVQNVAA APELAMGALE LESRNSTLDP GKPEMMKSPT NTTPHVPAEG PEASRPPKLH PGLRAAPGQE PPEHMAELQR NEQEQPLGQW HLSKRDTGAA LLAESRAEKN RLWGPLEVRR VGRSSKQLVD IPEGQLEARA GRGRGQWLQV LGGGFSYLDI SLCVGLYSLS FMGLLAMYTY FQAKIRALKG HAGHPAA
펩타이드1	서열번호2	C-DVQTLRERLIDALE (142~155aa, 15mer)
펩타이드2	서열번호3	C-KLADRSKIYMADLE (292~305aa, 15mer)
펩타이드3	서열번호4	C-DDRKEGAVLAK (376~386aa, 12mer)
펩타이드4	서열번호5	C-RQNVDHSQEAAKAKE (420~434aa, 16mer)
펩타이드5	서열번호6	C-RLAGAPSEDPQFPK (487~500aa, 15mer)
펩타이드6	서열번호7	C-ESRNSTLDPGKPE (572~584aa, 14mer)
펩타이드7	서열번호8	C-EPPEHMAELQRNE (620~632aa, 14mer)
펩타이드8	서열번호9	C-DIPEGQLEARAGR (680~692aa, 14mer)

이어서는, 상기와 같이 1차 선정된 8개의 펩타이드를 대상으로, 상기 펩타이드의 아미노산 서열의 소수성 및 친수성에 따라 면역원성이 높을 것으로 예상되는 단백질 서열 3개(펩타이드 1, 5, 8)를 2차로 선정하였다.

도 2 내지 도 4는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 펩타이드 1(Peptide #1), 펩타이드 5(Peptide #5) 및 펩타이드 8(Peptide #8)에서 면역원성이 높은 부위를 선택하기 위한 항원결합부위 분석 결과를 나타내는 그래프이다(왼쪽은 소수성을 나타내는 것이고, 오른쪽은 친수성을 나타내는 것이다).

도 2는 본 발명에 따른 첫 번째 펩타이드(#1)로서 GSGAVFPVAG ADVQTLRERL IDALESHHDT WPPACPPLEP (131-170aa)를 포함하는 아미노산 서열의 소수성 및 친수성을 나타내는 것이고, 도 3은 본 발명에 따른 두 번째 펩타이드(#5)로서 NAAVLWLWSS HNRVNARLAG APSEDPQFPK VQWPPRELCS (471-510aa)를 포함하는 아미노산 서열의 소수성 및 친수성을 나타내는 것이며, 도 4는 본 발명에 따른 세 번째 펩타이드(#8)로서 VGRSSKQLVD IPEGQLEARA GRGRGQWLQV LGGGFSYLDI (671-710aa)를 포함하는 아미노산 서열의 소수성 및 친수성을 나타내는 것이다.

여기에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질 서열(펩타이드 1, 5, 8)은 친수성이 높고, 소수성이 낮아서 면역원성이 높을 것으로 기대된다.

본 발명에 따른 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 단백질은 크게 QSOX1_L과 QSOX1_S 두 개의 아형단백질을 가지는데, 상기 펩타이드 8은 transmembrane domain을 포함하는 부분이어서 QSOX1의 splicing variant 중 QSOX1_L에만 존재하는 부분이고, 상기 펩타이드 1과 5는 두 variant 모두에 동일하게 존재하는 부분이기 때문에, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1) 검출을 위한 마커로는 펩타이드 8 보다는 펩타이드 1과 5이 더욱 바람직하다.

실시예 1-2 : 마우스의 면역화

하이브리도마 세포의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 상기 실시예 1-1을 통해 선정된 3개의 펩타이드 혼합물을 준비하였다. 그런 다음, 상기 준비한 펩타이드 혼합물(30 ㎍/㎕)을 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 150 ㎕에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다.

상기 에멀젼을 6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강 내에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1 150 ㎕와 동일한 부피의 프로인트 불완전 아주반트 (incomplete Freund's adjuvant, Sigma)를 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강 내에 2차 주사하였다. 2차 면역화 후 2주 후에 3차 면역화하였다. 마지막 면역화로부터 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1 10~30 ㎍/㎕를 마우스의 꼬리 정맥에 부스터(booster) 주사하였다.

상기 면역화된 마우스를 에테르로 마취시킨 후 헤파린 처리된 주사기로 심장에서 채혈한 후, 혈액을 4℃에서 하룻밤 정치시키고 원심분리(3000 rpm, 10분)하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 적당히 나누어 -80℃에 보관하였다.

실시예 2 : 세포 융합 ( Fusion )

실시예 2-1 : 세포 융합

먼저, 세포융합을 위해 골수종 세포(myeloma cell)를 준비하였다. 골수종 세포인 SP2/O 세포를 배양하고, 세포밀도를 2.5 ~ 5×10⁴/㎖로 하였다. 세포융합 24시간 전에 SP2/O 세포를 1/3로 희석하여 준비하였다.

상기 실시예 1을 통해 면역화된 마우스의 혈청에서 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인한 후, 면역화된 마우스를 에테르로 마취시키고 몸통의 좌측에 위치한 비장세포(spleen cell)를 적출하였다. 적출된 비장세포를 SF-DMEM2(DMEM + 2×AA)로 세척하고 3 ㎖ 시린지 2개를 이용하여 비장세포를 용출시켰다. 세포 현탁액을 수거하여 튜브에 담고 정치시켜 무거운 덩어리들을 가라앉히고 상층액을 새 튜브로 옮긴 다음 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 비장세포를 원심분리 하는 동안 상기 SP2/0 세포 플라스크의 세포를 모두 수거하여 50 ㎖ 튜브에 준비하였다. 원심분리된 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한(tapping) 후 SF-DMEM2를 채웠다. 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 각각 원심분리하고 세척한 다음, 상기 세척과정을 1회 더 반복하였다. 세척한 SP2/0 세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 또한, 세척한 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후, LB(lysis buffer) 1 ㎖에 적혈구(RBC, red blood cell)를 넣어 처리한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 그 다음, 비장세포와 SP2/O 세포를 각각 1500 rpm에서 5분간 원심분리하고, 원심분리된 비장세포와 SP2/O 세포의 상층액을 제거한 다음 탭핑 후 SF-DMEM2 10 ㎖를 채웠다. 비장세포와 SP2/O 세포를 각각 e-튜브에서 100배로 희석하고 계수하여 농도를 결정하였으며, 하기 표 2에 나타난바와 같이 비장세포와 SP2/O 세포는 10:1의 비율로 결정하였다.

비장세포	SP2 /0 세포	PEG
1×10⁸	1×10⁷	2 ㎖
8×10⁷	8×10⁶	1.5 ㎖
5×10⁷	5×10⁶	1 ㎖

그런 다음, 상기와 같이 결정된 농도의 비장세포와 SP2/O 세포를 튜브에 함께 넣고 500 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 제거한 후 알콜솜 위에 엎어 놓고 30초~1분 동안 반건조시키고 탭핑하였다. 여기에 PEG (sigma; 2 ㎖, 1.5 ㎖, 1 ㎖)를 천천히 넣으면서 1분 동안 천천히 피펫팅하여 반응시키고, SF-DMEM2를 넣으면서 튜브를 흔들어준 다음 50 ㎖를 채웠다. 500 rpm에서 10분 간 원심분리 후 상층액을 제거하고 탭핑하지 않은 상태에서 HT 배지 [HT 50×(HT(sigma) 1 vial + SF-DMEM1 10㎖) 1 ㎖, FBS 10 ㎖, SF-DMEM1(DMEM + 1×AA) 30 ㎖] 10 ㎖를 방울방울 떨어뜨리고, 조금씩 속도를 올리면서 50 ㎖가 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 37℃, 5% CO₂배양기에서 3시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 세포를 500 rpm에서 10분 간 원심분리한 후 분리된 융합 세포의 상층액은 조심스럽게 제거하고, HAT 배지 [HAT 50×(HAT(sigma) 1 vial + SF-DMEM1 10㎖) 4 ㎖, FBS 40 ㎖, SF-DMEM1 105 ㎖, 혈액 1~1.5 ㎖, 흉선 세포 현탁액 50 ㎖]을 이용하여 펠릿(pellet)을 피페팅한 후 HAT 배지와 융합 세포를 천천히 섞어 주었다. 이를 96-웰 플레이트에 180 ㎕로 분주하고 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다.

여기서, 상기 흉선 세포 현탁액은 다음과 같은 방법으로 미리 준비하였다. 즉, 정상 마우스 3마리를 준비하여 각각 마취시킨 후 헤파린 처리된 시린지로 심장 채혈을 하였다. 정상 마우스의 흉선(thymus) 조직을 적출하고, 적출된 흉선 조직을 SF-DMEM2로 3회 세척한 후, 흉선 세포를 용출시켰다. 그리고, 세포 현탁액을 수거하여 튜브에 담고 37℃에 준비하였다.

실시예 2-2 : 융합세포 배양 및 ELISA 시험

상기 실시예 2-1에 따라 세포융합 후, 96-웰에서 cDMEM2로 배양하였다. 8~9일째에 배지를 교환하였고, 배지를 교환한 후 5~7일째에 색이 변한 웰의 상층액을 120 ㎕ 거두었으며, 여기에 다시 cDMEM2로 채운 후 ELISA 시험을 수행하였다. 마우스 네 마리의 비장으로부터 추출된 세포는 융합 후 총 7개의 96-웰 플레이트에 분주하였다. 각 플레이트의 클론의 세포 배양액은 각각 3종류의 펩타이드(펩타이드 1, 5, 8) 면역원이 코팅된 플레이트에서 ELISA 실험을 수행하였다. 본 ELISA 시험은 본 발명에 따른 융합세포의 QSOX1 항원에 대한 결합 특이성을 보기 위한 것이다.

ELISA 시험은 구체적으로 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 먼저 본 발명에 따른 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)의 펩타이드 각각을 항원으로 하여 100 ng/㎕ 씩을 각 웰에 코팅한 후 4℃에서 하룻밤을 두었다가 세척하였다.

그리고, 블로킹 용액(blocking solution) 150~200 ㎕을 상온에서 1시간 동안 처리한 후 세척하였다. 다음으로 1oAb (상기 배양한 세포배양액) 100 ㎕을 상온에서 1시간 동안 처리한 후 세척하고, 2oAb (블로킹 용액 : 항 마우스 면역글로불린 G HRP (Horseradish peroxidase) 결합항체 = 5000 : 1) 100 ㎕을 상온에서 1시간 동안 처리한 후 세척하였다. 다음으로 기질 완충액 (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate) 100 ㎕를 상온에서 5분 간 처리하고, 정지액 (stop solution) 50 ㎕를 처리한 후, 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.

도 5 내지 도 11은 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 배양된 세포의 배양액을 항체로 이용해서, 3종류의 펩타이드(펩타이드 1, 5, 8) 면역원에 대하여 ELISA 실험을 한 7개 플레이트(PL1 : plate 1, PL2 : plate 2, PL3 : plate 3, PL4 : plate 4, PL5 : plate 5, PL6 : plate 6, PL7 : plate 7) 상의 결과이다. 각 ㅍ프플레이트의 H12 well 은 positive control로 final serum 을 1:1000로 dilution 하여 50ul씩 1oAb 로 loading 한 것이다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 7번째 플레이트의 H열 10번 클론(7H10 클론)이 항원 펩타이드 #1, #5와 #8에 면역 반응을 보이는 유일한 클론으로 확인되었다.

이어서는, 상기 7H10 클론이 포함된 웰을 선택하여 24-웰로 옮겨서 다시 배양하였고, 24-웰에서 배양한 후 다시 ELISA 시험을 수행하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 3가지 면역원에 대한 7H10 클론의 ELISA 결과는 대조군보다 높은 흡광도를 보이고 있고, 그 중에서도 펩타이드 5와 8의 흡광도가 높은 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.

	펩타이드 #1	펩타이드 #5	펩타이드 #8	대조군
7 H10	0.547	1.527	1.806	0.325

실시예 3 : 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 실시예 2에 따라 면역반응을 보이는 7H10 클론을 parent 클론으로 하여, 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하였다. 이는 상기 96웰에서 선택된 7H10 세포에서, 하나의 세포로부터 출발하는 단일클론을 생산하는 하이브리도마 세포(7H10 QSOX1_5 세포)를 선별하기 위한 것이다.

상기 실시예 2에서 제조한 융합세포 중에서 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX1)에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 항체의 생성여부를 확인하기 위하여 효소면역방법(ELISA)을 이용하여 스크리닝하였다.

단일 세포(single cell)로 유래된 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 희석법(dilution assay)을 사용하였으며, 이는 빠르고 간편하지만 단일 세포로 유래되었다고 확신하기에 부족하므로 2번 실시하는 것이 바람직하다. 단일 클론을 찾기 위해 아래의 방법을 3번 진행하여 단일세포 분리를 실시하였다.

먼저, 24-웰의 몇 부분을 선정하여 5 ㎕씩 따서 96-웰의 1번 라인(각 웰마다 5 ㎕의 세포)으로 옮기고, 각각 배양액 100 ㎕로 채워주었다. 다음으로 1번 라인의 세포를 1/2로 희석하여 2번 라인으로 옮기고, 각각 배양액을 채워주었다. 같은 방법으로 12번 라인까지 희석하여 준비하고 배양하였다. 세포가 적당히 자랐을 때 ELISA로 확인한 후 24-웰로 옮겨 배양하였다.

1차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 24-웰로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 2차 스크리닝을 수행하였다. 24-웰에서 키운 융합세포에서 복수(ascites)를 만든 세포를 선택하고 나머지는 동결시켜 보관하였다. 선택된 세포는 25T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 그 결과는 도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 5가 가장 높은 반응성을 나타내었다. 이러한 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다. 최종적으로 선택한 융합세포를 "7H10 QSOX1 1-5"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2013년 02월 06일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC12366BP).

실시예 4 : 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 검증

면역원으로 사용된 펩타이드에 대해 반응을 보인 클론(7H10)의 상층액이 임상 시료에 존재하는 단백질에도 반응을 하는지 확인하기 위해, 웨스턴 블럿을 수행하였다. 현재 QSOX1의 정제된 단백질은 없는 상황이므로, 폐암 환자의 조직 단백질을 이용한 검증을 실시하였다.

즉, 3명의 폐암 환자(#800, #940, #942)로부터 폐암 조직 용해물(lysate)(LC : lung cancer)과 정상 폐조직 용해물(N : normal)을 각각 5 ㎍씩 추출하고, SDS-PAGE에 로딩하여 단백질을 분리한 후 각각 시판중인 항체(Peprotech 사)와 본 발명에 따른 7H10 QSOX1_5 하이브리도마 세포 상층액으로 검출하였다.

도 13은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 하이브리도마 세포(7H10 QSOX1_5)의 상층액이 임상 시료에 존재하는 단백질에도 반응을 하는지 확인하기 위해, 폐암 환자(#800, #940, #942) 시료를 대상으로 웨스턴 블럿을 수행한 결과이다(대조군 : 시판중인 항체(Peprotech)).

여기에 나타난 바와 같이, QSOX1은 크게 QSOX1_L과 QSOX1_S 두 개의 아형단백질로 존재하는데, Peprotech사의 항체로 확인한 결과를 보면 아래쪽의 두꺼운 밴드(약 55kD 부위)가 QSOX1_S 단백질인 것으로 보여지고, 윗쪽의 얇은 밴드가 QSOX1_L인 것으로 확인된다. 즉, Peprotech사의 항체는 정상 폐조직 용해물(N : normal)과는 반응하지 않고, 폐암 조직 용해물(lysate)(LC : lung cancer)하고만 반응하고 있음을 알 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따른 7H10 QSOX1_5 하이브리도마 세포 상층액을 이용하는 경우에도, #940, #942 환자의 경우 정상 폐조직 용해물(N : normal)과는 반응하지 않고, 폐암 조직 용해물(lysate)(LC : lung cancer)하고만 반응하고 있음을 알 수 있다. 다만, #800 환자에서는 QSOX1_L의 결과가 다소 구분이 어렵지만 QSOX1_S 단백질에서는 뚜렷하게 폐암환자의 조직에서 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

도 13에서 본 단백질에 대한 밴드 이외 아래쪽에 나타난 비특이적 밴드들은 웰의 상층액을 사용함으로써 발생한 것으로 예상되며, 항체의 정제 후에는 비특이적 밴드가 나타나지 않을 것으로 보인다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)

KCTC12366BP

20130206

<110> LG ELCTRONIS INC. SNU R&DB FOUNDATION <120> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 specific antibody, Hybridoma cell producing the same, and Composition for diagnosis of lung cancer having the same <130> 0001 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 747 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 1 Met Arg Arg Cys Asn Ser Gly Ser Gly Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Asn Ala Ala Pro Arg 20 25 30 Ser Ala Leu Tyr Ser Pro Ser Asp Pro Leu Thr Leu Leu Gln Ala Asp 35 40 45 Thr Val Arg Gly Ala Val Leu Gly Ser Arg Ser Ala Trp Ala Val Glu 50 55 60 Phe Phe Ala Ser Trp Cys Gly His Cys Ile Ala Phe Ala Pro Thr Trp 65 70 75 80 Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val Lys Ala Trp Arg Pro Ala Leu Tyr Leu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Cys Ala Glu Glu Thr Asn Ser Ala Val Cys Arg Asp 100 105 110 Phe Asn Ile Pro Gly Phe Pro Thr Val Arg Phe Phe Lys Ala Phe Thr 115 120 125 Lys Asn Gly Ser Gly Ala Val Phe Pro Val Ala Gly Ala Asp Val Gln 130 135 140 Thr Leu Arg Glu Arg Leu Ile Asp Ala Leu Glu Ser His His Asp Thr 145 150 155 160 Trp Pro Pro Ala Cys Pro Pro Leu Glu Pro Ala Lys Leu Glu Glu Ile 165 170 175 Asp Gly Phe Phe Ala Arg Asn Asn Glu Glu Tyr Leu Ala Leu Ile Phe 180 185 190 Glu Lys Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Arg Glu Val Ala Leu Asp Leu Ser 195 200 205 Gln His Lys Gly Val Ala Val Arg Arg Val Leu Asn Thr Glu Ala Asn 210 215 220 Val Val Arg Lys Phe Gly Val Thr Asp Phe Pro Ser Cys Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Phe Arg Asn Gly Ser Val Ser Arg Val Pro Val Leu Met Glu Ser Arg 245 250 255 Ser Phe Tyr Thr Ala Tyr Leu Gln Arg Leu Ser Gly Leu Thr Arg Glu 260 265 270 Ala Ala Gln Thr Thr Val Ala Pro Thr Thr Ala Asn Lys Ile Ala Pro 275 280 285 Thr Val Trp Lys Leu Ala Asp Arg Ser Lys Ile Tyr Met Ala Asp Leu 290 295 300 Glu Ser Ala Leu His Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Val Gly Arg Phe Pro 305 310 315 320 Val Leu Glu Gly Gln Arg Leu Val Ala Leu Lys Lys Phe Val Ala Val 325 330 335 Leu Ala Lys Tyr Phe Pro Gly Arg Pro Leu Val Gln Asn Phe Leu His 340 345 350 Ser Val Asn Glu Trp Leu Lys Arg Gln Lys Arg Asn Lys Ile Pro Tyr 355 360 365 Ser Phe Phe Lys Thr Ala Leu Asp Asp Arg Lys Glu Gly Ala Val Leu 370 375 380 Ala Lys Lys Val Asn Trp Ile Gly Cys Gln Gly Ser Glu Pro His Phe 385 390 395 400 Arg Gly Phe Pro Cys Ser Leu Trp Val Leu Phe His Phe Leu Thr Val 405 410 415 Gln Ala Ala Arg Gln Asn Val Asp His Ser Gln Glu Ala Ala Lys Ala 420 425 430 Lys Glu Val Leu Pro Ala Ile Arg Gly Tyr Val His Tyr Phe Phe Gly 435 440 445 Cys Arg Asp Cys Ala Ser His Phe Glu Gln Met Ala Ala Ala Ser Met 450 455 460 His Arg Val Gly Ser Pro Asn Ala Ala Val Leu Trp Leu Trp Ser Ser 465 470 475 480 His Asn Arg Val Asn Ala Arg Leu Ala Gly Ala Pro Ser Glu Asp Pro 485 490 495 Gln Phe Pro Lys Val Gln Trp Pro Pro Arg Glu Leu Cys Ser Ala Cys 500 505 510 His Asn Glu Arg Leu Asp Val Pro Val Trp Asp Val Glu Ala Thr Leu 515 520 525 Asn Phe Leu Lys Ala His Phe Ser Pro Ser Asn Ile Ile Leu Asp Phe 530 535 540 Pro Ala Ala Gly Ser Ala Ala Arg Arg Asp Val Gln Asn Val Ala Ala 545 550 555 560 Ala Pro Glu Leu Ala Met Gly Ala Leu Glu Leu Glu Ser Arg Asn Ser 565 570 575 Thr Leu Asp Pro Gly Lys Pro Glu Met Met Lys Ser Pro Thr Asn Thr 580 585 590 Thr Pro His Val Pro Ala Glu Gly Pro Glu Ala Ser Arg Pro Pro Lys 595 600 605 Leu His Pro Gly Leu Arg Ala Ala Pro Gly Gln Glu Pro Pro Glu His 610 615 620 Met Ala Glu Leu Gln Arg Asn Glu Gln Glu Gln Pro Leu Gly Gln Trp 625 630 635 640 His Leu Ser Lys Arg Asp Thr Gly Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ser Arg 645 650 655 Ala Glu Lys Asn Arg Leu Trp Gly Pro Leu Glu Val Arg Arg Val Gly 660 665 670 Arg Ser Ser Lys Gln Leu Val Asp Ile Pro Glu Gly Gln Leu Glu Ala 675 680 685 Arg Ala Gly Arg Gly Arg Gly Gln Trp Leu Gln Val Leu Gly Gly Gly 690 695 700 Phe Ser Tyr Leu Asp Ile Ser Leu Cys Val Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 705 710 715 720 Phe Met Gly Leu Leu Ala Met Tyr Thr Tyr Phe Gln Ala Lys Ile Arg 725 730 735 Ala Leu Lys Gly His Ala Gly His Pro Ala Ala 740 745 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 2 Asp Val Gln Thr Leu Arg Glu Arg Leu Ile Asp Ala Leu Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 3 Lys Leu Ala Asp Arg Ser Lys Ile Tyr Met Ala Asp Leu Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 4 Asp Asp Arg Lys Glu Gly Ala Val Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 5 Arg Gln Asn Val Asp His Ser Gln Glu Ala Ala Lys Ala Lys Glu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 6 Arg Leu Ala Gly Ala Pro Ser Glu Asp Pro Gln Phe Pro Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 7 Glu Ser Arg Asn Ser Thr Leu Asp Pro Gly Lys Pro Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 8 Glu Pro Pro Glu His Met Ala Glu Leu Gln Arg Asn Glu 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Quescin-sulfhydryl oxidase 1 <400> 9 Asp Ile Pro Glu Gly Gln Leu Glu Ala Arg Ala Gly Arg 1 5 10

Claims

퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(Quescin-sulfhydryl oxidase 1 : QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고,
상기 단백질은 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 폐암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 서열번호 6의 단백질 서열을 항원결합부위(epitope)로 가지는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고,
상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 폐암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 6의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질을 인코딩하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하고,
상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 서열을 가지는 폐암 진단용 조성물.
폐암 마커인 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 상기 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상의 단백질을 검출하는 방법으로서,
상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
제7항에 있어서,
상기 하이브리도마 세포는 단일클론항체를 생산하는 KCTC 12366BP 인 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 6의 단백질 서열에 상응하는 결합부위를 가지는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포.
제7항 또는 제8항의 하이브리도마 세포에 의해 생산되며, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 항체.
제9항의 하이브리도마 세포에 의해 생산되며, 퀴에신-설프히드릴 옥시다제 1(QSOX 1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.