KR101753447B1 - 면역크로마토그래피 장치, 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

시험 시료에 분석물의 존재 또는 정량을 결정하기 위한 막-계 분석 장치, 방법 및 키트는 제공된다. 상기 면역크로마토그래피 장치는 시험 영역에서 포획 항체가 결합된 막을 포함하며, 여기서 상기 포획 항체는 분석물, 특히 PiZ 유전자 전달체로부터의 시료에 존재하는 Z-AAT 단백질과 결합할 수 있다.

Description

면역크로마토그래피 장치, 방법 및 키트 {IMMUNOCHROMATOGRAPHY DEVICES, METHODS AND KITS}
본 출원은 2010년 9월 24일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/386,214호 및 2011년 5월 05일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/482,867호의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체적인 내용은 본 발명에 참조로서 포함된다.
본 발명은 특이 결합을 포함하는 장치 및 분석, 특히 면역크로마토그래피 (immunochromatographic) 장치 및 분석에 관한 것이다.
다양한 분석적인 절차 및 장치는 시험 시료에 존재할 수 있는 분석물 (analytes)의 존재 및/또는 농도를 결정하기 위해 유동-통로 (flow-through) 분석에서 일반적으로 사용된다. 측방 유동 (lateral flow) 면역크로마토그래피 분석 또는 측방 유동 분석 (LFAs)으로 알려진, 측방 유동 시험 (Lateral flow test)은 예를 들어, 의학적 진단을 위한 현장 검사용 (point-of-care) (POC) 장치에서 일반적으로 사용된다. 개별적인 분석 레이아웃은 특정 제품에 대해 적용된다.
알파-1 항트립신 결핍 (Alpha-1 Antitrypsin Deficiency) (AATD)은 유전자 시험에 의해 진단할 수 있는, 유전적 질병 (hereditary disease)이다. 그러나, AATD는 잘 진단되지 않으며, 오직 10-15%만이 확인된다. 확인되지 않는 환자는 때때로 "일반적인" 만성 폐쇄 폐병 (chronic obstructive pulmonary disease) (COPD) 및 천식 (Asthma)으로 각각 오진한다.
분석물, 특히 Z-AAT 단백질의 존재를 결정하기 위한 효과적인 측방 유동 분석법에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 시험 영역 (test zone)에서 포획 항체 (capture antibody)가 결합된 막을 포함하는 면역크로마토그래피 장치를 제공한다. 상기 포획 항체는 분석물과 결합 가능하다. 상기 분석물은 PiZ 유전자 전달체 (gene carrier)로부터의 시료에 존재하는 Z-AAT 단백질 일 수 있다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 고정된 포획 항체에 의해 한정된 Z-AAT 단백질 포획 영역을 갖는 막을 포함하는 면역 분석 (immunoassay) 장치를 제공하고, 여기서 포획 항체는 항-Z-AAT 단백질 항체이다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 유동 시료에서 Z-AAT 단백질의 양 또는 존재를 결정하기 위한 면역 분석 장치를 제공한다. 상기 장치는:
시료 적용 영역;
막에 고정된 포획 항체에 의해 한정된 Z-AAT 단백질 포획 영역을 갖는 미세다공성 막, 여기서 상기 포획 항체는 LG96 또는 이의 항원-결합 단편 (fragment)이며;
상기 시료 적용 영역으로부터 상기 Z-AAT 단백질 포획 영역까지의 유로, 여기서 유체 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재 또는 양은 상기 포획 항체 및 상기 유체 시료에 존재할 수 있는 상기 Z-AAT 단백질 사이의 복합체의 형성에 의해 결정될 수 있으며; 그리고
상기 유로에 위치된 접합 구조 (conjugate structure)를 포함하며, 여기서 상기 접합 구조는 상기 Z-AAT 단백질에 특이적인 검출 시약 (detection reagent)을 포함하고, 상기 검출 시약은 이동하거나 이동가능하며, 여기서 상기 검출 시약은 금-접합된 LG96 또는 이의 금-접합된 항원-결합 단편이다.
어떤 관점에 있어서, 대상으로부터 Z-AAT 단백질을 검출하기 위한 방법은 제공된다. 상기 방법은:
본 발명의 면역분석 장치에 대상으로부터의 생물학적 시료를 적용시키는 단계; 및
상기 포획 항체 및 상기 유체 시료에 존재할 수 있는 Z-AAT 단백질 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계 단계를 포함하며, 여기서 상기 복합체의 검출은 상기 시료에 Z-AAT 단백질의 존재를 나타낸다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 PiZ 유전자 전달체를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 장치를 사용하여 면역크로마토그래피에 대상으로부터의 시료를 적용시키는 단계; 및 포획 항체에 분석물의 결합을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 포획 항체에 분석물의 결합은 상기 대상이 PiZ 전달체인 것을 나타낸다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 AAT 결핍과 관련된 상태 (condition) 또는 질병을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 장치를 사용하여 면역크로마토그래피에 대상으로부터의 시료를 적용시키는 단계, 및 포획 항체에 분석물의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 포획 항체에 분석물의 결합은 상기 대상이 상태 또는 질병을 갖는다는 것을 나타낸다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 AAT 결합에 관련된 상태 또는 질병을 진전시키는 대상의 소인 (predisposition)을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 장치를 사용하여 면역크로마토그래피에 대상으로부터의 시료를 적용시키는 단계, 및 포획 항체에 분석물의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 포획 항체에 분석물의 결합은 상태 또는 질병을 진전시키는 대상의 소인을 나타낸다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 생물학적 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은: 시험영역에서 제2 항체가 결합된 막상에 혼합된 상태의 상기 생물학적 시료 및 제1 항체를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 항체의 각각은 Z-AAT 단백질에 결합할 수 있고; 여기서 상기 시험영역에 제2 항체의 포획은 상기 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재를 나타낸다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 장치를 포함하는 키트 및 검출 시약을 제공한다.
본 발명은 시험 시료에 분석물의 존재 또는 정량을 결정하기 위한 막-계 분석 장치, 방법 및 키트를 제공한다. 상기 면역크로마토그래피 장치는 시험 영역에서 포획 항체가 결합된 막을 포함하며, 여기서 상기 포획 항체는 분석물, 특히 PiZ 유전자 전달체로부터의 시료에 존재하는 Z-AAT 단백질과 결합할 수 있다.
도 1은 단일클론 항체 (monoclonal antibodies) LG96 및 MG97을 갖는 샌드위치-ELISA인, 매칭 쌍 (matching pair)의 시험의 결과를 나타낸다. 부분적으로 정제된 단일클론 항체 LG96 및 MG97은 호스래디쉬 퍼록시다제 (horseradish-peroxidase) (각각 LG96HRP 또는 MG97HRP)로 표지된 포획 항체 또는 검출 항체로 사용될 수 있다. 집단 (Pooled) ZZ- 또는 MM-혈청 (serum)은 시료 버퍼로 연속-희석되고 항원 용액으로 사용된다. 상기 매칭 zx쌍인 LG96-LG96HRP, LG96-MG97HRP, MG97-LG96HRP 및 MG97-MG97HRP은 PiZZ-혈청과는 특이 결합을 나타내지만, PiMM-혈청과는 그렇지 않다.
도 2는 코팅된 AAT (M-폼 (form))을 갖는 단일클론 항체 LG96 및 MG97의 교차 반응성 (cross-reactivity)에 대한 시험의 결과를 나타낸다. 상기 M-특이 항체 F43.8.1 및 1AT은 양성 대조구로 작용하며, 이들 모두는 코팅된 AAT (M-폼)에 매우 강한 특이 결합을 나타낸다. 대조적으로, 항체 LG96 및 MG97은 AAT의 코팅된 M-폼에 결합하지 않는 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 어떤 구체 예에 따른 면역크로마토그래피를 위한 측방 유동 분석 (lateral flow assay) (LFA) 장치의 개략적인 레이아웃을 나타낸다.
도 4는 도 3에서와 같은 개략적인 레이아웃을 설명하고 있고, 여기서 상기 시료는 상기 타겟 분석물을 함유하지 않는다.
도 5는 LFA 장치의 사진이고, 여기서 상기 면역크로마토그래피 성분은 예를 들어, 플라스틱 물질로 만들어진 하우징에 넣어진 것으로 표현된다. 상기 시험 라인 (line) 또는 영역은 시험 결과가 상기 시료에서 분석물의 존재에 대해 음성으로 나타나면 부재라는 것을 보여준다. 상기 대조 라인 또는 영역이 양성이면, 상기 장치가 적절하게 작동된 것을 나타낸다.
도 6은 도 3에서와 같은 개략적인 레이아웃을 설명하고, 여기서 상기 시료는 상기 타겟 분석물을 함유한다.
도 7은 LFA 장치의 사진이고, 여기서 상기 면역크로마토그래피 성분은 도 5에서와 같이 하우징에 넣어진 것으로 표현된다. 상기 시험 라인 또는 영역은 상기 시험 결과가 시료에서 상기 분석물의 존재에 대해 양성인 것은 이의 존재를 나타낸다. 상기 대조 라인 또는 영역 또한 상기 장치가 적절하게 작동한 것을 나타내는 양성이다.
도 8은 본 발명의 어떤 구체 예에 따른 LFA의 원리를 설명하고 있고, 여기서 상기 시료는 개별적인 ZZ-타입으로부터의 혈액이다. 포획 항체 LG96; HRP와 접합된 검출 항체 (Detector antibody) MG97; 대조 항체 (Control antibody): Ig.
도 9는 본 발명의 또 다른 구체 예에 따른 LFA의 원리를 설명하고, 여기서 상기 시료는 개별적인 MM-타입으로부터의 혈액이다. 포획 항체 LG96; HRP와 접합된 검출 항체 MG97; 대조 항체: Ig.
도 10은 본 발명의 또 다른 구체 예에 따른 LFA의 원리를 설명하고 있고, 여기서 상기 시료는 개별적인 MZ-유형으로부터의 혈액이다. 포획 항체 LG96; FIRP와 접합된 검출 항체 MG97; 대조 항체: Ig.
도 11은 ZZ- 및 MM-혈청에 대한 LG96-MG97HRP의 결합 곡선의 결과를 나타낸다.
도 12는 ZZ-혈청에 대한 LG96-MG97HRP의 특이적 결합의 결과를 나타낸다. MM-혈청에 대한 결합은 없다.
도 13은 블랭크 시험에서 (1:20 희석된) 실제 시료의 스크린의 결과를 나타낸다.
도 14는 PiZZ-ELISA을 이용하여 다른 상업적으로 이용가능하고, 회사 내 (in-house)의 혈청/혈장 (plasma) 시료에서 Z-AAT-농도의 결정을 나타낸다.
도 15a-15d는 모든 가능한 항체 조합에서 혈청 시료 #1-6의 시험을 나타내고, 여기서 처음 언급된 항체는 상기 니트로셀룰로오스 상에 고정된 상기 포획 항체이고, 슬래쉬 (slash) 후 언급한 항체는 상기 금 입자에 연결된 상기 검출 항체이다.
도 16은 본 발명의 장치의 어떤 구체 예의 측면도이다.
도 17은 도 16에서 도시된 상기 장치의 종 단면도이다.
도 18은 도 16에서 도시된 상기 장치의 공급 영역의 확대도이다.
도 19는 (A) 도 16에 도시된 장치; 및 (B) 단일 카트리지 (single cartridge)를 포함하는 장치의 다른 구체 예의 반응 영역을 나타내는 확대도이다.
도 20은 도 16에서 도시된 상기 장치의 캡 및 절단 부의 측면도이다.
도 21은 본 발명의 장치의 어떤 구체 예의 종 단면도이다.
도 22는 본 발명의 장치의 또 다른 구체 예이다.
도 23은 몇몇 구체 예에 따른 본 발명의 장치이다.
도 24는 또 다른 구체 예에 따른 본 발명의 장치이다.
도 25는 또 다른 구체 예에 따른 본 발명의 장치이다.
도 26은 본 발명의 장치의 어떤 구체 예를 사용하여 ZZ(+) 혈청 시료의 세 가지 분리 스크린의 결과를 나타낸다.
도 27은 모세혈 (capillary blood) 대 혈청 시료 (상기 동일한 도너 (donor)로부터 20 ㎕ 모세혈 및 혈청 시료의 비교)의 시험을 나타낸다. 시험 신호는 광학 판독기 (optical reader) (QuickSens Omega 100 reader)를 사용하여 15 분 이후에 측정된다. mg/dL에서 수는 네펠로법 (nephelometry)에 의해 결정된 상기 AAT 혈청 수준을 나타낸다.
도 28은 시험 결과에 대한 다른 항응고제 (anticoagulant)의 효과를 나타낸다. 대조구: M-혈청, 시험 시료: ZZ-EDTA 혈장, ZZ-구연산 혈장, 및 ZZ-헤파린 혈장. 시험 신호는 상기 시험 개시 15분 후에 광학 판독기로 측정된다. mg/dL에서 수는 네펠로법에 의해 결정된 상기 AAT 혈청 수준을 나타낸다.
도 29는 (A) MM 도너; (B) ZZ 도너; 및 (C) SZ 도너 (20 ㎕ 혈청 시료는 사용되고, 결과는 다른 시간 후에 나타난다)로부터 혈청 시료를 시험한 것을 나타낸다. 'Vol.'는 광학 판독기에 의해 측정된 시험 라인 (T)의 신호 강도이다. 대조 라인은 'C'로 표시된다.
도 30은 혈청 및 전혈로 n-65 시험의 시험 요약을 나타낸다. 0 = PiMM 시료; 1 = PiMZ, PiSZ, 및 PiZZ 시료. 시험 신호는 광학 판독기를 사용하여 15-20 분후에 측정된다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 시험 영역에서 포획 항체가 결합된 막을 포함하는 면역크로마토그래피 장치를 제공한다. 상기 포획 항체는 분석물과 결합할 수 있다. 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 분석물은 Z-AAT 단백질이다. 상기 장치는 시료에서 상기 분석물의 존재를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "Z-AAT 단백질"은 아미노산의 Z-AAT 중합체에 관한 것이고, 상기 단백질의 특이 길이에 관한 것을 의도하지 않으며; 따라서 이의 단편은 "Z-AAT 단백질"의 정의 내에 포함된다. 이러한 용어는 또한 단백질의 후-번역 변형 (post-translational modifications), 예를 들어, 당쇄화 (glycosylation), 아세틸화 (acetylation), 인산화 (phosphorylation) 등 뿐만 아니라, 단량체, 이량체, 다량체 등을 포함하는 상기 Z-AAT 단백질의 형태, 변형체 (variant), 및 동족체 (analogue)를 포함한다. 따라서, 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 용어 "Z-AAT 단백질"은 용어 "Z-AAT 폴리펩타이드"와 동의어일 수 있고, 또는 둘 이상의 Z-AAT 폴리펩타이드 (예를 들어, 이량체, 다량체, 집합체)의 복합체에 관한 것일 수 있다.
시료 (Sample)
일반적으로, 상기 시료는 상기 분석물을 함유하거나 또는 함유하지 않는 물질에 관한 것이다. 상기 시료는 상기 시료의 특징을 변형 또는 변경하기 위한 전처리를 수반하거나, 또는 소스로부터 얻어진 것으로 직접 사용될 수 있다. 상기 시료의 소스는 혈액, 간질액 (interstitial fluid), 타액 (saliva), 수정체 분비물 (ocular lens fluid), 뇌척수액 (cerebral spinal fluid), 땀 (sweat), 소변 (urine), 우유 (milk), 복수 (ascites fluid), 라우코우스 (raucous), 활액 (synovial fluid), 복막액 (peritoneal fluid), 질액 (vaginal fluid), 양수 (amniotic fluid) 이와 유사한 것을 포함하는 생리적 체액 (physiological fluid)과 같은, 어떤 생물학적 소스일 수 있다. 바람직하게는 상기 시료는 수성 시료이다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 시료는 희석되지 않은 시료, 즉, 상기 시료를 생물학적 소스로부터 얻고, 상기 시료의 어떤 전-희석 없이 직접적으로 적용시킨 시료이다. 다른 구체 예에 있어서, 상기 시료는 혈액으로부터 혈장을 제조, 점성 유체 (viscous fluid)를 희석, 및 이와 유사한 것과 같이, 사용 전에 미리 전처리된다. 상기 시료의 전-처리는 여과, 침전, 희석, 증류, 농축, 갑섭 성분 (interfering component)의 불활성화, 및 시약의 첨가를 포함할 수 있다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 분석물을 함유한다는 의심이 가는 고체 물질은 상기 시료의 소스, 바람직하게는 액체 또는 반-액체 조성물을 형성하기 위해 상기 고체 물질을 변형하여 사용될 수 있다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 또 다른 구체 예에 있어서, 상기 시료는 모세혈이다.
막 (Membrane)
본 발명의 장치는 상기 시료에서 분석물의 존재 또는 양을 결정하기 위해 막-계 면역크로마토그래피 분석을 제공한다. 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 분석물은 Z-AAT 단백질이다. 예를 들어, 어떤 구체 예에 있어서, 상기 분석물은 Z-AAT 단백질이고, 여기서 포유류 (예를 들어, 사람)로부터 얻어진 혈액의 시료에서 상기 분석물의 존재는 상기 포유류가 PiZ 유전자 전달체라는 것을 나타낸다.
상기 막은 상기 시료가 통과할 수 있는 다양한 물질의 어떤 것으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 막을 형성하기 위해 사용된 물질은 천연 물질, 합성 물질, 또는 다당류 (예를 들어, 종이 및 셀룰로오즈 유도체와 같은, 셀룰로오즈 아세테이트 및 니트로셀롤로오즈와 같은 셀룰로오즈 물질)와 같은 합성적으로 변형된 자연적으로 발생하는 물질; 폴리에테르 설폰; 나일론 막; 실리카; 염화비닐, 염화비닐-프로필렌 공중합체, 및 염화비닐-초산비닐 공중합체와 같은 중합체를 갖는 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 다른 무기 미분화된 물질, 불활성화된 알루미나, 규조토 (diatomaceous earth), 또는 MgS0와 같은 무기 물질; 천연적으로 발생 (예를 들어, 면) 및 합성 (예를 들어, 나일론 또는 에리온) 모두의 직물; 실리카 겔, 아가로오스, 덱스트린, 및 젤라틴과 같은 다공성 겔; 폴리아크릴아미드와 같은 중합체성 필름; 및 이와 유사한 것을 포함 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 막은 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에스테르 설폰 물질로부터 형성된다. 상기 니트로셀룰로오스는 단독 니트로셀룰로오스일 수 있는 셀룰로오즈의 질산 에스테르, 또는 질산 및 하나 이상의 탄소 원자를 갖는 지방족 카르복실산과 같은 다른 산의 혼합 에스테르일 수 있다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 막은 니트로셀룰로오스를 포함한다. 니트로셀룰로오스는 기존 민감화 (sensitization)을 요구하지 않고 단백질을 결합시키는 능력을 가질 수 있다. 항체와 같은 특정 시약은, 니트로셀룰로오스에 직접 적용되어 그것에 고정될 수 있다. 상기 시약의 필수적 특이 결합 활성을 방해할 수 있는 화학적 처리는 거의 요구되지 않거나 요구되지 않는다. 상기 니트로셀룰로오스 상의 사용되지 않은 결합 부위는 그 후에 폴리비닐 알코올과 같은 단순한 물질을 사용하여 차단될 수 있다. 더구나, 니트로셀룰로오스는 기공 크기 범위에서 쉽게 이용가능하고, 이것은 시료 유동속도 등과 같은 특별한 요구에 적절한 막 물질의 선택을 용이하게 한다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 막은 단일 시험 영역 또는 상기 포획 항체가 결합된 라인 또는 영역을 포함한다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 막은 상기 수성 시료가 점진적으로 통과할 수 있는 막 상에 배열된, 예를 들어 일련의, 다수의 시험 영역을 포함한다. 어떤 구체 예에 있어서, 다수의 시험영역은 상기 분석물의 양적 측정을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 또는 또 다른 구체 예에 있어서, 다중-분석물 시험을 제공하기 위해 다른 특이적인 포획 항체로 개별적으로 로딩 (loaded)될 수 있다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 막은 상기 장치가 작동하는지의 결정을 제공하기 위한 대조영역 (control zone)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 대조 영역은 원하는 시험 결과를 결정하는 상기 시험 영역의 하부에 위치된다. 따라서 양성 대조 식별기 (indicator)는 적어도 상기 시료가 막을 통과하여 요구된 거리를 침투하였다는 정보를 제공한다.
예를 들어, 상기 대조 영역은 상기 시료가 막을 충분하게 침투되는지 확인하기 위한 검출 시약과 결합될 항체 또는 다른 분자/시약으로 로딩될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출 시약이 쥐의 히브리도마 (murine hybridoma)로부터 유도된 표지된 항체인 경우, 상기 대조 영역은 "항-마우스 (anti-mouse)" 항체 (예를 들어, 항-마우스 IgG)를 포함할 수 있다. 또 다른 구체 예에 있어서, 상기 대조 영역은 습윤된 경우, 색 변화 또는 색 형성을 생성하는, 무수 시약 (anhydrous reagent)을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 무수 황산 구리 (anhydrous copper sulphate)는, 수성 시료에 의해 습윤된 경우, 청색으로 변화할 수 있다. 또 다른 구체 예에 따르면, 대조 영역은 과량의 검출 시약과 반응할 수 있는 고정화된 분석물 (예를 들어, Z-AAT 단백질)을 함유할 수 있다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 막은 대조 항체가 결합된 대조영역을 포함하고, 여기에 상기 대조 항체는 상기 검출 시약과 결합할 수 있다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 대조 항체는 항-마우스 IgG이다.
포획 항체 (Capture Antibody)
바람직한 구체 예에 있어서, 상기 시험 영역에서 막에 결합된 상기 포획 항체는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 이것은 상기 Z-AAT 단백질에 대해 특이적이다.
다양한 구체 예에 있어서, 상기 항체는 실질적으로 PiMM 혈청 또는 정제된 와일드 타입 AAT에 대한 교차반응성이 거의 없거나 없는 것을 나타낸다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일클론 항체 (monoclonal antibody) 또는 이의 항원-결합 단편이다.
상기 용어 "다클론 (polyclonal)" 및 "단일클론"은 항체 제제의 균일성 (homogeneity)의 정도에 관한 것으로, 생산 방법에 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 특정한 항원결정부위 (epitope)와 면역반응할 수 있는 항원-결합 부위의 오직 하나의 종만을 함유하는 항체 분자의 집단에 관한 것이다.
항체의 단편은 단일-사슬 (single-chain), 융합 (chimeric), 인간화 (humanized), 영장류화 (primatized), 또는 비인간화 항체 (veneered antibodies)가 또한 고려되어 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 Z-AAT 단백질에 특이하게 결합할 수 있는 항체 단편은 Fab', Fab, F(ab')2, 단일도메인 항체 (DABs), Fv, scFv (단일 사슬 Fv), 선형 항체 (linear antibodies), 이체 (diabodies), 카멜화 항체 (camelized antibodies) 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 항체-계 구조체 (antibody-based constructs) 및 단편을 제조 및 사용하는 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 이러한 단편은 효소적 절단 (enzymatic cleavage) 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 파파인 (papain) 또는 펩신 절단은 각각 Fab 또는 F(ab')2 단편을 발생할 수 있다. 상기 요구 물질 특이성을 갖는 다른 단백질 분해효소는 또한 Fab 또는 F(ab')2 단편을 발생하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈 (stop codons)이 천연의 정지 부위의 상부에 도입된 항체 유전자를 사용하는 다양한 결절 형태 (truncated form)로 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중사슬 (heavy chain) 부분을 인코딩하는 융합 유전자는 상기 중사슬의 CHi 도메인 및 힌지 영역 (hinge region)을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것으로 설계될 수 있다.
다른 종으로부터 유도된 부분, 및 이와 유사한 것을 포함하는, 융합, CDR-그래프트된 또는 비인간화 단일 사슬 항체뿐만 아니라, 단일 사슬 항체, 및 융합, 인간화 또는 영장류화 (상보적인 결정 영역-그래프트 (CDR-그래프트)), 또는 비인간화 항체들은 또한 본 발명에 의해 포함된다. 이러한 항체의 다양한 부분은 종래의 기술에 의해 화학적으로 서로 합쳐질 수 있고, 또는 유전자 조작 기술을 사용하여 인접 (contiguous) 단백질로 제조될 수 있다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96, MG97, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 포획 항체는 단일클론 항체 MG97이고, 상기 검출 항체는 단일클론 항체 LG96이다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96이고, 상기 검출 항체은 단일클론 항체 LG96이다.
상기 단일클론 항체 LG96 및 MG97을 생산하는 융합세포주 (hybridoma cell lines)의 대표적인 시료 세포는 각각 기탁번호 DSM ACC3092 및 DSM ACC3093로 부다페스트 조약 (Budapest Treaty)에 따라, "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH," Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Germany에 2010년 9월 14일자에 기탁되었다.
당업자들은 기술분야에서 알려진 다수의 기술을 사용하여 단일클론 항체의 핵산 서열을 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체-인코딩 핵산은 "재조합" 단일클론 항체를 제조하기 위해 클론될 수 있다. 어떤 재조합 클로닝 기술은 항체-인코딩 핵산 서열의 합성에 주요한 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction) (PCR)의 사용을 포함하여, 활용될 수 있다. 따라서, 단일클론 항체 제조 방법은 적어도 제1 적절한 항-Z-AAT 항체-인코딩 핵산 분자 또는 적절한 항-Z-AAT 항체-생산 세포로부터의 세그먼트 (segment), 바람직하게는 융합세포 (hybridoma)를 얻는 단계; 및 재조합 항-Z-AAT 단일클론 항체를 얻기 위해 재조합 숙주세포 (host cell)에서 상기 핵산 분자 또는 세그먼트를 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
다른 재조합 기술은, 예를 들어, 파지미드 라이브러리-계 방법 (phagemid library-based methods)과 같은, 기술분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 상기 방법은: (a) 면역 형성의 Z-AAT 단백질의 면역유전학적으로 유효량을 포함하는 조성물, 바람직하게는 활성화된 배아줄기 세포 (endothelial cells)를 포함하는 조성물의 적어도 일회 복용량, 및 선택적으로 일회 복용량 이상을 동물에게 투여하여 동물을 면역화시키는 단계; (b) 상기 면역화된 동물의 항체-생산 세포, 바람직하게는 비장 (spleen)으로부터 분리된 조합 면역글로블린 파지미드 라이브러리 발현 RNA (combinatorial immunoglobulin phagemid library expressing RNA)를 제조하는 단계; (c) 적어도 제1 항-Z-AAT 항체, 선택적으로 상기 단일클론 항체 LG96 또는 MG97과 실질적으로 교차 반응 또는 경쟁하는 하나를 발현하는 적어도 제1 클론을 상기 파지미드 라이브러리로부터 선택되는 단계; (d) 적어도 제1 선택된 클론으로부터 항-Z-AAT 항체-인코딩 핵산을 얻는 단계 및 적어도 제1 항-Z-AAT 항체를 제공하기 위해 재조합 숙주 세포에서 핵산을 발현시키는 단계; 및 (e) 적어도 제1 선택된 클론으로부터 얻어진 상기 핵산에 의해 발현된 적어도 제1 항-Z-AAT 항체를 얻는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 시험 영역에서 상기 막에 결합된 상기 포획 항체는 상기 Z-AAT 단백질에 대해 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 단일클론 항체 LG96, MG97, 또는 모두로부터 하나 이상의 상보적인 결정 영역 (CDRs)을 포함한다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 단일클론 항체 LG96 또는 MG97와 같은 동일 또는 유사한 에피토프 특이성 (epitopic specificity) 을 갖는다. 단일클론 항체 LG96 또는 MG97과 동일 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편은 기술분야에서 알려진 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 동일 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는 항체는 Z-AAT 폴리펩타이드에 결합하기 위한 상기 단일클론 항체와의 경쟁력에 기초하여 확인될 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 예를 들어, LG96 mAb의 결합, 및 Z-AAT 폴리펩타이드에 대해 동일 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는 항체의 결합은 단일 펩타이드 (예를 들어, 천연 펩타이드, 합성 펩타이드)에 의해 억제될 수 있다.
어떤 특별한 이론에 제한받는 것은 아니지만, 시험될 시료에서 높은 분석물 농도를 갖는 문제점이 매우 높은 분석물 농도에서 감지가능한 신호의 감소로서 기술분야의 당업자에 의해 이해되는, 소위 "훅 효과 (Hook effect)"일 수 있다고 믿어진다. 정상적으로, 이종 샌드위치 분석 포맷에서, 상기 용해 표지된 항체 (예를 들어, 검출 시약) 및 상기 고체 상 항체 (예를 들어, 포획 항체)는 상기 샌드위치 복합체가 형성될 수 있고, 또한 필수적으로 완벽히 검출하기 위하여, 결정될 분석물에 대해 상대적으로 과량으로 존재한다. 그러나, 높은 분석물 농도의 존재에서, 항체의 제한된 수는 상기 시료에서 존재할 수 있는 분석물 분자의 매우 많은 수에 직면된다. 극단적인 경우에 있어서, 상기 분석물이 오직 부분적으로 결합되는 고체 상 항체의 결손이 있고, 더구나, 상기 고체 상에 결합된 분석물의 분획은 상기 표지된 항체가 용해 검출 항체/분석물의 복합체의 형성으로 과량의 분석물에 의해 포획되기 때문에 완벽히 검출될 수 없다. 이것은 인공의 거짓 시험 (false negative test) 결과를 유도할 수 있는 측정된 신호의 감소를 결과할 수 있다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 시료는 미리희석된 시료이고, 그 다음, 상기 면역크로마토그래피에 대상이 된다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 막은 상기 수성 시료가 상기 시험 영역에 도달하기 이전에 점진적으로 통과할 수 있는, 상기 시험영역에 근단 위치에 각각의 상기 막 상에 배열된 (예를 들어, 일련의) 하나 이상의 포획 영역 (capture zones)을 포함한다. 몇몇 구체 예에 있어서, 하나 이상의 포획 영역은 상기 영역에 고정화된/결합된 단일클론 항체 LG96 또는 MG97을 포함한다. 하나 이상의 포획 영역은 훅 효과 (Hook effect)에 대한 시료의 잠재적인 대상의 분석에서 훅 효과를 방지, 감소, 또는 제거하기 위해 제공할 수 있다.
접합 구조 (Conjugate structure)
어떤 구체 예에 있어서, 상기 장치는 리포터 부분 (reporter moiety)으로 표지된 검출 항체와 같은, 검출 시약을 갖는 접합 구조를 더욱 포함한다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 접합 구조는 상기 막에 접촉되도록 배치되고, 여기서 액체가 상기 접합 구조와 접촉한 경우; 상기 검출 시약은 막을 통해 재-수화 및 운반된다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 접합 구조는 상기 막의 근단부 (proximal end)에 상기 막에 유동적으로 연결된다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 접합 구조는 상기 막의 근단부에서 막과 부분적으로 중첩하는 접합 패드 (conjugate pad)이다.
예를 들어, 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 접합 구조는 액체를 빠르게 흡수할 수 있는 흡수성의 (bibulous), 다공성의 (porous) 또는 섬유모양의 (fibrous) 물질로 제조된다. 상기 물질의 다공성 (porosity)은 (예를 들어, 상기 구조의 축과 전적으로 또는 주로 평행하게 흐르는 기공 또는 섬유를 갖는) 일방향 (unidirectional) 또는 다방향 (multidirectional) (예를 들어, 상기 막이 무정형의 스폰지-같은 구조인, 전방향성 (omnidirectional))일 수 있다. 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 불화 폴리비닐리덴, 에틸렌 비닐아세테이트, 아크릴로니트릴, 및 폴리테트라플로로에틸렌와 같은 다공성 플라스틱 물질은 사용될 수 있다. 상기 물질에서 어떤 고유의 소수성을 감소시킬 수 있기 때문에, 제조 동안 표면-활성제로 상기 물질을 전-처리하는 것은 장점일 수 있고, 따라서, 빠르고 효과적으로 습한 시료를 취하고 운반하는 능력을 향상시킨다. 다공성 구조는 또한 종이 또는 니트로셀룰로오스와 같은 다른 셀룰로오즈 물질로부터 제조될 수 있다. 몇몇 구체 예에 있어서, 소위 펠트펜 (fiber tipped pen)의 펜촉 (nib)에 사용된 물질이 사용될 수 있고, 이러한 물질은 본 발명의 내용에서 적절한 단면 및 다양한 길이로 형상 또는 압출될 수 있다. 바람직하게는 상기 다공성 접합 구조를 포함하는 물질은 약 수초이내에 수성 액체로 포화될 수 있도록 선택된다. 바람직하게는 상기 물질은 습한 경우 활성을 유지한다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 접합 구조는 마감 또는 광택처리되고, 상기 검출 시약의 층이 증착된다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 막의 일부분은 상기 접합 구조를 수반한다. 기술분야의 당업자에게는, 실제로, 상기 마감/광택이 실제 표면 층을 형성하지 않고, 상기 마감/광택 물질이 상기 막의 두께를 다소 침투할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 상기 증착된 검출 시약은 또한 막을 침투할 수 있다. 이러한 구체 예에 따르면, 수성 시료는 상기 막의 길이를 따라 흐를 수 있고, 그렇게 함으로, 상기 마감/광택을 용해 및 상기 검출 시약을 이동, 및 상기 막을 따라 검출 시약을 운반한다.
검출 시약 (Detection Reagent)
바람직한 구체 예에 있어서, 상기 검출 시약은 리포터 (reporter) 부분으로 표지된 검출 항체이다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 상기 Z-AAT 단백질에 대해 특이적인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 다양한 구체 예에 있어서, 상기 항체는 실질적으로 PiMM 혈청 또는 순순한 와일드 타입 AAT에 교차반응성이 없거나 거의 없는 것으로 나타난다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 단일클론 항체 LG96, MG97, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 단일클론 항체 MG97이고, 여기서 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96이다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 단일클론 항체 LG96이고, 여기서 상기 포획 항체는 단일클론 항체 MG97이다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 포획 항체은 단일클론 항체 LG96이고, 상기 검출 항체는 단일클론 항체 LG96이다.
상기 리포터 부분은 당 업계에서 알려진 물질/리포터 시스템의 넓은 범위의 어떤 것일 수 있다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 리포터 부분은 효소 (예를 들어, 호스래디시 페록시다아제 (horseradish peroxidase) (HRP), 알칼리 포스페타아제 (alkaline phosphatase), 루시페나아제 (luciferase), β-갈락토시다아제 (β-galactosidase), 글루코오즈 옥시다아제 (glucose oxidase), 라이소자임 (lysozyme), 말레이트 탈수소효소 (malate dehydrogenase), 글루코오즈-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase)); 금속 졸 (metal sol), 셀레늄 졸 (selenium sol), 탄소 졸 (carbon sol), 등등; 착색된 또는 착색가능한 입자 (예를 들어, 착색된 또는 착색가능한 라텍스 입자); 콜로이드 금속 입자 (예를 들어, 콜로이드 금, 콜로이드 은, 콜로이드 플라티늄, 콜로이드 셀레늄)을 포함하는 리간드-수용체 쌍 (ligand-receptor pair)의 제1 부재 (member)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 리포터를 검출하기 위한 당 업계에서 알려진 방법의 예로는 시각적 검사 (visible inspection), 자외선(UV) 및 가시 분광법, 형광분석법 (fluorimetry) 및 방사 카운터 (radiation counter)에 의한 검출 방법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 리포터 부분은 상기 검출 항체에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합/연결될 수 있다. 상기 결합/연결은 당 업계에 알려진 어떤 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합/연결을 위해 사용된 시약은 글루타알데하이드 (glutaraldehyde), p-톨루엔 디이소시아네이트 (p- toluene diisocyanate), 여러 카보디이미드 (carbodiimide) 시약, p-벤조퀴논 m-페리오데이트 (p-benzoquinone m-periodate), N,Ni-o-페닐렌디말레이미드 (N,Ni-o-phenylenedimaleimide), 재조합 방법, 및 이와 유사한 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
혈액 분리 시스템 (Blood separation system)
다른 구체 예에 있어서, 상기 장치는 상기 시료를 수용하기 위한 혈액 분리시스템을 더욱 포함하고, 여기서 상기 혈액 분리 시스템은 상기 접합 구조에 유동적으로 연결된다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 혈액 분리 시스템은 상기 접합 패드를 부분적으로 중첩하는 혈액 분리 시스템이다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 시료는 상기 장치의 접합 구조 또는 상기 막 섹션에 직접적으로 적용되지 않아야 한다. 바람직한 구체 예에 있어서, 상기 시료는 상기 접합 구조에 유동적으로 연결된 상기 혈액 분리 시스템 (예를 들어, 흡착 물질/패드)에 적용된다. 예를 들어, 상기 혈액 분리 시스템은, 예를 들어, 상기 시료로부터 혈액 세포를 제거하기 위한, 필터로 작용할 수 있다. 여과된 시료는 그 다음 상기 접합 구조에 도달할 수 있다. 다른 구체 예에 있어서, 상기 여과공정의 과정 동안, 시약의 첨가는 건조상태에서 상기 혈액 분리 시스템에 존재하는 나중에 배출 성분을 용해시켜 동시에 효과적일 수 있다. 방해 요인은 이러한 성분에 의해 상기 용액으로부터 제거될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 표지 시약으로 옥시다아제 및 퍼옥시다아제의 사용을 방해할 수 있는 시료에 존재하는 아스코르브산 (ascorbic acid)은 적절한 산화제에 의해 무력화될 수 있다. 상기 혈액 분리 시스템은 또한 흡착에 의해 상기 시료로부터 방해 요인을 제거하는 흡착제로서 작용할 수 있다.
말단 구조 (Distal structure)
바람직하게, 상기 검출 시약 (예를 들어, 표지된 항체)은 상기 시험 영역에 액체 시료로 이동한다. 상기 시료의 흐름은 상기 시험 영역 뒤로 계속되고, 충분한 시료는 이것이 발생되는 순서로 상기 막에 적용된다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 장치는 상기 막의 원단부 (distal end)에 막에 유동적으로 연결된 말단 구조를 더욱 포함하고, 여기서 상기 말단 구조는 상기 근단부로부터 상기 원단부까지 충분한 유동-통로를 제공하도록 설계된다. 상기 말단 구조는 상기 막의 원단부에서 흡착제 "씽크 (sink)"로 작용한다. 상기 흡착제 씽크는, 예를 들어, 와트만 3MM 크로마토그래피 종이 (Whatman 3MM chromatography paper)를 포함할 수 있다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 말단 구조는 상기 원단부의 상기 막에 부분적으로 중첩하는 흡착 패드 (adsorbent pad)이고, 여기서 상기 흡착 패드는 모세관 작용 (capillary action)에 의해 막의 근단부에서 원단부까지 충분한 유동-통로를 제공하도록 설계된다.
방법 (Methods)
몇몇 구체 예에 있어서, 작동중에, 수성 시료는 상기 장치의 근단부에서의 혈액 분리 시스템에 적용된다. 상기 시료는 접합 구조를 통해 모세관 작용에 의해 유동하고, 상기 접합 구조에서부터 상기 시험 영역까지 상기 검출 시약을 전달하며, 그 다음, 예를 들어, 상기 시료가 결정될 상기 분석물을 함유하는지 또는 함유하지 않는지를 무시하고 육안에 의해 시각적 색상 신호를 나타내는 것을 제공하기 위한 상기 대조 영역까지 전달한다. 상기 분석물의 결정은 상기 시험 영역(들)에서 실행된다. 몇몇 구체 예에 있어서, 상기 장치의 사용자는 두 영역 (zones)에서 생성된 신호를 비교하여 상기 분석물이 상기 시료에 존재하는지를 결정할 수 있다.
예를 들어, 어떤 구체 예에 있어서, 만약 상기 시험이 포유류로부터 얻어진 혈액의 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재를 결정하기 위해 사용된다면, 상기 장치의 막 성분은 이에 고정화된 단일클론 항체 LG96을 갖는 단일 시험 영역; 및 이에 고정화된 항-마우스 IgG을 갖는 단일 대조 영역을 포함할 수 있다. 접합 패드는 상기 막의 근단부에서 상기 막으로 중첩될 수 있고, 여기서 상기 접합 패드는, 예를 들어, 착색된 라텍스 입자와 같이 리포터 부분으로 표지된 단일 클론 항체 MG97을 포함한다. 상기 시험 영역에서 가시 밴드의 검출은 상기 혈액에 상기 Z-AAT 단백질의 존재를 나타내고; 상기 대조 영역에서 가시 밴드의 검출은 상기 시료가 충분하게 막을 침투되었다는 것을 확인한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 PiZ 유전자 전달체를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은:
(a) 시험 영역에서 포획 항체가 결합된 막을 포함하는 면역크로마토그래피 장치를 사용하는 면역크로마토그래피에 시료를 적용시키는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 분석물과 결합할 수 있고, 여기서 상기 분석물은 PiZ 유전자 전달체로부터의 시료에 존재하는 Z-AAT 단백질이며, 여기서 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96 또는 MG97이고; 그리고
(b) 상기 시험 영역에서 신호를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 시험 영역에서의 신호의 존재는 상기 대상이 PiZ 전달체인 것을 나타낸다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 검출 시약은 단일클론 항체 LG96 또는 MG97이고, 여기서 상기 항체는 리포터 부분으로 표지된다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 PiZ 전달체는 PiZ 대립형질 (allele)을 갖는 어떤 대립형질의 조합인 표현형 (phenotype)을 갖는다.
몇몇 구체 예에 있어서,상기 표현형은 PiZZ, PiMZ, PiSZ, 또는 PiZ/Null이다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 대상의 혈액 순환은 검출가능한 Z-AAT 단백질 농도를 갖고, 이에 의해 상기 PiZ 대립형질의 존재를 나타낸다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 PiZ 전달체는 적어도 약 80 mg/dl의 AAT 혈청 수준을 갖는 이형접합 (heterozygous) MZ 전달체이다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 AAT 결합과 관련된 상태 또는 질병을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은:
(a) 시험 영역에서 포획 항체가 결합된 막을 포함하는 면역크로마토그래피 장치를 이용하는 면역크로마토그래피에 시료를 적용시키는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 분석물과 결합할 수 있고, 여기서 상기 분석물은 PiZ 유전자 전달체로부터의 시료에 존재하는 Z-AAT 단백질이며, 여기서 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96 또는 MG97이고; 그리고
(b) 상기 시험 영역에서 신호를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 시험 영역에서의 신호의 존재는 상기 대상이 상태 또는 질병을 갖는 것을 나타낸다.
장치
다른 관점에 있어서, 본 발명은 특이 결합 분석, 특히 면역 크로마토그래피 분석을 수행하기 위한 장치를 제공한다. 장치는 Z-AAT를 검출하기 위해 본 발명의 항체 빛 방법을 사용하는데 쉽게 적용될 수 있다. 고체-상 분석 장체는 면역크로마토그래피 면역분석 장치, 유동-통로 분석 장치, 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plates), 딥스틱 (dipsticks) 및 면역모세관 (immunocapillary)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구체 예에 있어서, 본 발명의 항체 및 방법의 사용에 적용될 수 있는 장치는 WO 2010/089102호에 기술되었고, 이것은 사람 또는 동물의 몸의 액체에 대한 장치의 사용을 위한 참조로서 본 발명에 포함된다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 장치는 알파-1-항트립신 결핍의 모세관 직접 결정을 위한 통합된 접촉면을 통해 랜싯 (lancet) 성분 및 혈액 수집 성분을 갖는 일회용, 폐쇄시스템이다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 장치는 본 발명의 면역크로마토그래피 방법 및 항체에 따라 Z-AAT 항원에 대한 샌드위치 면역 분석을 수행하기 위해 설계된다. 실시 예로써 도 16에 설명된 바와 같이, 장치 (10)의 구체 예는 연장된, 관형 하우징 (11)을 갖는다.
캡 (12)은 띠-형상 요소 (strip-shaped element) (45)를 잡아주는 홀더 (13)의 일 측면에 접하여 상기 하우징 (11)의 내부에 있다. 상기 띠-형상 요소 (45)는 하우징 (11)에 축 방향으로 확장되고, 컵-형상 분리 요소 (cup-shaped separator element) (41)의 노즐-형상 유입관 (nozzle-shaped intake tube) (44)에서, 이의 근단부에, 장착된다. 반응 영역 (reaction area) (30)으로부터 표시영역 (indication area) (40)을 분리시키는 상기 분리 요소 (separating element) (41)는, 컵-형상의, 상부 개방 단면을 가지며, 하우징 (11)에 꼭 맞게 기밀하게 자리 잡는다. 분리 요소 (separating element) (41)의 바닥에서 관통 홀 (through-hole) (42)은 상기 띠-형상 요소 (45)의 면 상에 직접 개방한다. 분리 요소 (41)는 상기 관통 홀 (42)의 스페이서 (spacer) (43) (도 17 및 19)에 의해 감싸여 진다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 띠-형상 요소 (45)는 백킹 (backing) (예를 들어, 플라스틱 백킹)으로 선택적으로 적층될 수 있는 막 (예를 들어, 니트로셀룰로오스와 같은 미세기공 흡착 물질의 일종)을 포함하고, 상기 막과의 접촉은; (a) 리포터 부분으로 표지된 검출 항체와 같은 검출 시약을 갖는 접합구조; 및 (b) 이의 근단부에서 원단부까지 막을 통하여 상기 분석 유체를 끌어당기는 것을 돕기 위하여 상기 막과 유체 소통하는 말단 구조, 예를 들어 제2 흡착 물질 (예를 들어, 와트만 3MM 크로마토그래피 종이, 유리 섬유)의 띠 (strip)이다. 상기 말단 구조는 또한 막을 통하여 통과하는 상기 유체를 흡착하는 흡착제로서 작용을 한다.
상기 막은 막에 고정화된 본 발명의 포획 항체를 갖는 시험 영역을 포함한다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 막은 상기 장치가 작동된 것의 결정을 제공하기 위한 대조영역을 더욱 포함한다. 바람직하게는, 상기 대조 영역은 원하는 시험 결과가 결정되는 상기 시험영역으로부터 하부에 위치된다. 따라서 양성 대조 식별은 상기 시료가 적어도 막을 통하여 요구된 거리를 침투하였다는 정보를 제공한다. 예를 들어, 상기 대조 영역은 상기 시료가 막을 충분히 침투하였다는 것을 확인하기 위해 검출 시약과 결합될 항체 또는 다른 분자/시약으로 로딩될 수 있다. 예를 들어, 여기서 상기 검출 시약이 쥐 융합 세포종로부터 유도된 표지된 항체인 경우, 상기 대조 영역은 항-마우스 IgG를 포함 할 수 있다. 어떤 구체 예에 있어서, 상기 시험 영역에서 상기 포획 항체는 LG96 및/또는 MG97이고; 상기 검출 시약은 검출가능한 표지로 표지된 LG69이며; 상기 대조 영역은 거기에 고정화된 항-마우스 IgG를 포함한다. 또 다른 구체 예에 있어서, 상기 시험 영역에서 상기 포획 항체는 LG96 및/또는 MG97이고; 상기 검출 시약은 검출가능한 표지로 표지된 MG97이며; 상기 대조 영역은 거기에 고정화된 항-마우스 IgG를 포함한다.
몇몇 구체 예에 있어서, 하나 이상의 카트리지는 상기 하우징 (11)의 축 방향에서 상기 분리 요소 (41) 위에 즉시 배열된다. 도 19a에서 도시된 구체 예에 있어서, 상기 장치는 상기 반응 영역 (30)에서 세 개의 카트리지 (31, 34, 및 37)를 포함하는 것으로 도시되고; 도 19b에 도시된 구체 예에 있어서, 단일 카트리지 (37) 장치가 도시된다.
도 19a에 관련된 실시 예에 의하면, 어떤 구체 예에 있어서, 각각의 카트리지 (31, 34, 37)는 상기 하우징 (11)의 내부 치수와 만나는 이의 외부 치수인 관형 하우징 부분 (tubular housing part) (31a, 34a, 37a)을 가지며, 밀봉 필름 (sealing films) (32/33 및 35/36 및 38/39)으로 상부와 하부는 밀봉된다. 상기 카트리지는 분석을 위해 요구되는 버퍼, 시약, 또는 다른 화학 물질을 포함할 수 있다. 상기 카트리지는 미리제작될 수 있고, 충진하여 사용되며, 관형 하우징 부분이 서로 축방향으로 놓이도록 상기 하우징 (11)에 꼭 맞는 상태로 밀봉된다. 도 19a에 도시된 구체 예에 있어서, 상기 카트리지 (37)에 접하는 상기 띠-형상 요소 (45)의 영역은 분리 부재 (separating member) (41)의 상부 가장자리와 맞닿은 저부 말단에 달려있다. 카트리지 (31)의 반대 상부 말단은 하나 이상의 카트리지가 서로에 대해 단단히 위치 및/또는 유지되도록 상기 하우징 (11)의 내부 벽에 대해 탄성 변형 (elastic deformation)하에서 클램프될 수 있는, 클램핑 슬리브 (clamping sleeve)의 형태로 배열된 클램핑 요소 (clamping element) (15)이다.
절단 장치 (19)는 상기 카트리지 (31, 34 및 37) 위에 배열되고, 상기 절단 장치는 절단 부 (cutting part) (22)를 포함한다. 상기 절단 부 (22)는, 예를 들어, 절단 날을 포함하는 칼인, 절단 칼 (23)을, 상기 카트리지 (31, 34, 37)를 접하는 이의 바닥 말단에서 포함하는 유지 몸체 (retaining body) (21) 및 관 연장부 (tubular extension) (21b)을 포함한다. 상기 관형 돌출부 (tubular projection) (21b)의 저부 말단 근처에 배열된 것은 환형 (annular) 또는 원통형 (cylindrical)의 밀봉 요소 (16)이고, 이것은 상기 하우징 (11)의 내부 및 상기 관형 돌출부 (21b)의 외부에 놓여 있고, 상기 클램핑 슬리브 (15)의 상부에서 축방향으로 지지된다.
상기 절단 부 (22)의 유지 몸체 (21)는 모세관 튜브 (capillary tube) (24)이 삽입되는 축심 홀 (axial center hole) (21a)를 갖는다. 관형 캡 (tubular cap) (25)은 상기 모세관 튜브 (24)의 돌출형 상부 섹션이 밀봉된 내부 폐쇄된 보어 (internal blind bore) (26)을 갖는다. 상기 캡 (25)의 상부 말단에 사용자가 캡 (25)을 축방향으로 돌리거나 움직일 수 있는 조작 부 (handle portion) (28)가 있다. 하부 말단에, 캡 (25)의 조작부 (28)의 반대편은 가이드 부재 (guide member) (27)이 있다.
도 20에서 도시된 바와 같이, 절단 부 (22)의 홀더 몸체 (21)는 슬럿-형상 게이트 (slot-shaped gate) (14) (도 16 참조)의 형태로 상기 하우징 (11)에서 형성된 캠 (cam)에 관여하는 방사형으로 외부로 향하는 확장된 가이드 핀 (guide pin) (17)을 갖는다. 도 16을 참조하면, 게이트 (14)는 하우징 (11)의 주변 방향으로 제1 섹션 (14a)을 확장하는 제1 섹션 (first section) (14a), 하우징 (11)의 종방향으로 제2 섹션 (second section) (14b)을 확장하는 제2 섹션 (14b), 하우징 (11)의 주변 방향으로 제3 섹션 (third section) (14c)을 확장하는 제3 섹션 (14c), 및 하우징 (11)의 종방향으로 제4 섹션 (fourth section) (14d)을 확장하는 제4 섹션 (14d)을 갖는다. 몇몇 구체 예에 있어서, 다소 좁은 교차 섹션은 섹션 (14c)로부터 섹션 (14d)로 상기 가이드 핀 (17)의 잘못된 전달을 방지하기 위하여 상기 제3 섹션 (14c) 및 상기 제4 섹션 (14d) 사이의 전이 영역 (transition area)의 노즈 (nose) (46)에서 제공될 수 있다. 게이트 (14)에서 상기 가이드 핀 (17)의 체결 (engagement)은 하우징 (11)에 대한 상기 절단 부 (22)의 이동을 결과하고, 회전에서 섹션 (14a 및 14c), 및 축 움직임에서 섹션 (14b 및 14d)를 커버한다.
상기 장치 (10)로 분석을 수행하기 위해서, 시험될 상기 시료 (예를 들어, 전혈)는 상기 상부 영역 (20)에 도입된다. 예를 들어, 상기 캡 (25)은 모세관 튜브 (24)의 일부분이 노출되도록 제거되고, 그 다음 예를 들어, 대상의 손가락 끝에서 혈액의 한방울과 접촉된다. 상기 시료는 모세관 작용에 의해 모세관 튜브 (24)로 들어간다. 이어서, 상기 캡 (25)은 상기 모세관 튜브 (24)상에 블라인드 홀 (blind hole)(26)로 배치되고, 부피가 블라인드 보어 (26)의 하부 및 상기 모세관 튜브 (24)의 상부 말단 사이가 감소되도록 전적으로 슬라이드되며, 상기 절단 부 (22)의 상기 관형 돌출부 (21b)의 내부 (29)로 상기 모세관 튜브 (24)의 저부 말단을 빠져 나가도록 시료에 압력을 증가시키는 것을 유도한다.
상기 장치에 인접하게 상기 캡 (25)에 배치하여, 캡 (25)의 가이드 (guide) (27)의 세그먼트 (segment) (27a)는 상기 절단 부 (22)에 캡 (25)의 회전 움직임의 전송이 수행되도록 잘록한 부분 (intake) (22a)과 맞물린다. 상기 사용자는 캡 (25)을 회전하고, 이에 의해 또한 절단 부 (22)는 상기 가이드 핀 (17)이 섹션 (14a)에 움직일 수 있는 것 만큼 회전된다. 그 다음, 상기 사용자는 캡 (25)을 누르고, 이에 의해 상기 가이드 핀 (17)이 섹션 (14b)에서 움직일 수 있는 만큼, - 절단 부 (22)의 상기 축 방향 대체의 결과로서, 상기 하우징 (11)의 축 방향으로 절단부 (22)를 내려보내며, 절단 칼 (cutting blade) (23)은 상기 카트리지 (31)의 상부 밀봉 필름 (32)과 접촉하고, 이에 의해 필름을 파괴/절단 (destroying/cutting)한다. 필름 (32)의 파괴에 따라, 관형 돌출부 (21b)의 내부 (29)에 존재하는 상기 시료는 카트리지 (31)의 내용물과 접촉한다. 다른 카트리지 (34 및 37)는 여전히 닫혀있다.
시험의 다음 단계 (phase)을 시작하기 위하여, 상기 사용자는 캡 (25)을 다시 회전하고, 이로 인해 상기 가이드 핀 (17)은 섹션 (14c) 및 섹션 (14d) 사이에 전이 영역 (transition area)에서 섹션 (14c)를 따라 이동된다. 이러한 위치에 있어서, 사용자는 절단 부 (23)가 상기 카트리지 (31)의 밀봉 필름 (33) 및 상기 카트리지 (34)의 밀봉 필름 (35) 모두의 파괴를 결과하기 위해 하우징 (11) 내에서 충분한 거리로 이동되도록 하우징 (11)으로 캡 (25)를 더욱 밀어내는 것이 가능하다. 또한 밀봉 필름 (36, 38, 및 39)을 파괴/절단하기 위하여, 캡 (25)은 섹션 (14d)를 따라 적당한 거리까지 더욱 이동된다. 이러한 방식에 있어서, 상기 시료는 카트리지 (34 및 37)의 내용물과 또한 성공적으로 접촉한다. 상기 시료는 그 다음 상기 컵-형상 분리기 (cup-shaped separator) (41)를 통과하고, 창 (window) (18)을 통해 시각화될 수 있는, 색 변화를 일으킬 수 있는, 하부에 밀착한 띠-형상 요소 (45)와 접촉하기 위해 상기 관통 홀 (42)을 통하여 흐른다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 장치는 하우징 (11)의 원단부 (예를 들어 도 20-25 참조)에 랜싯 (50)을 더욱 포함한다. 바람직하게, 상기 랜싯은 분리가능한 랜싯이다.
도 21을 참조하면, 상기 분석을 수행하기 위해서, 입구 (opening)는 시료를 얻기위하여 상기 장치의 랜싯 부품을 사용하여 시료 부위에서 몸체 조직에 형성된다. 상기 캡 (25)은 그 다음 모세관 튜브 (24)의 일부분에 노출하기 위해 제거되고, 그 다음 상기 시료와 접촉된다. 상기 캡 (25)은 그 다음 상기 모세관 튜브 (24)상에 상기 장치 (10)와 이의 블라인드 홀 (26)의 후면에 배치되고, 부피가 상기 블라인드 보어 (26)의 하부 및 상기 모세관 튜브 (24)의 상부 말단 사이에서 감소되도록 전적으로 슬라이드된다. 어떤 구체 예에 있어서, 카트리지 (31)의 밀봉 필름 (32)은 파괴되고, 이에 의해 상기 시료는 시료/버퍼 조성물을 형성하기 위해 카트리지 (31)내에 함유된 상기 버퍼와 접촉된다. 그 다음, 밀봉 필름 (33)의 파괴에 따라, 상기 시료/버퍼 조성물은 몇몇 구체 예에 있어서; 막; 검출 시약을 갖는 접합구조, 여기서 상기 검출 시약은 리포터 부분으로 표지된 검출 항체이고; 그리고 상기 막과 유체 소통하는 말단 구조를 포함하며, 여기서 상기 시료/버퍼 조성물은 상기 시료/버퍼 조성물이 모세관 현상으로 이동 (wicking)에 의해 이것으로 이동하도록 상기 접합 구조와 접촉하며, 따라서 상기 검출 시약과 접촉한 시료/버퍼 조성물을 가져오는, 상기 띠-형상 요소 (45)와 접촉한다.
상기 시료/버퍼/검출 시약 혼합물은 상기 띠-형상 요소 (45)의 상기 막 부분으로 연속적으로 끌어 들여지고, 이에 의해 상기 혼합물은 상기 포획 항체에 결합하기 위해 상기 혼합물에서 존재될 수 있는 어떤 Z-AAT 항원을 허용하는 상기 시험 영역에서 상기 막 상에 고정화된 포획 항체와 접촉한다. 선택적으로, 세척 용액은 상기 혼합물이 상기 포획 항체와 접촉된 후에 충분한 시간후에 상기 장치로 모세관 현상으로 이동된다. 상기 검출 항체의 검출가능한 표지는 그 다음 고정화된 포획 항체의 영역에서 시각화된다. 상기 분석 장치의 바람직한 구체 예에 있어서, 양성 대조구는 상기 고정화된 포획 항체와 구별되지만, 바람직하게는 고정화된 포획 항체의 영역에 접촉한 후에 이동하는 시료 유동에 의해 접촉된 영역에서 상기 막상에 고정화된 상기 항체와 인접한 상기 막에 포함된다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 고정화된 포획 항체에 의해 한정된 Z-AAT 단백질 포획 영역을 갖는 막을 포함하는 면역 분석 장치를 제공하고, 여기서 상기 포획 항체는 항-Z-AAT 단백질 항체이다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 포획 항체은 LG96 또는 이의 단편이다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 포획 항체은 MG97 또는 이의 단편이다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 장치는 시료 적용 영역 및 상기 시료 적용 영역으로부터 상기 Z-AAT 단백질 포획 영역까지 유동 통로를 더욱 포함하고, 여기서 유체 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재 또는 양은 상기 유체 시료에서 존재할 수 있는 상기 포획 항체 및 상기 Z-AAT 단백질 사이에 복합체의 형성에 의해 결정될 수 있다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 장치는 상기 유동 경로에서 위치된 접합 구조를 더욱 포함하고, 여기서 상기 접합 구조는 상기 Z-AAT 단백질에 대한 특이적인 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약은 이동하거나 또는 이동가능하다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 검출 시약은 검출 항체이다.
몇몇 구체 예에 있어서,상기 검출 항체는 LG96 또는 이의 단편이다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 MG97 또는 이의 단편이다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 리포터 부분으로 표지된다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 금-접합된 검출 항체이다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 유체의 소스는 시료는 모세혈, 혈청, 또는 혈장이다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 유체 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재 또는 양을 결정하기 위한 면역 분석 장치를 제공한다.
상기 장치는:
시료 적용 영역;
미세다공성 막에 고정된 포획 항체에 의해 한정된 Z-AAT 단백질 포획 영역을 갖는 상기 미세다공성 막, 여기서 상기 포획 항체는 LG96 또는 이의 항원-결합 단편이며;
상기 시료 적용 영역으로부터 상기 Z-AAT 단백질 포획 영역까지의 유로, 여기서 유체 시료에서의 Z-AAT 단백질의 존재 또는 양은 상기 유체 시료에 존재할 수 있는 상기 Z-AAT 단백질 및 상기 포획 항체 사이의 복합체의 형성에 의해 결정될 수 있으며; 그리고
상기 유로에 위치된 접합 구조를 포함하며, 여기서 상기 접합 구조는 상기 Z-AAT 단백질에 특이적인 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약은 이동하거나 이동가능하며, 여기서 상기 검출 시약은 금-접합 LG96 또는 이의 금-접합 항원-결합 단편이다.
어떤 관점에 있어서, 대상에서 Z-AAT 단백질을 검출하기 위한 방법은 제공된다. 상기 방법은:
본 발명의 면역분석 장치에 대상으로부터의 생물학적 시료를 적용시키는 단계; 및
상기 포획 항체 및 상기 유체 시료에 존재할 수 있는 Z-AAT 단백질 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계 단계를 포함하며, 여기서 상기 복합체의 검출은 상기 시료에 Z-AAT 단백질의 존재를 나타낸다.
키트 (Kits)
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 AAT 결핍에 관련된 상태 또는 질병을 진전시키는 대상의 소인을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(a) 시험 영역에서 포획 항체가 결합된 막을 포함하는 면역크로마토그래피 장치를 사용하는 면역크로마토그래피에 시료를 적용시키는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 분석물과 결합할 수 있고, 여기서 상기 분석물은 PiZ 유전자 전달체로부터의 시료에 존재하는 Z-AAT 단백질이며, 여기서 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96 또는 MG97이고; 그리고
(b) 상기 시험 영역에 신호를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 시험 영역에 신호의 존재는 상태 또는 질병을 진전시키는 대상의 소인을 나타낸다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은:
(a) 본 발명에 따른 면역크로마토그래피 장치, 여기서 상기 포획 항체는 단일클론 항체 LG96 또는 MG97이며; 그리고
(b) 검출 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 구체 예에 있어서, 상기 검출 시약은 리포터 부분이 접합된 검출 항체이다.
어떤 구체 예에 있어서, 상기 검출 항체는 단일클론 항체 LG96 또는 MG97이고, 여기서 상기 항체는 리포터 부분으로 표지된다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 단일클론 항체 LG96, MG97, 또는 모두를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 관점에 있어서, 상기 면역분석을 수행하기 위해 상기 장치 및 시약은 키트의 형태로 팩키지될 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 적절한 분석 장치, 항체 시약, 및/또는 버퍼와 같은 분석을 진전시키는 시약, 및/또는 만약 필요하다면, 선택된 표지의 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다.
어떤 관점에 있어서, 본 발명은 대상의 생물학적 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재를 측정하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 발명에 기술된 장치, 선택적으로 시약 및/또는 사용 설명서를 포함한다.
다른 구체 예에 있어서, 상기 키트는 선택적으로 예를 들어, 생물학적 시료를 수집/얻기 위한, 랜싯, 버퍼 (예를 들어, 시료 버퍼, CANDOR Bioscience GmbH, Wangen, Germany), 희석제, 여과, 모세관 (예를 들어, 20 ㎕ 모세관), 바늘, 및/또는 주사기 (syringes)를 포함하는 상업적 및 사용자 입장으로부터 원하는 다른 물질/성분을 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 구체 예에 있어서, 상기 키트는 또한 시험 결과의 검출 가능한 시스템을 포함할 수 있다. 결과는 상기 복합체상에 존재하는 표지에 의존하여 시각적 또는 기구적으로 검출될 수 있다. 바람직한 구체 예에 있어서, 결과는 시각적으로 검출된다.
실시 예
실시예 1
단일클론 항체
융합 세포종 (Hybridomas) LG96 및 MG97은 완성된 프루드의 보조제 (Freud's Adjuvant)에서 중합체 인간 알파 1-항트립신 (AAT)으로 BALB/c 쥐를 면역시켜 제조된다. 상기 쥐는 복강내 (intra-peritoneal) 면역화되고; 면역화 사이의 간격은 7-8 일이다. 면역화된 쥐 비장 세포는 형질세포종 (plasmacytoma) 세포주 (cell line) NSW와 융합된다. 융합 세포종 상층액은 AAT 결핍 PiZZ 환자로부터 중합체 hAAT 또는 혈청으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 단일클론 항체의 존재에 대해 스크린된다.
선택된 융합 세포종은 천연 AAT가 아닌 중합체 AAT에 대항하는 항체를 생산하는 것을 선택하기 위해 다시 클론되고 스크린된다. 상기 융합 세포종 LG96 및 MG97의 단일클론 항체는 중합체 AAT를 인식하는 것으로 나타나고, PiZ 혈청과 특이적으로 반응한다.
융합 세포종은 각 바이알에서 세포 농도가 2×106 cells/ml인 특정 배지 (20% FCS 및 10% DMSO를 갖는 DMEM)에서 냉동된다. 세포는 질소상태에 유지된다. 세포는 DMEM-10 배지 또는 20% 혈청을 사용하여 회복될 수 있다.
실시 예 2
상기 AAT의 PiZZ 타입에 대항하여 항체 LG96 및 MG97의 시험
단일클론 항체 LG96 및 MG97은 샌드위치-ELISA에서 자연 PiZZ 타입에 결합하는 이들의 능력이 시험된다. 상기 항체를 포함하는 소량의 세포 배양 상층액은 얻어지고, 두 항체는 CANDOR Bioscience GmbH (Wangen, Germany)에 의해 부분적으로 정제된다.
샌드위치-ELISA, 매칭 쌍의 시험
모든 사용된 면역분석 버퍼는 CANDOR Bioscience에 의해 제공된다. 상기 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plate) (MaxiSorp™, Nunc, Langenselbold, Germany)은 각 웰에 코팅 버퍼 pH 9.6 (제품번호 121)에서 1 ㎍/ml의 각 포획 항체의 150 ㎕를 첨가하여, 각각 부분적으로 정제된 항체 LG96 또는 MG97로 코팅되고, 쉐이킹 상태 (shaking conditions)로 실온에서 3시간 동안 배양된다. 상기 코팅 용액을 제거한 후에 상기 플레이트는 각 웰에 300 ㎕ 차단 용액 (Blocking Solution) (제품번호 110)을 첨가하여 차단되고, 4℃에서 밤새도록 배양된다. 상기 플레이트는 세척 버퍼 (제품 번호 140)로 세번 세척된다. 그 다음, 사람 혈청 (집합 유전자형 ZZ-혈청 또는 MM-혈청)은 각각 1 ㎍/ml LG96HRP 또는 MG97HRP을 함유하는 1:20 및 1:80 (5% 및 1.25% 혈청) 시료 버퍼 (제품 번호 105)로 희석된다. 혈청 없는 시료 버퍼는 음성 대조구 (0%)로 작용된다. 이들 혼합물의 150 ㎕는 각 웰에 첨가되고, 쉐이킹 상태하에서 실온으로 2 시간동안 배양된다. 상기 배양 단계 후에, 상기 플레이트는 세번 세척된다. 그 다음 150 ㎕의 TMB 용액 (Kem-En-Tec, Denmark)은 각 웰에 첨가되고 15 분 동안 배양된다. 상기 반응은 50 ㎕ 2 N H2SO4의 첨가로 정지된다. 450 nm에서 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정된다.
교차-반응성에 대한 시험
상기 마이크로타이터 플레이트 (microtiterplate) (MaxiSorp™, Nunc)은 각 웰에 코팅 버퍼 pH 7.4 (제품번호 120)에서 1 ㎍/ml의 AAT 150 ㎕를 첨가하여, 정제된 ATT (M-폼, BA672, Acris GmBH, Germany)로 코팅되고, 쉐이킹 상태 (shaking conditions)로 실온에서 6시간 동안 배양된다. 상기 코팅 용액을 제거한 후에 상기 플레이트는 각 웰에 250 ㎕ 차단 용액 (Blocking Solution) (제품번호 110)을 첨가하여 차단되고, 4℃에서 밤새도록 배양된다. 상기 플레이트는 세척 버퍼 (제품 번호 140)로 세번 세척된다. 상기 정제 후에, Z-특이 항체 LG96 및 MG97 및 상업적으로 시판되는 항체 F43.8.1 (Monosan? Uden, The Netherlands) 및 1AT (Acris Antibodies GmbH, Herferd, Germany)는 상기 M-폼에 모두 직접적으로 대향하는, 각 항체의 다른 분석 농도 (1,000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml 0.625 ng/ml 및 0 ng/ml)를 산출하기 위해 시료 버퍼 (제품 번호 105)로 연속적으로 희석된다. 150 ㎕의 각 연속적으로 희석된 항체는 각 웰에 첨가되고, 쉐이킹 상태에서 실온으로 2 시간동안 배양된다. 상기 배양 단계 후에 상기 플레이트는 네 번 세척된다. 검출을 위하여, HRP-표지된 2차 항체는 사용되고 (항-마우스-IgG-HRP 610-703-124, Biotrend, Germany), 이것은 0.5까지 시료 버퍼로 희석되고, 각 웰에 첨가되어 쉐이킹 상태로 실온에서 약 2 시간동안의 배양 단계를 수반한다. 그 후 상기 플레이트는 네 번 세척된다. 그 다음 150 ㎕의 TMB 용액 (Kem-En-Tec, Denmark)은 각 웰에 첨가되고 26 분 동안 배양된다. 상기 반응은 50 ㎕ 2 N H2SO4의 첨가로 정지된다. 450 nm에서 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정된다.
상기 결과는 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1은 항체 모두가 포획 항체 또는 호스래디시 페록시다아제 (horseradish-peroxidase) (HRP)로 표지된 검출 항체로써 사용되는 샌드위치-ELISA (매칭 쌍의 시험)를 나타낸다. AAT의 PiZZ- 또는 PiMM-타입 (도시되지 않은 유전자형)에서 가져온 10명 환자의 집단 사람 혈청은 항원 용액으로 사용된다. 부분적으로 정제된 항체를 사용하여, 상기 집단 PiZZ 타입 혈청에 대한 양성 특이 결합은 관찰되고, 상기 집단 PiMM 타입 혈청에 대한 교차 반응성은 없다.
교차-반응성에 대한 부가적인 시험의 결과는 도 2에 나타내었다. 여기서, 상기 AAT의 정제된 M-폼은 ELISA-웰에 코팅되고, 자연 항체 LG96 및 MG97의 결합은 결정된다. AAT의 코팅된 M-타입에 상기 M-특이 대조 항체 1AT 및 F43.8.1의 특이적 결합과 대조적으로, 상기 항체 LG96 및 MG97은 상기 AAT의 M-타입에 교차 반응성이 없는 것으로 나타난다.
상기 결과는 단일클론 항체 LG96 및 MG97이 AAT의 PiZZ 타입에 대항하는 샌드위치-ELISA에서 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 단일클론 항체 LG96 및 MG97은 상기 PiMM 타입에 교차 반응성이 없는 AAT의 PiZZ 타입에 대한 특이적인 샌드위치-형식 면역분석에서 분석 항체로 사용될 수 있다.
실시 예 3
Z-AAT 기준 ELISA의 진전
다른 대상 (P1-P10)의 10 개의 시료 (블랭크 시험)은 100% 적중률 (hit ratio) (도 13)을 갖는 Z-AAT의 존재에 대해 스크린된다. Z를 갖는 모든 시료는 나타나고, (MM과 같은) Z가 없는 것은 나타나지 않는다.
실시 예 4
부가적인 ELISA 시험
ZZ-환자 (혈청 #1 및 2), Prolastin? (혈청 #3 및 4)으로 치환될 MZ-환자, 및 대조 사람 (control person) (MM; 혈청 #5+6)으로부터의 혈청 시료가 사용된다. 상기 혈청 시료 1-6 (상술된)은 측정된다. (네펠로법에 의해 결정된) 36 mg/dl의 알려진 농도를 갖는 혈청 #1은 표준으로 사용된다. 혈청 시료 #2-6의 농도는 상기 ELISA 시험 (표 1)내에서 결정된다.
상기 혈청 시료 1-6 내의 Z-단백질 농도
혈청 #1
(PiZZ)		 혈청 #2
(PiZZ)		 혈청 #3
(MZ)		 혈청 #4
(MZ)		 혈청 #5
(PiMM)		 혈청 #6
(PiMM)
Konz.Z-단백질
[㎎/dL]
36.0
34.0
35.8
34.1
0.0
0.0
상기 항체 MG97 및 LG96의 특이성은 확인된다. 혈청 시료 #5 및 6은 명확한 음성이지만, 혈청 시료 #1-4는 강한 양성 신호를 나타낸다. 상업적으로 이용가능하거나 또는 사내 (in-house) 제제인, 다른 혈청 및 혈장 제제들은 이들의 Z-AAT-함량 (도 14)을 위해 시험된다. 사내 시료 뿐만 아니라, 상업적으로 이용가능한 혈청/혈장 시료는 음성 시료로 사용될 수 있다.
항체 표지
상기 LG96 항체뿐만 아니라 MG97은 40 nm 콜로이드 금 입자와 성공적으로 연결된다.
항체 조합
상기 항체는 모든 가능한 조합에서 검출 항체뿐만 아니라 포획 항체로 사용된다. 혈청 시료 #1-6은 상기 항체 스크린을 위해 사용된다 (도 15a-15d).
결론
상기 조합 MG97/LG96 및 LG96/LG96 (포획 항체/검출 항체)는 양성 시료 (#1-4) 및 음성 시료 (#5 및 6) 사이에 차이의 관점에서 최선으로 확인된다. 상기 LG96/LG96 조합은 #1+2, 3+4 및 5+6의 결과가 서로 근접하기 때문에 바람직할 수 있다.
실시 예 5
장치 시험
ZZ(+) 혈청은 도 26에서 도시된 바와 같은 세 개의 분리 장치에서 시험된다. 모든 3개 시험은 양성이다.
10: 장치 11: 관형 하우징
12: 캡 13: 홀더
16: 밀봉 요소 17: 가이드 핀
19: 절단 장치 21a: 축심 홀
21b: 관형 돌출부 22: 절단 부
23: 절단 칼 25: 관형 캡
27: 가이드 부재 30: 반응 영역
31, 34, 및 37: 카트리지
32/33 및 35/36 및 38/39: 밀봉 필름
40: 표시영역 41: 컵-형상 분리 요소
42: 관통 홀 43: 스페이서
44: 노즐-형상 유입관 45: 띠-형상 요소

Claims (44)

  1. i) 막에 고정된 Z-AAT 단백질에 특이적인 포획 항체에 의해 한정된 Z-AAT 단백질 포획 영역을 갖는 막;
    ii) 시료 적용 영역 및 상기 시료 적용 영역으로부터 상기 Z-AAT 단백질 포획 영역까지의 유로 (flow path); 및
    iii) 유로에 위치된 접합 구조;를 포함하고, 여기서 상기 접합 구조는 상기 Z-AAT 단백질에 특이적인 검출 시약을 포함하고, 상기 검출 시약은 이동하거나 이동가능하며,
    여기서 상기 포획 항체는 기탁번호 DSM ACC3092로 기탁된 융합세포 (hybridoma cells)에 의해 생산된 단일클론 항체 LG96 및 기탁번호 DSM ACC3093으로 기탁된 융합세포 (hybridoma cells)에 의해 생산된 단일클론 항체 MG97로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고,
    여기서 상기 검출 시약은 기탁번호 DSM ACC3092로 기탁된 융합세포 (hybridoma cells)에 의해 생산된 단일클론 항체 LG96인 검출 항체인 면역분석 장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    유체 시료에서 Z-AAT 단백질의 존재 또는 양은 상기 포획 항체 및 상기 유체 시료에 존재할 수 있는 상기 Z-AAT 단백질 사이의 복합체의 형성에 의해 결정될 수 있는 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 면역분석 장치는 시험 영역에서 상기 포획 항체가 결합된 막을 포함하는 면역크로마토그래피 장치이고, 여기서 접합 구조는 근단부에서 상기 막에 유동적으로 연결되고, 여기서 상기 검출 항체는 리포터 부분이 접합된 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 접합 구조는 상기 막의 근단부에서 상기 막을 부분적으로 덮는 접합 패드인 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 장치는 시료를 수용하기 위한 혈액 분리 시스템을 더욱 포함하며, 여기서 상기 혈액 분리 시스템은 상기 접합 구조에 유동적으로 연결된 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 혈액 분리 시스템은 접합 패드를 부분적으로 덮은 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 장치는 상기 막의 원단부에서 상기 막에 유동적으로 연결된 말단 구조를 더욱 포함하며, 여기서 상기 말단 구조는 상기 막의 상기 근단부로부터 상기 원단부까지 상기 시료의 충분한 유동-통로를 제공하는 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 말단 구조는 모세관 작용에 의해 상기 막의 근단부로부터 적어도 대조 영역까지 상기 시료의 충분한 유동-통로를 제공하는 흡착 패드인 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 막은 대조 항체가 결합된 대조 영역을 더욱 포함하며, 여기서 상기 대조 항체는 검출 시약과 결합 가능한 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 대조 항체는 항-마우스 IgG인 것을 특징으로 하는 면역분석 장치.
  11. 청구항 3의 장치를 사용하여 시험될 포유류로부터의 시료에 대해서, 면역크로마토그래피 분석을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 분석은:
    상기 포획 항체에 상기 Z-AAT 단백질을 결합하는 단계, 및
    상기 포획 항체, Z-AAT 단백질, 및 검출 시약 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
    여기서 상기 복합체를 검출하는 단계는 상기 포유류가 PiZ 전달체임을 나타내는 포유류가 PiZ 유전자 전달체인지 아닌지를 결정하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 PiZ 전달체는 PiZ 대립형질을 갖는 어떤 대립형질의 조합인 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 포유류가 PiZ 유전자 전달체인지 아닌지를 결정하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 표현형은 PiZZ, PiMZ, PiSZ, 또는 PiZ/Null인 것을 특징으로 하는 포유류가 PiZ 유전자 전달체인지 아닌지를 결정하는 방법.
  14. 청구항 1의 장치를 포함하며, 여기서 상기 검출 항체는 상기 검출 항체에 접합된 리포터 부분으로 표지된 (labeled) 키트.
  15. Z-AAT 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체로, 여기서 상기 단일클론 항체는 DSM ACC3092 (LG96) 및 DSM ACC3093 (MG97)로 이루어진 군으로부터 선택된 기탁 번호로 기탁된 융합세포에 의해 생산된 단일클론 항체.
  16. 기탁 번호 DSM ACC3092 (LG96)을 갖는 융합세포에 의해 생산된 청구항 15의 단일클론 항체.
  17. 기탁 번호 DSM ACC3093 (MG97)을 갖는 융합세포에 의해 생산된 청구항 15의 단일클론 항체.
  18. 청구항 15에 있어서,
    상기 항체는 표지된 (labeled) 단일클론 항체.
  19. DSM ACC3092 (LG96) 및 DSM ACC3093 (MG97)로 이루어진 군으로부터 선택된 기탁 번호로 기탁된 청구항 15의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주 (hybridoma cell line).
  20. ATCC 기탁 번호 DSM ACC3092 (LG96)로 기탁된 청구항 19의 융합세포주.
  21. ATCC 기탁 번호 DSM ACC3093 (MG97)로 기탁된 청구항 19의 융합세포주.
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