CN103140758A - 免疫层析装置、方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于确定测试样品中分析物的存在或量的基于膜的分析装置、方法和试剂盒。免疫层析装置包含膜，所述膜在测试区具有与其结合的捕获抗体，其中所述捕获抗体能够与分析物结合，特别是在来自PiZ基因携带者的样品中存在的Z-AAT蛋白。

Description

免疫层析装置、方法和试剂盒
相关申请
要求于2010年9月24日提交的美国临时申请No.61/386,214和于2011年5月5日提交的美国临时申请No.61/482,867的优先权，其各自通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及与特异性结合有关的装置和测定，尤其涉及免疫层析装置和测定。
背景技术
在流通型测定(flow-through assay)中通常使用多种分析方法和装置来确定测试样品中可能存在的分析物的存在和/或浓度。例如，在用于医学诊断的护理点(point-of-care，POC)装置中通常使用侧流测试，也称作侧流免疫层析测定或侧流测定(lateral flow assay，LFA)。各个测定设计适合于特定应用。
α-1抗胰蛋白酶缺陷症(AATD)是一种遗传性疾病，其可以通过基因检测来诊断。但是，AATD诊断不足，仅有10～15％被识别。无法识别的患者有时候被分别错误诊断为“常见”的慢性阻塞性肺病(chronicobstructive pulmonary，COPD)和哮喘。
依然需要用于有效确定分析物(特别是Z-AAT蛋白)存在的侧流测定。
发明内容
在一个方面，本发明提供了免疫层析装置，其包含膜，所述膜在测试区具有与其结合的捕获抗体，其中所述捕获抗体能够与分析物结合。所述分析物可以是在来自PiZ基因携带者的样品中存在的Z-AAT蛋白。
在一些方面，本发明提供了一种免疫测定装置，其包含：膜，所述膜具有由固定于其上的捕获抗体限定的Z-AAT蛋白捕获区，其中所述捕获抗体是抗Z-AAT蛋白抗体。
在另一些方面，本发明提供了用于确定流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量的免疫测定装置。所述装置包含：
样品施加区；
微孔膜，其具有由固定于其上的捕获抗体限定的Z-AAT蛋白捕获区，其中所述捕获抗体是LG96或其抗原结合片段；
从样品施加区到Z-AAT蛋白捕获区的流径，其中流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量可通过捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间复合物的形成来确定；以及
位于流径内的缀合物结构(conjugate structure)，其中缀合物结构包含有特异性针对Z-AAT蛋白的检测试剂，所述检测试剂是移动的或可移动的，其中所述检测试剂是金缀合LG96或其金缀合抗原结合片段。
在一个方面，提供了用于检测对象中Z-AAT蛋白的方法，所述方法包括：
将来自对象的生物样品施加于本发明的免疫测定装置；和
检测捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间形成的复合物，其中复合物的检出表明样品中存在Z-AAT蛋白。
在另一方面，本发明提供了用于确定PiZ基因携带者的方法。所述方法包括：使用根据本发明的装置对来自对象的样品进行免疫层析；和确定分析物与捕获抗体的结合，其中所述分析物与所述捕获抗体的结合表明所述对象为PiZ携带者。
在一些方面，本发明提供了用于诊断AAT缺陷相关的病症或疾病的方法。所述方法包括：使用根据本发明的装置对来自对象的样品进行免疫层析；和确定分析物与捕获抗体的结合，其中所述分析物与所述捕获抗体的结合表明所述对象具有所述病症或疾病。
在另一些方面，本发明提供了一种用于确定对象发生与AAT缺陷相关病症或疾病之易感性的方法。所述方法包括：使用根据本发明的装置对来自对象的样品进行免疫层析；和确定分析物与捕获抗体的结合，其中所述分析物与所述捕获抗体的结合表明对象易感于发生AAT缺陷相关病症或疾病。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定生物样品中Z-AAT蛋白的存在的方法。所述方法包括：将生物样品与第一抗体以混合状态提供到膜上，所述膜在测试区具有与其结合的第二抗体，其中第一抗体和第二抗体各自都能与Z-AAT蛋白结合；其中在测试区捕获第二抗体表明样品中存在Z-AAT蛋白。
在又一些方面，本发明提供了试剂盒，其包含：根据本发明的装置；和检测试剂。
附图说明
图1示出了使用单克隆抗体LG96和MG97的夹心式ELISA(sandwich-ELISA)的配对测定的结果。使用部分纯化的单克隆抗体LG96和MG97作为捕获抗体或作为标记有辣根过氧化物酶的检测抗体(分别为LG96HRP或MG97HRP)。将汇集的ZZ或MM血清用样品缓冲液连续稀释并且用作抗原溶液。配对LG96-LG96HRP、LG96-MG97HRP、MG97-LG96HRP和MG97-MG97HRP表现出与PiZZ血清特异性结合，但是不与PiMM血清特异性结合。
图2示出了包被有AAT(M型)的单克隆抗体LG96和MG97的交叉反应的测定结果。使用M特异性抗体F43.8.1和1AT作为阳性对照，两者表现出与包被的AAT(M型)强的特异性结合，相比之下，抗体LG96和MG97未表现出与经包被的M型AAT的结合。
图3示出了用于根据本发明的一个实施方案的免疫层析的侧流测定(LFA)装置的示意性设计。
图4示出如图3所示的示意性设计，其中样品不含目标分析物。
图5是LFA装置的照片，其中所述免疫层析组件显示为包装于外壳中，所述外壳由例如塑料材料制成。测试线或区显示为不存在，因此表明对于样品中分析物存在与否的测试结果是阴性的。对照线或区是阳性的，表明装置正常工作。
图6示出了如图3所示的示意性设计，其中样品包含目标分析物。
图7是LFA装置的照片，其中所述免疫层析组件显示为包装于如图5的外壳中。检测线或区域显示为存在，因此表明对于样品中分析物存在与否的测试结果是阳性的。对照线或区域也是阳性的，表明装置正常工作。
图8示出了根据本发明的一个实施方案的LFA的原理，其中样品是来自ZZ型个体的血液。捕获抗体是LG96；检测抗体是缀合有HRP的MG97；对照抗体：Ig。
图9示出了根据本发明的另一实施方案的LFA的原理，其中样品是来自MM型个体的血液。捕获抗体是LG96；检测抗体是缀合有HRP的MG97；对照抗体：Ig。
图10示出了根据本发明的又一实施方案的LFA的原理，其中样品是来自MZ型个体的血液。捕获抗体是LG96；检测抗体是缀合有HRP的MG97；对照抗体：Ig。
图11示出了LG96-MG97HRP与ZZ和MM血清的结合曲线的结果。
图12示出了LG96-MG97HRP与ZZ血清特异性结合。不结合MM血清。
图13示出了在空白测定中筛选实际样品(1∶20稀释)的结果。
图14示出了使用PiZZ-ELISA对不同的市售和自制血清/血浆样品中Z-AAT浓度的确定。
图15A至15D示出以每一可能的抗体组合的测试血清样品#1至6，其中先提到的抗体是固定在硝酸纤维素上的捕获抗体，斜线后面的抗体是与金粒子结合的检测抗体。
图16示出了本发明的装置的一个实施方案的侧视图。
图17是图16所示装置的纵切面。
图18是图16所示装置的进料区域的放大图。
图19是以下装置的反应区域的放大图：(A)图16所示装置；和(B)装置的另一实施方案，其中所述装置包括单个药盒。
图20示出了图16所述装置的帽和切割部分的侧视图。
图21示出了本发明装置的一个实施方案的纵切面。
图22是本发明装置的另一实施方案。
图23是根据一些实施方案的本发明装置。
图24是根据另一些实施方案的本发明装置。
图25是根据又一些实施方案的本发明装置。
图26示出了使用本发明装置的一个实施方案对ZZ(+)血清样品的三种分离筛选的结果
图27示出了毛细血管血液与血清样品对比的测定(比较来自同一供体的20μl毛细血管血液和血清样品)。在15分钟后使用光读取仪(QuickSens Omega100reader)测量测试信号。单位为mg/dL的数字表明通过浊度法确定的AAT血清水平。
图28示出了不同抗凝血剂对于测试结果的影响。对照：MM-血清。测定样品：ZZ-EDTA血浆、ZZ-柠檬酸盐血浆和ZZ-肝素血浆。在测定开始15分钟之后通过光读取仪测量测定信号。单位为mg/dL的数字表明通过浊度法确定的AAT血清水平。
图29示出了来自(A)MM供体、(B)ZZ供体和(C)SZ供体(使用20μl血清样品并且示出了不同时间后的结果)的血清样品的测试。“Vol”是通过光读取仪测量的测试线(T)的信号强度。对照线用“C”表示。
图30示出了利用血清和全血的n-65测试的结果汇总。0＝PiMM样品；1＝PiMZ、PiSZ和PiZ样品。使用光读取仪在15至20分钟后测量测试信号。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供了免疫层析装置，其包含膜，所述膜具有在测试区与其结合的捕获抗体。所述捕获抗体能够与分析物结合。在一个优选实施方案中，所述分析物是Z-AAT蛋白。所述装置可用于确定样品中分析物的存在。
本文所使用的术语“Z-AAT蛋白”是指Z-AAT的氨基酸聚合物，而不是意在指特定长度的蛋白质，因此，其片段包括在“Z-AAT蛋白”的定义内。该术语还包括Z-AAT蛋白的形式、变体和类似物，包括单体、二聚体、多聚体等以及蛋白质的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。因此，在一些实施方案中，术语“Z-AAT蛋白”可以是术语“Z-AAT多肽”的同义词或可以指两种或更多种Z-AAT多肽的复合物(例如，二聚体、多聚体、聚合体)。
样品
样品一般是指可含有或可不含有分析物的物质。样品可以如从来源得到的那样直接使用或者在修饰或改变样品特性的预处理之后使用。样品的来源可以是任何生物来源，例如生理流体，包括但不限于血液、间质液、唾液、晶状体液(ocular lens fluid)、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹腔液、阴道液、羊水等。优选地，样品是水性样品。
在一些实施方案中，样品是未稀释样品，即，样品从生物来源得到并且直接施加于装置而不对样品进行任何预稀释。在另一些实施方案中，在使用之前对样品进行预处理，例如从血液制备血浆，稀释粘液等。样品的预处理可包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、浓缩、灭活干扰组分和添加试剂。在一些实施方案中，可以使用怀疑含有分析物的固体材料作为样品的来源，优选通过对固体材料进行改造以形成液体或半液体组合物。
在一个实施方案中，样品是全血、血浆或血清。在另一个实施方案中，样品是毛细血管血液。
膜
本发明提供了用于确定样品中分析物的存在或量的基于膜的免疫层析测定。在一些优选实施方案中，分析物是Z-AAT蛋白。例如，在一个实施方案中，分析物是Z-AAT蛋白，其中从哺乳动物(例如，人)获得的血液样品中存在分析物表明所述哺乳动物是PiZ基因携带者。
所述膜可以由样品能够从其中通过的多种材料中的任意材料制成。例如，用于形成膜的材料可以包括但不限于：天然材料、合成材料或人工改性的天然材料，例如：多糖(例如，纤维素材料(例如，纸)和纤维素衍生物(例如，醋酸纤维素和硝酸纤维素)；聚醚砜；尼龙膜；二氧化硅；无机材料，例如灭活氧化铝、硅藻土、MgSO4或其他均匀分散在多孔聚合物基质中的无机细粒，聚合物为例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯醋酸乙烯共聚物；天然织物(例如，棉花)和合成织物(例如，尼龙或人造丝(rayon))；多孔凝胶，例如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺等。
在一个实施方案中，所述膜由硝酸纤维素和/或聚醚砜材料形成。硝酸纤维素可以是纤维素的硝酸酯，其可以是仅仅硝酸纤维素，或者硝酸与其他酸(例如，具有一个或多个碳原子的脂肪族羧酸)的混合酯。
在一些实施方案中，所述膜包含硝酸纤维素。硝酸纤维素能够与蛋白质结合，而不需要预先进行敏化处理。某些试剂(例如抗体)可直接施加于硝酸纤维素并且固定它上面。几乎不需要或不需要可干扰试剂重要特异性结合活性的化学处理。随后可使用简单的材料(例如，聚乙烯醇)封闭硝酸纤维素上的未使用的结合部位。另外，一系列不同孔径大小的硝酸纤维素是可用的，这有利于选择适合特定需要(例如，样品流速等)的膜材料。
在一个实施方案中，所述膜包含单个测试区或线或范围，其具有与其结合的捕获抗体。
在另一些实施方案中，所述膜包含例如依次排布在膜上的多个测试区，水性样品可以向前从中穿过。在一个实施方案中，可以使用多个测试区来提供分析物的定量测量，或者，在另一个实施方案中，多个测试区可分别装载不同的特异性捕获抗体以提供多分析物测试。
在又一些实施方案中，所述膜包含对照区，以确定装置工作。优选地，对照区位于确定期望结果的测试区的下游。因此，阳性对照指示物提供了样品至少已经在膜中透过所需距离的信息。
例如，对照区可以装载能够与检测试剂结合的抗体或其他分子/试剂，以确定样品已经充分透过膜。例如，当检测试剂是来源自小鼠杂交瘤的带标记抗体时，对照区可包含“抗小鼠”抗体(例如，抗小鼠IgG)。在另一实施方案中，对照区可包含湿润时产生颜色改变或颜色形成的无水试剂，例如无水硫酸铜，当其被水性样品湿润时变成蓝色。在又一实施方案中，对照区可包含能够与过量的检测试剂反应的固定的分析物(例如，Z-AAT蛋白)。
在一个实施方案中，所述膜包含对照区，其具有与其结合的对照抗体，其中所述对照抗体能够与所述检测试剂结合。在一些实施方案中，所述对照抗体是抗小鼠IgG。
捕获抗体
在一些优选实施方案中，结合在膜的测试区的捕获抗体是特异性针对Z-AAT蛋白的抗体或其抗原结合片段。在多个实施方案中，抗体对PiMM血清或纯化的野生型AAT表现出基本很少或没有交叉反应性。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
术语“多克隆”或“单克隆”是指抗体制剂的同质性程度，而不是旨在限制具体的产生方法。本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指仅包含一种能够与特定表位发生免疫反应的抗原结合部位的抗体分子群。
还设想了抗体的片段，所述抗体包括但不限于：单链、嵌合、人源化、灵长类化或镶贴修饰抗体(veneered antibody)。例如，能够与Z-AAT蛋白特异性结合的抗体片段包括但不限于Fab′、Fab、F(ab′)2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)、线性抗体、双抗体、骆驼化抗体(camelizedantibody)等。用于制备和使用多种基于抗体的构建物和片段的技术是本领域公知的。这样的片段可以通过酶切或通过重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割分别可产生Fab或F(ab′)2片段。也可以使用具有所需的底物特异性的其他蛋白酶来产生Fab或F(ab′)2片段。也可以使用在天然终止部位上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因产生多种截短形式的抗体。例如，可以将编码F(ab′)2重链部分的嵌合基因设计成包含编码CH1结构域和重链铰链区的DNA序列。
单链抗体和嵌合、人源化或灵长类化(互补决定区移植(CDR移植))或镶贴修饰抗体，以及包含来源于不同物种的部分的嵌合、CDR移植或镶贴修饰抗体等也涵盖在本发明内。这些抗体的多个部分可通过常规技术化学地结合在一起，或可使用基因工程技术制备成连续蛋白质。
在一个实施方案中，捕获抗体是单克隆抗体LG96、MG97或其抗原结合片段。在一个实施方案中，捕获抗体是单克隆抗体MG97，检测抗体是单克隆抗体LG96。在一个实施方案中，捕获抗体是单克隆抗体LG96，检测抗体是单克隆抗体LG96。
产生单克隆抗体LG96和MG97的杂交瘤细胞系的典型样品细胞根据布达佩斯条约的条款于2010年9月14日分别以登录号DSM ACC3092和DSM ACC3093储存在″Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，″Mascheroder Weg lb，38124Braunschweig，Germany。
本领域普通技术人员可以使用多种本领域已知的技术来确定单克隆抗体的核酸序列。可以克隆单克隆抗体的编码核苷酸以制备“重组”单克隆抗体。可以使用任何重组克隆技术，包括使用聚合酶链式反应(PCR)来引发抗体编码核苷酸序列的合成。因此，单克隆抗体制备方法包括以下方法，即包括：从来自合适抗Z-AAT抗体产生细胞(优选杂交瘤)中获得至少第一合适抗Z-AAT抗体编码核苷酸分子或区段；和在重组宿主细胞中表达核酸分子或区段以得到重组抗Z-AAT单克隆抗体。
其他重组技术是本领域已知的，例如基于噬菌体文库的方法。例如，所述方法可包括：(a)通过向动物施用至少一个剂量(任选多于一个剂量)的包含免疫有效量的免疫原性Z-AAT蛋白的组合物(优选包含活化内皮细胞的组合物)来免疫动物；(b)制备表达分离自免疫动物抗体产生细胞(优选分离自脾)的RNA的重组免疫球蛋白噬菌体文库；(c)从噬菌体文库中选择表达至少第一抗Z-AAT抗体的至少第一克隆，任选地为基本上与单克隆抗体LG96或MG97交叉反应或竞争的；(d)从至少所选第一克隆中得到抗Z-AAT抗体编码核酸以及在重组宿主细胞中表达所述核酸以提供至少第一抗Z-AAT抗体；和(e)获得由至少第一选择克隆得到的核苷酸表达的至少第一抗Z-AAT抗体。
在一些实施方案中，结合在膜上测试区的捕获抗体是特异性针对Z-AAT蛋白的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含一个或多个来自单克隆抗体LG96、MG97或它们两者的互补决定区(CDR)。
在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段具有与单克隆抗体LG96或MG97相同或类似的表位特异性。可通过本领域已知的多种方法来确定具有与单克隆抗体LG96或MG97相同或类似的表位特异性的抗体或抗原结合片段。例如，可基于与单克隆抗体竞争结合Z-AAT多肽的能力来鉴定具有相同或类似的表位特异性的抗体。在另一个例子中，可通过单个肽(例如，天然肽，合成肽)来抑制例如LG96mAb以及具有相同或类似表位特异性的抗体与Z-AAT多肽的结合。
不受任何特定理论的约束，相信待测样品中高分析物浓度的问题可以是所谓的“钩状效应(Hook effect)”，其被本领域普通技术人员理解为分析物浓度非常高时可检测信号的降低。通常，在异质夹心式测定(sandwichassay)形式中，可溶性标记抗体(例如，检测试剂)和固相抗体(例如捕获抗体)相对于待检测的分析物过量存在，从而可形成夹心复合物(sandwich complexes)并且基本上完全检测。但是，在高分析物浓度的存在下，有限数量的抗体面对样品中可能存在的极大量的分析物分子。在这种极端情况下，固相抗体不足，使得分析物仅能部分地结合，而且与固相结合的分析物级分不能够完全检测，这是因为标记抗体被过量的分析物捕获形成可溶性检测抗体/分析物的复合物。这可导致分析测量降低，其可导致假阴性测试结果。
在一些实施方案中，所述样品是预稀释样品，然后对其进行免疫层析。
在另一些实施方案中，所述膜包括一个或多个捕获区，其各自布置在膜上接近测试区的位置，水性样品可向前通过这些区域然后到达测试区。在一些实施方案中，所述一个或多个捕获区包含有固定/结合在上面的单克隆抗体LG96或MG97。可提供一个或多个捕获区以防止、减小或消除潜在受到钩状效应影响的样品测定中的钩状效应。
缀合物结构
在一个实施方案中，所述装置还包括具有检测试剂的缀合物结构，例如标记有报告部分的检测抗体。在一些实施方案中，所述缀合物结构放置为与膜相接触，其中当液体与缀合物结构接触时，检测试剂再水化并且被携带通过膜。
在另一些实施方案中，所述缀合物结构在膜的近端与膜流体连接。
在另一实施方案中，所述缀合物结构是缀合物垫，其在膜的近端处部分地覆盖膜。
例如，在一些实施方案中，所述缀合物结构由能够快速吸收液体的吸水、多孔或纤维材料制成。材料的孔隙可以是单向的(例如，孔或纤维全部或大部分平行于结构的轴连续)或多向的(例如，全方向的，因此膜具有无定形的海绵样结构)。可以使用多孔塑料，例如聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、乙烯醋酸乙烯、丙烯腈和聚四氟乙烯。有利地，可以在制造过程中用表面活性剂对材料进行预处理，因为这可降低材料中任何固有的疏水性，从而增强其快速有效地吸收和递送湿润样品的能力。多孔结构还可以由纸或其他纤维素材料(例如硝酸纤维素)制备。在一些实施方案中，可以使用目前在被称作纤维尖头笔(fiber tipped pen)的笔尖中使用的材料，可以将这样的材料形成或挤压成适合本发明的情况的各种长度和横截面。优选地，选择包含多孔缀合物结构的材料，从而使得多孔材料可以在大约数秒内被水性液体饱和。优选地，材料在湿润时依然坚韧。
在另一些实施方案中，所述缀合物结构是上面沉积一层检测试剂的装饰物(finish)或釉化物(glaze)。在一个实施方案中，所述膜的一部分携带所述缀合物结构。本领域技术人员在实践中将理解，所述装饰物/釉化物可能不形成实际表面层，装饰/釉化材料可渗入膜内一定厚度。沉积的检测试剂也可以穿透膜。根据这样的实施方案，水性样品可沿着膜的长度流动，而且通过这么做，溶解装饰物/釉化物和使检测试剂移动，并且沿着膜携带检测试剂。
检测试剂
在一些优选实施方案中，所述检测试剂是标记有报告部分的检测抗体。
在一个实施方案中，所述检测抗体是特异性针对Z-AAT蛋白的抗体或其抗原结合片段。在多个实施方案中，抗体对PiMM血清或纯化的野生型AAT表现出基本上很少或无交叉反应性。
在另一实施方案中，所述检测抗体是单克隆抗体LG96、MG97或其抗原结合片段。
在另一些实施方案中，所述检测抗体是单克隆抗体MG97，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96。在一些实施方案中，所述检测抗体是单克隆LG96，其中所述捕获抗体是单克隆抗体MG97。在一些实施方案中，所述检测抗体是单克隆抗体LG96，所述捕获抗体是单克隆抗体LG96。
报告部分可以是本领域已知的大范围材料/报告体系中的任意种。在一些实施方案中，报告部分包括配体受体对的第一成员，包括但不限于：酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)；金属溶胶、硒溶胶、碳溶胶等；有色或可显色颗粒(例如，有色或可显色乳胶颗粒)；胶体金属颗粒(例如，胶体金、胶体银、胶体铂、胶体硒)。本领域已知的检测报告物之方法的例子包括但不限于通过可见光检测、紫外线(UV)和可见光分光光度法、荧光测定法和辐射计数器的检测方法。
所述报告部分可与所述检测抗体共价或非共价结合/偶联。可通过任何本领域已知的方法完成结合/偶联。例如，用于结合/偶联的试剂包括但不限于戊二醛、对甲苯二异氰酸酯、多种碳二亚胺试剂、对苯醌、m-高碘酸盐、N，N1-O-亚苯基二马来酰亚胺、重组方法等。
血液分离系统
在另一些实施方案中，所述装置还包括用于接收样品的血液分离系统，其中血液分离系统与缀合物结构流体连接。在一个实施方案中，所述血液分离系统是部分地覆盖缀合物垫的血液分离系统。
在一些实施方案中，没有必要将样品直接施加于装置的缀合物结构或膜部分。在一个优选实施方案中，样品施加于与缀合物结构流体连接的血液分离系统(例如，吸收材料/垫)。例如，血液分离系统可具有滤器的功能，例如用于从样品中除去血细胞。然后过滤的样品可到达缀合物结构。在另一些实施方案中，在过滤处理的过程中，可通过将后者从以干状态存在于血液分离系统中的组分中溶解出去来同时实现试剂的添加。通过这样的组分，可以从溶液中消除干扰因素。因此，例如，通过合适的氧化剂，可以使存在于样品中的抗坏血酸(其可干扰作为标记试剂的氧化还原酶和过氧化物酶的使用)无效力。血液分离系统还可以作为吸附剂，其通过吸附从样品中除去干扰因素。
远端结构
优选地，检测试剂(例如，带标记抗体)随着液体样品迁移到测试区。样品继续流动超过测试区并且足够的样品被施加到膜上以使这能够发生。在一些实施方案中，所述装置还包含在膜的远端与膜流体连接的远端结构，其中所述远端结构设置成提供从近端到远端的足够流通(flow-through)。所述远端结构至少在膜的远端作为吸收“槽”。所述吸收槽可包括例如Whatman3MM层析纸。
在一个实施方案中，所述远端结构是部分覆盖膜的远端的吸附垫，其中所述吸附垫设置成通过毛细管作用提供从膜的近端到远端的足够流通。
方法
在一些实施方案中，在操作时，将水性样品施加于装置近端的血液分离系统。样品通过毛细管作用流动通过缀合物结构，并且将检测试剂从缀合物结构运输到检测区，然后到达对照区以给出例如肉眼可见的颜色信号的升高，而不论样品是否含有待检测的分析物。分析物的确定在测试区进行。在一些实施方案中，装置的使用者可以通过比较两个区域中产生的信号来确定样品中是否存在分析物。
例如，在一个实施方案中，如果测试用于确定从哺乳动物得到的血液样品中Z-AAT蛋白的存在，装置的膜组件可包含：具有固定于其上的单克隆抗体LG96的单个测试区；和具有固定于其上的抗小鼠IgG的单个对照区。缀合物垫可以在膜的近端覆盖在膜上，其中缀合物垫包含标记有报告部分(例如，有色乳胶粒子)的单克隆抗体MG97。在测试区检测到可见带表明血液中存在Z-AAT蛋白；在对照区检测到可见带证实样品已经充分透过膜。
在另一些方面，本发明提供了一种用于确定PiZ基因携带者的方法。所述方法包括：
(a)使用免疫层析装置对样品进行免疫层析，所述免疫层析装置包括有膜，所述膜具有结合它上面的测试区的捕获抗体，其中所述捕获抗体能够与分析物结合，其中所述分析物是在来自PiZ基因携带者的样品中存在的Z-AAT蛋白，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96或MG97；和
(b)确定测试区的信号，其中在测试区存在信号表明所述对象是PiZ携带者。
在一个实施方案中，检测试剂是单克隆抗体IG96或MG97，其中所述抗体标记有报告部分。
在另一些实施方案中，PiZ携带者具有这样的表现型，所述表现型是具有PiZ等位基因的任何等位基因组合。
在一些实施方案中，表现型是PiZZ、PiMZ、PiSZ或PiZ/Null。
在另一个实施方案中，对象的血液循环具有可检出的Z-AAT蛋白浓度，从而表明存在PiZ等位基因。
在另一些实施方案中，PiZ携带者是杂合MZ携带者，其具有至少约80mg/dl的AAT血清水平。
在又一些方面，本发明提供了用于诊断AAT缺陷相关病症或疾病的方法，所述方法包括：
(a)使用免疫层析装置对样品进行免疫层析，所述免疫层析装置包含膜，其在测试区具有与其结合的捕获抗体，其中所述捕获抗体能够与分析物结合，其中所述分析物是在来自PiZ基因携带者的样品中存在的Z-AAT蛋白，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96或MG97；和
(b)确定测试区的信号，其中在测试区存在信号表明所述对象患有所述病症或疾病。
装置
在另一些方面，本发明提供了用于进行特异性结合测定(特别是免疫层析测定)的装置。可容易地将装置适用于使用本发明的抗体和方法来检测Z-AAT。固相测定装置包括但不限于：免疫层析免疫测定装置、流通型测定装置、微量滴定板、量油尺和免疫毛细管(immunocapillary)。
在一个优选实施方案中，可适于使用本发明的抗体和方法的装置描述在WO2010/089102中，其有关用于人或动物体的液体的装置的教导通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述装置是一次性使用的封闭系统，其具有刺血针组件和血液采集组件，其经集成接口用于通过毛细管直接确定α-1抗胰蛋白酶缺陷。
在一个实施方案中，所述装置设置成用于根据本发明的免疫层析方法和抗体来进行Z-AAT抗体的夹心式免疫测定。例如图16举例示出的，装置10的实施方案具有长管状壳11。
帽12在外壳11的内部，朝向支撑带状元件45的支架13的一侧。带状元件45在外壳11内轴向延伸并且其近端置于杯状分隔元件41的喷嘴状摄入管44内。分隔元件41(其分隔指示区40与反应区30)具有杯状向上开口的横截面，并且在外壳11的紧密配合下密封安置。分隔元件41底部的通孔42直接开口在带状元件45的面上。分隔元件41被间隔器43的通孔42包围(图17和19)。
在一些实施方案中，带状元件45包含膜(例如，微孔吸收材料片，如硝酸纤维素)，任选地其可层压成衬垫(例如，塑料衬垫)。与膜接触的是(a)具有检测试剂(例如标记有报告部分的检测抗体)的缀合物结构；和(b)远端结构，例如，第二吸收材料的带(例如，Whatman3MM层析纸、玻璃纤维)，所述远端结构与膜流体连通，以有利于牵引分析流体从膜的近端到远端。远端结构还作为吸收材料吸收通过膜的流体。
所述膜包含其上固定有本发明捕获抗体的测试区。在一个实施方案中，所述膜还包含对照区，以确定装置正常工作。优选地，对照区位于确定期望测试结果的测试区下游。因此，阳性对照指标提供样品至少已经透过膜所需距离的信息。例如，对照区可装载有能够与检测试剂结合的分子/试剂，以确定样品已充分透过所述膜。例如，当检测试剂是标记有来源于小鼠杂交瘤的抗体时，对照区可包含抗小鼠IgG。在一个实施方案中，测试区的捕获抗体是LG96和/或MG97，所述检测试剂是标记有可检测标记的LG69，并且所述对照区包含固定于其上的抗小鼠IgG。在另一实施方案中，测试区的捕获抗体是LG96和/或MG97，所述检测试剂是标记有可检测标记的MG97，所述对照区包含固定于其上的抗小鼠IgG。
在一些实施方案中，一个或多个药盒在外壳11的轴向上紧挨分隔元件41上方排布。在图19A所示实施方案中，所示装置在反应区域30中包含31、34和37三个药盒，在图19B所示实施方案中，显示了单个药盒37的装置。
参照图19A的实例，在一个实施方案中，药盒31、34、37各自具有管状壳部分31a、34a、37a(其外部尺寸适合外壳11的的内部尺寸)，并且在顶部和底部被密封膜32/33和35/35以及38/39密封。所述药盒可包含缓冲液、试剂或测定所需的其他化学物质。药盒可以在外壳11内的紧密配合下以填充和密封状态预制和使用，以使得管状壳部分彼此轴向排布。在图19A所示实施方案中，带状元件45朝向药盒37的区域下端搁在分隔元件41的上边缘上。在对面药盒31的上端是以夹紧套形式排布的夹紧元件15，其可以在弹性形变下夹紧在外壳11的内壁，从而使得所述一个或更多个药盒牢固地放置和/或彼此支持。
切割装置19布置在药盒31、34和37的上方，所述切割装置包含切割部分22。切割部分22包含支护体21和管状延伸21b，其在朝向药盒31、34、37的底端包括切割刀23，例如，具有切削齿的刀。布置在管状突起21b下端附近的是环状或圆柱状密封元件16，其搁在外壳11的内部和冠状突起21b的外部，并且轴向支撑在夹紧套15的上部。
切割部分22的支护体21具有内部插有毛细管24的轴向中心孔21a，。管状帽25具有内部盲孔26，其中密封毛细管24突出的上部。在帽25的上端是手柄部分28，通过它使用者可以转动和轴向移动帽25。在下端，帽25的手柄部分的对面是导引件27。
如图20所示，切割部分22的支持体21具有径向向外延伸的导销17，其与以槽状门14(还参见图16)形式在外壳11内形成的的凸轮啮合。参见图16，门14具有在外壳11的周向上延伸的第一区段14a，在外壳11的轴向上延伸的第二区段14b，在外壳11的周向上延伸的第三区段14c，在外壳11的轴向上延伸的第四区段14d。在一些实施方案中，在第三区段14c与第四区段14d之间过渡区域中的鼻部46可提供稍变窄的横截面，从而防止导销17从部分14c中进入部分14d的错误移动。导销17在门14内啮合导致切割部分22相对于外壳11移动，并且旋转覆盖在区段14a和14c上，周向移动覆盖在区段14b和14d上。
为了使用装置10进行测定，将待检验的样品(例如，全血)引入到上部区域20中。例如，除去帽25以暴露出毛细管24的一部分，其然后与例如对象指尖的血滴接触。样品通过毛细管作用进入毛细管24。随后，放置帽25，使其盲孔26在毛细管上，并且完全滑下以使得盲孔26与毛细管24上端之间的体积减小，其导致压力增加，造成样品从毛细管24的下端出去进入切割部分22的管状突起21b的内部29。
通过将帽25放回到装置上，帽25的导引件之区段27a与入口22a啮合，从而使帽25的旋转运动传送到切割部分22上。使用者旋转帽25，从而也旋转切割部分22，直到导销17可以移动进入段14a。然后，使用者在帽25上压下，从而也在外壳11的轴向上压下切割部分22，直到导销17可以移动进入区段14b，由于切割部分22的这种轴向位移，切割刀片23与药盒31的密封膜32的上部接触，从而破坏/切割膜32。通过破坏膜32，存在于管状突起21b的内部29中的样品与药盒31的内容物接触。另外的药盒34和37依然封闭。
为了开始下一阶段的测定，使用者再次旋转帽25，从而使得导销17沿着区段14c进入区段14c与区段14d之间的过渡区域。在这个位置，使用者可以进一步将帽25推进到外壳11中，从而使得切割部分23在外壳内移动一段距离使得足以导致破坏药盒31的密封膜33和药盒34的密封膜35两者。为了还破坏/切割密封膜36、38和39，帽25进一步沿着区段14d移动合适的距离。这样，样品还相继与药盒34和37的内容物接触。然后，样品进入杯状分隔器41并且流过穿孔42，与下方紧接的带状元件45接触，在此处其可导致颜色改变，该变化可通过窗口18观察。
在另一些实施方案中，所述装置还包含在外壳11远端的刺血针50(例如，见图21至25)。优选地，所述刺血针是可拆卸的刺血针(lancet)。
参照图21，为了进行测定，使用装置的刺血针组件在体组织的采样部位形成开口以得到样品。然后除去帽25以暴露毛细管24的一部分，其然后与样品接触。然后将帽25放回装置10，使其盲孔26处于毛细管24上并且完全滑动，从而使得盲孔26的底部与毛细管的顶端之间的体积减少。在一个实施方案中，破坏药盒31的密封膜32从而允许样品与药盒31内包含的缓冲液接触以形成样品/缓冲液组合物。然后，在破坏密封膜33后，样品/缓冲液组合物与带状元件45接触，在一些实施方案中，带状元件45包含：膜；具有检测试剂的缀合物结构，其中检测试剂是标记有报告部分的检测抗体；和与膜流体连通的远端结构，其中样品/缓冲液组合物与缀合物结构接触，从而通过毛细管作用(灯芯效应)样品/缓冲液组合物被吸引进入缀合物结构，从而使得样品/缓冲液组合物与检测试剂接触。样品/缓冲液/检测试剂混合物继续被吸引进入带状元件45的膜部分，这样使得混合物与固定在膜上测试区的捕获抗体接触，从而允许任何可能存在于混合物中的Z-AAT抗原与捕获抗体结合。任选地，在混合物与捕获抗体接触足够的时间后，将清洗液吸进装置。然后检测抗体的可检测标记在固定捕获抗体的区域中显现。在测定装置的一个优选实施方案中，在膜上固定的捕获抗体附近(但是分开的)包含阳性对照，优选地，固定在膜上一个区域，在迁移的样品流体与固定捕获抗体的区域接触后与其接触。
在一些方面，本发明提供了免疫测定装置，其包括：膜，所述膜具有由其上固定的捕获抗体所限定的Z-AAT蛋白捕获区，其中所述捕获抗体是抗Z-AAT蛋白抗体。
在一个实施方案中，所述捕获抗体是LG96或其片段。
在另一实施方案中，所述捕获抗体是MG97或其片段。
在一些实施方案中，所述装置还包含样品施加区和从样品施加区到Z-AAT蛋白捕获区的流径，其中可通过捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间复合物的形成来确定流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量。
在另一些实施方案中，所述装置还包括位于流径中的缀合物结构，其中所述缀合物结构包含特异性针对Z-AAT蛋白的检测试剂，所述检测试剂是移动的或可移动的。
在一个实施方案中，所述检测试剂是检测抗体。
在一些实施方案中，所述检测抗体是LG96或其片段。
在另一些实施方案中，所述检测抗体是MG97或其片段。
在又一些实施方案中，所述检测抗体标记有报告部分。
在另一些实施方案中，所述检测抗体是金缀合检测抗体。
在又一些实施方案中，所述流体样品的来源是毛细血管血液、血清或血浆。
在另一些方面，本发明提供给了用于确定流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量的免疫测定装置。所述装置包含：
样品施加区；
微孔膜，所述微孔膜具有由固定于其上的捕获抗体所限定的Z-AAT蛋白捕获区，其中所述捕获抗体是LG96或其抗原结合片段；
从样品施加区到Z-AA蛋白捕获区的流径，其中可通过捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间复合物的形成来确定流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量；和
位于流径内的缀合物结构，其中所述缀合物结构包括特异性针对Z-AAT蛋白的检测试剂，所述检测试剂是移动的或可移动的，其中所述检测试剂是金缀合LG96或其金缀合抗原结合片段。
在一个方面，提供了用于检测对象中Z-AAT蛋白的方法。所述方法包括：
将来自所述对象的生物样品施加于本发明的免疫测定装置；和
检测捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间形成的复合物，其中复合物的检出表明样品中存在Z-AAT蛋白。
试剂盒
在一个方面，本发明提供了用于确定对象发生AAT缺陷相关病症或疾病之易感性的方法，所述方法包括：
(a)使用免疫层析装置对样品进行免疫层析，所述免疫层析装置包含膜，所述膜在测试区具有与其结合的捕获抗体，其中所述捕获抗体能够与分析物结合，其中所述分析物是在来自PiZ基因携带者的样品中存在的Z-AAT蛋白，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96或MG97；和
(b)确定测试区的信号，其中在测试区存在信号表明对象易患于所述疾病或病症。
在另一些方面，本发明还提供了试剂盒，其包含：
(a)根据本发明的免疫层析装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96或MG97；和
(b)检测试剂。
在一些实施方案中，所述检测试剂是上面结合有报告部分的检测抗体。
在一个实施方案中，所述检测抗体是单克隆抗体LG96或MG97，其中所述抗体标记有报告部分。
在另一些方面，本发明提供了包含单克隆抗体LG96、MG97或这两者的试剂盒。
在另一些方面，所述用于进行免疫测定的装置和试剂可以包装成试剂盒形式。例如，这样的试剂盒可包括合适的测定装置、抗体试剂和/或用于进行测定的试剂，例如缓冲液，和/或(如果需要)用于检测所选标记的试剂。
在一些方面，本发明提供了用于确定对象的生物样品中Z-AAT蛋白之存在的试剂盒，所述试剂盒包含本文所述装置，任选地具有用于使用的试剂和说明书。
在另一些实施方案中，所述试剂盒任选的还包含从商业或使用者角度出发所期望的另一些材料/组件，包括：刺血针、缓冲液(例如，SampleBuffer，CANDOR Bioscience GmbH，Wangen，Germany)、稀释剂、过滤器、毛细管(例如，20μl毛细管)、针和/或注射器(例如，用于采集/获得生物样品)。
在又一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含能够检测测定结果的系统。可根据复合物上存在的标记肉眼或借助仪器来检测结果。在一个优选实施方案中，通过肉眼检测结果。
实施例
实施例1
单克隆抗体
通过用完全弗氏佐剂中的多聚化人α1-抗胰蛋白酶(AAT)免疫BALB/c小鼠来制备杂交瘤LG96和MG97。在腹膜内免疫小鼠，免疫间隔为7至8天。将免疫小鼠的脾细胞与浆细胞瘤细胞系NSW融合。通过使用包被有多聚化hAAT或来自AAT缺陷的PiZZ患者之血清的微量滴定板进行ELISA来筛选所存在的单克隆抗体。
克隆所选的杂交瘤并且再次筛选以选择产生针对多聚化AAT但不针对天然AAT的那些。杂交瘤LG96和MG97的单克隆抗体表现出识别多聚化AAT并且与PiZ血清特异性反应。
将杂交瘤冷冻在特定介质(具有20％FCS和10％DMSO的DMED)中，每瓶的细胞浓度为2×106细胞/ml。将细胞保存在氮中。可使用DMED-10介质或20％血清使细胞恢复。
实施例2
抗体LG96和MG97针对PiZZ型AAT的测试
在夹心式ELISA中测试单克隆抗体LG96和MG97与天然PiZZ特异性结合的能力。得到包含抗体的少量细胞培养物上清液，并且用CANDOR Bioscience GmbH(Wangen，Germany)部分地纯化两种抗体。
配对测试，夹心式ELSA
所使用的全部免疫测定缓冲液由CANDOR Bioscience提供。通过向每一孔中加入150μl的包被缓冲液(coating Buffer)PH9.6(产品编号121)中1μg/ml各捕获抗体来分别用部分纯化的抗体LG96或MG97包被微量滴定板(MaxiSorpTM，Nunc，Langenselbold，Germany)，并且在振摇条件下于室温孵育3小时。在除去包被缓冲液后，通过向每一孔加入300μl封闭液(产品编号110)来封闭平板，并且在4℃孵育过夜。将平板用清洗缓冲液(产品编号140)清洗三次。之后，用分别包含1μg/ml LG96HRP或MG97HRP的样品缓冲液(产品编号105)稀释人血清(混合基因型ZZ血清或MM血清)1∶20和1∶80(5％和1.25％血清)。使用没有血清的样品缓冲液作为阴性对照(0％)。将150μl这些混合物加入到每一孔中并且在振摇条件下于室温孵育2小时。在孵育步骤之后，将平板清洗三次。然后向每一孔加入150μl TMB溶液(Kem-En-Tec，Denmark)并且孵育15分钟。通过加入50μl 2N H2SO4使反应终止。使用酶标仪测定450nm的吸光度。
交叉反应测试
通过向每一孔中加入150μl的包被缓冲液PH7.4(产品编号120)中1μg/ml AAT来用纯化的AAT(M-form，BA672，Acris GmBH，Germany)包被微量滴定板(MaxiSorpTM，Nunc)，并且在振荡条件下于室温孵育6小时。在除去包被缓冲液后，通过向每一孔加入250μl封闭液(产品编号110)来封闭平板，并且在4℃孵育过夜。将平板用清洗缓冲液(产品编号140)清洗四次。在纯化后，将Z特异性抗体LG96和MG97以及市售抗体F43.8.1(
Figure BDA00002961673600201
Uden，The Netherlands)和1AT(AcrisAntibodies GmbH，Herferd，Germany(这两者都针对M型)用样品缓冲液(产品编号105)连续稀释，得到每一抗体的不同测定浓度(1,000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、5ng ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml和0ng/ml)。向孔中加入150μl每一连续稀释抗体并且在振荡条件下于室温孵育2小时。在孵育步骤之后，将平板清洗四次。为了检测，使用HRP标记的第二抗体(抗小鼠IgG-HRP610-703-124，Biotrend，Germany)，用样品缓冲液将其稀释至0.5μg/ml并且加入到每一孔中，之后是在振荡条件下于室温孵育2小时的步骤。之后将平板清洗四次。然后向每一孔加入150μl TMB溶液(Kem-En-Tec，Denmark)并且孵育26分钟。通过加入50μl 2N H2SO4使反应终止。使用酶标仪测定450nm的吸光度。
结果在图1和图2示出。图1显示了夹心式ELISA(配对测试)，其使用这两种抗体作为捕获抗体或检测抗体，后者标记有辣根过氧化物酶(HRP)。使用携带有PiZZ或PiMM型AAT(基因型未示出)的10名患者的汇集人血清作为抗体溶液。使用部分纯化的抗体，观察到与汇集PiZZ型血清的阳性特异性结合，没有与汇集PiMM型血清的交叉反应。
结果表明，单克隆抗体LG96和MG97可以成功地用于针对PiZZ型AAT的夹心式ELISA。可以将单克隆抗体LG96和MG97用作夹心式免疫测定中特异性针对PiZZ型AAT的分析抗体，而不会与PiMM发生交叉反应。
实施例3
ZAAT参照ELISA的开发
筛选不同对象(P1至P10)的10个样品(空白测定)中Z-AAT的存在，100％命中率(图13)。指示出所有具有Z的样品，而不指示没有Z的那些(例如MM)。
实施例4
另一ELISA测试
使用来自ZZ患者的血清样品(血清#1和2)、用
Figure BDA00002961673600211
代替的来自MZ患者血清(血清#3和4)和来自对照人(MM，血清#5和6)。测量血清样品1至6(上文所述)。使用已知浓度为36mg/dl(通过浊度法确定)的血清#1作为标准品。在ELISA测定(表1)中确定血清样品#2至6的浓度。
表1：血清样品1至6中的Z蛋白浓度
Figure BDA00002961673600212
证实了抗体MG97和LG96的特异性。血清样品#5和6是清楚的阴性，而血清样品#1至4表现出强的阳性信号。测试不同的血清和血浆制剂(市购的或自制(in-house)制剂)的Z-AAT含量(图14)。可使用市售血清/血浆样品和本身样品作为阴性样品。
抗体标记
使MG97和LG96与40nm胶体金颗粒成功偶联。
抗体组合
以每一种可能组合将抗体用作捕获抗体和检测抗体。将血清样品#1至6用于抗体筛选(图15A至15D)
结论
根据阳性样品(#1至4)和阴性样品(#5和6)之间的差异确定组合MG97/LG96和LG96/LG96(捕获抗体/检测抗体)是最佳的。因为#1+2、3+4和5+6的结果彼此接近，可优选LG96/LG96组合。
实施例5
设备测试
如图26所示在三个单独的装置中测试ZZ(+)血清。全部三个测试都是阳性。

Claims (44)

1.免疫层析装置，其包含膜，所述膜在测试区具有与其结合之捕获抗体，其中所述捕获抗体能够与分析物结合，其中所述分析物是在来自PiZ基因携带者的样品中存在的Z-AAT蛋白。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体MG97。
4.根据权利要求1所述的装置，其还包含在近端与所述膜流体连接的缀合物结构，其中所述缀合物结构包含检测抗体，所述检测抗体具有与其缀合的报告部分。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述检测抗体是单克隆抗体LG96。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体MG97。
7.根据权利要求4所述的装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体MG97，并且所述检测抗体是单克隆抗体LG96。
8.根据权利要求4所述的装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96，并且所述检测抗体是单克隆抗体LG96。
9.根据权利要求4所述的装置，其中所述缀合物结构是缀合物垫，其在所述膜的近端处部分地覆盖所述膜。
10.根据权利要求4所述的装置，其还包含用于接收所述样品的血液分离系统，其中所述血液分离系统与所述缀合物结构流体连接。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述血液分离系统部分地覆盖所述缀合物垫。
12.根据权利要求10所述的装置，其还包含在所述膜的远端与所述膜流体连接的远端结构，其中所述远端结构设置成提供从所述膜的近端到远端的充分样品流通。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述远端结构是吸附垫，其设置成通过毛细管作用提供从所述膜的近端到至少对照区的充分样品流通。
14.根据权利要求1所述的装置，其中所述膜还包含具有与其结合之对照抗体的对照区，其中所述对照抗体能够与检测试剂结合。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述对照抗体是抗小鼠IgG。
16.用于确定PiZ基因携带者的方法，所述方法包括：
使用根据权利要求1所述的装置对来自对象的样品进行免疫层析；和
确定分析物与捕获抗体的结合，其中所述分析物与所述捕获抗体的结合表明所述对象是PiZ携带者。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96或MG97。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述PiZ携带者具有下述表型，即具有PiZ等位基因的任何等位基因组合。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述捕获抗体是单克隆抗体MG97，并且所述检测抗体是单克隆抗体LG96。
20.根据权利要求16所述的装置，其中所述捕获抗体是单克隆抗体LG96，并且所述检测抗体是单克隆抗体LG96。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述表型是PiZZ、PiMZ、PiSZ或PiZ/Null。
22.用于诊断AAT缺陷相关病症或疾病的方法，所述方法包括：
使用根据权利要求1所述的装置对来自对象的样品进行免疫层析；和
确定分析物与捕获抗体的结合，其中所述分析物与所述捕获抗体的结合表明所述对象具有所述病症或疾病。
23.用于确定对象发生AAT缺陷相关病症或疾病之易感性的方法，所述方法包括：
使用根据权利要求1所述的装置对来自所述对象的样品进行免疫层析；和
确定分析物与捕获抗体的结合，其中所述分析物与所述捕获抗体的结合表明所述对象易感于所述病症或疾病。
24.免疫测定装置，其包含：具有Z-AAT蛋白捕获区的膜，所述捕获区由固定于其上的捕获抗体所限定。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述捕获抗体是LG96或其片段。
26.根据权利要求24所述的装置，其中所述捕获抗体是MG97或其片段。
27.根据权利要求24所述的装置，其还包含样品施加区和从所述样品施加区到所述Z-AAT蛋白捕获区的流径，其中可以通过所述捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间的复合物的形成来确定Z-AAT蛋白的存在或量。
28.根据权利要求27所述的装置，其还包含位于所述流径内的缀合物结构，其中所述缀合物结构包含特异性针对Z-AAT蛋白的检测试剂，所述检测试剂是移动的或可移动的。
29.根据权利要求28所述的装置，其中所述检测试剂是检测抗体。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述检测抗体是LG96或其片段。
31.根据权利要求29所述的装置，其中所述检测抗体是MG97或其片段。
32.根据权利要求29所述的装置，其中所述检测抗体标记有报告部分。
33.根据权利要求29所述的装置，其中所述检测抗体是金缀合检测抗体。
34.根据权利要求27所述的装置，其中所述流体样品的来源是毛细血管血液、血清或血浆。
35.用于确定流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量的免疫测定装置，所述装置包含：
样品施加区；
微孔膜，其具有由固定于其上的捕获抗体所限定的Z-AAT蛋白捕获区，其中所述捕获抗体是LG96或其抗原结合片段；
从所述样品施加区到所述Z-AAT蛋白捕获区的流径，其中可通过所述捕获抗体与流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间复合物的形成来确定所述流体样品中Z-AAT蛋白的存在或量；和
位于所述流径内的缀合物结构，其中所述缀合物结构包含特异性针对Z-AAT蛋白的检测试剂，所述检测试剂是移动的或可移动的，其中所述检测试剂是金缀合LG96或其金缀合抗原结合片段。
36.用于检测对象中的Z-AAT蛋白的方法，所述方法包括：
将来自所述对象的生物样品施加于根据权利要求35所述的免疫测定装置；和
检测所述捕获抗体与所述流体样品中可能存在的Z-AAT蛋白之间形成的复合物，其中所述复合物的检出表明所述样品中存在Z-AAT蛋白。
37.用于确定生物样品中Z-AAT蛋白之存在的方法，所述方法包括：
将所述生物样品与第一抗体以混合状态提供到膜上，所述膜在测试区具有与其结合的第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体各自都能够与Z-AAT蛋白结合；其中在所述测试区捕获所述第二抗体表明所述样品中存在Z-AAT蛋白。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一抗体是LG96。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一抗体是MG97。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二抗体是LG96。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述第二抗体是MG97。
42.试剂盒，其包含：
(a)根据权利要求1所述的装置；和
(b)具有与其缀合的报告部分的检测抗体。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其包含捕获抗体，所述捕获抗体是单克隆抗体LG96或MG97。
44.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述检测抗体是单克隆抗体LG96或MG97，其中所述抗体标记有报告部分。
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Address after: North Carolina

Patentee after: Ji Li Fu therapy LLC

Address before: North Carolina

Patentee before: TALECRIS BIOTHERAPEUTICS, Inc.

CI03 Correction of invention patent
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Correction item: Patentee|Address

Correct: Grifols Therapeutics Inc.|North Carolina

False: Ji Li Fu therapy limited liability company|North Carolina

Number: 23-01

Volume: 34

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Granted publication date: 20150311