JP4956705B2 - 免疫測定装置及び方法 - Google Patents
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Description
(1)試料と、抗原に特異的に結合できる標識された第1の抗体とを反応させた溶液を添加するための部位、又は、標識された第1の抗体を含んでおり、第1の抗体が試料で溶解されて移動できるような形態で含まれている、試料を添加するための部位である、第1の部位
(2)第1の抗体に特異的に結合できる第2の抗体が、第3の部位に移動できないような形態で含まれている部位である、第2の部位
(3)第1の抗体に含まれる標識物を検出するための試薬或いはその一部を含む、第1の抗体の標識物を検出する部位である、第3の部位
(1)免疫源の作製
市販の抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体(オリエンタル酵母製)5mgとKLH (Calbiochem製)4mgを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.7)2mLにグルタルアルデヒド(70%)3μL添加して、室温で1時間反応させた。反応後、PBS緩衝液で透析して免疫源とした。
上記免疫原の0.5mg/mL溶液1mLと完全フロイントアジュバント1mLとを混合して乳化したものを8週令のBALB/cマウスに200μL腹腔内投与した。その後2週間おきに3回、上記免疫原−不完全フロイントアジュバント等量混合乳化液200μLを腹腔内投与した。更に、3回目の投与から2週間後に、上記0.5mg/mLの免疫原100μLを静脈注射した。
3日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾細胞をDMEM培地に懸濁し、洗浄を行った。一方、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8(大日本製薬)を、細胞融合に合わせて対数増殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。細胞融合はPEG法(PEG4000)を用いて実施した。
ハイブリドーマは、10%FCS入りDMEM培地とHAT培地により培養し、以下の方法によりスクリーニングした。ハイブリドーマ培養上清の一次スクリーニングは、固相抗原として抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体からペプシン消化して得た精製F(ab’)2フラグメント、二次抗体として市販のHRP標識ヤギ抗マウスIgG(Fc)抗体(ICN社製)を用いたサンドイッチELISA法により実施した。さらに、二次スクリーニングとして上記固相抗原にCRPをあらかじめ反応させて同様に操作することにより、CRPにより結合阻害を起こすタイプかどうか判定した。陽性ウェルのクローニングとスクリーニングの結果、抗ヒトCRPモノクローナル抗体を特異的に認識し、さらにCRPにより結合阻害を起こす抗体を産生するハイブリドーマとして、13Dと14Aの2クローンを得た。
上記で得られたハイブリドーマ細胞株のうち、13Dを拡大培養して抗イディオタイプ抗体の採取を行った。培養上清の精製は、プロテインAカラム(アマシャム・ジャパン製)により実施した。
(1)ペプシン消化
0.1M酢酸緩衝液(pH4.0)1mLに抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体5mgとペプシン(シグマ製)0.3mgを混合し、37℃で24時間反応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し、F(ab’)2フラグメントを1.8mg得た。抗ヒトCRPマウスモノクローナル抗体は、前記同様の市販品を使用した。
F(ab’)2フラグメント溶液は、限外濾過膜により5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5)に置換した。この抗体液に0.1Mシステアミン溶液を加えて37℃で2時間反応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し、F(ab’)フラグメントを1.0mg得た。
パーオキシダーゼ(HRP:ロシュ製)5mgを0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)750μLに溶解した。DMF120μLにN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ジーベンケミカル東京)2mgを溶解し、HRP溶液に75μL加えて、30℃で1時間反応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し、マレイミド化HRPを2.6mg得た。
F(ab’)フラグメント1.0mgとマレイミド化HRP1.0mgを混合し、冷蔵で24時間反応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し濃縮操作後、1.2mg/mLのHRP標識抗ヒトCRP抗体液を得た。
(1)標識エリア用濾紙(第1の部位)の調製
PBS緩衝液10mLでBSA10mg、グルコース10mgを溶解させた。次に、この溶液で実施例2で作製したHRP標識抗ヒトCRP抗体を5000倍希釈した。さらにこの溶液に濾紙(ワットマン製)を含浸させて乾燥後、12mm×5mmに裁断した。
10mm×5mmに裁断したハイフローメンブレン(ミリポア製)に、実施例1で作製した抗イディオタイプ抗体液1mg/mL溶液を5μL添加した。室温で乾燥後、3mg/mLカゼイン溶液に入れて30分放置後、取り出して乾燥させた。
TMBZ 5mg、ピラノースオキシダーゼ30単位をPBS緩衝液1mLに溶解した。この溶液に濾紙(ワットマン製3hr)を含浸させて乾燥後、7mm×5mmに裁断した。
支持体であるプラスチック板(60mm×5mm)に上端から25mm幅で両面粘着テープを貼った。次に、このプラスチック版の上端を5mmほど空けて上記(2)のメンブレンを貼り付けて固定した。次に、(2)のメンブレンの上端と2mmほど重なり合うように(3)の濾紙を貼り付けて固定した。さらに、(2)のメンブレンの下端が2mmほど重なり合うように(1)の濾紙を貼り付けて固定した。
0、3.25、7.5、15、30、60、120ng/mLのCRPを含有する溶液を検体として用いた。検体は、試料添加位置である標識エリア用濾紙に30μL添加して反応を開始し、5分後に色差計により検出エリアの690nmにおける反射率を測定した。得られた反射率とヒトCRPの濃度との関係を示す検量線を図4に示した。これによれば、低濃度から良好な検量線を示しており、CRPが定量可能であることが判明した。
Claims (6)
- 試料中の測定対象物である抗原と標識抗体を特異的に結合させて、その結合体の標識物を測定することにより抗原量を測定することが可能な免疫測定装置であって、1つの装置内に下記(1)乃至(3)の3つの部位を有し、それぞれの部位を順に溶液が移動できるように構成され、標識された第1の抗体は、抗体部分がF(ab’)フラグメントでかつF(ab’)フラグメントと標識物の結合比が1:1乃至1:n(nは整数)のいずれかであり、第2の抗体は、第1の抗体に対する抗イディオタイプ抗体でかつ抗原と第1の抗体との結合物には結合できない種類の抗イディオタイプ抗体である、免疫測定装置。
(1)試料と、抗原に特異的に結合できる標識された第1の抗体とを反応させた溶液を添加するための部位、又は、標識された第1の抗体を含んでおり、第1の抗体が試料で溶解されて移動できるような形態で含まれている、試料を添加するための部位である、第1の部位
(2)第1の抗体に特異的に結合できる第2の抗体が、第3の部位に移動できないような形態で含まれている部位である、第2の部位
(3)第1の抗体に含まれる標識物を検出するための試薬又はその一部を含む、第1の抗体の標識物を検出する部位である、第3の部位 - 第2の部位において、第2の抗体が担体或いは粒子に固定化されている、請求項1に記載の装置。
- 第1の抗体が酵素で標識されている、請求項1又は2に記載の装置。
- 第1の抗体に含まれる標識物を検出するための試薬が、NAD又はNADP或いはその誘導体、酵素基質又は酵素基質を二次的に生成させるための試薬類、発色基質、ジアホラーゼ、パーオキシダーゼの中から選択される1以上の試薬である、請求項3に記載の装置。
- 3つの部位が、それぞれガラス繊維膜、多孔性メンブレン、濾紙、ナイロン膜のうちのいずれかの材質で構成される、請求項1〜4のいずれかに記載の装置。
- 試料中の測定対象物である抗原と、前記抗原に特異的に結合する標識抗体とを反応させ、未反応の標識抗体を当該抗体に対する抗イディオタイプ抗体で捕捉し、捕捉されなかった抗原と標識抗体との結合物を検出する免疫測定方法であって、前記標識抗体の抗体部分が、F(ab’)フラグメントでかつF(ab’)フラグメントと標識物の結合比が1:1乃至1:n(nは整数)のいずれかであり、前記抗イディオタイプ抗体が、抗原と標識抗体との結合物には結合できない種類の抗イディオタイプ抗体である、免疫測定方法。
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