JPH03503928A - 液体サンプル中の分析物の定量測定装置および定量測定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 サンプル成分の定量法および装置 発明の分野 本発明は液状サンプル中の分析物定量に有用な装置に関するものである。さらに 本発明は、分析物を含む４員すなわち°４４成系′複合体、前記分析物と結合す るモノクローナル抗体自体、分析物と結合するラベルしたモノクローナル抗体Ｆ ａｂフラグメント、およびモノクローナル抗体のＦａｂ部分でなくＦｃ部分と結 合する固相結合モノクローナルないし非モノクローナル抗体を用いて、サンプル 中の分析物を定量する方法に関するものである。ここで分析物と結合するモノク ローナル抗体は両者ともに同一の動物から得られるものである。

背景および先行技術 抗原抗体サンドイツチ体の形成および免疫アッセイでのその利用は、過去１５年 以上に及んで°いる。この分野での先行技術には２つの明白な傾向が見られる。

最も初期の傾向は３成分複合体、すなわちＡｂ＋−Ａｇ−ＡｂｚＩ形の複合体で あり、ここでＡｂ２＊は若干のラベルを有するものである。後期の傾向は、多重 成分系で通常は４成分、場合によっては５以上の成分系である。先行技術の議論 はこの区別を保持している。

１．３成分複合体形成 特許文献はこの分野の発明例を多く含んでいる。アッセイの初期の例は５ｃｈｕ ｕｒｓ他のアメリカ特許４３．６５４．０９０（１９７２）に見られ、歴史的背 景としてのみでなく、この分野の若干の重要な側面を理解するのに有用である。

５ｃｈｕｕｒｓ他は、抗原の第２の部分と結合した可溶酵素ラベル抗体とともに 、抗原のエピトープすなわち結合位置に対応する固相結合抗体を用いての抗体の 検出を教示している。５ｃｈｕｕｒｓ他の開示する方法は、結合抗体、抗原およ びラベルした抗体形の間でのサンドイッチ形成後の酵素ラベルの定量を含んでい る。これは、酵素ラベルに基質を添加することにより固相ないし液相で行われる 。

通常、酵素−基質反応は発色ないし変色を生じるが、これは“イエス−ノー”テ ストで認められ得るか、あるいは存在する物質量が計測できるときは定量され得 る。

５ｃｈｕｕｒｓにはモノクローナル抗体ないし抗体フラグメントに関す議論がな いが、５ｃｈｕｕｒｓ他が１９６８年に出願され、１９７２年に特許されたので あるから、驚くに当たらない。すなわち、これは、ハイブリドーマ技術の進歩、 および、モノクローナル抗体製造のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法の開発よ りもずっと以前であったからである。

５ｃｈｕｕｒｓ他はさらに１９７４年にアメリカ特許徹３．７９１．９３２を取 得しているが、これもサンドイツチ体アッセイに関するものである。この特許に は、いわゆる“前向き”サンドイツ千体免疫アッセイが述べられている。このタ イプのアッセイは、特異的なステップ順が必要である。すなわちテストされるサ ンプルはまず不溶性の結合対象物と接触させ、これら両者を反応させて進行完結 するのである。固相複合体を溶液から除去し、ついで酵素ラベルを含む第２の結 合対象物を固相に加える。複合体との結合の後、前述の標準技術に従って酵素レ ベルを定量する。

ここでもモノクローナル抗体ないし抗体フラグメントに関する記述はない。

アメリカ特許＆　３，８６７．５１７　（１９７５）でＬｉｎｇは、酵素がサン ドイツチ体アッセイで用いられ得る唯一のラベルではないと教示している。この 特許ではラベルとして放射性抗体をアッセイする前向きサンドイツチ体が述べら れている。放射性ラベルは標準の放射性同位元素１１６１であった。抗体の放射 性ラベリングは標準技術であるが、放射性ヨードの結合のためには、抗体分子中 に適当なアミノ酸の存在を必要とする。さもなければ、ラベルはそのままの状態 を維持しない。

５ｃｈｕｕｒｓ他は、さらにもう１件の特許、アメリカ特許Ｎｃｔ　４，０１６ ．０４３を１９７７年に取得している。この特許では、基本的サンドイツチ体ア ッセイのより簡単なやり方が請求されている。ここでは、抗原−抗体反応の不溶 化成分および同成分のラベルサンプルの使用が教示されている。

この方法では、検出される抗原は２か所の同一エピトープサイトを有すると仮定 している。さらに、２つの同一レセプターを用いることにより、後述の“同時” アッセイの使用が除外されている。この結果、５ｃｈｕｕｒｓの′０４３のアッ セイは終了までに６０時間もの長時間がかかることになる。臨床ないし診断室で は、長時間を必要とする場合は不向きである。

Ｐｉａｓｉｏ他のアメリカ特許＆　４，０９８，８７６　（１９７８）では、“ 逆の”サンドイツチ体アッセイが述べられている。この特許は、定量される成分 がまず可溶ラベル抗体と結合し、ついで固定化抗体に結合し得ることがまず示さ れている点で、重要である。洗浄過程が除かれている点でも改良があり、これは アッセイを行う上での時間の節約を意味している。Ｐｉａｓｉｏ他は、そのアッ セイは理想的には半時間以内に完了し得ると教示している。この規範的システム はＰｉａｓｉｏ他の実施例では行われていないが、前述の５ｃｈｕｕｒｓ他の６ ０時間よりはかなり短縮されている。この方法の重大な欠点は固定抗体が非常に 大量必要なことである。

Ｎｉｓｗｅｎｄｅｒのアメリカ特許Ｎ１１４．０４８，２９８　（１９７７）で は、実際にはサンドイツチ体アッセイではなくて、固定化抗体が別の抗体に結合 するように用いられる発明が提示されている。この特許では、旧来の競争免疫ア ッセイの興味ある変形が教示されている。Ｎｉｓｗｅｎｄｅｒは固相結合抗体と 、最初のものとに結合する第２の放射性ラベル抗体と接触させるとともに、アッ セイされるサンプルとを接触させているか、定量される成分とは接触させていな い。

この効果により、測定者は放射性ラベルの固相との結合量を定量ることにより、 存在する物質を定量することができるのである。

この特許により、抗体が単に抗原のみでなく、他の抗体とも結合し得ることが示 されている。この性質は最近のアッセイでは重要であり、そのいくつかを以下に 述べる。

Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｒｇのアメリカ特許Ｎａ　４．２３５，６８９　（１９８０ ）では、抗体は２つの明白に区分される部分、Ｆｃ部分すなはち“定常”領域お よびＦａｂ部分を有することが認められており、Ｆａｂ部分はエピト・−プサイ トと結合する抗体部分である。Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｒｇは、ポリペブタイドのよ うなリガンドと結合したラベルＦａｂフラグメントの複合体を調製している。こ の複合体は、ついでいわゆる“競争”アッセイで用いられている。固相結合ない しサンドイツチ体アッセイには触れていない。

Ｊｅｏｎｇ他のアメリカ特許Ｎａ　４，２４４．９４０　（１９８１）では、“ 同時“サンドイツチ体免疫アッセイか教示されている。

このようなアッセイは、さまざまなエピトープサイトを有する抗原を必要とする が、これはすでに詳しく述へた理由により、２つの別々の抗体ないしレセプター が用いられなければならないからである。

Ｊｅｏｎｇ他のこの分野での１９８１年の技術の状態から見て、形成される３成 分の複合体（すなわち３種の複合体）を常に伴った前向き、逆、および同時アッ セイについての教示がなされたことが理解されよう。この技術分野で、“結合物 ”分子（Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｒｇ）としてのＦａｂフラグメントの利用が見られ 始めたが、これらのフラグメントは、免疫アッセイの本質的部分としては利用さ れておらず、またモノクローナル抗体も利用されていない。

これらの考え方はともに１９８３年に発効された特許で教示されている。１）ａ ｖｉｄ他はアメリカ特許ｋ　４．３７６．１１０（１０８３）で、モノクローナ ル抗体には“結合力”が十分でない、すなわち、サンドイツチ体アッセイで用い るには親和力が不十分であるという技術分野での偏った考えを打破している。Ｄ ａｖｉｄ他は、その両者が少なくとも１０　”　Ｌｉｔｅｒｓ／ｍｏｌｅの親和 力を有している限り、３成分サンドイッチ体アッセイの３つの型はすべてモノク ローナル抗体を用いで実施し得ると教示している。Ｍｏｕｓｓｅｂｏｉｓ他はア メリカ特許Ｎα４．３９７．０６０　（１９８３）で、固形の支持体と結合した Ｆａｂフラグメントを用いれば、膠着アッセイが実施し得ると教示している。や はりこの特許でも、モノクローナル抗体自体は使用されていなくとも、Ｆａｂフ ラグメントは免疫アッセイの共同体とは考えられないことが述べられている。

Ｇａ１ｌａｔｉ他のアメリカ特許Ｎａ　４，４６７．０３１　（１９８４）では 、胎児性ガン抗原（ＣＥＡ）の定量用の特異的サンドイツチ体アッセイについて 教示している。この発明の重要な特徴は、複合体形成を改良するためにさまざま な塩濃度を使用することである。これは本書で定義する“前向き”のサンドイツ チ体アッセイであり、そのアッセイで用いられる２つのモノクローナル抗体の可 能性を議論している。これもまた、３成分複合体であり、Ｆａｂは用いられてい ないことが分かるであろう。

Ｗｏｏｄｓ他のアメリカ特許Ｎα４，４６９．７８７　（１９８４）では、ラベ ルが第２抗体のＦｃ部分に結合することを必要とするサンドイツチ体アッセイが 教示されている。このラベルは第２の抗体に直接結合するのではなく、むしろ、 Ｗｏｏｄｓ他は、３成分複合体が形成された後にラベルが抗体のＦｃ部分に結合 するという発明を主張している。これが行われるのは、ラベルと固定化された最 初の抗体との間の干渉を防ぐためである。

すでに述べたアメリカ特許Ｎα４．３７６、　ｒｌＯの一部継続であるＤａｖｉ ｄ他が獲得したアメリカ特許Ｎａ４．４６９．７８７　（ｌ９８４）でも、再度 、３成分モノクローナル抗体サンドイッチ体およびその検出が教示されている。

この特許は、サンドイツチ体アッセイが均一相、すなわち相分離なしに行い得る ことを示すこのにより、この技術に追加されたものである。これは、多重エピト ープ抗原の“膠″により結合されなければ反応しないラベルで、３成分複合体の モノクローナル抗体成分をラベルすることにより行われる。

Ｃａｒｒｏ他のアメリカ特許Ｎｕ　４．５２２．９２２　（１９８５）では、サ ンドイツチ体アッセイと旧来の型の免疫アッセイ、いわゆる“沈澱“テストとが 結合されている。この発明では、３成分サンドイッチ体の形成に続いて、溶液か らの複合体の沈澱を行うための沈澱試薬の添加が教示されている。これはポリク ローナル抗血清を用いるラジオ免疫アッセイである。

この分野での最新特許では、基本的なサンドイツチ体の原理の変法が示されてい る。Ｐ−ｅｔｓｋａのアメリカ特許Ｎｉ１４，６２３，６２１　（１９８６）で は、分子の反復タンパク質部分上に一度存在した、エピトープにとって特異的な 固相結合モノクローナル抗体を用いることにより、低重合体タンパク質が測定さ れ得ることが教示されている。固相結合の後、単にラベルされた同一のモノクロ ーナル抗体の第２のサンプルが結合されるのである。単に抗体全体と３成分複合 体が再度形成されれば、同時アッセイは不可能である。

■、多数の要員による複合体形成 ４成分系の最も初期の例は、Ｗｏｌｔｅｒｓ他に発行されたアメリカ特許Ｎα４ ．３４３．８９６に示されている。１９７６年に提出された明細書に基づくこの 特許では、複合体Ａｂ、−Ａｂｔ−Ａｇ−Ａｂ、＊と結合した固相が教示されて いる。

Ｗｏｌｔｅｒｓの特許の決定的な制限は、Ａ　ｂ　ｔおよびＡ　ｂ　ｓ　＊が異 なる動物種に由来していることである。この理由はＡｂ、が、定常領域すなわち Ａ　ｂ　＋の“Ｆｃ”部分と反対方向に向けられねばならないためである。同一 の動物種由来の特殊な免疫群の抗体すべては、同一のＦｃ部分を有するであろう 。もしＡｂ、およびＡｂ、が同一の動物種由来であれば、ＡｂＩ−Ａｂ＊−Ａｇ −Ａｂ＊＊のみならず、Ａ　ｂ　＋　　Ａ　ｂ　ｉ　＊をも得られ、その両者が 固相と結合し、妨害と不正確さが結果として生じることが、先行技術により教示 されている。

Ａｘｅｎ他のアメリカ特許Ｎｕ　４，４６９，７９６　（１９８４）では、４つ 以上の成分が免疫反応に関係しているが、４部分複合体のみがＡ　ｂ　＋　−Ａ 　ｂ　ｔ−Ａ　ｇ　　Ａ　ｂ　ｓ　＊の複合体と結合した固相であることが教示 されている。コラム１の４１〜６０行に示される反応種についての記載で、Ａｘ ｅｎ他はＦａｂフラグメントについては少しも触れていないことは注目に値する 。

Ｔａｎｓｗｅｌｌ他のアメリカ特許ＮＱ４，６２４，９３０（１９８６）では、 溶液中の第１および第３のレセプターが抗原と結合する一方、第２の固相抗体が 第１の抗体と結合している４成分複合体が教示されている。Ｔａｎｓｗｅｌｌの 記述は、２重抗体系の利用に特許であり、とくにモノクローナル抗体については 述べていない。

Ｆｏｒｒｅｓｔ他のアメリカ特許Ｎａ　４．６５９．６７８　（１９８７）では 、前述の４部分結合以上に及んでおり、実際には抗体−ハブテン−抗体−ハブテ ン−抗体の５価複合体を形成している。複合体の尾部は放射活性でラベルされた 抗体である。少なくとも１つの抗体はモノクローナル抗体でなければならない。

Ｆｏｒｒｅｓ　を他は、多員複合体を形成するアッセイの長所および短所につい である程度精述している。例えばコラム２の１〜５行目にある問題への解決は、 Ａｂ−Ａｇ−Ｆａｂ＊複合体に結合するためのｍＡｂに結合した固相を用いるこ とであるａ　ｍ　Ａ　ｂに結合した固相は、ｍＡｂ。

−Ａｇ−Ｆａｂ−＊複合体を結合するために使用されるのは、この一度だけであ る。。しかしながらＦｏｒｒｅｓｔは、ｍ　Ａ　Ｂ　＋　−Ａ　ｇ　ｔ　−ｍ　 Ａ　ｂ　＊　−Ａ　ｇ　＋　　Ｆ　ａ　ｂ　＊が形成するために、ｍＡｂ、かも う１つの抗原と結合することを必要としている。しかしながら、この意味におい てｍＡｂ。

は２つのＡｂ結合サイトを持ち得ないために、“Ａｇｔ”が実際には結合剤を意 味することを理解せねばならない。

発明の要旨 この出願は、モノクローナル抗体のＦａｂ部分でなくてＦｃ部分と結合する固相 結合抗体、分析物と結合するモノクローナル抗体全体、分析物、およびモノクロ ーナル抗体のラベルされたＦａｂフラグメントとの間の４成分複合体の形成を含 む、液状サンプル中に分析物を定量する方法に関するものである。さらにまた、 免疫酵素測定アッセイ、競争的アッセイ、および置換アッセイに限らない他の形 のアッセイにも有用なアッセイ用の装置にも関する。

これらのおよび他の発明の様相が烏賊にして達成されるかは、以下記載から明ら かになるであろう。

図の簡単な説明 第１図は、“１％ウィックストリップ”と呼ばれる発明の実施例を図示している 。

第２図は、“ダブルウィックストリップ”と呼ばれる発明のもう１つの実施例を 図示している。

第３図は、“遅滞物理的応用システム”と呼ばれる発明のもう１つの実施例を図 示している。

第４図には、“遅滞拡散応用システム”と呼ばれる発明の実施例が与えられてい る。

第５図は、“ループストリップ”として知られる実施例である。

第６図は、−・体マトリックス”と呼ばれる発明の実施例を示している。

第７図は、“外部圧カストリップ”とよばれる発明のモデルを示している。

好適実施例の詳細な説明 第１図には、この発明で与えられるテストストリップ１１が示されている。装置 全体を支える安定したキャリヤホイル１２が装備されている。例えば、分析用サ ンプルの調製に有用な緩衝液ないし他の試薬を含むであろう選択的スポンジ１３ が示されている。サンプルは、例えばピペットで先ず、ゾーン１４．に適用し、 スポンジは液体に直接浸すか、または、液を例えばピペットで直接適用してもよ い。

“第１のゾーン”は１４に示されており、定量される分析物の少なくとも１つ、 分析物の同族体、ないし定量される分析物に結合する非固相結合レセプターを含 んでいる。さまざまな物質が可能である。定量される分析物は、ウィルスタンパ ク質、薬物ないし薬物残渣、その他のような抗原である場合がしばしばであるが 、とくに分析されるサンプルが生化学的液状物質でなければ、他の物質も定量さ れるであろう。サンドイツチ体アッセイの場合は、第１のゾーン１４には、定量 される分析物に結合する同一種からの２つのモノクローナル抗体が含まれている 。サンドイツチ体アッセイが行われる時には、第１のゾーン１４に含まれる２つ のモノクローナル抗体のうちの１つは、酵素のようなラベルを有しているであろ う。

“第３のゾーン”１５は、第１のゾーン１４によって運ばれるラベルのための基 質を含んでいる。この基質は、酵素がベーターガラクトシダーゼの時のベーター ガラクトシドのように、例えば、酵素により作用を受ける基質となり得るのであ る。それは、作用するラベルに必要な物質であるかも知れない。例えば、第３の ゾーンの基質は、第１のゾーンのラベルと結合して蛍光性部分を形成する物質、 ないし作用分子であるかもしれない。例えば、ラベルおよび基質は、両者が結合 してはじめて触媒活性を発揮する完全酵素の半分と半分であるかもしれない。

第１および第３のゾーンは、ラベルと基質の間で時期尚早な反応が生じないよう に、互いに別個に保存されねばならない。これは、第１および第３のゾーン１４ および１５の間に位置する遮蔽物１６により行われる。この遮蔽物は、サンプル が第２のゾーンに入るまで１４および１５のゾーンの間で拡散を防止する限り、 特殊な材料で作られていなくてもよい。

第２のゾーン１７は、サンプルからの分析物と反応しない第１のゾーン１６にあ る試薬のいずれとも結合する固相結合レセプターを含んでいる。ある°いは、サ ンドイツチ体アッセイが行われている時、この第２のゾーンは、モノクローナル 抗体のＦｃ部分とのみ結合する固相結合レセプターを含んでいる。

別構成ではこの第２のゾーンが２つの部分に分割されており、その１つはＦｃ特 異的、他の１つはＦｃ特異的でない。勿論この場合、シグナルの形成は４成分複 合体抗体を形成するかしないに関係している。このようにして、抗体と結合され た非特異的マトリックスは、ネガティブコントロールとして働らいている。

第１のゾーン１６および第２のゾーン１７は、互いに少なくとも部分的液状接触 の状態にあるに違いないことは、注目すべきである。第２のゾーン１７および第 ３のゾーン１５は、液状接触状態にあるかも知れないが、その必要はない。第１ 図の実施例には、障害ホイル１８の存在のために、第２および第３のゾーンの間 の液状接触は示されていない。この障害ホイルは、基質が第３のゾーンから第２ のゾーンへ通過するのを遅らすのに役立っている。このことによりシグナルか時 期尚早に形成することなく、いかなる反応でも固相結合成分および第１のゾーン の未反応試薬ないしｍＡｂ−Ａｇ−Ｆａｂ＊のサンドイツチ体の間で生じように なる。それはシグナルの時期尚早な形成なしに生じるように仕向けることになる 。

基質は最終的には第２のゾーンへ入らねばならないので、障害物１８は、液体透 過材料、好ましぐはポリビニールアルコールないし、界面活性剤との接触で液体 を透過させるような材料から成っている。

第４のゾーン１９は、第２のゾーン１７と接しており、そこから過剰のサンプル および試薬を受は取る。それは、装置全体としては“廃棄物容器”として作用す るのである。

任意に取り付けられたカバー用スリップ２０も同様にして装備されている。これ は、装置に安定性を追加するのである。

第２図では、第１図の装置の変更が示されている。装置２１では、スポンジ１３ がここではゾーン１４に先ず直接に接触し、第３のゾーン１５には直接には接触 しないことに気付く以外は、すべての成分は装置１１のものと同じである。むし ろ、第１および第３のゾーンの間での液体接触が部分的にある。ラベルおよび基 質の時期尚早な接触は、これらを例えば、障害物１６で互いに隔離されている覆 い付のポジション２２および２３に位置させることにより、回避されるのである 。

第３図では、第１および２図の任意使用のスポンジ１３か使用されていない実施 例が示されている。ここでは、装置３１には第１のゾーン３２が含まれており、 そのゾーンにサンプルが直接加えられる。ゾーン３２は第１および２図の第１の ゾーン１４と同様に機能する。それは第２のゾーン３３と部分的に液体接触を° 行い、熱論、第１および２図の第２のゾーン１７と同じ機能を果たしている。第 ３図の装置と第１および２図の装置との重要な相違は、基質を含有する第３のゾ ーンか置き換え構築されている点である。第３図の説明から分かるように、ポジ ション３４および３５を含む第３のゾーンは、第２のゾーンの下部にあり、そこ で液体接触をしている。第３のゾーンには部位３５の基質が含まれており、層３ ４により支えられている。

層３４が成分４３を通過移動した液体を受は入れる時には、その層は基質３５が 第２のゾーンと接触するように仕向けている。遮断層４４により、ゾーン１と成 分４３との液体接触は阻害されている。成分３４は、例えば、液体と接触すると 膨張するような圧縮スポンジでよい。

この構成では、ラベルと基質の間の時期尚早な反応は問題ではないが、それは液 体が第３のゾーンに到達し、基質を放出する迄に、第１のゾーンのラベルされた 反応物質と第３のゾーンの固相に結合した反応物質との間の反応が既に生じてい るからである。基質は第２のゾーンへと拡散し、そこで検知し得る量が形成され るのである。

過剰のサンプルおよび試薬は、第１図の実施例と同様に、第４のゾーン１９へ運 ばれ、装置全体は再びキャリアホイル１２で結合される。

この装置で示される任意な特徴は、カバ一手段３６である。このカバ一手段によ り、テストス゛トリップ中での反応状態の観察がより正確になるのである。一般 的には、このカバ一手段は、所々に覗き手段、すなわち“窓”を取り付けるこに より、選択的な観察がゆるされるのみである。実際に必要なのは、１か所の覗き 手段であるが、それは第２のゾーンの上部に位置すべきてあり、それにより検知 し得る量の形成がそこで観察できるのである。

もしカバ一手段３６において、４番目のゾーンの上部に覗き手段が追加されてい るならば、基質およびラベルされた結合対象物、例えば、未反応ラベルＦａｂフ ラグメント、との間の反応が観察され得る。さらに、もしカバ一手段３６が、例 えば第１および２図装置での使用に採用されるならば、覗き手段は、ゾーン１お よび３が接合する位置に具備され得るのである。これにより、もしラベルおよび 基質の時期尚早な混合か生じるかどうかを見定めることができる。カバ一手段は ホイル類などの様々な材料から作製し得る。それはまた、射出成形容器の一部分 である射出成形カバーであってもよい。

第４図は、防御層３７が３番目のゾーンで基質３５を被覆し、ゾーン２への基質 拡散が防御層３７に入り込んでいるゾーン２からの液体により開始されるという 点で、第３図の装置とは異なっている。このことにより、基質の時期尚早な混合 が生じないという保証かより大となるのである。既に指摘した選択的なカバ一手 段３６は、含まれていてもよいが、この実施例では含°まれでいない。

第５図の“ループ型実施例”には前記の第２図同様、スポンジ１３がサンプル適 用に用いられている装置の実施例が示されている。サンプルは第１のゾーン１４ に入り、そこて例えば、分析物および結合対象物、すなわちｍＡｂ、Ｆａｂ＊、 およびＡｇの間での反応が生じる。

第１のゾーン１４の内容物全体は第２のゾーン１７に移行し、そこで未反応ラベ ル物質ないしサンドイツチ体のいずれかか、そこに位置する固相結合反応物質に より取り上げられる。第２のゾーン１７での非結合物は、手段３８および３９に 運ばれ、その位置でラベル物質を保持する。液体サンプルの過剰量は、廃棄装置 １９に入るが、そこでは保持されないのである。この装置の構成では、サンプル が、ラベル基質を含有する第３のゾーン１５に強制的に送りこまれるようになっ ている。構造が第３のゾーン１５への移動を強制するようになっているので、１ ９への逆の流れは行われない。手段５２を経て、物質を含む基質は、障害物５３ を通り第２のゾーン１７へ戻り、そこで固相結合ラベル反応物質と基質との反応 が生じる。障害物５３は、サンプルが手段５２から障害物５３を経て進行するよ うに選定されており、第２のゾーン１７から先へは進むことはできない。

第６図には、装置の“一体マトリックス”の実施例が示されている。この具体例 では、第２および３のゾーンはマトリックス４２で本質的には１つどなっている 。基質は、必ずしもカプセル化には限定されないが、カプセル化などの方法によ り、このマトリックスに取り込まれる。１つのマトリックスでの２つのゾーンに 結合には、第１のゾーン１４からのラベルした反応物質と、そこに含まれる固相 結合材料との反応までの間、基質を遊離状態にしてはならないことが必要となっ ている。

第７図に示された最終実施例は、装置７１を示している。ここでは、図示された 要素のすべてか、この実施例で基質１５を含む第３のゾーンが第２のゾーン１７ と隔離されていることを除いて、第１および２図のものと同様である。外部から １５に力を加えるだけで、基質は固相結合のラベルと接触するように仕向けられ 得るのである。

様々なアッセイが、第１〜７図に示す好適実施例の一部ないし全部で行われる。

説明の目的で、第１．４、および５図の装置を用いた別のアッセイの仕組みが述 べられているが、しかしながら、これらの一部ないし全部が装置のいずれかにお いて使用のために採用されるかも知れないことは、当業者には明らかなことであ ろう。

血中のチロキシン（Ｔ４とも呼ばれる）の存在の下でテストを行う時は、サンプ ルは第１図の装置の第１のゾーンに適用する。水道水をスポンジ１３に加え、第 ３のゾーン１５に移動させる。第１のゾーンは、酵素ラベル西洋わさびパーオキ シダーゼを含むＴ４’特異的抗体を含有する一方、ゾーン１５は、オルトフェニ レンジアミンのような標準的西洋わさびパーオキシダーゼ基質のを含有している 。サンプルは第２のゾーン１７に向かって移動しはじめるが、第２のゾーンは、 固相結合固定化の形で、Ｔ４そのものないし関連分子Ｔ３を含んでいる。ゾーン １４を経て移動する際、サンプル中のＴ４は、いずれも西洋わさびパーオキシダ ーゼラベル化Ｔ４特異的抗体と反応して、複合体を形成する。非複合抗体ととも に、これらはゾーン１５を経て移動する液体の前方で、第２のゾーン１７に流れ 込む。障害物１８のために拡散に差異が生じる。

障害物１８が溶解する時、非複合抗体は第２のゾーン１７にある固相結合Ｔ３な いしＴ４と反応し、すでに形成したＴ４−抗体複合体は、廃棄ゾーン１９へ通過 する。

ここで、西洋わさびパーオキシダーゼの基質は、第２のゾーン１７へと通過し、 そこで固相上の固定化酵素と反応する。このようにして、当業者には承知のよう に、定量可能なシグナルが形成される。固相により捕捉される酵素量は、ランプ ル中のＴ３ないしＴ４の量の目安となる。

同様にして、第４図の装置を使用して、たとえば、胎児性ガン抗原（ＣＥＡ）　 、多重エピトープ様物質などのサンドイツチ体アッセイが行われ得る。このよう なテストでは、第１のゾーン３２には、マウス′−抗−ヒトＣＥＡモノクローナ ル抗体およびベーターグルコシダーゼでラベルしたマウス−抗−ヒトＣＥＡモノ クローナル抗体Ｆａｂフラグメントの両者が含有されている。第１のゾーン３２ とサンプルが接触すると、サンドイツチ体が全抗体（ＭＡｂ）　、ＣＥＡ　（Ａ ｇ）およびフラグメント（Ｆａｂ＊）の間で形成する。このｍＡｂ−Ａｇ−Ｆａ ｂ＊フラグメントは、未反応ｍＡｂおよびＦａｂ＊とともに、第２のゾーン３３ に通過するが、そこには固相に結合固定化されたヒツジ−抗マウスＦｃ特異的抗 体が含まれている。この固相は、過剰のｍＡｂのいずれかと前記のサンドイツチ 体の両方と結合している。しかしながら、Ｆａｂ＊はＦｃ部分を含んでいないの で、これは非結合で、廃棄ゾーンへと通過する。一方、サンプルの若干量は、基 質レゾルフィンベーターガラクトピラノシドを遊離し、これは第２のゾーン３３ へと移動する。この基質は、この領域で結合しているＦａｂ＊フラグメントと反 応して、サンプル中のＣＥＡの存在および量の指標となる。

第５図の装置を用いて、被験物がＨＩＶウィルスに暴露したか否かを決定するた めに競争的アッセイを行い得る。この種のテストで抗原ではなく抗体かアッセイ され、従って、この発明の目的でもあるが、テストはこれらが等価であることを 示している。

パーオキシダーゼのような酵素と共役°しているＨＩＶのｑｐ１２０に対する抗 体は、まず装置５１のゾーン１４に取り込まれる。ＨＩＶの抗体を含むかもしれ ない血清サンプルはスポンジ１３に導入され、１４へと拡散する。

サンプルの混合物および共役体は、第２のゾーン１７へ通過するが、このゾーン は、もし他の抗体が存在しなければラベルＩｇＧのすべてと結合するに充分で、 固相に固定化されたＨＩＶｑｐ１２０を含有している。非兵役体は部分３８を経 てトラップ３９へ移り、そのトラップはサンプルからの遊離ラベルのすべてを除 去する。残った溶液は第３のゾーン１５を通過し、被験物を遊離するが、それは 一方通行の障害物を通りマトリックスへのと達し、そこで結合ラベルと反応する 。間接的な関係があり、それはすなわち、結合されるラベルが多ければそれだけ 、サンプル中の抗体は少なく、その逆も成立するということである。

この発明の各局面で、さまざまな材料が使用可能である。抗体が優先するが、レ セプターとしては、例えばタンパク質Ａおよびビオチン−アビジン複合体のよう な追加的な材料を使用することができる。

４成分複合体の４番目を形成する固定化レセプターは、一番目のモノクローナル 抗体と結合し、モノクローナル抗体フラグメントと結合しない限り、前記にリス トの材料のいずれでもよいのである。とくに優先するのは、他の抗体のＦｃ部分 を結合し、フラグメン斗とは結合しない抗体である。

固相として抗体を用いる時は、ポリクローナル抗血清も使用可能ではあるが、モ ノクローナル抗体が優先する。

固相結合抗体を生じるような種類は、最初のレセプターとモノクローナル抗体Ｆ ａｂフラグメントとの間で交叉反応性がない限り、重要ではない。しかしながら 、抗原およびモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントと結合するモノクローナル 抗体は、まさに同種から派生するのである。

Ｆａｂフラグメント上で用いられるラベルは、免疫アッセイで用いられる通常の ラベルのいずれでもよいが、とくに好適なのは、その基質と反応して有色基質を 形成するような酵素である。そのような酵素の例は、ベーターグルコシダーゼ、 西洋わさびパーオキシダーゼ、塩基性ホスファターゼウレアーゼおよびアミラー ゼであるが、このことは、それらが単なる例であり、どのような酵素が使用可能 ということに対する制限と見なしてはならないことが認知されるであろう。アビ ジンがマトリックス結合レセプターの場合は、ビオチン化したモノクローナル抗 体が使用可能であることは、当業者には明白なことであろう。この場合、ラベル された成分はＦａｂフラグメントである必要はなく、ｍＡｂ全体であってもよい のである。

一番目のゾーンでの、ラベルＦａｂフチグメントないしｍＡｂおよび、最初の非 ラベルないしビオチン／アビジンでラベルした抗体の位置調整は、この発明の決 定的な要件ではない。サンプルが順次接触するか、同時に接触するように、それ らの位置を決めてもよいのである。

装置の組立に用いる材料は、数多くのさまざまなものを含んでもよい。勿論、さ まざまなゾーンは、液体吸収性および、良好な毛細状性質を有していなければな らない。そのような材料の例としては、吸水性の紙、ニトロセルロース紙、スポ ンジ、および他の吸収性材料がある。

これらは、繊維状の有無を問わず、それぞれのゾーンは、程度の違う毛細状性質 、吸収性などを有するさまざまな材料から構成されていてもよい。

レセプターは、例えば、臭化シアンで固定した固体状サポートに対するレセプタ ーのように、それを固定化する技術において既知のいずれの標準的方法で固定化 されてもよい。

前記のように、障害物が装置中に用いられる場合、液体が通過できるように選択 されなければならない。不活性なポリマーが優先され、とくにポリビニールアル コール（ＰＶＡ）が望ましい。それ以外の適切な材料は、当業者には明白なこと であろう。

カバ一手段が使用される場合は、その口は開口性、透明ないし半透明でなければ ならない。これにとって好ましい材料は透明なマイラーであり、一方゛、カバー の残りの部分は、例えば、透明な材料で覆われてもよい金属性のホイルのような 、適宜丈夫な材料から構成されている。

第１のゾーンおよび基質ゾーンの間のサポートおよび不透過性障害物のような、 この発明の追加的特徴は、技術的に既知な通常材料から構成されている。

以下の例が発明の作用を示しているが、これまで述べたことを限定するものでは ない。

ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）定量のための装置を調製しテストした。

４２１０ペーパー（Ｆｉｒｍａ　Ｋａｌｆｆ）を長さ２．６ｃｍ、幅０．６ｃｍ （第１ゾーン）に切った。一方の端にｌＯμｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ，７，０， １％ＢＳＡ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）を含ませ、中央部分を、ｈＣＧおよびベータ ーガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体のＦａｂ部分の共役体の２０Ｕ ／ｍｌを含む溶液の７．５μｌに含ませた。モノクローナル抗体フラグメントは 、黄体形成ホルモンに対する交叉反応性を存していなかった。この部分にもまた 、ｈＣＧのベーター鎖に対するモノクローナル抗体の１００μｇ／−の溶液の７ ５μｌを含ませた。紙片の緩衝液を含ませたのとは反対の末端に、５％ポリビニ ールアルコール水溶液のｌＯμｌを含ませた。このようにしてできた紙片を、長 さ１ｃｍ幅０、６ｃｍのＳｃｈ　ｌｅ　ｉ　ｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｌｌ　（第 ２のゾーン）から得た３５１２ペーパーの紙片の０．５ｍｍと重ね゛た。この紙 片を臭化シアンを用いて活性化しておき、マウス抗体のＦｃ部分に対するヒツジ 抗体をそれに固定し７た。この紙片を、１８％ポリビニールアルコール（廃棄ゾ ーン）の水溶液１５０ｕｐを含ませたＤ２８　（Ｗｈａｔｍａｎ）の長さ５ｃｍ 、幅０．６ｃｍの紙片の０．５ｍｍに重ねた。連続した紙片を形成するように指 示して重ねた３枚の紙片は、接着テープを用いて長さ１０ｃｍ、幅０．６ｃｍの ポリスチレンのストリップに乗せた。

生成したストリップはそれぞれ０．１ｏｏ　、２５０　、および５００　ｍｌＵ ／ｍｌｈ　ＣＧを含むように目盛り調整した尿サンプルに浸した。５分後、それ ぞれのストリップを、１００ｍｍｏ　ｌ！のＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５）の ０．８ｍｍｏｆレゾルフィンベーターーガラクトピラノシドの溶液に浸し、５分 間展開させた。ｈＣＧを含む尿に浸したストリップはすべて、第２および廃棄ゾ ーンで明るい赤紫色を呈したが、一方、ｈＧＣを含まないサンプルに浸したスト リップは、第２のゾーンで黄色で、第３のゾーンで赤紫色であった。色の変化は 、第２のゾーンおよび廃棄ゾーンでのレゾルフィンベーター−ガラクトピラノシ ドに及ぼすベーターガラクトシダーゼの作用を示している。

以上のサンプルは、例えば、前記した方法で分離ゾーンにレゾルフィンベーター −ガラクトピラノシドを含ませて、ごく容易に改変することができ、色の変化の 進展は、すでに記述したカバ一手段を通して観察することができた。

この発明の現在好適な実施例と考えられる物を説明したか、当業者には、この発 明から逸脱することなしに、さまざまな変更および改変がなされ得ることは明白 であり、従って、そのような変更および改変のすべてが発明の真の思想と範囲に 入るように意図されているのである。

０寸 ■　ループ ■　一体マトリックス ■　　外部圧カストリップ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年７月２０日

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の構成を備えた液体サンプル中の分析物の定量用装置、 （ａ）定量される分析物、前記の分析物の同族体、ないし前記の分析物の特異的 に結合する非固相レセプターのうちの少なくとも１つのサンプルを含む第１のゾ ーンであって、前記の第１ゾーンサンプルはラベルを有するもの、 （ｂ）前記の第１のゾーンと少なくとも部分的に液体接触状態にある第２のゾー ン、前記の第２のゾーンはサンプルを含む非結合ラベルに結合している固相結合 レセプターを含む、 （ｃ）検知可能な部分を形成するために少なくとも前記のラベルと結合している 反応性成分を含む第３のゾーン、 （ｄ）前記の第２のゾーンと液体接触状態にある第４ゾーンで、前記の第４のゾ ーン前記の第２のゾーンから通過する液体サンプルの受容に適合している。
2. ２．以下の構成を備えた液体サンプル中の分析物の定量用装置、 （ａ）前記の分析物と特異的に結合する異なる非固相結合レセプターの複数個の サンプルを含む第１のゾーンで、前記のレセプターの１つはラベルを有し、いま １つは有していない第１のゾーン、（ｂ）前記の第１のゾーンと部分的に液体接 触状態にある第２のゾーンで、前記の第２のゾーンが、ラベルを有せず、前記の ラベルされたレセプターと特異的に結合していない前記の第１のゾーンのレセプ ターに結合する固相レセプターを含む、 （ｃ）検知可能な部分を生成するために少なくとも前記のラベルと結合している 反応性成分を含む第３のゾーン、 （ｄ）前記の第２のゾーンと液体接触状態にある第４ゾーンで、前記の第４のゾ ーンは前記の第２のゾーンから通過する液体サンプルの受容に適合している。
3. ３．第１および第３のゾーンが互いに少なくとも液体接触状態にある請求項１記 載の装置。
4. ４．第１および第３のゾーンが互いに少なくとも液体接触状態にある請求項２記 載の装置。
5. ５．前記の第１のゾーンが前記の第２のゾーンと少なくとも液体接触状態にあり 、第３のゾーンが前記の第２のゾーンと少なくとも液体接触状態にある請求項１ 記載の装置。
6. ６．前記の第１のゾーンが前記の第２のゾーンと少なくとも液体接触状態にあり 、第３のゾーンが前記の第２のゾーンと少なくとも液体接触状態にある請求項２ 記載の装置。
7. ７．前記の第１および第３のゾーンが互いに分離している請求項１記載の装置。
8. ８．前記の第１および第３のゾーンが互いに分離している請求項２記載の装置。
9. ９．前記の第２および第３のゾーンが互いに分離している請求項１記載の装置。
10. １０．前記の第２および第３のゾーンが互いに分離している請求項２記載の装置 。
11. １１．前記の第２および第３のゾーンが液体透過障害物で分離している請求項９ 記載の装置。
12. １２．前記の第２および第３のゾーンが液体透過遮蔽物で分離している請求項１ ０記載の装置。
13. １３．前記の第１のゾーンと少なくとも部分的に液体接触状態にありサンプルの 適用に適合した第５のゾーンをさらに含む請求項１記載の装置。
14. １４．前記の第１のゾーンと少なくとも部分的に液体接触状態にありサンプルの 適用に適合した第５のゾーンをさらに含む請求項２記載の装置。
15. １５．前記の第１および第３のゾーンと少なくとも部分的に液体接触状態にあり サンプルの適用に適合した第５のゾーンをさらに含む請求項１記載の装置。
16. １６．前記の第１および第３のゾーンと少なくとも部分的に液体接触状態にあり サンプルの適用に適合した第５のゾーンをさらに含む請求項２記載の装置。
17. １７．検知反応を観察するのに適したカバー装置からさらになり、カバー装置が 前記の第２のゾーン上の前記のカバー装置内に位置した少なくとも１つの観察装 置を有する請求項１記載の装置。
18. １８．検知反応を観察するのに適したカバー装置からさらになり、カバー装置が 前記の第２のゾーン上の前記のカバー装置内に位置した少なくとも１つの観察装 置を有する請求項２記載の装置。
19. １９．前記の第２および第３のゾーンが互いに完全に合体している請求項１記載 の装置。
20. ２０．前記の第２および第３のゾーンが互いに完全に合体している請求項２記載 の装置。
21. ２１．非結合反応性成分から検知可能な部分を分離する方法で、前記の方法が前 記の第２のゾーンと少なくとも部分的に液体接触状態にある方法からさらになる 請求項１記載の装置。
22. ２２．非結合反応性成分から検知可能な部分を分離する方法で、前記の方法が前 記の第２のソーンと少なくとも部分的に液体接触状態にある方法からさらになる 請求項２記載の装置。
23. ２３．サンプルを固相サポートと接触し、前記サポートを第１のモノクローナル 抗体成分およびラベルモノクローナル抗体ないしフラグメントの複合体の形成に 有利な条件下で前記の第１のモノクローナル抗体および前記のラベルモノクロー ナル抗体ないしモノクローナル抗体フラグメントが同一種から選ばれる場合の前 記の成分に結合する前記の成分およびラベルモノクローナル抗体ないしモノクロ ーナル抗体フラグメントに結合する除去可能な第１のモノクローナル抗体に組入 れ、前記の複合体を前記の複合体と固定化レセプターとの間での４成分複合体を 形成するに有利な条件下で前記ラベルモノクローナル抗体ないしフラグメントで はなく前記第１のモノクローナル抗体と結合する固定化第２のレセプターと接触 し、前記の成分の測定として前記の４成分複合体中ないし前記のサンプルの残渣 中のラベルを測定することよりなる液体サンプルの成分の定量方法。
24. ２４．前記の第２のレセプターが前記の第１のモノクローナル抗体のＦｃ部分に 特異的な抗体である請求項２３記載のの方法。
25. ２５．前記の第２のレセプターが抗体であり前記のフラグメントがＦａｂフラグ メントである請求項２記載の方法。
26. ２６．前記のサンプルが前記のモノクローナル抗体フラグメントおよび前記のモ ノクローナル抗体と同時に接触する請求項２３記載の方法。
27. ２７．前記のサンプルが前記の第１のモノクローナル抗体および前記のラベルさ れたモノクローナル抗体ないしモノクローナル抗体フラグメントと連続して接触 する請求項２３記載の方法。
28. ２８．前記のモノクローナル抗体フラグメントラベルが酵素である請求項２３記 載の方法。
29. ２９．前記のモノクローナル抗体フラグメントラベルが放射活性である請求項２ ３記載の方法。
30. ３０．前記のモノクローナル抗体フラグメントラベルが蛍光性である請求項２３ 記載の方法。
31. ３１．前記の酵素がベーターガラクトシダーゼである請求の項２３記載の方法。
32. ３２．前記の測定が前記の４成分複合体と前記のラベルのための有色形成基質と 接触し前記の成分の測定として形成した有色を測定することよりなる請求項２３ 記載の方法。
33. ３３．前記の第１のモノクローナル抗体がビオチンアビジン複合体の１員を有し 前記の固定化第２のレセプターが前記の複合体の結合対象物である請求項２３記 載の方法。